HYDRAGEL HR K20
Ref. 3001
2014/10
HYDRAGEL HR K20 - 2014/10
NAMENA
HYDRAGEL HR K20 gelovi namenjeni su višefrakcionalnom razdvajanju serumskih proteina u humanom serumu ili u drugim biološkim tečnostima,
kao što su urin i likvor, elektroforezom u alkalno puferovanim (pH 8,8) agaroznim gelovima. Razdvojeni proteini boje se acidviolet (za kvalitativnu
analizu seruma, urina ili likvora) ili sa amidocrno (za kvantitativnu analizu seruma) bojom. Višak boje uklanja se kiselim rastvorom. Elektroforegramom
se vizuelno može otkriti svaki oblik abnormalnosti. Denzitometrija omogućava semikvantitativne, relativne vrednosti.
Svaki agarozni gel u pakovanju HYDRAGEL HR K20 namenjen je za ispitivanje 7 uzoraka.
Za in vitro dijagnostičku primenu.
PRINCIP TESTA
Elektroforeza proteina u kliničkim laboratorijama je rutinska skrining tehnika za otkrivanje proteinskih abnoramalnosti u serumu i drugim tečnostima.
Zasniva se na principu zonske elektroforeze i izvodi se na odgovarajućoj podlozi. Agaroza se razvila u pouzdanu i efektivnu podlogu. Većina kliničkih
laboratorija zadovoljna je s "tradicionalnih" pet glavnih frakcija, medjutim, tehnike visoke rezolucije pružaju dodatne dijagnostičke informacije.
Na HYDRAGEL HR K20 gelovima, serumski, urinski ili proteini likvora razdvajaju se na oko 10 frakcija. Svaka frakcija sadrži 1 ili više proteina. Sastav
gela, uslovi elektroforeze i izbor boje (acidviolet ili amidocrno) omogućavaju odlično razdvajanje i visoku osetljivost, posebno u gama zoni.
Elektroforegramom se vizuelno može otkriti svaki oblik abnormalnosti. Vizuelna zapažanja mogu da se dopune denzitometrijom čime se dobijaju
polukvantitativne, relativne vrednosti individualnih ili kombinovanih proteinskih frakcija.
REAGENSI I MATERIJALI ISPORUČENI U HYDRAGEL HR K20 PAKOVANJU
UPOZORENJE : Pogledajte listove sa bezbednosnim podacima.
|
|
|
|
|
|
|
PROIZVOD
Agrozni gelovi (spremni za upotrebu)
Tris-barbituratni pufer (koncentrovan rastvor)
Boja acidviolet (koncentrovana)
Rastvor za odbojavanje boje (koncentrovan)
Aplikatori sa 7 zubaca (spremni za upotrebu)
Filter papiri
ZA OPTIMALNE REZULTATE :
Svi reagensi iz istog pakovanja moraju se koristiti zajedno i prema uputstvu.
MOLIMO, PAŽLJIVO PROČITATI UPUTSTVO ZA UPOTREBU.
|
|
|
|
|
|
|
KAT. bR. 3001
10 gelova
3 bočice, 100 mL svaka
1 bočica, 75 mL
1 bočica, 100 mL
1 pakovanje od 10 kom.
1 pakovanje od 10 kom.
|
|
|
|
|
|
|
1. AGAROZNI GELOVI
Priprema
Agaroza gelovi su spremni za upotrebu. Svaki gel sadrži : agarozu ; rastvor pufera pH 8,8 ± 0,5 ; aditive, nisu opasni u koncetracijama primenjenim
za dobijanje optimalne performanse.
Upotreba
Kao podloga za elektroforezu proteina.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Gelove čuvati u horizontalnom položaju u originalnim zaštitnim pakovanjima, na sobnoj temperaturi (15 – 30 °C) ili u frižideru (2 – 8 °C). (Strelica na
prednjem delu kutije gela mora biti okrenuta nagore.)
Izbegavati promene temperature prilikom čuvanja i držanje u blizini prozora ili izvora toplote.
Stabilni su do datuma označenog na pakovanju i na nalepnicama pakovanja svakog gela.
NE ZAMRZAVATI!
Baciti ako:
(I) se na površini gela pojave kristali, talog ili tekstura gela postane vrlo mekana (kao posledica zamrzavanja) ;
(II) je vidljiv porast bakterija ili gljivica ;
(III) se u kutiji gela nalazi velika količina tečnosti (rezultat isticanja pufera iz gela zbog loših uslova čuvanja).
2. TRIS-bARbITURATNI PUFER
Priprema
Svaka bočica nerazblaženog rastvora pufera treba razblažiti do 1 litar sa destilovanom ili dejonizovanom vodom.
Nakon razblaživanja, radni rastvor sadrži : rastvor pufera pH 8,7 ± 0,5 ; aditive, nisu opasni u koncetracijama primenjenim za dobijanje optimalne
performanse.
Upotreba
Elektroforetski pufer.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Koncentrovan rastvor pufera čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Koncentrovan rastvor stabilan je nekoliko godina, najmanje do roka trajanja
označenog na pakovanju ili na nalepnicama na bočicama. Razblažen rastvor pufera stabilan je godinu dana na sobnoj temperaturi u zatvorenoj boci.
Baciti razblaženi rastvor pufera ako se pojavi zamućenje izazvano mikrobiološkom kontaminacijom
- 92 -
SEBIA UPUTSTVO ZA UPOTREBU - Srpski
HYDRAGEL HR K20 - 2014/10
3. ACIDVIOLET bOJA
Priprema
Bočicu sa nerazblaženim koncentrovanim rastvorom za violet bojenje treba razblažiti sa do 300 mL destilovane ili dejonizovane vode.
Nakon razblaživanja, radni rastvor za bojenje sadrži : kiseli rastvor pH ≈ 2 ; kiselo violet ; etilen glikol ; aditive, bezopasne u primenjenim
koncetracijama, neophodne za optimalnu performansu.
Upotreba
Za bojenje gelova posle razdvajanja elektroforezom.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Koncentrovan i radni rastvor čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru, u zatvorenoj boci da bi se izbeglo isparavanje. Koncentrovan rastvor za bojenje
stabilan je do isteka roka trajanja na pakovanju ili na nalepnici bočice s bojom.
Radni rastvor za bojenje stabilan je 6 meseci.
4. RASTVOR ZA ODbOJAVANJE
Priprema
Svaka bočica koncentrovanog rastvora za odbojavanje razblažuje se destilovanom ili dejonizovanom vodom do zapremine od 100 litara. Razblažiti
5 mL koncentrovanog rastvora s 5 litara destilovane vode (odgovara zapremini boce u kojoj je rastvor za odbojavanje).
Nakon razblaživanja, radni rastvor za odbojavanje sadrži kiseli rastvor pH ≈ 2.
Upotreba
Za uklanjanje viška boje ili pozadinskog obojenja sa gelova.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Koncentrovan rastvor za odbojavanje čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Stabilan je do datuma isteka roka trajanja na pakovanju ili na nalepnici
bočice s rastvorom.
NE ZAMRZAVATI!
Radni rastvor za odbojavanje stabilan je nedelju dana na sobnoj temperaturi u zatvorenoj bočici.
Ne dodavati natrijum azid!
Baciti ako se pojave znaci propadanja, npr. zamuti se zbog mikrobiološke kontaminacije.
Da biste sprečili razvoj mikroba u razblaženom rastvoru za odbojavanje koji se čuva duže od jedne nedelje, dodati 5 µL/dL od ProClin 300 ili CLEAN
PROTECT (SEBIA, PN 2059, 1 bočica od 5 mL).
Pogledati uputstvo za upotrebu za CLEAN PROTECT.
Radni rastvor za odbojavanje sa dodatim ProClin ili CLEAN PROTECT stabilan je u zatvorenoj boci na sobnoj temperaturi ili u frižideru do datuma
isteka roka trajanja označenog na pakovanju ili na nalepnici bočice sa rastvorom za odbojavanje.
5. APLIKATORI
Upotreba
Pojedinačni aplikatori za nanošenje uzoraka.
Čuvanje
Aplikatore čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru.
6. FILTER PAPIRI
Upotreba
Pojedinačni tanki papirni jastučići za upijanje viška tečnosti s površine gela pre nanošenja uzorka.
REAGENSI KOJI SU POTREbNI ALI NISU PRILOŽENI
UPOZORENJE : Pogledajte listove sa bezbednosnim podacima.
1. FIZIOLOŠKI RASTVOR
Priprema
Priremiti 0,15 M (0,9 g/dL) rastvora natrijum hlorida u destilovanoj ili dejonizovanoj vodi.
Upotreba
Za razblaživanje uzoraka.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Baciti posle 3 meseca ako promeni izgled, npr. zamuti se zbog kontaminacije mikroorganizmima.
2. FLUIDIL
Priprema
Fluidil (SEBIA, kat. br. 4587, 5 mL) spreman za upotrebu.
Upotreba
Za razblaživanje uzoraka sa sprečenom difuzijom kroz zupca aplikatora za uzorke (na primer, viskozni ili zamućeni uzorci, npr. serumi koji sadrže
krioglobulin ili kriogel, uzorci sa polimerizovanim Ig M,…) ili uzoraka koji daju elektroforetski šablon niskog inteziteta.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Čuvati na sobnoj temperaturi. Fluidil je stabilan do roka upotrebe označenog na nalepnici bočice.
Fluidil ne sme imati talog.
3. RASTVOR FIKSATIVA (opcija)
Priprema
Rastvor koji sadrži (zapreminski deo): 60 % etanola, 10 % sirćetne kiseline i 30 % destilovane ili dejonizovane vode pripremiti najmanje 15 minuta pre
upotrebe. Dobro izmešati.
- 93 -
HYDRAGEL HR K20 - 2014/10
Upotreba
Za fiksaciju elektroforetske separacije proteina u agaroznom gelu.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Rastvor za fiksaciju čuvati na sobnoj temperaturi, dobro zatvoren, da bi se sprečilo isparavanje. Baciti posle 3 meseca. U 150 mL fiksativa fiksirati
najviše 4 gela.
4. AMIDOCRNA bOJA (kat. br. 4554) (opcija)
Priprema
Koncentrovana amidocrna boja je viskozna tečnost koja može da želira. Sastav nerazblažene boje ne menja se povećanjem viskoznosti ili
učvršćivanjem.
Da bi se boja savršeno rastvorila, uvek postupiti na sledeći način:
1. U bočicu koncentrovane amidocrne boje dodati 15 mL sredstva za rastvaranje boje.
2. Pažljivo zatvoriti bočicu.
3. Snažno mućkati bočicu oko 5 sekundi.
4. Sipati ovaj rastvor u bocu za boju.
5. Ponoviti ovaj korak dva do tri puta.
6. Ostatak sredstva za rastvaranje boje sipati u bocu i dopuniti destilovanom ili dejonizovanom vodom do zapremine od 300 mL.
7. Sadržaj boce za boju dobro mešati 5 - 10 minuta.
Rastvor boje spreman je za upotrebu.
PAŽNJA: Loše rastvorena boja može da dovede do smanjenja vrednosti albuminske frakcije (nizak procenat ili bela "rupa" unutar frakcije).
Nakon razblaživanja, radni rastvor za bojenje sadrži : kiseli rastvor pH ≈ 2 ; amidoblack ; etilen glikol ; aditive, bezopasne u primenjenim
koncetracijama, neophodne za optimalnu performansu.
Upotreba
Za bojenje gelova posle razdvajanja elektroforezom.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Koncentrovan i radni rastvor čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru, u zatvorenoj boci da bi se izbeglo isparavanje. Koncentrovan rastvor za bojenje
stabilan je do isteka roka trajanja na pakovanju ili na nalepnici bočice s bojom.
Radni rastvor boje stabilan je mesec dana. Period stabilnosti može da se produži na 3 meseca ukoliko se radni rastvor čuva u frižideru.
Ne držati radni rastvor za bojenje blizu izvora toplote!
NAPOMENE :
Probe koje su izvršene za validaciju reagenasa pokazale su da, za različite rastvore i upotrebom prilagođene opreme za zapreminu rekonstitucije,
varijacija od ± 5 % na krajnju zapreminu nema neželjenih efekata na analizu.
U destilovanoj ili dejonizovanoj vodi koja je upotrebljena za razblaživanje rastvora, ne sme da rayvijaju bakterije ili buđ (upotrebite filter ≤ 0,45 µm) i
treba da imate otpornost veću od 10 megaoma x cm.
OPREMA I PRIbOR KOJI SU POTREbNI, ALI NISU ISPORUČENI
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Ispravljač: MG 300 SEBIA, kat. br. 1302 ili MG 500 SEBIA, kat. br. 1303.
HYDRAGEL K20 APLIKATOR SEBIA, kat. br. 1409, sadrži HYDRAGEL K20 nosač aplikatora.
Vlažna komora, kat. br.1270.
Kadica za elektroforezu: K20 SEBIA, kat. br. 1400.
Posude i držači gelova za obradu gela: HYDRAGEL K20 pomoćno pakovanje SEBIA, kat. br. 1420.
Pipete: 10 µL i 200 µL.
Inkubator – sušilica: IS 80 SEBIA, kat. br. 1430.
Densinometar / skener koji može da skenira ploče sa gelom 82 x 51 mm : HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA ili PHORESIS softver za ravan skener.
Pogledajte uputstvo proizvođača za rad i procedure kalibracije.
9. Kontrolni materijal.
UZORCI ZA ANALIZU
Uzorci za kvantitativnu analizu sa HYDRAGEL HR K20 mogu biti serum, urin ili cerebrospinalna tečnost (CSF).
Proteinski serumi mogu se takodje kvantitativno analizirati posle bojenja s acidvioletnom ili amidocrnom bojom.
Sakupljanje i čuvanje uzoraka
Za analizu se preporučuju sveži uzorci. Uzorci moraju da se sakupljaju prema uobičajenoj laboratorijskoj proceduri koja se koristi u kliničkom
laboratorijskom testiranju. Uzorke čuvati u frižideru (2 – 8 °C) najduže nedelju dana. Za potrebe dužeg čuvanja, uzorke zamrznuti (stabilnost najmanje
mesec dana).
Za povećanje stabilnosti uzoraka seruma i likvora pri zamrzavanju koristiti natrijum azid u koncentraciji 0,02 g/dL.
Za povećanje stabilnosti uzoraka urina pri zamrzavanju koristiti HEPES 0,1 M (pH 6,75) i natrijum azid, 0,02 g/dL.
Odmrznuti uzorci mogu da daju tačke na mestu aplikacije zbog denaturacije proteina ili lipoproteina.
VAŽNO: Izbegavati bornu kiselinu kao konzervans.
Priprema uzoraka za kvalitativnu analizu (s acidviolet bojom)
Serumi
Koristiti nerazblažen uzorak seruma.
- 94 -
HYDRAGEL HR K20 - 2014/10
Tretiranje uzoraka seruma sa Fluidil-om:
Tretiranje uzoraka seruma Fluidil-om mora da se primenjuje u sledećim slučajevima:
- Uzorci seruma sa sprečenom difuzijom kroz zupca aplikatora za uzorke, na primer, viskozni ili zamućeni serumi nakon skladištenja na temperaturi
od 2 do 8 °C ili nakon zamrzavanja (posebno oni koji sadrže krioglobulin ili kriogel).
- Uzorci seruma sa polimerizovanim Ig M.
- Uzorci seruma koji daju elektroforetski šablon niskog inteziteta.
U tim slučajevima, dodajte 25 µL Fluidil-a na 75 µL seruma i mešajte 15 sekundi. Onda sledite standardnu proceduru.
Likvor ili serum/likvor
Pripremiti uzorke s ukupnom koncentracijom proteina od oko 0,6 – 1,0 g/dL.
VAŽNO! Uzorci u paru: serum i likvor moraju da imaju istu koncentraciju ukupnih proteina.
Urini
Analizirati uzorke koji nisu koncentrovani. Ukoncentrovati urin ako je potrebna veća osetljivost.
NAPOMENA: Difuzija uzoraka urina kroz aplikator može da bude otežana kada je urin (čist ili koncentrovan) zamućen. U tom slučaju čestice odstraniti
centrifugiranjem (Sledite uobičajene preporuke o predanalitičkoj fazi koje se primenjuju na analizu uzoraka urina) ili filtracijom (0,45 µm).
Nekoncentrovani urin – koristiti čist urin
Ukoncentrovan urin – analiza se izvodi na uzorcima koji su prethodno ukoncentrisani i ukupna proteinska koncentracija iznosi oko 0,5 g/dL.
VAŽNO! Neki urini sadrže veliku količinu soli što može prouzrokovati deformaciju gela za vreme migracije i narušiti migracioni profil. Takvo oštećenje
daje pogrešan nalaz. U tom slučaju mora se izvršiti dijaliza urina da bi se odstranila so.
Priprema seruma za polukvantitativnu analizu (s amidocrnom ili acidvioletnom bojom)
Bojenje s amidocrnom bojom
Koristiti nerazblažene uzorke seruma.
Bojenje s acidvioletnom bojom
Koristiti uzorke seruma koji su prethodno razblaženi 4 puta s fiziološkim rastvorom (1 vol./3 vol.). Zatim slediti standardnu proceduru.
Uzorci koje treba izbegavati
• Ne koristiti hemolizovane uzorke seruma. Hemoliza povećava alfa-2 i beta zonu.
• Izbegavati uzorke plazme. Fibrinogen daje traku blizu mesta aplikacije kao i monoklonski imunoglobulin pa može zauzeti procenat odgovarajuće
zone.
NAPOMENA : Epruvete za sakupljanje i parametri centrifugiranja za biološke uzorke opisani su u dostupnoj dokumentaciji za predanalitičku fazu
biomedicinske analize (podaci koje obezbeđuju proizvođači epruveta, uputstva i preporuke o sakupljanju bioloških uzoraka…). Ukoliko nema nikakvih
indikacija o tipu epruveta koje treba koristiti ili o centrifugiranju u uputstvu za upotrebu, pogledajte ovu dokumentaciju, a za dimenzije epruveta koje
treba koristiti, pogledajte SEBIA dokument "Characteristics of tubes to use according to the instrument" (Karakteristike epruveta koje treba koristiti u
skladu sa instrumentom). Predanalitička faza mora da se izvodi u skladu sa najnovijim, različitim preporukama, uključujući one koje obezbeđuju
proizvođači epruveta, kao i primenjivim propisima.
POSTUPAK
I. MIGRACIJA
1.
2.
3.
4.
Staviti HYDRAGEL K20 nosač aplikatora na ravnu površinu i podići deo nosača aplikatora.
Sipati 120 µL destilovane ili dejonizovane vode u manju trećinu okvira utisnutog na nosaču aplikatora HYDRAGEL K20.
Raspakovati HYDRAGEL ploče agaroznog gela.
Brzo i ravnomerno zarolati tanki filter papir po površini gela da bi se upio višak tečnosti. Odmah skloniti papir.
UPOZORENJE: Ne ostavljati filter papir predugo u kontaktu s gelom da ne bi došlo do dehidracije gela.
5. Staviti ploču s gelom (gel okrenut nagore) s uglom nasuprot oznaci ucrtanoj na ramu.
6. Položiti i staviti gel na vodu. Proveriti da nema mehurića vazduha, da voda prekriva dno cele ploče s gelom i da je gel poravnat s ucrtanim
ramom.
7. Spustiti nosač aplikatora do srednje pozicije sa prekidačem u višoj poziciji.
8. Staviti aplikator na ravnu površinu sa oznakama brojeva jažica u gornjoj desnoj poziciji.
9. Sipati 10 µL čistog seruma u jažice aplikatora. Isprazniti aplikator u roku 2 minuta.
- Upotrebiti aplikator bez zadržavanja.
- Za kasniju upotrebu (do 8 sati), staviti aplikator u vlažnu komoru sa zupcima okrenutim nagore (koristiti plastični zaštitni ram), držati celu
komoru u frižideru i postaviti gelom na nosač aplikatora HYDRAGEL K20 neposredno pre upotrebe.
Za dodatne detalje pogledati uputstva za vlažnu komoru.
10. Skloniti plastični zaštitni ram.
11. Staviti aplikator uzoraka na poziciju br. 5 na nosaču aplikatora.
VAŽNO: Brojevi na aplikatoru uzoraka moraju biti okrenuti prema operateru.
12. Spustiti nosač aplikatora pomoću prekidača tako da aplikator dodiruje površinu gela. NE PRITISKATI NOSAČ NADOLE.
- Analiza seruma: ostaviti aplikator u kontaktu sa gelom 30 sekundi.
- Par CSF/serum i koncentrovani urin: ostaviti aplikator u kontaktu sa gelom 2 minuta.
- Nekoncentrovani urin: ostaviti aplikator u kontaktu sa gelom 7 minuta i 30 sekundi
13. Posle aplikacije, podignuti prekidač aplikatora gore, skinuti ga i odložiti.
14. Staviti gel u odgovarajuću elektroforetsku kadicu, prema polaritetu naznačenom na gelu, nižom stranom gela na stranu katode.
15. Kod korišćenja SEBIA K20 kadice, staviti HYDRAGEL na most s gelom okrenutom nadole ; gel mora biti uronjen 1 cm u pufer na obe strane.
Pogledati uputstvo za upotrebu za komoru K20.
- 95 -
||
|
|
|
||
16. Uključiti kadicu u struju.
|
||
|
|
|
||
USLOVI MIGRACIJE
Zapremina pufera po segmentu
Ukupna zapremina pufera
Vreme migracije
Stalni napon
Početna jačina struje (po gelu)
17. Posle migracije, isključiti komoru i skloniti ploču s gelom.
II. FIKSACIJA
HYDRAGEL HR K20 - 2014/10
SERUM I
CSF/SERUM PAR
150 mL
300 mL
40 minuta
80 V
9 ± 1 mA
||
|
|
|
||
SEbIA K20
URIN
150 mL
300 mL
30 minuta
90 V
9 ± 1 mA
|
||
|
|
|
||
Obraditi gel prema jednoj od sledećih procedura.
Fiksacija toplim vazduhom (preporučuje se jedino uz SEBIA IS 80 Inkubator / sušač):
Potpuno osušiti gel u inkubatoru – sušaču na 80 °C (minimalno 10 min).
Fiksacija s rastvorom fiksativa :
1.
2.
3.
4.
Staviti gel u držač (isporučen sa SEBIA HYDRAGEL K20 pomoćnim pakovanjem) za dalju obradu.
Napuniti posudu (isporučena u SEBIA HYDRAGEL K20 pomoćnom pakovanju) sa 150 mL rastvora fiksativa.
Uroniti gel u rastvor fiksativa 15 minuta.
Izvaditi gel i osušiti ga toplim vazduhom na 80 °C u inkubatoru / sušaču IS 80.
VAŽNO: Gel mora biti potpuno suv.
III. bOJENJE - ODbOJAVANJE bOJE
1. Uroniti (10 minuta) osušen i ohladjen gel u rastvor za bojenje.
2. Odbojiti pozadinsku boju sa tri uzastopna postupka sve dok pozadina ne postane potpuno bezbojna i jasna.
3. Obrisati višak vode na površini gela s ubrusom i osušite ga toplim vazduhom na 80 °C. Ako je potrebno, očistiti zadnju (plastičnu) stranu suvog
filma vlažnim ubrusom.
IV. TUMAČENJE - OČITAVANJE
Vizuelno tumačite odvajanja da bi se uočile abnormalnosti u šablonu. Vizuelna posmatranja mogu se upotpuniti densinometrijom kako bi se dobile
polukvantitativne, relativne vrednosti za pojedinačne ili kombinovane frakcije proteina.
Skeniranje pomoću densinometra / skenera tako što se izabere odgovarajući program skeniranja.
KONTROLA KVALITETA
Uključiti normalan uzorak uz svako testiranje uzoraka.
REZULTATI
Vrednosti
Skeniranje densinometrom obojenih elektroforegrama daje relativne koncentracije (procente) pojedinačnih zona proteina.
Normalne vrednosti (srednje vrednosti ± 2 SD) za pojedinačne glavne elektroforetske proteinske zone, upotrebom postupka za HYDRAGEL HR K20,
ustanovljene su u zdravoj populaciji od 225 odraslih osoba (muškaraca i žena):
|
|
|
|
|
|
ZONA
Albumin
Alfa-1 globulini
Alfa-2 globulini
Beta globulini
Gama globulini
Preporučuje se da svaka laboratorija odredi sopstvene normalne vrednosti.
|
|
|
|
|
|
HYRYS
56,2 - 69,0
1,2 - 3,2
7,8 - 13,4
7,4 - 13,4
9,8 - 18,6
|
|
|
|
|
|
PHORESIS
57,5 - 67,9
1,0 - 3,8
7,2 - 12,8
7,6 - 13,6
10,3 - 18,3
|
|
|
|
|
|
Tumačenje
Tumačenje je kvalitativno. Za pomoć u tumačenju videti LITERATURU.
SERUMSKI PROTEINI
Tumačenje rezultata vrši se poredjenjem elektroforegrama ispitivanog uzorka i normalne kontrole. U slučaju povećanja, smanjenja ili dodatnih frakcija,
potrebno je potvrditi primećenu promenu drugim testovima kao što je kvantitativno odredjivanje specifičnih proteina imunoelektroforezom ili
imunofiksacijom.
Medju velikim brojem plazmatskih proteina, samo njih oko 15 ima koncentraciju koja dozvoljava da budu otkriveni na HYDRAGEL 7 HR gelu. Primarni
značaj HYDRAGEL HR K20 gela je u otkrivanju slabih monoklonskih ili oligoklonskih traka.
PROTEINI LIKVORA
Likvor je biološka tečnost s niskom koncentracijom proteina: u normalnom likvoru to je oko 30 ± 15 mg/dL. Većina proteina likvora potiče iz seruma
odakle se filtriraju i transportuju kroz krvno-likvorsku barijeru. Za analizu na HYDRAGEL HR K20 likvor mora da se koncentriše do koncentracije od
0,6 do 1 g/dL.
- 96 -
HYDRAGEL HR K20 - 2014/10
Normalni uzorak likvora poseduje sledeće zone:
• prealbumin ili transtiretin kao najbržu frakciju,
• albumin, najveća frakcija zastupljena sa oko 75 % od ukupnih proteina,
• alfa-1 zona, sadrži uglavnom a-1antitripsin,
• alfa-2 zona, sadrži uglavnom proteine velike molekulske mase ; ova frakcija je normalno veoma slaba jer ovi proteini ne mogu da prodju kroz krvnolikvorsku barijeru,
• beta frakcija, sadrži transferin
• beta-2 zona, sadrži primarno CDT transferin (transferin siromašan ugljenim hidratima) takodje se zove Tau protein,
• gama zona, sadrži uglavnom Ig G, a ponekad i Ig A i Ig M.
Povećana sinteza imunoglobulina u centralnom nervnom sistemu (intratekalna sinteza imunoglobulina) opisana je kod različitih bolesti CNS-a
uključujući demijelizaciju, zapaljenske i infektivne bolesti i autoimune reakcije.
Sinteza intertekalnog Ig CSF najčešće je povezana sa smanjenjem različitiosti Ig-a što se manifestije pojavom oligoklonskih traka koje se mogu videti
elektroforezom visoke rezolucije.
Karakteristika intratekalne sinteze Ig-a u likvoru je prisustvo oligoklonalnih traka Ig u likvoru, s odsustvom ovih traka u serumu.
Zbog ovoga neophodno je da se:
- analizira par: likvor i serum uzeti od istog pacijenta u isto vreme, uz isključenje bilo kakavog tretmana koji bi uticao na koncentraciju Ig-a seruma,
- koristi ista količina proteina (oko 1 g/dL) u svakom od ta 2 uzorka,
- prisustvo patoloških traka u gama zoni kod likvora, bez iste frakcije u serumu, potvrdi imunofiksacijom.
Imunološka potvrda prisustva traka imunoglobulina u likvoru je neophodna jer i drugi proteini mogu da daju trake u gama zoni (npr., tau frakcija,
karboanhidraza, post gama ili CRP). Ove trake nemaju isti dijagnostički značaj kao "prave" oligoklonske trake imunoglobulina.
URIN
Elektroforeza urina ima značaj za otkrivanje prisustva monoklonske komponente ili drugih urinarnih proteina.
HYDRAGEL HR K20 se koristi kao skrining test za proteine urina. On omogućava detekciju monoklonske komponente (koja može biti potvrdjena i
indentifikovana pomoću imunofiksacije) i detekciju tubularnih proteina, glomerularnih ili mešovitog porekla (koji mogu da se okarakterišu
odgovarajućom metodom, kao što je gel filtracija u SDS puferu, nefelometrijski imunoesej ili imunofiksacija s odgovarajućim antitelima).
POTVRDNI TESTOVI
U slučaju povećanja, smanjenja ili dodatnih frakcija, potrebno je potvrditi primećenu promenu drugim testovima kao što su imunohemijski postupci.
SEBIA nudi brojne specijalizovane testove:
• monoklonski proteini u serumu ili urinu: HYDRAGEL IF K20 SEBIA (kat. br. 3031) I HYDRAGEL DOUBLE IF K20 SEBIA (kat. br. 3036),
• Bence Jones proteini u urinu: HYDRAGEL BENCE JONES K20 SEBIA (kat. br. 3038),
• Tipizacija tubularnog ili glomerularnog oštećenja (molekularno sito u SDS puferu): HYDRAGEL PROTEINURIE K20 SEBIA (kat. br. 3004).
Ograničenja
LDL i HDL lipoproteini su kompleksne komponente sa veoma promenljivom prirodnom elektoroforetskom pokretljivošću koji se pomeraju iz zone beta
do zone alfa-2. Da bi se izbegle poteškoće integracije i tumačenja, HYDRAGEL gelovi su napravljeni sa posebnim hemijskim sastavom koji uglavnom
postavlja HDL u zonu alfa-2 i LDL u zonu beta.
Migracija je veoma osetljiva na sledeće parametre :
- skladištenje uzoraka,
- koncetracija lipoproteina,
- tretman lekovima (na primer heparinom),
- nivo dehidracije gela (skladištenje gela),
- varijacije u sirovinama, čak i kada su male.
Zbog ovih razloga, može da se uoči malo anodno pomeranje ovih lipoproteina, koje može da postane uočljivo sa proširenjem ili malim deljenjem zona
alfa-2 i / ili beta.
1) Procenat alfa-2 i beta frakcija ostaje potpuno nepromenjeno bez obzira na malo deljenje koje nastaje zbog promene elektroforetske pokretljivosti.
2) Karakterističan oblik beta-lipoproteinske frakcije (sa značajnom fokalizacijom i nepravilnim oblikom neće dovesti do pogrešnog tumačenja, samo
je aspekt promenjen.
Kod odmrznutih uzoraka, moguća je pojava trake na mestu aplikacije uzrokovane denaturacijom proteina.
Ne koristitI hemolizovane i uzorke plazme.
Zbog ograničenja u rezoluciji i osetljivosti zonske elektroforeze, moguće je da se neke monoklonske komponente ne otkriju ovom metodom.
Problemi u radu
Ukoliko se pojavi problem s testom, a priprema i čuvanje materijala kao i sam postupak testa izvedeni su prema propisu, pozvati tehničku službu
dobavljača.
Podaci o sigurnosti pakovanja reagenasa i informacije o rešavanju otpada dostupne su kod tehničke službe dobavljača.
PODACI O IZVODJENJU TESTA
Kvalitativna analiza
Rezultati dobijeni na HYDRAGEL HR K20 gelu pokazuju vrlo dobru reproducibilnost u i izmedju gelova za sva testirana područja i razlike se ne mogu
vizuelno odrediti prilikom ponavljanja.
Patološki i normalni uzorci seruma, urina i CSF/serum para postavljeni su na HYDRAGEL HR K20 i poredjeni sa komercijalnim gelovima visoke
rezolucije. Uzorci su pripremljeni kako preporučuje korišćen postupak. Sličnost/različitost elektroforetskih uzoraka i prisustvo monoklonskih ili
oligoklonskih traka uzeto je za osnovu poredjenja.
Vizuelno kvalitativno poredjenje izmedju dva testa zasnovano je na broju zona i njihovoj lokaciji. Rezultati ova dva postupka su se slagali kod svih
116 uzoraka i podudarali su se s kliničkom dijagnozom.
Patološki serum koji sadrži monoklonsku komponentu (identifikovanu i kvantifikovanu na drugi način) serijski je razblažen s normalnim serumom, a
pojednačna razblaženja testirana su elektroforezom. Osetljivost je odredjena s najvećim serijskim razblaženjem koje je dalo primetnu traku bojenjem
s acidviolet bojom, i iznosila je 0,1 g/dL.
- 97 -
HYDRAGEL HR K20 - 2014/10
Polukvantitativna analiza
Za polukvantitativnu primenu, rezultati dobijeni s HYDRAGEL HR K20 pokazuju vrlo dobru reproducibilnost u i izmedju gelova za sve testirane aspekte.
Razlike prilikom ponavljanja nisu mogle da se vizuelno odrede, srednja vrednost CV bila je 3,8 %.
Postupak s HYDRAGEL HR K20, acidviolet i amidocrnom bojom poredjen je s drugom dostupnom komercijalnom "HR" gel metodom (tradicionalna
HR separacija serumskih proteina i bojenje s acidviolet bojom).
Radi mogućeg poredjenja, svi elektroforegrami su bili skenirani (žuti filter) kao 5-zonalno razdvajanje.
Klinički serumski uzorci (n = 56) analizirani su svim postupcima i relativne koncentracije za svaku frakciju poredjene su korišćenjem linearne regresivne
analize. Srednja vrednost CV za sve proteinske frakcije, s oba rastvora za bojenje, bila je 0,952.
|
|
|
|
|
||
FRAKCIJE
Albumin
Alfa-1
Alfa-2
beta
Gama
|
|
|
|
|
|
||
Koeficijent
korelacije
0,960
0,965
0,920
0,909
0,985
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
||
HYDRAGEL HR K20 (acidviolet)
Nagib
Odsečak
Područje
na y-osi
0,95
1,35
35,4 - 65,6
1,02
0,27
1,7 - 7,9
0,93
1,00
6,5 - 24,3
0,95
0,19
5,3 - 20,4
0,95
2,41
9,5 - 39,4
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
||
HYDRAGEL HR K20 (amidocrna)
Koeficijent
Nagib
Odsečak
Područje
korelacije
na y-osi
0,953
0,96
2,42
38,0 - 68,5
0,963
1,17
- 0,17
1,2 - 9,0
0,966
0,95
0,29
6,3 - 24,4
0,936
0,87
0,69
5,0 - 19,4
0,962
1,03
0,01
6,1 - 38,4
|
|
|
|
|
|
||
Patološki serum koji sadrži monoklonsku komponentu (identifikovanu i kvantifikovanu na drugi način) serijski je razblažen s normalnim serumom, a
pojedinačna razblaženja testirana su elektroforezom, korišćenjem HYDRAGEL HR K20 postupka. Osetljivost je odredjena s najvećim serijskim
razblaženjem koje je dalo primetnu traku bojenjem s acidviolet i amodocrnom bojom.
Približno ista osetljivost/intenzitet bojenja uočena je kada je elektroforeza izvodjena sa čistim serumom koji je bojen s amidocrnom bojom u poredjenju
sa serumom razblaženim u odnosu 1/4, bojenim acidviolet bojom, a iznosio je 0,1 g/dL.
Analize su bile linearne do najmanje 5,8 g/dL albumina i 3,9 g/dL gama globulina za svaki postupak bojenja.
NAPOMENA: Detekcioni limit može da se razlikuje u zavisnosti od položaja monoklonske komponente i poliklonske pozadine u gama zoni.
MIGRACIJA
- 98 -
HYDRAGEL HR K20 - 2014/10
bIbLIOGRAPHIE / bIbLIOGRAPHY
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.;
17.
Cameron JS. 1987. The nephrotic syndrome. Am J Kidney Dis, 10 : 157-171.
Chopin N. 1991. Étude de la protéinurie. Inf Tech Biol, 1 : 23-28.
Cohen R, François B, Sabot JF, Bernard P, Picq JP, Adeleine P. 1985. Étude comparative de l’immunoélectrophorèse urinaire et de quatre index
de sélectivité glomérulaire au cours des glomérulopathies chroniques. Path Biol, 33 : 23-26.
Davenport RD, Keren DF. 1988. Oligoclonal bands in cerebrospinal fluids, significance of corresponding bands in serum for diagnosis of multiple
sclerosis. Clin Chem, 34 : 764-765.
Joachim GR, Cameron JS, Chwartz M, Belker EL. 1964. Selectivity of protein excretion in patients with the nephrotic syndrome. J Clin Invest, 43,
2332-2346.
Keren DF, “High resolution electrophoresis and immunofixation techniques and interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 1994,
397 pp.
Laurell DB. 1972. Comparison and variation of the gel electrophoresis fractions of plasma cerebrospinal fluid and urine. Scand J Clin Lab
Investigation, 29 : 71-82.
Le Carrer D. 1990. Protéinuries : Mise au point sur leur exploration biologique en 1990. L’Eurobiologiste, 190 : 395-405.
Le Carrer D, Chopin N. 1994. Profil protéique urinaire : Proposition d’un protocole d’exploration biologique des protéinuries. Revue française des
laboratoires, 269 : 29-37.
Le Carrer D, Nicolas A, Ducasse L. 1992. L’analyse des protéinuries au laboratoire de biologie en 1992. Revue française des laboratoires, 225 :
41-47.
Linstedt G, Lindberg PA. 1974. Loss of tubular proteinuria pattern during urine concentration with a commercial membrane filter cell. Clin Chem
Acta, 56 : 125-126.
Olsson JE, Link M. 1973. Immunoglobulin abnormalities in multiple sclerosis. 1973. Arch Neurol, 28 : 392-399.
Papadopoulos NM, Costello R, Kay AD, Cuttler NR, Papoport SL. 1984. Combined immunochemical and electrophoretic determination of protein
in paired serum and cerebrospinal fluid samples. Clin Chem, 30 : 1814-1816.
Pearson SD, Wu JT. Sensitive, specific detection of oligoclonal banding in cerebrospinal fluid by agarose gel electrophoresis. 1989. Clin Chem,
35 : 1997.
Philipon C. 1989. Protéines urinaires : Intérêt clinique et interprétation. Technique et Biologie, 6 : 239-249.
Waller KV, Ward KM, Mahan JD, Wismatt DK. 1989. Current concepts in proteinuria. Clin Chem, 35 : 755-765.
Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité.
Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97.
- 153 -
HYDRAGEL HR K20 - 2014/10
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 1
Figure 2
1 2
3 4
5 6
7
Figure 3
Figure 4
1 2
3 4
5 6
7
1 2 3
4 5 6
7
7
5 6
3 4
1 2
- 154 -
Download

HYDRAGEL HR K20