HYDRAGEL IF Penta K20
Ref. 3037
Masque standard / Standard mask
2014/03
HYDRAGEL IF Penta K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
PouŽÍtÍ KÍtu
HYDRAGEL IF Penta K20 kit je určen k detekci monoklonálních proteinů v lidském séru pomocí imunofixační elektroforézy na alkalicky pufrovaných
(pH 9.2) agarózových gelech. Po elektroforetickém rozdělení sérových proteinů a jejich následné imunofixaci pentavalentním antisérem proti těžkým
řetězcům anti-gama, anti-alfa a anti-mu volným i vázaným lehkým řetězcům anti-kappa a lambda jsou tyto precipitované proteiny barveny amidočerní.
Přebytek barvy je odstraněn kyselým roztokem.
Každý gel je určen pro analýzu 3 vzorků.
Pouze pro diagnostické použití in vitro.
PRINCIP tEStu
Výskyt abnormálních proužků s pohyblivostí gama, ale také alfa a beta (mohou být skryty v odpovídajících zónách za proteiny běžně se zde
vyskytujícími), je vždy podezřelý. Je nutno vyloučit monoklonální proteiny a tím příp. gamapatie. K identifikaci se používá technika imunofixace.
Elektroforéza doplněná imunofixací je jednoduchou technikou, jež umožňuje zafixování stanovovaných proteinů v nosiči tím, že se vytvoří nerozpustný
komplex s příslušnou protilátkou. Probíhá ve čtyřech stupních :
1. Separace proteinů elektroforézou na agarózovém gelu.
2. Fixace a imunoprecipitace rozdělených proteinů : Fixační roztok a antisérum nanášené přímo na povrch gelu difundují do gelu a precipitují všechny
proteiny – odpovídající antigeny.
3. Rozpustné nezprecipitované proteiny jsou odsátím a vymytím z gelu odstraněny. Precipitát komplexu protilátky s antigenem zůstává zachycen v
gelové matrici.
4. Precipitované proteiny jsou vizualizovány barvením. Proužky imunoprecipitátů jsou porovnány s odpovídajícími abnormálními proužky na
elfogramu testovaného vzorku.
Elektroforéza vzorků probíhá simultánně ve 2 stopách. Po rozdělení je pro porovnání použita stopa ELP. Imunofixační stopa (Penta) ukazuje
monoklonální komponenty, které reagovaly s pentavalentním antisérem.
Technika poskytuje jasné a lehce interpretovatelné výsledky.
REAGENCIE A MAtERIÁL oBSAŽENÝ V KItu HYDRAGEL IF Penta K20
VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy.
PoLoŽKY
KAt. Č. 3037
Agarózové gely (připraveno k použití)
10 gelů
Pufr Tris-barbital (zásobní roztok)
3 lahv. po 75 mL
Ředící roztok pro amidočerň
1 lahv. 60 mL
Amidočerň (zásobní roztok)
1 lahv. 20 mL
Odbarvovací roztok (zásobní roztok)
1 lahv. 100 mL
Promývací roztok (zásobní roztok)
1 lahv. 80 mL
Aplikátory (6 zubů) (připraveno k použití)
1 bal., 10 ks
Tenké filtrační papíry
1 bal., 10 ks
Hřebínkové papír. filtry
1 bal., 10 ks
Tlusté filtrační papíry
2 bal. po 10 ks
POZN. : Fixační roztok a pentavalentní antisérum jsou dodávána zvlášť (viz článek DALŠÍ POTŘEBNÉ REAGENCIE).
PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY :
Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku.
PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK.
1. AGARÓZoVÉ GELY
Příprava
Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok pH 9.2 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální
provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.
Použití
Podpůrné medium pro elektroforézu a imunofixaci.
Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku
Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech – šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě
(15 - 30 °C) nebo v chladničce (2 - 8 °C). Zamezit prudkým změnám teploty – neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje.
Stabilní do doby expirace vyznačené na krabici či štítcích na obalech gelů.
NEMRAZIT!
Nepoužívejte :
(i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne,
(ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně,
(iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování).
- 106 -
SEBIA NÁVOD - Czech
HYDRAGEL IF Penta K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
2. tRIS-BARBItAL PuFR
Příprava
Každá lahvička zásobního tlumivého roztoku se může zředit destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 1 litr.
Pracovní roztok po naředění obsahuje : tlumicí roztok pH 9.2 ± 0.5.
Použití
Elektroforetický pufr.
Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku
Pufr lze skladovat při pokojové teplotě nebo v ledničce. Je stabilní několik let, při nejmenším do data expirace vyznačeného na balení či lahvičkách.
Zředěný pufr je stabilní po dobu 1 roku při pokojové teplotě v uzavřené láhvi.
Při zjištění zákalu v roztoku, který je obvykle známkou mikrobiální kontaminace, je nutno pufr vylít.
3. ŘEDÍCÍ RoZtoK PRo AMIDoČERŇ
Příprava
Zásobní ředicí roztok barvicího roztoku musí být použit podle pokynů v odstavci "AMIDOČERŇ". Obsahuje kyselý roztok pH ≈ 2.
Použití
Příprava barvícího roztoku s amidočerní.
Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku
Zásobní roztok ředícího roztoku pro amidočerň se skladuje při pokojové teplotě nebo při teplotě 2 - 8 °C. Zásobní roztok je stabilní do data expirace
vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. NEMRAZIT.
Nepřidávat azid sodný.
4. AMIDoČERŇ
Příprava
Koncentrát amidočerni je viskózní roztok, který může gelovatět. Citlivost zásobního barvícího roztoku není změněna zvýšením viskozity nebo
ztuhnutím.
V každém případě je pro dosažení správného rozpuštění barvícího roztoku nutné dodržet následující postup :
1. Přidejte 15 mL ředícího roztoku pro amidočerň do lahvičky s koncentrovanou amidočerní.
2. Pečlivě uzavřete lahvičku.
3. Lahvičku pořádně protřepejte po dobu cca 5 sekund.
4. Přelijte tento roztok do odměrného válce pro přípravu barvicího roztoku.
5. Opakujte tento krok 2 - 3x, až do úplného rozpuštění koncentrované amidočerni.
6. Nalijte zbylý obsah lahvičky s ředícím roztokem pro amidočerň do odměrného válce a doplňte do 300 mL destilovanou nebo deionizovanou vodou
7. Promíchávejte obsah válce po dobu 5 - 10 minut.
Barvící roztok je připraven k použití.
POZN. : Nesprávná příprava barvícího roztoku povede k nedostatečnému barvení albuminové frakce (nízká procentuální hodnota světlého středu
frakce).
Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok o pH ≈ 2 ; amidočerň ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální
provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.
Použití
Barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze.
DŮLEŽItÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použitích k barvení.
Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku
Zásobní i pracovní barvicí roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování.
Zásobní barvicí roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok.
Pracovní barvicí roztok je stabilní 1 měsíc. Stabilita roztoku může být prodloužena na 3 měsíce, pokud je uchováván v chladničce. Ihned po použití musí
být uzavřené nádoby uloženy v chladničce.
Neskladujte pracovní barvicí roztok v blízkosti zdrojů tepla.
5. oDBARVoVACÍ RoZtoK
Příprava
Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 1 litr
pracovního roztoku doplněním 1 mL zásobního roztoku do 1 litru destilovanou nebo deionizovanou vodou.
Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok pH ≈ 2.
Použití
Roztokem se odstraňuje přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny.
Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku
Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do doby expirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Pracovní
odbarvovací roztok je stabilní 1 týden při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávejte azid sodný!
Nepoužívat při změně vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku.
Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μL/dL roztoku
ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička, 5 mL).
Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT.
Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě
stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky.
- 107 -
HYDRAGEL IF Penta K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
6. PRoMÝVACÍ RoZtoK
Příprava
Lahvička zásobního promývacího roztoku může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 5 litrů. Praktické je zředit pouze 16 mL
zásobního roztoku do 1 litru.
Promývací pracovní roztok po zředění obsahuje : tlumicí roztok pH 8.7 ± 0.5.
Použití
K promytí a oplachu gelů po inkubaci s fixačním roztokem a antiséry.
Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku
Zásobní i pracovní promývací roztok se skladují v uzavřených nádobách při pokojové teplotě nebo v ledničce. Jsou stabilní do data expirace
vyznačeného na obalu kitu nebo na štítcích lahviček s promývacím roztokem.
Roztok odstraňte při změně vzhledu nebo vzniku zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace.
7. APLIKÁtoRY
Použití
Jednorázové aplikátory k nanesení vzorků - připraveny k použití.
Skladování
Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.
8. tENKÉ FILtRAČNÍ PAPÍRY
Použití
Proužky tenkého filtračního papíru, na jedno použití. Jsou určeny k odsání přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků.
Skladování
Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.
9. HŘEBENY Z tLuStÉHo FILtRAČNÍHo PAPÍRu
Použití
K odsátí přebytečného fixačního roztoku a antisér z povrchu gelu po provedené imunofixaci
10. tLuStÉ FILtRAČNÍ PAPÍRY
Použití
K odsátí nezprecipitovaných proteinů z gelu po imunofixaci.
Skladování
Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.
PotŘEBNÉ REAGENtY NEoBSAŽENÉ V BALENÍ
VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy.
1. FIXAČNÍ RoZtoK
Příprava
Fixační roztok pro imunofixaci (SEBIA, kat. č. 4799, 1 lahvička 2.5 mL) je připraven k použití. Obsahuje : kyselý roztok pH ≈ 2 ; přídavné látky nezbytně
nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Fixační roztok je specifický pro imunofixační techniku s použitím
standardní 3 IF Penta masky.
K usnadnění identifikace a monitorování aplikace je roztok zbarven do žluta neškodnou barvičkou, jež koresponduje s barvou nálepky na lahvičce.
Použití
K fixaci elektroforeticky separovaných proteinů v referenční stopě (ELP).
DŮLEŽItÉ : K zabránění kontaminace mezi reagenciemi, nezaměňte jejich víčka.
Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku
Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu kitu a nálepce lahvičky. Roztok nesmí obsahovat
sraženiny.
2. PENtAVALENtNÍ ANtISÉRuM
Příprava
Lahvička s pentavalentním antisérem (SEBIA, kat. č. 4516, 1 lahvička 8 mL) je směsicí savčích imunoglobulinů proti lidským Ig. toto antisérum je
specifické pro imunofixační techniku s použitím standardní 3 IF Penta masky.
K usnadnění identifikace a monitorování aplikace je antisérum zbarveno do žluto-oranžova neškodnou barvičkou, jež koresponduje se zbarvením
nálepky na lahvičce.
Při výskytu lehkého zákalu ponechejte antisérum minimálně 10 minut stát při pokojové teplo-tě, což by mělo být dostačující k vyjasnění roztoku –
přetrvávající zákal by však neměl žádným způsobem ovlivnit imunochemickou reakci. V případě výskytu nerozpustných precipitátů, je doporučeno
antisérum centrifugovat při 600 g po dobu 5ti minut.
Použití
K imunofixaci elektroforeticky rozdělených proteinů.
Antiséra mohou pocházet z různých živočišných druhů. Nemíchejte antiséra mezi sebou a to ani se stejnou specificitou. Vždy měňte pipetovací špičky
při pipetování antiséra z jiné lahvičky.
DŮLEŽItÉ : K zabránění kontaminace mezi reagenciemi, nezaměňte jejich víčka.
- 108 -
HYDRAGEL IF Penta K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku
Pentavalentní antisérum se skladuje při 2 - 8 °C v chladničce. Je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu kitu a nálepek lahviček.
POZN. : Během transportu by antisérum mělo vydržet bez chlazení (při 15 - 30 °C) bez ne-příznivého vlivu na provedení 15 dní.
3. FLuIDIL
Příprava
Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587, 1 lahvička, 5 mL) je připraven k použití.
Použití
K ředění viskózních nebo zkalených vzorků, např. sér obsahujících kryoglobulin nebo kryogel.
Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku
Skladujte při pokojové teplotě. Je stabilní do doby expirace vyznačené na štítku lahvičky.
Nesmí obsahovat precipitáty.
POZNÁMKY :
Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky
objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy.
Destilovaná nebo deionizovaná voda použitá pro rekonstituci roztoků musí být bez přítomnosti bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr ≤ 0.45 µm)
a musí mít odpor vyšší než 10 megaohmů na cm.
ZAŘÍZENÍ NEZBYtNÁ K PRoVEDENÍ tEStu
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Zdroj proudu : MG 300 SEBIA, kat. č. 1302 nebo MG 500 SEBIA, kat. č. 1303.
HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, kat. č. 1409, včetně nosiče aplikátorů HYDRAGEL K20.
Vlhká Komůrka kat. č. 1270.
Elektroforetická Komora, K20 SEBIA, kat. č. 1400.
Nádobky a držáky gelů pro manipulaci s nimi – HYDRAGEL Accessory Kit SEBIA, kat. č. 1420.
Pipety 10 µL, 20 µL, 100 µL a 200 µL.
Sušička – Inkubátor, IS 80 SEBIA, kat. č. 1430.
VZoRKY K ANALÝZE
odběr a skladování vzorků
Pro analýzu jsou vhodné čerstvé vzorky séra. Odběr a získání séra musí být provedeno dle zásad správné laboratorní práce.
Takto odebrané vzorky lze skladovat jeden týden v chladničce nebo nejméně jeden měsíc zmražené.Stabilitu vzorku séra zvýšíme přidáním azidu
sodného (0.02 g/dL).
DŮLEŽItÉ : Jako konzervační prostředek nepoužívejte kyselinu boritou.
Vzhledem k určité denaturaci bílkovin a lipoproteinů, mohou rozmražené vzorky vykazovat při aplikaci slabší otisky.
Příprava vzorků
Používejte jen neředěné vzorky séra.
Některá séra (zvláště, která obsahují kryoglobulin nebo kryogel) se mohou po skladování při 2 - 8 °C nebo po rozmražení zakalit nebo stát viskózními.
Špatně difundují přes zuby aplikátoru a proto je vhodné přidat 25 µL Fluidilu k 75 µL séra a 15 sec. promíchat (na Vortexu). Teprve poté lze pokračovat
standardním postupem.
Nepoužívat vzorky
Nelze použít vzorky plasmy – proužek fibrinogenu v gama zóně by mohl být považován za monoklonální imunoglobulin.
POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu
(údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků…). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají
být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle
dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých
doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů.
PRACoVNÍ PoStuP
I. MIGRACE
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Umístěte nosič aplikátorů na rovný povrch (viz Obr. 1) a zvedněte část s očíslovanými zuby.
Na spodní třetinu vyznačeného rámečku napipetujte 120 µL destilované vody.
Vybalte gelovou plotnu.
Rozviňte rychle a rovnoměrně jeden tenký filtrační papír po povrchu plotny a odsajte přebytek tekutiny.
POZOR: Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu, mohlo by dojít k dehydrataci gelu.
Položte plotnu (gelem nahoru) okrajem ke stop značce na spodní straně vyznačeného rámečku (viz Obr. 2).
Plotnu ohněte a položte ji na napipetovanou vodu a zajistěte, aby se voda rozprostřela rovnoměrně bez vzniku vzduchových bublin (viz Obr. 2).
Snižte nosič aplikátoru s očíslovanými zuby do střední polohy.
Umístěte aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (viz Obr. 3).
Aplikujte 10 µL séra do jamek aplikátoru. Všechny jamky nutno napipetovat do 2 minut.
- 109 -
VZoRKY Č.
1
2
3
ELP
1
3
5
JAMKA Č.
HYDRAGEL IF Penta K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
Penta
2
4
6
- Použijte aplikátor okamžitě
- Pro delší uchování (až 8 hodin) umístěte aplikátor do vlhké komory zoubky nahoru, uchopením za plastikovou část chránící zoubky, komoru
zakryjte víčkem a umístěte do chladničky.
Podrobnosti najdete v návodu pro vlhkou komoru.
10. Odlomte rámeček chránící zuby aplikátoru
11. Umístěte aplikátor do pozice č. 6 na nosič aplikátoru.
DŮLEŽItÉ : Čísla musí směřovat k obsluze (viz Obr. 4).
12. Snižujte aplikátorový nosič opatrně tak, aby aplikátor kontaktoval povrch gelu. NESTLAČUJTE DRŽÁKY AŽ DOLŮ.
13. Po 15ti sekundách aplikátor zvedněte a odstraňte.
14. Gelovou plotnu vložte do migrační elektroforetické komory dle polarity vyznačené na gelu - dolní částí gelu na katodickou stranu. Při použití
komory SEBIA K20 vložte HYDRAGELovou plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru. Okraje plotny budou ponořeny asi
1 cm.
Podrobnosti najdete v návodu pro migrační komoru K20.
15. Komoru zapoj do proudového zdroje.
PoDMÍNKY DĚLENÍ
Objem pufru ke každé elektrodě
Celkový objem pufru
Čas dělení
Konstantní napětí
Počáteční proud (na gel)
SEBIA K20
150 mL
300 mL
20 minut
100 V
16 ± 3 mA
16. Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu.
II. IMuNoFIXACE
1.
2.
3.
4.
5.
Umístěte HYDRAGEL K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu.
Napipetujte 120 µL destilované nebo deionizované vody na dolní třetinu vyznačeného rámečku na nosiči.
Opřete plotnu dolním okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku (viz Obr. 2) gelem k sobě.
Gel ohněte a pokládejte na plochu s kapkou vody tak, aby se tato rovnoměrně pod ním rozprostřela bez tvorby vzduchových bublin (viz Obr. 2).
Aplikační šablonu 3 IF Penta nastavte na nosiči následujícím způsobem (viz Obr. 5) :
- umístěte aplikační šablonu na ukotvující příchytky,
- držte šablonu za ouško a položte ji na gel,
- stopy na šabloně musí být přesně srovnány s vyznačením zubů aplikátoru vlevo na gelu.
6. Reagencie pipetujte dle následující tabulky :
StoPA
ELP
Penta
oBJEM
35 µL
25 µL
REAGENCIE
fixační roztok
pentavalentní antisérum
POZN. : Aby nedošlo k záměně, barva štítku na lahvičce souhlasí s barvou jamek aplikační šablony.
- při pipetování se nesmí do špičky pipety dostat žádné bubliny.
- Aplikujte reagencie (viz obr. 6) :
- Pipetu držte vertikálně a její špičku lehce vložte na dno jamky.
- Dbejte aby při aplikaci reagencie nevnikly do žlábku bubliny.
7. Při pokojové teplotě inkubujte 5 minut.
III. oDStRANĚNÍ REAGENCIÍ
BARVA
žlutá
žluto-oranžová
1. Odstraňte přebytek reagencií hřebenem z tlustého filtračního papíru (viz Obr. 7).
2. Reagencie odstraňte v průběhu 30 sekund.
- Papírový hřeben lehce zasuňte pod úhlem 30° do štěrbiny na dolním konci aplikační šablony tak, aby se jeho zuby lehce dotkly hladin
antisér.
- Jemným vychýlením hřebene od sebe do úhlu maximálně 45° lze odsát přebytečnou reagencii (viz Obr. 8).
DŮLEŽItÉ : Hřeben musí zůstat nakloněn do úhlu maximálně 45°. Pokud by byl kolmo ke gelu, mohl by jej poškodit.
IV. oDStRANĚNÍ NEZPRECIPItoVANÝCH PRotEINŮ
1. Vyjměte hřeben.
2. Zkontrolujte, zda jsou antiséra dobře odsáta, t.j. :
- na gelu nejsou žádná antiséra,
- zuby hřebene jsou obarveny po celé jejich délce.
Pokud není odsátí antisér úplné, vložte stejný papírový hřeben znovu do téže pozice a zopakujte předchozí postup.
3. Vyjměte aplikační šablonu.
4. Na gel položte na 4 minuty jeden tlustý filtrační papír.
DŮLEŽItÉ : Dokonale přitiskněte tlustý filtrační papír k celému povrchu gelu a přesvědčte se, že dobře přilnul.
- 110 -
HYDRAGEL IF Penta K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
5. Filtrační papír sejměte. V kolmé poloze promývejte ve fyziologickém roztoku po dobu 5 minut. Gel musí být umístěn tak, aby stopa č. 1 byla
na dolním konci držáku.
6. Gel položte na rovnou plochu.
7. Na gel přiložte nový tlustý filtrační papír tak, aby celou plochou přilnul k povrchu gelu.
8. Osušte gel v sušičce při 80 °C tak, aby filtrační papír kompletně vyschl.
9. Aplikační šablonu očistěte malým kartáčkem (např. kartáčkem na zuby) podle postupu uvedeného v části "POSTUP ČIŠTĚNÍ MASKY".
Ověřte, že je šablona před opakovaným použitím zcela suchá ; pomocí sacího papíru odstraňte z jamek kapky vody.
V. BARVENÍ A oDBARVoVÁNÍ
1. Po usušení ponořte usušený gel kolmo do promývacího roztoku na 3 minuty. Gel musí být umístěn tak, aby stopa č. 1 byla na dolním konci
držáku.
2. Na 4 minuty vložte v kolmé poloze do barvícího roztoku.
3. Odbarvěte ve třech po sobě následujících lázních s odbarvovacím roztokem dokud není pozadí zcela bezbarvé a průhledné.
4. Osušte gel v proudu 80 °C teplého vzduchu. Zadní stranu gelu očistěte vlhkým, měkkým papírem.
KoNtRoLA KVALItY
Po každé změně série reakčního činidla se doporučuje analyzovat kontrolní sérum (jako např. Kontrolní sérum IT / IF, SEBIA PN 4788).
POZNÁMKA : Je-li to nezbytné, může být normální kontrolní roztok séra SEBIA, kat. č. 4785 použit jako negativní kontrola.
VÝSLEDKY
Pentavalentní antisérum detekuje :
• Ig G, Ig A, Ig M, kappa a lambda,
• kappa a lambda lehké řetězce,
• kappa a lambda lehké řetězce vázané na těžké řetězce epsilon a delta.
Interpretace
- Normální vzorek séra vykazuje lehké difúzní zbarvení polyklonálních imunoglobulinů ve všech stopách, bez ostrých proužků.
- Hypergamaglobulinemie je charakterizována sytě zbarvenou, difúzní zónou a nepřítomností jakýchkoliv ostrých proužků.
- Gamapatie je charakterizována přítomností jednoho nebo více ostrých proužků.
Speciální případy
• Lehká monoklonální gamopatie může být v normálním elektroforetickém profilu skryta (např. mobilita dysglobulinu). Tento proužek bude detekován
pentavalentním antisérem.
Jakékoli frakce monoklonálního typu budou identifikovány dalším vyšetřením pomocí:
• HYDRAGEL IF K20 SEBIA, kat. č. 3031 nebo HYDRAGEL DOUBLE IF K20 SEBIA, kat. č. 3036 ;
• HYDRAGEL BENCE JONES K20 SEBIA, kat. č. 3038.
omezení
Použití jiných, než specifických antisér pro tuto imunofixační metodu pro použití standardní masky, může mít špatný vliv na výsledky.
Díky omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy, je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou detekovány touto
metodou.
Tato metoda, stejně jako všechny imunofixační techniky, zcela závisí na citlivosti a specifičnosti antisér. Antiséra jsou biologické produkty, pro které je
mimořádně důležitá výrobní kontrola. Společnost SEBIA vyvinula některé pokročilé testy určené pro různé typy antisér, přesto však některé
monoklonální složky nemusejí být detekovány.
Tato imunofixační metoda používá pentavalentní antisérum a jedná se o postup vyšetření, který musí být doplněn podrobnější analýzou, například
imunofixačním postupem prováděným s celým spektrem antisér.
Problémy
Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte TechnickoServisní středisko vašeho dodavatele.
Soupravy, reagencie, bezpečnostní listy a informace o likvidaci odpadu jsou dostupné na Technicko-Servisním středisku vašeho dodavatele.
HoDNotY
Byly použity standardní materiály, příprava vzorků a techniky. Všechny elektroforeogramy byly hodnoceny vizuálně.
Reprodukovatelnost mezi vzorky a specificita
Reprodukovatelnost mezi vzorky byla demonstrována na jednom normálním séru analyzovaném na 4 HYDRAGEL 3 IF Penta gelech stejné šarže. Pro
všechny dráhy na gelu byl použit fixační roztok při použití barvení amidočerní.
Všechny dráhy všech čtyřech gelů daly identické výsledky, a jak se očekávalo i typ normálního vzorku bez přítomnosti monoklonální komponenty.
Reprodukovatelnost mezi gely a specificita
Reprodukovatelnost mezi gely byla demonstrována na třech patologických vzorcích (jeden vzorek s monoklonální komponentou o vysoké koncentraci
a dva vzorky s monoklonální komponentou o nízké koncentraci). Tyto 3 vzorky byly podrobeny testům na 6-ti HYDRAGEL IF Penta K20 gelech stejné
šarže. Všechny testované vzorky daly identické výsledky na každém gelu, a jak se očekávalo i typ s jednou monoklonální komponentou detekovanou
imunofixací pro každý testovaný vzorek.
- 111 -
HYDRAGEL IF Penta K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
Výsledky dosažené HYDRAGEL IF Penta K20 technikou vykazují velice dobrou reprodukovatelnost pro všechny testované aspekty. Nebyly zde žádné,
vizuálně detekovatelné rozdíly mezi opakováními.
Přesnost
Třicet (30) různých patologických sérových vzorků a dvanáct (12) normálních sér bylo podrobeno analýze soupravou HYDRAGEL IF Penta K20 a jiným
komerčně dostupným agarózovým, gelovým, imunofoxačním systémem. Ve všech případech, výsledky analyzované na gelech SEBIA a jiném
komerčně dostupném testu, byly identické.
Citlivost
Následně ředěné 3 patologické vzorky séra s monoklonální bílkovinou byly analyzovány HYDRAGEL IF Penta K20 metodou. Pro barvení byla použita
amidočerň.
Výsledky jsou následně sumarizovány.
VZoREK Č.
1
2
3
MoNoKLoNÁLNÍ KoMPoNENtA
tYP
KoNC. (g/L)
gama
2.8
lambda
alfa
9.8
kappa
mu
7.4
kappa
- 112 -
DEtEKČNÍ LIMIt (g/L)
AMIDoČERŇ
0.25
0.25
0.25
BIBLIoGRAPHIE / BIBLIoGRAPHY
HYDRAGEL IF Penta K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
Pour des informations complémentaires sur l'interprétation des profils obtenus par immunofixation, voir 1. et 2.:
For additional information on interpretation of immunofixation patterns refer to 1. and 2.:
1. Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
2. Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd
ed., 1994, 397 pp.
3. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage, sensibilité, spécificité.
Impact-Internat, 1986, Sept : 93-97.
- 143 -
SCHÉMAS / FIGuRES
Figure 1
HYDRAGEL IF Penta K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
Figure 2
1 2
3 4
5 6
7
Figure 3
Figure 4
1 2
3 4
5 6
7
1 2 3
4 5 6
7
7
5 6
3 4
1 2
Figure 5
Figure 6
- 144 -
SCHÉMAS / FIGuRES
Figure 7
Figure 8
- 145 -
HYDRAGEL IF Penta K20 - 2014/03
Masque standard / Standard mask
Download

HYDRAGEL IF Penta K20