Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MİKROBİYOLOJİ
STANDARTLARI (UMS)
Üreaz Testi
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-22
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no
Değişiklik
Tarih
Üreaz testi
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
GENEL BİLGİ ................................................................... 3
TEKNİK BİLGİLER ............................................................. 3
1
2
3
4
Test için asgari laboratuvar koşulları ................................ 3
Testin uygulanması ....................................................... 5
Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması ...................... 5
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 5
EKLER............................................................................. 7
Ek-1 Üre besiyerlerinin hazırlanması1,5 ................................ 7
KAYNAKLAR ..................................................................... 8
Sayfa 2 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-22 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Üreaz testi
Kapsam ve Amaç
Üreaz testi mikroorganizmaların üreyi hidroliz etme yeteneğinin test edilmesi
amacıyla kullanılır. Üreaz testi özellikle Enterobacteriaceae üyelerinin
tanımlanmasında IMViC test paketini tamamlayıcıdır. Ayrıca diğer birçok bakteri
ve mantar türünün tanımlanmasında da üreaz testi kullanılır. Bu UMS’de de rutin
laboratuvarlarda üreaz testinin uygulanması ve yorumlanmasına dair bir rehber
sunulması hedeflenmiştir. Helicobacter pylori enfeksiyonu tanısı için gastrik
biyopsi örneklerine uygulanan üreaz testi bu UMS’nin kapsamında değildir.
Genel Bilgi
Pek çok organizma sahip oldukları üreaz enzimlerinin aktivitesi ile üreyi kullanma
yeteneğine sahiptirler. Üreaz enzimi ürenin amonyak ve karbondioksite
yıkılmasını sağlar; amonyak bir ile reaksiyon ile amonyum karbonata dönüşür ve
ortam pH’ı alkali olur. Alkali ürünler, pH indikatörü fenol kırmızısının varlığında
ortam renginin sarıdan pembe-kırmızıya dönüşmesi ile saptanır (1,2).
Bu yetenek üreaz pozitif türlerin diğerlerinden ayırt edilmesinde, özellikle
Enterobacteriaceae ailesi içinde, çok kullanışlıdır. Proteus’lar ve bazı
Enterobacter, Citrobacter ve Klebsiella türleri üreaz pozitiftirler. Üreaz negatif
olan Salmonella ve Shigella türleri de çoğu üreaz pozitif olan Yersinia türlerinden
üreaz testi ile ayırt edilirler (1,3).
Üreaz aktivitesinin gösterilmesi ayrıca üreaz negatif olan Corynebacterium
diphtheriae’nin bazı üreaz pozitif patojen türlerden (Corynebacterium ulcerans ve
Corynebacterium pseudotuberculosis) ayrımında önemlidir. Üreaz testi Brucella
türlerinin, Helicobacter pylori’nin ve Cryptococcus, Trichosporon gibi pek çok
maya cinsinin tanımlanmasında da kullanışlı bir araçtır (1,4).
Test için kullanılan üre besiyeri üre ve fenol kırmızısı içerir. Fenol kırmızısı pH
indikatörüdür ve pH>8.4 ise besiyeri pembe-kırmızı, pH<6.8 ise sarı-açık turuncu
görünür. Besiyeri protein içermez ya da çok az içerir. Bu da üre dışında protein
deaminasyonuna bağlı pH yükselmesini ve yanlış pozitifliği önler (1,5).
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koşulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS’de bahsi geçen organizmalar ile ilgili işlemler asgari BGD2 laboratuvar
şartlarında gerçekleştirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. Aerosol oluşturması muhtemel tüm laboratuvar çalışmaları bir
biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-22 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 8
Üreaz testi
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS’yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım
ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aşina olmalı, ve;(iii)
daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
1.3. Örnek, Reaktif, Donanım
1.3.1. Test mikroorganizmaları

Dışkı kültürlerinden enterik patojen şüpheli izolatlar - enterik
patojenlerin tanımlanması amacıyla her şüpheli gram negatif çomak
bakteriye KIA/TSI pasajını takiben IMViC test paketi ile birlikte üreaz
testi de uygulanır.

Güç üreyen gram negatif çomaklar (Brucella spp, H. pylori, ve
Pasteurella spp şüpheli izolatlar)

Gram pozitif çomaklar (Corynebacterium spp ve Rhodococcus spp
şüpheli izolatlar) – özellikle difteri şüphesinde klinik örneklerden izole
edilmiş Corynebacterium izolatlarının üreaz pozitif patojen kökenlerden
biri olup olmadığının ayrımı için

Mayalar (Cryptococcus spp, Trichosporon spp, Candida spp izolatları)
1.3.2. Üre besiyerleri
Besiyerleri piyasadan hazır temin edilebileceği gibi laboratuvarda da
hazırlanabilir. Üre besiyeri olarak aşağıdakilerden biri kullanılır:

Christensen’in üre agarı – Üre, pepton, dekstroz, tampon madde, fenol
kırmızısı ve agar içerir. Yatık agar şeklinde tüplerde hazırlanır. İçeriği
güç üreyen pek çok bakterinin üremesini destekler. Laboratuvarda
hazırlamak için bkz. Ek-1.
ÖNEMLİ: Besiyerine katılacak üre çözeltisi otoklavlanmaz! Filtrasyon ile
steril edildikten sonra otoklavlanmış agar baza eklenir. Piyasada, agar
baza eklemek üzere hazır 10 kat yoğun (10) üre çözeltileri mevcuttur.

Christensen’in üre buyyonu – Sıvı besiyeri olarak hazırlanır (bkz. Ek-1)

Hızlı üre besiyeri – Piyasadan hazır temin edilir. Agar ve buyyon
formları vardır. Üretici firmanın talimatı doğrultusunda kullanılır. Hızlı
üre testi laboratuvarda izole edilmiş organizmalardan başka gastrik
biyopsi örneklerinin incelenmesinde de tercih edilir.

Üre diskleri veya tabletleri – uygulama kolaylığı nedeniyle tercih
edilebilirler. Üretici firmanın talimatına göre kullanılırlar.
1.3.3. Diğer materyal

Bakteriyolojik öze, tek kullanımlık veya nikrom

Cam tüpler, burgu kapaklı, 1275 mm

Filtre, enjektör tipi, selüloz asetat veya naylon, por çapı 0.22µm

Enjektör, 50 mL’lik, filtre ile sterilizasyon için

İnkübatör, 35-37°C
Sayfa 4 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-22 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Üreaz testi
1.4. Kalite kontrol

Her yeni besiyeri lotu kullanıma sokulmadan önce kalite kontrol suşları
ile test edilmelidir. Lotlar arasında haftada bir; laboratuvar testi daha
uzun aralıklarla yapıyorsa her testte kalite kontrol yapılmalıdır.

Saklamaya kaldırmadan önce tüpler incelenmeli; agar bazlı olanlarda
hava kabarcığı, yarık vb. gözleniyorsa o tüpler atılmalıdır.

Her kullanım öncesi besiyeri tüpleri kontaminasyon, donma, kuruma,
renk değişimi vb. yönünden incelenmeli; sorun gözlenen tüpler
atılmalıdır.

Kalite kontrol organizmaları:
Escherichia coli ATCC 25922 – negatif (renk değişikliği yok)
Proteus mirabilis ATCC 12453 – pozitif (koyu pembe-kırmızı)
2 Testin uygulanması

Steril öze kullanılarak, tek düşmüş koloniden (ya da enterik patojen
söz konusu ise - bakterinin KIA/TSI agar pasajının 4-6 saatlik
kültüründen) hafif bir inokulum alınır.

Üre agarın yatık yüzeyine sürülerek ekim yapılır. Üre buyyon
kullanılıyorsa öze ile inokulum buyyon içinde homojenize edilir.
ÖNEMLİ: Besiyerleri burgu kapaklı tüplerde hazırlanmış olmalıdır.
Pamuk tıkaçlı tüpler laboratuvar güvenliği kuralları gereği kullanılmaz!

Kapak gevşek olacak şekilde aerobik şartlarda 35-37°C’de inkübe
edilir. Nonfermentatif bakteriler 30°C’de inkübe edilmelidir.

Tüplerde renk değişimi (pembe-kırmızı) olup olmadığı 2., 4., 6. ve 24.
saatlerde incelenir. Gerektiğinde tüpler 7 güne kadar izlenir.
NOT: Eğer organizma yatık kısımda üreme göstermiyorsa saf
kültüründen yoğun miktarda alınması ve üre agara pasajlanması
önerilir; önceden oluşmuş üreazı bu yolla saptamak mümkün
olabilmektedir.
3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması

Pozitif üreaz testi – tüpte yoğun pembe renk meydana gelmesi;
etkene göre değişen sürede (15 dakika ile 24 saat içinde)

Negatif üreaz testi – renk değişimi olmaması
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Bazı organizmalar (Brucella spp ve H. pylori) üreye çok hızlı bir şekilde
etki ederlerken diğerleri yavaş reaksiyon gösterirler.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-22 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 8
Üreaz testi

Üreaz test tipinin seçilmesinde (agar, buyyon, disk vb.) organizmaya
göre karar verilmelidir.

Uygun olmayan besiyeri, yetersiz inokulum veya eski kültürlerin
kullanılması halinde yanlış negatif sonuçlar alınabilir.

Pepton içeren besiyerlerinde gecelik inkübasyonlarda, üreme ile birlikte
ürenin hidrolizine değil, peptonun yıkımına bağlı olarak alkali reaksiyon
gelişebileceği akılda tutulmalıdır.

Eğer besiyeri tamponlu değilse testin duyarlılığı düşer.

Üre ışığa duyarlı bir maddedir ve kendiliğinden hidrolize uğrayabilir.
Buzdolabında, karanlıkta saklanmalıdır.
Sayfa 6 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-22 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Üreaz testi
Ekler
Ek-1 Üre besiyerlerinin hazırlanması1,5
%1’lik Fenol kırmızısı (Stok indikatör)
Fenol kırmızısı, toz
Distile/deiyonize su
0.1 g
10 mL
1. Fenol kırmızısı maddesi su içinde eritilir ve burgu kapaklı bir tüpe aktarılır.
2. Raf ömrü 1 yıldır. Tüpün üzeri içeriğin adı, konsantrasyonu, hazırlama ve son
kullanma tarihleri yazılarak etiketlenir, buzdolabında (2-8°C) saklanır.
Üre Baz 10 çözeltisi
Pepton
Sodyum klorür (NaCl)
Monopotasyum fosfat (KH2PO4)
Glikoz
Üre
Fenol kırmızısı, %1’lik
Distile/deiyonize su
1g
5g
2g
1g
20 g
1.2 mL
100 mL
1. Maddeler su içinde eritilir. pH 6.8’e ayarlanır. Steril bir şişe alınır ve aseptik
şartlarda çözelti bu şişeye filtrasyon ile sterilize edilerek aktarılır. Takiben
burgu kapaklı tüplere 10 mL alikotlar1,2 halinde dağıtılır.
2. Raf ömrü 3 aydır. Tüplerin üzeri, içeriğin adı, konsantrasyonu, hazırlama ve
son kullanma tarihleri yazılarak etiketlenir, buzdolabında (2-8°C) saklanır.
Agar Baz
Agar
Distile/deiyonize su
1.5 g
90 mL
1. Agar su ile karıştırılır. 121°C’de 15 dk otoklavlanır.
1
Bu alikotların her biri 100 mL üre agar veya buyyon içindir. Laboratuvar tüketim hızına göre (raf ömrü içinde
tüketip tüketemeyeceğini değerlendirerek) hazırlayacağı üre baz 10 solüsyon miktarını gerekiyorsa
değiştirmelidir.
2
10 (konsantre) solüsyonda kristaller oluşursa, genellikle oda sıcaklığında veya 40°C su banyosunda birkaç
dakika içerisinde çözünürler.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-22 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 8
Üreaz testi
Christensen’in Üre Agarı
1. Otoklavlandıktan sonra agar baz bir 55°C’ye ayarlı bir su banyosu içinde
soğutulur.
2. Bir adet 10 mL üre baz 10 içeren tüp de su banyosu içinde 50-55°C’ye
ısıtılır.
3. Üre baz 10 aseptik olarak agar baza eklenir; karışması sağlanır. Burgu
kapaklı tüplere 3-4 mL dağıtılır. Yatık pozisyonda katılaşmaya bırakılır.
4. Raf ömrü 3 aydır. Tüplerin üzeri, içeriğin adı, hazırlama ve son kullanma
tarihleri yazılarak etiketlenir, buzdolabında (2-8°C) saklanır. Renk değişikliği
(olursa) ürün özelliğinin değiştiğini gösterir. Böyle tüpler kullanılmaz!
Christensen’in Üre Buyyonu
Üre baz 10
Steril distile/deiyonize su
10 mL
90 mL
1. Aseptik şartlarda karıştırılır ve burgu kapaklı tüplere 1 mL dağıtılır.
2. Raf ömrü 1 aydır. Tüplerin üzeri, içeriğin adı, hazırlama ve son kullanma
tarihleri yazılarak etiketlenir, buzdolabında (2-8°C) saklanır. Renk değişikliği
(olursa) ürün özelliğinin değiştiğini gösterir. Böyle tüpler kullanılmaz!
Kaynaklar
1 York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical tests for the identification of aerobic
bacteria. Urea test. In: Garcia LS (editor in chief). Clinical Microbiology Procedures Handbook.
2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 3.17.48.1 - 3
2 Bilgehan H. Besiyerleri, ayıraçlar ve deneyler: Üre agar (Christensen’s). Klinik Mikrobiyolojik Tanı.
5. Baskı, Barış Yayınları, Izmir. 2009, p. 707
3 Barryl AL, Bernsohn KL, Thrupp LD. Four-hour urease test for distinguishing between Klebsiella
and Enterobacter. Appl Environ Microbiol 1969;18(2):156-158
4 Goldie J, Veldhuyzen van Zanten SJO, Jalali S, Hollingsworth J, Riddell RH, Richardson H, Hunt
RH. Optimization of medium for rapid urease test for detection of Campylobacter pylori in gastric
antral biopsies. J Clin Microbiol 1989;27:2080–2082.
5 Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC Jr. (eds). The
Enterobacteriaceae. Chart 3-8: Urease. In: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology.
4th ed., J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA. 1992, p.178.
Sayfa 8 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-22 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Download

Üreaz Testi - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu