Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ
STANDARTLARI (UMS)
KIA / TSI
Kligler’s Iron Agar ve Triple Sugar Iron Agar Testleri
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları ÇalıĢma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-11
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
KIA / TSI
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3
GENEL BĠLGĠ ................................................................... 3
TEKNĠK BĠLGĠLER ............................................................. 4
1
2
3
4
Test için asgari laboratuvar koĢulları ................................ 4
Testin uygulanması ....................................................... 6
Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması ...................... 6
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 7
ĠLGĠLĠ DĠĞER UMS BELGELERĠ ............................................ 8
KAYNAKLAR ..................................................................... 8
Sayfa 2 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-11 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
KIA / TSI
Kapsam ve Amaç
KIA ve TSI baĢta Enterobacteriaceae olmak üzere gram negatif bakterilerin ilk
tanımlama basamağında bazı temel biyokimyasal özelliklerinin gözlemlendiği
besiyerleridir. Bu UMS’de KIA/TSI testlerinin dayandığı prensipler, kullanımları ve
doğru yorumlanmaları için bir rehber sunulması hedeflenmiĢtir.
Kısaltmalar ve Tanımlar
H2S
Hidrojen sülfür
KIA
Kligler Iron Agar
Oksidatif ve
fermentatif
metabolizma
Bakteriler karbonhidratları aerob (oksidatif) ve anaerob
(fermentatif) yollardan biri veya her ikisi ile yıkma yeteneklerine
göre ayrılabilirler. Fermentasyon, oksijenden ziyade bir organik
maddenin son hidrojen alıcısı olarak iĢlev gördüğü metabolik bir
süreçtir. Agar bazlı tüp besiyerlerinde oksidatif reaksiyon üst
kısımda izlenebilirken, dipte de fermentasyon reaksiyonunun
gözlenmesi mümkün olur (1).
TSI
Triple Sugar Iron (agar)
Genel Bilgi
KIA ve TSI gram negatif bakterilerin ilk tanımlanmasında kullanılan besiyerleridir.
Bu besiyerlerinde bakteriler Ģekerleri kullanma özelliklerinin yanı sıra, gaz ve H2S
oluĢturma yetenekleri temelinde de ayırt edilirler (2).
TSI besiyerinin formülü büyük ölçüde KIA ile ortak özelliklere sahiptir. KIA
besiyerinde bir kısım glikoz (%0.1) ve 10 kısım laktoz (%1.0) bulunur. TSI ise bu
Ģekerlere ilave olarak 10 kısım da (%1.0) sukroz içeren üç Ģekerli bir besiyeridir.
Bunların dıĢında her iki besiyeri kazein ve et peptonların yanı sıra, H2S üretimini
görünür kılan ferrik ve ferröz iyonlar ile sodyum tiyosülfat ve pH indikatörü olarak
fenol kırmızısı içerirler. Bakterinin H2S üretimi besiyerinin siyah bir renk alması ile
kendini gösterir (2,3).
Bu besiyerleri, biyokimyasal reaksiyonları açığa çıkarabilmek amacıyla tüpte, yatık kısım (3 cm) ve dip kısmı (3 cm) olacak Ģekilde- hazırlanma aĢamasında
agara özel bir eğim verilerek elde edilirler. Ġnokülasyon, test edilecek
organizmanın saf kültüründen bir iğne öze ile yatık kısma yayma, dip kısma
batırma kültürü Ģeklinde yapılır. Uygun bir inkübasyon süresinin sonunda inoküle
edilmiĢ tüp incelenir.
Laktoz negatif (laktozu fermente edemeyen) bakteriler, üremeye baĢladıklarında,
glikozdan asit üretimine bağlı olarak besiyerinde sarı renk oluĢtururlar. Glikoz
ortamda az miktarda bulunduğundan hızla tükenir. Dolayısı ile besiyerinin yatık
kısmında oksidatif metabolizma devreye girer ve peptonların aerobik yoldan
yıkımı ile meydana gelen ürünler pH’ı alkali yapar; yatık kısmın rengi kırmızıya
döner. Dip kısımda oksijen olmadığından oksidatif metabolizma kullanılamaz ve
dip asit reaksiyonda sarı kalır.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-11 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 8
KIA / TSI
Sonuç olarak; KIA ya da TSI tüpünde yatık kısımda alkali (K) ve dip kısımda asit
(A) reaksiyon (K/A; kırmızı yatık / sarı dip) ile karakterli organizma bir “laktoz
negatif bakteri” olarak ayırt edilir.
Laktoz pozitif (laktozu fermente eden; ve/veya -TSI söz konusu ise- sukrozu
fermente eden) bakteriler -ortamda glikoz tükendikten sonra da
kullanabilecekleri Ģekerler bulunduğundan- besiyerinin yatık ve dip kısımlarında
büyük miktarda asit üretmeye devam ederler; böylece tüpün her iki kısmında da
reaksiyon asit kalır (A/A; sarı yatık / sarı dip). Eğer besiyerinde hiç renk değiĢimi
gözlenmiyorsa, bu, bakterinin glikozu da diğer Ģekerleri de fermente etme
yeteneğine sahip olmadığını gösterir (K/K; kırmızı yatık / kırmızı dip).
ġeker fermentasyonu sonucu gaz üretimi dip kısımda kimi zaman besiyerini
yırtmıĢ hava kabarcıkları halinde gözlenir. Bakterinin sodyum tiyosülfat ile
etkileĢimi sonucu ise H2S üretilir. H2S oluĢumu, ferrik iyonların indirgenmesine
bağlı olarak besiyerinde siyah çökelti meydana gelmesi ile ayırt edilir.
Bu besiyerleri yaygın bir Ģekilde enterik patojenlerin tanımlanmasında kullanılsa
da diğer bazı bakterilerin bazı biyokimyasal özelliklerinin gözlenmesi (ör.,
Erysipelothrix ve Campylobacter’de H2S üretiminin gösterilmesi; oksidasyonfermentasyon besiyerinde üreyemeyen narin bakterilerin glikozu fermente etme
yeteneğinin saptanması vb.) için de yararlıdır (2).
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koĢulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS’de bahsi geçen organizmalar ile ilgili iĢlemler asgari BGD2 laboratuvar
Ģartlarında gerçekleĢtirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. Aerosol oluĢturması muhtemel tüm laboratuvar çalıĢmaları bir
biyolojik güvenlik kabininde gerçekleĢtirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS’yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım
ile ilgili eğitim almıĢ olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aĢina olmalı, ve; (iii)
daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
1.3. Örnek, Besiyeri, Reaktif ve Donanım
Test mikroorganizmaları

Enterik patojen bakterilerin tanımlanması amacıyla – Gram negatif
bakteri izolatının taze kültürü,

Glikozu fermente edip etmediğinin gösterilmesi amaçlanan gram
negatif çomaklar - güç üreyenler dahil,
Sayfa 4 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-11 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
KIA / TSI

H2S üretiminin gösterilmesi için - Campylobacter,

Laktobasilleri Erysipelothrix’ten ayırt etmek ve H2S üretiminin
gösterilmesi için - katalaz negatif, gram pozitif çomaklar,

Acinetobacter spp’yi tanımlamak için - oksidaz pozitif, katalaz negatif,
hareketsiz, MacConkey agarda üremiĢ gram negatif kokobasiller.
Besiyeri

Laboratuvar KIA veya TSI’den hangisini tercih edeceğine karar
vermelidir.

KIA veya TSI tüpte yarı-yatık agar - piyasadan temin edilebilir veya toz
besiyerinden laboratuvarda hazırlanır. Hazırlamak için;
(a) Besiyeri tozu uygun miktarda tartılıp, sulandırılır, ısıtılarak eritilir;
pH’si kontrol edilmeli, gerekiyorsa pH 7.3-7.4’e ayarlanmalıdır.
(b) ErimiĢ besiyeri 16125mm burgu kapaklı tüplere 5-7 mL alikotlar
halinde dağıtılır; 121°C’de 15 dk otoklavlanır ve oda ısısında yarıyatık pozisyonda (yatık kısım 3 cm, dip kısım 3 cm) dondurulur.
Raf ömrü 3 aydır; tüpler etiketlenir ve buzdolabında saklanır.
ÖNEMLĠ: (i) Laboratuvar güvenliği kuralları gereği pamuk tıkaçlı tüp
kullanılmaz! Burgu kapaklı tüpler kullanılmalıdır. (ii) Campylobacter
spp test edilmesinde en iyi sonuç için KIA/TSI taze olmalı, en fazla bir
hafta içinde kullanılmalıdır.
Diğer gereç, donanım



Öze, iğne uçlu, tek kullanımlık veya nikrom
Ġnkübatör, 35-37°C
KurĢun asetat kağıdı (H2S üretimini saptamak için, opsiyonel)
1.4. Kalite kontrol

Her besiyeri lotuna kullanıma sokulmadan önce kalite kontrol
uygulanmalıdır. Lotlar arasında haftada bir; laboratuvar testi daha
uzun aralıklarla yapıyorsa her testte kalite kontrol yapılır.

Saklamaya kaldırmadan önce besiyerleri incelenmeli; hava kabarcıklı,
yarık, vb. olan ve yeterince derin dip kısmı olmayan tüpler atılmalıdır.
Yatık ve dik kısımların aĢağı yukarı eĢit uzunlukta olması gerekir.

Her kullanım öncesi tüpler kontaminasyon, donma, kuruma, renk
değiĢimi vb. yönünden incelenmeli; sorunlu tüpler atılmalıdır.

Kalite kontrol organizmaları – aĢağıdaki tabloda verilmektedir.
Organizma / ATCC no
TSI
KIA
Escherichia coli / 25922
A/A, gaz
A/A, gaz
-
Salmonella enterica ser Typhimurium / 14028
K/A, gaz±
K/A, gaz±
+
Pseudomonas aeruginosa / 27853
K/K, gaz yok
K/K, gaz yok
-
Campylobacter hyointestinalis / 35217(opsiyonel)
K/K, gaz yok
K/K, gaz yok
+
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-11 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
H2S
Sayfa 5 / 8
KIA / TSI
2 Testin uygulanması

KIA/TSI tüpü oda sıcaklığına getirilir.

Steril bir iğne öze ile teste alınacak koloninin merkezine dokunulur.

Öze, tüpün tabanına 3-5 mm kalana dek KIA/TSI agarın dip kısmına
batırılır. Ardından öze geri çekilir ve yatık kısım yüzeyine zikzak çizerek
ekim yapılır.

Tüpün kapağı hava geçiĢine izin verecek Ģekilde gevĢek kapatılır.
Sıkılmaz!
NOT: Güç üreyen organizmalar için alternatif olarak, Ģerit Ģeklindeki
kurĢun asetat kağıt tüpün ağız kısmına yerleĢtirilir. Tüp kapağı, kağıt
Ģeridi burada asılı pozisyonda tutacak Ģekilde, fazla sıkmadan kapatılır.

Tüpler aerobik ortamda, 35-37°C’de 18-24 saat inkübe edilir.

Süre sonunda tüpün yatık ve dip kısımlarındaki reaksiyonlar (renk
değiĢikliği, gaz ve H2S oluĢumu yönünden) incelenir.
ÖNEMLĠ: ġeker fermentasyonlarının yorumu 18-24 saatte yapılmalıdır!
Eğer okunmaları gecikecekse tüpler buzdolabına kaldırılmalıdır.
Ġnkübasyonun uzatılması sadece H2S üretiminin beklenmesi amacıyla
yapılabilir. Campylobacter’lerde bu süre 3 güne kadar uzayabilir.
3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması
3.1. KIA/TSI tüpünde olası reaksiyonlar

Asit (A) reaksiyon – sarı

Alkali (K) reaksiyon – kırmızı

H2S üretimi – besiyerinde siyah renk değiĢimi; yatık ve dip kısım
arasında halka Ģeklinde olabilir, sadece dip kısımda olabilir veya bütün
besiyerini kaplamıĢ olabilir. H2S üretimi düĢük düzeyde olduğunda
agarda siyahlaĢma gözlenmezken, kullanılmışsa kurĢun asetat kağıt
siyahlaĢır.

Gaz üretimi – hava kabarcıkları, agarda yarılma veya besiyerinin yukarı
itilmesi Ģeklinde gözlenebilir.
3.2. Reaksiyonların yorumu ve raporlanması

A/A: glikoz ve laktoz (ve/veya TSI için sukroz) fermente edilmiĢ

K/A: sadece glikoz fermente edilmiĢ (laktoz negatif bakteri)

K/K: hiçbir Ģeker fermente edilmemiĢ (nonfermentatif).
Sayfa 6 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-11 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
KIA / TSI
3.3. Sonuçların raporlanması
KIA/TSI testi ile elde edilen sonuçlar ön tanımlama niteliğindedir, kesin
tanımlama için ilave testlerle desteklenmeleri gerekir.
AĢağıda sıralanan hususlar dikkate alınmalıdır:

Enterobacteriaceae üyeleri ve diğer enterik patojenlerin (Salmonella
spp, Shigella spp, E. coli, Yersinia spp, Vibrio spp, Aeromonas spp…)
tanımlanmasında KIA/TSI testleri mutlaka diğer tanımlama testleri ile
tamamlanmalıdır.
NOT: Bu belgenin sonunda listelenen “Ġlgili UMS belgeleri”ne bakınız!

Eğer bir Campylobacter sp Ģüpheli organizma H2S pozitif ise ön rapor
“olası Campylobacter hyointestinalis” Ģeklinde verilir ve diğer testler ile
teyit edildikten sonra kesin rapor gönderilir (2).

Eğer bir katalaz negatif, gram pozitif çomak bakteri vankomisine
dirençli ve H2S pozitif ise “olası Erysipelothrix rhusiopathiae” Ģeklinde
rapor edilir (2).
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Yatık kısımda asit oluĢumu yanlıĢ okunup raporlanabileceğinden test 18
saatten önce değerlendirilmemelidir.

AĢırı H2S üretimi glikoz reaksiyonunu maskeleyebilir. Eğer bu durum
gözlenirse glikoz fermentasyonu vardır ve öyle kaydedilmelidir. Gaz
üretimi de kontrol edilmelidir.

KIA kullanıldığında laktoz negatif ancak sukroz pozitif olan bakteriler
(ör., Providencia sp) tanımlanamaz. Bu durum özellikle dıĢkı
kültürlerinin incelenmesi sırasında önem kazanır; laktoz ve sukroz
negatif olan fekal patojenlerle (Salmonella sp, Shigella sp), laktoz
negatif, sukroz pozitif bakterilerin aynı KIA reaksiyonunu vereceği
akılda tutulmalıdır. KarıĢma olasılığı TSI kullanımı ile bertaraf edilebilir.
Ancak her durumda yanlıĢ yorumlardan kaçınmak için KIA/TSI testi
sonuçları sonraki biyokimyasal testler ile doğrulanmalıdır.

TSI kullanıldığında ise, laktoz negatif olan fakat sukrozu fermente
edebilen Yersinia enterocolitica ve Edwardsiella tarda A/A reaksiyonu
vereceğinden değerlendirme esnasında “enterik patojen değil” denerek,
atlanabilirler (4). TSI kullanan laboratuvarların da bu olasılığı akılda
tutmaları gerekir. Bu durum KIA kullanımı ile bertaraf edilebilir.

Gaz üretimi TSI’de daha iyi değerlendirilir. Ancak TSI’de H2S üretimi,
özellikle sukroz pozitif bakterilerde -enzim mekanizması
etkilendiğinden dolayı- baskılanabilir. Sülfit-indol-motilite (SIM) agar
H2S üretiminin saptanmasında KIA veya TSI’den daha duyarlıdır.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-11 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 8
KIA / TSI
İlgili diğer UMS belgeleri
Bu prosedür belgesinde (KIA / TSI ) geçen bazı hususlar için daha ayrıntılı veya
ilave bilgi için aĢağıda listelenen UMS belgelerine baĢvurunuz:
UMS, B-TP-04
Hareket testi
UMS, B-TP-06
IMVIC testleri (sitrat utilizasyonu için)
UMS, B-TP-13
Lizin-Ornitin-Arjinin dihidrolaz/dekarboksilaz testleri
UMS, B-TP-15
Nitrat redüksiyonu
UMS, B-TP-16
Oksidaz testi
UMS, B-TP-17
ONPG testi
UMS, B-TP-22
Üreaz testi
Kaynaklar
1
York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical Tests for the Identification of Aerobic
Bacteria. Carbohydrate Utilization Tests. In: Garcia LS (editor in chief). Clinical Microbiology
Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 3.17.9.1 3.17.9.6
2
York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical Tests for the Identification of Aerobic
Bacteria. Kligler’s Iron Agar Test and Triple Sugar Iron Agar Test. In: Garcia LS (ed in chief).
Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007,
p. 3.17.25.1 - 3.17.25.3
3
Shigei J. Test methods used in the identification of commonly isolated aerobic gram-negative
bacteria: Kligler Iron Agar Test and Triple Sugar Iron Agar Test. In: Isenberg HD (ed in chief).
Clinical Microbiology Procedures Handbook. ASM Press, Washington D.C. 1992, p. 1.19.46 and
1.19.55
4
MacFaddin JF. Biochemical tests for the identification of medical bacteria. 3rd ed., The
Lippincott, Williams & Wilkins Co., Philadelphia, PA. 2000, p. 239–253.
Sayfa 8 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-11 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Download

KIA/TSI testleri - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu