HYDRAGEL BENCE JONES K20
Ref. 3038
Masque standard / Standard mask
2014/03
HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
NAMENA
HYDRAGEL BENCE JONES K20 gelovi proizvedeni su za kvalitativno otkrivanje i identifiaciju Bence Jones proteina, monoklonskih slobodnih lakih
kapa ili lambda lanaca u humanom urinu ili serumu, elektroforetskom imunofiksacijom. Detekcija Bence Jones protein služi kao kvalitativna pomoć u
identifikaciji monoklonskih gamapatija.
Svaki agarozni gel u pakovanju HYDRAGEL BENCE JONES K20 namenjen je za testiranje jednog uzorka.
Za in vitro dijagnostičku primenu.
PRINCIP TESTA
Prisustvo patoloških zona u elektroforegramu seruma i urina, prvenstveno u beta i gama globulinskim zonama, uvek pobudjuju sumnju na monoklonski
protein (M-proteini, paraproteini, monoklonalski imunoglobulini) i monoklonsku gamapatiju. Da bi se identifikovale te patološke zone, primenjuje se
tehnika imunofiksacije.
Imunofiksacijska elektroforeza je jednostavna tehnika koja omogućava proteinu da se nakon elektroforeze fiksira, in situ, stvaranjem kompleksa sa
svojim antitelom. Jednostavna je za izvodjenje (u četiri koraka) i za tumačenje.
Bence Jones protein test izvodi se pomoću poluautomatskog sistema HYDRASYS koji izvršava sve radnje potrebne da se gel pripremi za tumačenje
:
1. Elektroforeza uzoraka odvija se istovremeno na 6 traka na alkalno puferovanom agaroznom gelu.
2. Posle elektroforeze, jedna traka (ELP) služi kao referentna koja pokazuje elektroforetski raspored proteina u uzorku. Ostalih pet traka su
imunofiksirane odgovarajućim antiserumima : trovalentni anti-teški lanci (gama, alfa i mu), anti-kapa slobodni i vezani laki lanci, anti-lambda
slobodni i vezani laki lanci, anti-kapa slobodni laki lanci i anti-lambda slobodni laki lanci.
3. Proteini koji se nisu istaložili, uklanjaju se s gela blotingom i ispiranjem. Talog kompleksa antigen-antitelo smešten je u matrici gela.
4. Precipitirani proteini vizuelizuju se bojenjem acidvioletom. Višak boje odstranjuje se kiselim rastvorom.
Imunoprecipitirane trake porede se s odgovarajućim abnormalnim trakama iz elektroforetskog uzorka i identifikuju reakcijom ili njenim izostankom
pomoću pojedinačnih antiseruma.
Ova jednostavna i brza tehnika daje jasne slike, koje se lako tumače.
REAGENSI I MATERIJALI ISPORUČENI U HYDRAGEL BENCE JONES K20 PAKOVANJU
UPOZORENJE : Pogledajte listove sa bezbednosnim podacima.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
PROIZVODI
Agrozni gelovi (spremni za upotrebu)
Tris-barbituratni Pufer (koncentrovan)
Boja Acidviolet (koncentrovana)
Rastvor za odbojavanje (koncentrovan)
Aplikatori 6 zubaca (spremni za upotrebu)
Filter papiri tanki
Filter papiri češljasti
Filter papiri debeli
3038
| KAT.10 BR.
|
gelova
|
|
| 3 bočice, 75 mL svaka |
| 1 bočica, 75 mL |
| 1 bočica, 100 mL |
| 1 pakovanje od 10 |
| 1 pakovanje od 10 |
| 1 pakovanje od 10 |
| 2 pakovanja po 10 |
NAPOMENA : Rastvor za fiksaciju i antiserumi naručuju se odvojeno od pakovanja (Vidi POTREBNI REAGENSI, kOjI NISu ISPORučENI).
ZA OPTIMALNE REZuLTATE :
Svi reagensi iz istog pakovanja moraju se koristiti zajedno i prema uputstvu za upotrebu.
PAŽLjIVO PROčITATI uPuTSTVO ZA uPOTREBu!
1. AGAROZNI GELOVI
Priprema
Agaroza gelovi su spremni za upotrebu. Svaki gel sadrži : agarozu ; rastvor pufera pH 9,2 ± 0,5 ; aditive, nisu opasni u koncetracijama primenjenim
za dobijanje optimalne performanse.
Upotreba
Kao podloga za elektroforezu i imunofiksaciju proteina.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Gelove čuvati u horizontalnom položaju u originalnim zaštitnim pakovanjima, na sobnoj temperaturi (15 – 30 °C) ili u frižideru (2 – 8 °C).
Stabilni su do datuma naznačenom na pakovanju i na nalepnicama pakovanja svakog gela. (Strelica na prednjem delu kutije gela mora biti okrenuta
nagore.) Izbegavati promene temperature prilikom čuvanja i držanje u blizini prozora ili izvora toplote.
NE ZAMRZAVATI!
Baciti ako :
(I) se na površini gela pojave kristali, talog ili tekstura gela postane vrlo mekana (kao posledica zamrzavanja) ;
(II) je vidljiv porast bakterija ili gljivica ;
(III) se u kutiji gela nalazi velika količina tečnosti (rezultat isticanja pufera iz gela zbog loših uslova čuvanja).
- 85 -
SEBIA UPUTSTVO ZA UPOTREBU - Srpski
HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
2. TRIS-BARBITURATNI PUFER
Priprema
Svaka bočica nerazblaženog rastvora pufera treba razblažiti do 1 litar sa destilovanom ili dejonizovanom vodom.
Nakon razblaživanja, radni rastvor sadrži : rastvor pufera pH 9,2 ± 0,5.
Upotreba
Elektroforetski pufer.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Koncentrovan rastvor pufera čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Koncentrovan rastvor stabilan je nekoliko godina, najmanje do roka trajanja
označenog na pakovanju ili na nalepnicama na bočicama. Razblažen rastvor pufera stabilan je godinu dana na sobnoj temperaturi u zatvorenoj boci.
Baciti razblaženi rastvor pufera ako se pojavi zamućenje izazvano mikrobiološkom kontaminacijom.
3. BOJA ACIDVIOLET
Priprema
Bočicu sa nerazblaženim koncentrovanim rastvorom za violet bojenje treba razblažiti sa do 300 mL destilovane ili dejonizovane vode.
Nakon razblaživanja, radni rastvor za bojenje sadrži : kiseli rastvor pH ≈ 2 ; kiselo violet ; etilen glikol ; aditive, bezopasne u primenjenim
koncetracijama, neophodne za optimalnu performansu.
Upotreba
Za bojenje gelova posle razdvajanja elektroforezom.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Koncentrovan i radni rastvor čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru, u zatvorenoj boci da bi se izbeglo isparavanje. Koncentrovan rastvor za bojenje
stabilan je do isteka roka trajanja na pakovanju ili na nalepnici bočice s bojom.
Radni rastvor za bojenje stabilan je 6 meseci.
4. RASTVOR ZA ODBOJAVANJE
Priprema
Svaka bočica koncentrovanog rastvora za odbojavanje (SEBIA, kat. br. 4540, 10 bočica, svaka od 100 mL) razblažuje se destilovanom ili
dejonizovanom vodom do zapremine od 100 litara. Praktično je razblažiti 1 mL koncentrovanog rastvora s 1 litra destilovane vode (odgovara zapremini
boce u kojoj je rastvor za odbojavanje).
Nakon razblaživanja, radni rastvor za odbojavanje sadrži kiseli rastvor pH ≈ 2.
Upotreba
Za uklanjanje viška boje ili pozadinskog obojenja sa gelova.
Za neutralizaciju kiselog rastvora za uklanjanje boje, u praznu bocu za otpad, sipati 15 mL 50 % rastvora natrijum hidroksida.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Koncentrovan rastvor za odbojavanje čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Stabilan je do datuma isteka roka trajanja na pakovanju ili na nalepnici
bočice s rastvorom.
NE ZAMRZAVATI!
Radni rastvor za odbojavanje stabilan je nedelju dana na sobnoj temperaturi u zatvorenoj bočici.
Ne dodavati natrijum azid!
Baciti ako se pojave znaci propadanja, npr. zamuti se zbog mikrobiološke kontaminacije.
Da biste sprečili razvoj mikroba u razblaženom rastvoru za odbojavanje koji se čuva duže od jedne nedelje, dodati 5 µL/dL od ProClin 300 ili CLEAN
PROTECT (SEBIA, PN 2059, 1 bočica od 5 mL).
Pogledati uputstvo za upotrebu za CLEAN PROTECT.
Radni rastvor za odbojavanje sa dodatim ProClin ili CLEAN PROTECT stabilan je u zatvorenoj boci na sobnoj temperaturi ili u frižideru do datuma
isteka roka trajanja označenog na pakovanju ili na nalepnici bočice sa rastvorom za odbojavanje.
5. APLIKATORI
Upotreba
Pojedinačni aplikatori za jednokratnu upotrebu za nanošenje uzoraka.
Čuvanje
Aplikatore čuvati na suvom mestu, na sobnoj temperaturi ili u frižideru.
6. FILTER PAPIRI TANKI
Upotreba
Pojedinačni, tanki apsorbujući papirni jastučići za upijanje viška tečnosti s površine gela pre nanošenja uzorka.
Čuvanje
Čuvati na suvom mestu, na sobnoj temperaturi ili u frižideru.
7. FILTER PAPER ČEŠLJASTI
Upotreba
Prethodno pripremljeni, pojedinačni debeli apsorbujući papirni češljići za upijanje viška rastvora fiksativa i antiseruma s površine gela posle
imunofiksacije.
8. FILTER PAPIRI DEBELI
Upotreba
Pojedinačni, debeli papirni jastučići za upijanje neprecipitiranih proteina s gela posle imunofiksacije.
Čuvanje
Čuvati na suvom mestu, na sobnoj temperaturi ili u frižideru.
- 86 -
HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
REAGENSI KOJI SU POTREBNI ALI NISU PRILOŽENI
UPOZORENJE : Pogledajte listove sa bezbednosnim podacima.
1. PAKOVANJE ANTISERUMA I RASTVORA ZA FIKSACIJU
Pakovanje antiseruma i rastvora za fiksaciju, GAM, K, L za imunofiksaciju sa standardnom maskom, SEBIA, kat. br. 4835, sadrži 3 bočice antiseruma
(anti-gama, alfa, mu teških lanaca, anti-kapa slobodnih i vezanih lakih lanaca i anti-lambda slobodnih i vezanih lakih lanaca), svaka po 1 mL, i 1 bočica
rastvora za fiksaciju od 2,5 mL. One su specifične za imunofiksaciju sa 1 BENCE JONES maskom, SEBIA.
1.1. ANTISERUMI
Priprema
Spreman za upotrebu. Svi antiserumi su ukupni anti-humani imunoglobulini sisara. Za lakšu identifikaciju i kao pomoć za praćenje njegove aplikacije,
antiserum je obojen različitim neškodljivim bojama. Boja nalepnica na bočicama odgovara boji antiseruma. Kada se antiserum lagano zamuti, ostaviti
bočicu antiseruma na sobnoj temperaturi, najmanje 10 minuta. Za to vreme, rastvor će se razbistriti. Ako se zamućenje ipak zadrži, ono ne bi trebalo
da utiče na imunološku reakciju.
Upotreba
Za imunofiksaciju elektroforeziranih proteina.
NAPOMENA : Antiserum je specifičan za imunofiksaciju sa 1 BENCE jONES maskom, SEBIA.
Antiserumi mogu biti poreklom od različitih životinjskih vrsta. Ne mešati dve različite bočice antiseruma, čak ni kada imaju iste specifičnosti i UVEK
promenite nastavak na pipeti kada menjate bočicu s antiserumom.
VAŽNO : Da bi se izbegla kontaminacija izmedju reagensa, posle svake upotrebe, vratiti zatvarač na odgovarajuću bočicu.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Antiserum čuvati u frižideru (2 – 8 °C). Stabilan je do isteka roka trajanja naznačenog na pakovanju ili na nalepnici bočice antiseruma. Baciti ako
promeni izgled, npr. zamuti se zbog kontaminacije mikrobima.
NAPOMENA : Antiserum se tokom transporta može čuvati 15 dana van frižidera, na temperaturi od 15 do 30 °C, bez negativnih posledica na izvodjenje
testa.
1.2 FIKSATIV
Priprema
Rastvor fiksativa spreman je za upotrebu. On sadrži : kiseli rastvor pH ≈ 2 ; aditive, koji nisu opasni u koncetracijama primenjenim, neophodnim za
dobijanje optimalne performanse.
Fiksativ je obojen neškodljivom bojom za lakšu identifikaciju i kao pomoć u toku njegove primene.
Upotreba
Za fiksiranje razdvojenih proteina u referentnoj traci (ELP).
NAPOMENA : Fiksativ je specifičan za imunofiksaciju sa 1 BENCE jONES maskom, SEBIA.
VAŽNO : Kako bi izbegla kontaminacija izmedju reagensa, nakon svake upotrebe, vratiti zatvarač na odgovarajuću bočicu.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Fiksativ čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Stabilan je do roka upotrebe naznačenog na pakovanju ili nalepnici bočice fiksativa. Fiksativ ne
sme da sadrži talog.
2. PAKOVANJE ANTISERUMA SLOBODNIH LAKIH LANACA
Pakovanje antiseruma, anti-kapa slobodni laki lanac i anti-lambda slobodni laki lanac za imunofiksaciju sa standardnom maskom, SEBIA, kat. br. 4836,
sadrži dve bočice antiseruma po 1 mL. One su specifične za imunofiksaciju sa 1 BENCE JONES maskom, SEBIA.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja : Vidi prethodni paragraf 1.1.
3. FIZIOLOŠKI RASTVOR
Priprema
Pripremiti 0,15 M rastvra (0,9 g/dL) natrijum hlorida u destilovanoj ili dejonizovanoj vodi.
Upotreba
Za razblaživanje uzoraka, ukoliko je to potrebno.
Za ispiranje gelova posle inkubacije s rastvorom za fiksaciju i antiserumom.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Fiziološki rastvor čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Baciti posle 3 meseca ako promeni izgled npr. zamuti se zbog mikrobne kontaminacije.
Za duže čuvanje, dodati 0,1 g/dL natrijum azida.
NAPOMENE :
Probe koje su izvršene za validaciju reagenasa pokazale su da, za različite rastvore i upotrebom prilagođene opreme za zapreminu rekonstitucije,
varijacija od ± 5 % na krajnju zapreminu nema neželjenih efekata na analizu.
u destilovanoj ili dejonizovanoj vodi koja je upotrebljena za razblaživanje rastvora, ne sme da rayvijaju bakterije ili buđ (upotrebite filter ≤ 0,45 µm) i
treba da imate otpornost veću od 10 megaoma x cm.
POTREBNA OPREMA I PRIBOR, NISU ISPORUČENI U PAKOVANJU
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Ispravljač : MG 300 SEBIA, kat. br. 1302 ili MG 500 SEBIA, kat. br. 1303.
HYDRAGEL K20 APLIKATOR SEBIA, kat. br. 1409, sadrži HYDRAGEL K20 nosač aplikatora i šablon za aplikaciju reagensa 1 BENCE JONES.
Vlažna komora, kat. br. 1270.
Kadica za elektroforezu : K20 SEBIA, kat. br. 1400.
Posude i držači gelova za obradu ploča s gelom : HYDRAGEL K20 pomoćno pakovanje SEBIA, kat. br. 1420.
Pipete : 10 µL, 20 µL, 100 µL i 200 µL.
Inkubator-sušilica, IS 80 SEBIA, kat. br. 1430.
- 87 -
HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
UZORCI ZA ANALIZU
Prikupljanje uzoraka i čuvanje
Analiza se sprovodi pre svega na sveže prikupljenom urinu u periodu od 24 sata (kada to nije moguće, proporučuje se analiza uzoraka urina
prikupljenog od prvog ili drugom mlaza ujutru). Uzorci urina moraju biti prikupljeni prema ustanovljenim procedurama koje se koriste u kliničkom
laboratorijskom testiranju.
Uzorci mogu da se čuvaju u frižideru do jedne nedelje između 2 i 8 °C.
Za duže periode čuvanja:
• Bez dodataka sredstava zaštite, proporučuje se čuvanje uzoraka urina zamrznutih na - 70 °C.
• Sa sredstvima zaštite, uzorci urina mogu da se zamrznu na - 20 °C. Zamrzavanje sa HEPES 0,1 M (pH 6,75) i / ili natrijum azid, 0,02 g/dL poboljšava
stabilnost čuvanja.
Zamrznuti uzorci su stabilni najmanje jedan mesec.
Odmrznuti ili uzorci koji nisu pravilno čuvani mogu da imaju oznaku na mestu aplikacije zbog propadanja proteina, i ako su prisutni imunoglobulini,
fragmenti teških lanaca anodne pokretljivosti (u alfa 2 ili beta zonama) bez odgovarajućih teških lanaca.
VAŽNO: Izbegavajte bornu kiselinu kao sredstvo zaštite.
NAPOMENA: uzorci urina ne treba da se čuvaju na sobnoj temperaturi!
• Ako se analizira serum, on mora da se sakuplja prema već ustanovljenim laboratorijskim procedurama.
Ako je potrebno, čuvati u frižideru na 2 – 8 °C nedelju dana. Za duži period čuvanja, zamrznuti uzorke. Zamrznuti serumi stabilni su najmanje mesec
dana. Odmrznuti uzorci mogu imati blage mrlje na mestu aplikacije zbog denaturacije proteina ili lipoproteina.
Priprema uzoraka
urini
Analiziraju se nekoncentrisani urini. Detekcioni nivo Bence Jones proteina je oko 1 - 5 mg/dL. Urine ukoncentrsati ako to zahteva laboratorijska
procedura ili ako se traži veća osetljivost. Po pravilu, dovoljno je 20 - 100 puta koncentrisati.
NAPOMENA : Difuzija uzoraka urina u nastavak aplikacije mogu biti sprečeni kada je urin (čisti ili koncentrovan) zamućen. u tom slučaju preporučuje
se centrifugiranje (Sledite uobičajene preporuke o predanalitičkoj fazi koje se primenjuju na analizu uzoraka urina) ili filtracija (npr. filter s veličinom
pora 0,45 µL).
Serumi
Uz urin, na Bence Jones protein gelu može da se testira i serum pacijenta. Razblažiti serum u fiziološkom rastvoru ili u diluentu za imunofiksaciju,
prethodno razblaženim u odnosu 1/4 (1 deo diluenta, 3 dela destilovane ili dejonizovane vode) : 1/10 za ELP, GAM, K i L trake (1 deo serum, 9 dela
razblaženog diluenta ili fiziološki rastvor) i 1/3 (1 deo serum, 2 dela razblaženi diluent ili fiziološki rastvor) za Kf i Lf trake.
NAPOMENA : Ako je nivo ukupnih imunoglobulina < 0,5 g/dL, koristiti manje razblaženje uzorka.u fiziološkom rastvoru ili u diluentu za imunofiksaciju
pripremljenom kako sledi : 1 deo diluenta, 3 dela destilovane i dejonizovane vode. Npr. razblažiti 1/5 seruma za ELP, GAM, k i L trake (1 deo seruma,
4 dela razblaženog diluenta ili fiziološkog rastvora) i 1/2 (1 deo seruma, 1 deo razblaženog diluenta ili fiziološkog rastvora) za kf i Lf trake.
Za Ig D i/ili Ig E analizu, primeniti isto razblaženje kao za kapa i lambda slobodne i vezane lake lance.
VAŽNO :
• Ne koristiti uzorke plazme. Fibrinogen daje traku u referentnoj traci, blizu mesta aplikacije, što može da se tumači kao monoklonski protein.
• Neki urini imaju visok sadržaj soli. To može da dovede do deformacije gela za vreme migracije i kao posledicu poremećaj slike migracije. Ako takav
poremećaj učini tumačenje nepouzdanim, treba uraditi dijalizu urina da se odstrani so.
• Zbog bakterijske kontaminacije imunoglobulin (paraprotein) prisutan u urinu može da podlegne proteolizi.
To može da izazove pozitivnu reakciju s antiserumom sloodnih lakih lanaca. U tom slučaju, serumski paraprotein koji se eliminiše urinom može da
da monoklonsku traku sa trovalentnim antiserumom i s jednim tipom antiseruma anti slobodnim i vezanim lakim lancima i s odgovarajućim
antiserumima anti slobodni lakih lanaca.
• Polimerizacija Bence Jones proteina smanjuje osetljivost detekcije s antiserumima anti slobodnih lakih lanaca, jer polimerizacija može da blokira
epitope koji normalno reaguju s antiserumima anti slobodnih lanaca.
• Kada se ništa ne otkrije a posumnja se na Bence Jones proteine, izvršite depolimerizaciju pre elektroforeze : pomešajte 100 µL urina sa 5 µL
beta-merkaptoetanola razblaženog u odnosu 1:10 sa slanom ili destilovanom ili dejonizovanom vodom i ubacite aplikator.
NAPOMENA : Epruvete za sakupljanje i parametri centrifugiranja za biološke uzorke opisani su u dostupnoj dokumentaciji za predanalitičku fazu
biomedicinske analize (podaci koje obezbeđuju proizvođači epruveta, uputstva i preporuke o sakupljanju bioloških uzoraka…). ukoliko nema nikakvih
indikacija o tipu epruveta koje treba koristiti ili o centrifugiranju u uputstvu za upotrebu, pogledajte ovu dokumentaciju, a za dimenzije epruveta koje
treba koristiti, pogledajte SEBIA dokument "Characteristics of tubes to use according to the instrument" (karakteristike epruveta koje treba koristiti u
skladu sa instrumentom). Predanalitička faza mora da se izvodi u skladu sa najnovijim, različitim preporukama, uključujući one koje obezbeđuju
proizvođači epruveta, kao i primenjivim propisima.
POSTUPAK
I. MIGRACIJA
1.
2.
3.
4.
Staviti HYDRAGEL K20 nosač aplikatora na ravnu površinu i podići deo nosača s numerisanim oznakama.
Sipati 120 µL destilovane ili dejonizovane vode u donju trećinu ucrtanog rama na HYDRAGEL K20 nosaču aplikatora.
Raspakovati HYDRAGEL agaroznu ploču s gelom.
Brzo i ravnomerno staviti filter papir na površinu gela da upije višak tečnosti. Odmah sklokniti papir.
PAŽNJA : Ne ostavljati filter papir predugo na površini gela da ne bi došlo do dehidracije.
5. Staviti ploču s gelom (gel okrenut nagore) na uglove naznačene na dnu okvira.
6. Saviti gel i polako ga spustiti na vodenu površinu. Voditi računa da se ne stvaraju mehurići, da voda prekriva celu ploču s gelom i da je gel
poravnat s ucrtanim ramom.
7. Spustiti nosač aplikatora tako da su numerisane oznake u srednjem, a prekidač u gornjem položaju.
8. Staviti jedan aplikator na ravnu podlogu s brojevima jažica u gornjoj desnoj poziciji.
- 88 -
HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
9. Dodati 10 µL pravilno razblaženog seruma u jažice aplikatora kako sledi. Aplikator napuniti za 2 minuta.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
IMUNOFIKSACIONA TRAKA
ELP
GAM
K
L
Kf
Lf
|
|
|
|
|
|
|
BROJ JAŽICE
1
2
3
4
5
6
- Aplikator upotrebiti bez odlaganja
- Za kasniju upotrebu (najduže 8 sati), aplikator staviti u vlažnu komoru sa zupcima okrenutim nagore (koristiti plastični zaštitni ram), a celu
komoru držati u frižideru. Ploču s gelom namestiti na HYDRAGEL K20 nosač aplikatora neposredno pre upotrebe.
Za detaljnije informacije pogledati uputstvo za Vlažnu komoru.
10. Skinuti zaštitni ram sa zubaca aplikatora.
11. Postaviti aplikator u poziciju 6 nosača.
VAŽNO : Brojevi na aplikatorima moraju biti okrenuti prema operateru.
12. Spustiti nosač aplikatora s prekidačem tako da dodje u kontakt s površinom gela. NE GURATI NOSAČE DOLE DO KRAJA.
13. Posle 5 minuta, uključiti prekidač da bi se aplikator podigao a zatim aplikator skloniti i baciti.
14. Staviti gel u odgovarajuću elektroforetsku komoru prema polaritetu naznačenom na gelu, donju stranu gela na katodnu stranu. Pri korišćenju
komore SEBIA K20, staviti HYDRAGEL na most tako da je strana s gelom okrenuta nadole. Gel treba da uroni u pufer oko 1 cm sa svake
strane.
Za detaljnije informacije videti uputstvo za upotrebu za k20 komoru.
15. Uključiti kadicu u izvor struje.
|
|
|
|
|
|
USLOVI MIGRACIJE
Zapremina pufera po odeljku
Ukupna zapremina pufera
Vreme migracije
Konstanti napon
Početna jačina struje (po gelu)
16. Posle migracije, isključiti kadicu i skloniti ploču s gelom.
II. IMUNOFIKSACIJA
|
|
|
|
|
|
SEBIA K20
150 mL
300 mL
20 minuta
100 V
16 ± 3 mA
|
|
|
|
|
|
1.
2.
3.
4.
Postaviti HYDRAGEL K20 nosač aplikatora na ravnu podlogu.
Sipati 120 µL destilovane ili dejonizovane vode u donju trećinu ucrtanog rama na HYDRAGEL K20 nosaču aplikatora.
Staviti ploču s gelom (gel okrenut nagore) na uglove naznačene na dnu okvira.
Saviti gel i polako ga spustiti na vodenu površinu. Voditi računa da se ne stvaraju mehurići, da voda prekriva celu ploču s gelom i da je gel
poravnat s ucrtanim ramom.
5. Namestiti šablon aplikacionog reagensa 1 BENCE JONES na sledeći način :
- Postaviti vodič aplikacionog šablona na kukice.
- Držati šablon pomoću nastavaka i spustite ga na gel.
- Žlebovi šablona moraju biti savršeno poravnati s otiscima zubaca aplikatora na levoj strani gela.
6. Dodati reagense sledećim redom :
|
|
|
|
|
|
|
ŽLEB
ELP
GAM
K
L
Kf
Lf
|
|
|
|
|
|
|
ZAPREMINA (µL)
40
25
25
25
25
25
|
|
|
|
|
|
|
REAGENS
Rastvor za fiksaciju
Trovalentni antiserum
Antiserum anti-kappa lakih lanaca (slobodni i vezani)
Antiserum anti-lambda lakih lanaca (slobodni i vezani)
Antiserum anti-kappa slobodni lakih lanaca
Antiserum anti-lambda slobodni lakih lanaca
|
|
|
|
|
|
|
žuta
ljubičasta
zelena
plava
narandžasta
crvena
NAPOMENA : Da bi se izbeglo mešanje, boja reagensa na nalepnici bočice odgovara boji na jažicama aplikacionog šablona.
- uvući reagens bez stvaranja mehurića u vršku pipete.
- Dodati reagens.
- Držati pipetu vertikalno, a njen vrh polako spustiti na dno jažice.
- Injektirati reagens tako da se proširi po udubljenjima, ali bez stvaranja mehurića.
7. Inkubirati na sobnoj temperaturi oko 10 minuta.
III. UKLANJANJE REAGENSA
BOJA
|
|
|
|
|
|
|
1. Ukloniti višak reagensa češljastim filter-papirom.
2. Ukloniti reagens za 30 sekundi.
- Staviti svaki češljić pod uglom od 30° u proreze na donjem kraju šablonskog žleba tako da zupci dodiruju vertikalnu stranu od operatoera.
- Dopustiti da zupci češljića, nagnutog pod uglom od 45°, lagano dodiruju tečnost.
VAŽNO : Svaki češljić mora ostati nakrivljen (45°). Ako je postavljen ravno, može oštetiti gel.
- 89 -
HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
IV. UKLANJANJE NENATALOŽENIH PROTEINA
1. Ukloniti češljiće.
2. Proveriti da li je reagens dobro apsorbovan što je indicirano sledećim :
- odsustvo reagensa na gelu.
- čitava dužina zubaca je obojena.
Ako je apsorpcija reagensa nekompletna, ponovo upotrebit isti češljasti filter-papir (u istom položaju) i ponoviti ručno proces uklanjanja.
3. Uhvatiti aplikacioni šablon reagensa za držak, podići ga i skloniti.
4. Postaviti debeli filter-papir na gel na 4 minuta. Filter-papir mora biti ujednačen u kontaktu s gelom.
VAŽNO : Lagano pritisnuti celu površinu filter-papira da bi se omogućilo njegovo savršeno prianjanje na gel.
Skloniti filter-papir. Gel 5 minuta prati u vertikalnom položaju fiziološkim rastvorom. Gel postaviti tako da ELP traka bude na dnu držača gela.
Postaviti gel na ravnu podlogu.
Staviti novi debeli filter-papir na gel tako da bude ujednačen u kontaktu s gelom.
Gel sušiti u inkubator-sušilici na 80 °C (oko 7 minuta) sve dok se filter-papir potpuno ne osuši, ili bez inkubator-sušilice, tako da filter-papir
5 minuta bude u ujednačenom kontaktu s gelom, a zatim gel potpuno osušiti toplim vazduhom.
9. Očistite šablon za apliciranje malom četkom (npr. četkicom za zube) pomoću procedure koja je navedena u "PROCEDURA ZA ČIŠĆENJE
MASKE".
Pre ponovne upotrebe proverite da li je šablon potpuno suv ; uklonite kapljice iz bunarčića tapkanjem mekim papirom.
5.
6.
7.
8.
V. BOJENJE I ODBOJAVANJE
1.
2.
3.
4.
Posle sušenja, potpuno osušen gel 3 minuta u vertikalnom položaju uroniti u fiziološki rastvor.
Vertikalno, 4 minuta uroniti gel u rastvor za bojanje.
Boju ukloniti u tri uzastopne kadice s rastvorom za uklanjanje boje sve dok pozadina ne postane potpuno bezbojna i čista.
Gel sušiti toplim vazduhom na 80 °C. Ako je potrebno, mokrim mekanim papirom očistiti zadnju (potpornu) stranu.
KONTROLA KVALITETA
Preporučuje se aktiviranje ispitanog kontrolnog seruma (kao što je IT / IF Control, SEBIA PN 4788) nakon svake promene serije reagensa.
NAPOMENA : Ako je potrebno, Normal Control Serum (Normalni kontrolni serum), SEBIA, PN 4785, može se koristiti kao negativna kontrola.
REZULTATI
Tumačenje rezultata
Prisustvo Bence Jones proteina u urinu karakteriše :
- monoklonska traka otkrivena s jednim od antiseruma anti-slobodnih i vezanih lakih lanaca kapa ili lambda (trake K ili L),
- ista monoklonska traka otkrivena odgovarajućim antiserumima anti slobodnih lakih lanaca (trake Kf ili Lf),
- nema reakcije s trovalentnim antiserumom (traka GAM).
Zbog razlika u osetljivosti antiseruma (antiserumi u odnosu na slobodne i vezane lake lance su osetljiviji za razliku od antiseruma u odnosu na
slobodne lake lance), prisustvo Bence Jones proteina u urinu se takođe karakteriše sa :
- monoklonalni lanac detektovan jednim od anti-slobodnih i vezanih lakih lanaca kappa ili lambda antiseruma, (K ili L trake),
- nema reakcije sa odgovarajućim anti-slobodnim lakim lancem antiseruma (Kf ili Lf trake),
- nema reakcije sa trivalentnim antiserumom (GAM traka).
Serum treba prethodno da se analizira da bi se isključilo prisustvo Ig D ili Ig E. Da bi se to potvrdilo, uzorak urina takođe mora da se analizira nakon
koncentracije.
Serumski paraprotein u urinu bez Bence Jones proteina karakteriše :
- jedna monoklonska traka otkrivena trovalentnim antiserumom,
- ista traka otkrivena s jednim antiserumom anti slobodnih i vezanih lakih lanaca i,
- nema reakcije s odgovarajućim antiserumom anti slobodnih lakih lanaca.
Serumski paraprotein u urinu udružen s Bence Jones proteinom karakteriše :
- jedna monoklonska traka otkrivena trovalentnim antiserumom,
- ista traka otkrivena s jednim antiserumom za anti slobodne i vezane lake lanace,
- jedna monoklonalna traka otkrivena s jednim antiserumom anti slobodnih i vezanih lakih lanaca. Ova traka najčešće ne migrira na istom nivou kao
ona otkrivena s trovalentnim antiserumom,
- ista traka otkrivena s jednim od antiseruma protiv slobodnih lakih lanaca.
- U retkim slučajevima, dve trake migriraju zajedno (ali, obojenost trake lakog lanca jača je nego u GAM traci).
Polimerizovani oblici Bence Jones proteina karakteristični su po :
- izostanku reakcije s trovalentnim antiserumom,
- nekoliko traka otkriveno je s jednim antiserumom protiv slobodnih i vezanih lakih lanaca,
- iste trake mogu da se otkriju odgovarajućim antiserumom slobodnih lakih lanaca.
Ograničenja postupka
Upotreba drugih antiseruma osim onih specičnih za postupak imunofiksacije s dinamičnom maskom, može imati uticaj na rezultate testa.
Moguće je da, zbog ograničenja rezolucije i osetljivosti zona elektroforeze, neke monoklonske komponente ne budu otkrivene ovom metodom.
Problemi u radu
Ukoliko se pojavi problem s testom, a priprema i čuvanje materijala kao i sam postupak testa izvedeni su prema propisu, pozvati tehničku službu
dobavljača.
Dokumentacija o sigurnosti pakovanja reagenasa i informacije o rešavanju otpada dostupne su kod tehničke službe dobavljača.
- 90 -
HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
PODACI O IZVODJENJU
Korišćeni su standardni materijali, priprema uzorka i standardni postupak. Svi elektroforegrami su tumačeni vizuelno.
Reproducubilnost unutar gela i specifičnost
Reproducibilnost unutar gela prikazana je na tri različita uzorka : normalni serumski uzorak, uzorak urina sa slobodnim kapa lakim lancima i uzorak
urina sa slobodnim lambda lakim lancima. Posle elektroforetske separacije proteina uzoraka, rastvor za fiksaciju se koristi za sve trake svakog
HYDRAGEL 1 BENCE JONES iz iste serije i gelovi se boje s acidviolet bojom (četiri gela za serumski uzorak i dva gela za svaki uzorak urina).
Sve trake na četiri gela dale su isti rezultat pokazujući tipičan primer koji se očekuje kod normalnog seruma ; monoklonska traka nije detektovana s
rastvorom fiksativa. Za svaki patološki uzorak urina, sve trake na dva gela dale su identičan rezultat, očekivan za tipove uzorka ; jedna monoklonska
traka sa fiksativom za svaki uzorak urina.
Reproducibilnost izmedju gelova i specifičnost
Reproducibilnost izmedju gelova pokazana je na 3 različita patološka uzorka (jedan serumski uzorak sa dve monoklonske komponente Ig G kapa i
Ig G lambda, jedan uzorak urina sa slobodnim kapa lakim lancima i jedan uzorak urina sa slobodnim lambda lakim lancima). Svi uzorci su obradjeni
procedurom HYDRAGEL BENCE JONES K20 na tri gela iz iste serije.
Svi testirani uzorci dali su iste rezultate na svakom gelu, tipične za analizirane uzorke Dve monoklonske trake utvrdjene su imunofiksacijom serumskog
uzorka po jedna traka za svaki urin i to na slobodnom lakom lanacu.
Rezultati dobijeni postupkom HYDRAGEL BENCE JONES K20 pokazuju dobru reproducibilnost sa svih testiranih aspekata. Ne postoji nikakva vidljiva
razlika tokom ponavljanja testova.
Pouzdanost
Dvadeset pet (25) patoloških uzoraka urina (dvadeset četiri uzorka urina sa slobodnim kapa i lambda lakim lancima) i šesnaest (16) patoloških
serumskih uzoraka (12 serumskih uzoraka sa slobodnim kapa ili lambda lakim lancima) obradjeni su i drugim komercijalno dostupnim sistemima
imunofiksacije na agaroznom gelu. Rezultati dobijeni sa dve procedure su bili isti i iste trake uočene su kod svih patoloških uzoraka sa svakim
sistemom.
Osetljivost
Detekcijski limit za Bence Jones protein odredjen je serijskim razblaženjem patoloških uzoraka i iznosi 1 - 4 mg/dL za uzorke urina i 4 - 10 mg/dL za
serumske uzorke postupcima HYDRAGEL BENCE JONES K20.
- 91 -
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY
HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
Pour des informations complémentaires sur l'interprétation des profils obtenus par immunofixation, voir 1. et 2.:
For additional information on interpretation of immunofixation patterns refer to 1. and 2.:
1. Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
2. Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,
2nd ed., 1994, 397 pp.
3. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage, sensibilité, spécificité.
Impact-Internat, 1986, Sept : 93-97.
4. JB Oudart et al (2014) Place des explorations urinaires dans le diagnostic et le suivi des gammapathies monoclonales en pratique quotidienne.
Ann. Biol. Clin., 72 (2) : 147 – 152.
- 143 -
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 1
HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
Figure 2
1 2
3 4
5 6
7
Figure 3
Figure 4
1 2
3 4
5 6
7
1 2 3
4 5 6
7
7
5 6
3 4
1 2
Figure 5
Figure 6
- 144 -
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 7
Figure 8
- 145 -
HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
Download

HYDRAGEL BENCE JONES K20