JavaScript must be enabled to view this document. Please enable JavaScript and reopen the document.
ÜRÜN PROSPEKTÜSÜ
LABType® SSO TİPLEME TESTLERİ
Katalog No. Bu ürün prospektüsünde bahsedilen ürünlerin katalog numaraları için
LABType® SSO Tipleme Testleri Referans Tablosuna bakın.
İn Vitro Tanılama Kullanımı İçindir
İçindekiler
Kullanım Amacı .................................................. 1
Özet ve Açıklama................................................ 1
İlkeler ................................................................ 2
Reaktifler ........................................................... 2
Ekipman Gereksinimi........................................... 3
Numune Toplama ve Hazırlama ............................ 4
İşlemler ............................................................. 4
A. Sağlanan Malzemeler ..................................... 4
B. Gerekli Olan, Ancak Sağlanmayan
Malzemeler ............................................... 4
C. Kullanım Yönergeleri....................................... 5
1. Boncuk Kullanımı ve Saklanması ................. 5
2. Çoğaltım .................................................. 5
3. Test Kurulumu........................................... 6
4. LABType Boncuklarının Hazırlanması........... 7
D. Test İşlemleri..................................................8
1. Denatürasyon/Nötralizasyon ........................8
2. Hibridizasyon.............................................9
3. Etiketleme .................................................9
E. Veri Toplama..................................................9
Sonuçlar .......................................................... 10
İşlemin Kısıtlamaları........................................... 11
Beklenen Değerler ............................................. 12
Spesifik Performans Özellikleri ............................ 13
Kaynakça ......................................................... 13
Lisanslar, Patentler ve Ticari Markalar .................. 14
Yetkili Avrupa Temsilcisi ..................................... 14
96 Numuneli Deney İçin Protokol Özeti ................. 15
Sembollerin Açıklaması ...................................... 16
Revizyon Tarihçesi ............................................ 16
KULLANIM AMACI
HLA Sınıf I ve Sınıf II alellerinin DNA tiplemesi.
ÖZET VE AÇIKLAMA
1
Tarihsel olarak, HLA antijenlerini saptamak için kabul edilen yöntem lenfositotoksisite testi olmuştur. Ancak, PCR
teknolojilerinin gelişmesiyle, DNA bazlı doku tipleme teknolojileri laboratuarda olağan duruma gelmiştir. DNA bazlı
metodolojilerin çoğu için PCR işlemi sadece, gerekli hedef DNA’yı elde etmek için bir çoğaltma (amplifikasyon)
adımı olarak kullanılmaktadır. HLA tipleme işlemi o zaman, farklı aleller arasında ayırım yapmak için bir çoğaltma
sonrası adımı gerektirir (örn. RFLP, SSOP, ters nokta boyama). LABType® SSO, numune DNA tarafından
kodlanmış alelleri saptamak için floresan kodlu mikrokürelere bağlanmış olan sekansa özgü oligonükleotid
probları (SSO) kullanır. Hedef DNA’yı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltma adımının eklenmesine ek
olarak tek reaksiyon karışımı içinde algılama ve hibridizasyon, bu yöntemi hem küçük hem de büyük çaplı testler
için uygun yapar. Lenfositotoksisite reaksiyon ölçeğinin (1 = negatif ila 8 = pozitif) aksine, LABType® test
sonuçları ya pozitif ya da negatiftir. Bu da sonuçları karmaşık yöntemlerle yorumlama ihtiyacını ortadan kaldırır.
Ayrıca, tek nükleotid değişimleri PCR-SSP’de ayırımcı olabilirken, çapraz reaksiyona giren gruplar (CREG’ler)
serolojik tipleme için büyük zorluklar oluşturur.
www.onelambda.com
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 1 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
İLKELER
LABType®, ters SSO DNA tipleme yöntemine Luminex® teknolojisini uygular. Önce, hedef DNA, gruba özgü bir
primer kullanılarak PCR ile çoğaltılır. PCR ürününün biyotinleştirilmiş olması, R-Fikoeritrin-konjuge Strepavidin
(SAPE) kullanılarak saptanmasına olanak sağlar.
PCR ürünü denatüre edilir ve floresan kodlu mikrokürelere konjuge olan komplemanter DNA problarına yeniden
®
hibritleşmesine olanak sağlanır. Bir akış analiz cihazı (LABScan™ 100 [Luminex 100/200] veya LABScan3D™
®
[Luminex FLEXMAP 3D] olabilir), her bir mikroküre üzerindeki PE (fikoeritrin) floresan şiddetini belirler. HLA
tipleme ataması, reaksiyon örüntüsünün yayınlanmış HLA gen sekanslarıyla bağlantılı örüntülerle
karşılaştırılmasına dayanır.
REAKTİFLER
A. Tanım
®
LABType SSO DNA tipleme sistemi, amplifiye genomik DNA numunelerinde HLA alellerinin kontrollü DNADNA hibritleştirme reaksiyonu kanalıyla saptanması amacıyla, mikroküreler üzerinde hareketsizleştirilmiş
sekansa özgü oligonükleotid probları temin eder ve ardından LABScan™ 100 ya da LABScan3D™ akış analiz
cihazıyla akış analizi sağlar. Sistem bileşenleri şunlardan oluşur:

Mikroküreler ile bunlara kovalent bağla bağlanmış probların önceden optimize ve test edilmiş karışımı




Hedef DNA’nın proba bağlanmasını kolaylaştırma amaçlı hibridizasyon reaksiyon tamponları
Bağlanmamış DNA’yı uzaklaştırmak için Yıkama Tamponu
Stok SAPE solüsyonunu seyreltmek için SAPE tamponu
DNA çoğaltma reaktifleri (önceden optimize edilmiş HLA lokusa özgü primer karışımı): Her LABType
ürünü için lokusa özgü primer karışımı ve boncuk karışımı kullanılması esastır. Bu reaktifler lota özgü
olup, farklı lotlar için kullanılamaz.
D-mix (özel formülasyonlu çoğaltma tampon karışımı).

Mikroküre karışımı, HLA alelleri için sekansa özgü benzersiz oligonükleotid probları içeren, floresan boyalarla
fişlenmiş mikrokürelerden oluşur. Her mikroküre karışımı, arka plandaki spesifik olmayan sinyalleri hariç
bırakmak ve numune miktarındaki ve reaksiyon verimindeki olası değişimleri hesaba almak üzere ham verileri
normalize etmek için negatif ve pozitif kontrol mikroküreleri içerir. Mikroküre karışımları, belirtilen HLA lokusa
özgü primer karışımları kullanılarak DNA çoğaltımı ile elde edilen özel PCR ürünleri için önceden optimize
edilmiştir. HLA lokusa özgü primer karışımları; 20 µl hacim içinde 40 ng saflaştırılmış genomik DNA’dan spesifik
HLA genlerinin çoğaltılması (amplifikasyonu) için önceden optimize edilmiş olup, bunların D-mix, belirtilen
miktarda rekombinant Taq polimeraz ve aşağıdaki PCR reaksiyon profili ile birlikte kullanılması amaçlanmıştır.
Her lot için, her bir prob tarafından aşağıda tarif edilen işlemler kullanılarak saptanabilecek spesifik HLA
alellerini görmek için temin edilen çalışma sayfasına bakın. Lota özgü prob bölgeleri için Boncuk Prob Bilgileri
belgesine başvurun.
B. Uyarı veya Dikkat
1.
2.
3.
4.
5.
6.
FDA Ataması: IVD
Uyarı: Jel boyaması için kullanılan ve bu ürün içinde bulunmayan etidyum bromür, bilinen bir
kanserojendir. Gerekli dikkati göstererek kullanın. Cilt yoluyla emilmesi halinde zararlı olabilir.
Gözlere, cilde veya giysilere sıçramasını önleyin. Sıkıca kapalı durumda saklayın.
Kullandıktan sonra elleri iyice yıkayın. Dökülen alanı su spreyi ile yıkayın.
Uyarı: Denatürasyon Tamponu ve Nötralizasyon Tamponu koroziftir ve yanıklara sebep
olabilir. Teması halinde gözler veya cilt en az 15 dakika bol suyla yıkanmalı ve bu sırada
kirlenen giysi ve ayakkabılar çıkartılmalıdır (GBF’ye bakın).
®
Dikkat: LABType SSO Boncuk Karışımı ışığa hassas olup ışıktan korunmalıdır.
Dikkat: LABType® SSO Boncuk Karışımının buzu çözüldükten sonra üç ay içinde
kullanılmalıdır.
Detaylı bilgiler için Güvenlik Bilgi Formuna başvurun.
C. Reaktiflerin Kullanıma Hazırlanması
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 2 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
Bu belgedeki Kullanım Yönergeleri kısmına bakın.
D. Depolama Talimatı
Bütün LABType® reaktifleri ve tamponları, ürün kutusu içinde -80° ile -20°C arasında güvenle
saklanabilir. Gereksiz muameleden kaçının. Tüm ambalajın teslim alındıktan sonra kullanım için
hazır olana kadar açılmadan donmuş halde saklanması önerilir. Ancak, boncuk karışımları
kullanım için bir kez çözüldükten sonra 2° ile 8°C arasında saklanmalı ve asla tekrar
dondurulmamalıdır.
LABType® reaktiflerinin optimum stabilitesini temin etmek için gereken depolama ve kullanım
koşullarının kısa bir özeti aşağıda verilmiştir.
LABType® Tamponları:
SAPE tamponu dışındaki bütün LABType® tamponlarının kabul edilebilir sıcaklık aralığı -80° ile
25°C arasında olup bu tamponlar tekrar dondurulabilir. SAPE tamponu tekrar dondurulamaz.
SAPE tamponu -80° ile 8°C arasında saklanmalıdır. SAPE tamponu, buzu çözüldükten sonra
soğutucuda 2° ile 8°C arasında saklanmalıdır.
LABType® SSO Boncuk Karışımları:
LABType® Boncuk Karışımlarının en stabil oldukları hal donmuş haldir. Boncukların ilk olarak,
kullanıma hazır olana kadar -80° ile -20°C arasında depolanması önerilir. Boncuklar, kullanım için
çözüldükten sonra 2° ile 8°C arasında 3 aya kadar saklanabilir.
Önemli: Boncukların raf ömrünü uzatmak için yeniden dondurup çözdürmeyin.
LABType® Primer Setleri ve D-mix:
LABType® Primer Setlerinin ve D-mix’in en stabil hali -80° ile -20°C arasında donmuş haldir. Her
iki reaktif de tekrarlı donma-çözülme döngülerine tabi tutulabilir. Bu sebeple, daima -80° ile -20°C
arasında saklanmaları önerilir.
E.
İnstabilite Göstergeleri
1. Vorteks uygulaması ile giderilemeyen kümelenme veya renk kaybı sergileyen boncuklar kullanılamaz
sayılmalıdır.
2. Nakliyat veya depolama sırasında ürün reaktiflerindeki tuzlar çökelmişse, oda sıcaklığında (20-25°C)
uzun süre vorteks uygulayarak yeniden eritin.
3. Donmuş D-mix alikuotları oda sıcaklığında (20-25°C) çözüldükten sonra pembe ila açık mor renkli
olmalıdır. Belirtilen renkte olmayan herhangi bir D-mix alikuotu kullanılamaz sayılmalıdır.
EKİPMAN GEREKSİNİMİ







®
®
LABScan™ 100 (Luminex 100/200) veya LABScan3D™ (Luminex FLEXMAP 3D ) akış analiz cihazı
Luminex® XY Platformu (LABScan™ 100 akış analiz cihazı üzerinde otomatik olarak 96 numune okumak
için Luminex Corporation’dan opsiyonel aksesuar)
Santrifüj
1.5 ml’lik mikrofüj tüpü için rotor (14000 - 18000 g)
96 hazneli mikroplaklar için dönünce açılan rotor (1000 - 1300 g)
Hızı ayarlanabilen vorteks mikseri
Isı döngüleyici - Veriti™ 96 Hazneli Isı Döngüleyici veya aşağıdaki özellikleri içeren cihaz
 Blok format 0.2 ml alaşım
 Standart 0.2 ml’lik 96 hazne formatlı
 103°C sıcaklığı koruyabilen ısıtmalı kapak
 Maksimum blok rampa hızı 3.90°C/saniye
 Maksimum numune rampa hızı 3.35°C/saniye
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 3 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
 +0.8°C/saniyelik ve -1.6°C/saniyelik numune rampa hızında 9600 emülasyon modunu çalıştırmak





üzere etkinleştirilmiş
Maksimum sıcaklık farkı blok genelinde 25°C, alandan alana 5°C
Sıcaklık doğruluğu ±0.25°C (35–99.9°C) alan
Sıcaklık aralığı 4.0°C ila 99.9°C alan
Sıcaklık tekdüzeliği <0.5°C (95°C’ye eriştikten 20 saniye sonra) alan
PCR hacim aralığı 10–80 µl alan
NUMUNE TOPLAMA VE HAZIRLAMA
A. DNA, aralarında tam insan kanı, kandan izole edilmiş lenfosit hücreleri (buffy coat), filtre kağıdı üzerindeki
kan, lenf düğümleri, yanak içi eküvyonları ve kemik iliğinin de bulunduğu kaynaklardan, aşağıdaki kriterleri
karşılayan doğrulanmış bir yöntemle arındırılabilir. PCR analizi için kullanılacak DNA numunesi, steril su
içinde veya 20 ng/µl optimal konsantrasyonda 1.65-1.80 A260/A280 oranlı, 8.09.0 pH değerli 10 mM TrisHCl içinde tekrar süspanse edilmelidir. Kullanılan diğer spesifikasyonlar laboratuar tarafından
doğrulanmalıdır.
B. Numuneler, herhangi bir DNA polimeraz inhibitörü içermemeli ve 0.5 mM konsantrasyondan daha fazla
şelasyon ajanı (örn. EDTA) içeren çözeltiler içinde tekrar süspanse edilmemelidir.
C. DNA numuneleri, izole edildikten hemen sonra kullanılabilir veya sonuçlar üzerinde hiçbir olumsuz etkiye yol
açılmaksızın -20°C veya altında uzun süre saklanabilir.
D. DNA numunelerinin nakliyat sırasındaki bütünlüğünü korumak için numuneler 4°C veya altında taşınmalıdır.
İŞLEMLER
A. Sağlanan Malzemeler
NOT: Verilen hacimler, test için gereken miktardan biraz daha fazladır. Bunun amacı, pipetleme işleminden
kaynaklanan kayıpları hesaba almaktır. Farklı lotlardan gelen bileşenleri karıştırmayın.
100 Test/Paket
20 Test/Paket
2.25 ml Denatürasyon
Tamponu - 1 flakon
4.95 ml SAPE Tamponu 1 flakon
50 µl Denatürasyon Tamponu
- 1 flakon
990 µl SAPE Tamponu 1 flakon
2.5 ml Nötralizasyon Tamponu 1 flakon
1.38 ml Primer Seti D-Mix 2 flakon, her biri 690 µl
100 µl Nötralizasyon Tamponu
- 1 flakon
276 µl Primer Seti D-Mix - 1
flakon
3.4 ml Hibridizasyon Tamponu 1 flakon
400 µl Lokusa Özgü Primer Seti
- 1 flakon
680 µl Hibridizasyon Tamponu
- 1 flakon
80 µl Lokusa Özgü Primer Seti 1 flakon
55 ml YıkamaTamponu - 1 şişe
400 µl LABType SSO birincil 1 flakon
10 ml Yıkama Tamponu 1 flakon
80 µl LABType SSO veya HD
Boncuk Karışımı - 1 flakon
Boncuk Karışımı –
®
®
* 20 µl Ek – 1 flakon*
* NOT: LABType® (100 test) kitleri, sürekli optimum çözünürlük için gerektiği gibi birincil boncuk karışımı ve ek boncuk
karışımı olmak üzere iki boncuk flakonu içerebilir.
B. Gerekli Olan, Ancak Sağlanmayan Malzemeler
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Deiyonize su
%70 etanol
%20 klorlu ağartıcı
R-Fikoeritrin-Konjuge Streptavidin--SAPE
Kılıf sıvısı (OLI Kat. No. LXSF20 veya LSXF20X5)
Rekombinant Taq polimeraz (OLI Katalog No. TAQ30, TAQ50 ve TAQ75)
15 - 50 ml’lik atılabilir tüpler
96 hazneli, ince duvarlı PCR tepsisi, veya tüpler, ve 1000 – 1300 g santrifüje dayanabilecek tutucu
Dikkat: PCR plağı, ısıtma bloğu ile sıkı temas halinde olmalıdır.
9.
Tepsi kapağı
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 4 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
NOT: 2400 numune için yeterli PCR tepsileri (25) ve tepsi kapakları (180) One Lambda’dan sipariş
edilebilir (OLI Kat. No. PCRTRAC)
10. Elektroforezi aparatı/güç kaynağı  150V minimum kapasiteli UV transillüminatör (Fotodyne
FOTO/UV®21 veya eşdeğeri)
11. Fotoğraf veya görüntü belgeleme sistemi
12. Elektroforezi çalışma tamponu - örneğin: 0.5 µg/ml etidyum bromürlü 1x TBE tampon (89mM Tris-borat; 2
mM disodyum EDTA, pH 8.0) veya etidyum bromürlü 5XTBE Tampon
®
13. Elektroforezi sınıfı agaroz (örn., FMC Seakem LE veya eşdeğeri)
14. PCR Pedi
15. Buz banyosu veya eşdeğeri.
C. Kullanım Yönergeleri
Dikkat: Alikuotlama sürecinde özel ihtimam gösterilmelidir. Aşağıda tanımlanan adımların izlenmemesi reaktif
kaybı ile sonuçlanabilir.
1.
Boncuk Kullanımı ve Saklanması
a. Önerilen plastik malzemeleri kullanmak (tüpler, tepsiler, pipet uçları) spesifik olmayan yapışmalardan
kaynaklanan boncuk kaybını en aza indirebilir. (“Gerekli Olan, Ancak Sağlanmayan Malzemeler”
kısmına bakın.)
®
b. LABType SSO boncukları bir tüp içinde bırakılırsa çöküp kümelenebilir. Boncuklar uygulanmadan
önce eşit bir şekilde dağıtılmalıdır. Tam olarak homojen bir karışım elde etmek için, boncukları daima
birkaç kez pipetleyerek veya yatay konumda 10 ila 30 saniye veya gerektiği kadar vorteksleyerek
iyice karıştırın.
®
c. LABType SSO HD ürünlerinde, kümeleşmeyi önlemek için aşağıdaki işlemler önerilir. Aşağıda
verilen Test İşlemlerinin adım 2f, 2g ve 3c’sinde süpernatant çıkartıldıktan hemen sonra, tepsi ters
çevrilip kuru bir kağıt havlu üzerine çok hafifçe vurularak mümkün olduğu kadar fazla sıvı
çıkartılmalıdır. Tepsiyi bir kapakla kapatın ve peletleri gevşetmek için düşük hızda iyice vorteks
uygulayın. Tarif edildiği gibi sonraki adıma geçin.
®
d. LABType SSO boncukları alüminyum folyo poşet içinde ambalajlanmıştır. Kullanıma hazır olmadığı
sürece boncukları folyo poşetten çıkartmayın.
®
e. LABType SSO boncukları, dahili floresan boyanın yanı sıra yüzeylerine bağlanmış olarak HLA alele
özgü problar içerirler. Boncukların ışıktan ağarmasını önlemek için, kullanım ve depolama sırasında
boncukları ışıktan koruyun. Boncukları, kullanıma hazır olana kadar, temin edilen tüp içinde ağızları
sıkıca kapalı olarak -20°C’de saklayın. Deney sırasında boncukların üzerini alüminyum folyo veya
dengiyle kaplayın.
Dikkat:
 Çözüldükten sonra boncukları 2° ile 8°C arasında saklayın ve 3 ay içinde kullanın. Boncukları
tekrar dondurmayın.
 Çoğaltma Primer Karışımını ve D-Mix’i içeren paketleri sadece çoğaltma öncesi alanında açın. Bu
ürünleri -80°C ile -20°C arasında çoğaltma öncesi alanında saklayın.
2.
Çoğaltma (Kurulum, çoğaltma öncesi alanında gerçekleştirilmelidir.)
®
a. “LABType PCR Programı”nı Tablo 2’de gösterildiği gibi ısı döngüleyicinize girin. Tüm parametreleri
teyit edin.
b. Isıtmalı kapağı ısıtmak için ısı döngüleyiciyi çalıştırın.
c. DNA’yı, Çoğaltma Primerlerini ve D-Mix’i çözün. Kullanılana kadar buz üzerinde tutun.
d. Steril su kullanarak genomik DNA konsantrasyonunu 20 ng/µl’ye ayarlayın.
e. D-mix’e ve Çoğaltma Primerine 15 saniye vorteks uygulayın; ardından 3-5 saniye santrifüjleyin.
f. Aşağıdaki Tablo 1’i kullanarak, D-mix ve Primerler belirtilen miktarlarda karıştırın. 15 saniye vorteks
uygulayıp buz üzerine yerleştirin. Taq polimerazın pipetlenen miktarının doğru olmasını temin etmek
için en az 10 reaksiyonluk ana karışım hazırlamanız önerilir.
g. Taq polimerazı kullanımdan hemen önce ekleyin.
Tablo 1: Çoğaltma (Amplifikasyon) Karışımı
Reaksiyon Sayısı
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
D-mix
(µl)
Çoğaltma Primeri
(µl)
Taq Polimeraz
(µl)
Sayfa 5 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
Reaksiyon Sayısı
h.
i.
j.
k.
D-mix
(µl)
Çoğaltma Primeri
(µl)
Taq Polimeraz
(µl)
1
13.8
4
0.2
10
138.0
40
2.0
50
690.0
200
96
1491.0
432
10.0
21.6
(22)
Bir tüpün dibine 2 µl DNA (20 ng/µl’de) pipetleyin (son hacim PCR reaksiyonu başına 20 µl olacak
şekilde). Buharlaşmayı ve kontaminasyonu engellemek için tüpleri veya tepsileri kısmen kapatılmış
olarak saklayın.
Adım 2.f.’de hazırlanan Çoğaltma Karışımına uygun miktarda (örn. 20 µl’lik reaksiyon başına 0.2 µl
[tipik olarak 5 U/ul’de]) Taq polimeraz ekleyin.
Birkaç saniye vorteks uygulayın ve 3-5 saniye santrifüjleyin.
DNA içeren her hazneye 18 µl Çoğaltma Karışımı alikuotlayın.
Dikkat: Çapraz kontaminasyonu önlemek için, önceden tüpün dibine alikuotlanmış DNA ile temas
etmediğinizden emin olun.
Kapağını kapatın. Tepsi kapağı kullanıyorsanız, her bir haznenin kenarı üzerine sıkıca
bastırıldığından emin olun. Kapağı kapatmadan önce, tepsi üzerine ısı döngüleyicinizle uyumlu bir
PCR Pedi yerleştirin. Isı döngüleyicinin kapağını kapatın ve sıkın.
®
m. Tablo 2’de gösterilen “LABType SSO PCR Programı”nı çalıştırın.
n. Veriti™ 96 Hazneli Isı Döngüleyici için “ramp speed (rampa hızı)” değerini 9600 programına
ayarlayın. Diğer sistemler için üretici belgelerine başvurarak, rampa hızını Ekipman Gereksinimi
kısmında verilen spesifikasyonlara ayarlayın. Önemli derecede farklı rampa hızı kullanılması
çoğaltma (amplifikasyon) verimini ve son sonuçları etkileyecektir.
l.
Tablo 2: LABType® SSO PCR Programı
Adım
Sıcaklık ve
İnkübasyon Süresi
Döngü Sayısı
Adım 1:
96°C 03:00
1
Adım 2:
96°C 00:20
5
60°C 00:20
72°C 00:20
Adım 3:
96°C 00:10
30
60°C 00:15
72°C 00:20
3.
Adım 4:
72°C 10:00
1
Adım 5:
4°C sonsuza kadar
1
o.
Amplifiye DNA şimdi Bölüm D’deki Test İşlemleri kullanılarak test edilmeye hazırdır.
NOT: Önce 2-5 µl amplifiye DNA’nın jel elektroforezi ile analiz edilmesi önerilir. Bir çoğaltma
ürününün (bandının) hibridizasyon deneyinden önce teyit edilmesi optimal sinyal üretimi sağlar.
p.
Amplifiye edilen ürün derhal kullanılmazsa, üstü örtülen DNA tepsisi -80° ile -20°C arasında bir aya
kadar saklanabilir.
Test Kurulumu
a. LABScan™ 100 ve XY Platformunu ya da LABScan3D™ cihazını çalıştırın ve Kullanım Yönergeleri
Kısım D’de tarif edilen başlatma işlemlerini izleyin. LABScan™ 100 veya LABScan3D™ cihazlarının
ısınması için en az 30 dakika gereklidir.
b. Isı döngüleyiciyi açın ve programı 60°C HOLD (Bekletme) veya eşdeğeri bir ayarda en az 1.5 saat
çalıştırın (veya sürekli bekletin). Isı döngüleyicinize uygun bir PCR Pedi kullanıma hazır olarak
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 6 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
bulundurulmalıdır. Isı döngüleyicinin ısıtmalı kapağının kullanımdan önce uygun sıcaklığa
ulaştığından emin olun. Doğru inkübasyon sıcaklığını temin etmek için uygun 96 hazneli PCR tepsi
tutucusunu kullanın.
Bütün reaktifleri (kahverengi 100X SAPE şişesi hariç) depolandıkları yerden oda sıcaklığına çıkartın.
Reaktiflerin gereken hacimlerini temiz taşıyıcılara alikuotlayın. (Aşağıdaki tabloları referans olarak
kullanın). Üçüncü yıkama adımı sırasında 1X SAPE’yi hazırladığınızdan emin olun. 100X SAPE
şişesini depodan sadece gerektiği zaman çıkartın ve derhal 2° ila 8°C’ye geri götürün. Boncuk
Karışımının kullanılmayan kısmını ve SAPE Tamponunu 2° ila 8°C’ye geri koyun. (Boncuk Karışımını
buzu çözüldükten sonra tekrar dondurmayın.)
4.
®
LABType Boncuklarının Hazırlanması (iki boncuk flakonu içeren 100 Testlik Kit için):
®
a. 2 boncuk flakonu içeren LABType kitlerinde, buzu çözüldükten hemen sonra tüplere çabuk bir spin
uygulayın (çoğu küçük santrifüjlerde 100 RCF’de [göreceli merkezkaç kuvveti] 10-15 saniye).
b. Flakonlara orta düzeyli kuvvette 20 saniye vorteks uyguladıktan sonra yukarıda belirtildiği gibi yine
çabuk bir spin uygulayın.
c. Birincil boncuk flakonunu alın ve boncuk çözeltisini karıştırmak ve pipet ucunu hazırlamak için P1000
veya eşdeğerini kullanarak birkaç kez (yavaşça fakat iyice) pipetle alıp bırakın.
d. Adım (c)’de kullanılan aynı pipet ucunu kullanarak, birincil boncukların bütün hacmini dikkatle ek
boncuk flakonuna aktarın.
e. Boşalmış olan birincil boncuk flakonunu atın. Ek boncuk tüpü, birleştirilen boncukların yeni lot/parti
tanılayıcısı ile etiketlenir. Bu lot numarası doğru analiz “cat” dosyaları ve veri sayfalarıyla ilişkilidir.
f. Homojen bir boncuk karışımı elde etmek amacıyla, kapağı kapatılmış olan tüpü her biri için 10 saniye
olmak üzere 3 kez vorteksleyerek, birleştirilmiş boncukları iyice karıştırın. Hemen kullanın veya 2.
sayfadaki Depolama Talimatı başlıklı bölümde verilen koşullarda saklayın. Boncuk flakonunu
kullanmadan hemen önce en az 20 saniye süreyle orta ayarda vortekslediğinizden emin olun.
Tablo 3: Reaktif Hazırlama
Reaktif
Boncuk Karışımı
Hibridizasyon
Tamponu
Yıkama Tamponu
Test başına
Miktar
4 µl
34 µl
480 µl
Denatürasyon
Tamponu
2.5 µl
Nötralizasyon
Tamponu
5 µl
SAPE Stok
(100X)
SAPE Tamponu
0.5 µl
49.5 µl
Hazırlama Yöntemi ve Öneriler

Oda sıcaklığında, gerekli sayıda test için uygun hacmi (artı fazladan hacmi*) temiz bir tüpe
alikuotlayın.

Işıktan koruyun. Boncuk Karışımı tüpünün tüm içeriğini 96 numune için kullanın.

Kullanmadan hemen önce vorteks uygulayın.

Boncuk Karışımı için kullanılan test adedinin tam aynısı için alikuotlayın.

Hibridizasyon Karışımını hazırlamak için önceden alikuotlanmış Boncuk Karışımına ekleyin.

Kullanıma kadar oda sıcaklığında (20° ila 25°C) saklayın.

Gerekli test sayısı için uygun hacmi, artı fazladan hacmi* alikuotlayın ve oda sıcaklığında (20°
ila 25°C) tutun.

Tüm içeriği 96 numunelik bir çukur içinde kullanın.

Test adedi için uygun hacmi, artı fazladan hacmi* alikuotlayın.

Tüm içeriği 96 numunelik bir çukur içinde kullanın. Oda sıcaklığında (20° ila 25°C) tutun.

Test adedi için uygun hacmi, artı fazladan hacmi* alikuotlayın.

2.5 ml’nin tamamını 96 numune için kullanın. Oda sıcaklığında (20° ila 25°C) tutun.

Son santrifüj adımı sırasında, SAPE Stok malzemesi ile SAPE Tamponundan 1:100 seyrelti
yaparak uygun sayıda test için (artı fazladan hacimde*) 1X SAPE solüsyonu hazırlayın.

Işıktan koruyun.

96 numune için yeterli 1X SAPE çözeltisi hazırlayın (görülen pipetleme hatalarına bağlı olarak
yaklaşık 110 numune için yeterli miktarda).

SAPE Stok şişesini 2° ila 8°C’de saklayın.
*NOT: Gerekli fazladan hacim, pipetleme tekniği ve ekipmanın kalibrasyon durumuna bağlıdır. 96 test için temin
edilen tüpteki Boncuk Karışımının tam hacmini kullanın (yaklaşık 110 test için yeterlidir). 115 test için 1X SAPE
hazırlayın ve malzeme eksikliğini önlemek için diğer reaktiflerin tam hacmini kullanın. Tüm pipetleme cihazlarının
kalibre edilmesi ve bu cihazların su alikuotlanarak test edilmesi önerilir. Denatürasyon ve Nötralizasyon
Tamponları gibi fazla hacimde temin edilen reaktifler için çok kanallı pipetleme amacıyla bir çukur kullanılabilir.
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 7 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 8 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
Tablo 4: Reaktif Hacimleri
Denatürasyon
Tamponu (µl)
Test Sayısı
Nötralizasyon
Tamponu (µl)
Hibridizasyon
Tamponu (µl)
Yıkama Tamponu (µl)
Tepsi Yöntemi
Boncuk
Karışımı (µl)
1
2.5
5
34
480
4
10
25
50
340
4800
40
20
50
100
680
9600
80
50
125
250
1700
24000
200
96
240
480
3264
46080
384
Tablo 5: SAPE ve SAPE Tamponu Hacimleri
Test
Sayısı
SAPE Stok
Hacmi (µl)
SAPE Tampon
Hacmi (µl)
1
0.5
49.5
10
5.0
495.0
20
10.0
990.0
50
25.0
2475.0
96
48.0
4752.0
NOT: Tablo 4 ve 5 içindeki reaktif hacimleri tam test sayıları içindir. Alikuotların gerçek sayısı pipetleme
doğruluğuna göre değişir. 96 numunelik tam deney için; boncuk karışımının tamamının, hibridizasyon tamponu
hacminin tamamının, 57.5 µl stok SAPE ve 5693 µl SAPE tamponu kullanılması önerilir (bu miktarlar test için
gereken tam miktarlardan biraz daha fazladır).
D. Test İşlemleri
TEKNİK ÖNLEMLER
1.
1.
Az sayıda (48 veya daha az) numune ile deney yapılacaksa, 96 hazneli bir tepsi, uygun sayıda hazneye
göre kesilmiş bir tepsi veya 0.2 ml’lik ince duvarlı strip PCR tüpü kullanılabilir. Kesilmiş bir tepsi veya strip
tüp kullanırken bir tüp rafı kullandığınızdan emin olun.
2.
Numunelerin 96 hazneli bir tepsi içinde karıştırılması, tepsinin kapatılmasını ve birkaç saniye
vortekslenmesini içerir. Vorteks mikserinin hızını, 96 hazneli PCR tepsisi içindeki sıvının aşırı sıçrama
olmadan yeterli düzeyde çalkalanabilmesini temin edecek şekilde ayarlayın. Hız ayarını not edin ve 96
hazneli tepsi yöntemi için kullanın.
3.
Hazneler arasında numune kontaminasyonunu önlemek için 96 hazneli PCR tepsisi dikkatli bir şekilde ve
tamamen kapatılmalıdır. Kapağı 96 haznenin her kenarına karşı bastırarak tepsiyi kapatın. Tepsi kapaklarını
tekrar kullanmayın. Tepsi kapağı kullanılmasını gerektiren her bir adım için yeni bir kapak kullanın. Uygun
olan yerlerde tekrarlayıcı pipet kullanılabilir; ancak, tekrarlayıcı pipetin hacim doğruluğu genellikle daha
düşüktür.
4.
Düzenli aralıklarla kalibrasyon ve verilecek her bir hacim için manüel hacim kontrolü önerilir. Hibridizasyon
Karışımını eklerken tekrarlayıcı pipet kullanmayın.
Denatürasyon/Nötralizasyon
a. Bir buz banyosu hazırlayın.
b. Bir tepsi tutucusuna 96 hazneli bir plaka yerleştirin.
c. 96 haznelik temiz bir plakanın bir haznesine 2.5 µl Denatürasyon Tamponu aktarın.
d. Her bir amplifiye DNA’dan 5 µl ekleyin. Numune yerlerinin ve tanılayıcılarının not edildiğinden emin
olun. İyice karıştırın (tercihen pipetle alıp bırakarak) ve oda sıcaklığında (20–25°C’de) 10 dakika
inkübe edin.
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 9 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
NOT: Amplifiye DNA önce alikuotlanabilir ve Denatürasyon Tamponu ardından eklenebilir.
e.
f.
2.
Hibridizasyon
NOT: Isı döngüleyicinin açık olduğundan ve termal bloğu ısıtmak üzere 60°C programının
başlatıldığından emin olun.
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
3.
Pipetle 5 µl Nötralizasyon Tamponu ekleyin ve iyice karıştırın (tercihen pipetle alınıp bırakılarak).
Rengin parlak pembeden soluk sarıya veya şeffafa döndüğüne dikkat edin.
Nötralize olmuş PCR ürününü içeren PCR plakasını buz banyosu üzerine yerleştirin.
Dikkat: PCR ürününün suyla kontaminasyonunu önleyin.
Hibridizasyon Karışımını hazırlamak için uygun hacimlerde Boncuk Karışımını ve Hibridizasyon
Tamponunu birleştirin.
Her hazneye 38 µl Hibridizasyon Karışımı ekleyin.
Tepsiyi tepsi kapağı ile kapatın ve düşük hızda iyice vorteks uygulayın.
Tepsi tutucudan çıkartın ve PCR tepsisini önceden ısıtılmış ısı döngüleyiciye yerleştirin (60°C).
PCR Pedini tepsinin üstüne veya kapakları PCR tüpleri üstüne yerleştirin. Kapağı kapatıp sıkın. 15
dakika inkübe edin.
Tepsiyi tepsi tutucu içine yerleştirin ve tepsi kapağını çıkartın. Her hazneye hızlı bir şekilde 100 µl
Yıkama Tamponu ekleyin. Tepsiyi tepsi kapağıyla kapatın. Tepsiye 1000-1300 g’de 5 dakika santrifüj
uygulayın. Tepsiyi tepsi tutucu içine yerleştirin ve yıkama tamponunu çıkartın.
Yukarıdaki adım 2.f’yi toplamda üç yıkama adımı olacak şekilde iki kez daha tekrarlayın. Üçüncü
santrifüjleme sırasında 1X SAPE çözeltisini hazırlamayı unutmayın.
Etiketleme
a. Tepsiyi tepsi tutucuya yerleştirin. Her hazneye 50µl 1X SAPE solüsyonu ekleyin. Tepsi kapağını tepsi
üzerine yerleştirdikten sonra düşük hızda iyice vorteks uygulayın. Tepsiyi önceden ısıtılmış ısı
döngüleyiciye yerleştirin (60°C). PCR Pedini tepsinin üstüne veya kapakları PCR tüpleri üstüne
yerleştirin. Kapağı kapatıp sıkın. 5 dakika inkübe edin.
b. Tepsiyi çıkartın. Tepsiyi tepsi tutucuya yerleştirin. Kapağı çıkartın ve her hazneye hızlı bir şekilde 100
µl Yıkama Tamponu ekleyin.
c. Tepsiyi tepsi kapağıyla kapatın. Tepsiye 1000 – 1300 g’de 5 dakika santrifüj uygulayın. Tepsiyi tepsi
tutucu içine yerleştirin ve süpernatantı çıkartın.
d. Her hazneye 70 µl Yıkama Tamponu ekleyin. Pipetleyerek nazikçe karıştırın. 8 veya 12 kanallı pipet
kullanarak okuma plakasına aktarın. Yeni pipet uçları kullanarak numuneler arası kontaminasyonu
önleyin.
e. NOT: Son hacim en az 80 µl olmalıdır.
f. Tepsiyi tepsi kapağı ve alüminyum folyo ile kapatın. Tepsiyi, ölçüm için LABScan™ 100 veya
LABScan3D™ içine yerleştirilene kadar karanlık bir yerde 4°C’de tutun.
g. En iyi sonuçları alabilmek için numuneleri en kısa zamanda okuyun. Numunelerin uzun süre (4
saatten daha fazla) saklanması sinyal kaybına neden olabilir. Numuneler hemen okunamıyorsa
tepsiyi kapağıyla birlikte gece boyunca karanlık bir ortamda 4°C’de saklayın. Okumadan hemen önce
numuneleri iyice karıştırdığınızdan emin olun.
1 2 3 4 5 6 7
8 9 11 10 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Şekil 1
E.
Luminex® XY Platformunda numuneler aşağıdaki düzende okunur:
A1’den - H1’e, A2’den - H2’ye, A12’den - H12’ye.
Veri Toplama
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 10 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
NOT: Veri toplamak için genel ilkeler aşağıda belirtildiği gibidir. LABScan™ 100 veya LABScan3D™ cihazının
®
3
®
®
4
kullanımı hakkındaki detaylar Luminex 100/200 veya Luminex FLEXMAP 3D Kullanıcı Kılavuzundadır .
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Sistemi açın ve LABScan™ 100 ve/veya LABScan3D™ cihazını halihazırda kullanılmakta olan yazılım
sürümüne ait Luminex Kullanıcı Kılavuzuna3.4 göre örnek alımı ve kalibrasyon için kurun.
Ürün katalog numarasında ve lot numarasına göre bir şablon/protokol seçin.
a. Veri toplama şablonları/protokolleri bir CD üzerinde One Lambda’dan temin edilebilir veya One
Lambda web sitesinden indirilebilir.
b. Kendi şablonunuzu oluşturmak için “Luminex Kullanıcı Kılavuzu”nun Veri Toplama bölümündeki
talimatı takip edin. Başlatma
Çalıştırılacak numuneler için bir dosya adı oluşturun.
Tüm şablon/protokol ayarlarının doğru olduğundan emin olun.
Numune tanılayıcılarını girin.
Dikkat: Aynı numune bir kereden fazla test edildiğinde farklı bir tanılayıcı atanmalıdır.
Plaka şimdi çalıştırılmaya hazırdır.
Plakayı XY platformuna yükleyin ve rezervuarı kılıf sıvısı ile doldurun.
Oturumu başlatmak için “START (BAŞLA)” tuşuna tıklayın. Numuneler çalıştırıldıktan sonra veri çıktısı bir
“.csv” dosyasına kaydedilecektir.
Oturumun sonunda makineyi kılıf sıvısı ile 2 kez yıkayın.
NOT: Luminex® yazılım sürümleri - LABScan 100 (IS 2.2/2.3 ve/veya xPONENT 3.1); LABScan 3D
(xPONENT 4.0 ve/veya 4.2) kullanılmalıdır. LABType HD Analizi için - Veri okuma ve analizi sırasında
yeni (ek) lotu/seriyi belirttiğinizden emin olun. Veri analizi için Luminex® akış analiz cihazından çalıştırma
dosyasının tamamını alın ve kaydedin.
SONUÇLAR
A. Veri Hesaplamaları
1.
Luminex® Data Collector (Veri Toplayıcı) yazılımı veya eşdeğeri tarafından oluşturulan ortalama floresan
şiddeti (MFI), numune başına her boncuk (veya boncuğa bağlanan prob) için floresan şiddetini içerir.
Pozitif değer yüzdesi şu şekilde hesaplanır:
Pozitif Değer Yüzdesi = 100 x [MFI (Prob n) - MFI (Prob Negatif Kontrol)/
MFI (Prob Pozitif Kontrol) - MFI (Prob Negatif Kontrol)]
Pozitif reaksiyon; prob için pozitif değerlerin, prob için önceden belirlenen sınır değerinden yüksek olan
yüzdesi olarak tanımlanır. Negatif reaksiyon ise, sınır değerinden düşük olan pozitif değerlerin yüzdesi
olarak tanımlanır. Kontrollü ürün Kalite Kontrol (QC) ortamında, negatif kontrol için MFI tipik olarak 0-100
olup, lotlar ve lokusa özel ürünler arasında farklılık gösterebilir. Aralığın dışındaki sinyaller; numune
miktarı ve/veya numune kalitesi, teknik, cihaz kalibrasyonu ve amplifiye DNA, tamponlar, SAPE ve
boncuk karışımı dahil olmak üzere tüm reaktiflerin durumu gibi deney parametrelerinin verimsiz
kontrolünden kaynaklanabilir.
2.
Hesaplanan pozitif değer yüzdesini, her test probu için önceden belirlenmiş sınır değerleri ile karşılaştırın.
Sınır değerinin üstünde pozitif değer yüzdesine sahip problara pozitif öznitelik, sınırın altındakilere ise
negatif öznitelik atayın. Pozitif kontrolün MFI değeri 1200 - 7000 MFI arasında olmalıdır. (MFI değeri bu
aralığın dışına düşebilir [Beklenen Değerler, Kısım C’ye bakın] ve her pozitif kontrol prob ve lotuna göre
değişir.) Her probun MFI değeri, pozitif kontrol MFI değerine göre normalize edilir ve pozitif kontrol MFI
değerinin yüzdesi olarak ifade edilir. Her bir probun sınır değeri 100-200 numunelik bir DNA paneli
kullanılarak belirlenmiştir.
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 11 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
B. Veri Analizi
1.
Test numunelerinin HLA alellerini (veya alel gruplarını), pozitif ve negatif boncuk tanılayıcı örüntülerini
LABType® SSO veri sayfasındaki bilgilerle eşleştirilerek veya HLA Fusion™ Yazılımını kullanarak
saptayın.
Not: LABType™ Yüksek Tanımlı deneylerin ve ek boncuk flakonu içeren LABType™ deneylerinin veri
analizi için HLA Fusion™ yazılım sürümü 2.0 veya üstü kullanılmalıdır.
İŞLEMİN KISITLAMALARI
LABType® SSO sistemi, HLA lokusa özgü DNA amplifikasyon süreci ile DNA-DNA hibridizasyon sürecini
birleştirir. İşlemin yanı sıra bu ürün içinde tarif edilen ekipman kalibrasyonu kesinlikle izlenmelidir.
DNA çoğaltımı (amplifikasyonu), HLA gen(ler)inin hedeflenen kesimine özgü PCR ürünlerini elde etmek için
yüksek düzeyde kontrollü koşullar gerektiren dinamik bir süreçtir. DNA çoğaltma süreci için temin edilen işlemler
harfiyen uygulanmalıdır. Özellikle, amplifikasyon reaksiyonu DNA miktarı ve kalitesi tarafından önemli düzeyde
etkilenebileceğinden, standartlaştırılmış bir DNA çıkartma işleminin yanı sıra DNA miktar ve kalitesinin
spektrofotometrik ölçümü ve ardından jel elektroforezi analizi yapılması önemle önerilir.
Ayrıca, ilk malzemelerin PCR ürünleriyle kontaminasyonunu önlemek için, DNA amplifikasyonundan sonra
üretilen bütün malzemeler (reaksiyon karışımları dahil olmak üzere PCR sonrası malzemeleri, tüm atılabilir
plastikler, pipetleme cihazları ve jel elektroforezi cihazları gibi ekipmanlar), DNA amplifikasyonundan önce
kullanılan malzemelerden (tüm atılabilir plastikler dahil olmak üzere PCR öncesi malzemeler, pipetleme cihazları,
numune DNA’ları, amplifikasyon reaksiyonlarının kurulumunda kullanılan tüm diğer reaktifler) fiziksel olarak farklı
yerlere ayrılmalıdır.
Amplifikasyon öncesi çalışma alanına, ilgili düzenleyici merciler tarafından temin edilen ilkelerle uyumlu bir
doğrulanmış algılama yöntemiyle rutin olarak silme testi uygulanması önerilir.
LABType® SSO kullanan hibridizasyon bazlı DNA-DNA deneyi, sıcaklığa son derece duyarlı bir süreçtir. Deney
için kullanılan sıcaklık sık sık kontrol edilmelidir (kalibre edilmelidir). Optimal sonuçların elde edilebilmesi için,
işlemlerde belirtilen sıcaklıklara ve inkübasyon sürelerine aynen riayet edilmelidir.
LABType® SSO mikroküreleri ışığa karşı duyarlıdır ve mümkün olduğunca ışıktan korunmalıdır. Maksimum raf
ömrü sağlamak için dondurulup çözülmesinden kaçınılmalıdır.
Temin edilen mikroküre karışımı, HLA alele-özgü problar taşıyan, dikkatle optimize edilmiş miktarda mikroküre
setleri içerir. Karışımdaki herhangi bir değişiklik, deney sonuçlarının doğruluğunu önemli derecede etkileyebilir ve
sonuçları geçersiz kılar. Mikrokürelerin deney sırasında kaybını önlemek için, bu belgede belirtilen işlemler
izlenmeli ve sadece önerilen pipet uçları ve tüpler kullanılmalıdır. Temin edilen mikroküre karışımı, HLA aleleözgü problar taşıyan, dikkatle optimize edilmiş miktarda mikroküre setleri içerir. Karışımdaki herhangi bir
değişiklik, deney sonuçlarının doğruluğunu önemli derecede etkileyebilir ve sonuçları geçersiz kılar.
SSP ile kıyaslandığında, SSO’da kullanılan problar DNA numunesini test başına yalnızca bir bölgede
sorgulayabildiğinden SSO daha fazla belirsizlik içerir; buna karşın SSP, DNA numunesini test başına iki bölgede
sorgulayabilir. SSO yönteminin temel kısıtlaması olan bu durum HLA profesyoneli tarafından bilinir. Daha önce
belirtildiği gibi, reaksiyon örüntüsünün yorumlanmasına ve HLA tiplemesinin atanmasına yardım etmek üzere
LABType® SSO Tipleme Testlerinin her lotu için bir Çözünürlük Kısıtlamaları listesi kanıtlanır.
Kullanılacak bütün cihazların, (örn. ısı döngüleyici, pipetleme cihazları, LABScan™ 100 veya LABScan3D™ ve ısı
bloğu) üreticilerinin önerileri doğrultusunda kalibre edilmeli ve/veya doğrulanmalıdır.
Lota özgü bilgiler için Boncuk Probu Bilgileri belgesine başvurun.
HLA alellik tanımlarının karmaşıklığı nedeniyle verilerin incelenmesi ve yorumlanması, ve HLA tiplemelerinin
atanması sadece sertifikalı bir HLA teknisyen veya uzmanı tarafından yapılmalıdır.
Bu test, klinik kararları için tek kaynak olarak kullanılmamalıdır.
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 12 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
BEKLENEN DEĞERLER
A. Numune Çoğaltılması
1.
2.
Temin edilen HLA lokusa özgü primer karışımından yeterli miktarda amplifiye DNA elde edilmesi beklenir.
Etidyum bromürle boyanmış agaroz jel elektroforezi tarafından çoğaltılmış ürünün görülmemesi test
sonucunu geçersiz kılar.
DNA’nın çoğaltılması, daha önce amplifiye olmuş DNA tarafından kontaminasyona tabidir.
Kontaminasyon saptanması (kontamine eden amplifikasyon ürünlerini saptamak için su kullanılarak
yapılan bir kontrol amplifikasyonu veya önceden belirlenmiş DNA silme testi kanalıyla) test sonuçlarını
geçersiz kılabilir.
B. LABScan™ 100 ve LABScan3D™ Analizör
1.
2.
LABScan™ 100 veya LABScan3D™, günlük bakım ve kalibrasyon ve/veya doğrulama gerektiren gelişmiş
®
®
®
akış analiz cihazlarıdır. Tüm gerekli bakım işlemleri için Luminex 100/200 veya Luminex FLEXMAP 3D
Kullanıcı Kılavuzuna başvurun. Günlük bakım, rutin başlatma ve kapatma prosedürlerini içerir. En iyi
performans için, rutin başlatma işleminin bir parçası olarak cihazı kalibre edin. Sistem monitörü panelinde
gösterilen Δ Cal Temp sıcaklığı LABScan 100 için 3C°’den veya LABScan 3D için 5C°’den fazla
olduğunda cihazı kalibre edin.
LABType® SSO numuneleri analiz edilmeden önce cihaz kalibrasyon testinden geçmelidir.
C. Veri Toplama ve Analizi
Geçerli veri elde etmek için her veri alımında iki parametre (boncuk sayısı ve Ortalama Floresan Şiddeti [MFI])
izlenmelidir. Boncuk sayısı, analiz edilen toplam boncuk adedini belirtir ve 100 ±%25’in üstünde olmalıdır. Boncuk
sayısında önemli düşüş görülmesi, veri alımı veya deney sırasında boncuk kaybı olduğunun göstergesi olabilir ve
test sonuçlarını geçersiz kılabilir.
MFI, sayılan boncuklarda saptanan bir PE sinyalini temsil eder. MFI, reaksiyon sonucuna bağlı olarak değişiklik
gösterir. Pozitif kontrol probu için MFI değeri lottan lota değişiklik gösterebilmekle birlikte, aynı zamanda numune
miktarı ve/veya kalitesi, teknik, cihaz kalibrasyonunun yanı sıra çoğaltılmış (amplifiye) DNA, tamponlar, SAPE ve
boncuk karışımı dahil olmak üzere tüm reaktiflerin durumuna bağlı olarak da değişebilir.
Analiz yazılımındaki ürün kalite kontrolü veri bilgileri, numune koşullarını karşılayan DNA’lar kullanılarak elde
edilmiş lota özgü değerler sunar (Numune Toplama ve Hazırlama, kısım B).
Kullanıcıların her lot için referans numune doğrulama testlerini kullanarak kendi kontrol değeri aralıklarını
belirlemeleri önemle tavsiye edilir. Pozitif kontrol probu için MFI değerinde önemli derecede düşme veya
yükselme ve bunun eşliğinde atanamayan reaksiyon örüntüleri, yetersiz numune miktarı ve/veya kalitesi,
kötü deney verimi veya cihaz arızasının göstergesi olabilir ve test sonuçlarını geçersiz kılabilir.
SPESİFİK PERFORMANS ÖZELLİKLERİ
Normal numunelerde ve bu ürün etiketinde belirtilen spesifikasyonlar dahilinde olan veri toplama ve deney
koşulları kullanılarak (örn. 20 ng/μl başlangıç genomik DNA konsantrasyonu ve saflık, 1.65 ile 1.80 arasında
OD260/280, hibridizasyon inkübasyon sıcaklığı ve yıkama koşulları, LABScan™ 100 veya LABScan3D™ analiz
cihazı performans durumu) pozitif ve negatif reaksiyonlar, numunenin ilgili Ortalama Floresans Yoğunluğu (MFI)
ile karşılık gelen sınır değeri karşılaştırılarak belirlenir. Sınır değeri, LABType® SSO ürününün belirli bir lotu için
deneysel olarak belirlenir; sınır değeri, numunenin HLA genotipine bağlı olarak pozitif ve negatif sinyalleri ayırt
etmek için kullanılır. Sonuçların, belirli HLA alel(ler)inin varlığını veya yokluğunu yansıtıp kesin bir tipleme ataması
sağlaması beklenir.
KAYNAKÇA
1.
Terasaki, PI, Bernoco, F, Park MS, Ozturk G, Iwaki Y. Microdroplet testing for HLA-A, -B, -C, and –D
antigens. American Journal of Clinical Pathology 69:103-120, 1978.
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 13 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
Slater RD, Parham P. Mutually exclusive public epitomes of HLA-A, B, C Molecules. Human Immunology 26:
85-89, 1989.
3. The Luminex® 100 User’s Manual, Luminex Corporation, PN 89-00002-00-005 Rev. B.
4. Luminex® FLEXMAP 3D® Hardware User Manual, Luminex Corporation PN 89-00002-00-187.
5. Ng J, Hurley CK, Baxter-Lowe LA, et al. Large-scale oligonucleotide typing for HLA-DRB1/3/4 and HLA-DQB1
is highly accurate, specific, and reliable. Tissue Antigens. 1993; 42: 473-479.
6. Bodmer JG, Marsh SGE, Albert E, Bodmer WF, Bontrop RE, Dupont B, Erlich HA, Hansen JA, Mach B, Mayr
WR, Parham P, Petersdorf EW, Sasasuki T, Schreuder GMT, Strominger JL, Svejgaard A, Terasaki PI.
Nomenclature for factors of the HLA system, 1998. Tissue Antigens, 53, 407-446, 1999. Human Immunology,
60, 361-395, 1999. European Journal of Immunogenetics, 26, 81-116, 1999.
7. Colinas RJ, Bellisario R et al. Multiplexed genotyping of beta-globin variants from PCR-amplified newborn
blood spot DNA by hybridization with allele-specific oligodeoxynucleotides coupled to an array of fluorescent
microspheres. Clinical Chemistry 46: 996-998, 2000.
TİCARİ MARKALAR VE SORUMLULUK RETLERİ
2.
LABType® tipleme reaktiflerinin üretim ve dağıtımı, 21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA 91303, A.B.D.
adresinde bulunan One Lambda Inc. şirketi tarafından yapılır. Rekombinant Taq polimeraz, F. HoffmannLaRoche tarafından üretilir.
LABType®, One Lambda Inc. şirketinin tescilli ticari markasıdır.
LABScan™ ve HLA Fusion™, One Lambda Inc. şirketinin ticari markalarıdır.
Luminex® ve FLEXMAP® Luminex Corporation’ın tescilli ticari markalarıdır.
Pipetman®, Rainin Instrument Co., Inc. şirketinin tescilli ticari markasıdır.
Fotodyne® FOTO/UV21, FOTODYNE Incorporated şirketinin tescilli ticari markasıdır.
FMC SeaK®em, FMC Corporation’ın tescilli ticari markasıdır.
Amplitaq™, Roche Molecular Biochemicals şirketinin ticari markasıdır.
YETKİLİ AVRUPA TEMSİLCİSİ
MDSS GmbH, Schiffgraben 41, 30175, Hannover, Almanya
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 14 / 16
JavaScript must
be enabled
to view
this document.
Please
enableTestleri
JavaScript and reopen the document.
One Lambda,
Inc. | Ürün
Prospektüsü:
LABType®
SSO Tipleme
96 Numuneli Deney için Protokol Özeti
A. Kurulumu Öncesi
1. LABScan™ 100 veya LABScan™ 3D analiz cihazını açın ve başlangıç prosedürünü başlatın. Isı döngüleyiciyi açın ve 60°C
inkübasyon programını başlatın.
2.
Kırılmış buz parçalarından oluşan buz banyosunu hazırlayın (PCR tepsisinin buzda dik durmasını temin edecek kadar az miktarda
su ekleyin).
3.
4.
5.
D-Mix ve DNA’yı çözün ve vorteks uygulayın.
Bütün reaktifleri (100x SAPE şişesi hariç) depolama sıcaklıklarından çıkartıp oda sıcaklığında kullanmak üzere hazırlayın.
Hibridizasyon tamponu hacminin tamamını ve Boncuk Karışımının tamamını temiz bir tüp içinde iyice karıştırın; ışıktan koruyun.
B. Çoğaltma
1.
Bütün çoğaltma reaktiflerinin buzunu çözün ve buz üzerine yerleştirin.
2.
PCR tepsisindeki 96 haznenin her birine 2 µl genomik DNA numunesi alikuotlayın.
3.
432 µl Primer Karışımı, 1491 µl D-Mix ve 22 µl Taq polimerazı karıştırın. İyice vorteks uygulayın ve kısa süre santrifüjleyin.
4.
DNA içeren 96 hazneye Adım 3’teki Amplifikasyon Karışımından 18 µl alikuotlayın.
5.
PCR tepsisini kapatın.
6.
Tepsiyi, LABType® SSO PCR programını kullanarak bir PCR fırınında çalıştırın.
6.
PCR tepsisini PCR fırınından çıkartın ve amplifiye DNA’yı %2.5 agaroz jel üzerinde kontrol edin (hazne başına 5 µl kullanın).
C. Denatürasyon/Nötralizasyon
1. İnce duvarlı 96 hazneli temiz bir PCR tepsisine hazne başına 2.5 µl Denatürasyon Tamponu alikuotlayın.
2. Hazne başına 5 µl amplifiye DNA ekleyin. 96 hazne içindeki numune konumlarını not edin.
NOT: Amplifiye DNA önce alikuotlanabilir ve ardından Denatürasyon Tamponu eklenebilir.
3.
4.
5.
6.
7.
Karışımın rengi parlak pembeye dönüşene kadar iyice karıştırın.
Oda sıcaklığında (20° ila 25°C) 10 dakika inkübe edin.
Hazne başına 5 µl Nötralizasyon Tamponu ekleyin.
Karışım şeffaflaşana veya rengi soluk sarıya dönüşene kadar iyice karıştırın.
Tepsiyi dikkatli bir şekilde buz üzerine yerleştirin.
D. Hibridizasyon/Yıkama
1. Nötralize edilmiş tüm DNA’lara hazne başına 38 µl Hibridizasyon Karışımı (yukarıdaki A.5.’ten) alikuotlayın.
2. Tepsiyi kapatın ve düşük hızda iyice vorteks uygulayın.
3. Tepsiyi 96 hazneli bir blok içinde 60ºC’lik ısı döngüleyicide 15 dakika inkübe edin (PCR Pedi kullanın).
4. Tepsiyi çıkartın. Her hazneye 100 µl Yıkama Tamponu ekleyin. Tepsiye yeni bir kapak yerleştirin ve 5 dakika süreyle 1000 g spin
uygulayın.
5.
6.
7.
E.
Yaklaşık 10 µl veya daha az numune bırakarak süpernatantı çıkartın.
Adım D.4 ve D.5’i toplamda 3 yıkama olacak şekilde iki defa daha tekrarlayın.
Son santrifüj adımı sırasında 1X SAPE (57.5 µl Stok ve 5693 µl SAPE Tamponu) hazırlayın ve üstü kapalı olarak oda sıcaklığında
bırakın.
Etiketleme
1.
2.
3.
4.
Üçüncü yıkamadan süpernatantı çıkarttıktan sonra (yukarıda D.6) hazne başına 50 µl 1X SAPE ekleyin.
5.
6.
Süpernatantı çıkartın. Son hacmi 80 µl yapmak üzere Yıkama Tamponu ekleyin.
7.
Pipetleyerek karıştırın ve tüm numuneleri veri toplaması için 96 hazneli mikro plakaya aktarın.
Tepsiyi dikkatle kapatın ve düşük hızda iyice vorteks uygulayın
Isı döngüleyicide 60°C’de yukarıdaki gibi 5 dakika inkübe edin.
Tepsiyi çıkartın ve her hazneye 100 µl Yıkama Tamponu ekleyin. Tepsiye yeni bir kapak yerleştirin ve 5 dakika süreyle 100 g spin
uygulayın.
Pipetleyerek karıştırın ve tüm numuneleri veri toplaması için 96 hazneli mikro plakaya aktarın.
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 15 / 16
JavaScript must be enabled to view this document. Please enable JavaScript and reopen the document.
One Lambda, Inc. | Ürün Prospektüsü: LABType® SSO Tipleme Testleri
SEMBOLLERİN AÇIKLAMASI
Sembol
Tanım
Katalog numarası
İn vitro tanılama tıbbi cihazı
Kullanım talimatına başvurun
Dikkat, eşlik eden belgelere başvurun
Biyolojik riskler
Sıcaklık sınırlaması
CE İşareti
CE tıbbi kalite işareti
Üretici
Avrupa Topluluğu içindeki yetkili temsilci
REVİZYON TARİHÇESİ
Revizyon
Tarih
22
2013/11
Revizyon Tanımı
LABScan™ 100 eklendi. Küçük çaplı düzeltmeler/netleştirmeler yapıldı.
Büyük güncelleme. FM3D (LABScan3D™) eklendi. Ekipman Gereksinimi Kısmına bilgi
23
2014/05
eklendi. Numune Toplama ve Hazırlama Kısmının A maddesi güncellendi. Gerekli
Olan, Ancak Sağlanmayan Malzemeler Kısmının B maddesi güncellendi. Kullanım
Yönergelerinin 14. maddesi güncellendi. Test İşlemleri Kısmının Veri Toplama
maddesine bilgi eklendi. Kaynakçaya Luminex eklendi. Bütün fontlar Arial’a
değiştirildi; Heading2 (Başlık2) stili güncellendi.
®
24
2014/08
PCR No. 437’ye göre: Luminex yazılım sürümü gerekliliği xPONENT 4.0’dan
xPONENT 4.0 ve/veya xPONENT 4.2’ye değiştirildi (Kullanım Yönergeleri, paragraf
D.4 Notlar). Beklenen Değerler paragraf B.1’e FM3D için Δ Cal Temp sıcaklığı
eklendi.Yeni belge şablonuna aktarıldı. “İçindekiler” güncellendi.
*0197 Sadece Annex II List B ürünleri için geçerlidir
RSSO-LTYP-PI-TR-00, Rev 24
Sayfa 16 / 16
Download

LABType® SSO TİPLEME TESTLERİ