Gebe ratlarda metoklopramid
maruziyetinin endometrial
reseptivite ve gebelik oranlarına
etkisi
Op.Dr. Yasemin Çekmez
TJOD-2015
Amaç
Bu çalışmada metoklopramide maruz kalan gebe ratlarda
endometriyal integrin β3 düzeylerinin immünhistokimyasal
olarak incelenmesi ile ilacın gebelikteki kullanımının gebelik
oranları ve endometriyal reseptivite üzerine olan etkisinin
araştırılması amaçlanmıştır.
Giriş:
Endometriyal reseptivite endometriyum epitelinin yapısal ve fonksiyonel
olarak embriyo implantasyonuna hazır olduğu dönemdir.Ratlarda bu süre
gebeliğin 4. gününe denk gelir.
Endometriyal reseptivite gebelik oranlarını belirlemede primer faktör
olarak kabul edilir ve implantasyon dönemindeki Integrin β3 ekspresyonu
bu konuda hem insanlarda hem de ratlarda endometriyal reseptivite
belirteci olarak kabul görmüştür.
Nedeni açıklanamayan infertil kadınlarda endometriyal integrin β3
ekspresyonunda azalmanın etkili olduğu yapılan çalışmalarda
gösterilmiştir.
Giriş:
Azalmış endometriyal reseptivite konjenital olabileceği gibi çevresel
faktörler ve ilaçlara bağlı olarak da görülebilir.
Metoklopramid gebelik bulantı ve kusmalarında yaygınlıkla
kullanılan hem santral hem de periferik etkileri olan bir ilaçtır.Bu
denli sık kullanımına rağmen gebelikte güvenilir olup olmadığına
ilişkin bilgiler sınırlıdır.
Biz bu çalışmada metoklopramidin endometriyal integrin β3
ekspresyonu üzerine etkisi olup olmadığını inceleyerek
endometriyal reseptivite ve gebelik oranlarına etkisini araştırmayı
amaçladık
Materyal-metod:
Çalışma Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi hayvan laboratuarı etik
kurul onayı alınarak yine aynı laboratuarda yapılmıştır.
Deney hayvanlarının seçimi: Çalışma için 150-200 gr arasında toplam
30 sağlıklı dişi rat seçildi.Ratlar çalışma öncesi 1 hafta boyunca rutin
olarak beslendi.Vajinal smear methoduna göre tüm ratların estrous
dönemi belirlenerek 1:1 olacak şekilde 1 gece boyunca erkek ratlar ile
aynı kafeste tutulduktan sonra sabah bakılan smear incelemesinde sperm
pozitif olanlar gebe olarak kabul edildi.Toplam 18 gebe rat çalışmaya
dahil edilerek 6şar olacak şekilde 3 gruba ayrıldı.
Materyal-metod:
Akut toksisitenin belirlenmesi: Çalışmada 0.025kg
metoclopramide Hydrochloride toz formu kullanıldı(National Healthcare
Pvt.Ltd, Birganj Nepal).3cc salin ile dilüe edilerek bir gecelik açlık sonrası
oral olarak uygulandı.Akut toksisite için 10 dişi rat kullanıldı. Ratlar her
grupta 2 şer tane olacak şekilde 5 gruba ayrıldı.Gruplara sırasıyla viz.1, 3,
10, 30, 100 mg/kg olacak şekilde artan dozlarda ilaç uygulandı.Ratlar ilk
2 saat ve sonrasındaki 4 saat boyunca gözlendi.Bir gece sonraki mortalite
dikkate alındığında 30 mg/ kg dozda toksisite belirtileri izlenmediği
görüldü.Tolere edilebilen maksimum dozun(30 mg/kg) 10 da biri olacak
şekilde 1mg/ kg ve 3 mg/ kg dozları çalışmada kullanılabilecek güvenli
dozlar olarak seçildi.
Materyal-metod:
İlaç uygulamaları ve çalışma dizaynı: 6 şar rattan oluşan 3 gruba
Kontrol: İlaç yok(kontrol)
Düşük doz: Metoklopramid (1mg/kg) oral
Yüksek doz: Metoklopramid (3mg/kg) oral
olacak şekilde gebeliğin 1. ve 15. günleri arasında metoklopramid
uygulaması yapıldı. Tüm ratlar gebeliğin 19. gününde hafif eter anestezisi
altında laparotomize edildi.Uterus ve hornlar incelenerek implantasyon
sahası sayıları,yaşayan rezorbe olan ve ölü fetus sayıları kaydedilerek
gruplar arasında gebelik oranları açısından karşılaştırma yapıldı
Materyal-metod:
Endometriyal epitel ve stromanın immünhistokimyasal
incelemesi :
Streptavidin-Biotin tekniği kullanıldı.1,3 ve 3 mm doku örnekleri
alınarak parafin bloklar oluşturulduktan sonra xylene ile yıkanarak
dokulardan parafin uzaklaştırıldı.Ardından seri olarak alkol ve PBS
(pH:7.2) ile yıkama yapılarak rehidratasyon sağlandı.Mevcut dokular
ardından sitratlanarak (pH:6.0)mikrodalga ile 5 dakika ısıtıldıktan
sonra rat monoklonal anti-integrin antikorla 25 °C de 60 dakika inkübe
edildi.(EPR2417Y, ab75872, abcam, 1:150 dilution) .Konvansiyonel
biotin-streptavidin metodu (Thermo, Ultravision anti-Polyvalent
HRP/DAB Kit TP-015-HD, United States) uygulanarak sinyal oluşumu
sağlandıktan sonra hematoksilen boyaması yapıldı.
İstatistik:
Verilerin analizinde SPSS software version 11.5 kullanıldı. The kategorik
değişkenlerin karşılaştırmasında Ki Kare testi kullanılırken değerler sayılar
ve yüzdeler olarak belirtildi.Sürekli verilerde Kruskall-Wallis ve Oneway
ANOVA analizleri kullanılarak değerler median, minimum ve maksimum
olarak belirtildi.P < 0.05 değeri istetistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Bulgular:
Toplam ve yaşayan fetus sayıları incelendiğinde yüksek doz ilaç
uygulanan grupta yaşayan fetus oranlarının diğer gruplara oranla
daha düşük olduğu görüldü.(Tablo 1)
Control
Low dose
(n=6)
(1mg/kg,n=
High dose
(3mg/kg,n=6)
6)
Number of fetuses
Median (Min-max)
Number
of
7.3(0-11) *
3.3(0-8) **
7(0-12)
4(0-9) *
1.3(0-4) **
living
fetuses
Tablo 1
10 (0-13)
Median (Min-max)
* p < 0.05 un-treated vs. high dose
**p < 0.05 low dose vs. high dose
Bulgular:
Özellikle yüksek dozda olmak
üzere ilaç uygulanan
grupta fetus sayısında azalma
ve hornlarda atrofi saptandı.
(Fig 1a,1b,1c)
Bulgular:
Gruplar arasında endometriyal epitel İntegrin β3 immünhistokimyasal
boyamasında anlamlı fark izlendi.
Endometriyal stroma incelemesinde , kontrol grubunda integrin
β3 ekspresyonu ilaç uygulanan gruplara oranla daha yaygın ve
yoğun (> 50% ) olduğu görüldü.
Ancak endometriyal epitelde integrin β3 ekspresyonu açısından
gruplar arasında anlamlı fark izlenmedi.(Table 2) ( fig 2)
Bulgular:
Control
Low Dose
High Dose
(n=6)%
(n=6)%
(n=6)%
absent
0(0.0%)
0(0.6%)
1(16.6%)
Light
2(33.3%)
3(50%)
3(50%)
Dark
4(66.6%)
3(50%)
2(33.3%)
0(0,0%)
0(0.0%)
1(16.6%)
<=%50
1(16.6%)
2(33.3%)
3(50%)
>%50
5(83.3%)
4(66.6%)
2(33.3%)
absent
0(00,0%)
1(16.6%) *
4(66.6%) **
Light
2(33.3%)
3(50%) *
2(33.3%) **
Dark
4(66.6%)
2(33.3%) *
0(12,5%) **
absent
0(00,0%)
1(16.6%) *
4(66.6%) **
<=%50
2(33.3%)
2(33.3%) *
1(16.6%) **
>%50
4(66.6%)
3(50,0%) *
1(16.6%) **
Endometrial epitelium
Staining intensity
Staining universality
absent
Endometrial stroma
Staining intensity
Staining universality
Tablo 2
* p < 0.05 un-treated vs. high dose
**p < 0.05 low dose vs. high dose
Bulgular:
Figür 2
Tartışma:
İmplantasyon başarılı bir gebelik için ilk aşama olup fonksiyonel bir
blastokist, reseptif endometriyum ve maternal -embriyonik
dokularda senkronizasyon gerektirir.Endometriyal gland ve stroma
arasındaki sinyal kaskadı fetusun implantasyonu ve sağlıklı gelişimi için
uygun ortamın oluşmasını sağlar.
Günümüzde pek çok çalışma ile endometriyal reseptivite ile ilgili pek
çok gen ve belirteç olduğu ortaya koyulmuş olup Integrinler
endometriyal reseptivite prediktörü olarak kabul gören
belirteçlerdendir.
integrin αvβ3 kombine çalışmasının özellikle insan endometriyumunda
hücreler arası etkileşimle adezyonu tetiklediği kabul edilmektedir.
Integrin implantasyon sürecinde özellikle glandüler epitelde
eksprese olurlar ve gebelik oluştuktan sonra stromaya doğru
yer değiştirirler.
Tartışma:
Azalmış İntegrin β3 ekspresyonuna bağlı azalmış endometriyal
reseptivite konjenital olabileceği gibi çevresel etkenlerle de
olabilir.Germeyer ve ark yaptığı çalışmada açıklanamayan tekrarlı
gebelik kayıpları olan olgularda integrin ekspresyonunun sağlıklı
gebeliği olanlara oranla anlamlı olarak düşük olduğu rapor edilmiştir.
Endometriyozis nedenli infertil olan bayanlarda da integrin αvβ3
azalma olduğu gösterilmiştir.
Yine çevresel etkenlere örnek olarak Zhou ve ark SOPH maruziyetinin
doz bağımlı olarak endometriyal reseptiviteyi azalttığı ve embriyo
implantasyonu bozduğunu yaptıkları çalışma ile göstermişlerdir.
Tartışma:
Biz bu çalışmada gebe ratlarda metoklopramid maruziyetinin
integrin β3 ve endometriyal reseptiviteye etkisi olup olmadığını
inceledik.
Her ne kadar mevcut çalışmalarda ilk trimesterde metoklopramid
kullanımının konjenital malformasyon,perinatal ölüm,düşük doğum
ağırlığı ve düşük APGAR skorları gibi kötü perinatal sonuçlara neden
olmadığı yayınlanmış olsa da ilacın gebelikteki güvenilirliği hala
belirsizliğini sürdürmektedir.
Bu alanda yürütülen daha dar kapsamlı bir çalışmada yüksek doz
metoklopramid maruziyetinin farelerde gebelik oranlarını azalttığı
rapor edilmiş olup etki mekanizması konusunda inceleme
yapılmamıştır.
Tartışma:
Integrin β3 ün epiteldeki fonksiyonu adezyonun sağlanmasıyken
gebelik oluşmasından sonra stromaya göç eder ve implantasyonun
gerçekleşmesinde rol oynar.
Çalışma sonuçlarımıza göre metoklopramid endometriyal epiteldeki
integrin β3 ekspresyonunu azaltmamaktadır.Ancak stromal integrin β3
ekspresyonu yüksek doz grubunda anlamlı olarak düşüktür.Bu etkinin
implantasyon için önemli olan gebeliğin 4. gününde endometriyal
resptivitede azalmaya neden olduğunu ve buna bağlı gebelik
oranlarında azalma olduğunu düşünmekteyiz.
Rezorbe olan ve ölü olan fetus sayısının yüksek doz ilaç uygulanan
grupta fazla saptanması da yine ilacın integrin β3 düzeyini azaltması
sonucu yetersiz implantasyon olarak yorumlanabilir.
Sonuç:
Bu çalışma gebelikte metoklopramid maruziyetinin integrin β3
ekspresyonuna etkisini araştıran ilk çalışma özelliğinde olup insan
gebelikleri üzerindeki etkisi konusunda kontrollü veri
bulunmamaktadır.
Gebe ratlarda metoklopramid maruziyeti doz bağımlı olarak
integrin β3 ü etki ederek embriyo implantasyonunu
azaltmaktadır.
Çalışma sonuçlarımıza dayanarak gebelikte metoklopramid
kullanımının kar zarar hesabı yapılarak kullanılmasını
önermekteyiz. Bu konuda daha geniş seri insan ve hayvan çalışmaları
ile metoklopramid in gebelikteki güvenilirliği incelenmelidir.
Teşekkür Ederim
Download

Yasemin Çekmez