KÖK HÜCRE NAKİL ÜRÜNLERİNDE
KALİTE KONTROL TESTLERİ
Bio.Utku SEYİS
Kalite Kontrol Sorumlusu
Acıbadem Labcell Hücre Laboratuvarı ve Kordon Kanı Bankası
2014
• İnsan sağlığı için üretimi yapılan her ürünün, üretiminin
tüm aşamalarında ve hasta uygulamalarında yüksek
kalite seviyesine sahip olması gerekmektedir.
• Bu amaçla, son yıllarda her türlü kan ve kan ürünü, kök
hücre bankacılığı, hücre ve gen tedavi ürünlerinin
Transplant Merkezleri altında nakillerinin yapılması
gerekliliği belirmiştir.
• Ülkemizde de Nakil ürünleri için Trasplant Merkezlerinin
ve nakil ürünleri üretim tesislerinin kurulumunun hızla
arttığı bir dönemdeyiz.
KALİTE
• Bu tesislerde üretilen ürünler için belirlenen şartlar
altında ve belirlenen bir zaman süresi içersinde
istenilen fonksiyonları yerine getirebilme hizmetine
ihtiyaç vardır.
Kalite Kontrol
• Verilen hizmetin önceden saptanmış özellikleri
taşıyıp taşımadığının ve ne ölçüde güvenilir
olduğunun incelenmesi için kullanılan kalite
kontrol yöntemleri geliştirilmiştir.
Kalite Kontrolün Faydaları
• Ürün kalitesi kontrol edilir, kullanışlılığı ve
kullanma süresi belirlenir.
• Üretim ve kalite kontrol metotlarının istatistiksel
veri ve kullanıcı geri bildirimleri sonucunda
revizyonu sağlanır.
• Üretilen ürünün istenilen özellikte olup olmadığı
kontrol edilmiş olur.
• Ürünlerde meydana gelen beklenenin dışındaki
değişmeleri önceden tespit edip hatalı üretimi
engellemek.
Nakil Ürünlerinde Kalite Kontrol
Kalite Kontrol
1-Kabul Öncesi Ham
Ürün:
Ham ürünün geldiği
anda paket halindeki
durumunu tanımlar.
1-Kabul Öncesi Ham Ürün
•
•
•
•
•
Ambalaj
Görünüm
Isı Takibi
Hacim
Viral Seroloji
Ambalaj
• Güvenlik bandı sağlam olmalı ve ilk kez görevli
personel tarafından açılmalıdır.
• Güvenlik bandının sağlam olmadığı durumda
durum rapor edilir ve gönderici tarafa konu
hakkında bilgi verilir.
Görünüm
• Dağılmayan ve farklı renkte partiküller,
• Vişne görünümünde serum,
• Hemoliz, pıhtılaşma veya enfeksiyoz bozulma
işaretidir.
Isı Takibi
• Uzak mesafelerdeki nakiller için 4-8°C arasında, 24
saat içindeki nakiller için oda sıcaklığında bir ısı ile
transfer sağlanmalı (oda ısısında olması kuralsız
olması anlamına gelmez 18-24°C aralığında olmalı ve
fazla bir sapma olmamalıdır.), ısı takip çubuğu ile ısı
takibi yapılmalıdır.
Hacim
• Aferez ürünleri için 150-300 ml arasında
• Kemik iliği erişkin yaş grubu için > 500 ml
– Pediatrik yaş grubu için > 150 ml olmalıdır.
*(volüm bu rakamların altında olduğunda yetersizlik bilgisi hasta sahibi doktora
iletilmelidir. Bunların altında alınan volümlerden hedeflenen yeterliliğe
ulaşılamayacağından üretimle kaynaklı sorumluluk azaltılmış olunur.)
Viral Seroloji
• Eğer ürün otolog ise laboratuvar ve personel güvenliği için
İşleme başlamadan, test sonuçları verici dokümanlarından takip
edilir veya bilinmiyor ise testler çalıştırılarak ürün laboratuvara
alınır.
• Ürün Allogeneik ise mutlaka seroloji testleri bilinmelidir. Özel
durumlarda da Mesul Müdür onayı alınarak işlemlere devam
edilir. (Başka bir Donör bulunamıyorsa)
• Akraba dışı nakillerde DNA PCR çalışılması tercih edilmelidir.
2-İşlem Öncesi
Ham Ürün:
Kabul öncesi kalite
kontrolü geçip
üretim alanına
giren işlenmemiş
ham ürüne verilen
addır.
2-İşlem Öncesi Ham Ürün
• Canlılık
• Hücre Sayısı
• Mikrobiyolojik Kalite Kontrol (Aerob,Anaerob, Mantar Kültürü)
• Mikroskobik Kontrol (Yayma)
• Kalite kontrol laboratuarına gelen
kemik iliğindeki MNH tiplerinin,
büyüklük, sitoplazma ve çekirdek
yapılarına göre değerlendirerek
ürün yeterliliğini belirlemek amacı
ile yapılmaktadır.
• Ön kalite kontrolde yeterlilik
verebilmek için mikroskopta 10x
alanda en az 2 megakaryosit
görülmeli ve ml deki hücre sayısı
> 15 milyon olmalıdır.
3-Ara Ürün:
Ham ürünün son ürün
haline gelene kadar
geçirdiği aşamaları
tanımlar.
Plazma, eritrosit azaltımı
ve hücre maniplasyonu,
ara ürün olarak
tanımlanabilir.
• Canlılık
• Hücre Sayısı
4-İşlem Sonrası Ürün
(Son Ürün):
Bitmiş ürünü
tanımlar.
Son üründen ileride
oluşabilecek
problemlere karşılık
2 adet şahit numune
saklanmalıdır.
4-İşlem Sonrası Ürün (Son Ürün)
• Canlılık
• Hücre Sayısı
• Flow Sitometri (İmmünfenotipleme)
• Mikrobiyolojik Kalite Kontrol (Aerob,Anaerob, Mantar Kültürü)
• CFU
Yapılan Testler, Kısa Metodoloji ve
Kabul Sınırları
Canlılık
• İn vitro şartlarda
üretilen hücrelerin
canlılıklarının kabul
edilebilir sınırlarda
olup olmadığını
belirlemek için yapılan
kalite kontrol testidir.
• Tyrpan Blue(Mavisi) ve
7AAD ile yapılır.
• > % 90 olması
hedeflenmiştir.
Canlılık
• Canlılık ölçümü yapılacak numuneden
flaşlama yaparak mikropipet ile 100µl
çekilir ve örnek tüpene aktarılır. Aynı
tüpe 100µl Tyrpan Blue eklenerek
flaşlama yapılır.
• Elde edilen karışımdan 10µl alınır ve
lamda değerlendirme yapılır.
• Değerlendirme için yaklaşık 100 ve
üzeri hücre sayılır.
• Mavi renkle boyalı hücreler ölü
hücreler, açık renkte şeffaf olanlar
canlı hücrelerdir.
• Toplam hücrelerin ölü hücrelerden
farkının 100 ile çarpımının, toplam
hücre sayısına bölümü canlılık oranını
verecektir.
Hücre Sayısı
• İn vitro şartlarda üretilen
hücrelerin istenilen aşamada
hücre sayısını belirlemek için
yapılan kalite kontrol testidir.
• Thoma lamı veya CBC cihazı
kullanılarak hücre sayısı tespit
edilir.
• Aferez ürünlerinin CBC
cizhazında okutulmasının
olumsuz bir yanı yoktur ancak
kemik iliklerinde yanlış sonuçlar
verebilme ihtimeline karşılık
Thoma ile sayımı önerilmektedir.
Thoma Lamında Hücre Sayımı
• Thoma lamı düz bir zemin üzerine koyulur ve lamelin
yapışması gereken sayım alanı çerçevesinin üzerine
thoma lamelini kapatılır.
• Eliza pipeti ile numune tüpündeki süspansiyonundan
uygun yöntemle 100 μl hücreye iki kere al-ver yapılıp
üçüncüde alınır ve örnek tüpüne koyulur.
• Hücre süspansiyonundan eliza pipeti ile 50 μl çekilir.
Thoma Lamında Hücre Sayımı
• Thoma lamının her iki yanında bulunan kanalların ortasında
kalan sayım alanında lamelin lam ile birleştiği noktaya eliza
pipetinin ucu dayanır ve tam orta noktasından yavaşça hücre
solüsyonunu sayım alanına pipetlenir.
• Bu işlem thoma lamının diğer tarafı içinde tekrarlanır.
Thoma Lamı Hücre Sayısı
• Mikroskop açılır, lam yerleştirilir ve 20 ‘lik objektife
ayarlanır.
• Sayım alanındaki birbirine paralel ve birbiriyle kesişen
çizgiler ve hücreler görülür.
• Thoma lamı 4 büyük kareden ve kendi içinde de 16
küçük kareden oluşan sayım alanına sahiptir. Bu alanın
içine düşen tüm hücreler ayrı ayrı sayılır.
Thoma Lamı Hücre Sayısı
Thoma Lamı Hücre Sayısı
Flow Sitometri (İmmünfenotipleme)
• Süspansiyon halindeki
hücre ya da partikülleri
bir akış kanalından
belirli bir hızda tek tek
geçerken sınıflandıran
bir sistemdir. Hücre
büyüklüğü ve
granülasyonu ile birlikte
aynı anda farklı
floresan boya ile
işaretlenmiş örnekler
analiz edilebilir.
Flow Sitometri (İmmünfenotipleme)
Flow Sitometri (İmmünfenotipleme)
• ISHAGE Yöntem:
CD 45 FITC
CD 34 PE
7AAD
Trucount tüpe eklenir.
• Milan Mulhouse Yöntem:
CD 45 FITC
CD 34 PE
BD tüpe eklenir
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol
• Aerob ve anaerob olarak Mikrobiyolojik
kültür şişeleri ile yapılır ve cihazlara
yüklenir.
• Ürünün giriş ve çıkışından örnekler
alınır.
• Mantar kültürü için de örnekler alınır ve
takibi yaplır.
• İhtiyaç olursa ara ürün basamaklarından
da kültür örneklemesi yapılır.
• Kültür sonuçları 24.saat, 48.saat, 7.gün
ve 14. gün aralıklarında takip edilir.
CFU (Colony Forming Unit)
• CFU yapan hücreler yarı katı besiyerin de 14 gün
süresince büyüme faktörlerinin desteğiyle beslenmeye
alındıklarında koloniler oluştururlar. Bu kolonilerin
gelişimi sonrası sayımları yapılır ve böylece test edilmek
istenen üründeki CFU oranı hesaplanır.
– CFU-GM: granulocyte macrophage
– BFU-E: Burst forming unit erythroid
– CFU-GEMM: granulocyte, erythrocyte, macrophage,
megakaryocyte
1. Gün 4x
7. Gün 4x
14. Gün 10x
14. Gün 4x
14. Gün
14. Gün
Otolog Nakil Kabul Sınırları
Allogeneik Nakil Kabul Sınırları
Dondurma Öncesi Son Üründe Olması
Gereken Hücre Limitleri
Kabul Değerleri
WBC
(Jelleşme) Perifer de <1 x 108/ml
Kemik iliği <5 x 107/ml
Nötrofil
(Jelleşme) <20.000/µl
HTC
Trombosit Miktarı
Son Ürün Canlılık
< %5
(Jelleşme) < 200.000/µl
> % 90
Yapılan Testler
Kabul Öncesi Ham Ürün
İşlem Öncesi Ham Ürün
Ara Ürün
Son Ürün
Mikrobiyolojik Kültür
X
X
X
Canlılık
X
X
X
Hücre Sayısı
X
X
X
Mikroskobik Tarama(Yayma)
X
Ambalaj
X
Görünüm
X
Isı Takibi
X
Hacim
X
Seroloji
X
Flow (İmmünfenotipleme)
X
CFU
X
TEŞEKKÜRLER….
Acıbadem Labcell Hücre Laboratuvarı ve Kordon Kanı Bankası
2014
Download

KÖK HÜCRE NAKİL ÜRÜNLERİNDE KALİTE KONTROL TESTLERİ