Devyser Resolution 21 v2
Kat. No.: 8-A012.2-21
Devyser Resolution 18 v2
Kat. No.: 8-A012.2-18
Devyser Resolution 13 v2
Kat. No.: 8-A012.2-13
Devyser Resolution XY v2
Kat. No.: 8-A012.2-XY
For in vitro Diagnostic Use
Návod k použití
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 1 z 32
Obsah
Obsah
1. Seznámení se systémem Devyser Resolution v2
Použití
Obsah soupravy
Postup
Princip metody
2. Upozornění
3. Symboly použité na štítcích
4. Požadovaný materiál
4.1 Součástí kitu
Konfigurace
Složky Devyser Resolution 21 v2
Složky Devyser Resolution 18 v2
Složky Devyser Resolution 13 v2
Složky Devyser Resolution XY v2
4.2 Požadované položky, které nejsou v soupravě
Příprava reagencií
Extrakce DNA
Amplifikace
Detekce
Size Standard
4.3 Souprava pro barevnou kalibraci
5. Skladování a nakládání se soupravou
6. Požadavky na vzorek
Klinické vzorky
Postup a skladování
Kontroly
7. Návod k použití
7.1 Pracovní postup Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2
7.2 Příprava vzorků a amplifikace PCR
Extrakce DNA
Přidání vzorku
Amplifikace
7.3 Detekce
Příprava vzorků
Příprava vzorku pro kapilární elektroforézu
Příprava přístroje
Run Modules
8. Výsledky a analýza
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
2
4
4
4
4
4
6
7
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
9
9
9
9
10
11
11
11
11
12
12
12
12
12
13
14
14
14
14
14
16
Stránka 2 z 32
Principy QF-PCR
Marker pro X chromozóm
Nepolymorfní markery
Pseudoautozomální XY markery
Přehled markerů Devyser Resolution v2
Přehled markerů Devyser Resolution 18 v2
Přehled markerů Devyser Resolution 13 v2
Přehled markerů Devyser Resolution XY v2
Provádění analýzy
Poměrová kritéria (Ratio Criteria – RC)
Markery se dvěma píky
Markery se třemi píky
Výškový poměr
Interpretace výsledků
Troubleshooting
Artefakty PCR
Elektroforetické artefakty
9. Klinická studie
Devyser Resolution v2 (8-A012.2)
Sensitivita
Specificita
Opakovatelnost
10. Limitace použití
11. Reference
12. Upozornění zákazníkům
13. Kontaktní informace
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
16
18
19
19
20
20
21
21
22
22
22
22
22
22
23
24
25
27
27
27
27
28
29
30
31
32
Stránka 3 z 32
1. Seznámení se systémem Devyser Resolution v2
Použití
Souprava Devyser Resolution v2 je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu aneuploidií
chromozomů 21.
Souprava Devyser Resolution 18 v2 je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu aneuploidií
chromozomů 18.
Souprava Devyser Resolution 13 v2 je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu aneuploidií
chromozomů 13.
Souprava Devyser Resolution XY v2 je in vitro diagnostický produkt pro diagnózu aneuploidií
chromozomů X a Y.
Obsah soupravy
Souprava Devyser Resolution v2 obsahuje reagencie připravené k použití pro PCR amplifikace
genetických markerů.
Postup
DNA extrakce: Souprava Devyser Resolution v2 byla validována s použitím QIAamp DNA Blood
Mini Kit (Qiagen, kat. č. 51104) pro extrakci DNA z lidské krve a amniotické tekutiny; QIAamp
DNA Mini Kit (Qiagen, kat. č. 51304) pro extrakci DNA z biopsií choriových klků.
Amplifikace: Souprava Devyser Resolution v2 byla validována s využitím PCR cycleru ABI
GeneAmp® System 9700.
Detekce: Genetické analyzátory Applied Biosystems (ABI 310, 3100, 3130, 3500, 3730) a
MegaBACE podporující detekci Dye-Set DEV-5.
Princip metody
Kvantitativní fluorescenční PCR (QF-PCR) zahrnující amplifikaci, detekci a analýzu krátkých
opakujících se sekvencí (STR) a konzervativních sekvencí. Pro amplifikaci chromozom
specifických sekvencí se používají fluorescenčně značené primery, takže počet kopií každé
sekvence odpovídá počtu příslušných chromozomů.
Vzniklé PCR produkty jsou separovány a analyzovány pomocí automatického genetického
analyzátoru. Relativní množství každé alely je kvantifikováno pomocí výpočtu poměru obsahu
píků, příp. jejich výšek. Normální diploidní vzorek obsahuje příspěvek obou somatických
chromozomů. Dvě alely chromozom specifické STR sekvence jsou detekovány jako dva píky v
poměru 1:1, pokud je marker heterozygotní a jako jeden pík, pokud je marker homozygotní.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 4 z 32
Detekce další alely prostřednictvím tří píků v poměru 1:1:1 nebo jako dva píky v poměru 2:1
resp. 1:2 znamená přítomnost další STR sekvence, která může znamenat přítomnost dalšího
chromozomu, jako je tomu u trizomie.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 5 z 32
2. Upozornění
A.
Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2 sady byly ověřeny pomocí PCR celkový reakční objem 25
µl.Změna reakčního objemu může vést k nesprávným výsledkům.
B.
Předejděte mikrobiální kontaminaci při vyjímání alikvotů z reakčních zkumavek. Doporučujeme
používat špičky s filtry.
C.
Nemíchejte reagencie z různých šarží ani z různých zkumavek stejné šarže.
D.
Nepoužívejte soupravu s prošlou záruční lhůtou.
E.
Nepoužívejte otevřené nebo poškozené reagenční zkumavky.
F.
Práce v laboratoři má postupovat jedním směrem. Začíná přípravou reagencií, postupující do
prostoru pro extrakci DNA, do prostoru pro amplifikaci DNA a nakonec do prostoru pro
detekci.Příprava reagencií a extrakce DNA provádějte v oddělených prostorách. Přístroje i
spotřební materiál má být lokalizován pouze v příslušném prostoru a nesmí se přenášet mezi
těmito oddělenými prostory. V příslušném prostoru používejte rukavice a při jeho opouštění je
vyměňte za nové.Přístroje ani spotřební materiál pro přípravu reagencií nepoužívejte pro
extrakci DNA. Přístroje a spotřební materiál pro amplifikaci a detekci nepřenášejte mimo tyto
prostory. Přístroje ani spotřební materiál pro přípravu reagencií nepoužívejte pro extrakci DNA.
Přístroje a spotřební materiál pro amplifikaci a detekci nepřenášejte mimo tyto prostory.
G.
Nakládání s reagenciemi a vzorky, jejich použití, skladování a likvidace musí splňovat požadavky
ČSN pro nakládání s biohazardním materiálem.
H.
Při práci se vzorky a reagenciemi soupravy používejte nepudrované rukavice, laboratorní plášť
a ochranu očí. Po skončení práce se vzorky a reagenciemi si řádně omyjte ruce.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 6 z 32
3. Symboly použité na štítcích
Šarže
Exspirace
Výrobce
Počet testů
In vitro diagnostický medicínský prostředek
Skladujte při teplotě nižší nebo rovné
Katalogové číslo
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 7 z 32
4. Požadovaný materiál
4.1 Součástí kitu
Konfigurace
Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2 sady obsahují reagencie pro analýzu 25 vzorků každého.
Složky Devyser Resolution 21 v2
Barva víčka
Oranžová
Žlutá
Barva Zkumavky
Čirá
Hnědavá
Štítek
PCR Activator
Resolution 21 v2
Katal.č.
4-A018
4-A180
Obsah soupravy
1
1
Štítek
PCR Activator
Resolution 18 v2
Katal.č.
4-A018
4-A179
Obsah soupravy
1
1
Štítek
PCR Activator
Resolution 13 v2
Katal.č.
4-A018
4-A178
Obsah soupravy
1
1
Štítek
PCR Activator
Resolution XY v2
Katal.č.
4-A018
4-A181
Obsah soupravy
1
1
Složky Devyser Resolution 18 v2
Barva víčka
Oranžová
Bílá
Barva Zkumavky
Čirá
Hnědavá
Složky Devyser Resolution 13 v2
Barva víčka
Oranžová
Oranžová
Barva Zkumavky
Čirá
Hnědavá
Složky Devyser Resolution XY v2
Barva víčka
Oranžová
Red
Barva Zkumavky
Čirá
Hnědavá
4.2 Požadované položky, které nejsou v soupravě
Příprava reagencií
· Plast pro termocykler
· Pipeta /multikanálová pipeta/ nebo dispenzor a špičky s filtry.
· Nepudrované chirurgické rukavice
Extrakce DNA
· Reagencie a přístroje dle požadavků výrobce extrakční soupravy.
· Pipeta nebo dispenzor a špičky s filtry.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 8 z 32
Amplifikace
· Thermocycler: ABI GeneAmp® PCR System 9700 v módu 9600.Pro použití jiných PCR
thermocyclerů je nutno použít ramping: ohřev 0,8°C/s, chlazení 1,6°C/s.
· Pipeta /multikanálová pipeta/ nebo dispenzor a špičky s filtry.
Detekce
· Applied Biosystems Genetic Analyzer (ABI 310, 3100, 3130, 3500, 3730)
· Metodika je validovaná na polymerech: POP-4 a POP-7
· Hi-Di Formamide, čistota pro genetickou analýzu
· 1x Genetic Analyzer Buffer
· Pipeta /multikanálová pipeta/ nebo dispenzor a špičky s filtry.
Size Standard
560 SIZER ORANGE (Devyser cat.# 8-A402) nebo GeneScan™ 600 LIZ® Size Standard (Life
Technologies cat.# 4366589)
4.3 Souprava pro barevnou kalibraci
ABI 3100, 3130, 3730: Použijte kit DEV-5 Dye Set MultiCap kit (Devyser cat# 8-A401) jako
“Any5Dye” dye set.
ABI 3500: Použijte DEV-5 Dye Set MultiCap kit (Devyser cat# 8-A401) a vytvořte DEV-5 dye set.
ABI 310 Matrix file generation: Použijte DEV-5 Dye Set SingleCap kit (Devyser cat# 8-A400).
Zvolte soubor modulu “GS STR POP4 (1 mL) G5.md5”
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 9 z 32
5. Skladování a nakládání se soupravou
A.
Skladujte všechny komponenty při maximální teplotě -18 °C.
B.
Smíchané reakční mixy (připravené přidáním Resolution 21, 18, 13 a XY v2 Mix do PCR
Activator) je možné skladovat při +2 to +8 °C po dobu 7 dní nebo při méně než -18 °C po dobu
90 dní. Vyhněte se opakovanému rozmrazování a zmrazování.
C.
Likvidace zbytků reagencií musí být v souladu s legislativou ČR.
D.
Nemíchejte reagencie z různých šarží.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 10 z 32
6. Požadavky na vzorek
Klinické vzorky
Souprava Devyser Resolution v2 je určena pro použití s lidskou genomovou DNA izolované z plné
krve, amniové tekutiny a choriové tkáně.
Postup a skladování
Dle pokynů výrobce.
Kontroly
Je doporučeno používat vhodné kontroly v každém runu jako například zdravou DNA a negativní
kontrolu (bez DNA).
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 11 z 32
7. Návod k použití
7.1 Pracovní postup Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2
Smíchané master mixy (Mix + activator) je vhodné připravit před použitím a celý process
dokončit v jednom dni. Pouze pokud extrahujete vzorky předchozí den, připravte master mixy
den následující.
Aktivované reakční směsi se připraví přidáním každého z rezoluce 21, 18, 13 a XY v2 směsi
oddělit zkumavky PCR aktivátoru.
Devyser Resolution v2 byl validován při použití celkového amplifikačního objemu 25 µL. Změna
reakčního objemu může vést k nesprávným výsledkům.
Ujistěte se, že je Resolution Mix kompletně rozmražen.
1. Stočte krátce každou zkumavku. V tomto kroku zkumavky nevortexujte.
2. Přidat 500 ul každého z Resolution v2 směsi na samostatné trubky PCR Activator.
3. Opatrně promíchejte reakční master mix několikerým nasátím pipetou od spodu
zkumavky.
4. Vortexujte reakční master mix a lehce centrifugujte.
5. Napipetujte 20 µL smíchaného master mixu do PCR zkumavek.
6. Uzavřete zkumavky a krátce je stočte.
7. Pokračujte ke kroku 7.2
Smíchaný reakční master mix je stabilní při +2-8 °C po dobu 7 dní a při méně než -18 °C po dobu
90 dní. Vyhněte se opakovanému rozmrazování a zmrazování.
7.2 Příprava vzorků a amplifikace PCR
Extrakce DNA
Dle pokynů výrobce.
Pokud chcete použít jinou izolační soupravu pro diagnostické účely, musíte tento izolační postup
nejprve validovat v kombinaci se Soupravou Devyser Resolution 21, 18, 13 a XY v2.Doporučená
koncentrace DNA pro analýzu soupravou Devyser Complete v2 je 2 až 30 ng/PCR reakci(0,4- 6
ng genomové DNA/µL vzorku).
Přidání vzorku
Vzorky a kontroly by měl být přidán na vyhrazeném místě odděleném od přípravy reagencie,
amplifikační a detekční oblasti.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 12 z 32
1. Přidejte 5 µL vzorku (0,4 - 6 ng genomové DNA/µL vzorek) do každé PCR zkumavky se
smíchaným reakčním master mixem(z kroku 7.1)
2. Zkumavky uzavřete a krátce stočte.
Amplifikace
Nejméně 30 minut před amplifikací zapněte termocykler.
Pro ABI GeneAmp® System 9700 nastavte “ramp speed” na “9600 mode”.
Pro použití jiných PCR termocyklerů použijte tento ramping: ohřev 0,8 °C/s, chlazení 1,6 °C/s.
Amplifikační prostor:
Naprogramujte termocykler pro amplifikaci dle následujícího teplotního profilu (přečtěte si
manuál pro podrobné informace o programování termocykleru):
95 °C 15 min
94 °C 30 sec; 58 °C 1 min 30 sec; 72 °C 1 min 30 sec for 27 cycles
72 °C 30 min
4 °C FOREVER
1. Nastavte reakční objem 25 µL.
2. Spusťte amplifikaci (délka cca 3 hodiny).
3. Po amplifikaci vyjměte zkumavky s amplifikační reakcí z termocykleru, vložte je do
stojánku a stočte. Odstředivka krátce sbírat obsah. Opatrně sejměte víčka, abyste
zabránili kontaminaci aerosolem.Amplifikovaný materiál nepřenášejte do
předamplifikačních prostor. Amplifikovaný materiál musí zůstat v amplifikačním a
detekčním prostoru.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 13 z 32
7.3 Detekce
Příprava vzorků
Řiďte se manuály pro příslušný analyzátor ABI ohledně údržby a nastavení přístroje. Před
spuštěním analýzy soupravou Devyser Resolution v2, přístroj musí být kalibrován na dye set
DEV-5.Detaily v sekci 4.3.
Příprava vzorku pro kapilární elektroforézu
1. Připravte nanášecí směs smícháním 2 µL velikostního standardu (560 SIZER ORANGE) s
100 µL Hi-DiTM Formamidu (směs stačí pro 6 jamek/zkumavek).
2. Vortexujte 15 s.
3. Do jamek mikrotitrační destičky (nebo do jednotlivých zkukmavek v případě ABI310)
napipetujte po 15 μl nanášecí směsi před vložením do analyzátoru.
4. Přidejte 1,5 µl PCR amplifikátu vzorku do příslušné jamky/zkumavky s ELFO nanášecí
směsí.
5. Uzavřete destičku/zkumavky.
Příprava přístroje
Připravte si pracovní protokol s využitím software analyzátoru s následujícím nastavením:
l
l
l
Sample ID
Dye Set: Any5Dye/DEV-5
Doporučený run Module: Viz níže pro jednotlivé polymery a přístroje.
Run Modules
Množství PCR produktu nasátého do kapiláry může být upraveno změnou injekčního napětí a
injekční doby.
ABI 310(Běh s modulem souboru "GS STR POP4 (1 ml) G5.md5")
Run Parameters
POP-4
Capillary length
47 cm
Run temperature
60 ˚C
Injection voltage
15 kV
Injection time
5 - 15 s
Run voltage
15 kV
Run time
40 min
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 14 z 32
ABI 3100/3130
Run Parameters
Capillary length
Run temperature
Injection voltage
Injection time
Run voltage
Run time
POP-4/POP-7
36 cm
60 ˚C
1,5 kV
20 s
15 kV
1500 s
ABI 3500
Run Parameters
Capillary length
Run temperature
Injection voltage
Injection time
Run voltage
Run time
POP-7
50 cm
60 ˚C
1,6 kV
15 s
19,5 kV
1500 s
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 15 z 32
8. Výsledky a analýza
Doporučené postupy pro diagnostiku aneuploidií pomocí QF-PCR byly stanoveny sdružením
Clinical Molecular Genetics Society (UK) a Association for Clinical Cytogenetics (UK) a jsou
dostupné na: http://www.cmgs.org.uk
Principy QF-PCR
Chromozom–specifické krátké opakované DNA sekvence (small tandem repeats – STR) jsou
amplifikovány PCR. Vizualizací fluorescenčně značených primerů můžeme kvantifikovat PCR
produkty. Kvantifikace se provádí výpočtem plochy píku příslušné STR pomocí automatického
DNA sekvenátoru. STR se liší mezi jedinci velikostí, podle toho, kolikrát se opakují čtveřice
nukleotidů v každé alele. DNA amplifikovaná z normálního heterozygotního jedince (má alely s
různou velikostí) pro specifickou STR sekvenci bude mít dva píky s odlišnou délkou v daném
rozsahu (viz obr. 8.1).STR marker, které jsou heterozygotní jsou považovány za informativní.
Obr. 8.1. Heterozygotní marker (poměr ploch 1:1)
DNA amplifikované z trizomických jedinců vykáže buď další pík (tři různé alely) se stejnou
plochou (obr 8.2), nebo jen dva píky (dvě různé alely), z nichž jeden má dvojnásobnou plochu
než druhý pík (viz obr. 8.3.).
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 16 z 32
Obr. 8.2. Trizomický marker (poměr ploch 1:1:1)
Obr. 8.3. Trizomický marker (poměr ploch 2:1 a 1:2)
Přítomnost jen jednohu píku znamená homozygozitu (všechny alely mají stejnou délku) a jsou
považovány za neinformativní. Jedinci, kteří jsou homozygotní nebo monosomický pro specifický
STR marker mají jen jeden pík (obr. 8.4.).
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 17 z 32
Obr. 8.4. Homozygotní/monozomní marker
Marker pro X chromozóm
Markery T1 a T3 jsou nepolymorfní marker chromozómu X a mohou být použity pro určení
počtu chromozómů X u monozomií chromozomu X. Markery X chromozómu jsou v sekvencích
na chromozómu X a na autozomálních chromozómech amplifikovaných stejnou sadou primerů.
Amplifikované markery jsou separovány podle délky.
Markery X chromozómu jsou v sekvencích na chromozómu X a na autozomálních
chromozómech amplifikovaných stejnou sadou primerů. Amplifikované markery jsou
separovány podle délky. U zdravé ženy je poměr markerů 1:1
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 18 z 32
Obrázek 8.5. Markery T1, T2 a T3 u zdravé ženy (poměr 1:1).
Obrázek 8.6. Markery T1, T2 a T3 u muž ženy.
Nepolymorfní markery
Markery AMELXY a SRY jsou umístěny v nepolymorfních sekvencích na chromozómu X (AMELX)
a chromozómu Y (AMELY a SRY) a jsou použity pro detekci přítomnosti Y chromozómu. AMELXY
může být použit k určení relativního počtu chromozómů X a Y.
Pseudoautozomální XY markery
Markery XY2 a XY3 jsou polymorfní STR marker jsou umístěny na obou X a Y chromozómech.
Marker ZFYX je ne-polymorfní marker (není to STR marker), který je přítomen na obou
chromozómech X i Y.
Tyto markery, pokud jsou informativní, mohou být použity pro určení celkového počtu
pohlavních chromozómů.Není možné určit, která alela je na X nebo na Y chromozómu.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 19 z 32
Přehled markerů Devyser Resolution v2
ID
Pozice1
Markeru
Velikost markeru (bp)2
21A
21B
21C
21D
21H
21I
21J
21K
21M
21q21.3
21q21.1
21q22.3
21q22.13
21q21.3
21q21.1
21q22.2
21q21.2
21q22.11
D21S1435
D21S11
D21S1411
D21S1444
D21S1442
D21S1437
D21S2055
D21S1409
D21S1280
150 - 208
215 - 290
245 - 345
440 - 495
362 - 420
105 - 152
385 - 488
160 - 220
290 - 390
Barva
fluoroforu
Modrá
Modrá
Žlutá
Žlutá
Red
Žlutá
Modrá
Zelená
Zelená
1. UCSC
2. Na základě získaných velikostí markerůna přístroji ABI3130, POP-7 polymer a 560 SIZER ORANGE.Vezměte,
prosím, na vědomí, že velikost markerůse může lišit v závislosti na použitém přístroji, typu polymeru a size markeru
během elektroforézy.
Přehled markerů Devyser Resolution 18 v2
ID
Pozice1
Markeru
Velikost markeru (bp)2
18A
18B
18C
18D
18G
18I
18J
18M
18P
18p11.31
18q12.3
18q12.3
18q22.1
18q11.2
18q21.31
18p11.31
18p11.32
18q22.1
D18S391
D18S978
D18S535
D18S386
D18S1002
D18S858
D18S976
GATA178F11
D18S1364
190 - 230
195 - 230
300 - 350
338 - 430
325 - 380
360 - 418
440 - 495
347 - 410
130 - 205
Barva
fluoroforu
Modrá
Žlutá
Žlutá
Zelená
Modrá
Žlutá
Žlutá
Red
Zelená
1. UCSC
2. Na základě získaných velikostí markerůna přístroji ABI3130, POP-7 polymer a 560 SIZER ORANGE.Vezměte,
prosím, na vědomí, že velikost markerůse může lišit v závislosti na použitém přístroji, typu polymeru a size markeru
během elektroforézy.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 20 z 32
Přehled markerů Devyser Resolution 13 v2
ID
Pozice1
Markeru
Velikost markeru (bp)2
13A
13B
13C
13D
13E
13F
13G
13I
13K
13q12.12
13q21.32 - q21.33
13q31.3
13q13.3
13q22.1
13q12.2
13q14.11
13q.31.1
13q21.1
D13S742
D13S634
D13S628
D13S305
D13S800
D13S252
D13S325
D13S317
D13S1492
224 - 334
365 - 435
420 - 475
435 - 505
180 - 230
255 - 320
312 - 417
155 - 212
100 - 175
Barva
fluoroforu
Zelená
Modrá
Žlutá
Zelená
Žlutá
Modrá
Žlutá
Zelená
červený
1. UCSC
2. Na základě získaných velikostí markerůna přístroji ABI3130, POP-7 polymer a 560 SIZER ORANGE.Vezměte,
prosím, na vědomí, že velikost markerůse může lišit v závislosti na použitém přístroji, typu polymeru a size markeru
během elektroforézy.
Přehled markerů Devyser Resolution XY v2
ID
Pozice1
Markeru
AMELXY
SRY
ZFYX
sY625
T1
T2
T3
X1
X2
X3
X4
X5
X8
X9
X10
XY2
XY3
Xp22.2 / Yp11.2
Yp11.31
Yp11.31 / Xp22.11
Yq11.21
7q34 / Xq13
Xq23 / 2p23.3
3p24.2 / Xq21.1
Xq26.2
Xq13.1
Xq26.2-26.3
Xq21.33
Xq25 - 26.1
Xq21.31
Xq27.1-q27.2
Xp22.32
Xq21.31 / Yp11.31
Xp22.33 / Yp11.32
AMELX / AMELY
SRY
ZFY / ZFX
sY625
DXS1187
DXS981
XHPRT
DXS6809
DXS6854
DXS6803
DXS2390
DXS6807
DXYS267
DXYS218
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Barva
fluoroforu
X = 104, Y = 110 (+/- 2bp)
Zelená
235 (+/- 2bp)
Modrá
156 -167
Žlutá
254 (+/- 2bp)
Zelená
7 = 180 / X = 200 (+/- 2 bp)
Zelená
X= 118 / 2 = 121 (+/- 2 bp)
Žlutá
3 = 137 X = 141 (+/- 2bp)
červený
120 - 172
Zelená
262 - 300
Zelená
265 - 308
Žlutá
292 - 342
Modrá
392 - 430
Zelená
100 - 140
Modrá
312 - 357
červený
242 - 286
Modrá
175 - 217
Modrá
215 - 260
červený
Velikost markeru (bp)2
Stránka 21 z 32
1. UCSC
2. Na základě získaných velikostí markerůna přístroji ABI3130, POP-7 polymer a 560 SIZER ORANGE.Vezměte,
prosím, na vědomí, že velikost markerůse může lišit v závislosti na použitém přístroji, typu polymeru a size markeru
během elektroforézy.
Provádění analýzy
Při provádění manuální analýzy identifikujete píky markerů v elektroforetogramu podle
specifických velikostních rozpětí markerů uvedených v seznamu markerů. Vezměte, prosím, na
vědomí, že velikost markerůse může lišit v závislosti na použitém přístroji, typu polymeru a size
markeru během elektroforézy. Analýza heterozygótních marker s dvěma píky se provádí
kalkulací poměru pík1/pík2. Pík1 je plocha píku kratšího fragmentu, pík2 je plocha píku delšího
fragmentu. Viz níže – poměrová kritéria pro interpretaci.
Pro marker se třemi píky se poměr počítá z plochy od nejmenšího píku, tj. pík1/pík2/pík3.
Homozygotní markery se označují jako neinformativní.
Poměrová kritéria (Ratio Criteria – RC)
RC 1 je použit pro píky se vzdáleností <24bp
RC 2 je použit pro píky se vzdáleností ˃24bp
Poměr alel se nesmí kalkulovat v případě, že je vzdálenost/rozdíl mezi alelalmi vyšší než 40 bp,
protože v tomto případě mohlo dojít k preferenční amplifikaci, která může ovlivnit poměry alel.
Markery se dvěma píky
Ratio
RC 1
RC 2
1:2
<0,65
<0,65
Neprůkazný
0,65-0,74
0,65-0,74
1:1
0,75-1,44
0,75-1,54
Neprůkazný
1,45-1,75
1,55-1,75
2:1
>1,75
>1,75
Markery se třemi píky
Poměr
RC 1
RC 2
Neprůkazný
<0,74
<0,74
1:1:1
0,75-1,44
0,75-1,54
Neprůkazný
>1,45
>1,55
Výškový poměr
Výškový poměr lze použít, když je poměr ploch hodnocen jako "inconclusive" (neprůkazný).
Použijí se stejná poměrová kritéria, jako pro výpočet poměrů ploch.
Interpretace výsledků
K interpretaci výsledku jako normálního pro chromozóm je nutné mít minimálně dva
informativní markery daného chromozómu a ostatní markery musí být neinformativní.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 22 z 32
K interpertaci výsledku jako abnormálního pro chromozóm je nutné mít minimálně dva markery
informativní jako abnormální a ostatní markery musí být neinformativní.
Normální alelický pattern: Markerů se dvěma píky obdobné plochy/výšky, jejichž poměr je
hodnocen 1:1.
Abnormaníl alelický pattern:
a) Markerů se dvěma píky odlišné plochy/výšky, jejichž poměr je hodnocen 2:1 nebo 1:2.
b) Markery se třemi píky se stejnými nebo podobnými poměry výšky/plochy, jejichž poměr je
hodnocen 1:1:1
Monosomy X pattern is determined by:
a) All X and XY markers showing homozygous allelic pattern.
b) Pokud píky AMELY a SRY nejsou detekovány.
c) Marker T1 ukazuje 2 píky s odlišnou plochou/výškou, kde je poměr píků hodnocen jako 2:1.
d) Marker T2 ukazuje 2 píky s odlišnou plochou/výškou, kde je poměr píků hodnocen jako 1:2.
e) Marker T3 showing two peaks of differing height/area and the peak ratio is classified as 2:1.
Můžou se objevit píky markerů s délkou mimo dané rozpětí, tyto v rámci systému Devyser
Resolution v2 nehodnotíme.
Poměr alel se nesmí kalkulovat v případě, že je vzdálenost/rozdíl mezi alelalmi vyšší než 40 bp,
protože v tomto případě mohlo dojít k preferenční amplifikaci, která může ovlivnit poměry alel.
Troubleshooting
Pokud marker vykáže neprůkazné výsledky, nebo není detekován, může to mít řadu příčin:
» Chromozomální mosaicismus
» Copy number variation (CNV)
» Microvarianty způsobené specifickými opakováními mutací
» Částečná chromozomální trizomie
» Stutter pík převyšuje, nebo překrývá specifický alelický pík.
» Překryv barevného signálu mezi kanály
» Elektroforetické spiky
» Asymetrická amplifikace
» Kontaminace DNA: druhý genotyp, PCR amplikony
» Polymorfismus v oblasti nasedání primeru
» Somatická microsatelitní mutace
» DNA koncentrace je příliš vysoká, nebo příliš nízká.
» DNA použitá v PCR je degradovaná.
» Submicroskopická duplikace/delece některého z markerů
» Velikost alela je rozdíl větší než 40 bp způsobuje šikmé poměry alel.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 23 z 32
Ve výjimečných případech byla zjištěna chyba amplifikace sekvence AMELY kvůli mutaci v místě
nasedání primeru.
Ve vyjímečných případech byla zjištěna chyba amplifikace sekvence marker T1 kvůli poměr
zkreslen kvůli mutaci v místě nasedání primeru.
Pokud je získán normální I abnormální výsledek pro jeden chromozóm, je doporučeno použít
jinou metodiku pro určení příčiny chyby.
Počet variací (CNVs) byl pozorován u markerů 13A, 13B, 13C, 13D, 18B, 18C, 18D-1, 18D-2, 21B,
21C, 21G, X2, X3, XY3, AMELXY, ZFYX a T1.
Pokud je elektroferogram nízké kvality, data není možné vyhodnotit.PCR produkt můžeme
opakovaně nanést do analyzátoru a analyzovat znovu.
Artefakty PCR
Stutter píky (obr. 8.7) jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jednu nebo několik
repetic menší, než aktuální STR alela. Stutter píky můžeme zahrnout do výpočku
poměrů.Typický stutter pík má obsah menší, než 15% vůči příslušnému STR píku.
Obr. 8.7. Stutter pík je označen šipkou.
-A píky (obr. 8.8) jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jeden pár bazí kratší, než
PCR produkt s plnou délkou (+A pík). –A píky můžeme zahrnout do výpočku poměrů.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 24 z 32
Obr. 8.8. –A a +A píky jsou vyznačeny šipkami.
Elektroforetické artefakty
Během detekce může dojít k přesahu signálu mezi jednotlivými detekčními kanály (Obr 8.9).
Crosstalk se jeví jako stejně vysoké vrcholy v sousedních barevných kanálech a měla by být
vyloučena z analýzy.
Obr 8.9. Pík přesahující ze green do blue kanálu je označen šipkou.
Dye blobs se mohou objevit v rozsahu analýzy (obr. 8.10). Obecně platí, že barva dye blobs se
objeví jako široký pík bez definovaného vrcholu jedné barvy a vyskytují se v datech relativně
brzy na začátku.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 25 z 32
Obr 8.10. Dye blob je označen šipkou.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 26 z 32
9. Klinická studie
Pro testování kitu Devyser Resolution v2 bylo analyzováno 257 vzorků. Všechny výsledky analýzy
kitem Devyser Resolution v2 byly porovnány s daty z karyotypování nebo QF-PCR analýzy.
Z analyzovaných 257 vzorků bylo 225 normálních/zdravých a 30 mělo aneuploidii alespoň u
jednoho z testovaných chromozomů.
255 vzorků mělo analyzovatelný výsledek a všechny se plně shodovaly s výsledky karyotypování.
Tabulka 1. Výsledky testování 276 vzorků.
Výsledek
Normální
Trisomie 13
Trisomie 18
Trisomie 21
Triploid
45, X
47, XXY
47, XYY
48, XXXX
Výrazná kontaminace mateřskými buňkami
Kontaminace dalších genotypem
Neinformativní
Celkem
Devyser Resolution v2
225
2
5
8
6
3
4
1
1
1
1
0
257
Předchozí testování*
225
2
5
8
6
3
4
1
1
1
1
0
257
*) karyotypování a/nebo QF-PCR analýza
Devyser Resolution v2 (8-A012.2)
Sensitivita
Definice: Podíl (%) pacientů s dobře definovanou chromozomální aberací ve zkušební hodnotě v
rámci definované rozhodovací meze.
Výsledek: >97% sensitivita
Specificita
Definice: Podíl (%) pacientů bez dobře definované chromozomální aberací a jejichž výsledky
byly negativní ve zkušební hodnotě v rámci definované rozhodovací meze.
Výsledek: >99% specifita
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 27 z 32
Opakovatelnost
Definice: Stupeň (%) shody mezi měřeními provedenými na stejných vzorcích za rozdílních
měnících se podmínek.
Experimentální design: Normalní mužský vzorek (46, XY) byl amplifikován 102-krát při šesti
různých podmínkách a prováděných různými operatory na různých PCR cyclerech a genetických
analyzátorech. Všech 102 replikátů vyšlo stejně.
Výsledek: >99% opakovatelnost
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 28 z 32
10. Limitace použití
A.
Používat tento product smí jen osoba vyškolená v technikách PCR a kapilární elektroforézy.
B.
Souprava Devyser Resolution v2 byla validována na použití s termocycylerem ABI Thermal
Cycler GeneAmp® 9700. Pokud chcete pro klinickou diagnostiku použít jiný termocykler, je
nutná validace soupravy Devyser Resolution v2 pro tento cykler.
C.
Souprava Devyser Resolution v2 je validována s izolačními soupravami QIAamp DNA Blood Mini
Kit pro extrakci DNA z plné lidské krve a amniotické tekutiny; QIAamp DNA Mini Kit pro extrakci
DNA z biopsií choriových klků.Analýza s dalšími matricemi a izolačními soupravami nebyla
validována a může způsobit falešně negativní nebo falešně pozitivní výsledky.
D.
Souprava Devyser Resolution v2 je určena pouze pro detekci specifických chromozomálních
aneuploidií dle návodu k použití. Souprava nebyla testována pro detekci strukturálních změn,
mozaiky ani abnormalit v jiných, než uvedených chromozomech. Výsledky obdržené použitím
soupravy Devyser Resolution v2 mohou být aplikovány pouze na tkáně nebo specifické vzorky.
Kontaminace mateřskými buňkami neo u placentálního masaicismu může způsobit
nesrovnalosti mezi výsledky získanými soupravou Devyser Resolution v2 a jinými technikami.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 29 z 32
11. Reference
PROFESSIONAL GUIDELINES FOR CLINICAL CYTOGENETICS AND CLINICAL MOLECULAR
GENETICS. QF-PCR FOR THE DIAGNOSIS OF ANEUPLOIDY BEST PRACTICE GUIDELINES (2012),
v3.01, January 2012.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 30 z 32
12. Upozornění zákazníkům
Výsledky obdržené pomocí soupravy Devyser Resolution v2 musí být interpretovány s
přihlédnutím k dalším laboratorním výsledkům a klinickému obrazu pacienta.Devyser AB
nezodpovídá za následná klinická rozhodnutí.
LIZ® a GeneAmp® jsou registrovanými obchodními známkami společnosti Life Technologies
Corporation.
GeneScanTM, POP-4TM, POP-7TM a Hi-DiTM jsou ochrannými známkami společnosti Life
Technologies Corporation.
Koupí tohoto produktu nezískáváte licenci k provádění PCR podléhající patentům vlastněným
třetí stranou.
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 31 z 32
13. Kontaktní informace
Devyser AB
Instrumentvägen 19
SE-126 53 Hägersten
SWEDEN
Phone: +46-8-562 15 850
Homepage: www.devyser.com
Technická podpora
Phone: +46-8-562 15 850
E-mail: [email protected]
Devyser Resolution v2, CE-IVD, Instructions for Use, 7-A026-CZ, 6-2013.
© Devyser AB 2014
Stránka 32 z 32
Download

Devyser Resolution v2_navod.pdf