Total protein miktarının bilinmesi
şarttır:
protein
veriminin belirlenmesi
saflık kontrolu
deneylerin optimizasyonu
spesifik aktivite tayini ve saflaştırma
derecesinin belirlenmesi (enzimler için)
KULLANILAN YÖNTEMLER







Kjeldahl yöntemi (azot miktarının tayinine dayanır)
ZOR ,
Kızıl ötesi spektrometri
duyarlılığı
düşük,
Türbidimetri
Fluorimetri
hata payı
yüksek
Refraktometri
yöntemler
Polarografi
Amino asit analizine dayanarak (asit hidrolizden sonra
yapılır. Trp, Cys asit hidrolize duyarlı; Gln, Asn, asit forma dönüşür. Bunlar da hatalar
yol açar)
Son yıllarda en çok kullanılan
yöntemler:
UV ve GÖRÜNÜR ALANDA
ABSORBSİYONA DAYANAN
SPEKTROFOTOMETRİK
YÖNTEMLER
OPTİK ANALİZ YÖNTEMLERİ
HAKKINDA KISA BİLGİ:

ELEKTROMANYETİK IŞINLAR ile MADDE
arasındaki etkileşimden yararlanan yöntemlerdir.
ELEKTROMANYETİK IŞIN NE
DEMEKTİR?
Elektromanyetik Işın: Uzayda büyük
bir hızla ilerleyen bir enerji
İki önemli karakteri var:
1) Dalga karakteri: Uzayda sinüzoidal
(dalga hareketiyle) yayılan elektrik ve
manyetik vektörlere sahiptir. Madde ile
etkileşiminde elektrik vektörü rol oynar.

(lambda)
= c/
(nü)
= Dalga boyu
c= Işık hızı (3x1010 cm/sn)
 = frekans (birim zamanda belli bir
noktadan geçen dalga sayısı)
2) Tanecik karakteri: Bir ışın demeti çok
sayıda tanecikten oluşur. Enerjili bu
taneciklere FOTON denir.
E=hx
h= Planck sabiti (6.626 x 10-34 j.sn)
MADDE-IŞIN ETKİLEŞİMİ


Işının elektrik alanı ile maddenin bağ
elektronları arasında gerçekleşir
Maddenin yapısına göre değişir.
Madde ortamına giren ışın değişime uğrar:

Doğrultusu değişir
YANSIMA
(REFLECTION)
KIRILMA
(REFRACTION)

Başka demetlere ayrılır:
ÇİFTE KIRILMAYA
UĞRAR
(DOUBLE
REFRACTION)
KIRINIMA UĞRAR
(DIFFRACTION)
SAÇILIMA UĞRAR
(SCATTERING)
Kutuplaşma düzlemi değişir:
OPTİK ÇEVİRME


Kutuplaşma derecesi azalır:
DEPOLARİZASYON
Bu fiziksel değişimler
maddenin enerji
düzeylerinde herhangi bir
değişime yol açmaz.

Işının belli dalga boyları madde tarafından
ABSORBLANIR (SOĞURULUR, EMİLİR):
ABSORBSİYON
Bu enerji maddeyi (yani onu oluşturan atom veya
molekülleri) UYARILMIŞ (EKSİTE) hale geçirir.
X +
Düşük enerji
düzeyi (ground: G
ile de gösterilir)
h
X*
Yüksek enerji düzeyi
(uyarılmış durum: S1 ile de
gösterilir)
Tanecik eski haline dönerken bu enerji geri verilir:
X*
X +
ısı

Uyarılmış madde bir ışın yayabilir:
EMİSYON
X*
X
+ h
SPEKTROSKOPİK YÖNTEMLERİN TEMELİNDE
ABSORPSİYON VE EMİSYON YATMAKTADIR.
Bu olaylar enerji düzeyinde değişim yaratır.
OPTİK ANALİZ YÖNTEMLERİ
Spektroskopik Yöntemler
Spektroskopik Olmayan Yöntemler
TEMELİ: Enerji düzeyleri
arasındaki geçişler sonucu
ortaya çıkan SPEKTRUM
ölçülür.
TEMELİ: Işının YÖNÜNDEKİ veya
FİZİKSEL ÖZELLİKLERİNDEKİ
DEĞİŞİM ölçülür. Enerji düzeyleri
arasında geçişler olmasını
gerektirmez.
Spektroskopik Yöntemler
•Spektrofotometri (UV-Visible, IR, X ışını)
•Kolorimetri
•Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi
•NMR Spektroskopisi
ÖLÇÜLEN ÖZELLİK
IŞININ
ABSORPLANMASI
•ESR (Elektron Spin Rezonans)
Spektroskopisi
•(Kütle Spektrometrisi)
•Emisyon Spektroskopisi
•Atomik Emisyon Spektroskopisi
•Fluoresan Spektroskopisi
•Radyokimyasal Yöntemler
IŞININ
YAYILMASI
(EMİSYON)
Spektroskopik Olmayan Yöntemler
•Türbidimetri
•Nefelometri
ÖLÇÜLEN ÖZELLİK
IŞININ SAÇILMASI
•Raman Spektroskopisi
•Refraktometri
•İnterferometri
•X ışını Difraksiyonu
•Elektron Difraksiyonu
•Polarimetri
IŞININ
KIRILMASI
IŞININ KIRINIMA
UĞRAMASI
IŞININ KUTUPLANMA
ÖZELLİKLERİNİN
DEĞİŞİMİ
YÖNTEMİN ADI: SPEKTROFOTOMETRİ
ALETİN ADI: SPEKTROFOTOMETRE
Monokromatör: tek bir dalga
boyundaki ışının seçilmesi
için kullanılır
Döteryum (D2) lamba: UV ışık için
Tungsten (W) lamba: görünür ışık için kullanılır.
Spektrofotometrenin çalışma
prensibi:

Lamba tarafından yayılan ışın demeti monokromatör
(prizma) yardımıyla tek bir dalga boyundaki ışına
(monokromatik ışına) dönüştürülür.
Bu ışın örneğin içinde bulunduğu odaya girer. Ölçümü
yapılacak örnek, KÜVET içine konulur.
Görünür alanda çalışılıyorsa CAM (optik) KÜVET;
UV’de çalışılıyorsa KUVARTZ (silika) KÜVET kullanılır.


Örnekten geçen ışığın şiddeti detektör tarafından
algılanır ve kaydedici ya da yazıcıya elektrik sinyali
şeklinde gönderilir.
Double-beam (Çift ışınlı spektrofotometrelerde ışın
hem örnekten hem de kör örnekten (referans)
geçirilir.
UV-Visible Spektroskopisi ve
Lambert-Beer Yasası:
Moleküler Biyolojide UV ve görünür ışınlar
kullanılarak :
•Molekülün yapısı hakkında bilgi edinilebilir.
(özellikle UV alandaki absorpsiyon önemlidir.)
•Konsantrasyon (derişim) belirlenebilir
•Kimyasal reaksiyonun gidişi izlenebilir.
•Enzim aktivitesi ölçülebilir.
Tabakaya gelen
ışık
Tabakadan
çıkan ışık
Şiddeti: I0
Şiddeti: I
Homojen bir
absorplayıcı
ortam
Lambert yasası:

Homojen bir absorplayıcı ortamdan geçen
ışının şiddeti tabaka kalınlığının artması ile
üssel olarak azalır:
I = I0 x e-kd
I = geçen ışının şiddeti
I0= gelen ışının şiddeti
k = absorpsiyon katsayısı
d = tabakanın kalınlığı
Beer yasası:

Işının şiddeti içerisinden geçtiği maddenin
konsantrasyonuna bağlıdır.
I = I0 x e-kc
I = geçen ışının şiddeti
I0= gelen ışının şiddeti
k = absorpsiyon katsayısı
c = konsantrasyon
Bu iki yasanın birleştirilmesiyle :
I = I0 x e-kcd
I/I0 = e-kcd
ln I/I0 = -k x c x d
ln I0/I = k x c x d
I = geçen ışının şiddeti
I0= gelen ışının şiddeti
k = absorpsiyon katsayısı
c = konsantrasyon
d = ışık yolu
(sıvının içinde bulunduğu
küvetin genişliği)
kxcxd
log I0/I =
k/2.303=
2.303

(epsilon)
Maddenin
konsantrasyonu
Işık yolu (cm)
log I0/I =  x c x d = A (Absorbans)
veya E (Ekstinksiyon)
Absorpsiyon (veya Ekstinksiyon) katsayısı
Konsantrasyonun (c) birimi g/l olursa,
S, spesifik absorpsiyon katsayısı;
Konsantrasyonun (c) birimi mol/l olursa,
adını alır.
M, molar absorpsiyon katsayısı
Işık yolu (d) 1 cm olduğunda
A yerine OPTİK DANSİTE (O.D.)
terimi kullanılır.
Lambert-Beer yasasından sapmalar:
NEDENİ:
YÜKSEK KONSANTRASYON
YANLIŞ DALGA BOYU SEÇİMİ
Pozitif sapma
uygunluk
Optik dansite
Negatif sapma
Konsantrasyon
Spektrofotometrik ölçümler iki farklı
şekilde yapılabilir:


Belli bir dalga boyunda absorbans ölçülür.
Konsantrasyon veya absorbsiyon katsayısının
belirlenmesine yarar.
Belli bir dalga boyu aralığında absorbans
taraması yapılır. Böylece ABSORPSİYON
SPEKTURUMU elde edilir. Maddenin kimyasal
karakteri hakkında bilgi sağlar.
PROTEİNLERİN
KONSANTRASYONUNU
BELİRLEMEK İÇİN KULLANILAN
UV-VISIBLE YÖNTEMLER:
ÖLÇÜM
Protein çözeltisinin UV
absorbsiyonunun
ölçülmesi
Protein çözeltisinin bir
belirteçle reaksiyona
sokulup oluşan renkli
bileşiğin (kromofor)
görünür alanda ölçülmesi
A280/A260 Oranı
(Warburg – Christian Yöntemi
Tirozindeki fenolik gruplar ve triptofandaki indolik gruplar nedeniyle birçok protein 280
nm’de maksimum absorbsiyon gösterir. Bu özellikten yararlanılarak örnekteki protein
miktarının yaklaşık olarak bulunması için hızlı bir yöntem geliştirilmiştir. Çok duyarlı
olmamakla beraber (duyarlılık: 0.05-2.0 mg/ml), kolaylığı ve hızlı sonuç
vermesi nedeniyle çok kullanılan bir tekniktir. Ancak, 260 nm’de maksimum
absorbsiyon gösteren nükleik asitlerin 280 nm’de de absorbsiyon yetekleri olduğu
unutulmamalıdır. Bu nedenle nükleik asit artıkları ile kontamine durumdaki ilk kaba
ekstrelerle çalışıldığında hatalı sonuçlar elde edilebilir. Bunun önüne geçmek için,
Warburg ve Christian (1941) tarafından geliştirilmiş bir seri hata düzeltme faktörü
(Tablo 2 ) genel olarak tüm proteinler için kullanılmakta ve bu yöntemde ortaya
çıkabilecek hata payı daha aza indirgenebilmektedir.
Tablo 2. A280/A260 oranına bağlı olarak, örnekteki nükleik asit % si ve düzeltme faktörlerinin yaklaşık değerleri.
(1 cm ışık yolu için geçerli)
A280/A260 oranı
% Nükleik asit
Faktör
1.75
0.00
1.116
1.63
0.25
1.081
1.52
0.50
1.054
1.40
0.75
1.023
1.36
1.00
0.994
1.30
1.25
0.970
1.25
1.50
0.944
1.16
2.00
0.899
1.09
2.50
0.852
1.03
3.00
0.814
0.979
3.50
0.776
0.939
4.00
0.743
0.874
5.00
0.682
0.846
5.50
0.656
0.822
6.00
0.632
0.804
6.50
0.607
0.784
7.00
0.585
0.767
7.50
0.565
0.753
8.00
0.545
0.730
9.00
0.508
0.705
10.00
0.478
0.671
12.00
0.422
0.644
14.00
0.377
0.615
17.00
0.322
0.595
20.00
0.278
Protein konsantrasyonu (mg/ml) =
Faktör x A280
veya
Protein konsantrasyonu (mg/ml) =
1.5 x A280  0.75 x A260
Biüre Yöntemi

Duyarlılığı düşük (1-10 mg/ml) olmakla beraber,
pratikliği nedeniyle geniş çapta kullanılan bir
yöntemdir. Reaksiyonun esası Cu atomunun
peptid azotlarına bağlanması sonucu alkali
çözeltide 540 - 560 nm’de maksimum
absorbsiyon gösteren renkli bir kompleks
oluşumuna dayanır. Bakır atomlarının ana zincire
bağlanması nedeniyle amino asit içeriğinin
ölçümler üzerinde herhangi bir önemli etkisi
yoktur.
Boya-Bağlama
(Bradford Yöntemi)

Bu yöntem, “Coomassie Brilliant Blue G-250” boyasının farklı
konsantrasyonlardaki proteinlere bağlanarak, farklı renk
şiddetinde (koyulukta) çözeltiler ortaya koymasından
yararlanılarak geliştirilmiştir. Boyanın özellikle arjinin gibi bazik
amino asitlere ve bazı aromatik amino asitlere bağlanma
eğiliminde olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla bu yöntemde
proteinin primer yapısının önemi vardır. Duyarlılık sınırları, total
reaksiyon karışımında (5.1 ml) 20 - 140 g olan bu yöntemde (ki
bu da örnek konsantrasyonunun 0.2 - 1.4 mg/ml arasında
olması demektir) asidik boya proteine bağlanır ve 495-595 nm
arasında maksimum absorbsiyon değerleri elde edilir.
Lowry Yöntemi

Bu yöntem, fosfomolibdotungstik asit (Folin-Ciocalteau
Belirteci) çözeltisinin tirozin bakiyeleri ile reaksiyona
girerek mavi bir renk oluşturması esasına dayanır.
Reaksiyon, bakır ile protein arasında kompleks oluşumu
ile başlar, alkali çözeltide, oda temperatüründe 5-10
dakika içinde tamamlanır. Bakırın varlığı yöntemin
duyarlılığını 3-15 kat artırmaktadır, çünkü Cu ile yapılan
kompleks, Folin belirtecindeki Mo ve WO4 (wolframid)
ile birleşerek yeni bir kompleks ortaya koyar. Ancak
analiz edilen örnekteki fenolik maddeler hatalara yol
açabilir. Duyarlılık: 20-400 g/ml
Download

spektroskopi-1 (İndirme : 51)