Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ
STANDARTLARI (UMS)
X,V ve XV faktör gereksinimi
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları ÇalıĢma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-23
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
X,V ve XV faktör gereksinimi
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3
GENEL BĠLGĠ ................................................................... 3
TEKNĠK BĠLGĠLER ............................................................. 4
1
2
3
4
Test için asgari laboratuvar koĢulları ................................ 4
Testin uygulanması ....................................................... 6
Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması ...................... 7
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 7
ĠLGĠLĠ DĠĞER UMS BELGELERĠ ............................................ 9
KAYNAKLAR ..................................................................... 9
Sayfa 2 / 9
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-23 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
X,V ve XV faktör gereksinimi
Kapsam ve Amaç
Haemophilus türleri üremek için kan hücrelerinde bulunan bazı maddelere ihtiyaç
duyarlar. Bunlar X faktör olarak adlandırılan hemin, hematin ve V faktör olarak
adlandırılan NAD olup, üreme faktörleri olarak da bilinirler. Faktör gereksinimi
türlere göre değiĢmektedir ve laboratuvarda Haemophilus üyelerinin bu özellikleri
temelinde ayrımlarını yapmak mümkündür. Bu UMS’nin amacı X, V ve XV faktör
gereksinimi testlerinin yapılıĢı ve yorumlanmasına dair bir rehber sunmaktır.
Kısaltmalar ve Tanımlar
BHI
Brain heart infusion (beyin kalp infüzyonu)
NAD, NADP
Nikotinamid-adenin-dinükleotid, (NAD-fosfat)
TSA
Triptik soya agar
TSB
Triptik soya buyyonu
Genel Bilgi
Hemophilus türleri üremek için kanda bulunan bazı maddelere (X ve V faktörler)
gereksinim duyan bakterilerdir. Bazı türler sadece X faktöre gereksinim duyar ki,
X faktör tek bir maddeden ziyade pek çok demirli pigment (hemin, hematin)
tarafından sağlanabilen ısıya-dirençli tetrapirol bileĢikleridir. Bu bileĢikler
bakterinin katalaz, peroksidaz ve elektron transport sistemi sitokromlarının
sentezinde kullanılırlar. Bazı Haemophilus türleri de ayrıca V faktöre (NAD;
koenzim I veya NADP; koenzim II) gereksinim duyarlar. Her iki faktör de kan
hücreleri içinde bulunur ve üreme faktörleri olarak da adlandırılırlar (1,2).
Kanlı agar içeriğindeki koyun eritrositleri de bu faktörleri taĢırlar. Ancak
eritrositler hücre bütünlüğü bozulmamıĢ halde olduklarından üremeleri bu
faktörlere bağlı olan Haemophilus’lar koyun kanlı agarda üreyemezler.* Eğer
besiyeri, yapılıĢı esnasında kan eklendikten sonra hücrelerin parçalanacağı bir
sıcaklığa ısıtılırsa hem X, V faktörleri ortama salınır, hem de koyun kanında
normalde bulunan ve V faktörünü hidrolize edebilen enzimlerin aktivitesi
engellenmiĢ olur. Nitekim bu Ģekilde elde edilen çikolata agar, Haemophilus’ların
üremesine elveriĢli bir besiyeridir ve klinik örneklerden bakterinin izolasyonunda
laboratuvarların çoğunun ilk tercihidir (1).
Haemophilus’ların X ve V faktör gereksinimleri onların hem izolasyonlarında hem
de tür düzeyinde tanımlanmalarında kullanılan temel karakteristikleridir. Örneğin,
her ne kadar koyun kanlı agara saf inokulum pasajı yapıldığında üremezlerse de
solunum yolu örnekleri vb. karıĢık kültürlerinde diğer bakterilere ait kolonilere
komĢu küçük koloniler yaparak üredikleri gözlenmiĢtir. Bu tür üremenin özellikle
stafilokok kolonilerinin hemoliz zonları içinde gözlenmesi “satellit fenomeni”
olarak adlandırılmıĢ ve satellit testine temel teĢkil etmiĢtir (1,2).
*
Haemophilus türleri, farklı olarak, %5 at kanlı ve tavĢan kanlı agarlarda ürerler. Bu besiyerlerinde hemoliz
karakterini (bazı türler -hemolitiktir) görmek mümkün olduğundan dolayı, tanımlamada tercih edilirler.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-23 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 9
X,V ve XV faktör gereksinimi
Satellit testi için Staphylococcus aureus, kanlı agarda Ģüpheli örneğin (sürüntü
veya koloni) ekiminin yapıldığı bölgeye “çizgi ekimi” tekniği ile inoküle edilir. S.
aureus hemoliz aktivitesi ile eritrositlerden X faktörünü serbestleĢtirirken kendisi
de üremesi esnasında NAD üretip ortama salan bir bakteridir. Ġnkübasyon
sonunda hemoliz zonu içinde -örnekte varsa- Haemophilus kolonilerinin üremesi
beklenir. Bugün teknik sadece S. aureus ile değil -bazı ek avantajlar sağladıkları
için- diğer stafilokok türleri ile de uygulanabilmektedir (2).
X ve V faktörlerine gereksinim laboratuvarda, filtre kâğıdına (disk/Ģerit)
emdirilmiĢ ürünlerin kullanılması ile de araĢtırılabilir. Piyasada X faktör, V faktör
ve XV faktör diskleri/Ģeritleri Ģeklinde kullanıma hazır ürünler vardır.
Testi uygulamak için öncelikle bu faktörleri kesinlikle içermeyen bir besiyerine
(TSA, BHI agar) Ģüpheli organizmanın yoğun yüzey ekimi yapıldıktan sonra
diskler/Ģeritler yerleĢtirilir. X ve V faktörleri suda eriyebilir özellikte maddeler
olduklarından kolayca besiyerine yayılır. Yeterli bir inkübasyon süresinin sonunda
plak incelendiğinde, disklerin/Ģeritlerin etrafındaki üreme paternine göre yorum
yapılır. Örneğin, Haemophilus parainfluenzae V faktör varlığında ürerken,
Haemophilus influenzae ancak her iki faktörün varlığında üreyebilir (1,3,4).
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koĢulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS’de bahsi geçen organizmalar ile ilgili iĢlemler asgari BGD2 laboratuvar
Ģartlarında gerçekleĢtirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. Aerosol oluĢturması muhtemel tüm laboratuvar çalıĢmaları bir
biyolojik güvenlik kabininde gerçekleĢtirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS’yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım
ile ilgili eğitim almıĢ olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aĢina olmalı, ve; (iii)
daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
1.3. Örnek, Besiyeri, Reaktif, Donanım
İnceleme örneği

Haemophilus Ģüpheli izolatın çikolata agardaki taze kültürü – X ve V
faktör gereksinimi veya satellit fenomeni testleri için.

Alt solunum yolu örneği – satellit fenomeni testi için (primer izolasyon
amacıyla kanlı agara bilinen stafilokok suĢu ile birlikte inokülasyon için)
Sayfa 4 / 9
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-23 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
X,V ve XV faktör gereksinimi
Besiyeri, Reaktif, Test organizması

TSA, BHI, TSB (5) – X ve V faktör disk testi için. Besiyerleri piyasadan
hazır temin edilebilir veya toz maddesinden laboratuvarda hazırlanabilir.
Laboratuvarda hazırlama ve saklama koĢulları için üretici firmanın
talimatları izlenmelidir.
ÖNEMLĠ: Her ne kadar bu prosedürün dayandığı değiĢik kaynaklar
faktör içermeyen herhangi bir besiyerinin test için kullanılabileceğini
belirtiyor olsalar da araĢtırmacılar Doern ve Chapin (5) 187 H.influenza
suĢunun X-V faktör gereksinimini test ettikleri çalıĢmalarında dört
besiyerini (TSA, BHI agar, nutrient agar ve Mueller-Hinton agar)
incelemiĢler ve bunların doğru tanımlama performansını
sırasıyla %95.7, %92.5, %56.1 ve %71.1 bulmuĢlardır. TSA, X-V
faktör gereksinimi testleri için en ideal besiyeri olarak önerilmiĢtir (5).

X, V ve XV faktör diskleri (ya da Ģeritleri) - piyasadan temin edilir;
üretici firmanın talimatına göre saklanır.

Kanlı agar – satellit fenomeni testi için

Staphylococcus aureus ATCC 25923 veya bir Staphylococcus
epidermidis suĢu (-laktamaz negatif) - satellit fenomeni testi için
NOT: Herhangi bir stafilokok testte kullanılabilir. Ancak eğer test kanlı
agar plağa yapılan bir primer kültüre uygulanacaksa koagülaz negatif,
-laktamaz negatif, nonhemolitik bir stafilokokun seçilmesi
Haemophilus türlerinin hemoliz karakterinin de gözlenebilmesi için
kullanıĢlıdır.
Diğer gereç, donanım

Öze, steril tek kullanımlık veya nikrom,

Eküvyon, steril

Vorteks

Ġnkübatör, CO2’li ya da mumlu jar
1.4. Kalite kontrol

Her yeni besiyeri ve reaktif lotu kullanıma sokulmadan önce pozitif ve
negatif kalite kontrol suĢları ile test edilmelidir.

Periyodik olarak (özellikle balgam kültürlerinde doğrudan örneğin
ekildiği plaklara inoküle edilecek ise), satellit testinde kullanılacak
stafilokok suĢunun kontamine olup olmadığı test edilmelidir.

Alternatif olarak derin dondurucuda saklanan stafilokok stokundan
ayda bir yeni pasaj yapılmalıdır.

Kalite kontrol organizmaları:
Haemophilus influenzae ATCC 43065, XV faktör varlığında ürer
Haemophilus parainfluenzae ATCC 7901, V faktör varlığında ürer
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-23 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 9
X,V ve XV faktör gereksinimi
2 Testin uygulanması
2.1. X ve V faktör gereksinimi için disk testi

Steril bir tüpe 2-3 mL uygun bir sıvı besiyeri (faktör içermeyen; BHI,
TSB gibi) konur. Sıvı besiyeri yerine SF de kullanılabilir.

Ġncelenecek izolatın kolonisi bir öze ile alınarak sıvı besiyerinde
yeterince koyu (McFarland No 1) bir süspansiyon hazırlanır. Homojen
bir süspansiyon elde etmek için vortekslenir. Eğer primer izolasyon
plağında yeterli üreme yoksa ya da plak kontamine ise önce çikolata
agara pasaj yapılmalıdır.
ÖNEMLĠ: Sıvı besiyerine inokulum transfer ederken agar besiyerinden
parça taĢınmamasına özen gösterilmelidir. Çünkü primer izolasyon
plağı X ve V faktörleri içerir ve bunların çok küçük miktarları bile testi
etkileyerek hatalı tanımlamaya neden olabilir.

Bir TSA (veya benzeri, kesinlikle X ve V faktör içermeyen bir besiyeri)
plağı alınır. Steril bir eküvyon süspansiyona daldırılır. Tüpün kenarında
süzdürüldükten sonra eküvyon plak yüzeyine en az iki yönde sürülerek
ekim yapılır.

Plak yüzeyi kuruduktan sonra X, V ve XV faktörlerini içeren kâğıt
Ģerit/diskler ekim alanının üzerine yerleĢtirilir (bkz. ġekil 1). Disklerin
arasında en az 3.5 cm (veya üretici firmanın önerdiği kadar) mesafe
olmalıdır. Eğer iki izolat test edilecekse diskler ġekil-1’de görüldüğü
gibi yerleĢtirilir!

Plağın kapağı kapatılır, ters çevrilir ve mumlu jara (veya varsa
doğrudan CO2 inkübatöre) yerleĢtirilir.

Nemli ve %3-5 CO2’li ortamda 18-24 saat 35°C’de inkübe edilir.
NOT: Yeterli nem oranı için (i) inkübatör tabanına düz cam bir tepside
distile su, veya (ii) jar tabanına ıslatılmıĢ filtre kağıdı, konmalıdır

Ġnkübasyonu takiben plak iyi bir aydınlatma altında disklerin etrafında
üreme varlığı açısından incelenir ve yorumlanır.
2.2. Satellit fenomeni testi

ġüpheli izolat kanlı agara pasajlanır. Eğer klinik örnek söz konusu ise
hem kanlı agara hem de çikolata agara ekim yapılır.

Stafilokok kolonisinden bir steril öze ile alınır ve kanlı agarda ekim
yapılmıĢ bölgeyi çaprazlayan bir çizgi ekim (veya birden fazla kısa çizgi
ekimler) yapılır.

Her iki plak da %3-5 CO2’li ortamda 18-24 saat 35°C’de inkübe edilir.

Kanlı agar plağı stafilokok ekim çizgisinin etrafında satellit kolonilerin
varlığı yönünden incelenir (bkz. ġekil 2).

Çikolata agar plağı Haemophilus Ģüpheli üreme yönünden
değerlendirilir ve tanımlama testleri uygulanır.
Sayfa 6 / 9
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-23 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
X,V ve XV faktör gereksinimi
3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması
3.1. X ve V faktör gereksinimi için disk testi

Sadece XV diski (X ve V faktörlerinin ikisini bir arada içeren disk)
etrafında üreme olması (ġekil 1’deki plağın üst yarısında olduğu gibi) –
H. influenzae veya Haemophilus haemolyticus olabilir. H. haemolyticus
tavĢan veya at kanlı besiyerinde hemoliz yapma özelliği ile
H.influenzae’dan ayrılabilir (Tablo 1).

X veya V faktörlerinden yalnız birinin etrafında üreme olması organizma diğer Haemophilus türlerinden biri olabilir.
3.2. Satellit fenomeni testi

Pozitif sonuç – stafilokok ekim çizgisi etrafında üremiĢ narin koloniler
görülmesi (bkz. ġekil 2).

Negatif sonuç – kanlı agarda kolonilerin sadece stafilokok ekim
çizgisine yakın değil her yerde üremiĢ olması veya hiç üreme
olmaması.

H. haemolyticus ve H. parahaemolyticus V faktöre gereksinim duyan
bakterilerdir; ancak stafilokok ekimi olmadan da kanlı agarda üreyebilir
ve satellit fenomeni göstermezler. Çünkü bu bakteriler hemolitiktir ve
besiyerine NAD salınmasını sağlayabilirler.
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Disk testinde, primer izolasyon plağından koloni alınırken besiyeri
parçası alınması X faktör (hemin) taĢınmasına ve dolayısı ile hatalı
sonuca neden olabilir.

Disk testinde kullanılan baz besiyerinde eser miktarda hemin
bulunması bile hatalı test sonucuna neden olabilmektedir. Ancak hiç X
faktörü içermeyen bir besiyeri mevcut değildir.

Disk test daha çok H. parainfluenzae ve H. influenzae tiplendirmesinde
olmak üzere, hatalı sonuçlar verebilmektedir ki bu oran %20’ye kadar
çıkabilir. Özellikle bazı H. parainfluenzae suĢlarının güç üreme özelliği
bu suĢlar için disk testlerinin okunmasını güçleĢtirebilir. Daha doğru
sonuç almak için “porfirin sentezi testi” önerilir.

V faktör, X faktörden daha hızlı bir Ģekilde besiyerine yayılma
özelliğindedir. Diskler birbirine çok yakın yerleĢtirilirse V faktör X faktör
diskinin yayılma alanına girebilir ve hatalı sonuçlar elde edilebilir.

Üretici firmalar X, V disklerindeki faktör konsantrasyonunu vermezler.
Bu nedenle satın alınacak disklerin kabulü, ambalaj içeriğinin
kontrolünden ziyade, bir dizi Haemophilus suĢu ile laboratuvarda test
edilerek ürünün performansının değerlendirilmesine dayanmalıdır.

Satellit testi ile elde edilen bulgular ön tanı niteliğindedir. Mutlaka diğer
testlerle tanımlama iĢlemi tamamlanmalıdır.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-23 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 9
X,V ve XV faktör gereksinimi
Şekil 1. Üreme faktörleri gereksinimi:
agar plakta bakteri ekim alanlarının
üzerine yerleĢtirilmiĢ X, V ve XV faktör
diskleri. Üstteki izolat sadece XV diskinin
etrafında üremiĢ olup H. influenzae ön
tanısı konabilir (3 no.lu kaynaktan
alınmıĢtır)
Şekil 2. Satellit fenomeni. Kanlı agar
plağında stafilokok ekim çizgisi yakınında
küçük Haemophilus sp kolonileri
gözlenirken ekim çizgisinin uzağında
üreme olmadığı dikkati çekmektedir.
(Kaynak:http://infectionnet.org/notes/mi
croorganisms/bacterial-pathogens-ofthe-respiratory-tract-andcns/attachment/satellite2/ )
Tablo 1. Üreme gereksinimlerine göre Haemophilus türlerinin tanımlanması (3).
Tür
X ve V Faktör gereksinimi
At veya tavşan kanlı
agarda β-hemoliz
X
V
+
+
+
+
+
H. parahaemolyticus
-
+
+
H. aphrophilus
+
-
-
H. parainfluenzae*
-
+
-
H. paraphrophilus*
-
+
-
H. influenzae
H. haemolyticus
*H. paraphrophilus ve H. parainfluenzae ornitin testi ile ayrılır; ilki negatif iken ikincisi pozitiftir.
Sayfa 8 / 9
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-23 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
X,V ve XV faktör gereksinimi
İlgili diğer UMS belgeleri
Bu UMS belgesi (X,V ve XV Faktör Gereksinimi) Haemophilus spp tanımlanma
Ģeması ile ilgilidir ve kullanımı ile ilgili bu belgeye de baĢvurulabilir:
UMS, B-MT-05
Haemophilus influenzae invaziv enfeksiyonlarının mikrobiyolojik
tanısı
Kaynaklar
1 Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC, Jr. (eds). Haemophilus.
Chapter 6. In: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 4th ed., J.B. Lippincott
Company, Philadelphia, PA. 1992, p. 279-301.
2 York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical tests for the identification of aerobic
bacteria. Satellite Test. In: Garcia LS (editor in chief). Clinical Microbiology Procedures Handbook.
2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 3.17.44.1 - 3.17.44.3
3 Perilla MJ, Ajello G, Bopp C, Elliott J, Facklam R, Knapp JS, Popovic T, Wells J, Dowell SF.
Streptococcus pneumoniae. In: Manual for the Laboratory Identification and Antimicrobial
Susceptibility Testing of Bacterial Pathogens of Public Health Importance in the Developing World.
Chapter V. CDC, and WHO. 2003, p. 45-62
4 Popovic T, Ajello GW, Facklam RR. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis Caused by
Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. Centers for
Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA. 1998.
5 Doern GV, Chapin KC. Laboratory identification of Haemophilus influenzae. Effets of basal media
on the results of the satellitism test and evaluation of the RapID NH system. J Clin Microbiol
1984;20:599-601.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-23 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 9 / 9
Download

X, V ve XV faktör gereksinimi