Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ
STANDARTLARI (UMS)
Safrada Erime Testi
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları ÇalıĢma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-20
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
Safrada erime testi
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
GENEL BĠLGĠ ................................................................... 3
TEKNĠK BĠLGĠLER ............................................................. 3
1
2
3
4
Test için asgari laboratuvar koĢulları ................................ 3
Testin uygulanması ....................................................... 4
Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması ...................... 5
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 6
ĠLGĠLĠ DĠĞER UMS BELGELERĠ ............................................ 8
KAYNAKLAR ..................................................................... 8
Sayfa 2 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-20 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Safrada erime testi
Kapsam ve Amaç
Safrada erime testi, Streptococcus pneumoniae tanısında kullanılan tamamlayıcı
bir testtir ve kesin tanı konmasını destekler. Bu UMS‟nin amacı safrada erime
testinin yapılıĢına ve yorumlanmasına dair bir rehber sunmaktır.
Genel Bilgi
Alfa hemoliz yapmıĢ karakteristik bir koloni görünümü olsa da S. pneumoniae bu
özelliği ile diğer -hemolitik viridans streptokoklardan ayırt edilemez. Safrada
erime S. pneumoniae‟nin ayırıcı tanısı için önemli bir özelliktir ve safrada erime
testi ile saptanır.
Test, belirli bir süre, uygun sıcaklıkta safra tuzlarına (sodyum deoksikolat) maruz
bırakılan kolonilerde erime görülmesi esasına dayanır. Bu testten diğer
streptokoklar etkilenmezken, pnömokokların eridiği gözlenir (1,2). Safra
tuzlarının pnömokok hücrelerinde bulunan otolitik enzimleri (amidaz) aktive
ettiği, böylece hücrelerin lizisini tetiklediği düĢünülmektedir.
Safrada erime testi tüpte yapılabileceği gibi, lam üzerindeki hücre
süspansiyonuna ya da doğrudan plaktaki koloninin üzerine reaktifin eklenmesi ile
de uygulanabilir.
Test, -hemolitik streptokokların ayırıcı tanısında, özellikle optokine orta duyarlı
(çapı 5-mm olan disk ile inhibisyon zon çapı 8-13 mm; çapı 10-mm olan disk ile
zon çapı <16 mm ölçülmüĢ) izolatların S. pneumoniae olup olmadıklarının teyit
edilmelerinde çok kullanıĢlıdır (1,2,3).
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koĢulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS‟de bahsi geçen organizmalar ile ilgili iĢlemler asgari BGD2 laboratuvar
Ģartlarında gerçekleĢtirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. Aerosol oluĢturması muhtemel tüm laboratuvar çalıĢmaları bir
biyolojik güvenlik kabininde gerçekleĢtirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS‟yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım
ile ilgili eğitim almıĢ olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aĢina olmalı, ve; (iii)
daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-20 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 8
Safrada erime testi
1.3. Örnek, Reaktif, Donanım
İnceleme örneği

S. pneumoniae Ģüpheli izolatın taze kanlı-agar kültürü (ortası çökmüĢ
veya mukoid koloni, -hemolitik, katalaz negatif, gram pozitif diplokok)
NOT: Daha önce optokin testi yapılmıĢ ise optokin test plağındaki
üremeden alınarak test için hücre süspansiyonu hazırlanabilir (1).

Lanset Ģeklinde gram pozitif diplokoklar görülmüĢ pozitif kan kültürü
Reaktifler (1)

SF, steril (%0.85‟lik sodyum klorür) (pH 7.0)

Safra tuzu reaktifleri (%2‟lik tüp testi için; %10‟luk direkt plak testi
için) piyasadan hazır temin edilebilir. Laboratuvarda hazırlamak için:
(a) %2‟lik safra tuzu çözeltisi: 0.2 g sodyum deoksikolat 10 mL SF
içinde eritilir. Etiketlenir, 15-30°C‟de saklanır. Daha düĢük
sıcaklıkta koyulaĢabilir. Raf ömrü 9 aydır.
(b) %10‟luk safra tuzu çözeltisi: 1 g sodyum deoksikolat 10 mL SF
içinde eritilir. Saklama koĢulları %2‟lik çözeltisindeki gibidir.
Diğer gereç, donanım







Öze, steril tek kullanımlık veya nikrom,
Test tüpleri,
Pastör pipeti veya damlalık
Lam (direkt lam testi yapılacaksa)
Gram boya veya metilen mavisi boya (direkt lam testi yapılacaksa)
Vorteks
Ġnkübatör (35°C)
1.4. Kalite kontrol

Her yeni reaktif lotu kullanıma sokulmadan önce pozitif ve negatif
kalite kontrol suĢları ile test edilmelidir.

Safra çözeltisi eğer berrak ve çok açık sarı renkte değilse kullanılmaz!

Kalite kontrol organizmaları (2):
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619, pozitif (safrada erir)
Enterococcus faecalis ATCC 29212, negatif (safrada erimez)
2 Testin uygulanması
2.1. Tüp testi

Bir tüpe 0.5 mL steril SF konur. Ġncelenecek organizmadan bir öze ile
alınarak yeterince koyu (McFarland No 1) bir süspansiyon hazırlanır.
Homojen bir süspansiyon elde etmek için çalkalanır veya vortekslenir.

Ġki temiz tüp alınır; birinin üzerine “test”, diğerinin üzerine “kontrol”
yazılır. Her bir tüpe 0.25 mL bakteri süspansiyonu konur.
Sayfa 4 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-20 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Safrada erime testi

Test tüpüne 5 damla %2‟lik safra çözeltisi, kontrol tüpüne 5 damla
SF eklenir. Tüpler hafifçe karıĢtırılır.

Tüpler 35°C‟de 2 saat kadar inkübe edilir. 15-20 dakikada bir, safra
tuzları içeren tüpteki bulanıklık kontrol edilir. BerraklaĢma ya da
bulanıklığın kaybolması erimenin olduğunu gösterir (pozitif sonuç).
2.2. Direkt plak testi (Spot test)

Safrada erime testi tüp yerine plakta da yapılabilir. Bunun için
incelenecek organizmanın %5 koyun kanlı agar plağında 18-24 saatlik
taze pasajı kullanılır.

Bir damla %10‟luk safra solüsyonu besiyeri plağındaki kuĢkulu
kolonilerin üzerine damlatılır. Kolonilerin yerinden oynatılmamasına
dikkat edilmelidir.
NOT: Damlatılırken, damlalığın ucu agara değdirilmemelidir!

Agar-yüzü yukarı bakacak Ģekilde plak, 35°C normal atmosferde 15-30
dk veya damla kuruyuncaya dek bekletilir.

Plak erime bulgusu açısından incelenir.
2.3. Direkt lam testi (kan kültüründeki Ģüpheli üremeden)

Bir test, bir de kontrol lamı hazırlanır.

Test lamına Ģüpheli üremenin olduğu kan kültüründen 1 damla
damlatılır. Üzerine 1 damla %10‟luk safra reaktifi eklenir. Kurumaya
bırakılır.

Kontrol lamına 1 damla Ģüpheli üremenin olduğu kan kültüründen
damlatılır. Üzerine 1 damla SF eklenir. Kurumaya bırakılır.

Her iki lam da Gram veya metilen mavisi ile boyanır ve kokların varlığı
yönünden incelenir.
3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması
3.1. Tüp testi

Test tüpünde – 2 saatlik inkübasyon süresi sonunda kontrol tüpüne
göre, bulanıklığının kaybolması (berraklaĢma) safrada erime
bulgusudur (safrada erime pozitif) (bkz. ġekil 1).

Kontrol tüpünde – 2 saat inkübasyon sonunda bulanıklığın devam
etmesi
3.2. Direkt plak testi (Spot test)

30 dk içinde plaktaki kolonilerin düzleĢmiĢ veya zeminde -hemolitik
alan bırakarak kaybolmuĢ olması – safrada erime pozitif.

Koloni bütünlüğünün değiĢmemiĢ olması – safrada erime negatif.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-20 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 8
Safrada erime testi
3.3. Direkt lam testi (kan kültüründeki Ģüpheli üremeden)

Mikroskopik incelemede kontrol lamında diplokoklar gözlenirken test
lamında organizmanın görülmemesi - safrada erime testi pozitif
3.4. Raporlama (2,3)

S. pneumoniae için raporlama kriterleri ġekil-2‟de özetlenmiĢtir.

Eğer bir -hemolitik, gram pozitif diplokok kolonisi katalaz negatif ise
ve tüp test veya spot test ile safrada erime bulgusu pozitif ise
kesinlikle S. pneumoniae olarak rapor edilir.

Eğer organizma için safrada erime bulgusu negatif ise muhtemelen
viridans streptokoktur. Ancak küçük bir yüzde ile safra-dirençli S.
pneumoniae olabilir. Eğer koloniler tipik ise (halen pnömokok
olabileceği düĢünülüyorsa) ileri inceleme yapılmalıdır.
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Safrada erime deneyi sadece S. pneumoniae‟yi diğer -hemolitik
streptokoklardan ayırt etmek için kullanılır.

Safra tuzlarının yüksek konsantrasyonunda S. pneumoniae‟nin normal
otolizisi inhibe olabilir. Özellikle spot testte safra tuzu reaktifi
buharlaĢıp kuruduğunda konsantrasyonu yükseldiği için sonuca etki
edebilir.

Eski kültürlerin kendiliğinden erime olasılığı söz konusu olduğundan
safrada erime deneyinde eski kültürler kullanılmamalıdır.

YanlıĢ negatif sonuç olasılığından kaçınmak için tüp testi yaparken
kullanılan serum fizyolojiğin pH‟ı 7.0‟ye ayarlanmıĢ olmalıdır.

Spot (direkt plak) test yapılırken koloninin yer değiĢtirmesi olasılığına
karĢı dikkatli olunmalıdır; hatalı bir Ģekilde pozitif olarak yorumlanabilir.
Plağın değerlendirilmesinde güçlük yaĢanıyorsa test, tüp testi veya lam
testi ile tekrarlanmalıdır.

Safra reaktifi soğukta saklandığında kalınlaĢır. Böyle bir durumda,
reaktif ĢiĢesi 37°C‟de bekletilmeli, sıvılaĢmasını sağlandıktan sonra
kullanılmalıdır.

Bazı S. pneumoniae izolatları safra varlığında erimezler. Bunun virülans
faktörünün (veya kapsülün) kaybına bağlı olabileceği düĢünülmektedir.
Diğer bir ifade ile erime gözlenmediği halde izolat S. pneumoniae
olabilir. Böyle bir durumda halen izolatın pnömokok olabileceği
düĢünülüyorsa, baĢka bir test ile (DNA probu vb.) bakteri identifiye
edilmelidir (4).

ÇeĢitli tanımlama yöntemlerinin karĢılaĢtırıldığı bir çalıĢmada tüp testin
duyarlılığı %96, spot testin duyarlılığı ise %99.4 bulunmuĢtur. Daha
ileri bir duyarlılık için spot veya tüp test negatif kökenlere DNA prob
(veya henüz yapılmamıĢ ise önce optokin disk testi) uygulanması
önerilir (4).
Sayfa 6 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-20 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Safrada erime testi
Suş 1
Kontrol
Suş 2
Safrada
erime (-)
Kontrol
Safrada
erime (+)
Şekil 1. S. pneumoniae tanımlamasında safrada erime için tüp testi. Resimde iki
farklı bakteri suĢu için testin sonuçları görülmektedir. SuĢ 1‟de hem test hem de
kontrol tüpünde bulanıklık görülmektedir; suĢ S. pneumoniae değildir. SuĢ 2 test
tüpünde (en sağdaki tüp) bulanıklık tümü ile kaybolmuĢ gözükmektedir; bu durum
bakteri hücreleri erimiĢ olmasının bir sonucudur; tanı S. pneumoniae„dir (3 no.lu
kaynaktan uyarlanmıĢtır).
Kanlı agarda -hemolitik koloni görünümü,
katalaz negatif, gram pozitif diplokok
Optokin duyarlılığı testi / Safrada erime deneyi
Optokin
duyarlılığı (mm)
Safrada
erime
Yorum-Raporlama
IZ ≥ 14*
+
S. pneumoniae
14 > IZ > 8
+
S. pneumoniae
14 > IZ > 8
−
Pnömokok değil
IZ = 0
−
* Klinik izolatların>%95‟i bu özelliktedir.
Pnömokok değil
IZ, inhibisyon zonu
Şekil 2. S.pneumoniae‟nin tanımlanmasında karar ve raporlama için basit akıĢ Ģeması
(3 no.lu kaynaktan uyarlanmıĢtır).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-20 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 8
Safrada erime testi
İlgili diğer UMS belgeleri
Bu UMS belgesi (Safrada Erime Testi) pnömokok tanımlanma Ģemasında yer alan
diğer testlerle de ilgilidir ve daha detaylı bilgi için aĢağıda listelenmiĢ bu belgelere
baĢvurulabilir.
UMS, B-TP-18
Optokin duyarlılığı testi
UMS, B-MT-05
Streptococcus pneumoniae invaziv enfeksiyonlarının
mikrobiyolojik tanısı
Kaynaklar
1 Perilla MJ, Ajello G, Bopp C, Elliott J, Facklam R, Knapp JS, Popovic T, Wells J, Dowell SF.
Streptococcus pneumoniae. In: Manual for the Laboratory Identification and Antimicrobial
Susceptibility Testing of Bacterial Pathogens of Public Health Importance in the Developing World.
Chapter V. CDC, and WHO, 2003, p. 45-62
2 York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical tests for the identification of aerobic
bacteria. Bile Solubility Test. In: Garcia LS (editor in chief). Clinical Microbiology Procedures
Handbook. 3rd ed. update, ASM, Washington D.C. 2010, p. 3.17.6.1 - 3.17.6.3
3 Popovic T, Ajello GW, Facklam RR. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by
Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. Centers for
Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA. 1998.
4 Mundy LS, Janoff EN, Schwebke KE, Shanholtzer CJ, Willard KE. Ambiguity in the identification of
Streptococcus pneumoniae. Optochin, bile solubility, quellung, and the AccuProbe DNA probe
tests. Am J ClinPathol 1998;109:55–61.
Sayfa 8 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-20 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Download

Safrada erime testi - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu