Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MİKROBİYOLOJİ
STANDARTLARI (UMS)
Hareket Testi
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-04
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
Hareket testi
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3
GENEL BİLGİ ................................................................... 3
TEKNİK BİLGİLER ............................................................. 4
1
2
3
4
Test için asgari laboratuvar koşulları ................................ 4
Testin uygulanması ....................................................... 5
Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması1 ..................... 7
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 8
EKLER............................................................................. 9
Ek-1 Hareket testi besiyerinin (HTB) hazırlanması1 ............... 9
KAYNAKLAR ................................................................... 10
Sayfa 2 / 10
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-04 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Hareket testi
Kapsam ve Amaç
Bakterilerin hareket yeteneklerinin gösterilmesi değerli bir mikrobiyolojik
tanımlama parametresidir. Bazı organizmalar (ör., Escherichia coli‟nin laktoz
negatif kökenleri ve Shigella sp.) farklı türlere ait olmalarına rağmen benzer veya
aynı biyokimyasal reaksiyonları gösterdiklerinde, onları hareket testi ile ayırt
etmek mümkün olabilir. Çeşitli hareket testleri vardır. Bu UMS‟nin amacı hareket
testlerinin uygulanması ve yorumlanması için bir rehber sunmaktır.
Kısaltmalar ve Tanımlar
BHI
Brain Heart Infusion (beyin kalp infüzyonu)
HTB
Hareket Testi Besiyeri. Bir yarı-katı agar besiyeridir. Yabancı
kaynaklarda „Motility Test Medium (MTM)‟ şeklinde aranır.
KIA/TSI Kligler iron agar / Triple sugar iron agar; aynı amaçla
kullanılabilecekleri için (metinde) biri veya diğeri anlamında.
TSB
Triptik soya buyyonu
TTC
Trifenil tetrazolyum klorid
Genel Bilgi
Bazı bakteriler hücre duvarına ait „kamçı‟ olarak adlandırılan hareket
organellerine sahiptir. Hareket yeteneği genellikle çomak formundaki bakterilere
özgüdür, ancak az sayıda kok türünde de görülür (1). Kamçı üretimi kültür
şartlarına göre değişebilir; ör., Listeria monocytogenes oda sıcaklığında hareketli
iken 30°C‟nin üzerinde inkübe edildiğinde hareket yeteneğini kaybeder (2).
Bakterinin hareketinin gösterilmesi amacıyla hareket testleri kullanılır. Bir
bakteriye uygulanan hareket testi kesin tür tanımlaması için karar verdirici
olabildiğinden, laboratuvarın tanı kapasitesi için önemlidir. Hareket yeteneği, bir
mikroskop alanında veya tüpte ya da plaktaki yarı-katı agarda bakterinin bir
noktadan başka bir noktaya hareketinin gözlenmesi yoluyla test edilebilir. Tüp
testinde bir yarı-katı agara (HTB) batırma ekimi yapılır. Hareketli bakterilerin
agar boyunca bulanıklık oluşturarak ekim çizgisinin dışına çıktıkları gözlenirken,
hareketsiz olanlar sadece ekim çizgisinde ürerler (1,3). Mikroskopi yönteminde
ise bakteri süspansiyonu çukur lamda asılı-damla tekniği ile incelenir. Bu yöntem
daha ziyade HTB‟de iyi üreyemeyen bakteriler için kullanışlıdır (2,4).
HTB %0.4-0.5 agar içerir ve genellikle gram negatif enterik bakteriler için
kullanılır. Diğer bazı maddelerin ilavesi ile, bakterinin başka özellikleri de paralel
olarak test edilebilir (ör., Motilite-indol-ornitin besiyeri).
Besiyerine istenirse tetrazolyum tuzları da (ör., TTC) eklenebilir. Besiyerinde
çözünmüş halde ve renksiz bir vital boya olan TTC bakteri tarafından alındığında
indirgenerek çözünmez kırmızı renkli bir maddeye (asit formazan) dönüşmektedir
ve bakterinin hareketini daha iyi gözlenir hale getirir. Ancak bu madde bazı nazlı
bakterilerin üremesini baskılayabildiği için, her durumda kullanılamaz (1,4).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 10
Hareket testi
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koşulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS‟de bahsi geçen organizmalar ile ilgili işlemler asgari BGD2 laboratuvar
şartlarında gerçekleştirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. Aerosol oluşturması muhtemel tüm laboratuvar çalışmaları bir
biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS‟yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım
ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aşina olmalı, ve; (iii)
daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
1.3. Örnek, Besiyeri, Donanım
Test mikroorganizmaları

Hareket incelemesi gerekli görülen her klinik izolat
Asılı damla preparatı hazırlamak için besiyeri

Sıvı besiyeri, karbonhidrat içermeyen (ör., Nitrat buyyonu, TSB, BHI)

Herhangi bir yatık agar; zor üreyenler için TSB veya BHI eklenmiş

SF veya distile su
Yarı-katı agarda hareket testi için besiyeri / reaktif

Hareket testi besiyeri (HTB) – piyasadan hazır temin edilebilir veya
laboratuvarda hazırlanabilir (bkz. Ek-1). TTC içermesi isteğe bağlıdır.

Sülfit, indol, hareket (SIM) besiyeri - H2S‟i saptamak için sülfit içerir;
indol reaksiyonunu da değerlendirmek mümkündür.

Hareket-nitrat besiyeri

İndol ve lizin içeren hareket besiyeri (motilite-indol-lizin; MIL)

İndol ve ornitin içeren hareket besiyeri (motilite-indol-ornitin; MIO)

TTC, %1‟lik çözelti, steril
Diğer gereç, donanım

Çukur lam, asılı damla preparatı hazırlamak için (normal lam da lam
üzerinde Vazelin ile halkadan çukur oluşturularak kullanılabilir).

Lameller (2222 mm)

Mikroskop (ışık veya faz kontrast)

İğne öze, steril tek kullanımlık veya nikrom,
Sayfa 4 / 10
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-04 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Hareket testi
1.4. Kalite kontrol

Her yeni besiyeri lotu kullanıma sokulmadan önce pozitif ve negatif
kalite kontrol suşları ile test edilmeli, sterilite kontrolü yapılmalıdır.
Tüpler kullanım öncesi kontaminasyon yönünden incelenmelidir.

Laboratuvar personelinin asılı-damla testi uygulama becerisi, bilinen
hareketli suşların sıvı kültürlerinden yapılan egzersizlerle valide
edilmelidir.

Kontrol organizmaları– aşağıdaki tabloda listelenmiştir (1).
Organizmalar / ATCC
Besiyeri Hareket
Escherichia coli 25922
Hepsi
Testler
I
H2S
L
O
+
+
-
-
+
Klebsiella pneumoniae 13883, 27736 Hepsi
-
-
-
+
-
Proteus vulgaris 33420
+
+
+
* Kısaltmalar:
I, indol;
L, lizin;
SIM
O, ornitin;
SIM, sülfit-indol-motilite medium
2 Testin uygulanması
2.1. Asılı-damla tekniği
2.1.1. İnokulumun hazırlanması

Bakterinin taze agar kültüründen tek düşmüş bir koloniden sıvı kültür
yapılır. İnokulum hafif olmalı; bulanıklık görülmemelidir.

Besiyerinin seçimi etkene göre ve aşağıdaki ölçütler dikkate alınarak
yapılır:
(a)
Organizmanın üremesini destekleyecek, karbonhidrat içermeyen
bir besiyeri (BHI, nitrat buyyon vb.) seçilir.
(b)
Gram-negatif çomaklar için serum fizyolojik kullanılabilir.
(c)
Legionella için ılık, steril çeşme suyu kullanılır.
(d)
Bacillus spp için daima bir sıvı besiyeri kullanılmalıdır.
(e)
Enterokoklar için 0.5 mL BHI veya TSB kullanılır.
(f)
Zor üreyen mikroorganizmalar için bir yatık agar ekimi yapılır ve
dikkatlice yatık kısmın dibine, ekim çizgisini bir miktar kaplayacak
şekilde birkaç damla BHI veya besleyici buyyon eklenir. Asılı
damla, bir gecelik inkübasyon sonrasında sıvı kısımdan bir damla
kullanarak hazırlanır. Bu teknik özellikle nonfermentatif gram
negatif çomaklar için idealdir.
(g)
Su kullanılabilir; ancak bazı hareketli organizmaların distile suda
hareketsiz hale geldiklerine dair raporlar vardır.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 10
Hareket testi
2.1.2. Asılı-damla preparatın hazırlanması ve inceleme

Bakteri süspansiyonundan küçük bir damla bir lamelin ortasına konur.
Lamelin her bir köşesine çok küçük birer damla su konur.

Çukur lam, çukur kısmı alta gelecek şekilde çevrilir ve lamelin üzerine
getirilir; dikkatlice lamelin üzerine bırakılır (çukur kısım bakteri
damlasının üzerine gelecek şekilde).
NOT: Eğer çukur lam yoksa normal bir lam üzerine Vazelinden bir
halka yapılarak çukur oluşturulur ve aynı amaçla kullanılır.

Lamel lama yapışacaktır. Lam dikkatlice çevrilip düzeltildiğinde bakteri
içeren damla çukurun üstünde asılı durumda olacaktır.

Preparat mikroskopta 400 büyütmede bakteri hareketi yönünden
incelenir. Preparat ışık mikroskobunda ışık şiddeti azaltılarak -diyafram
kısılarak- veya faz kontrast mikroskobunda incelenmelidir.

İncelemede hareket gözlenmez ise sıvı kültür inkübe edilir:
(a) Nonfermenter gram negatif çomaklar 30°C‟de, 24 saat,
(b) Enterokoklar ve Listeria 30°C‟de, 2 saat,
(c) Diğer organizmalar için kendi optimal üreme şartlarında (genellikle
35°C‟de) inkübe edilirler.

İnkübasyon sonrası sıvı kültürden tekrar preparat hazırlanır, incelenir.
2.2. Tüp besiyerinde hareket testi

İnkübasyon öncesi tüp besiyeri oda ısısına getirilir.

Besiyeri yüzeyi kuru olmalıdır. Yüzey ıslak ise hareketsiz bakteriler bu
sıvı ile agar kenarından yayılarak üreyebilir ve bulanıklığa neden
olabilirler. Bu nedenle eğer sıvı varsa ekimden önce tüp eğilerek
dikkatlice dökülmelidir.

Bakterinin taze agar kültüründen tek düşmüş bir koloniden veya yatık
agar pasajından iğne öze ile inokulum alınır.

Tüpteki yarı-katı agarın merkezinden daldırılarak yaklaşık 2 cm ilerlenir.
Tek bir hareketle ekim yapılmalıdır.

Hareket tüplerinin okunması bazen zordur. Bu nedenle eş zamanlı
olarak pozitif ve negatif kontrol organizmaları için de tüpler inoküle
edilmelidir. Testin değerlendirilmesi böylece daha kolay ve güvenilir
olur.

Tüp kapakları gevşek kapatılır ve bir gece inkübe edilirler. İnkübasyon
şartları aşağıdaki gibidir:
(a) Enterobacteriaceae; 35°C‟de 24 saat,
(b) Nonfermenter gram negatifler ve enterokoklar; 30°C‟de, 24 saat,
(c) Negatif sonuç ile ilgili bir soru işareti varsa, 25°C de inkübe edilir,
(d) Listeria ve Yersinia‟lar için iki tüpe ekim yapılır; biri 35°C‟de, diğeri
25°C de 24 saat inkübe edilir.
Sayfa 6 / 10
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-04 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Hareket testi
2.3. Plak besiyerinde hareket testi

Yarı-katı agar besiyeri içeren bir tüp alınır ve kaynar su banyosunda
eritilir ve steril bir Petri kabına dökülür; katılaşması beklenir.
NOT: Yarı-katı agar besiyeri önceden tüplere 18-20 mL dağıtılarak
hazırda bulunduruluyor olmalıdır (bkz. Ek-1).

Bir iğne öze ile incelenecek bakterinin taze kültüründen, tek düşmüş
koloninin üzerine veya KIA/TSI pasajına dokunarak inokulum alınır.

Plaktaki besiyerinin ortasına dokunarak nokta ekim yapılır. Yukarıda
2.2‟de belirtildiği gibi inkübe edilir.
3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması1
3.1. Asılı-damla preparatında hareketin değerlendirilmesi

Pozitif sonuç – aceleci, zikzak, yuvarlanma veya diğer anlamlı yer
değiştirme şeklinde hareketlerin gözlenmesi.

Negatif sonuç – hareket görülmemesi veya sadece Brownian hareket
NOT 1: Brownian hareket, bir sıvıda asılı haldeki partiküllerin
(bakterilerin) moleküler bombardımana bağlı olarak titreşip
salınmasıdır ve gerçek hareketlilik ile karıştırılmamalıdır. Brownian
harekette organizmaların diğerlerine göre bağıl konumu değişmez.
Gerçek hareketlilik durumunda ise, organizmaların birbirlerine göre
yer değiştirdikleri ayırt edilir.
NOT 2: Campylobacter‟lerde çok aktif bir hareketlilik gözlenir; alanın
içine giren, alandan çıkan, koşuşturan minik noktalar gibi görünürler.
3.2. Tüp besiyerinde hareket testinin değerlendirilmesi

Pozitif sonuç – tüp besiyerinde ekim çizgisinden uzaklaşarak, yaygın
üreme veya besiyerinde bulanıklık görülmesi: bakteri hareketli.

Negatif sonuç – tüp besiyerinde temiz/berrak bir görünüm ve sadece
inokülasyon çizgisinde sınırlı üreme görülmesi: bakteri hareketsiz.
NOT: TTC içeren besiyerinde bakterinin ürediği yerde kırmızı renk
meydana gelir. Hareketli organizmalar -ekim çizgisinden yayılanpembe bir renk üretirler. Hareketsiz organizmalar ise ekim çizgisinde
sınırlı bir pembe-kırmızı renk oluştururlar.

Negatif tüpler, eğer gerek görülüyorsa 25°C‟de 5. güne kadar tutulur.
3.3. Plak besiyerinde hareket testinin değerlendirilmesi

Pozitif sonuç – agar plakta inokülasyon noktasından uzağa doğru
(agar TTC‟li ise, pembe) difüzyon gözlenmesi: bakteri hareketli.

Negatif sonuç – sadece ekim noktasında üreme; dışa doğru bir
yayılma olmaması: bakteri hareketsiz.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 10
Hareket testi
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Asılı damla testinde, özellikle zayıf hareket yeteneği olan bakterilerde,
bakteri hareketi ile Brownian hareket karıştırılabilmektedir. Her bir
hücre daha uzun süre izlenerek hareketin niteliği ayırt edilmeye
çalışılmalıdır.

Mikroskop lamının aşırı ısınması gözlem sonuçlarını etkileyebilir.

Eğer bakteriyel kamçılar ısıtma, çalkalama vb. bir travma ile hasar
görmüş ise yanlış negatif sonuç alınabilir. Böyle çevresel etkiler
bakterinin hareket yeteneğini kaybetmesine yol açabilmektedir.

Bazı organizmalar (ör.,Yersinia spp, Listeria spp) 35-37°C‟de kamçı
proteinlerini sentezleyemezler, fakat 22-25°C‟de sentezleyebilirler.

TTC bazı zor üreyen bakteri türleri için inhibitör olabilir.

Bazı bakteriler kan kültürlerinden ilk izolasyonda hareket özelliği
göstermezler.

Bazı bakterilerin eski kültürlerinde hareket özellikleri azalır. Hareket
testi taze kültürlerden tekrarlanmalıdır.

Bacillus türleri en iyi taze plaklarından direkt test edilir. Eğer taze plak
mevcut değilse bir plağa ekim yapılır ve 4 saat inkübe edilir; asılıdamla preparatı bu inkübasyondan sonra yapılır.

Anaeroblar için hareketlilik sonuçlarını belirlemek zordur. Yalnızca
pozitif sonuçlar anlamlı kabul edilir.

Pseudomonas aeruginosa gibi üremek için oksijen gereksinimi yüksek
olan organizmalar tüp besiyerinin yüzeyine yayılan bir film katman
oluştururlar. Bu tür bakterilerin hareket testinde -özellikle oksijenin
giderek azaldığı düzeylerde üremeyecekleri için- ekim çizgisinden
yayılma gözlenmeyecektir.

Pek çok organizma tüpte yarı-katı agarın derin kısımlarında üreyemez;
bunlar için plak besiyerine nokta ekim daha uygun olabilir.

Hareketsiz, mukoid Klebsiella kökenleri tüp besiyerinde yanlış pozitif
hareket reaksiyonu verebilir; bu mukoid suşların tüp ile besiyeri
arasına yayılması yüzünden olabilmektedir ve bulanık görünüm hareket
reaksiyonu ile karıştırılabilmektedir.
Sayfa 8 / 10
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-04 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Hareket testi
Ekler
Ek-1 Hareket testi besiyerinin (HTB)
hazırlanması1
Tüpte hareket testi için besiyerinin hazırlanması
Sığır eti özütü
Pankreatik kazein
Sodyum klorür
Agar
Distile/deiyonize su
3.0 g
10.0 g
5.0 g
4.0 g
1000 mL
1. Maddeler bir erlene konur; bir manyetik karıştırıcı üzerinde karıştırılarak ısıtılır
(kaynama derecesinde), eritilir.
2. pH ölçülür ve gerekli ise 7.3‟e ayarlanır. 121°C‟de 15 dakika otoklavlanır.
3. 50°C‟ye soğutulur.
NOT: TTC eğer isteniyorsa bu aşamada eklenir. Steril, %1‟lik TTC‟den 5 mL
1000 mL besiyerine eklenir.
4. Besiyeri aseptik şartlarda, steril, burgu kapaklı tüplere (13x100-mm) 5 mL
tevzi edilir. Kapakları gevşek kapatılır.
5. Tüpler dik pozisyonda donmaya bırakılır. Donduktan sonra da kapaklar bir
süre daha gevşek bırakılarak besiyeri yüzeylerinin kuruması beklenir.
6. Besiyerinin adı ve son kullanma tarihi yazılarak tüplerin üzeri etiketlenir.
Kapaklar sıkılaştırılır ve buzdolabında saklanırlar; saklama koşullarına
uyulduğunda raf ömrü 6 aydır.
Plakta hareket testi için tüplerin hazırlanması
1. Agar oranı hayli düşük (%0.4) olan HTB‟nin plaklara dökülmüş halde,
bütünlüğü bozulmadan saklanması güçtür ve dolayısı ile plakta hareket testi
için besiyerinin test yapılacağı zaman plağa dökülmesi tercih edilir.
2. Bu amaçla, besiyeri önce yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanır. Tüplere
dağıtma aşamasında (4. adım) büyük tüplere (25x150 mm) 20 mL dağıtılır
ve dik konumda dondurulduktan sonra saklanır.
3. Bu şekilde hazırlanmış her bir tüp daha sonra test yapılacağı zaman kaynar su
banyosunda eritilecek ve bir Petri plağına dökülecektir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 9 / 10
Hareket testi
Kaynaklar
1 York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical tests for the identification of aerobic
bacteria. Motility Test. In: Garcia LS, Isenberg HD (eds). Clinical Microbiology Procedures
Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 3.17.31.1 - 3.17.31.4
2 Pratt-Rippin K, Pezzlo M. Identification of commonly isolated aerobic gram-positive bacteria:
Broth motility test: Hanging drop. In: Isenberg HD (ed in chief). Clinical Microbiology Procedures
Handbook. ASM Press, Washington D.C. 1992, p. 1.20.37
3 Manual for the Laboratory Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing of Bacterial
Pathogens of Public Health Importance in the Developing World. Center for Diseases Control and
World Health Organisation. 2003.
4 Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC, Jr. (Eds). The
Enterobacteriaceae. In: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 4th ed., J.B.
Lippincott Company, Philadelphia. 1992, p.125.
Sayfa 10 / 10
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-04 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Download

Hareket testi - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu