Edu Sekce I – Základy průtokové cytometrie
Zpracování a základní analýza
vzorků
Jozef Janda
Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR
Centrum PigMod
Přehled
Izolace buněk

Izolace buněk

Barvení


Nastavení


Měření




Aplikace



Měření

Analýza dat



Barvení

Analýza
Suspenze jednotlivých buněk
Buněčné linie v suspenzi
Krev
Adherentní buňky
Pevné tkáně

Značené protilátky
DNA barviva
Fluorescenční sondy
Nespecifické barvení
Intracelulární
Kontroly
Nastavení cytometru



Voltage
Threshold
Compensation




Možnosti zobrazení
Gating
Doublet elimination
Vyloučení mrtvých buněk
Statistika
Batch analysis
Příklady využití





Fenotypizace
Buněčný cyklus
Apoptóza
Funkční studie
Cell sorting
Workflow
Izolace buněk

Příprava vzorků

Barvení
Nastavení


Nastavení cytometru

Měření

Analýza
Aplikace



Příprava suspenze jednotlivých buněk
Barvení fluorescenčně značenými protilátkami
Voltage
Threshold
Kompenzace
Vlastní měření
Analýza dat

Vizualizace, Gating, Statistika
Flow cytometry basics
Izolace buněk
Barvení
Fluidics
Optics
Nastavení
Měření
Analýza
Electronics
Aplikace
Animation - http://www.unsolvedmysteries.oregonstate.edu/flow_06
Sample preparation
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Single cell suspension !!!
 Trypsinize
 Filter !!!
 Add EDTA
 Add DNase
 Work on ice
Izolace buněk
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Izolace buněk
Izolace buněk
Barvení



Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace

Buněčná kultura v suspenzi
Krev
Adherentní buňky
Pevné tkáně
Izolace buněk
Izolace buněk

Buněčná kultura v suspenzi

Barvení

Nastavení


Měření
Analýza



Aplikace
Rovnou na FACS
Buňky v dobré kondici, optimální koncentrace
Zbavit se mrtvých buněk, fragmentů, případně agregátů
Fixace?, Před nebo po barvení?
Krev
Adherentní buňky
Pevné tkáně
Izolace buněk
Izolace buněk
Barvení


Buněčná kultura v suspenzi
Krev

Nastavení

Lýza erytrocytů
Izolace subpopulací

Měření
Analýza



Aplikace
Hustotní gradient (Ficoll, Percoll)
Magnetická separace (MACS)
Adherentní buňky
Pevné tkáně
Lýza erytrocytů?
Izolace buněk
Barvení


Hypotonická lýza, NH4Cl, komerční roztoky
Lyse-Wash
+ Odstraní zbytky Ery a volnou protilátku – čistá práce
- Riziko selektivní ztráty buněk
- Čas
Nastavení
Měření

Lyse-No-Wash
+ Rychlejší
- Vyšší background kvůli nenavázaným protilátkám
- Zbytky erytrocytů
Analýza
Aplikace

No-Lyse-No-Wash
+ Nejrychlejší příprava
- Potřebujete akustický cytometr
Izolace buněk
Izolace buněk
Barvení



Nastavení
Buněčná kultura v suspenzi
Krev
Adherentní buňky

Oddělení buněk

Měření


Analýza
Zabránění opětovné agregace


Aplikace

Neenzymaticky (EDTA)
Enzymaticky (trypsin)
EDTA, chlazení
Filtrace
Pevné tkáně
Izolace buněk
Izolace buněk

Buněčná kultura v suspenzi
Krev
Adherentní buňky

Pevné tkáně


Barvení
Nastavení

Rozvolnění tkáně
Mechanicky

Enzymaticky (kolagenáza 220U/ml, trypsin 0,25%)
http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/
Měření

Analýza

Aplikace
Izolace jednotlivých buněk




Filtrace – nylonové sítko (40 nebo 70μm)
Hustotní gradient
MACS
Zabránění agregace


EDTA (5mM)
Dnáza I (100mg/ml, 5mM MgCl2)
Barvení buněk
Izolace buněk
Barvení


Čím barvíme – protilátky, DNA barviva, jiné sondy
Výběr flourochromů

Nastavení


Měření

Analýza
Aplikace



Konfigurace cytometru (lasery, filtry, detektory)
Různá úroveň exprese barvených molekul
Různá relativní intenzita fluorochromů (stain index)
Spekrální překryv – potřeba kompenzace?
Dostupnost značených protilátek
Izotypová kontrola
Nespecifické barvení
Barvení buněk
Izolace buněk
Barvení

Fluorescenčně značené protilátky



Nastavení

Měření
Přímé barvení
Nepřímé barvení

Primární protilátka neznačená + sekundární značená
Biotinylovaná primární protilátka + značený straptavidín
Výhody - amplifikace signálu, možnost použití s různými primárními

Problém – kombinace více barev


Analýza
Výhody – rychlé, umožňuje kombinace barev
Nevýhody – nižší citlivost
Aplikace
Barvení buněk
Izolace buněk

Izotypová kontrola

Barvení

Nastavení

Měření
Analýza


jako specifická protilátka
Slouží jako kontrola nespecifické vazby protilátky
Identifikace negativní populace při analýze dat
Další kontroly

Aplikace
Stejný živočišný druh a izotyp
Stejná koncentrace



Nebarvené buňky
Single-stained (pro nastavení kompenzace)
FMO (fluorescence minus one) v mnohobarevné cytometrii
Experimentální kontroly (negativní, pozitivní)
Barvení buněk
Izolace buněk
Barvení

Nespecifická fluorescence



Nastavení
Měření
Autofluorescence


Mrtvé buňky


Analýza

Aplikace

Hlavně excitace modrým laserem
Fenolová červeň a flavonoidy v kultivačních médiích
Ve stejném kanálu barvit markery s vysokou expresí
Omezit buněčnou smrt při přípravě buněk, odstranit mrtvé buňky
Barvení mrtvých buněk a jejich vyloučení během analýzy dat
DNA barviva nepronikající intaktní buněčnou membránou (PI, DAPI)
Vázání protilátek na Fc-gama receptory


Fc-blok (protilátka blokující CD16/CD32)
Preinkubace s neznačeným myším IgG
Nastavení cytometru
Izolace buněk
Barvení



Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace

Výběr paramentrů
Voltage
Threshold
Kompenzace
Sideward scatter SSC
Forward scatter FSC
http://static.abdserotec.com/uploads/Flow-Cytometry.pdf
Setting threshold
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Single –stained sample
Analýza dat
Izolace buněk

Barvení
Vizualizace


Nastavení

Gating

Statistika
Měření
Analýza


Aplikace
Histogram
Dotplot, Density plot, Contour plot

Percentage of parent population
MFI – median fluorescence intensity
Batch analysis
Analýza dat
Izolace buněk

Barvení
Nastavení



Analýza
Vyloučení doubletů
Odstranění mrtvých buněk


Gate na populaci buněk
Dotplot FSC-A vs. FSC-H

Měření
Aplikace
Dotplot FSC vs. SSC
PI
Vlastní analýza

Gating, Statistika
Karel Souček 2013
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Histogram
FORWARD SCATTER (FSC)
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Výška pulzu (FCS-H) vs. Plocha (FCS-A):
Odlišení jednotlivých buněk od dvojic a shluků
Výška pulzu (FCS-H) vs. Plocha (FCS-A):
Odlišení jednotlivých buněk od dvojic a shluků
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-andServices/Applications/Cell-Analysis/Flow-Cytometry/FlowCytometry-Technical-Resources.html
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení

Statistika



Nastavení

Měření

Analýza
Analýza subpopulací
Intenzita fluorescence – analýza distribuce


Aplikace
Počty buněk v jednotlivých subpopulacích
Gate statistics
Quadrant statistics
MFI (medián intenzity fluorescence), průměr, percentily
CV (koeficient variace)
Analýza dat
Izolace buněk
Barvení
Shapiro's Seventh Law of Flow Cytometry:
Nastavení
Měření
Analýza
Aplikace
“No data analysis technique can make
good data out of bad data”
Practical Flow Cytometry (4th Eds; Wiley--Liss)
Bi-exponenciální zobrazení
Herzenberg et al., Nature Immunology 2006
Flow cytometry resources
http://www.practicalflowcytometry.com/
http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Introduction_to_flow_cytometry_May_10.pdf
http://flow.csc.mrc.ac.uk/?page_id=852
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-andServices/Applications/Cell-Analysis/Flow-Cytometry/Flow-Cytometry-TechnicalResources.html
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Molecular-Probes/MolecularProbes-Webinars/flow-cytometry-webinars.html
http://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/productsand-services/flow-cytometry/webinar-symposium/index.htm
http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/archives/index.jsp#multicolor
http://www.abcam.com/blog/index.cfm/Webinars
Download

Zpracování a základní analýza vzorku