EMBRİYO SEÇİMİNDE ARRAY CGH
Doç. Dr. Eray ÇALIŞKAN
Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tüp Bebek Merkezi - Kök Hücre ve Gen Tedavileri Merkezi –
Genetik Ar-Ge Laboratuvarı
Preimplantasyon Genetik Tarama:
Neden?
• Embriyoların implante olup yaşayamamasının 50%
nedeni anöploidi
• Anöploidilerin 70%’i oositin ilk mayoz bölünmesi
sırasında oluşur
• İyi morfolojisi olan blastokistlerin %30’unda anöploidi
vardır
Preimplantasyon Genetik
Tarama: Neden?
• Embryo seçimi; morfolojik özellikler
• Daha iyi morfolojisi olan embriyolar daha fazla
implante olurlar: yine de %20-30
• Morfolojik olarak iyi kabul edilen embriyolarda
anöploidi oranı 30-40%’dır:
• Başarısız embriyo implantasyonu,
• Düşük
• Trizomik bebek doğumu
Munne et al., RBM online, 2003
FISH TABANLI TECRUBE
• RKÇ’lar PGT’nın implantasyon oranı veya eve canlı
bebek götürme oranını arttırmadığını göstermiştir
•
Staessen et al 2004, 2008; Mastenbroek 2007; Hardarson 2008; Meyer et al 2008; Debrock 2009)
•
•
•
•
ANCAK,
FISH ilk jenerasyon teknolojidir
8 kromozom FISH – yüksek yanlış negatiflik 27%
Merkezlerin embriyo biyopsisi tecrübesi?
– Kutup cisimciği, 3. gün, blastokist
Johnson et al, Hum Reprod, 2010
FISH TANISINDA YANLIŞ POZİTİFLİK
• Eğer FISH tanısı monozomi ise embriyoların 65%’i
array CGH ile öploid bulunmuştur
• Eğer FISH tanısı trisomi ise embriyoların 47%’si
array CGH ile öploid
• Eğer FISH tanısı kompleks anöploid ise
embriyoların 63%’ü array CGH ile öploid
Northrop et al, Hum Reprod, 2010
FISH teknolojisi
Array CGH
• FISH ile prob başına 2-3%
allel dropout hızı
• Tüm yanlış tanı oranı 2%
• 6 prob ile yanlış tanı hızı
%12-18
• 8 prob ile yanlış tanı hızı
%16-24
• Allel dropout problemi
• Bir allelin rastgele kaybı
• Fazla amplifikasyon
• Az amplifikasyon
Handyside 2004, Rendwick 2006, Spits 2006, Glentis 2009
SPONTAN DÜŞÜK DATASI
Bulgu
FREKANS
45,X
18
Triploidi
17
Trisomi 16
16.4
Trisomi 22
5.7
Trisomi 21
4.7
Trisomi 15
4.2
Trisomi 13
3.7
Trisomi 18
3
Diğer trizomiler
14.3
Tetraploidi
6
Dengesiz translokasyonlar
3
Diğer
4
51%
PREIMPLANTASYON GENETİK TARAMA
• Kendiliğinden düşüklerde en sık rastlanan genetik
anormallikler
–
–
–
–
–
–
–
Triploidi
Monosomi X
Trizomi 16
Trizomi 22
Tetraploidi
Trizomi 15
Trizomi 21
FISH analizi ile sık tarananlar
13,18,21, X, Y – 14, 12
Tanı oranı 51%-%16 YTO
İN VİTRO YAŞAM?
• Düşüklerin analizi veya yaşayan anöploidiler
transfer öncesi embriyolar hakkında çok az
bilgi veriyor. Bazı anomaliler implante
olabiliyor AMA
• Hiç implante olmayan veya daha düşük oranda
implante olanlar?
• Bazı kromozomların anöploidiye daya yatkın
oldukları dogması doğru mu?
2136 embriyo testi – Mark Hughes’un izniyle
45 47
XO XXY
3% 1%
21 M
4%
Mutations and translocations
22 T
4%
22 M
7%
1 T 1M
3T
2% 2% 2 2T M
4T
1%3%
1%
4M
1%
2%
21 T
20 M 3%
2%
20 T
1%
19 M
4%
19 T
3% 18 M
2% 18 T
16 M
2%
17 T
7%
17 M
2% 16 T 1% 15 M
4%
3%
3M
1%
15
T
3%
5T 5M
1% 2%
6T
1%
6M 7T
1% 1%
7M
8M 9T
8 T 2%
2% 1%
1%
9M
10 T 3%
1%
10 M
11 T
2%
12 M 1%
11 M
2%
12 T 2%
14
13 T 1%
14 M T 13 M 2%
3% 2% 2%
224 embriyo testi – TÜMGEN-Kocaeli University Experience
47XXY
2%
45 XO
3%
8 probe FISH
45% Detection Rate
Drop-out %16-24
20 M
3%
mutations
22 M
11%
0%
1M
4%
7M
8 M 3%
21 M
7%
3%
9M
4%
19 M
7%
18 M
4%
17 M
3%
2M
4% 3 M 4 M 5 M
2%
3% 3%
6M
2%
16 M
10%
15 M
6%
10 M
11 M 3%
3%
12 M
13 M 3%
14 M 4%
5%
GENETIK METHODLAR
• PCR – Polimeraz zincir reaksiyonu
– Amplification of genes interested
• FISH – Floresan in situ hibridizasyon
– Kromozoma özgü bazı gen bölgelerini farklı
renkteki Florockromlarla işaretlemek
• CGH array
– Oligonükleotid \ BAC array ile tüm genin
taranması
46,XY,t(7;13)(q22;q12)
q22-
q12-
SNP
ARRAY CGH NEDİR?
VE ne değildir?
OligoArray
44k
= 44.000 prob
44.000 X 65bp
=2.860.000bp
2.860.000
= 3MB
Genome
= 3.000.000.000
Tüm genomun 1/1000’ini tarar
BACArray
Tüm genomun 1/3000’ini tarar
Kontrol DNA
Cy3 işaretlemesi
Hasta DNA’sı
Cy5 işaretlemesi
Ko-Hibridizasyon
Yıkama ve tarama
Kalite Kontrolü ve Data analizi
CONTROL
1.5
1.0
0.5
TEST
CONTROL
1.5
1.5
1.0
1.0
0.5
0.5
TEST
CONTROL
1.5
1.0
0.5
TEST
kutup cisimciği
blastomere
blastokist
reciprokal translokasyon
TÜMGEN®
KUTUP CİSİMCİĞİ BİYOPSİSİ
Öploid
-16
+22
+15,-22
KARMAŞIK ANÖPLOİD
KARMAŞIK ANÖPLOİD
ARDIŞIK KUTUP CİSİMCİĞİ VE OOSİT VERİSİ
Kocaeli Üniversitesi-TÜMGEN ® & Cambridge UniversityBlueGnome ®
Kutup Cisimciği 1 - öploid
Kutup Cisimciği 2 - öploid
Oosit - Öploid
Kutup Cisimciği 1
Kutup Cisimciği 2
KC 1 A - +15,
KC2 A - -2, -5, -9, -15, -21
Oosit A - +2, +5, +9, +15, +21
BLASTOMER ANALİZİ
Blastomer tek hücre- öploid
Blastomer tek hücre- anöploid
BLASTOKİST ANALİZİ
FISH SONUCU = Monozomi 17
11
12
Kutup Cisimciği 1
İç Hücre Kitlesi
KC 1
Blastokist
IHK 1
Öploid Trofoektoderm hücresi
Karmaşık Anöploidi
Trofoektoderm hücresi
RESİPROKAL TRANSLOKASYON
t(3:11)
t(2;22)
t(2;22)
-chr2
Dengesiz translokasyonlar
t(2;22)(p12;11.22)
12 saat içinde sonuç -8p, -15
Kromozom görüntüsü -8p
12 saat içinde sonuç +8p, +22
Kromozom görüntüsü +8p
Lokus Analizi– Hastalıkların kontrolü
Embriyo seçiminde Array CGH in
Klinik kullanımı
• Kopya sayısındaki değişkenlikleri
tanımlar
• Konvensiyonel metodların sağlamasını
yapar
• Anöploidi tanısında yararlıdır
• Delesyon ve dublikasyonları tanır
• Uniparental dizomi tanısını SNP
temelli olarak yapar
Embriyo seçiminde Array CGH in
Klinik kullanımı
• Klasik karyotipleme ile %100 uyumludur
• %10-30 ekstra bilgi sağlar
ArrayCGH Avantajları
Array CGH’in kısıtlamaları
• Bazı dengeli translokasyonları
atlayabilir
• Hala pahalı ama gittikçe ucuzluyor
• Yüksek çözünürlüklü tarayıcılara
ihtiyaç vardır
• Üretici, dağıtıcı ve testi
yapabilenler az sayıda
MOZAİK EMBRİYOLAR
•
•
•
•
Önce trofoektoderm sonra İHK biyopsisi yapılınca
42.3% tüm hücreler öploid
30% tüm hücreler anöploid
32.4% si mozaik
– 15.4% karışık farklı hücre dizilerinden oluşan
anöploidiler,
– 17% hem normal hem anöploid hücreler var.
– Mozaik diploid– Toplamın %6’sında yani anöploid
blastokistlerin %30 unda normal öploid iç hücre
kütlesi var
Embriyo seçiminde array CGH
kullanan Klinik Çalışma Sonuçları
Sonuç
Embriyo Grade ‘i
Öploid
111 222 33
1.5
Mozaik öploid
11111 2222222 333
1.9
Kaotik anöploid
11 222 333
1.7
Anöploid
1111 2222 333
2.2
Segment hataları
111111 222 3
1.4
Johnson et al, Hum Reprod, 2010
Dengeli translokasyonlara bağlı
tekrarlayan düşüğü olanlarda
• 28 çift 228 embriyo testi
• Test edilen embriyoların 16 % sı genetik olarak
normal
• ET başına devam eden gebelik oranı 72%
Fiorentino et al, Hum Reprod, 2011
2008 -2011 KUTUP CİSİMCİĞİ VEYA
BLASTOMER BİYOPSİSİ
• Vakalar
• Hibridizasyon
•
•
•
•
82
224
Anöploid embriyo oranı
%68
Öploid embriyo oranı
%32
Tüm embriyoları öploid olan hasta 0%
Tüm test edilen embriyoları anöploid olan hasta
sayısı %19.5 (n=16)
GEBELİK SONUÇLARI
•
•
•
•
Vakaların ortanca yaşı 41 (35-44)
Daha önce 3 IVF başarısızlığı n= 21
Parental translokasyonlar with RPL n= 15
Anne yaşı 40 ve üzeri n= 23
• Vakaların ortanca yaşı 31 ( 26-34)
• Elektif= 23
PR PET: 27%
PR PET: 58%
PR PET: 32%
PR PET: 61%
SONUÇ
• Array CGH uygulamaları sonucunda PGT için
yeni bir dönem başlamıştır
• Gelecekteki teknolojik gelişmeler array CGH
uygulamalarını daha da geliştirecektir
KOCAELİ ÜNİVERSİTESİ
TÜP BEBEK MERKEZİ
KOCAELİ ÜNİVERSİTESİ
GENETİK ANABİLİMDALI
TÜMGEN® TEKNOPARK
‘ARRAYLAND’
Download

eray çalışkan -embriyo seçiminde array cgh