Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MİKROBİYOLOJİ
STANDARTLARI (UMS)
Tuz Tolerans Testi
%6.5’luk Sodyum Klorürde Üreme
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-21
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
Tuz tolerans testi
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3
GENEL BİLGİ ................................................................... 3
TEKNİK BİLGİLER ............................................................. 4
1
2
3
4
Test için asgari laboratuvar koşulları ................................ 4
Testin uygulanması ....................................................... 5
Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması ...................... 5
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 5
EKLER............................................................................. 6
Ek-1 %6.5 NaCl buyyon (Tuz Tolerans Besiyeri) hazırlanması2 6
KAYNAKLAR ..................................................................... 6
Sayfa 2 / 6
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-21 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Tuz tolerans testi
Kapsam ve Amaç
Organizmaların sodyum klorürün (NaCl) değişik konsantrasyonlarında üreyebilme
yetenekleri pek çok bakterinin (enterokoklar, halofilik vibriolar vb.)
tanımlanmasında kullanılan bir özelliktir.
Gram pozitif, katalaz negatif kokların tanımlanmasında da %6.5 tuz içeren
ortamda üreme özelliğinden yararlanılır ve bu onların ayırıcı tanısında önemli
parametrelerden biridir.
Bu UMS’de enterokokların tanımlanmasında tuz toleransı testinin uygulanması ve
yorumlanması ile ilgili prosedür verilmektedir. Prosedür diğer organizmaların test
edilmesinde kullanılan besiyeri ve tuz oranlarını kapsamaz; bununla birlikte,
besleyici buyyonun ve içindeki tuz konsantrasyonunun amaca uygun olarak
değiştirilmesi ile diğerlerine de uyarlanabilir.
Kısaltmalar ve Tanımlar
Halofilik
Tuzu seven (organizma)
NaCl
Sodyum klorür
PYR
L-pirolidonil--naftilamid
Genel Bilgi
Enterokokları diğer streptokoklardan ayıran önemli özelliklerden biri de %6.5NaCl
içeren ortamda üreme özelliğidir ve PYR testinin alternatifi olarak kullanılabilir.
Bu özelliğin test edilmesinde kullanılan tuz tolerans besiyeri kalp infüzyonu,
glikoz ve %6.5 NaCl içerir; indikatör olarak da bromkrezol moru bulunur.
Konsantrasyonu hayli yüksek olan tuz, besiyerinde seçici etken olarak işlev
görmektedir; çoğu bakterinin ozmotik dengesini ve membran geçirgenliğini
olumsuz yönde etkiler ve bu bakteriler canlılıklarını sürdüremezler. Buna karşın
tuza toleranslı organizmalar 48 saatte rahatlıkla ürerler.
Bulanıklık bir üreme göstergesi olsa da “pozitif tuz tolerans testi” daha ziyade
glikozun organizma tarafından kullanılması sonucu oluşan asit yıkım ürünlerinin
indikatör ile etkileşerek ortam rengini sarıya çevirmesi ile tanımlanır (1).
Pek çok laboratuvarda tuz tolerans testi, eskülin testi ile birlikte enterokokların,
grup D streptokok türleri olan Streptococcus bovis ve Streptococcus equinus’dan
ayırt edilmesinde kullanılmaktadır (2).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-21 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 6
Tuz tolerans testi
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koşulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS’de bahsi geçen organizmalar ile ilgili işlemler asgari BGD2 laboratuvar
şartlarında gerçekleştirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. Aerosol oluşturması muhtemel tüm laboratuvar çalışmaları bir
biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS’yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım
ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aşina olmalı, ve; (iii)
daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
1.3. Örnek, Reaktif, Donanım
Test mikroorganizmaları

Ayırıcı tanısı için tuz toleransı testine gereksinim duyulan şüpheli
izolatların taze kültürleri (agar plakta veya buyyonda).
Besiyeri

%6.5 NaCl buyyon (tuz tolerans buyyon) – Ticari olarak piyasadan
hazır temin edilebilir. Laboratuvarda hazırlanabilir (bkz. Ek-1).

%6.5 NaCl yatık agar besiyeri – indikatörün renk değişiminin
gözlenmesi daha kolay olabilir (bkz. Ek-1).
Diğer gereç, donanım

Öze, steril tek kullanımlık veya nikrom,

Test tüpleri,

İnkübatör (35°C)
1.4. Kalite kontrol

Her yeni besiyeri serisi kullanıma sokulmadan önce pozitif ve negatif
kalite kontrol suşları ile test edilmelidir.

Her kullanımdan önce besiyeri bulanıklık ve renk değişimi yönünden
kontrol edilmelidir.

Kalite kontrol organizmaları (1):
Enterococcus faecalis ATCC 29212 – tuzlu besiyerinde ürer (pozitif)
Streptococcus bovis ATCC 33317 – üremez (negatif)
Sayfa 4 / 6
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-21 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Tuz tolerans testi
2 Testin uygulanması

%6.5 NaCl buyyon içeren tüpe öze ile taze kültür plağından tek
düşmüş bir-iki koloni ya da steril Pastör pipeti ile bir gecelik buyyon
kültüründen bir-iki damla inoküle edilir.
NOT: İnokülasyon %6.5 NaCl içeren yatık agar besiyerine de yapılabilir.

Tüpün kapağı sıkıştırılır.

Aerobik olarak 35°C’de bir gece inkübe edilir ve üreme bulguları
(bulanıklık ve renk değişimi) değerlendirilir. İnkübasyon 14. güne
kadar uzatılabilir.
3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması

Pozitif sonuç – Belirgin bir bulanıklık ve/veya renk değişimi (menekşe
renginden sarıya) olması. Genellikle 24 saat içinde gözlenir; ancak
testin inkübasyon süresi gerekiyorsa 14. güne kadar uzatılır (1).

Negatif sonuç – herhangi bir bulanıklık veya sarı renk gelişmemesi.
NOT: Eğer eskülin pozitif ve %6.5 NaCl buyyonda üremiş ise
organizma bir Enterococcus türüdür. Eğer organizma eskülin pozitif
ancak %6.5 NaCl buyyonda ürememiş ise bir grup D streptokoktur.
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Eğer buyyona yoğun bir ekim yapılmış ise inokulumun kendisi üreme
sanılabilir ve hatalı bir şekilde pozitif olarak yorumlanabilir.

İnkübasyon sırasında üreme dibe çökmüş olabilir; testin yanlış negatif
yorumlanmasını önlemek için değerlendirme öncesi tüp hafifçe
çalkalanır.

Bazı grup B streptokoklar (hatta izolatların %80 kadarı) ve grup A
streptokoklar tuza-toleranslı olabilirler. Bazı aerokok türleri de hem
eskulin pozitif olabilir hem de %6.5 NaCl’de üreyebilirler.

Test için yatık agar kullanılması -renk değişimi erken dönemde ve
özellikle yatık kısmın tepesinde başlayacağı için- zayıf reaksiyonların
gözlenmesinde kolaylık sağlar.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-21 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 6
Tuz tolerans testi
Ekler
Ek-1 %6.5 NaCl buyyon (Tuz Tolerans Besiyeri)
hazırlanması2
İndikatör (%1.6’lık Bromkrezol moru)
Brom krezol moru
Etanol, %95’lik
1.6 g
100 mL
Karıştırılıp eritilir. Koyu renkli şişede oda sıcaklığında saklanır. Raf ömrü 1 yıldır.
%6.5’luk NaCl buyyon
Besiyerinin temel besleyici maddesi kalp infüzyonu olup normal olarak %0.5 NaCl içerir.
Bu nedenle %6.5’luk NaCl buyyon hazırlanırken tuz konsantrasyonunu artırmak için
litreye 60 g hesabı ile tuz eklenir.
100 mL besiyeri için şu örnek kullanılabilir:
Kalp infüzyon buyyonu
Sodyum klorür
İndikatör (%1.6’lık bromkrezol moru)
Glikoz
Distile/deiyonize su
2.5 g
6g
0.1 mL
0.5 g
100 mL
1. Maddeler su içinde karıştırılarak eritilir.
NOT: Eğer besiyeri yatık agar olarak hazırlanmak isteniyorsa 100 mL besiyeri için 1.5
g agar eklenir ve kaynar su banyosunda eritilir.
2. Burgu kapaklı tüplere 3-5 mL alikotlar halinde dağıtılır. 121°C’de 15 dakika
otoklavlanır.
NOT: Agar katılmış ise tüpler otoklav sonrasında yatık halde dondurulur.
3. Raf ömrü 6 aydır. Tüplerin üzeri besiyerinin adı, hazırlama ve son kullanma tarihleri
yazılarak etiketlenir, buzdolabında (2-8°C) saklanır.
Kaynaklar
1 York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical tests for the identification of aerobic
bacteria: 6.5% salt and temperature tolerance test. In: Garcia LS (editor in chief). Clinical
Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p.
3.17.43.1 - 3
2 Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC, Jr. (eds). The Gram-positive
cocci Part II: Streptococci and Streptococcus-like bacteria. Chart 11-4: Salt tolerance test. In:
Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 4th ed., J.B. Lippincott Company,
Philadelphia. 1992, p. 460.
Sayfa 6 / 6
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-21 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Download

Tuz tolerans testi - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu