Rutinde Mantar
Enfeksiyonlarına
Laboratuvar Yaklaşımı;
Serolojik ve Moleküler Yöntemler
Dr. M. Ali SARAÇLI
KASIM 2012
• Serolojik tanı
• Moleküler tanı
Annelerin hayali
2/28
MİKOLOJİDE SEROLOJİ
• Kültür tanımlamasının doğrulaması
– Ekzoantijen testleri
• İnvitro serolojik tanı
– EIA, LA, KF, Kart test
– Antijen testleri: Çapraz reaksiyonlar,
klirens
– Antikor testleri: İmmün baskılanmış/
yetmezlik durumları, flora, kolonizasyon
– Cins/türler arası antifungal duyarlılık farkı
– Yetersiz epidemiyolojik bilgi kaynağı
3/28
Ekzoantijen testi
• İmmünodifüzyon testidir;
– Mantar türüne özgün saflaştırılmış antikorlar
– Kültürü yapılan hücrelerinden elde edilen antijenler
• Presipitin bandı oluşumu araştırılır.
• Sınıf II güvenlik kabini içinde gerçekleştirilmelidir
(Coccidioides !!!!)
• Yorumlama - presipitin bandlarının
bandlarının;;
– Tam olarak karşılaşıp uç uca birleşmesi: Tam uyum
– Biri diğerini çaprazlayacak şekilde karşılaşması: Çapraz reaksiyon
4/28
Ekzoantijen testi
R: Antikor
A: Antijen
EX: Kültür ekstresi
Histoplasma,, Blastomyces ve Coccidioides üçlü test
Histoplasma
http://www.mycology.adelaide.edu.au/virtual/2006/ID2-May06.html
5/28
Ticari Ekzoantijen test
sağlayıcıları
• Immunomycologics:
Immunomycologics: “Exo
“Exo Antigen
identification system
system””
– Histoplasma
Histoplasma,, Coccidioides
Coccidioides,, Blastomyces
• Meridian Diagnostics
Diagnostics:: İmmünodifüzyon
plakları
6/28
IN VITRO SEROLOJİK TANI
•
•
•
•
•
•
•
•
Kriptokokkoz
Aspergilloz
Kandidoz
Histoplazmoz
Koksidioidomikoz
Blastomikoz
Parakoksidioidomikoz
Sporotrikoz
7/28
KRİPTOKOKKOZ
• Antijen saptama (polisakkarit)
–
–
–
–
–
EIA, lateks aglutinasyon, kart test kitleri
Serum/BOS
>%90 duyarlılık ve özgüllük
Tanıda kullanılışlı, ancak tedaviye yanıt saptamada güvenilmez
Yalancı pozitif/negatif durumlarda: Tekrar test, kültür yapılması
• Antikor saptama
– EIA
– Serum
– Sadece epidemiyolojik açıdan önemli
Pastorex Crypto plus
(BioRad)
8/28
ASPERGİLLOZ
• Antijen saptama (Galaktomannan)
– Galaktomannan 1→5
1→5--β-d-galactofuranose yan zincirine karşı
mAb
– Yalancı pozitiflik: Bifidobacterium
Bifidobacterium,, piperasilinpiperasilin-tazobaktam vb.
beta laktam/kombinasyonlar (tek doz kesilince 2h, çok dozda 11-5
günde negatifleşir), gıdalar (makarna, tahıllar), barsak hasarı,
küfler (Penicillium
(Penicillium,, Fusarium
Fusarium,, Alternaria
Alternaria,, Mucorales,
Paecilomyces, Geotrichum, Histoplasma).
Histoplasma). Erişkin %2.5, çocuk
%10, yeni doğan %83
– Aspergillus türlerinin antijen saçılımı birbirinden farklı
– İnvaziv aspergilloz riskinde haftada 2 test
– BAL: Kolonizasyona bağlı olarak %3%3-19 yalancı pozitiflik
• Antikor saptama
– İmmunodifüzyon ve KF (IMMY Diagnostics)
9/28
Galaktomannan antijen testi
• BAL/Serum: CI ≥0.5
• BAL (Invaziv Pulmoner
Aspergilloz): CI =?; CI=1.1
CI=1.1
özgüllük %98.1
%98.1,, duyarlılık %100*
• Negatif prediktif değeri >PPV
(%92--99/ %17(%92
%17-59; çocuklarda )
• A.terreus !!
GMI 5-9 günde normale
dönenler
GMI pozitif kalan ve
artanlar (eşik üzerine
+≥1.0)
Platelia Aspergillus Ag,
BioRad
* Li –Yang Hsu et al. BMC Infectious Diseases 2010, 10:44
10/28
KANDİDOZ
•
Antijen saptama
–
–
–
–
•
Mannan, 230230-250 kDa’luk germ tüp duvar mannoproteini,
Blastospor duvarı, Miçelyum duvarı, 54 kDa’luk
sitoplazmik antijen, 52 kDa’luk metalloprotein, Sekrete
edilen aspartil proteinaz, Enolaz, Isı labil antijen
Transient antijenemi sorun
Platelia Candida Ag plus (BioRad)
Duyarlılık %50%50-94 << Özgüllük %76%76-96 (9 makale)
Antikor saptama
–
–
İmmunodifüzyon (IMMY Diagnostics)
EIA--Platelia Candida Ab plus (BioEIA
(Bio-Rad)
11/28
HİSTOPLAZMOZ
• Antijen saptama
– İnvaziv histoplazmozda
• idrarda >%90, serumda >%75 pozitif
• BOS
• blastomikoz, koksidiyoidomikoz, penisilloz,
parakoksidiyoidomikoz ile çapraz reaksiyonlar
– Duyarlılık %75%75-90, özgüllük %98 *
• Antikor saptama
– H (akut faz) ve M (tüm fazlar) antijenlerine karşı
• EIA, ID, KF
* Wheat, L.J. 2003. Trends Microbiol. 11:488-94
12/28
KOKSİDİOİDOMİKOZ
• Antijen saptama
– EIA
• Ticari değil
• P.brasiliensis ile çapraz reaksiyon
– Serum ve idrar örnekleri
• Antikor saptama
– EIA, KF, ID, LA kitleri mevcut
– EIA duyarlılık%95.5, özgüllük %98.5*
• Premier EIA, Meridian Diagnostics
• Coccidioides DxSelect™, Focus Diagnostics
* J Clin Microbiol. 1995, 33:940–3
13/28
BLASTOMİKOZ
8-15 µm
• Antijen saptama
–
–
–
–
Serum ve idrar
ARUP reference laboratories (Utah/ABD)
MiraVista Blastomyces antigen EIA
EIA duyarlılık idrar(%93.5*, %92.9**), serum (%87*, %79.3**)
• Antikor saptama
– A ve WIWI-1 antijenlerine karşı antikor aranması: EIA,
immunodifüzyon, KF (IMMY Diagnostics)
– Duyarlılık %90%90-100, özgüllük %98
* Spector D. et al. J Vet Intern Med 2008;22:839–843
** Durkin, M. et al. 2004. J. Clin. Microbiol. 42:4873-4875
14/28
PARAKOKSİDİOİDOMİKOZ
• Antijen saptama
– Gp43 ve gp70 antijen testleri
• Antikor saptama
– İmmünodifüzyon (IMMY Diagnostics)
15/28
SPOROTRİKOZ
• Antikor testi
– Lateks aglutinasyon (IMMY Diagnostics)
16/28
BETA--D GLUKAN TESTİ
BETA
• ß-D glukan, zigomiçetler
zigomiçetler ve kriptokoklar
hariç mantar duvarının bileşeni
• Test, Limulus test prensibi ile çalışır
• “horseshoe crab” ın beyaz kan hücresinin
koagülasyonuna dayanır
• <60 pg/ml negatif; ≥80 pg/ml pozitif
• Duyarlılık %52%52-100, özgüllük %45%45-100*,
NPV>%95**
NPV>%95
**
• Ig infüzyonu, hemodiyaliz, gram pozitif
bakteremi , kandida kolonizasyonu,
pip/tazobak. vb. yalancı pozitiflik nedeni
• Tür tanısına olanak vermez !!!
* Clin Infect Dis. (2011) 52 (6): 750-770.
* * J Clin Microbiol (2005) 43 (12): 5957-62
17/28
MOLEKÜLER TANI
• Sekans tabanlı moleküler tanımlama
– ITS,
– büyük alt birim rRNA dizileme
– mtDNA
• Hibridizasyon tabanlı moleküler tanımlama
– DNA array
– Accu
Accu--probe
• PCR tabanlı moleküler tanımlama
– Henüz ticari değil
18/28
Sekans tabanlı tanımlama
• MicroSEQ D2 LSU rDNA Fungal Identification Kit
– rRNA büyük alt birim D2 bölgesi
– >1000 türü içeren veri tabanı
– 24 saatten kısa sürede sonuç alma
5’
• Ticari olmayan ITS, SSU ve LSU rDNA ve mtDNA dizi analiz
çalışmaları ÇOK SAYIDA
1.3 kb
SSU
18 S rRNA
0.7 kb
ITS1
3.4 kb
LSU
5.8 S ITS2
IGS: Intergenic spacer
ITS: Internal Transcribed Spacer
ETS: External Transcribed Spacer
28 S rRNA
3.2 kb
ETS2
IGS
ETS1
19/28
Iwen PC et al. Medical Mycology, 2002, 40:87-109.
3’
Hibridizasyon Tabanlı
Tanımlama
DNA array
DNA ekstraksiyonuekstraksiyonu-spesifik PCRPCR-Hibridizasyon
• Fungi 2.1 (Chipron)
• Nanochip (Savyon Diagnostics)
Kültürden DNA ekspraksiyonuekspraksiyonu-Hibridizasyon
• Accuprobe (Gen(Gen-probe)
20/28
CHIPRON FUNGI 2.1
30 test spotu x 2
150 TL
• Aspergillus fumigatus
fumigatus,, flavus
flavus,,
niger,, nidulans
niger
nidulans,, terreus
terreus,,
versicolor
• Candida albicans
albicans,, dubliniensis
dubliniensis,,
glabrata,, guilliermondii
glabrata
guilliermondii,, kefyr
kefyr,,
krusei,, lambica
krusei
lambica,, lusitaniae
lusitaniae,,
parapsilosis,, tropicalis
parapsilosis
tropicalis,,
pelliculosa
• Mucor circinelloides
circinelloides,,
Rhizomucor pusillus
pusillus,, Absidia
corymbifera
• Rhizopus microsporus
microsporus,, oryzae
oryzae,,
stolonifer
• Cryptococcus neoformans
• Paecilomyces variotii
• Scedosporium prolificans
21/28
®
NanoChip Savyon Diagnostics
• Fungal paneli henüz YOK
• Bakteri/parazit paneli genişliyor
• Mikrobiyoloji paneli 2013’de Türkiye’de
22/28
Gen--prob
Gen
probe
e (Accuprobe) testi
• Sadece kültür doğrulama testi (C.
(C. immitis, H. capsulatum ve
B. dermatitidis)
dermatitidis)
• Hücrelerde yüksek miktarda bulunan rRNA’nın saptanması
temeline dayanmaktadır
• Floroflor ile işaretlenmiş özgün DNA probu test izolatının
rRNA’sı ile türe spesifik olarak hibridize olur
• Erken ve zayıf üremede, kontamine üremede kullanılabilir
• Pahalıdır
• AccuProbe (Gen(Gen-Probe Inc., San Diego, CA) adı altında kit
olarak pazarlanmaktadır.
23/28
PCR TABANLI MOLEKÜLER
TANI
24/28
Aspergillus PCR
• 200’den fazla tür barındıran Aspergilus cinsi/60 tür önemli
• PCR testleri 20 yılı aşkın süredir kullanımdakullanımda-Ticari ürün YOK
• Standardize değil [European
[European Organization for Research and
Treatment of Cancer and the Mycoses Study Group
(EORTC/MSG)’’ un invasiv fungal hastalık tanı kriteri değil]
(EORTC/MSG)
• International Society for Human and Animal Mycoses (ISHAM)’
(ISHAM)’
ın European Aspergillus PCR Initiative (EAPCRI) çalışma grubu
standardizasyon için uğraşıyor.
• DNA ekstraksiyon safhasında sorunlar mevcut. Yüksek kan
hacmi kullanımı, DNA’nın küçük hacimde çözülmesi öneriliyor *
• Konidiya eklenmiş serum gerçeği yansıtmıyor (hifal
angioinvazyon--multinükleer!!!)
angioinvazyon
25/28
* J CLIN MICROBIOL (2010), 48(4):1231–40
Candida PCR
• 170’den fazla tür barındıran Candida cinsinde 20 kadar tür
sıklıkla izole edilmektedir
• Ticari ürün veya üzerinde uzlaşı sağlanmış PCR protokolu
YOK
• Real
Real--time PCR, multipleks PCR, erime eğrisi analizleri ve PCRPCRRFLP gibi yöntemler ile tür tanımlaması yapılıyor
26/28
PCR ÇALIŞMALARI
• DNA ekstraksiyonunda sorunlar
– Etkinlik
– Standardizasyon
• Çok kopya genlerin kullanılması duyarlılığı 
• Tür çeşitliliğiçeşitliliği- multipleks yaklaşımlar sınırlı
katkı
• Kolonizan/enfekte eden/kontaminan ayırımı
zor
27/28
Download

Antikor saptama