Rutinde Mantar
Enfeksiyonlarına
Laboratuvar Yaklaşımı;
Serolojik ve Moleküler Yöntemler
Dr. M. Ali SARAÇLI
ARALIK 2012
• Serolojik tanı
• Moleküler tanı
Annelerin hayali
2/29
MİKOLOJİDE SEROLOJİ
• Kültür tanımlamasının doğrulaması
– Ekzoantijen testleri
• İnvitro serolojik tanı
– EIA, LA, KF, Kart test
– Antijen testleri:
• Çapraz reaksiyonlar
• Klirens
– Antikor testleri: İmmün baskılanmış/
yetmezlik durumları, flora, kolonizasyon
– Cins/türler arası antifungal duyarlılık farkı
– Epidemiyolojik bilgi kaynağıdır
3/29
Ekzoantijen testi
• İmmünodifüzyon testidir;
– Kültürü yapılan hücrelerinden elde edilen antijenler
– Mantar türüne özgün saflaştırılmış antikorlar
• Presipitin bandı oluşumu araştırılır
• Sınıf II güvenlik kabini içinde
gerçekleştirilmelidir (Coccidioides
(Coccidioides !!!!)
• Yorumlama - presipitin bandlarının;
– Tam olarak karşılaşıp uç uca birleşmesi: Tam uyum
– Biri diğerini çaprazlayacak şekilde karşılaşması: Çapraz
reaksiyon
4/29
Ekzoantijen testi
R: Antikor
A: Antijen
EX: Kültür ekstresi
Histoplasma,, Blastomyces ve Coccidioides üçlü test
Histoplasma
http://www.mycology.adelaide.edu.au/virtual/2006/ID2-May06.html
5/29
Ticari Ekzoantijen test
sağlayıcıları
• Immunomycologics:
Immunomycologics: “Exo
“Exo Antigen
identification system
system””
– Histoplasma
Histoplasma,, Coccidioides
Coccidioides,, Blastomyces
• Meridian Diagnostics
Diagnostics:: İmmünodifüzyon
plakları
6/29
IN VITRO SEROLOJİK TANI
•
•
•
•
•
•
•
•
Kriptokokkoz
Aspergilloz
Kandidoz
Histoplazmoz
Koksidioidomikoz
Blastomikoz
Parakoksidioidomikoz
Sporotrikoz
7/29
KRİPTOKOKKOZ
• Antijen saptama (polisakkarit)
–
–
–
–
–
EIA, lateks aglutinasyon, kart test kitleri
Serum/BOS; >%90 duyarlılık ve özgüllük
BOS(+) ise EORTC/MSG “proven” İnvaziv Fungal Hastalık
Tanıda kullanılışlı, ancak tedaviye yanıt saptamada güvenilmez
Yalancı pozitif/negatif durumlarda: Tekrar test, kültür yapılması
• Antikor saptama
– EIA
– Serum
– Sadece epidemiyolojik açıdan önemli
Pastorex Crypto plus
(BioRad)
8/28
ASPERGİLLOZ
• Antijen saptama (Galaktomannan)
– Galaktomannan 1→5
1→5--β-d-galactofuranose yan zincirine karşı mAb
– Yalancı pozitiflik:
• Bifidobacterium,
Bifidobacterium, küfler (Penicillium
(Penicillium,, Fusarium
Fusarium,, Alternaria
Alternaria,, Mucorales,
Paecilomyces, Geotrichum, Histoplasma)
Histoplasma )
• Piperasilin
Piperasilin--tazobaktam vb. beta laktam/kombinasyonlar (tek doz kesilince
2h, çok dozda 11-5 günde negatifleşir)
• Gıdalar (makarna, tahıllar
• Barsak hasarı
• Erişkin %2.5, çocuk %10, yeni doğan %83
– Aspergillus türlerinin antijen saçmalrı birbirinden farklı
– İnvaziv aspergilloz riskinde haftada 2 test
– BAL: Kolonizasyona bağlı olarak %3%3-19 yalancı pozitiflik
• Antikor saptama
– İmmunodifüzyon ve KF (IMMY Diagnostics)
9/28
Galaktomannan antijen testi
• EORTC/MSG “probable” IFH
kriteri
• BAL/Serum: CI ≥0.5
• BAL (Invaziv Pulmoner
Aspergilloz): CI =?; CI=1.1
CI=1.1 özgüllük
%98.1
98.1,, duyarlılık %100*
• Negatif prediktif değeri >PPV (%92(%9299/ %17%17-59; çocuklarda )
• >200 Aspegillus türü, A.terreus !!
GMI 5-9 günde normale
dönenler
GMI pozitif kalan ve
artanlar (eşik üzerine
+≥1.0)
Platelia Aspergillus Ag,
BioRad
10/29
* Li –Yang Hsu et al. BMC Infectious Diseases 2010, 10:44
KANDİDOZ
•
Antijen saptama
–
Muhtelif antijenler
• Mannan, 230230-250 kDa’luk germ tüp duvar mannoproteini,
Blastospor duvarı, Miçelyum duvarı, 54 kDa’luk sitoplazmik antijen,
52 kDa’luk metalloprotein, Sekrete edilen aspartil proteinaz, Enolaz,
Isı labil antijen
–
–
–
–
•
Transient antijenemi sorun
~180 Candida türü / C.glabrata, Ckrusei, C.lusitaniae,…
C.lusitaniae,…
Platelia Candida Ag plus (BioRad)
Duyarlılık %50%50-94 << Özgüllük %76%76-96 (9 makale)
Antikor saptama
–
–
İmmunodifüzyon (IMMY Diagnostics)
EIA--Platelia Candida Ab plus (BioEIA
(Bio-Rad)
11/28
HİSTOPLAZMOZ
• Antijen saptama
– İnvaziv histoplazmozda
• idrarda >%90, serumda >%75 pozitif
• EORTC/MSG “Probable” İFH (BOS, idrar, kan)
• blastomikoz, koksidiyoidomikoz, penisilloz,
parakoksidiyoidomikoz ile çapraz reaksiyonlar
– Duyarlılık %75%75-90, özgüllük %98 *
• Antikor saptama
– H (akut faz) ve M (tüm fazlar) antijenlerine karşı
• EIA, ID, KF
* Wheat, L.J. 2003. Trends Microbiol. 11:488-94
12/28
KOKSİDİOİDOMİKOZ
• Antijen saptama
– EIA
• Ticari değil
• P.brasiliensis ile çapraz reaksiyon
– Serum ve idrar örnekleri
• Antikor saptama
– EIA, KF, ID, LA kitleri mevcut
– EORTC/MSG “Proven” İFH; BOS veya 2x serum
– EIA duyarlılık%95.5, özgüllük %98.5*
• Premier EIA, Meridian Diagnostics
• Coccidioides DxSelect™, Focus Diagnostics
* J Clin Microbiol. 1995, 33:940–3
13/29
BLASTOMİKOZ
8-15 µm
• Antijen saptama
–
–
–
–
Serum ve idrar
ARUP reference laboratories (Utah/ABD)
MiraVista Blastomyces antigen EIA
EIA duyarlılık idrar(%93.5*, %92.9**), serum (%87*, %79.3**)
• Antikor saptama
– A ve WIWI-1 antijenlerine karşı antikor aranması: EIA,
immunodifüzyon, KF (IMMY Diagnostics)
– Duyarlılık %90%90-100, özgüllük %98
* Spector D. et al. J Vet Intern Med 2008;22:839–843
** Durkin, M. et al. 2004. J. Clin. Microbiol. 42:4873-4875
14/29
PARAKOKSİDİOİDOMİKOZ
• Antijen saptama
– Gp43 ve gp70 antijen testleri
• Antikor saptama
– İmmünodifüzyon (IMMY Diagnostics)
– EORTC/MSG “Proven İFH, 2x serum
15/29
SPOROTRİKOZ
• Antikor testi
– Lateks aglutinasyon (IMMY Diagnostics)
16/29
BETA--D GLUKAN TESTİ
BETA
• ß-D glukan, zigomiçetler
zigomiçetler ve kriptokoklar
hariç mantar duvarının bileşeni
• EORTC/MSG “Probable” İFH kriteri
• Limulus testi (koaglütinasyon) prensibi ile
çalışır
• <60 pg/ml negatif; ≥80 pg/ml pozitif
• Duyarlılık %52%52-100, özgüllük %45%45-100*,
NPV>%95**
NPV>%95
**
• Ig infüzyonu, hemodiyaliz, gram pozitif
bakteremi , kandida kolonizasyonu,
pip/tazobak. vb. yalancı pozitiflik nedeni
• Tür tanısına olanak vermez !!!
* Clin Infect Dis. (2011) 52 (6): 750-770.
* * J Clin Microbiol (2005) 43 (12): 5957-62
horseshoe crab
beyaz kan hücreleri
17/28
MOLEKÜLER TANI
• Sekans tabanlı moleküler tanımlama
– ITS
– büyük alt birim rDNA dizileme
– mtDNA
• Hibridizasyon tabanlı moleküler tanımlama
– DNA array
– Accu
Accu--probe (Kültur tanımlamanın doğrulaması)
• PCR tabanlı moleküler tanımlama
– Henüz ticari değil
18/29
Sekans tabanlı tanımlama
• MicroSEQ D2 LSU rDNA Fungal Identification Kit
– rRNA büyük alt birim D2 bölgesi
– >1000 türü içeren veri tabanı
– 24 saatten kısa sürede sonuç alma
5’
• Ticari olmayan ITS, SSU ve LSU rDNA ve mtDNA dizi analiz
çalışmaları ÇOK SAYIDA
1.3 kb
SSU
18 S rRNA
0.7 kb
ITS1
3.4 kb
LSU
5.8 S ITS2
IGS: Intergenic spacer
ITS: Internal Transcribed Spacer
ETS: External Transcribed Spacer
28 S rRNA
3.2 kb
ETS2
IGS
ETS1
19/29
Iwen PC et al. Medical Mycology, 2002, 40:87-109.
3’
Hibridizasyon Tabanlı
Tanımlama
DNA array
• Fungi 2.1 (Chipron)
• Nanochip (Savyon Diagnostics)
• DNA ekstraksiyonu – PCR - hibridizasyon
Accuprobe (Gen(Gen-probe)
• Kültürden rRNA ekstraksiyonu - Hibridizasyon
20/29
CHIPRON FUNGI 2.1
30 test spotu x 2
• Aspergillus fumigatus
fumigatus,, flavus
flavus,,
niger,, nidulans
niger
nidulans,, terreus
terreus,,
versicolor
• Candida albicans
albicans,, dubliniensis
dubliniensis,,
glabrata,, guilliermondii
glabrata
guilliermondii,, kefyr
kefyr,,
krusei,, lambica
krusei
lambica,, lusitaniae
lusitaniae,,
parapsilosis,, tropicalis
parapsilosis
tropicalis,,
pelliculosa
•
•
2012
Maliyetleri
32 test 2.850
Mucor circinelloides
circinelloides,,
TL
Rhizomucor pusillus
pusillus,, Absidia Test Sistemi:
14.000 TL
corymbifera
. Okuyucu
Rhizopus microsporus
microsporus,, oryzae
oryzae,, . Yazılım
. Santrifüj
stolonifer
ATQ
Biyoteknoloji
Cryptococcus neoformans
•
• Paecilomyces variotii
• Scedosporium prolificans
Tel : 0312
4964319
21/29
®
NanoChip Savyon Diagnostics
• Fungal paneli henüz YOK
• Bakteri/parazit paneli genişliyor
• Mikrobiyoloji paneli 2013’de Türkiye’de
22/29
Gen--prob
Gen
probe
e (Accuprobe) testi
• Sadece kültür doğrulama testi (C.
(C. immitis, H. capsulatum ve
B. dermatitidis)
dermatitidis)
• Hücrelerde yüksek miktarda bulunan rRNA’nın saptanması
temeline dayanmaktadır
• Floroflor ile işaretlenmiş özgün DNA probu test izolatının
rRNA’sı ile türe spesifik olarak hibridize olur
• Erken ve zayıf üremede, kontamine üremede kullanılabilir
• AccuProbe (Gen(Gen-Probe Inc., San Diego, CA) adı altında kit
olarak pazarlanmaktadır.
23/29
PCR TABANLI MOLEKÜLER
TANI
24/29
Aspergillus PCR
• 200’den fazla tür barındıran Aspergilus cinsi/60 tür önemli
• PCR testleri 20 yılı aşkın süredir kullanımdakullanımda-Ticari ürün YOK
• Standardize değil [European
[European Organization for Research and
Treatment of Cancer and the Mycoses Study Group
(EORTC/MSG)’’ un invasiv fungal hastalık tanı kriteri değil]
(EORTC/MSG)
• International Society for Human and Animal Mycoses (ISHAM)’
(ISHAM)’
ın European Aspergillus PCR Initiative (EAPCRI) çalışma grubu
standardizasyon için uğraşıyor.
• DNA ekstraksiyon safhasında sorunlar mevcut. Yüksek kan
hacmi kullanımı, DNA’nın küçük hacimde çözülmesi öneriliyor *
• Konidiya eklenmiş serum gerçeği yansıtmıyor (hifal
angioinvazyon--multinükleer!!!)
angioinvazyon
25/29
* J CLIN MICROBIOL (2010), 48(4):1231–40
Candida PCR
• 170’den fazla tür barındıran Candida cinsinde 20
kadar tür sıklıkla izole edilmektedir
• Ticari ürün veya üzerinde uzlaşı sağlanmış PCR
protokolu YOK
• Real
Real--time PCR, multipleks PCR, erime eğrisi
analizleri ve PCRPCR-RFLP gibi yöntemler ile tür
tanımlaması yapılıyor
26/29
PCR ÇALIŞMALARI
• DNA ekstraksiyonunda sorunlar
– Etkinlik
– Standardizasyon
• Çok kopya genlerin kullanılması duyarlılığı 
• Tür çeşitliliğiçeşitliliği- multipleks yaklaşımlar sınırlı
katkı
• Kolonizan/enfekte eden/kontaminan ayırımı
zor
27/29
KÜTLE SPEKTROMETRİ
TOF tüpü
Matriks
Matrix
Assisted
Laser
Desorbtion
Ionisation
I
Time
Of
Flight
Dedektör
Spektrum analizi
28/28
Mantarlarda MALDIMALDI-TOF
• Kalın hücre duvarı sorun oluşturabilir
• Küflerde doğrudan kültürden çalışma yerine;
– sıvı besiyeri kültürü
– 95 oC’de inkübasyon
– cam boncuklarla parçalama
• Sıcaklık ve besiyeri içeriği gibi kültür şartları
protein ekspresyon profilini etkiler
29/29
Download

Antikor saptama