PLATELIA™ Aspergillus IgG
96 TESTOV
62783
DETEKCIA ANTI-ASPERGILOVÝCH IgG PROTILÁTOK V ĽUDSKOM SÉRE ALEBO PLAZME
POUŽITÍM IMUNOENZYMATICKEJ METÓDY
1- POUŽITIE
Platelia™ Aspergillus IgG je nepriama mikroplatničková imunoenzymatická technika na detekciu anti-aspergilových IgG
protilátok v ľudskom sére alebo plazme.
2- INDIKÁCIA NA POUŽITIE
Platelia™ Aspergillus IgG je test, ktorý – pokiaľ je interpretovaný na základe klinického a terapeutického kontextu
pacienta a vykonaný spoločne s ďalšími diagnostickými technikami, napr. rádiologickým, cytologickým, imunologickým a
mykologickým vyšetrením – môže byť použitý ako pomôcka pri diagnostike aspergilovej patológie.
3- KLINICKÝ VÝZNAM
Pri imunokompetentných subjektoch je možné nájsť rôzne chronické aspergilové patológie a ich diagnóza je často
náročná.
Proces senzibilizácie plesní je príčinou alergických prejavov, ako je astma, alergická bronchopulmonálna aspergilóza
(ABPA), ktorá reprezentuje najhoršiu klinickú formu 4, 8. Pacienti postihnutí mukoviscidózou tvoria populáciu
exponovanú riziku ABPA, a sú pravidelne monitorovaní ohľadne tejto diagnózy 1, 2.
Pri subjektoch vystavených masívnemu vdychovaniu spór je možné stretnúť sa s vonkajšou alveolitídou; medzi
najznámejšie formy patrí choroba chovateľov vtákov a pľúcne ochorenie farmárov.
Aspergilóm predstavuje najtypickejšiu nealergickú chronickú patológiu, ktorá je výsledkom kolonizácie postihnutej
pľúcnej dutiny (tuberkulóza, emfyzém, sarkoidóza, karcinóm pľúc) hubovými mycéliami tvoriacimi tzv. „aspergilový bal“
4, 6, 10.
V súvislosti s inými nealergickými patológiami predstavuje chronická nekrotická aspergilóza mimoriadne závažnú
progresívnu smrteľnú formu.
Pri týchto rôznych klinických prejavoch, či už alergických alebo nealergických, je diagnostika aspergilózy často ťažká.
Dôvodom je skutočnosť, že klinické príznaky môžu poukazovať na iné mykotické, bakteriálne, vírusové, či dokonca
zhubné postihnutie. Rádiologické vyšetrenie, ktoré je charakteristické pre aspergilóm, je menej preukazné pre iné formy
aspergilózy, kde klinické a rádiologické vyšetrenie predstavuje iba určité elementy pri diagnostickej orientácii.
Pre podporu tejto diagnózy sú nevyhnutné biologické parametre, najmä sérologické testy 5. V dôsledku toho pri
pacientoch s rizikom aspergilómu, závažnej, avšak často klinicky latentnej infekcie, je dôležité sérologické
monitorovanie. Niektoré diagnózy ABPA sú založené na piatich kritériách, vrátane sérologickej detekcie anti-aspergilovej
protilátky 13.
Platelia™ Aspergillus IgG je test slúžiaci na detekciu imunoglobulínov triedy G, namierený proti rekombinantnému
purifikovanému
aspergillovému antigénu. Predstavuje nástroj pre diagnostickú pomoc pri tých chronických formách aspergilózy, ktoré sú
pozorované pri imunokompetentných subjektoch 3. Okrem toho prítomnosť anti-aspergilových protilátok bola nedávno
popísaná pri onkohematologických pacientoch pred zavedením imunosupresívnej liečby pre transplantáciu kostnej
drene. Tieto štúdie odporúčajú detekciu kolonizácie aspergilom, keď je pacient prijatý do nemocnice alebo po zvážení
pred transplantáciou pri tých pacientoch, ktorí sa stanú rizikovou populáciou pre invazívnu aspergilózu po začatí
imunosupresívnej liečby.
4- PRINCÍP POSTUPU
Platelia™ Aspergillus IgG je dvojfázová nepriama mikroplatničková imunoenzymatická technika používaná na detekciu
anti-aspergilových IgG protilátok v ľudskom sére alebo plazme.
Vzorky zriedeného séra alebo plazmy sú nanesené do jamôk mikroplatničiek senzibilizovaných purifikovaným
rekombinantným aspergilovým antigénom 7.
Po inkubácii pri teplote 37 °C sa stripy sa premyjú, aby sa odstránil všetok voľný materiál.
Do každej jamky sa pridá konjugát (myšia monoklonálna protilátka proti ľudskému IgG značená peroxidázou) a inkubuje
sa pri teplote 37 °C.
Pokiaľ je v ľudskej vzorke prítomný IgG anti-Aspergillus, vytvorí sa komplex: Ag Aspergillus - ľudský IgG anti-Aspergillus
– myšia anti-humánna IgG Ab/peroxidáza.
Stripy sa premyjú, aby sa odstránil všetok voľný materiál. Pridanie chromogénu obsahujúceho peroxidázový substrát a
inkubácia pri izbovej teplote sa používa na detekciu komplexov, ktoré sa mohli vytvoriť.
Táto enzymatická reakcia sa zastaví pridaním 1N kyseliny sírovej.
Na odčítanie optickej hustoty sa použije spektrofotometer nastavený na 450/620 nm.
1
5- REAGENCIE
Reagencie sa dodávajú v dostatočnom množstve na vykonanie 96 testov v maximálne 9 testovacích cykloch.
Podmienky uchovávania a čas použiteľnosti reagencií nájdete na škatuli s popisom indikácií.
Pred použitím nechajte všetky reagencie stabilizovať na izbovú teplotu (+18 - 30 °C).
Ihneď po použití reagencie ochlaďte na teplotu +2 - 8 °C. Nepoužité stripy vráťte do originálneho vrecúška a starostlivo
uzavrite. Neodstraňujte desikant.
Označenie
R1
Microplate
R2
Concentrated
Washing Solution
(20x)
R3
Calibrator 0
R4a
Calibrator 10
R4b
Calibrator 20
R4c
Calibrator 40
R4d
Calibrator 80
R6
Conjugate
R7a
Sample
Diluent 1
R7b
Sample
Diluent 2
R9
Chromogen TMB
R10
Stopping Solution
Typ reagencie
Mikroplatnička:
- 96 jamôk (12 stripov po 8 jamkách)
senzibilizovaných purifikovaným rekombinantným
aspergilovým antigénom.
Koncentrovaný premývací roztok (2 0x):
- Tris pufer NaCl (pH 7,4)
-2 % Tween® 20
- Konzervačné činidlo: < 1,5 % ProClin™ 300
Kalibrátor 0 AU/ml (pripravený na použitie):
- Tris pufer NaCl neobsahuje IgG anti-Aspergillus
- Konzervačné činidlo: < 1,5 % ProClin™ 300
Kalibrátor 10 AU/ml (pripravený na použitie):
- ľudské sérum obsahujúce anti-aspergilové protilátky
- Konzervačné činidlo: < 1,5 % ProClin™ 300
Kalibrátor 20 AU/ml (pripravený na použitie):
- ľudské sérum obsahujúce anti-aspergilové protilátky
- Konzervačné činidlo: < 1,5 % ProClin™ 300
Kalibrátor 40 AU/ml (pripravený na použitie):
- ľudské sérum obsahujúce anti-aspergilové protilátky
- Konzervačné činidlo: < 1,5 % ProClin™ 300
Kalibrátor 80 AU/ml (pripravený na použitie):
- ľudské sérum obsahujúce anti-aspergilové protilátky
- Konzervačné činidlo: < 1,5 % ProClin™ 300
Konjugát (pripravený na použitie)
- Myšia monoklonálna protilátka proti ľudskému IgG
značená peroxidázou
- Fenolová červeň
- Konzervačné činidlo: < 1,5 % ProClin™ 300
Riedidlo vzoriek 1 (pripravené na použitie):
- Tris pufer NaCl,
- 0,1 % Tween® 20,
- Fenolová červeň
- Konzervačné činidlo: < 1,5 % ProClin™ 300
Riedidlo vzoriek 2 (pripravené na použitie):
- Tris pufer NaCl,
- 0,1 % Tween® 20,
- brómkrezolová modrá,
- Konzervačné činidlo: < 1,5 % ProClin™ 300
Chromogénny roztok TMB (pripravený na použitie)
- roztok 3,3’, 5,5’ - tetrametylbenzidín (< 0,1 %), H2O2
(<1,0 %)
Zastavovací roztok (pripravený na použitie):
- 1N roztok kyseliny sírovej
Adhezívne krycie fólie
Prezentácia
1
1 x 70 ml
1 x 2,5 ml
1 x 2,5 ml
1 x 2,5 ml
1 x 2,5 ml
1 x 2,5 ml
1 x 26 ml
1 x 28 ml
1 x 26 ml
1 x 28 ml
1 x 28 ml
4
6- POKYNY OHĽADNE ZDRAVIA A BEZPEČNOSTI
1.
2.
3.
4.
5.
Výhradne pre diagnostické použitie in vitro.
Určené iba na profesionálne použitie.
Použitie tohto testu s inými vzorkami než je ľudské sérum alebo plazma sa neodporúča.
Kalibrátory R4a, R4b, R4c a R4d sú pripravené z ľudského séra negatívneho na anti-HIV-1, anti-HIV-2 a anti-HCV
protilátky a HBs protilátky použitím CE označených testov. Napriek tomu je potrebné so všetkými reagenciami
zaobchádzať ako s potenciálne infekčnými materiálmi. Všetky testy musia byť vykonávané v súlade s normou
OSHA týkajúcou sa patogénnych činidiel prenášaných krvou, biologickej bezpečnosti úrovne 2 alebo v súlade s
ostatnými prijatými postupmi biologickej bezpečnosti.
Používajte ochranný odev vrátane laboratórneho plášťa, prostriedky na ochranu očí a tváre, rukavíc na jedno
použitie (sú odporúčané rukavice vyrobené zo syntetických materiálov neobsahujúcich latex). S reagenciami v
súprave a so vzorkami pacienta manipulujte v súlade s vyžadovanými zásadami správnej laboratórnej praxe (SLP).
Po vykonaní testu si dôkladne umyte ruky.
2
6.
7.
8.
9.
Nepipetujte ústami.
V priestoroch, v ktorých sa manipuluje so vzorkami alebo reagenciami súpravy, nefajčite, nepite ani nejedzte.
Zamedzte rozliatiu vzoriek alebo roztokov.
Povrchy pošpinené kontaminovanou tekutinou, ktorá neobsahuje kyselinu, musia byť starostlivo vyčistené použitím
účinného dezinfekčného prostriedku. Dezinfekčné prostriedky, ktoré je možné použiť, obsahujú (avšak nie sú
obmedzené iba na) roztok javelskej vody zriedenej na 10 % (0,5 % roztok chlórnanu sodného), 70 % etanolu alebo
0,5 % Wescodynu Plus™. Materiál používaný na čistenie sa musí zlikvidovať v špeciálnej nádobe na
kontaminovaný odpad.
POZOR: Roztoky obsahujúce javelskú vodu nikdy nevkladajte do parného sterilizátora.
10. Ak je kontaminujúcou kvapalinou kyselina, pošpinené povrchy sa musia utrieť alebo neutralizovať použitím
bikarbonátu sodného a miesto sa musí opláchnuť a vysušiť. Ak kontaminujúca kvapalina obsahuje biologicky
nebezpečný materiál, miesto umyte chemickým dezinfekčným prostriedkom.
11. Všetky vzorky a reagencie použité na tento test zlikvidujte ako potenciálne infekčné materiály. Nebezpečné
chemické a biologické odpady sa musia zlikvidovať v súlade s platnými predpismi.
12. POZOR: Potenciálne chemické riziká niektorých komponentov súpravy sú uvedené nižšie (pozrite kapitolu 5 –
REAGENCIE)
Niektoré reagencie obsahujú ProClinTM 300 < 1,5 %:
R43: Môže spôsobiť senzibilizáciu pri kontakte s pokožkou.
S23-24-37-60: Nevdychujte pary/aerosóly. Zabráňte kontaktu s pokožkou. Noste vhodné rukavice. Tento
materiál a príslušná nádoba musia byť zlikvidované ako nebezpečný odpad.
Xi-Dráždivý
13. Karta bezpečnostných údajov (KBÚ) je k dispozícii na požiadanie.
7- BEZPEČNOSTNÉ OPATRENIA PRE UŽÍVATEĽOV
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
ZMRAZENÉ VZORKY SÉRA UCHOVÁVANÉ V NEZNÁMYCH PODMIENKACH MÔŽU VYKAZOVAŤ FALOŠNE
POZITÍVNE VÝSLEDKY VZHĽADOM NA MOŽNOSŤ KONTAMINÁCIE PLESŇAMI A/ALEBO BAKTÉRIAMI.
Nepoužívajte súpravu ani žiadne z reagencií po dátume použiteľnosti súpravy.
Nemiešajte ani nekombinujte reagencie zo škatúľ s rôznymi číslami šarží počas rovnakého cyklu.
POZNÁMKA: Môžete používať aj iné šarže premývacieho roztoku (R2, označeného * zeleno ako 20 x),
chromogénu (R9, označeného * tyrkysovo ako TMB) a zastavovacieho roztoku (R10, označeného * červeno
ako 1N), než je stanovené za predpokladu, že používate reagencie, ktoré presne zodpovedajú jednej a tej
istej šarži počas rovnakého cyklu.
POZNÁMKA: Premývací roztok (R2 označený * zeleno ako 20 x) nesmie byť zmiešaný s premývacím
roztokom (R2 * označený modro ako 10 x) dodávaným v súprave s reagenciami Bio-Rad.
* na štítku fľaštičky
Pred nadávkovaním nechajte reagencie 30 minút vytemperovať na izbovú teplotu (+18 až +30 °C).
Použite pokiaľ možno jednorazové vybavenie. Pokiaľ to nie je možné, použite dôkladne umyté a destilovanou
vodou vypláchnuté sklenené nádoby.
Skontrolujte, či sú pipety presné a či používané prístroje pracujú správne.
Reagenciu R2 opatrne rozpusťte; zamedzte pritom kontaminácii.
Enzymatická reakcia je veľmi citlivá na akékoľvek kovy alebo ióny kovov.
V dôsledku toho nesmie žiadny kovový prvok prísť do styku s rôznymi roztokmi obsahujúcimi konjugát alebo roztok
substrátu.
Pri pipetovaní kalibrátorov a vzoriek použite novú pipetovaciu špičku na každú jamku, aby sa zabránilo
kontaminácii.
Pre zaistenie dostatočného premytia jamôk dodržte odporúčaný počet premývacích cyklov a zaistite, aby sa všetky
jamky celkom zaplnili a potom celkom vyprázdnili. Preplachovanie by sa malo vykonávať použitím premývačky
mikroplatničiek.
Nedovoľte, aby mikroplatnička vyschla v období medzi ukončením premývacieho cyklu a pridaním reagencií.
Nepoužívajte rovnakú fľašu na konjugát a vyvíjací roztok.
Počas uchovávania alebo inkubácie zamedzte expozícii chromogénneho alebo vyvíjacieho roztoku silnému svetlu.
Nedovoľte, aby sa roztoky obsahujúce chromogén dostali do styku s oxidačným činidlom.
Chromogén (R9) musí byť bezfarebný. Modré sfarbenie znamená, že je reagencia nepoužiteľná a musí sa vymeniť.
Zamedzte kontaktu zastavovacieho roztoku s oxidačným činidlom, kovom alebo iónmi kovov.
Nevyužitý prebytočný konjugát nevracajte do originálnej fľaštičky.
8- PRÍPRAVA REAGENCIÍ A UCHOVÁVANIE
Mikroplatnička (R1)
Každý rámik obsahujúci 12 stripov je zabalený do vrecúška. Nožnicami rozstrihnite vrecúško tesne pod spojom. Otvorte
vrecúško a vyberte rámik. Rámik obsahujúci nepoužité stripy vložte späť do pôvodného vrecúška. Vrecúško opatrne
uzavrite a vložte na miesto pri teplote +2 - 8 °C.
Po otvorení vákuovo zataveného vrecúška sú stripy stabilné počas 8 týždňov, ak sa uchovávajú v starostlivo
uzatvorenom originálnom vrecúšku pri teplote +2 – 8 °C. Skontrolujte, či je desikant stále prítomný.
3
Premývací roztok (R2)
Pripravte premývací roztok zriedením koncentrovaného roztoku (20 x) v destilovanej vode: 50 ml R2 v 950 ml
destilovanej vody. (Pre celú platničku s 12 stripmi použite 650 ml nariedeného premývacieho roztoku, okrem mŕtveho
objemu použitej premývačky). Po nariedení je možné premývací roztok uchovávať počas 14 dní pri teplote +2 - 30 °C.
Po otvorení je koncentrovaný premývací roztok stabilný do skončenia doby použiteľnosti vyznačenej na štítku, ak sa
uchováva pri teplote +2 – 30 °C a ak nie je kontaminovaný.
Kalibrátor 0 (R3), kalibrátor 10 (R4a), kalibrátor 20 (R4b), kalibrátor 40 (R4c), kalibrátor 80 (R4d):
Kalibrátory sú pripravené na použitie.
Po otvorení sú reagencie stabilné počas 8 týždňov, ak sú uchovávané pri teplote +2 - 8 °C a ak nie sú kontaminované.
Konjugát (R6), riedidlo vzoriek 1 (R7a), riedidlo vzoriek 2 (R7b), chromogénny roztok TMB (R9):
Tieto reagencie pripravené na použitie.
Po otvorení sú reagencie stabilné počas 8 týždňov, ak sú uchovávané pri teplote +2 - 8 °C a ak nie sú kontaminované.
Zastavovací roztok (R10):
Táto reagencia je pripravená na použitie.
Po otvorení je táto reagencia stabilná do skončenia doby použiteľnosti vyznačenej na štítku, ak sa uchováva pri teplote
+2-8 °C a ak nie je kontaminovaná.
9 - VZORKY
1.
2.
3.
4.
Testy sa vykonávajú na vzorkách séra alebo plazmy odobraných v antikoagulantoch obsahujúcich EDTA, heparín
alebo citrát.
Pri odoberaní, spracovaní a uchovávaní týchto krvných vzoriek dodržujte nasledujúce zásady:
• Odoberte krvnú vzorku v súlade so zavedenou praxou.
• Pri sére umožnite, aby sa pred centrifúgovaním vytvorila zrazenina.
• Skúmavky uchovávajte uzatvorené.
• Po centrifúgovaní separujte sérum alebo plazmu a uchovávajte v utesnenej skúmavke.
• Vzorky je možné uchovávať pri teplote +2 - 8 °C, ak sa test vykoná do 4 dní.
• Ak sa test nevykoná do 4 dní, vzorky sa zmrazia na teplotu -20 °C (alebo -80 °C).
• Nemali by ste vykonávať viac než päť cyklov zmrazenia/rozmrazenia. Po rozmrazení a pred vykonaním testu je
nutné vzorky starostlivo homogenizovať (použitím vortexovej trepačky).
Výsledky nie sú ovplyvnené vzorkami obsahujúcimi 90 mg/l bilirubínu alebo 100 mg/l konjugovaného bilirubínu,
lipemickými vzorkami obsahujúcimi ekvivalentné množstvo 36 g/l trioleinu (triglyceridu) alebo hemolyzovanými
vzorkami obsahujúcimi 10 mg/ml hemoglobínu.
Vzorky nezahrievajte.
10- POSTUP
Poskytnuté vybavenie
Pozrite kapitolu REAGENCIE.
Potrebné vybavenie, ktoré nie je súčasťou dodávky
1. Sterilná destilovaná alebo demineralizovaná voda na zriedenie koncentrovaného premývacieho roztoku.
2. Absorpčný papier.
3. Jednorazové rukavice.
4. Ochranné okuliare.
5. Chlórnan sodný (javelská voda) a bikarbonát sodný.
6. Automatické alebo poloautomatické pipety alebo multipipety nastaviteľné alebo vopred nastavené na odmeranie a
nadávkovanie objemov 10 µl až 1000 µl, 1 ml, 2 ml a 10 ml.
7. Odmerné skúmavky s objemom 25 ml, 50 ml, 100 ml a 1000 ml.
8. Jednorazové skúmavky.
9. Nádoba na likvidáciu kontaminovaného odpadu.
10. Vortexová trepačka.
11. Inkubátor mikroplatničiek nastaviteľný na teplotu 37 ± 1 °C (*).
12. Poloautomatická alebo automatická premývačka mikroplatničiek (*).
13. Čítačka mikroplatničiek vybavená filtrami 450 nm a 620 nm (*).
(*) Podrobnosti ohľadne špecifických informácií o potrebnom vybavení vám poskytne naše technické oddelenie.
Postup EIA
Dodržujte stanovený protokol.
Dodržujte zásady správnej laboratórnej praxe:
- Pred použitím nechajte všetky reagencie vytemperovať na izbovú teplotu (18 – 30 °C) na čas najmenej 30 minút.
- Používajte vždy všetky kalibrátory, keď sa dávka použije na validáciu testu.
4
Postupujte nasledujúcim spôsobom:
1. Starostlivo stanovte schému nanášania a identifikácie kalibrátorov a vzoriek pacientov.
2. Testované vzorky najskôr predrieďte: v pomere 1/20, t. j. 10 μl séra alebo plazmy + 190 μl riedidla vzoriek 1 (R7a).
Predriedenie vzoriek spôsobí červené sfarbenie.
3. Vyberte rámik a stripy (R1) z ochranného obalu. Nepoužité stripy vložte do obalu a obal uzavrite.
4. Do jamôk určených na testované vzorky naneste 190 μl riedidla vzoriek 2 (R7b) a pridajte 10 μl predriedených
vzoriek v pomere 1/20, opatrne opakovane 2 alebo 3-krát premiešajte.
POZNÁMKA: V tejto fáze postupu je možné nanášanie kontrolovať, pretože po pridaní 10 μl predriedených
vzoriek sa jamky obsahujúce vzorky sfarbia do sivej farby. Jamka, ktorá neobsahuje žiadnu vzorku, má farbu
fialovomodrú.
5.
Podľa nasledujúcej schémy naneste kalibrátory pripravené na použitie (200 μl na jamku):
- A1: Kalibrátor 0 (R3)
- B1: Kalibrátor 10 AU/ml (R4a)
- C1: Kalibrátor 20 AU/ml (R4b)
- D1: Kalibrátor 40 AU/ml (R4c)
- E1: Kalibrátor 80 AU/ml (R4d)
A
B
C
D
E
F
G
H
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
1
R3
R4a
R4b
R4c
R4d
S1
S2
S3
2
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
3
S12
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Mikroplatničku prikryte adhezívnou krycou fóliou a pevne zatlačte celý povrch pre zaistenie tesnosti.
Mikroplatnčku okamžite inkubujte v suchom inkubátore mikroplatničiek počas 60 ± 5 minút pri teplote 37 °C
(± 1 °C).
Pripravte nariedený premývací roztok (pozrite kap. 8).
Odstráňte adhezívnu kryciu fóliu. Odsajte obsah všetkých jamôk do nádoby na kontaminovaný odpad (obsahujúcej
chlórnan sodný).
Mikroplatničku 4 krát premyte v premývačke mikroplatničiek (s 800 µl nariedeného premývacieho roztoku). Po
poslednom premytí mikroplatničku obráťte a odstráňte zvyšnú tekutinu opatrným poklepaním na absorpčný papier.
Pred použitím homogenizujte obsah fľaštičky R6 prevrátením. Ak používate viackanálovú pipetu, naberte iba objem
potrebný na vykonanie príslušného cyklu: použite 3,5 ml pre dva stripy po 8 jamkách.
Do každej jamky pridajte 200 µl konjugátu R6.
Mikroplatničku prikryte adhezívnou krycou fóliou a pevne natlačte celý povrch pre zaistenie tesnosti.
Mikroplatničku inkubujte v suchom inkubátore počas 60 ± 5 minút pri teplote 37 °C (± 1 °C).
Odstráňte adhezívnu kryciu fóliu. Odsajte obsah všetkých jamôk do nádoby na kontaminovaný odpad (obsahujúcej
chlórnan sodný).
Mikroplatničku 4 krát premyte v premývačke mikroplatničiek (s 800 µl nariedeného premývacieho roztoku). Po
poslednom premytí mikroplatničku obráťte a odstráňte zvyšnú tekutinu opatrným poklepaním na absorpčný papier.
Do každej jamky rýchlo pridajte 200 µl chromogénneho roztoku TMB (R9), pričom zamedzte expozícii ostrému
svetlu.
Mikroplatničku inkubujte v tme počas 30 ± 5 minút pri izbovej teplote (+18 - 30 °C). Počas tejto fázy inkubácie
nepoužívajte adhezívnu kryciu fóliu.
Do každej jamky pridajte 100 µl zastavovacieho roztoku (R10) použitím rovnakého sledu a rýchlosti nanášania, aké
boli použité pre substrátový roztok. Dobre premiešajte.
Spodok každej mikroplatničky dôkladne utrite.
Odčítajte optickú hustotu každej jamky pri 450 nm (referenčný filter pri 620 nm) do 30 minút po pridaní
zastavovacieho roztoku (pred odčítaním musia byť stripy vždy uložené tak, aby boli chránené pred priamym
slnečným svetlom).
Pred zapísaním výsledkov skontrolujte zhodu medzi výtlačkom z čítačky a schémou nanášania mikroplatničiek.
11- KONTROLA KVALITY (VALIDAČNÉ KRITÉRIÁ)
Pri vykonávaní testu vždy používajte kalibrátory pre každú mikroplatničku.
Pre validáciu stanovenia musia byť splnené nasledujúce kritériá:
• Hodnota optickej hustoty (OD):
OD R4a > 0,200
5
• Pomery:
OD R4a / OD R3 > 3,00
OD R4b / OD R4a > 1,20
OD R4c / OD R4b > 1,20
OD R4d / OD R4c > 1,00
12- INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV
Vytvorenie kalibračnej krivky
Kalibračná krivka je definovaná použitím 5 bodov hodnôt (kalibrátory) 0, 10, 20, 40 a 80 AU/ml.
Nakreslite kalibračnú krivku [OD = funkcia (AU/ml)] zaznamenaním OD pre kalibrátory R3, R4a, R4b, R4c a R4d na
zvislú os (os Y) a potom zaznamenaním ich príslušných koncentrácií v AU/ml na vodorovnú os (os X). Bod po bode
vytvorte krivku prepojením rôznych bodov hodnôt.
Stanovenie koncentrácie anti-aspergilových IgG protilátok (AU/ml) testovaných vzoriek
Koncentráciu anti-aspergilových IgG protilátok vyjadrená v AU/ml je možné stanoviť pre každú testovanú vzorku z krivky
vytvorenej v časti 12.
Interpretácia výsledkov
•
Vzorky s koncentráciami nižšími než 5 AU/ml (C < 5) sú považované za negatívne na prítomnosť anti-aspergilovej
IgG protilátky.
•
Vzorky s koncentráciami medzi 5 a 10 AU/ml (5 ≤ C < 10) sú považované za intermediálne na prítomnosť antiaspergilovej IgG protilátky.
•
Vzorky s koncentráciami vyššími alebo rovnajúcimi sa 10 AU/ml (C ≥10) sú považované za pozitívne na
prítomnosť anti-aspergilovej IgG protilátky.
Body hodnôt použité na vykreslenie kalibračnej krivky nie je možné použiť na získanie presnej titrácie koncentrácií
väčších než 80 AU/ml.
Ak chcete stanoviť titer vysoko pozitívnych vzoriek presnejšie, stanovenie musíte začať znovu vykonaním ďalších
predriedení vzorky zriedením R7a:
Pre vzorku s titrom > 80 AU/ml a s OD < 3,000: najskôr predrieďte vzorku v R7a v pomere 1/5.
Pre vzorky s titrom > 80 AU/ml a s OD ≥ 3,000: najskôr predrieďte vzorku v R7a v pomere 1/60.
Po tomto počiatočnom predriedení pokračujte v súlade s postupom uvedeným v odseku 10 (predriedenie v R7a v
pomere 1/20 a potom zriedenie v R7b v pomere 1/20).
Titer vysoko pozitívnej vzorky sa vypočíta vynásobením získaného titra faktorom predriedenia (t. j.: 5 alebo 60 podľa
vykonaného predriedenia).
„Intermediálny“ výsledok je možné potvrdiť inou vzorkou odobranou od pacienta v priebehu 2 - 3 týždňov od odobrania
vzorky, ktorá poskytla intermediálny titer.
Pri sérologickom monitorovaní pacienta odporúčame otestovať všetky vzorky pacienta v rovnakom cykle pre zistenie
signifikantných odchýliek v titroch anti-aspergilových IgG protilátok.
13 - OBMEDZENIA POSTUPU
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Negatívny výsledok nemôže vylúčiť diagnózu aspergilózy. Diagnózu aspergilózy je možné urobiť až po
preštudovaní klinických, terapeutických, rádiologických, cytologických, priamych mykologických a sérologických
výsledkov, pričom je nutné interpretovať každý izolovaný prvok s opatrnosťou.
Pri imunokompetentnom pacientovi s podozrením na aspergilózu môže byť vzorka odobraná na začiatku ochorenia
infekciou plesní Aspergillus negatívna na detekciu anti-aspergilového IgG. Preto sa odporúča nový test zo vzorky
odobranej v dvojtýždennom alebo trojtýždennom intervale.
Postup a interpretácia výsledkov popísaných pre test Platelia™ Aspergillus IgG sa musí monitorovať, ak sú vzorky
testované na prítomnosť anti-aspergillových IgG protilátok. Odporúčame, aby si užívateľ súpravy pred testom
starostlivo prečítal príbalovú informáciu. Je nutné dôsledne dodržať protokol na pipetovanie vzoriek a reagencií,
premývanie platničky a inkubačné doby.
Falošne negatívny výsledok môže byť získaný v prípade, že vzorky a reagencie nie sú pridané tak, ako je uvedené
v príbalovej informácii. V prípade procedurálnej chyby sa musí testovať nová vzorka od rovnakého pacienta.
Ku kontaminácii jamôk s negatívnymi vzorkami pacienta jamkami obsahujúcimi pozitívne vzorky pacienta alebo
vzorkami pacienta môže dôjsť vtedy, ak sa obsah jednej jamky dostane do druhej jamky pri nešetrnom
zaobchádzaní s mikroplatničkou alebo kvôli zlej technike pipetovania pri pridávaní reagencií.
Účinnosť výsledkov testu Platelia™ Aspergillus IgG nebola vyhodnocovaná pri vzorkách séra alebo plazmy
novorodencov a detských pacientov.
Účinnosť testu Platelia™ Aspergillus IgG nebola stanovená pre manuálne odčítanie a/alebo vizuálne stanovenie
výsledkov.
6
14 - OČAKÁVANÉ HODNOTY
Prevalencia anti-Aspergillus IgG meraná pomocou testu Platelia™ Aspergillus IgG bola vyhodnotená použitím panelu
129 vzoriek od 64 francúzskych pacientov trpiacich cystickou fibrózou a predstavujúcich riziko aspergilovej infekcie. Z
celkového počtu 129 vzoriek bolo 53 pozitívnych a 12 intermediálnych pre prevalenciu 53/129 = 41,1 % [95 % CI: 32,5 50,1 %] pri zvážení intermediálnych výsledkov ako negatívnych a 65/129 = 50,4 % [95 % CI: 41,4 - 59,3 %] pri zvážení
intermediálnych výsledkov ako pozitívnych. Z hľadiska pacientov, z celkového počtu 64 testovaných vzoriek obsahovalo
29 vzoriek aspoň 1 pozitívnu vzorku a 5 vzoriek najmenej 1 intermediálnu vzorku a žiadne pozitívne vzorky, pre
prevalenciu 29/64 = 45,3 % [95 % CI: 32,8 - 58,3 %] pri zvážení intermediálnych výsledkov ako negatívnych a 34/64 =
53,1% [95 % CI: 40,2 - 65,7 %] pri zvážení intermediálnych výsledkov ako pozitívnych.
15- FUNKČNÉ CHARAKTERISTIKY
A. Štúdia reprodukovateľnosti
• Presnosť v rámci testu (opakovateľnosť):
Pre vyhodnotenie opakovateľnosti v rámci testu („intra-assay“) bola testovaná jedna negatívna a päť pozitívnych vzoriek
32-krát v rovnakom cykle. Titer v AU/ml sa určil pre každú vzorku. Priemerná hodnota titrov, štandardná odchýlka (SD)
a variačný koeficient (% CV) pre každú vzorku sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:
Presnosť v rámci testu (opakovateľnosť):
Slabo
Negatívna
N = 332
pozitívna
vzorka
vzorka č. 1
Priemer
2,44
9,31
(AU/ml)
SD
0,067
0,320
CV %
2,7 %
3,4 %
Slabo
pozitívna
vzorka č. 2
Slabo
pozitívna
vzorka č. 3
Stredne
pozitívna
vzorka
Vysoko
pozitívna
vzorka
10,31
13,64
31,69
43,10
0,218
2,1 %
0,387
2,8 %
0,939
3,0 %
1,546
3,6 %
• Presnosť medzi testami (opakovateľnosť):
Pre vyhodnotenie reprodukovateľnosti medzi testami („inter-assay“) bol testovaný každý zo šiestich vzoriek (jeden
negatívny a päť pozitívnych vzoriek) dvojmo vo dvoch cykloch denne počas 20 dní. Titer v AU/ml sa určil pre každú
pozitívnu vzorku. Negatívna vzorka je vyjadrená pomerom.
Priemerná koncentrácia pomerov, štandardná odchýlka (SD) a variačný koeficient (% CV) pre každú vzorku sú uvedené
v nasledujúcej tabuľke:
Presnosť medzi testami (reprodukovateľnosť):
Slabo
Negatívna
N = 80
pozitívna
vzorka
vzorka č. 1
Priemer
1,88
3,60
(AU/ml)
SD
0,26
0,46
CV %
13,8
12,8
Slabo
pozitívna
vzorka č. 2
Slabo
pozitívna
vzorka č. 3
Stredne
pozitívna
vzorka
Vysoko
pozitívna
vzorka
6,99
12,34
32,49
51,65
0,92
13,1
1,49
12,1
5,25
16,2
7,65
14,8
B. Skrížené reakcie
Patológia
Počet testovaných vzoriek
Počet pozitívnych vzoriek
Anti-Candida protilátky
54
2*
Anti-ds-DNA protilátky
10
0
ANA pozitívne
10
0
Myelom IgG
10
0
Toxoplazma IgG
10
0
Ľudské anti-myšie protilátky
12
0
HIV
10
0
Reumatoidný faktor
10
0
* Dve séra testované pozitívne boli potvrdené komerčnou súpravou pre stanovenie anti-aspergilových IgG protilátok.
C. Linearita
Lineárny dynamický rozsah dávky Platelia™ Aspergillus IgG by stanovený medzi 2 a 80 UA/ml použitím štúdií riedenia
vykonaných na 5 pozitívnych vzorkách.
D. Klinické štúdie
Výkonnostné charakteristiky súpravy Platelia™ Aspergillus IgG boli vyhodnotené na 2 pracoviskách pri celkovom počte
499 vzoriek od 329 pacientov.
7
SENZITIVITA
Senzitivita bola stanovená použitím panelu 277 vzoriek z 2 pracovísk vo Francúzsku, a boli rozdelené nasledovne:
• Na pracovisku 1 bolo testovaných 129 sér od 64 pacientov trpiacich cystickou fibrózou a predstavujúcich vysoké riziká
alergickej bronchopulmonálnej aspergilózy (ABPA).
• Na pracovisku 2 bolo testovaných 148 sér od 43 pacientov trpiacich závažnou chronickou aspergilózou.
Výsledky pracoviska 1
Nižšie uvedená tabuľka zhŕňa výsledky získané na pracovisku 1 pri populácii pacientov trpiacich cystickou fibrózu, pri
ktorých bola stanovená diagnóza ABPA na základe klinických údajov, s výsledkami celkového IgE, aspergilovej
elektrosynerézy, detekciou aspergilových antigénov a detekciou anti-aspergilových IgG protilátok s komerčným testom
EIA iným než Platelia ™ Aspergillus IgG. Pacienti boli zaradení do 4 kategórií: neprítomnosť ABPA, skoršia ABPA,
podozrenie na ABPA a potvrdené ABPA 9, 11. Neprítomnosť ABPA však neznamená vylúčenie inej aspergilovej
patológie 12. Stav pacienta s aspergilovou elektrosynerézou alebo Platelia ™ Aspergillus IgG bol považovaný za
pozitívny, ak bola aspoň jedna zo vzoriek pacienta pozitívne testovaná zodpovedajúcou metódou. Inak bol stav
považovaný za intermediálny, ak bola aspoň jedna z testovaných vzoriek pacienta intermediálna a negatívny, ak boli
všetky testované vzorky pacienta negatívne.
Výsledky elektrosynerézy
Kategórie
pacientov
49 pacientov
bez ABPA
5 pacientov
so skorším
ABPA
Stav
Počet
pacientov
Pozitívni
Negatívni
40
7 (1)
Pozitívni
9
8
Negatívni
5
5(3)
Pozitívni
0
-
4 pacienti
s podozrením
na ABPA
Negatívni
2
2 (4)
Pozitívni
2
2
6 pacientov
s potvrdeným
ABPA
Negatívni
3
2 (5)
Pozitívni
3
3
Výsledky PlateliaTM Aspergillus IgG
Pozitívni (%)
Negatívni (%)
Stav pacientov
(intermediálni (intermediálni
pacienti
pacienti
považovaní
považovaní
Intermediálni Negatívni
za
za
negatívnych)
pozitívnych)
11/40
7/40 (17,5 %)
(27,5 %)
4 (2)
29
95 % CI
95 % CI
[7,3-32,8 %]
[14,6-43,9 %]
8/9
9/9
1
0
(88,9 %)*
(100,0 %)*
5/5
5/5
0
0
(100,0 %)*
(100,0 %)*
2/2
2/2
0
0
(100,0 %)*
(100,0 %)*
2/2
2/2
0
0
(100,0 %)
(100,0 %)
2/3
2/3
0
1
(66,7 %)*
(66,7 %)*
3/3
3/3
0
0
(100,0 %)*
(100,0 %)*
1): 57 % (4/7) pozitívnych výsledkov pri Platelia™ Aspergillus IgG testovaných pozitívne s inou komerčne dostupnou
súpravou EIA na detekciu anti-Aspergillus IgG.
(2): 100 % (4/4) intermediálnych výsledkov pri Platelia™ Aspergillus IgG testovaných negatívne s inou komerčne
dostupnou súpravou EIA na detekciu anti-Aspergillus IgG.
(3): 100 % (5/5) pozitívnych výsledkov pri Platelia™ Aspergillus IgG testovaných pozitívne s inou komerčne dostupnou
súpravou EIA na detekciu anti-Aspergillus IgG.
(4): 100 % (2/2) pozitívnych výsledkov pri Platelia™ Aspergillus IgG testovaných pozitívne s inou komerčne dostupnou
súpravou EIA na detekciu anti-Aspergillus IgG.
(5): 100 % (2/2) pozitívnych výsledkov pri Platelia™ Aspergillus IgG testovaných pozitívne s inou komerčne dostupnou
súpravou EIA na detekciu anti-Aspergillus IgG.
* : 95 % interval spoľahlivosti nemohol byť vypočítaný vzhľadom na nedostatočné objemy vzoriek.
Výsledky pracoviska 2
Nižšie uvedená tabuľka zhŕňa výsledky získané pri rovnakej populácii pacientov trpiacich závažnou chronickou
aspergilózou, získaných na základe kompatibilnej snímky pľúc, kultúr expektorácie pozitívnych na Aspergillus a
sérologických testov pozitívnych na Aspergillus použitím imunoelektroforézy (IEP).
8
• Výsledky podľa vzorky
Výsledky IEP
Kategórie
pacientov
Závažná
chronická
aspergilóza
Stav
Počet
pacientov
Pozitívni
Pozitívni
109
105
Intermediálni
22
15
Negatívni
17
6
Výsledky PlateliaTM Aspergillus IgG
Pozitívni (%)
Negatívni (%)
Stav pacientov
(intermediálni
(intermediálni
pacienti
pacienti
Intermediálni Negatívni považovaní za považovaní za
negatívnych)
pozitívnych)
96,3 %
99,1 %
95 % CI
95 % CI
3
1
[90,8-99,0]
[95,0-100]
68,2 %
86,4 %
95 % CI
95 % CI
4
3
[45,1-86,1]
[65,1-97,1]
35,3 %
64,7 %
5
6
95 % CI
95 % CI
[14,2-61,7]
[38,5-85,8]
• Výsledky podľa pacientov
Stav pacienta s aspergilovou imunoelektroforézou alebo Platelia™ Aspergillus IgG bol považovaný za pozitívny, ak bola
pozitívna aspoň jedna z testovaných vzoriek pacienta pozitívne testovaná zodpovedajúcou metódou. Inak bol stav
považovaný za intermediálny, ak bola aspoň jedna z testovaných vzoriek pacienta intermediálna a negatívny, ak boli
všetky testované vzorky pacienta negatívne.
Výsledky IEP
Výsledky PlateliaTM Aspergillus IgG
Pozitívni (%)
Stav pacientov
Kategórie
(intermediálni
Počet
pacientov
Stav
pacienti
pacientov
Pozitívni Intermediálni Negatívni považovaní za
negatívnych)
95,0 %
Závažná
Pozitívni
40
38
1
1
95 % CI
chronická
[83,1-99,4]
aspergilóza
Negatívni
3
1
1
1
33,3 %*
* : 95 % interval spoľahlivosti nemohol byť vypočítaný vzhľadom na nedostatočné objemy vzoriek.
Negatívni (%)
(intermediálni
pacienti
považovaní za
pozitívnych)
97,5 %
95 % CI
[86,8-99,00]
66,7 %*
ŠPECIFICITA
Špecificita bola stanovená použitím panelu 222 vzoriek od 222 hospitalizovaných pacientov na pracovisku 1 (200
vzoriek) a na pracovisku 2 (22 vzoriek) bez symptómov aspergilovej infekcie.
Testovaná
populácia
/
pracovisko
Počet
vzoriek
Negatívne
Intermediálne
Pozitívne
Pracovisko
1
200
199
1
0
Pracovisko
2
22
22
0
0
Celkom
222
221
1
0
Špecificita
(intermediálni
pacienti
považovaní
za negatívnych)
99,5 %
95 % CI
[97,2 -100,0 %]
100 %
95 % CI
[84,6 -100,0 %]
99,6 %
95 %
[97,5-100,0 %]
Špecificita
(intermediálni
pacienti
považovaní
za pozitívnych)
100 %
95 % CI
[98,2-100,0 %]
100 %
95 % CI
[84,6 %-100,0 %]
100 %
95 % CI
[98,3-100,0 %]
16. KONTROLA KVALITY VÝROBCU
Všetky vyrábané reagencie sú pripravované podľa nášho systému kvality, počínajúc príjmom surovín, končiac
komerčným využitím produktu. Každá šarža je podrobená kontrole kvality a je uvoľnená na trh len vtedy, keď spĺňa
vopred definované akceptačné kritériá.
Bio-Rad uchováva záznamy spojené s výrobou a kontrolami každej jednotlivej šarže.
9
17. LITERATÚRA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Agarwal, R. 2009. Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Chest 135 (3): p805-826.
Agarwal, R., Nath, A., Aggarwal, A. N., Gupta, D., Chakrabarti, A. 2009. Aspergillus hypersensitivity and allergic
bronchopulmonary aspergillosis in patients with acute severe asthma in a respiratory intensive care unit in North
India. Mycoses 24.
Centeno-Lima, S., de Lacerda, J. M., do Carmo, J. A., Abecasis, M., Casimiro, C., Exposto, F. 2002. Follow-up of
anti-Aspergillus IgG and IgA antibodies in bone marrow transplated patients with invasive aspergillosis. Journal of
clinical laboratory analysis 16: p156-162.
Denning, D. W. 2001. Chronic forms of pulmonary aspergillosis. Clinical microbiology and infection 7 (Suppl 2):
p25-31.
Latzin, P., Hartl, D., Regamey, N., frey, U., Schoeni, M. H., Casaulta, C. 2008. Comparison of serum markers for
allergic bronchopulmonary aspergillosis in cystic fibrosis. Eur. Respiratory Journal 31: p36-42.
Pagella, F., Matti, E., De Bernardi, F., Semino, L., Cavanna, C., Marone, P., Farina, C., Castelnuovo, P. 2007.
Paranasal sinus fungus ball: diagnosis and management. Mycoses 50: p451-456.
Sarfati, J., Monod, M., Recco, P., Sulahian, A., Pinel, C., Candolfi, E., Fontaine, T., Debeaupuis, J.P., Tabouret, M.,
Latgé, J.P. 2006. Recombinant antigens as diagnostic markers for aspergillosis. Diagnostic microbiology and
infectious disease 55: p. 279-291.
Schubert, M. S. 2009. Allergic fungal sinusitis: pathophysiology, diagnosis and management. Medical Mycology p17.
Shah, A. 2008. Aspergillus-associated hypersensitivity respiratory disorders. Indian journal of Chest disease and
allied sciences 50: p117-128
Shah, R., Vaidesswar, P., Pandit, S. P. 2008. Pathlogy of pulmonary aspergillomas. Indian journal of pathology and
microbiology 51 (3): p342-345.
Thia, L. P., Balfour Lynn, I. M. 2009. Diagnosing allergic bronchopulmonary aspergillosis in children with cystic
fibrosis, Paediatric Respiratory Reviews 10: p37–42
Tillie-Leblond, I., Tonnel, A. B. 2005. Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Allergy 60: p1004-1013.
Virnig, C., Bush, R. K. 2007. Allergic bronchopulmonary aspergillosis: a US perspective. Current opinion in
Pulmonary Medicine 13: p67-71.
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00
Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33
881037
06/2009
10
Download

PLATELIA™ Aspergillus IgG 62783 96 TESTOV - Bio-Rad