Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MİKROBİYOLOJİ
STANDARTLARI (UMS)
Oksidaz Testi
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-16
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
Oksidaz testi
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3
GENEL BİLGİ ................................................................... 3
TEKNİK BİLGİLER ............................................................. 3
1
2
3
4
Test için asgari laboratuvar koşulları ................................ 3
Testin uygulanması ....................................................... 4
Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması ...................... 5
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 5
KAYNAKLAR ..................................................................... 6
Sayfa 2 / 6
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-16 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Oksidaz testi
Kapsam ve Amaç
Oksidaz testi sitokrom oksidaz enziminin gösterilmesi amacıyla kullanılır. Oksidaz
pozitif ve negatif organizmaların ayrımı ilk tanımlamada önemli bir basamak
olduğu için oksidaz testinin doğru bir şekilde yapılması da kritik önemdedir. Bu
UMS’nin amacı, testin doğru uygulanması için bir rehber sunmaktır.
Kısaltmalar ve Tanımlar
NADH
Nikotin amid adenin dinükleotid (NAD+)’in indirgenmiş halidir. NAD+
oksitleyicidir; diğer moleküllerden elektron alır ve indirgenir.
TMpPD
N, N, N’, N’-tetra-metil-p-fenilen diamin dihidroklorid
Genel Bilgi
Oksidaz testi, sitokrom oksidaz enzimi üretiminin gösterilmesine dayanır. Bazı
bakteriler, demir içeren bir hemoprotein olan sitokrom oksidaz veya indofenol
oksidaza sahiptirler. Bu enzimler NADH gibi verici bileşiklerden bir elektron
alıcısına (genellikle oksijene) elektron taşınmasını katalize ederler (1,2).
Sitokrom sistemi sadece, nihai hidrojen alıcısı olarak oksijeni kullanma yetisine
sahip olan aerob organizmalarda mevcuttur. Bu metabolizmanın son ürünü su
veya katalaz ile yıkılmış hidrojen peroksittir (3). Atmosferik oksijenin varlığında
oksidaz testi yapılırken örneğin p-fenilen diamin dihidroklorid gibi renksiz bir
boya enzim için yapay bir elektron alıcısı olarak hizmet vermektedir. Böylece
boya okside edilir ve koyu mor bir bileşik olan indofenol mavisi oluşur (1,2).
Oksidaz testi özellikle gram negatif bakterilerin ilk tanımlanma basamağında
yararlıdır. Oksidaz pozitif gram negatiflerin hatalı tanımlanmasını önlemek için
tüm gram negatif çomaklara oksidaz testi yapılmalıdır. Bütün Enterobacteriaceae
üyeleri oksidaz negatiftir. Aeromonas, Pseudomonas, Neisseria, Moraxella,
Campylobacter, Pasteurella ve Vibrio kökenleri ise oksidaz pozitiftir (1,2).
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koşulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS’de bahsi geçen organizmalar ile ilgili işlemler asgari BGD2 laboratuvar
şartlarında gerçekleştirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. Aerosol oluşturması muhtemel tüm laboratuvar çalışmaları bir
biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-16 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 6
Oksidaz testi
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS’yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım
ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aşina olmalı, ve; (iii)
daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
1.3. Örnek, Reaktif, Donanım
Test mikroorganizmaları

Agar plakta tek düşmüş koloniler (taze kültür) - besiyeri glikoz,
inhibitör veya boya içermeyen bir besiyeri olmalıdır.
Kovacs ayıracı, %1’lik

TMpPD’nin distile/deiyonize sudaki %1’lik çözeltisi doğrudan veya test
şeritlerine emdirilmiş olarak kullanılır. Piyasada hazır ürünler mevcuttur.

Taze çözelti, 5mL steril su içine 50mg TMpPD karıştırılarak hazırlanır.
ÖNEMLİ: Oksidaz solüsyonu hızla kendiliğinden okside olabilir! Bu
nedenle daima kullanılacağı gün taze hazırlanmalıdır ya da
oksidasyonu geciktirmek için askorbik asit (%1 oranında) ilavesi
yapılmalıdır. Solüsyon oda ısısında gün ışığından korunarak saklanır ve
kullanılmamış kısım gün sonunda atılır.
Diğer gereç, donanım




Öze, steril tek kullanımlık veya platin, veya steril kürdan
Eküvyon (steril)
Filtre kağıdı (ör., Whatman No1) – küçük kesilmiş (ör.,1050 mm).
Petri kabı, tek kullanımlık
1.4. Kalite kontrol

Ayıracın veya test şeridinin rengi mavi / mor ise kullanılmamalıdır! Her
yeni ayıraç / test şeridi lotu kalite kontrol suşları ile test edilmelidir.

Kalite kontrol organizmaları:
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 – oksidaz pozitif (pozitif kontrol)
Escherichiacoli ATCC 25922 – oksidaz negatif (negatif kontrol)
2 Testin uygulanması
2.1. Direkt plak tekniği

Plak besiyerindeki test edilecek kolonilerin üzerine 1-2 damla Kovacs
ayıracı damlatılır. Plak hareket ettirilmemelidir.
ÖNEMLİ: Eğer kolonilerden pasaj yapılması planlanıyorsa direkt plak
tekniğini uygulamayın! Çünkü üstü reaktif kaplı koloniler -organizmalar
öldüğü için- pasaja uygun olamazlar.

Koloni renginin 10 sn içinde mavi-mora dönüp dönmediği gözlemlenir.
Sayfa 4 / 6
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-16 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Oksidaz testi
2.2. Filtre kağıdı tekniği

Bir parça filtre kağıdı Petri kabına konur; 1-2 damla Kovacs ayıracı
damlatılır.
NOT: Eğer ticari oksidaz şeridi kullanılıyor ve ürünün kullanma talimatı
aksini belirtmiyorsa, Petri kabına konan şerit 1-2 damla steril su ile
ıslatılır.

Taze kültürden incelenecek koloni öze veya kürdan ile alınır; şeridin
ayraç damlatılmış (ıslatılmış) kısmına sürülür.

Rengin 10 sn içinde mavi-mora dönüp dönmediği gözlemlenir.
2.3. Eküvyon metodu

Eküvyon Kovacs ayıracına daldırılır ve fazlası şişenin kenarından
süzdürülür. Ardından eküvyon ile koloniye dokunulur.

Rengin 10 sn içinde mavi-mora dönüp dönmediği gözlemlenir.
ÖNEMLİ: Eğer koloniden pasaj planlanıyorsa bu tekniği uygulamayın!
2.4. Modifiye oksidaz

Sitokrom c’yi saptayan modifiye oksidaz testi mikrokokların (pozitif)
stafilokoklardan (negatif) ayrımında kullanılabilen testlerden birisidir.

Test için dimetil sulfoksit içinde (suda değil) %6’lık TMpPD ayıracı
kullanılır. Test, oksidaz testi ile aynı şekilde gerçekleştirilir (4).
3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması

Pozitif sonuç – 10-30 sn içinde mavi-mor bir renk oluşması halinde
sonuç “pozitif” olarak yorumlanır.

Zayıf pozitif sonuç – 30-60 sn içinde renk gelişimi olursa “zayıf
pozitif” reaksiyon olarak değerlendirilir; çoğu Pasteurella spp için
tipiktir.

Negatif sonuç – Renk oluşmaması veya renk değişiminin 60
saniyeden sonra gelişmesi halinde sonuç “negatif” olarak yorumlanır.
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Nikel-krom tel özeler kullanılmaz! Çünkü alevde yakma sırasında
oluşan yüzey oksidasyon ürünleri yanlış pozitif sonuçlara neden
olabilmektedir (1).

Mukoid koloniler, reaktifin organizmaya zayıf penetrasyonu nedeniyle
yanlış negatif sonuç verebilir. Eski kültürlerden elde edilen oksidaz
sonuçları güvenilir değildir (5).

Bazı Pseudomonas türleri oksidaz negatif olabilir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-16 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 6
Oksidaz testi

Glikoz veya diğer şekerler, tellürit ya da boyalar içeren besiyerlerinde
(EMB, MacConkey, TCBS vb.) üremiş kolonilere oksidaz testi yapılmaz;
yanlış pozitif ya da yanlış negatif sonuçlara neden olabilirler (6).
Kaynaklar
1 York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical tests for the identification of aerobic
bacteria. Oxidase test. In: Garcia LS (editor in chief). Clinical Microbiology Procedures Handbook.
3rd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2010, p. 3.17.39.1 - 3.17.39.3
2 Bilgehan H. Besiyerleri, ayıraçlar ve deneyler: Oksidaz deneyleri. Klinik Mikrobiyolojik Tanı. 5.
Baskı, Barış Yayınları, Izmir. 2009, p. 688
3 MacFaddin JF, ed. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd ed., Lippincott
Williams and Wilkins, Philadelphia. 2000, p. 363-7.
4 Faller A, Scheifer KH. Modified oxidase and benzidine tests for seperation of staphylococci from
micrococci. J Clin Microbiol 1981;13:1031-1035.
5 Barrow GI, Feltham RKA, eds. Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical
Bacteria. 3rd ed. Cambridge University Press. Cambridge. 1993, p. 214-8.
6 Collins CH, Lyne PM, Grange JM, Falkinham JO, eds. Collins and Lyne's Microbiological Methods.
8th ed. Vol 97. Arnold Publishers, UK. 2004, p. 98.
Sayfa 6 / 6
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-16 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Download

Oksidaz testi - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu