HYDRAGEL ISO-CK K20
Ref. 3024
2014/10
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2014/10
NAMENA
HYDRAGEL ISO-CK K20 namenjen je za identifikaciju i kvantifikaciju tri izoenzima kreatin kinaze (CK) u humanom serumu elektroforezom na alkalno
puferovanom (pH 8,4) agaroznom gelu. Osušeni gelovi spremni su za vizuelno tumačanje i denzitometriranje da bi se odredila tačna relativna
koncentracija pojedinih zona.
Svaki agarozni gel namenjen je za analizu 7 uzoraka na HYDRAGEL ISO-CK K20 pakovanju.
Za in vitro dijagnostičku primenu.
PRINCIP TESTA
Izoenzimi kreatin kinaze sastoje se od dve subjedinice : M (mišićne) i B (moždane) koje su grupisane u dimere. Postoje tri osnovne kombinacije
subjedinica i tri izoenzima : MM, uglavnom lokalizovan u srcu i skeletnoj muskulaturi, MB u srčanom mišiću i BB u moždanom tkivu.
Svaka subjedinica ima specifično električno naelektrisanje koje uslovljava karakterističnu pokretljivost pojedinih CK izoenzima. Na HYDRAGEL
7 ISO CK/LD gelovima BB frakcija je najviše anodna, MM frakcija je najviše katodna dok je MB u sredini.
Povišene vrednosti CK izoenzima potvrdjene su kod infarkta miokarda (MI). Koncetracija MB je povećana 4 – 8 sati posle infarkta miokarda. Analiza
CK izoenzima ide uglavnom zajedno sa LD (laktat dehidrogenaza) izoenzimima i/ ili s drugim ranim srčanim markerima da bi se potvrdila ili isključila
dijagnoza MI, procenila težina bolesti i pratilo bolesnikovo stanje.
Svi CK izoenzimi katalizuju istu reakciju što je iskorišćeno za njihovu vizuelizaciju. U HYDRAGEL ISO-CK K20, uzorak seruma podvrgne se elektroforezi
a razdvojeni izoenzimi se vizuelizuju upotrebom specifičnog obojenog supstrata prema sledećim reakcijama :
Kreatin Fosfat + ADP
ATP + D-Glukoza
CK
Kreatin + ATP
HEKSOKINAZA
Glukoza-6-Fosfat + NADP
Glukoza-6-Fosfat + ADP
G-6-PDH
NADPH + 6-Fosfoglukonolakton
NADPH + PMS
NADP+ PMSH
PMSH + TNBT
PMS + TNBT redukovani
talog formazana
Količina nastalog formazana proporcionalna je enzimskoj aktivnosti CK.
SKRAĆENICE :
CK : Kreatin kinaza
HK : Heksokinaza
G-6-PDH : Glukoza -6-fosfat dehidrogenaza
ADP : Adenozin 5' Difosfat
ATP : Adenozine 5' Trifosfat
NADP : Nikotin Adenin Dinukleotid Fosfat
NADPH : Nikotinamide Adenin Dinukleotide Fosfat reducirani
PMS : Fenazin Metosulfat
PMSH : Fenazin Metosulfate redukovani
TNBT : Tetranitro Blue Tetrazolium
REAGENSI I MATERIJALI ISPORUČENI U HYDRAGEL ISO-CK K20 PAKOVANJU
UPOZORENJE : Pogledajte listove sa bezbednosnim podacima.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
PROIZVOD
Agrozni gelovi (spremni za upotrebu)
HYDRAGEL ISO CK/LD pufer (koncentrovan)
Rastvor za aktivaciju (spreman za upotrebu)
Rastvarač za supstrat (spreman za upotrebu)
Hromogen (koncentrovan)
ISO-CK Supstrat (zamrznut – osušen)
ISO CK/LD rastvor za zaustavljanje reakcije (spreman za upotrebu)
Rastvor za odbojavanje (koncentrovan)
Aplikatori sa 7 zubaca (spremni za upotrebu)
Filter papiri tanki
Filter papiri debeli
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
KAT. bR. 3024
10 gelova
3 bočice po 10 mL
1 bočica od 0,75 mL
1 bočica od 40 mL
1 bočica od 3 mL
10 bočica
1 bočica od 40 mL
1 bočica od 100 mL
1 pakovanje od 10 komada
1 pakovanje od 10 komada
1 pakovanje od 10 komada
Tokom transporta, pakovanje može da stoji van frižidera (15 do 30 °C) 15 dana bez neželjenih efekata na performansu.
ZA OPTIMALNE REZULTATE :
Svi reagensi iz istog pakovanja moraju se koristiti zajedno i prema datom uputstvu.
PAŽLJIVO PROČITATI UPUTSTVO ZA UPOTREBU!
- 85 -
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
SEBIA UPUTSTVO ZA UPOTREBU - Srpski
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2014/10
1. AGAROZNI GELOVI
Priprema
Agaroza gelovi su spremni za upotrebu. Svaki gel sadrži : agarozu ; rastvor pufera pH 8,4 ± 0,5 ; aditive, nisu opasni u koncetracijama primenjenim za
dobijanje optimalne performanse.
Upotreba
Kao podloga za elektroforezu izoenzima laktat dehidrogenaze.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Gelove čuvati u horizontalnom položaju u originalnim zaštitnim pakovanjima, na sobnoj temperaturi (15 – 30 °C) ili u frižideru (2 – 8 °C). (Strelica na
prednjem delu kutije gela mora biti okrenuta nagore.)
Izbegavati promene temperature prilikom čuvanja i držanje u blizini prozora ili izvora toplote.
Stabilni su do datuma naznačenog na pakovanju i na nalepnicama pakovanja svakog gela.
NE ZAMRZAVATI!
Baciti ako :
(I) se na površini gela pojave kristali, talog ili tekstura gela postane vrlo mekana (posledica zamrzavanja gela) ;
(II) je vidljiv porast bakterija ili gljivica ;
(III)se u kutiji gela nalazi velika količina tečnosti (kao rezultat isticanja pufera iz gela zbog loših uslova čuvanja).
2. HYDRAGEL ISO CK/LD PUFER
Priprema
Svaka bočica nerazblaženog rastvora pufera treba razblažiti do 1 litar sa destilovanom ili dejonizovanom vodom.
Nakon razblaživanja, radni rastvor sadrži : rastvor pufera pH 8,4 ± 0,5 ; aditive, nisu opasni u koncetracijama primenjenim za dobijanje optimalne
performanse.
Upotreba
Elektroforetski pufer.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Koncentrovan rastvor pufera čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Stabilan je nekoliko godina, a najmanje do isteka roka trajanja naznačenog na
pakovanju ili na nalepnici bočice s puferom. Razblaženi rastvor pufera stabilan je godinu dana, na sobnoj temperaturi u zatvorenoj boci. Baciti razblaženi
pufer ako promeni izgled, npr. zamuti se zbog kontaminacije mikrobima.
NAPOMENA : Rastvor pufera tokom čuvanja može da požuti, ali to ne utiče negativno na izvodjenje.
3. RASTVOR ZA AKTIVACIJU *
Priprema
Rastvor za aktivaciju spreman je za upotrebu. Sadrži : ß-Merkaptoetanol.
Upotreba
Za pripremu uzoraka pre elektroforetskog razdvajanja.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Rastvor za aktivaciju čuvati u frižideru. Stabilan je do isteka roka upotrebe naznačenog na pakovanju ili nalepnici na bočici rastvora za aktivaciju.
Baciti rastvor za aktivaciju ako promeni izgled, npr. zamuti se zbog kontaminacije mikroorganizmima.
Rastvor za aktivaciju ne sme imati talog.
VAŽNO : Odmah zatvoriti posle svake upotrebe da bi se izbeglo propadanje zbog oksidacije.
NAPOMENA : ISO-CK rastvor za aktivaciju treba da ima jak miris na ß-merkaptoetanol. Ako je taj miris slab ili ga nema, to je znak slabljenja ili
potpunog gubitka aktivnosti. Rastvor za aktivaciju može se regenerisati dodavanjem čistog ß-merkaptoetanola. Dodati 7 % na preostalu zapreminu
rastvora.
4. RASTVARAČ ZA SUPSTRAT
Priprema
Supstrat-rastvarač je spreman za upotrebu. On sadrži : rastvor pufera pH 6,7 ± 0,5 ; aditive, nisu opasni u koncetracijama primenjenim za dobijanje
optimalne performanse.
Upotreba
Za pripremanje rastvora za supstrat kao što je opisano pod br. 6.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Rastvarač za supstrat čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Stabilan je do datuma roka trajanja naznačenog na pakovanju i na nalepnici bočice
rastvarača.
Baciti rastvarač za supstrat ako promeni izgled, npr. zamuti se zbog mikrobiološke kontaminacije.
Rastvor za supstrat ne sme imati talog.
5. HROMOGEN*
Priprema
Hromogen je spreman za upotrebu. Sadrži : TNBT (Tetranitroblue tetrazolium) u dimetilformamidu (DMF).
Upotreba
Za pripremu rastvora za razvijanje boje kao što je opisano pod br. 6.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Hromogen čuvati u frižideru (2 – 8 °C). Stabilan je do datuma naznačenog na pakovanju ili nalepnici bočice.
- 86 -
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2014/10
6. ISO-CK SUPSTRAT*
Priprema
Svaka bočica supstrata sadrži : govedji albumin, glukozu, ADP (Adenozin 5' difosfat), NADP (Nikotinamid Adenin Dinukleotid Fosfat), heksokinazu (iz
kvasca), glukoza-6-fosfat dehidrogenazu (iz kvasca), PMS (Fenazin Metosulfat) i aditive, neškodljive u upotrebljenim koncentracijama, neophodne za
optimalno izvodjenje.
Rastvor za razvijanje boje pripremiti daleko od svetlosti, neposredno po početku migracije.
U bočicu sa supstratom (1/2) dodati 2 mL sredstva za rastvaranje supstrata. Zatvoriti i lagano promešati bočicu. Ostaviti na sobnoj temperaturi.
Neposredno pre upotrebe dodati 0,15 mL hromogena i promešati.
Upotreba
Za razvijanje enzimske reakcije sa izoenzimima kreatin kinaze posle elektroforeze.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Supstrat čuvati u frižideru. Stabilan je do isteka roka upotrebe naznačenog na pakovanju ili nalepnici bočice.
7. ISO CK/LD RASTVOR ZA ZAUSTAVLJANJE REAKCIJE
Priprema
Rastvor za blokiranje je spreman za upotrebu. On sadrži kiseli rastvor pH ≈ 2.
Upotreba
Za zaustavljanje reakcije enzima sa supstratom posle inkubacije gelova.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Rastvor za blokiranje može se čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Stabilan je do isteka roka trajanja naznačenog na bočici. Baciti rastvarač za
supstrat ako promeni izgled, npr. zamuti se zbog mikrobiološke kontaminacije.
8. RASTVOR ZA ODbOJAVANJE
Priprema
Svaka bočica koncentrovanog rastvora za odbojavanje razblažuje se destilovanom ili dejonizovanom vodom do zapremine od 100 litara. Praktično je
razblažiti 1 mL koncentrovanog rastvora sa 1 litra destilovane vode (što odgovara zapremini boce u kojoj je rastvor za odbojavanje).
Nakon razblaživanja, radni rastvor za odbojavanje sadrži kiseli rastvor pH ≈ 2.
Upotreba
Za ispiranje gela posle skeniranja.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Koncentrovan rastvor za odbojavanje čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Stabilan je do datuma isteka roka trajanja na pakovanju ili na nalepnici
bočice s rastvorom. Radni rastvor za odbojavanje stabilan je nedelju dana na sobnoj temperaturi u zatvorenoj bočici.
Ne dodavati natrijum azid!
Baciti ako se pojave znaci propadanja, npr. zamuti se zbog mikrobiološke kontaminacije.
Da biste sprečili razvoj mikroba u razblaženom rastvoru za odbojavanje koji se čuva duže od jedne nedelje, dodati 5 µL/dL od ProClin 300 ili CLEAN
PROTECT (SEBIA, PN 2059, 1 bočica od 5 mL).
Pogledati uputstvo za upotrebu za CLEAN PROTECT.
Radni rastvor za odbojavanje sa dodatim ProClin ili CLEAN PROTECT stabilan je u zatvorenoj boci na sobnoj temperaturi ili u frižideru do datuma
isteka roka trajanja označenog na pakovanju ili na nalepnici bočice sa rastvorom za odbojavanje.
9. APLIKATORI
Upotreba
Pojedinačni aplikatori za nanošenje uzorka.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Aplikatore čuvati na suvom mestu, na sobnoj temperaturi ili u frižideru.
10. FILTER PAPIRI TANKI
Upotreba
Pojedinačni tanki papirni jastučići za upijanje viška tečnosti s površine gela pre nanošenja uzorka.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Aplikatore čuvati na suvom mestu, na sobnoj temperaturi ili u frižideru.
11. FILTER PAPIRI DEbELI
Upotreba
Pojedinačni debeli papirni jastučići za upijanje viška rastvora za zaustavljanje reakcije s površine gela, pre sušenja.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Čuvati na suvom mestu, na sobnoj temperaturi ili u frižideru.
* NAPOMENA : Rastvor za aktivaciju, hromogen i ISO-CK supstrat mogu se tokom transporta držati 15 dana van frižidera, na temperaturi od 15 do
30 °C, bez ikakvih negativnih posledica na izvodjenje testa.
REAGENSI KOJI SU POTREbNI ALI NISU PRILOŽENI
FIZIOLOŠKI RASTVOR
Priprema
Pripremiti 0,15 M (0,9 g/dL) natrijum hlorida s destilovanom ili dejonizovanom vodom.
- 87 -
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2014/10
Upotreba
Za razblaživanje serumskih uzoraka da bi se postigla potpuna aktivnost CK od oko 750 IU/L kada je ta aktivnost veća od 750 IU/L.
Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja
Fiziološki rastvor čuvati na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Baciti posle 3 meseca ako promeni izgled, npr. zamuti se zbog mikrobne kontaminacije. Za
čuvanje u dužem periodu dodati 0,1 g/dL natrijum azida.
NAPOMENE :
Probe koje su izvršene za validaciju reagenasa pokazale su da, za različite rastvore i upotrebom prilagođene opreme za zapreminu rekonstitucije,
varijacija od ± 5 % na krajnju zapreminu nema neželjenih efekata na analizu.
U destilovanoj ili dejonizovanoj vodi koja je upotrebljena za razblaživanje rastvora, ne sme da rayvijaju bakterije ili buđ (upotrebite filter ≤ 0,45 µm) i
treba da imate otpornost veću od 10 megaoma x cm.
POTREbNA OPREMA I PRIbOR, NISU ISPORUČENI U PAKOVANJU
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Ispravljač : MG 300 SEBIA, kat. br. 1302 ili MG 500 SEBIA, kat. br. 1303.
HYDRAGEL K20 APLIKATOR SEBIA, kat. br. 1409, sadrži HYDRAGEL K20 nosač aplikatora.
HYDRAGEL ENZ K20 pomoćno pakovanje, SEBIA, kat. br. 1422, sadrži šablonski nosač K20 i šablon za nanošenje reagensa R1.
Vlažna komora za čuvanje, kat. br. 1270.
Kadica za elektroforezu : K20 SEBIA, kat. br. 1400.
Posude i držači gela za procesiranje ploča s gelom : HYDRAGEL K20 pomoćno pakovanje SEBIA, kat. br. 1420.
Pipete : 10 µL, 200 µL i 5 mL.
Inkubator-sušilica : IS 80 SEBIA, kat. br. 1430.
Densinometar / skener koji može da skenira ploče sa gelom 82 x 51 mm : HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA ili PHORESIS softver za ravan skener.
Pogledajte uputstvo proizvođača za rad i procedure kalibracije.
10. Materijali za kontrolu kvaliteta ("Enzycontrol" SEBIA, kat. br. 4790).
UZORCI ZA ANALIZU
Sakupljanje i čuvanje uzoraka
Za analizu se preporučuju sveži uzorci seruma.
Uzorci moraju biti sakupljani prema ustaljenoj proceduri koja se koristi u kliničkom laboratorijskom testiranju. Čuvati uzorke najduže nedelju dana na
2 – 8 °C.
Priprema uzoraka
Pomešati 500 µL uzorka seruma sa 5 µL rastvora za aktivaciju i inkubirati 10 minuta na sobnoj temperaturi.
Razblažiti uzorak seruma fiziološkom rastvorom da bi se postigla ukupna CK aktivnost od 750 IU/L kad je ta aktivnost > 750 IU/L.
Uzorci koje treba izbegavati
Ne koristiti hemolizovane uzorke. Enzimi iz eritrocita mogu da ometaju reakciju.
Ne analizirati uzorke koji sadrže inhibitore enzimatske aktivnosti CK kao što su heparin, EDTA, citrat, fluoridi ili indoacetat.
NAPOMENA : Epruvete za sakupljanje bioloških uzoraka opisane su u dostupnoj dokumentaciji za predanalitičku fazu biomedicinske analize (podaci
koje obezbeđuju proizvođači epruveta, uputstva i preporuke o sakupljanju bioloških uzoraka…). Ukoliko nema nikakvih indikacija o tipu epruveta koje
treba koristiti u uputstvu za upotrebu, pogledajte ovu dokumentaciju, a za dimenzije epruveta koje treba koristiti, pogledajte SEBIA dokument
"Characteristics of tubes to use according to the instrument" (Karakteristike epruveta koje treba koristiti u skladu sa instrumentom). Predanalitička faza
mora da se izvodi u skladu sa najnovijim, različitim preporukama, uključujući one koje obezbeđuju proizvođači epruveta, kao i primenjivim propisima.
POSTUPAK
I. MIGRACIJA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Staviti HYDRAGEL K20 nosač aplikatora na ravnu površinu i podići deo nosača s upisanim brojevima.
Dodati 120 µL destilovane ili dejonizovane vode u donju trećinu rama ucrtanog na HYDRAGEL K20 nosaču aplikatora.
Raspakovati HYDRAGEL agaroznu ploču s gelom.
Brzo i ravnomerno staviti tanki filter papir na površinu gela kako bi upio višak tečnosti. Odmah skloniti papir.
PAŽNJA : Ne ostavljati filter papir predugo na površini gela da ne bi došlo do dehidracije.
Staviti ploču s gelom (gel okrenut nagore) na uglove naznačene na dnu okvira.
Saviti gel i polako ga spustiti u vodu. Voditi računa da se ne stvaraju mehurići, da voda prekriva celu ploču s gelom i da je gel poravnat s
ucrtanim ramom.
Spustiti nosač aplikatora tako da su numerisane oznake u srednjem, a prekidač u gornjem položaju.
Staviti jedan aplikator na ravnu podlogu s brojevima jažica u gornjoj desnoj poziciji.
Dodati 10 µL uzorka seruma u svaku jažicu aplikatora. Aplikator napuniti za 2 minuta.
- Aplikator upotrebiti bez odlaganja.
- Za kasniju upotrebu (najduže 8 sati), aplikator staviti u vlažnu komoru sa zupcima okrenutim nagore (koristiti plastični zaštitni ram), a čitavu
komoru držati u frižideru. Ploču s gelom namestiti na HYDRAGEL K20 nosač aplikatora neposredno pre upotrebe.
Za detaljnije informacije pogledati uputstvo za Vlažnu komoru.
Skinuti zaštitni ram sa zubaca aplikatora.
Postaviti aplikator u poziciju 6 nosača.
VAŽNO : Brojevi na aplikatorima moraju biti okrenuti prema operateru.
Spustiti nosač aplikatora s prekidačem tako da dodje u kontakt s površinom gela. NE GURATI NOSAČE DOLE DO KRAJA.
- 88 -
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2014/10
13. Posle 10 minuta, uključiti prekidač da bi se aplikator podigao, a zatim aplikator skloniti i baciti.
14. Staviti gel u odgovarajuću elektroforetsku komoru prema polaritetu istaknutom na gelu, donju stranu gela na katodnu stranu. Pri korišćenju
komore SEBIA K20, staviti HYDRAGEL na most tako da je strana s gelom okrenuta nadole. Gel treba da uroni u pufer oko 1 cm sa svake
strane.
Za detaljnije informacije videti uputstvo za upotrebu za K20 komoru.
15. Uključiti komoru u izvor struje.
|
|
|
|
|
|
USLOVI MIGRACIJE
Zapremina pufera po odeljku
Ukupna zapremina pufera
Vreme migracije
Konstanti napon
Početna jačina struje (po gelu)
16. Posle migracije, isključiti komoru i skloniti ploču s gelom.
II. VIZUELIZACIJA
|
|
|
|
|
|
SEbIA K20
150 mL
300 mL
20 minuta
80 V
10 ± 2 mA
|
|
|
|
|
|
VAŽNO : Preporučuje se prethodno zagrevanje inkubatora-sušača 5 minuta do temperature dole navedene, pre postavljanja nosača K20 i gela
na inkubaciju.
1. Postaviti šablonski nosač na ravnu podlogu i skloniti poklopac.
2. Sipati 120 µL destilovane ili dejonizovane vode na donju trećinu ucrtanog rama na šablonskom nosaču.
3. Postaviti ploču s gelom (gel okrenut nagore) na uglove naznačene na dnu okvira.
4. Saviti gel i polako ga spustiti na vodenu površinu. Voditi računa da se ne stvaraju mehurići, da voda prekriva celu ploču s gelom i da je gel
poravnat s ucrtanim ramom.
5. Postaviti šablon za aplikaciju reagensa R1 na nosač kako sledi :
- Postaviti šablon za aplikaciju na za to predvidjena mesta.
- Držati ručku šablona i spustiti šablon na gel.
6. Posle mešanja hromogena i supstrata u bočici, dodati 2 mL ISO-CK rastvora supstrata :
- Pipetu držati vertikalno.
- Lagano pritisnuti vrh pipete u rupicu šablona.
- Pažljivo i progresivno uštrcati reagens pazeći da se ne stvaraju mehurići.
7. Zatvoriti poklopac šablonskog nosača.
8. Postaviti nosač u inkubator-sušilicu na 37 °C tokom 30 minuta.
III. ELIMINACIJA SUPSTRATA I APLIKACIJA RASTVORA ZA ZAUSTAVLJANJE REAKCIJE
1. Posle inkubacije, skloniti šablonski nosač iz inkubator-sušilice i staviti ga na ravnu površinu.
2. Otvoriti poklopac.
3. Ukloniti preostali rastvor supstrata :
- Pipetu držati vertikalno i vrh lagano pritisnuti u rupicu šablona.
- Pažljivo i progresivno uvući reagens.
4. Pipetirati 2 mL rastvora za zaustavljanje reakcije. Ne stvarati mehuriće vazduha.
5. Zatvoriti poklopac šablonskog nosača.
6. Staviti nosač u inkubator-sušilicu pri 37 °C tokom 10 minuta.
IV. UKLANJANJE RASTVORA ZA ZAUSTAVLJANJE REAKCIJE, APLIKACIJA FILTER-PAPIRA I SUŠENJE GELA
1. Izvaditi nosač iz inkubator-sušilice i otvoriti poklopac.
2. Skloniti rastvor za zaustavljanje reakcije (videti Eliminaciju supstrata).
3. Skloniti šablon :
- Prihvatiti šablon za dršku
- Podići ga i skloniti.
4. Gel ostaviti na ploči nosača.
5. Staviti jedan debeli filter-papir na gel :
- Nasloniti filter-papir pod uglom od 45°.
- Poravnati donju stranu filter-papira s krajevima gela.
- Spustiti filter-papir na gel.
- Pritisnuti čitavu površinu filter-papira da bi se omogućilo njegovo savršeno prianjanje na gel.
6. Zatvoriti poklopac nosača.
7. Postaviti nosač u inkubator-sušilicu na 37 °C tokom 3 minuta.
8. Posle 3 minuta, izvaditi nosač iz inkubator-sušilice i otvoriti poklopac.
9. Skloniti filter-papir i osušiti gel na 51 °C.
10. Isprati šablon destilovanom vodom ili alkoholom i dobro ga osušiti mekanim apsorbujućim papirom. Pre ponovne upotrebe, proveriti da li je
šablon potpuno suv.
V. SKENIRANJE GELA
1. Očistiti pozadinu (plastičnu potpornu stranu) sasušenog filma vlažnim, mekanim papirom.
2. Ako je potrebno, mekanim papirom ukloniti bilo kakvu nečistoću s gela.
3. Skeniranje pomoću densinometra / skenera tako što se izabere odgovarajući program skeniranja.
VI. PRANJE GELA
Posle skeniranja, gel treba isprati da bi se elektroforegrami bolje sačuvali (da se spreči pozadinska obojenost).
1. Uroniti gel u rastvor za odbojavanje boje na 10 minuta.
2. Osušiti gel vrućim vazduhom (51 °C).
- 89 -
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2014/10
KONTROLA KVALITETA
Uz svako izvodjenje testa preporučuje se analiziranje kontrolne krvi (kao Enzycontrol SEBIA, kat. br. 4790).
REZULTATI
Vrednosti
Skeniranje nije potrebno ako uzorci ne sadrže MB ili BB frakciju.
Humani serum ima tri frakcije :
• MM frakcija je najizraženija u normalnom ljudskom serumu s vrlo malom pokretljivošću (gama zona).
• MB frakcija ima srednju pokretljivost (beta zona).
• BB frakcija ima najveću pokretljivost (alfa-1 zona).
Normalne vrednosti :
CK MM : 97 do 100 %
CK MB : 0 do 3 % ako je aktivnost CK izmedju 15 i 500 IU/L
CK MB : 0 do 4 % ako je aktivnost CK veća od 500 IU/L
CK BB : 0 %
Preporučuje se da svaka laboratorija odredi sopstvene normalne vrednosti.
Tumačenje rezultata
• MB frakcija se povećava 4 – 8 sati posle infarkta miokarda.
• BB frakcija je povećana uglavnom kod nekih bolesti i trauma nervnog sistema.
• Ukupna CK (uglavnom MM) povećana je u sledećim slučajevima :
- hirurgija, trauma,
- intezivne fizičke vežbe,
- mišićna distrofija,
- miopatia,
- polimiositis,
- hipotireoza,
- lekovi, intramuskularne injekcije.
• Makro CK (tip 1) je kompleks izmedju CK i imunoglobulina. On se nalazi izmedju MM i MB frakcija.
• Mitohondrijski CK (tip 2) nalazi se na katodnoj strani MM frakcije.
Problemi u radu
Ukoliko se pojavi problem s testom, a priprema i čuvanje materijala kao i sam postupak testa izvedeni su prema propisu, pozvati tehničku službu
dobavljača.
Dokumentacija o sigurnosti reagenasa pakovanja i informacije o rešavanju otpada dostupne su kod tehničke službe dobavljača.
PODACI O IZVODJENJU
SEBIA's HYRYS denzitometar korišćen je za sva denzitometrijska merenja. Pojedinačne vrednosti, srednja vrednost, SD i CV, prikazana je u tabeli koja
sledi. Rezultati pokazuju vrlo dobru reproducibilnost za sve testirane aspekte : Srednja CV vrednost bila je 3,2 %.
Reproducibilnost unutar gelova
Tri različita serumska uzorka testirana su elektroforetski postupkom HYDRAGEL ISO-CK K20. Uzorci A i B bili su serumi s povišenim MB, a uzorak C
normalni serum.
Svaki uzorak primenjen je u svih 7 traka na gelovima iste serije.
Elektroforegrami su obradjeni denzitometrijski, a u tabeli su prikazani : srednja vrednost, SD i CV za svaku CK frakciju (MB i MM) i za svaki uzorak.
PARAMETRI
Uzorak A
SREDNJA VREDNOST (%)
SD
CV (%)
Uzorak B
SREDNJA VREDNOST (%)
SD
CV (%)
Uzorak C
SREDNJA VREDNOST (%)
SD
CV (%)
Reproducibilnost izmedju gelova
Mb
MM
14,1
0,3
2,2
85,9
0,3
0,4
2,2
0,1
6,5
97,8
0,1
0,1
11,0
0,2
1,4
89,0
0,2
0,2
Šest različitih serumskih uzoraka Enzycontrol SEBIA analizirano je na 10 gelova iste serije korišćenjem postupka HYDRAGEL ISO-CK K20. Srednja
vrednost, CV, SD i CV (n = 10), izračunata je za svaki serumski uzorak i svaku CK frakciju. Rezultati su bili gotovo isti za sve uzorke. Sledeća tabela
pokazuje raspone SD i CV svih uzoraka i srednju vrednost CV za sve uzorke (n = 10).
- 90 -
|
|
|
|
|
|
|
|
CK FRAKCIJA
MM
MB
BB
Tačnost – Studija poredjenja
SD
0,3 - 1,3
0,1 - 1,1
1,0
|
|
|
|
(%) |
| SREDNJA VREDNOST
1,0
|
|
6,5
|
|
3,6
|
|
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2014/10
CV (%)
0,3 - 2,4
3,0 - 10,0
3,6
Trideset (30) različitih serumskih uzoraka (normalnih i patoloških) analizirano je korišćenjem pakovanja SEBIA HYDRAGEL ISO-CK K20 i drugih
komercijalno dostupnih testova za elektroforetsko odredjivanje izoenzima kreatin kinaze. U vizuelnoj detekciji CK izoenzima postojala je savršena
podudarnost izmedju dva testa. Rezultati linearne regresione analize denzitometrijskih vrednosti MB i MM frakcija (n = 30) prikazani su u tabeli.
|
|
|
|
PARAMETAR
MB frakcija
MM frakcija
y = SEBIA vrednosti
Osetljivost
|
|
|
|
Koeficijent korelacije
0,988
0,988
|
|
|
|
Odsečak na y osi
- 0,102
0,749
|
|
|
|
Nagib
0,993
0,993
|
|
|
|
Raspon % vrednosti
(SEbIA test)
0,0 – 14,4
85,6 – 100,0
|
|
|
|
Patološki serumski uzorak s MB frakcijom aktivnosti 40 IU/L serijski je razblaživan, a razblaženja su elektroforezovana pomoću postupka HYDRAGEL
ISO-CK K20. Posle denzitometrije, najniža detektovana aktivnost MB frakcije bila je 2,5 IU/L.
Linearnost
Serijska razblaženja uzorka koji sadrži MM i MB frakcije testirana su, od totalne CK aktivnosti od 750 IU/L do 20 IU/L. Sistem je bio linearan u celom
području merenja.
- 91 -
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2014/10
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
bIbLIOGRAPHIE / bIbLIOGRAPHY
Abbott LB, Van Lente F, 1985. Procedure for characterization of creatine kinase variants on agarose electrophoretograms. Clin Chem, 31, 3 : 445.
Anido VA, Conn RB, Mengoli HF, Anido G, 1974. Diagnostic efficacy of myocardial creatine phosphokinase using polyacrylamide disk gel electrophoresis. Am J Clin Pathol, 61 : 599.
Cawley LP, 1969. Electrophoresis and immunoelectrophoresis. Little, Brown and Company, Boston.
Christenson RH, Azzazy HME, 1998. Biochemical markers of the acute coronary syndromes. Clin Chem, 44 : 1855.
Doran GR, Wilkinson JH, 1975. The origin of elevated activities of creatine kinase and other enzymes in the sera of patients with myxedema. Clin
Chim Acta, 62 : 203.
Dubo H, Park DC, Pennington RJT, Kalbag RM, Walton JN, 1967. Serum-creatine-kinase in cases of stroke, head injury and meningitis. Lancet, 2 : 743.
Jockers-Wretou E, Pfleiderer G, 1975. Quantitation of creatine kinase isoenzymes in human tissues and sera by an immunological method. Clin
Chim Acta, 58 : 223.
Kachmar JF, Moss DW: Enzymes. In Fundamentals of Clinical Chemistry. NW Tietz, Editor, Saunders, Philadelphia, 1976, pp 652-660.
Keffer JH, 1996. Myocardial markers of injury. Clin Chem, 105, 3 : 305.
King JO, Zapf P, 1972. A review of the value of creatine phosphokinase estimations in clinical medicine. Med J Aust, 1 : 699.
Konttinen A, Somer H, 1973. Specificity of serum creatine kinase isoenzymes in diagnosis of acute myocardial infarction. Br Med J, 1, 386.
Konttinen A, Somer H, Auvinen S, 1974. Serum enzymes and isoenzymes. Extrapulmonary sources in acute pulmonary embolism. Arch Intern Med,
133 : 243.
LaFair JS, Myerson RM, 1968. Alcoholic myopathy. Arch Intern Med, 122 : 417.
Mair J, Morandell D, Genser N, Lechleitner P, Dienstl F, Puschendorf B, 1995. Equivalent early sensitivities of myoglobin, creatine kinase MB mass,
creatine kinase isoform ratios, and cardiac troponins I and T for acute myocardial infarction. Clin Chem, 41, 9 : 1266.
Morin LG, 1977. Creatine kinase : stability, inactivation, reactivation. Clin Chem, 23, 4 : 646.
Nealon DA, Henderson AR, 1975. Measurement of brain-specific creatine kinase isoenzyme activity in serum. Clin Chem, 21 : 1663.
Rao PS, Mueller HS, 1976. Evaluation of the chemical activation procedure (Rao’s method) for the measurement of the MB isoenzyme of creatine
kinase. Clin Chem, 22 : 932.
Rock RC, Dreskin R, Kickler T, Wimsatt T, 1975. Creatine kinase isoenzymes in serum of patients with Reye’s syndrome. Clin Chim Acta, 62 : 159.
Roe CR, Limbird LE, Wagner GS, Nerenberg ST, 1972. Combined isoenzyme analysis in the diagnosis of myocardial injury : Application of electrophoretic methods for the detection and quantitation of the creatine phosphokinase MB isoenzyme. J Lab Clin Med, 80 : 577.
Thompson WG, Mahr RG, Yohannan WS, Pincus MR, 1988. Use of creatine kinase MB isoenzyme for diagnosing Myocardial infarction when total
creatine kinase is high. Clin Chem, 34, 11 : 2208.
Vassella F, Richterich R, Rossi E, 1965. The diagnostic value of serum creatine kinase in neuromuscular and muscular disease. Pediatrics, 35 : 322.
Vincent WR, Rapaport E, 1965. Serum creatine phosphokinase in the diagnosis of acute myocardial infarction. Am J Cardiol, 15 : 17.
Weime RJ, 1965. Agar Gel Electrophoresis, Elsevier, Amsterdam.
Wolf PL, Kearns T, Neuhoff J, Lauridson J, 1974. Identification of CPK isoenzyme MB in myocardial infarction. Lab Med, 5 : 48.
Young DS, Pestaner LC, Gibberman V. Clin Chem, 21 : 1D (1975).
Zimmerman HJ, Henry JB: Clinical Enzymology. In Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 16th ed., JB Henry, Editor, Saunders, Philadelphia, 1979, pp 365-368.
Zsigmond EK, Starkweather WH, 1963. Abnormal serum and muscle creatine phosphokinase (CPK) isoenzyme pattern in a family with malignant
hyperthermia. Anaesthesis, 22 : 16.
Zsigmond EK, Starkweather WH, Duboff GS, Flynn KA, 1972. Elevated serum creatine phosphokinase activity in a family with malignant hyperpyrexia. Anesth analg, 51 : 827.
Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. ImpactInternat, Septembre 1986.
- 142 -
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 1
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2014/10
Figure 2
1 2
3 4
5 6
7
Figure 3
Figure 4
1 2
3 4
5 6
7
1 2 3
4 5 6
7
7
5 6
3 4
1 2
Figure 5
Figure 6
1 2
3 4
5 6
7
- 143 -
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2014/10
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 7
Figure 8
Figure 9
Figure 10
Fraction identification
BB
MB
Macro-CK Type
MM
Application point
Mitochondrial (Macro-CK Type
- 144 -
Download

HYDRAGEL ISO-CK K20