JavaScript must be enabled to view this document. Please enable JavaScript and reopen the document.
ÜRÜN PROSPEKTÜSÜ
Micro SSP™ HLA DNA Tipleme Tepsileri
Katalog No. OLI ürün-katalog numaraları, belirli ürün bileşenleri ve gereklilikleri için Micro
SSP™ HLA DNA Tipleme Tepsileri Ürün Referans Tablosuna başvurun.
İn Vitro Tanılama Kullanımı İçindir.
KULLANIM AMACI
Sınıf I ve Sınıf II HLA alellerinin DNA tiplemesi.
ÖZET VE AÇIKLAMA
Tarihsel olarak, HLA antijenlerini saptamak için kabul edilen yöntem lenfositotoksisite testi olmuştur. 1 Ancak, PCR
teknolojilerinin gelişmesiyle, DNA bazlı doku tipleme teknolojileri laboratuarda olağan duruma gelmiştir. DNA bazlı
metodolojilerin çoğu için PCR işlemi sadece, gerekli hedef DNA’yı elde etmek için bir çoğaltma (amplifikasyon)
adımı olarak kullanılmaktadır. HLA tipleme işlemi o zaman, farklı aleller arasında ayırım yapmak için bir çoğaltma
sonrası adımı gerektirir (örn. RFLP, SSOP, ters nokta boyama). PCR bazlı diğer yöntemlerin aksine, One Lambda
Inc. Micro SSP™ DNA tiplemesinde kullanılan SSP metodolojisi, PCR işlemi sırasında farklı aleller arasında
ayırım yapar.2 Bu, çoğaltma sonrası işlem süresini basit bir jel elektroforezi saptama adımı olarak kısaltır.
Lenfositotoksisite reaksiyon ölçeğinin (1 = negatif ila 8 = pozitif) aksine, Micro SSP™ test sonuçları ya pozitif ya
da negatiftir. Bu da sonuçları karmaşık yöntemlerle yorumlama ihtiyacını ortadan kaldırır. Ayrıca, tek nükleotid
değişimleri PCR-SSP’de ayırımcı olabilirken, çapraz reaksiyona giren gruplar (CREG’ler) serolojik tipleme için
büyük zorluklar oluşturur. 3 Son olarak, DNA tipleme reaktiflerinin sentetik doğası nedeniyle (örn. oligonükleotid
primerleri), stabilite büyük ölçüde iyileştirilmiş ve lotlar arası değişim azaltılmıştır.
İLKE(LER)
PCR-SSP metodolojisi, tamamen eşleşen oligonükleotid primerlerinin bir hedef sekansı çoğaltmak için
rekombinant Taq polimeraz ile eşleşmeyen oligonükleotid primerine kıyasla daha verimli olarak kullanıldığı
prensibine dayanır. Primer çiftleri, sadece tek bir alel veya alel grubu ile kusursuz olarak eşleşecek şekilde
tasarlanmıştır. Sıkı kontrol altındaki PCR koşullarında, kusursuzca eşleşen primer çiftleri hedef sekansların
çoğalması ile sonuçlanırken (yani, pozitif sonuç), eşleşmeyen çiftler çoğalma ile sonuçlanmaz (yani, negatif
sonuç). PCR sürecinden sonra, çoğaltılmış DNA fragmanları agaroz jel elektroforezi ile ayrılır ve etidyum bromür
ile boyanıp ultraviyole ışığa maruz bırakılarak görüntülenir. PCR-SSP sonuçlarının yorumlanması, belirli bir
çoğaltılmış DNA fragmanının mevcut olup olmamasına dayanır. PCR reaksiyonu sırasındaki çoğalma çeşitli
etkenler (pipetleme hatalar, kötü DNA kalitesi, inhibitörlerin mevcut olması vb.) tarafından olumsuz şekilde
etkilenebileceğinden, her PCR reaksiyonuna bir iç kontrol primer çifti dahil edilir. Kontrol primer çifti, tüm insan
DNA numunelerinde mevcut olan İnsan β-globin geninin korunmuş bir bölgesini çoğaltır ve PCR reaksiyonunun
bütünlüğünü doğrulamak için kullanılır. Pozitif bir tipleme bandının mevcudiyetinde (bir HLA alelinin spesifik
amplifikasyonu), iç kontrol primer çiftinin ürünü, spesifik primer çiftleri ve iç kontrol primer çifti arasındaki
konsantrasyon ve erime sıcaklığı farklılıkları nedeniyle zayıf olabilir veya hiç mevcut olmayabilir. Belirli HLA primer
çiftlerinin çoğalmış DNA fragmanları iç kontrol primer çiftinin ürününden daha küçük, ancak dağınık ve
birleşmemiş primer bandının ürününden daha büyüktür. Böylece, belirli bir HLA alel veya alel grubu için pozitif
reaksiyon, jel üzerinde iç kontrol ürün bandı ve birleşmemiş primer bandı arasında çoğalmış DNA fragmanı olarak
görüntülenir (Beklenen Değerler/Jel Yorumlaması kısmına bakın).
www.onelambda.com
SSP-DNAT-PI-TR-00, Rev 19
Sayfa 1 / 11
JavaScript must be enabled to view this document. Please enable JavaScript and reopen the document.
One Lambda, Inc. | Ürün Prospektüsü: Micro SSP™ HLA DNA Tipleme Tepsileri
REAKTİFLER
A. Tanım
Micro SSP™ DNA Tipleme Tepsilerinde, insan β-globin geni ve HLA alellerinin polimeraz zincir
reaksiyonu (PCR) tarafından çoğaltılması için sekansa özgü oligonükleotid primerleri temin edilir.
Önceden optimize edilmiş primerler 96 hazneli 0.2 ml’lik ince duvarlı tüp tepsisinin farklı hazneleri içinde
PCR için sunulur (kurutulmuş olarak) ve DNA numuneleri, rekombinant Taq polimeraz ve özel
formülasyonlu dNTP-tampon karışımı (Micro SSP™ D-mix) eklemek için hazırdır. Her tipleme tepsisi,
Micro SSP™ DNA Tipleme Tepsisi tarafından üretilen iç kontrol PCR ürününün mevcudiyetini algılayan
bir negatif kontrol reaksiyon tüpü içerir. İnsan -globin geninden çoğaltılan iç kontrol PCR ürünü, her
haznede çoğalması nedeniyle en olası kontamine edici PCR ürünüdür. Her primerin miktarı; Micro
SSP™ D-mix, belirtilen miktardaki rekombinant Taq polimeraz ve bu belgede (sayfa 2’de) ayrıntıları
verilen PCR reaksiyon profiliyle birlikte kullanıldığında 100 ng DNA numunesinin optimal çoğaltımı için
ayarlanmıştır. Temin edilen çalışma sayfasında, deneyin belirtilen PCR koşulları altında her bir primer
seti tarafından çoğaltılabilen spesifik aleller gösterilmektedir. Lota özgü primer konum yerleri için Primer
Bilgi belgesine başvurun.
B. Uyarı veya Dikkat
1. FDA Ataması: IVD
2. Uyarı: PCR Sonrası manipülasyonları için kullanılan pipetler PCR Öncesi manipülasyonları
için kullanılmamalıdır.
3. Uyarı: Biyolojik Tehlike: DNA boyaması için kullanılan etidyum bromür olası bir kanserojendir.
Boyanmış jelleri ele alırken daima eldiven takın.
4. Uyarı: Biyolojik Tehlike: Tüm kan ürünlerine olası enfeksiyöz ürün muamelesi yapılmalıdır. Bu
ürünün türetildiği kaynak malzeme, ABD Gıda ve İlaç İdaresi FDA’nın halihazırda gerektirdiği
testler uyarınca test edildiğinde negatif bulunmuştur. Bilinen hiçbir test yöntemi, insan kanından
türetilen ürünlerin enfeksiyöz ajanlar iletmeyeceğini garanti edemez.
5. Dikkat: UV ışıkları bloke eden göz koruması takın ve jelleri görüntülerken veya fotoğraflarını
çekerken UV ışık kaynağına direkt olarak bakmayın.
6. Detaylı bilgiler için Güvenlik Bilgi Formuna başvurun.
C. Reaktiflerin Kullanıma Hazırlanması
1. Kullanım Yönergeleri kısmına bakın.
D. Depolama Talimatı
Reaktifleri ambalaj üzerinde belirtilen sıcaklıkta saklayın. Ambalaj üzerine basılmış son kullanım
tarihinden önce kullanın.
E. Kullanım için Gerekli Saflandırma veya İşlem
Kullanım Yönergeleri kısmına bakın.
F. İnstabilite Göstergeleri
1. Tüplerinde veya kenarlarında buharlaşma kayıplarına neden olabilecek çatlaklar bulunan primer
seti tepsilerini kullanmayın.
2. Nakliyat veya depolama sırasında D-mix alikuotlarındaki tuzlar solüsyon içinde çökelmişse,
bunları oda sıcaklığında (20-25 °C) uzun süre vorteks uygulayarak yeniden eritin.
3. Donmuş D-mix alikuotları oda sıcaklığında (20-25 °C) çözüldükten sonra pembe ila açık mor
renkli olmalıdır. Belirtilen renkte olmayan herhangi bir D-mix alikuotu kullanılamaz sayılmalıdır.
EKİPMAN GEREKSİNİMİ
A. Isı Döngüleyicinin Programlanması
96 Hazneli GeneAmp PCR System 9600, 9700 veya Veriti™ 96 Hazneli Isı Döngüleyici (Applied
Biosystems) veya eşdeğeri. 96 Hazneli GeneAmp® PCR System 9700 için rampa hızını 9600’e
ayarlayın. Veriti™ 96 Hazneli Isı Döngüleyici için rampa hızını 9600 Emülasyon Moduna ayarlayın. Isı
döngüleyicinizi aşağıdaki “İşlem Adımları”na başlamadan önce programlayın.
One Lambda PCR Programı (OLI-1)
SSP-DNAT-PI-TR-00, Rev 19
Sayfa 2 / 11
JavaScript must be enabled to view this document. Please enable JavaScript and reopen the document.
One Lambda, Inc. | Ürün Prospektüsü: Micro SSP™ HLA DNA Tipleme Tepsileri
Döngü
Sayısı
1
Adım
1
2
Sıcaklık
(°C)
96
63
Süre
(saniye)
130
60
9
1
2
96
63
10
60
20
1
2
3
96
59
72
10
50
30
Son
1
4
---
Isı döngüleyiciye özgü bilgiler için üreticinin kullanıcı kılavuzuna başvurun.
B. %2.5 Agaroz Jelin Hazırlanması
(Micro SSP™ Jel Sistemi için, OLI Kat. No. MGS108)
1. Kurulum:
a.
Tabandaki kilitleme pimini açık konuma kaydırın.
b.
Doğru yönü temin etmek üzere renk kodlu kenarları eşleştirerek jel kutusunu tabana yerleştirin.
c.
Kilitleme pimini kilitli konuma kaydırarak jel kutusunu tabana kilitleyin.
d.
Terazileme baloncuğunu ve yükseklik ayarlı üç bacağı kullanarak tabanı terazileyin.
2. 14 jel tarağının yönünü belirleyip jel tarağı tutucusuna tam olarak yerleştirin.
3. 0.5 μg/ml etidyum bromür içeren 100 ml 1x Tris Borat EDTA tampona (1x TBE) (500 ml’lik cam şişe
içinde), 2.5 g elektroforezi sınıfı agaroz ekleyin. Homojen solüsyon oluşana kadar ısıtın.
4. Jel kutusuna jel solüsyonundan 30 ml ekleyin. Jel solüsyonu eklendikten hemen sonra jel kutusuna ileri
geri eğim vererek agarozun tüm yüzeyi eşit bir şekilde kaplamasını temin edin. Renk kodunu eşleştirerek,
jel tarağı tutucusunu doldurulmuş jel kutusu üzerine çabukça yerleştirin. Katılaşması için 15 dakika süre
tanıyın.
5. Tabanı tutarak jel tarağı tutucusunu kaldırıp jel taraklarını çıkartın. Her hazneyi doldurmak üzere, 0.5
g/ml etidyum bromür içeren 1xTBE’den jele eşit bir şekilde 10 ml ekleyin.
C. Jel Elektroforezi
(Micro SSP™ Jel Sistemi için, OLI Kat. No. MGS108)
1. PCR reaksiyonunu tamamladıktan sonra:

DNA primer seti tepsisini ve jel kutusunu, negatif kontrol haznesi sol üst köşeye gelecek şekilde
yönlendirin.

Numuneleri sıçratmadan, tepsi kapağını nazikçe çıkartın.
2. Her bir PCR reaksiyonunu (10 μl) sırayla %2.5 agaroz jeline aktarın. Tüm numunelerin doğru sırayla
aktarıldığından emin olun. (Elektroforezi boyası eklemek gerekmez.) 8 ya da 12 kanallı Pipetman®
kullanılması önerilir.
NOT: Numunelerin sırası (çalışma sayfasıyla eşleşmek için) soldan sağa ve yukarıdan aşağıyadır.
3. Jel kutusunu, renk kodlu kenarları eşleştirerek jel kutusu kapağıyla kapatın. Kırmızı izleme boyası jel içine
yaklaşık 0.5 cm nüfuz edene kadar numunelere 140-150 voltta elektroforez uygulayın (kullanılan agaroza
bağlı olarak yaklaşık 3-5 dakika). Kapağı çıkartın.
4. Tabandaki kilitleme pimini açık konuma kaydırarak jel kutusunu çıkartın. Jel kutusunu bir UV
transillüminatör cihazına aktarın. Tamamlanan jelin fotoğrafını çekin.
5. Fotoğrafı, negatif kontrol reaksiyonu sol üst köşeye gelecek şekilde yönlendirin ve karşılık gelen pozitif
alel gruplarını tepsi ile birlikte temin edilen çalışma sayfası üzerinde işaretleyin.
NUMUNE TOPLAMA VE HAZIRLAMA
A. DNA, tercih edilen herhangi bir yöntemle insan lökositlerinden saflaştırılabilir.
B. PCR-SSP analizi için kullanılacak DNA numunesi steril su içinde veya 25-200 ng/μl konsantrasyonda,
1.65-1.80 A260/A280 oranlı, 8.0-9.0 pH değerli 10 mM Tris-HCl içinde tekrar süspanse edilmelidir.
SSP-DNAT-PI-TR-00, Rev 19
Sayfa 3 / 11
JavaScript must be enabled to view this document. Please enable JavaScript and reopen the document.
One Lambda, Inc. | Ürün Prospektüsü: Micro SSP™ HLA DNA Tipleme Tepsileri
C. Numuneler, 0.5 mM’den daha yüksek konsantrasyonlu EDTA gibi şelatlama ajanları içeren çözeltiler içinde
tekrar süspanse edilmemelidir.
D. DNA numuneleri, izole edildikten hemen sonra kullanılabilir veya sonuçlar üzerinde hiçbir olumsuz etkiye yol
açılmaksızın -20 °C veya altında uzun süre (1 yıldan fazla) saklanabilir.
E. DNA numunelerinin nakliyat sırasındaki bütünlüğünü korumak için numuneler 4 °C veya altında taşınmalıdır.
İŞLEMLER
A. Sağlanan Malzemeler
1. Micro SSP™ DNA primer seti tepsileri
2. Önceden alikuotlanmış D-mix tüpleri (test için uygun sayıda)
3. Tepsi kapakları (test için uygun sayıda)
B. Gerekli Olan, Ancak Sağlanmayan Malzemeler
1. Rekombinant Taq Polimeraz (5 ünite/μl)
2. Pipetleme cihazları, örneğin: Gilson® P-20, Gilson® P200 Pipetman®
3. Atılabilir pipet uçları
4. Vorteks mikseri
5. Mikrosantrifüj
6. PCR tepsisi mikrotüp saklama rafı ve kapağı (Robbins Scientific, Kat. No. 1044-39-5)
7. Tepsiyle kullanılacak basınç pedi (OLI Kat. No. SSPPAD, SSPPAD384, SSPPADGRY) Sadece ısı
döngüleyicinize özgü basınç pedini kullanın. Mikro SSP™ Basınç Pedi Protokolüne bakın
(PCR_PAD_INS.DOC).
NOT: Basınç Pedi en fazla 300 PCR çalışması için kullanılabilir. Basınç pedinin tepsi kapağı ile temas
eden yüzeyi pürüzsüzlüğünü kaybederse lütfen yeni bir ped siparişi verin.
8. 96 hazne formatlı PCR için ısı döngüleyici ve 0.2 ml’lik ince duvarlı reaksiyon tüplerine uygun tepsi/tutucu
9. Agaroz solüsyonlarını ısıtmak için ısıtma tablası veya mikrodalga fırını
10. Elektroforezi aparatı/güç kaynağı (150V minimum kapasiteli)
11. UV transillüminatör (Örneğin: Fotodyne FOTO/UV21)
12. Fotoğraf veya görüntü belgeleme sistemi
13. 0.5 µg/ml etidyum bromürlü 1x TBE tampon (89mM Tris-borat; 2 mM disodyum EDTA, pH 8.0) veya
etidyum bromürlü 5XTBE Tampon (OLI Kat. No. 5XTBE100)
14. Elektroforezi sınıfı agaroz (örn., FMC Seakem® LE)
C. Kullanım Yönergeleri
1. Numune Hazırlama
a. Tercih ettiğiniz yöntemi kullanarak lökosit numunesinden genomik DNA’yı saflaştırın. Son DNA
konsantrasyonu 25 - 200ng/l (100ng/l optimaldir), A260/A280 oranı 1.65-1.80 arasında olmalıdır.
b. Numunenin hazırlanması ve depolanması hakkında özel bilgi için yukarıdaki NUMUNE TOPLAMA
VE HAZIRLAMA kısmına bakın.
Bir Micro SSP HLA DNA Tipleme Tepsisi kullanarak, saflaştırılmış DNA üzerinde PCR uygulayın
veya DNA numunesini tiplemeye hazır olana kadar -20 °C veya altında saklayın.
2. Reaktif/Ekipman Hazırlığı
a. Bir ısı döngüleyicisini, One Lambda PCR programını çalıştırmak üzere programlayın. (Yukarıdaki
“Ekipman Gereksinimi” kısmına bakın.)
b. Rekombinant Taq polimeraz (5 birim/μl) hazır bulundurun. -20 °C’de saklayın.
c.
SSP-DNAT-PI-TR-00, Rev 19
Sayfa 4 / 11
JavaScript must be enabled to view this document. Please enable JavaScript and reopen the document.
One Lambda, Inc. | Ürün Prospektüsü: Micro SSP™ HLA DNA Tipleme Tepsileri
c.
Micro SSP™ Jel Sistemini (Kat. No. MGS108) kullanarak veya en az 96 numunelik haznelerle
elektroforezi jelini (%2.5 agaroz) hazırlayın (hazne sıraları arasında en az 1 cm bulundurun).
3. Taq Polimeraz Pipetleme Talimatı
One Lambda’nın kalite kontrol testleri, Taq polimeraz etiketi üzerinde gösterilen hacmin bu üründe
belirtilen test adedi için yeterinden fazlasını temin ettiğini belirtmektedir. Eğer ilave Taq gerekiyorsa,
sipariş doğrudan F. Hoffmann-La Roche’a veya onların temsilcisine verilmelidir.
İsrafı önlemek için lütfen aşağıda verilen Taq pipetleme talimatını izleyin.
NOT: Taq polimerazın viskozitesi çok yüksek olduğundan alikuotlama işlemine özel dikkat gösterilmelidir.
Aşağıda tanımlanan adımların izlenmemesi reaktif kaybı ile sonuçlanabilir.
a. Kalibre edilmiş Gilson® Pipetman® ile yavaşça pipetleyin. (Daha yüksek doğruluk düzeyi için P10
Pipetman® önerilir.)
b. Pipet ucu Taq’ın yüzey tabakasını ancak geçmelidir.
Uyarı: Pipet ucunu Taq içine daldırmayın.
c. Pipet ucundaki Taq fazlalığını flakonun kenarına silerek giderin.
4. İşlem Adımları
a. Seçilen Micro SSP™ primer seti tepsisine uyan Micro SSP™ D-Mix hacmini (tüpünü), primer seti
tepsisini (tepsilerini) ve uygun sayıda DNA numunesini belirtilen depolama sıcaklığından çıkartın. Oda
sıcaklığında (20° - 25 °C) buzunu çözün.
NOT: Tepsi ve kapağı, tek bir çalışma oturumunda test edilecek örneğe yetecek kadar kesilebilir.
Kullanılmayan kısımlar derhal belirtilen saklama koşullarına geri götürülmelidir.
DNA numunelerine vorteks uygulayın.
b. Primer seti tepsisini bir PCR Tepsisi Mikrotüp Saklama Askısına (Robbins Scientific, Kat. No. 104439-5) yerleştirin ve tepsi etiketini çıkartın.
c. Taq polimerazı dondurucudan çıkartın ve kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
d. Bir Pipetman® (veya eşdeğerini) kullanarak primer seti tepsisindeki negatif kontrol reaksiyon tüplerine
1 μl DNA seyreltisi ekleyin.
e. Bir Pipetman® (veya eşdeğerini) kullanarak Micro SSP™ D-mix tüpüne rekombinant Taq polimeraz
(5 birim/μl) ekleyin. (Miktar için Mikro SSP™ Ürün Referans Tablosuna bakın.)
f. Tüpü kapatın ve 5 saniye vorteks uygulayın. Tüpün yanlarındaki tüm sıvıyı aşağı indirmek için Micro
SSP™ D-mix tüpüne bir mikrosantrifüj içinde puls-spin uygulayın.
g. Bir P20 Pipetman® (veya eşdeğerini) kullanarak negatif kontrol reaksiyon tüpüne 9 μl Micro SSP™
D-mix pipetleyin.
h. Bir Pipetman® (veya eşdeğerini) kullanarak DNA numunesini Micro SSP™ D-mix tüpüne ekleyin.
(Miktar için Mikro SSP™ Ürün Referans Tablosuna bakın.)
i. Tüpü kapatın ve 5 saniye vorteks uygulayın. Micro SSP™ D-mix tüpüne mikrosantrifüj içinde pulsspin uygulayın.
j. Bir P20 Pipetman® veya bir elektronik Pipetman® kullanarak, Micro SSP™ D-mix tüpünden numunereaksiyon karışımı Micro SSP™ primer seti tepsisinin negatif kontrol reaksiyon tüpleri hariç her bir
reaksiyon tüpü içine 10 μl alikuotlayın.
Önemli: Tüpler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için numuneyi (her bir reaksiyon tüpünün
dibinde kurumuş olan) primerlerden yukarıya uyguladığınızdan emin olun. Pipet ucuyla tüpün iç
duvarına dokunarak numunenin tüp dibine kaymasını sağlayın. Bütün numunelerin her tüpün dibine
düştüğünü kontrol edin. Düşmemişse, tepsiyi hafifçe banko üzerine vurarak, PCR işlemine
başlamadan önce bütün numunelerin tüp dibine yerleşmesini sağlayın.
k. Reaksiyon tüplerini temin edilen tepsi kapağı ile kapatın. PCR sırasında buharlaşma kaybını önlemek
için bütün tüplerin ağızlarını tepsi kapağıyla tamamen kapatılmış olduğunu kontrol edin.
l. Mikro SSP™ primer seti tepsisi ısı döngüleyiciye yerleştirin.
m. Isı döngüleyici kapağını kapatmadan önce bir basınç pedini tepsinin üstüne pürüzlü yüzü yukarı
gelecek şekilde yerleştirin. (Isı döngüleyicinizle kullanılacak özel basınç pedini bulmak için Micro
SSP™ Basınç Pedi Protokolüne bakın.)
SSP-DNAT-PI-TR-00, Rev 19
Sayfa 5 / 11
JavaScript must be enabled to view this document. Please enable JavaScript and reopen the document.
One Lambda, Inc. | Ürün Prospektüsü: Micro SSP™ HLA DNA Tipleme Tepsileri
n. Micro SSP™ PCR program numaranızı girin. Reaksiyon hacmi olarak10 μl seçeneğini belirtin.
o. PCR programını başlatın. Bu program yaklaşık 1 saat 16 dakika sürer. Son adım, çalışma
durdurulana kadar numuneyi 4 °C’de tutar.
p. Primer seti tepsisini ısı döngüleyiciden çıkartın. Numuneleri sıçratmadan, tepsi kapağını nazikçe
çıkartın. Jel elektroforezi işlemini daha sonra yapmak isterseniz primer seti tepsisinin içindeki
numuneleri -20 °C veya altında saklayın.
q. Her PCR reaksiyonunu (10 μl) sırayla Mikro SSP™ Gel System’deki (OLI Kat. No. MGS108) bir %2.5
agaroz jeline aktarın. (8 veya 12 kanallı Pipetman® veya 96 Haznelik Aktarma Cihazı (OLI Kat. No.
TRNDV96) kullanılması önemle önerilir.)
Not: Primer seti tepsisini sol üst köşedeki negatif kontrol reaksiyon haznesi ile yönlendirerek, tüm
numunelerin doğru sırayla aktarılmasına dikkat edin. Numunelerin sırası (çalışma sayfasıyla
eşleşmek için) soldan sağa ve yukarıdan aşağıyadır. Elektroforezi boyası eklemek gerekmez.
r. Kırmızı izleme boyası jel içine yaklaşık 0.5 cm nüfuz edene kadar numunelere 140-150 voltta
elektroforez uygulayın (kullanılan agaroza bağlı olarak yaklaşık 3-5 dakika).
s. Bir UV transillüminatör cihazında jelin fotoğrafını çekin.
t. Tepsilerle birlikte verilen çalışma sayfasını kullanarak veya One Lambda Inc.ten temin edilebilecek
HLA yazılımının yardımıyla tipleme sonuçlarını yorumlayın.
NOT: One Lambda’nın DNA tipleme tepsilerindeki numuneler elektroforezi jelinin sadece birkaç
sırasını dolduruyorsa, bir jele değişik numuneler yüklenebilir. Jel üzerindeki numune pozisyonlarını
kaydetmeye özen gösterin.
SONUÇLAR
Alel Grupları
DRB1*01
DRB1*15
DRB1*16
DRB1*0301, 0304
DRB1*0302, 0303
DRB1*04
DRB1*11
DRB1*12
DRB1*13
DRB1*14
DRB1*07
DRB1*08
DRB1*09
DRB1*10
DRB5*
DRB3*
DRB4*
DQB1*05
DQB1*06
DQB1*02
DQB1*0301, 0304
DQB1*0302, 0304
DQB1*0303
DQB1*04
DR 72
Seroloji
12
24
2
6
6
14
23a
5
17
11b
16
7
5
5
26
c
57
d
32
34
32
24
22
11
3
11
Micro SSP™
12
24
2
6
6
14
24
5
17
10
16
7
5
5
26
56
33
34
32
24
22
11
3
11
a, b) DRB1*11 ve DRB1*14 üzerindeki çelişkiler, seroloji tarafından DRB1*14 atanırken DNA tiplemesi tarafından
DRB1*1117 atanan bir numuneye dayanmaktadır. DRB1*14 seroloji reaktifleri, DRB1*14 alelleri ile örüntü
analizine dayanarak epitop 31FHNQEEF37’yi saptamaları öngörülen monoklonal antikorlardır. Bu amino asit
sekansı ayrıca DRB1*1117 ile paylaşılır (yayınlanmış amino asit sekanslarına göre).
SSP-DNAT-PI-TR-00, Rev 19
Sayfa 6 / 11
JavaScript must be enabled to view this document. Please enable JavaScript and reopen the document.
One Lambda, Inc. | Ürün Prospektüsü: Micro SSP™ HLA DNA Tipleme Tepsileri
c)
DRB3 üzerindeki uyumsuzluk, hem seroloji hem de DNA tiplemesi tarafından homozigöz bir DRB1*08
atanan, ancak seroloji tarafından ek olarak bir DRB3* atanan bir numuneye dayanmaktadır. DRB1*08 ve
DRB3* amino asit sekansları paylaşır; bu da DRB1*08 homozigositesinin çift doz etkileri altında sahte pozitif
serolojik reaksiyonlar üretebilir.6
d)
DRB4 üzerindeki sahte negatif uyumsuzluğu, sadece DNA tiplemesi tarafından DRB4 atanan bir numuneye
dayanmaktadır. Hem seroloji hem de DNA tiplemesi tarafından yapılan atamalar, bu numunenin protein
düzeyinde DRB4 alel ifadesini taşımadığı bilinen DR7-DQ9 haplotipini içerdiğini göstermektedir.7
NOT:
Lota özgü performans verileri istek üzerine temin edilebilir.
İŞLEMİN KISITLAMALARI

PCR-SSP, ayırımcı çoğaltma sağlamak için koşulların yüksek düzeyde kontrol altına alınmasını gerektiren
dinamik bir süreçtir. Bu ürün içinde temin edilen işlem kesinlikle takip edilmelidir.

Çıkartılan numune DNA’sı, belirli çoğaltma süreci için şablon temin eder ve dolayısıyla yoğunluğu ve saflığı,
işlemde belirtilen aralıklar dahilinde olmalıdır.
Tüm cihazlar (örn. PCR makinesi, pipetleme cihazları) üreticilerinin önerileri uyarınca kalibre edilmelidir. Lota
özel bilgi için Çözünürlük Kısıtlamaları belgesine başvurun.


Lota özel bilgi için Çözünürlük Kısıtlamaları belgesine başvurun.
BEKLENEN DEĞERLER
A. Veri Analizi
1. Başarılı bir çoğaltma işleminin kontrolü olarak, bir iç (daha yavaş yer değiştiren) kontrol bandı negatif
haznelerde (negatif kontrol haznesi hariç) daima görünür olmalıdır. Herhangi bir haznede çoğalma
olmaması test sonuçlarını geçersiz kılabilir.
2. Eğer PCR sırasında belirli bir HLA geni çoğaldıysa, elektroforetik jel üzerinde daha hızlı yer değiştiren bir
pozitif tipleme bandı gözlemlenecektir. Bu durum pozitif bir test sonucunu belirtir.
3. İç kontrol bandı pozitif haznelerde zayıf olabilir veya hiç mevcut olmayabilir.
4. Numune DNA’sının HLA tiplemesini elde etmek için, pozitif haznelerdeki örüntüyü Micro SSP™ çalışma
sayfası üzerindeki bilgilerle eşleştirin.
5. İç kontrol bandının bulunması ve/veya negatif kontrol haznesinde pozitif tipleme bandının bulunması tüm
test sonuçlarını geçersiz kılar.
6. Opsiyonel analiz – HLA Fusion™ Yazılımı.
SSP-DNAT-PI-TR-00, Rev 19
Sayfa 7 / 11
JavaScript must be enabled to view this document. Please enable JavaScript and reopen the document.
One Lambda, Inc. | Ürün Prospektüsü: Micro SSP™ HLA DNA Tipleme Tepsileri
B. Jel Yorumlaması*
Pozitif
Reaksiyon
Negatif
Reaksiyon
Amplifikasyo
n
Yok
Hazne
İç Kontrol Bandı
Pozitif Tipleme Bandı
Primer Bandı
*İç kontrol bandı ve geniş birleşmemiş primer bandı boyut markörleri olarak görev yapar. İki boyu markörü
arasındaki görünür bantlar pozitif tipleme bantları olarak sayılmalıdır.
SPESİFİK PERFORMANS ÖZELLİKLERİ
A. Micro SSP™ HLA tipleme sisteminin doğruluğunu değerlendirmek için Micro SSP™ ve serolojik HLA
tipleme metodolojilerinin karşılaştırması yapıldı. Bu karşılaştırmada, seksen bir rastgele tam kan
numunesi alındı ve One Lambda Inc. HLA Sınıf II Doku Tipleme Tepsisi DR72F ve Micro SSP™ Jenerik
HLA Sınıf II DNA Tipleme Tepsisi kullanılarak bunların HLA Sınıf II tiplemesi analiz edildi. Sonuçlar, iki
yöntem arasında %96 (78/81) uyum gösterdi. Bir sonraki sayfada verilen tablo, her bir spesifitenin iki
farklı yöntem tarafından toplam kaç kere atandığını temsil etmektedir. (Vurgulanan sonuçlar iki yöntem
arasındaki uyumsuzlukları belirtmektedir.)
KAYNAKÇA
1. Terasaki, P.I., Bernoco, F., Park, M.S., Ozturk, G., and Iwaki, Y. Microdroplet testing for HLA-A, -B, -C and -D
antigens. American Journal of Clinical Pathology 69:103-120, 1978.
2. Newton, C.R., Graham, A., Heptinstall, E., Powell, S.J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J.C., and
Markham, A.F. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS).
Nucleic Acids Research 17: 2503-2516, 1989.
3. Slater, R.D. and Parham, P. Mutually exclusive public epitopes of HLA-A,B,C Molecules. Human Immunology
26: 85-89, 1989.
4. Bodmer J., Marsh S., Albert E., Bodmer W., Bontrop R., Charron D., Dupont B., Erlich H., Mach B., Mayr W.,
Parham P., Sasazuki T., Schreuder G., Strominger J., Svejgaard A. and Terasaki P. Nomenclature for factors
of the HLA system, 1995. Human Immunology 43:149-164, 1995.
5. Terasaki, P.I. Histocompatibility Testing, 1980. UCLA Tissue Typing Laboratory, Los Angeles, California.
6. Savage, D.A., Bidwell, J.L., Cullen, C., Bidwell, E.A., and Middleton, D. Identification of HLA-DRw52
associated antigens using HLA class II allogenotyping. Tissue Antigens 32: 278-285, 1988.
7. Sutton, V.R., Kienzle, B.K., and Knowles, R.W. An altered splice site is found in the DRB4 gene that is not
expressed in HLA-DR7, Dw11 individuals. Immunogenetics 29: 317-322, 1989.
SSP-DNAT-PI-TR-00, Rev 19
Sayfa 8 / 11
JavaScript must be enabled to view this document. Please enable JavaScript and reopen the document.
One Lambda, Inc. | Ürün Prospektüsü: Micro SSP™ HLA DNA Tipleme Tepsileri
TİCARİ MARKALAR VE SORUMLULUK RETLERİ
SORUN GİDERME
Sorun
Bant yok veya
soluk bantlar
Olası Nedenleri
DNA
Kullanılan miktar yetersiz
Yeterince saf değil (A260/A280
1.65 - 1.80 arasında değil)
PCR inhibitörü mevcut (örn.
EDTA 0.5 mM’den fazla)
Çözümü
Testi tekrarlayın; Micro SSP™ Ürün
Referans Tablosu’nda verilen miktarı
kullanın.
DNA hazırlama işlemini tekrarlayın;
A260/A280’in 1.65 - 1.80 arasında
olduğunu kontrol edip ardından testi
tekrarlayın.
DNA hazırlama işlemini tekrarlayın;
DNA’yı EDTA < 0.5 mM solüsyon
içinde yeniden süspanse edip ardından
testi tekrarlayın.
Rekombinant Taq
polimeraz
Testi tekrarlayın; Micro SSP™ Ürün
Referans Tablosu’nda verilen miktarı
kullanın.
Kullanılan miktar yetersiz
Enzim bozulmuş
Testi tekrarlayın; taze bir tüp enzim
kullanın.
Sahte bantlar
EtBr
Kullanılan miktar yetersiz
0.5 g/ml’de EtBr ile tekrar 1 X TBE
yapın. Testi tekrarlayın.
Basınç Pedi
Basınç pedi aşınmış
Basınç pedini 300 PCR çalışmasından
sonra değiştirin.
DNA
Kullanılan miktar çok fazla
Yeterince saf değil (A260/A280
1.65 - 1.80 arasında değil)
Kontamine (diğer DNA veya
PCR ürünü)
Testi tekrarlayın; Micro SSP™ Ürün
Referans Tablosu’nda verilen miktarı
kullanın.
DNA hazırlama işlemini tekrarlayın;
A260/A280’in 1.65 - 1.80 arasında
olduğunu kontrol edip ardından testi
tekrarlayın.
DNA çıkartmak ve PCR için tüm
tamponlardan/reaktiflerden yeni
alikuotlar kullanın; DNA çıkartma
işlemini ve testi tekrarlayın.
Negatif kontrolde
bantlar
™
Rekombinant Taq
polimeraz
Kullanılan miktar çok fazla
Testi tekrarlayın; Micro SSP Ürün
Referans Tablosu’nda verilen miktarı
kullanın.
EtBr
Kullanılan miktar çok fazla
0.5 g/ml’de EtBr ile tekrar 1 X TBE
yapın. Testi tekrarlayın.
Reaktifler
Kontamine (diğer DNA veya
PCR ürünü)
DNA çıkartmak ve PCR için tüm
tamponlardan/reaktiflerden yeni
alikuotlar kullanın; DNA çıkartma
işlemini ve testi tekrarlayın.
Micro SSP™
GeneAmp
Fotodyne FOTO/UV21
FMC SeaKem
Applied Biosystems
SSP-DNAT-PI-TR-00, Rev 19
One Lambda Inc.
ARMS™
Applied Biosystems
FOTODYNE Incorporated
FMC Corporation
Rainin Instrument Co., Inc.
Gilson® ve Pipetman®
Veriti™
Zeneca Limited
Sayfa 9 / 11
JavaScript must be enabled to view this document. Please enable JavaScript and reopen the document.
One Lambda, Inc. | Ürün Prospektüsü: Micro SSP™ HLA DNA Tipleme Tepsileri
BU BELGEDE KULLANILAN PATENTLER
Lisanslı ürünü satın alana duyuru: Bu ürünün satış fiyatına, Roche Molecular Systems Inc. ve F.
Hoffmann-LaRoche Ltd (“Roche”) şirketlerine ait 4683202, 4683195 ve 4965188 numaralı ABD
Patentleri ve bunların diğer ülkelerdeki emsalleri altında sınırlı ve devredilemeyen haklar dahil olup;
sözü edilen haklar, sadece söz konusu patentlerde tarif edilen Polimeraz Zincir Reaksiyonu (“PCR”)
İşlemini uygulamak ve ürünün sadece bu miktarını, satın alanın sadece organ, kemik iliği veya doku
nakli HLA Tipleme uygulamalarında kullanması içindir ve adli delil analizini veya ebeveynlik tespitini
açıkça hariç bırakır. Bu ürünü, PCR kullanarak organ veya doku nakli amacıyla HLA Tiplemesine
uygulamak ve ticari hizmetler sunmak için, sonuçların satın alan tarafından ücret veya diğer bedel
karşılığında raporlanması dahil olmak üzere kullanma hakkı da işbu vesile ile verilmektedir. PCR
uygulamaları için lisans satın alma hakkında daha fazla bilgi, Amerika Birleşik Devletleri’nde “Director of
Licensing, Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501 ABD” ve
Amerika Birleşik Devletleri dışında “PCR Licensing Manager, F. Hoffmann-La Roche Ltd,
Grenzacherstr.124, CH-4070 Basel, İsviçre” ile temas kurularak temin edilebilir.
SSP teknolojisinin lisansı, Zeneca Limited şirketinin Blacklands Way, Abingdon Business Park,
Abingdon, Oxfordshire, İngiltere OX14 IDY adresinde faaliyet gösteren Zeneca Diagnostics firması
kanalıyla alınmış olup, Zeneca Corporation’a ait “Method of detecting nucleotide sequences (Nükleotid
sekanslarını saptama yöntemi)” başlıklı Avrupa Patent No. 0 332 435 B1, Amerika Birleşik Devletleri
Patent No. 5595890, Kanada Patent No. 1323592 ve dünya genelindeki em sal patentlerin ve patent
başvurularının kapsamı altındadır.
Micro SSP™ DNA tipleme reaktiflerinin üretim ve dağıtımı, One Lambda Inc., 21001 Kittridge Street,
Canoga Park, CA 91303, A.B.D. tarafından yapılmaktadır. Rekombinant Taq polimeraz, F. HoffmannLaRoche tarafından üretilir.
YETKİLİ AVRUPA TEMSİLCİSİ
MDSS GmbH, Schiffgraben 41, 30175, Hannover, Almanya
SEMBOLLERİN AÇIKLAMASI
Sembol
Tanım
Katalog numarası
İn vitro tanılama tıbbi cihazı
Kullanım talimatına başvurun
Dikkat, eşlik eden belgelere başvurun
Biyolojik riskler
Sıcaklık sınırlaması
CE İşareti
CE tıbbi kalite işareti
Üretici
Avrupa Topluluğu içindeki yetkili temsilci
SSP-DNAT-PI-TR-00, Rev 19
Sayfa 10 / 11
JavaScript must be enabled to view this document. Please enable JavaScript and reopen the document.
One Lambda, Inc. | Ürün Prospektüsü: Micro SSP™ HLA DNA Tipleme Tepsileri
REVİZYON TARİHÇESİ
Revizyon
Tarih
Revizyon Tanımı
17
2011/12
0197 ile birlikte dipnotu eklendi (0197 Sadece Annex II List B ürünleri için
geçerlidir). Annex II List B dahilinde olmayan ürünler için ek bir CE İşareti eklendi.
18
2012/11
Fusion Software opsiyon olarak eklendi. Üstbilgi değiştirildi.
2014/08
Önemli Not kısmından belge tanılayıcısı, MSSP_REF_TABLE.PI.DOC kaldırıldı;
Not içeriği REF kısmına götürüldü. IVD ve Dikkat sembolleri eklendi. Üretim
sembolü başlık kısmından kaldırıldı. Ayrıca, Ekipman Gereksinimi kısım A’ya
“veya eşdeğeri” eklendi. Güncel ürün prospektüsü şablonuna aktarıldı.
19
*0197 Sadece Annex II List B ürünleri için geçerlidir.
SSP-DNAT-PI-TR-00, Rev 19
Sayfa 11 / 11
Download

Micro SSP™ HLA DNA Tipleme Tepsileri