Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MİKROBİYOLOJİ
STANDARTLARI (UMS)
Suş Saklama Prosedürü
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-24
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
Suş saklama prosedürü
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3
GENEL BİLGİ ................................................................... 3
TEKNİK BİLGİLER ............................................................. 4
1
2
3
4
Saklama teknikleri için asgari laboratuvar koşulları ............ 4
Dondurarak saklama prosedürü ...................................... 6
Saklanan izolatın yeniden canlandırılması ......................... 6
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 7
KAYNAKLAR ..................................................................... 8
Sayfa 2 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-24/ Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Suş saklama prosedürü
Kapsam ve Amaç
Kültürlerde üreyen mikroorganizmalar zaman içinde canlılıklarını kaybederler.
Eğer izolatların gelecekte yine kullanılması düşünülüyorsa, ölüm hızını
yavaşlatmak ya da durdurmak ve özelliklerini olduğu gibi koruyarak saklamak
gerekir. Bu UMS‟de de bakteri izolatlarını saklamak için rutin laboratuvarlarda
kolay uygulanabilir olan dondurarak saklama prosedürünün verilmesi
hedeflenmiştir. Diğer saklama teknikleri ve diğer organizma türleri (mantar,
parazit, virüs) için prosedürler bu kapsama dahil edilmemiştir.
Kısaltmalar ve Tanımlar
Desikatör
Laboratuvarda içine konulan maddenin kuru halde kalması için
kullanılan kap; içinde nem alıcı madde bulunur ve sıkı kapanır.
Saklama
Bir organizmayı fenotipik ve genotipik özelliklerinde herhangi bir
değişikliğe meydan vermeden ve kontamine etmeden canlı
durumda tutabilmek (yöntemi)
‘skim-milk’
Yağsız süt
TSB
Triptik soya buyyon
Genel Bilgi
Organizma kültürlerinde hücre ölümünün temel nedeni metabolik olayların
devam etmesi sonucu ortaya çıkan toksik maddeler ve çevresel etkilerdir.
Organizmanın yaşamını sürdürebilmesi için gereken metabolik olaylar yavaşlatılır
veya önlenebilirse bakteri uzun süre saklanabilir. Kültürlerdeki toksik olayların
yavaşlatılması iki temel yol ile sağlanabilir. Birincisi, ortam ısısının düşürülmesi
(dondurma); ikincisi, ortamdaki suyun uzaklaştırılması işlemidir (kurutma). Rutin
laboratuvarlarda ortam ısısının düşürülmesi yöntemi kolaylıkla uygulanabilir.
Nitekim, organizmaların gelecekte yapılabilecek çalışmalar için kısa veya uzun bir
dönem boyunca saklanması, modern mikrobiyolojinin tarihi kadar eskidir ve
çeşitli organizma türleri için çeşitli saklama yöntemleri geliştirilmiştir (Tablo 1)
(1,2). Mikroorganizma koleksiyonları eğitim amaçları, standart suşların
korunması, epidemiyolojik incelemeler, testlerin tekrarı, hastalığın tedavisi ile
ilgili süreçler ya da mikrobiyal evrim ve farklılaşma üzerine bilimsel
araştırmalarda kullanılabilecek çok değerli kaynaklardır.
Seçilecek saklama tekniği amaca ve organizmaya göre değişkenlik gösterir. Klinik
laboratuvarlar için basit ve yaygın uygulanabilir saklama yöntem(ler)i idealdir.
Bunlardan biri dondurarak saklama olup, bu teknik ile bakteri izolatlarının
birkaç aydan birkaç yıla kadar saklanması mümkündür (1,3). Dondurarak
saklama için bakterinin önce bir koruyucu ortam içine alınması gerekir. Koruyucu
olarak en sık gliserol buyyon, „„skim-milk‟‟ veya at, koyun gibi bir hayvanın kanı
kullanılır. Bu gibi maddelerin ortak özelliği -su, kristalize olduğunda bakterinin
delinmesine ve ölümüne yol açabildiğinden- donma esnasında suyun kristalize
olmasını önleyerek bakteriyi korumalarıdır (3).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-24/ Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 8
Suş saklama prosedürü
Tablo 1. Klinik mikrobiyolojide mikroorganizmaların saklanması için kullanılan yöntemler (2).
Teknik
Açıklama
Periyodik pasaj
Organizmayı periyodik aralıklarla yeni bir besiyerine pasajlama. Değişkenlere (pasaj
sıklığı, kullanılan besiyeri ve saklama sıcaklığı) de bağlı olarak, bu teknikte, mutasyon
oranı yüksek olabilir, varyantların üretimine yol açılabilir.
Mineral yağda yatık
agar kültürü
Organizmanın yatık agarda üretilmiş ve üzeri steril mineral yağ ile kaplanmış kültürü.
Oda ısısında veya buzdolabında saklanabilir.
Minimal ortam (saf
su ya da su agar)
Organizmanın sudaki yoğun süspansiyonları. Bazı organizmalara (Pseudomonas spp,
çoğu mantar vb.) uygulanabilir; buzdolabında 3-5 ay veya daha uzun süre canlılık
korunabilir.
Koruyucu ortam
içinde dondurma
Organizmanın bir koruyucu ortam (%16‟lık gliserol buyyon, %10‟luk „„skim-milk‟‟,
hayvan kanı) içindeki yoğun süspansiyonu; -20°C ya da -80°C‟de birkaç aydan birkaç
yıla kadar saklanabilir.
Kurutma
Organizma steril toprak, steril filtre kağıdı diskler ya da jelatin damlaları üzerinde
kurutulur; desikatör içinde buzdolabında ya da daha uzun süreler için derin dondurucuda
saklanabilir.
Dondurarak kurutma
(liyofilizasyon)
Organizmanın „„skim-milk‟‟ gibi bir koruyucu içindeki süspansiyonunda hızla
dondurularak kurutulması işlemi; içinde bulunduğu ampulün hava ile teması tamamen
kesilmiştir; canlılık çok uzun süre korunur (30 yıl rapor edilmiştir).
Ultra-dondurma
Sıvı azot (-196°C) kullanılır; narin organizma kültürleri bile 15 yıldan fazla korunur.
Teknik Bilgiler
1 Saklama teknikleri için asgari laboratuvar
koşulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS‟de bahsi geçen organizmalar ile ilgili işlemler asgari BGD2 laboratuvar
şartlarında gerçekleştirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. Aerosol oluşturması muhtemel tüm laboratuvar çalışmaları bir
biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
Güvenlik uyarısı! Mikroorganizmaların saklanması, laboratuvarda zaman içinde
büyük miktarda ve çeşitlilikte patojen organizmanın yoğun süspansiyonlarını
içeren tüplerin/ampullerin birikmesi anlamına gelir. Bu saklanmış (dondurulmuş,
liyofilize vb.) organizmaların tutulduğu dolap veya rafların istenmeyen bir şekilde
devrilmesi (ör., deprem, hatalı yerleştirme) ve tüplerin/ampullerin saçılması ve
kırılması olasılığına karşı ciddi önlemler alınmış olmalıdır! (Varsa) yüksek riskli
patojen mikroorganizma kültürlerinin de yetkisiz kişilerin eline geçmesini
önlemek için gereken önlemler alınmış olmalıdır! Yüksek riskli patojen
mikroorganizma kültürlerinin/stoklarının laboratuvarda bulundurulması ile ilgili
olarak THSK, Ulusal Kültür Koleksiyonları ile iletişim kurunuz!
Sayfa 4 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-24/ Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Suş saklama prosedürü
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS‟yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım
ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aşina olmalı, ve; (iii)
daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
1.3. Örnek, Besiyeri, Donanım
Örnek

Saklanması hedeflenen izolat
Besiyerleri

%10‟luk skim-milk – 1 g toz „skim-milk‟ 10 mL distile su içinde eritilir.*
110°C‟de 10 dk otoklavlanır. Alternatif olarak solüsyon kaynar su
banyosunda 1 saat tutulur; bu işlem üst üste 2 gün daha tekrarlanır
(tindalizasyon). Etiketlenir ve buzdolabında saklanır. Raf ömrü 6 aydır.

%16‟lık gliserollü buyyon – 1 g TSB (glikoz içermeyen), 10 mL gliserol
ve 40 mL distile su manyetik karıştırıcıda karıştırılır, eritilir. pH ölçülür
ve 7.2‟ye ayarlanır. 115°C‟de 10 dk otoklavlanır. Etiketlenir ve
buzdolabında saklanır. Raf ömrü 6 aydır.

İzolatın taze pasajını elde etmek için besiyeri plakları –
(a) %5 koyun kanlı agar veya çikolata agar
(b) Üremek için özel besiyerlerine gereksinim duyan bakteriler için
üreyebildikleri özel besiyeri – ör., Brucella spp için Brucella agar,
Bordetella spp için Bordet-Gengau agar, Bordetella ve Legionella
spp için BCYE (buffered charcoal yeast extract) agar gibi.
Diğer gereç, donanım

Öze, steril tek kullanımlık veya nikrom

Derin dondurucu tüpleri, plastik, dıştan burgu kapaklı, steril (2.0 mL)

Pastör pipeti, steril

Vorteks
1.4. Kalite kontrol
*

Saklama besiyerine sterilite kontrolü uygulanır.

Sterilite kontrol için 3 adet kanlı veya çikolata agar plağı alınır ve
saklama besiyerinden (%10‟luk skim-milk veya %16‟lık gliserol buyyon)
her bir plağa 100 µL yayma ekim yapılır. 35°C‟de 48-72 saat inkübe
edilir.

Plaklarda hiç mikroorganizma ürememiş olması beklenir. Üreme varsa
o saklama besiyeri serisi atılır.
Laboratuvar kendi tüketim hızına göre hazırlayacağı miktarı değiştirebilir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-24/ Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 8
Suş saklama prosedürü
2 Dondurarak saklama prosedürü
ÖNEMLİ: Zaman içinde saklama işlemi laboratuvarda yer sıkıntısının baş
göstermesine neden olur. Bu nedenle laboratuvarlar suş saklama hususunda
öncelikle bir politika oluşturmalı; bütün izolatları değil ama bu politika
çerçevesinde saklanması gereken izolatları saklamalıdır. Saklama sürecinin
basit bir algoritması Şekil 1‟de verilmiştir.

Öncelikle saklanacak izolatın yoğun saf kültürü elde edilmiş olmalıdır.
Bunun için izolatın rahat üreyebileceği plak besiyerinden iki adet alınır.
Üzerine izolatın kimlik bilgileri (adı, laboratuvar no vb.) ve tarih yazılır.

İzolatın orijinal kültüründen bir koloni (veya saf kültüründen bir öze
dolusu) alınarak her iki plağa -azaltma yapmaksızın- yoğun ekim
yapılır.

Plaklar izolatın gereksinimine göre uygun inkübasyon şartlarında
(aerob veya mikroaerofil), 35-37°C‟de, 24 saat inkübe edilir.
NOT: İnkübasyon süresi sonunda yeterli üreme gözlenmez ise süre
uzatılır.

İki adet derin dondurucu tüpü alınır; tüplere aseptik şartlarda 1‟er mL
saklama besiyeri (%10‟luk „skim-milk‟ veya %16‟lık gliserol buyyon)
konur.
NOT: Saklama besiyeri tüplere alikotlar halinde önceden otoklavlama
öncesi veya sonrasında dağıtılabilir. Otoklavlama sonrası dağıtılırken
aseptik şartların sağlanmasına büyük özen gösterilmeli, işlem tercihen
biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır.

Tüplerin üzeri etiketlenir – izolatın bütün kimlik bilgileri ve işlem tarihi
yazılır.

Öze yardımıyla bir plaktaki yoğun üremenin tamamı toplanır; saklama
besiyeri içeren tüplerden birine konur. Diğer plaktaki üremenin de
tamamı toplanarak diğer tüpe konur. Kapakları sıkıca kapatılır.
NOT: İzolatların saklama tüpleri içine aktarılması işlemi biyogüvenlik
kabini içinde yapılmalıdır!

Tüpler vortekslenerek homojenize edilir.

Tüplerden biri -20°C‟ye (1 yıl için) diğeri -80°C‟ye (8-10 yıl için)
kaldırılır. Eğer laboratuvarda -80°C derin dondurucu yoksa her iki tüp
de -20°C‟ye kaldırılır.

Koleksiyon kayıt defterine saklamaya alınan suşların kimlik bilgileri ve
işlem tarihi kaydedilir. Laboratuvar bütün suş saklama işlemlerini kayıt
altına almalıdır!
3 Saklanan izolatın yeniden canlandırılması

Pasaj için izolatın rahat üreyeceği seçici olmayan bir besiyeri plağı
alınır. Suşun kimlik bilgileri yazılır.
Sayfa 6 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-24/ Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Suş saklama prosedürü

Saklanmış izolat derin dondurucudan çıkarılır.

Hemen (tüp içeriğinin erimesini beklemeden) tüpün üst kısmından
steril öze ile hafif kazıyarak öze dolusu alınır; hazırlanmış besiyeri
plağına ekilir.

Tüp tekrar ve hemen derin dondurucuya, alındığı kutuya kaldırılır.
NOT: Mümkünse tüp derin dondurucudan bir buz kabının içine konarak
çıkarılmalı, çok kısa bir süre için bile olsa oda sıcaklığına maruz
kalmaması sağlanmalıdır.

Ekim yapılmış plak uygun inkübasyon şartlarında inkübasyona kaldırılır.
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Güç üreyen bakteriler için inkübasyon süresini 72 saatte kadar
uzatmak gerekebilir.

Bakteri canlandırılırken derin dondurucudan çıkarılmış tüplerin
çözülmemesine azami dikkat edilmeli ve işlem hızlı yapılmalıdır.
İzolatın saklanması
Saklanacak bakterinin
yoğun pasajını yap
Bakteri için uygun şartlarda inkübe et
Her bir plaktaki üremeyi bir derin dondurucu tüpüne topla
Saklama
besiyeri
1mL
Vorteksleyerek homojenize et
Derin dondurucuya kaldır
Saklanmış izolatın canlandırılması
Saklanmış izolatı derin
dondurucudan çıkar
Bir öze dolusu al ve uygun
besiyerine pasajla
Tüpü hemen tekrar derin dondurucuya kaldır!
Şekil 1. Laboratuvarda bir bakteri izolatının dondurularak saklanması ve saklanmış izolatın yeniden
canlandırılması için basit akış şeması. (Kaynak: Akbaş E. Henüz yayınlanmamış doküman.
2012)
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-24/ Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 8
Suş saklama prosedürü
Kaynaklar
1 Petti CA, Carroll KC. Procedures for the storage of microorganisms. In: Versalovic J, Carroll KC,
Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW (eds). Manual of Clinical Microbiology. 10th ed.,
ASM Press, Washington D.C. 2011, p. 124-131
2 Prescott LM, Harley JP, Klein DA (eds.). Industrial microbiology and biotechnology. In:
Microbiology. 5th ed., The McGraw-Hill Companies, USA. 2002, p.1000
3 Sewell DL. Quality control. In: Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. ASM
Press, Washington D.C. 1992, p. 13.2.22-23
Sayfa 8 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-24/ Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Download

Suş saklama prosedürü - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu