Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
T.C.
NEVŞEHİR HACI BEKTAŞ VELİ ÜNİVERSİTESİ
MÜHENDİSLİK-MİMARLIK FAKÜLTESİ
ÇEVRE MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ
ÇEVRE MİKROBİYOLOJİSİ LABORATUARI
…………………DENEYİ
(Raporu hazırlayanın/hazırlayanların numarası, adı ve soyadı, grup no)
……………..
…………….
Dersin Sorumlusu
………
………
NEVŞEHİR – 2014
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
DENEY SONUÇ RAPORLARININ YAZIM TEKNİĞİ
Deney raporunu yazarken dikkat etmeniz gereken önemli noktalar aşağıda açıklanmıştır.
Öncelikle deney sonuç raporunda aşağıdaki başlıklar bulunmalıdır
1. Kapak Sayfası
2. Deneyin Amacı
3. Teori (literatür çalışması)
4. Deney Yöntemi
5. Veri Analizi
6. Sonuç ve Tartışma (yorum)
7. Kaynaklar
1. KAPAK SAYFASI:
Hazırlanan raporu tanıtan bir kapak sayfası hazırlanmalıdır. Kapak sayfasında deneyin adı, sorumlu
öğretim görevlilerinin adları ve raporu hazırlayan öğrencilerin bilgileri yer almalıdır. Bir sonraki
sayfada örnek bir kapak sayfası görülmektedir.
2. DENEYİN AMACI:
Bu başlık altında yapılan deneyin hangi amaç ve/veya amaçlar için yapıldığı öğrencinin kendi
cümleleri ile belirtilmelidir.
3. TEORİ (LİTERATÜR ÇALIŞMASI):
Bu başlık altında yapılan deney hakkında teorik bilgi verilecektir. Teorik bilgi kaynak göstermek şartı
ile her türlü Türkçe ve yabancı kaynak kullanılarak verilebilir. Kaynağını belirtmek suretiyle
internetten bulunan bilgilerde teorik bilgiler arasında verilebilir. İnternetten alınan bilgilerin hiçbir
şekilde düzenleme yapılmadan kopyala/yapıştır yapılmamasına dikkat edilmelidir.
Metin İçinde Kaynak Gösterimi:
Yazılan rapor içinde kaynakların gösteriminde soyadı ve tarih sistemi kullanılır.
i. Bu sistemde metin içerisinde atıf yapılan kaynaklar “Yazar(lar)ın Soyad(lar)ı ve Yıl” sistemine göre
yapılır. Kaynak eserin yazarının soyadı (ilk harfi büyük, diğerleri küçük harf olarak) ve eserin yayın
tarihi yazılmalı, yazar soyadından sonra virgül konulmalıdır. Aynı satırda birkaç yazar adı yer alacaksa
tarihlerden sonra noktalı virgül konulmalı, bunlar en eski yayından en yeni yayına doğru
sıralanmalıdır.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
4. DENEY YÖNTEMİ:
Bir deney için birden fazla analiz yöntemi bulunabilmektedir. Laboratuvarda yapılan deney hangi
analiz yöntemi ile gerçekleştirilmişse bu başlık altında bu bilgiler verilerek deneyin nasıl yapıldığı
maddeler halinde anlatılmalıdır.
5. VERİ ANALİZİ:
Bu başlık altında deney yapılırken elde edilen veriler yazılmalı ve analiz sonucu ile ilgili hesaplamalar
yapılmalıdır.
6. SONUÇ VE TARTIŞMA (YORUM):
Bu başlık altında deney sonucunda elde edilen verilerin ne ifade ettiğini, deneyin sonucunda elde
ettiğiniz verilerin sizin açınızdan öneminin ne olduğunu kendi cümleleriniz ile açıklamanız
gerekmektedir.
7. KAYNAKLAR:
Bu bölümün hazırlanmasında, değinilen bir belgeye okur tarafından kolaylıkla ulaşılabilmesi için,
gereken bilgilerin eksiksiz verilmesinin temel ilke olduğu unutulmamalıdır. Metin içinde
değinilmeyen bir belgeye kaynaklar listesinde yer verilmemelidir.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
DEĞERLENDİRME ESASLARI:
1. Öğrenciler Laboratuar dersinde deneyden önce Kuiz sınavına gireceklerdir. Genel notlandırmada
Kuizlerin ağırlığı %10 oranında olacaktır.
2. Her bir öğrenci yukarıdaki formata göre hazırlayacakları raporu ilgili deney bitiminden en geç 1
hafta sonra deneyi yaptıran ilgili öğretim elemanına teslim edeceklerdir. Genel notlandırmada
Raporların ağırlığı %10 oranında olacaktır.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
2013-2014 EĞİTİM ÖĞRETİM YILI ÇEVRE MİKROBİYOLOJİSİ DERSİ LABORATUAR DENEY TARİHLERİ
04.03.2014
MİKROBİYOLOJİDE KULLANILAN MALZEME VE CİHAZLAR
11.03.2014
CAM MALZEMELERİN TEMİZLENMESİ VE STERİLİZASYON 1
18.03.2014
CAM MALZEMELERİN TEMİZLENMESİ VE STERİLİZASYON 2
08.04.2014
MİKROSKOP KULLANIMI
15.04.2014
BESİYERİ HAZIRLAMA
22.04.2014
ÇEVREMiZDEKi MiKROORGANiZMALAR VE KATI VASATTA
(STANDART PLATE AGAR) TESPİTLERİ
29.04.2014
MİKROBİYOLOJİDE BOYAMA TEKNİKLERİ: BASİT BOYAMA
06.05.2014
MİKROBİYOLOJİDE BOYAMA TEKNİKLERİ: GRAM BOYAMA
13.05.2014
MİKROSKOPTA MANTAR VE BAKTERİ MORFOLOJİLERİNİN
İNCELENMESİ
20.05.2014
MİKROSKOPTA ALG VE PROTOZOA MORFOLOJİLERİNİN
İNCELENMESİ
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
DENEYSEL ÇALIŞMALAR ESNASINDA LABORATUARDA DİKKAT EDİLMESİ
GEREKEN HUSUSLAR
Laboratuarda yapılan çalışmalar sonucunda elde edilen sonuçların güvenilirliği, kullanılan deney
metotlarının hassaslığı yanında, çalışanların dikkat ve titizliğine de bağlıdır. Bu nedenle çalışmalar
esnasında aşağıdaki kurallara uyulması çalışanların kendisi ve çevresindeki arkadaşları için ve yapılan
deneyin hassasiyeti bakımından da son derece önemlidir.
Bu nedenle laboratuar deneyleri esnasında aşağıdaki kurallara uyulmasına azami derecede dikkat
edilmelidir.
1. KİŞİSEL TEDBİRLER
a) Her türlü laboratuar çalışması esnasında mutlaka beyaz ve temiz bir önlük giyilmelidir. Böylece
çalışma esnasında olabilecek herhangi bir kimyasal çözeltinin sıçrama ve bulaşmalardan giyilen
elbiselerin zarar görmesi engellenmiş olacaktır.
Laboratuar önlüğü olmayanlar laboratuar çalışmalarına kesinlikle alınmayacaklardır.
b) Laboratuar çalışmaları sırasında ve laboratuara giriş çıkış esnasında koridorlarda son derece sessiz
olunmalıdır, etrafı rahatsız edecek şekilde gürültü ve aşırı hareketlerden kesinlikle kaçınılmalıdır.
c) Palto, pardösü, ceket, şapka gibi giyim eşyaları ile çanta ve kitaplar laboratuar çalışması yapılan
masaların üzerine bırakılmamalı, bunlar için ayrılan yerlere konulmalıdır.
d) Laboratuarda yiyecek yenmeyeceği gibi sigara içmek, sakız çiğnemek kesinlikle yasaktır. Gereksiz
hareket ve davranışlardan kaçınılmalıdır.
e) Laboratuara gelmeden önce o gün yapılacak deney föyü iyice okunmalı, föyden anlaşılmayan
noktalar farklı kaynaklardan da araştırılarak deneye hazırlıklı gelinmelidir. Öğrenci, ilgili deneye
hazırlıklı gelmelidir.
2. ÇALIŞMA ESNASINDA
a) Çalışma esnasında düzen ve temizliğe azami derecede dikkat edilmelidir. Deney esnasında
kullanılan malzemelerin üzerine gerekiyorsa etiket yapıştırılarak ne oldukları, hangi gruba ait oldukları
ve deney günü yazılmalıdır.
b) Deneyde kullanılacak cam v.s. malzemeler deneyden önce sorumlular tarafından masalarda hazır
bulundurulacaktır. İlave olarak gerekecek alet ve malzemeler sorumlulardan istenilmeli, masa ve
dolaplar karıştırılmamalıdır. Yerlerinden alınan malzeme ve reaktif şişeleri kullanıldıktan sonra
sorumlulara teslim edilmelidir
c) Seyreltme yaparken özellikle asitler su üzerine ilave edilmelidir. Kesinlikle asit üzerine su ilave
edilmemelidir. Aksi takdirde ani sıçrama ve patlamalara neden olunabilir.
d) Herhangi bir kimyasal madde koklanacaksa elle yelpazelenerek koklanmalıdır. Direkt burna
yaklaştırılarak koklanmamalıdır.
e) Yüze veya gözlere herhangi bir kimyasal madde sıçrayacak olursa hemen bol suyla yıkanmalıdır.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
Hatta mümkünse bütün yüz musluğun altına sokularak uzun süre yıkanmalı ve bu arada hemen deney
sorumlularına haber verilmelidir.
f) Deneyde kullanılan cam eşyalar masaların uç ve kenar kısımlarına konulmamalıdır.
g) Kuvvetli asit ve bazlar pipetle çekilirken ağızla emilmez. Aksi halde ağza kaçan bu gibi maddeler
büyük zararlar verebilirler. Buna benzer bir durumda ağız bol su ile çalkalanarak uzun süre yıkanmalı
ve laboratuar sorumlularına haber verilmelidir. Bu gibi maddeler pipetle çekilirken laboratuar
görevlilerinden yardım istenilmelidir.
h) Deneysel çalışma sırasında laboratuar içinde gezinmek, aletleri kurcalamak yasaktır. Deney
sorumlularından izin alınmaksızın deney yapılan kısmın dışına çıkılmamalıdır.
3. CİHAZLARLA ÇALIŞIRKEN
a) Çalışma şekli bilinmeyen hiçbir elektrikli cihaz kullanılmamalıdır.
b) Çalışmakta olan bir cihazın kontrol ve ayar düğmeleri ile kesinlikle oynanmamalıdır.
c) Gaz tüplerine çok dikkat edilmeli ve deney sorumlularından habersiz dokunulmamalıdır.
4. ÇALIŞMA BİTTİĞİNDE
a) Deneysel çalışma bittiğinde deneyde kullanılan bütün malzemeler önce deterjanla yıkanmalı, sonra
birkaç kez su ile çalkalanmalıdır. Daha sonra distile (saf) su ile durulanmalı ve kurumaları için eski
yerlerine konulmalıdır.
b) Çalışma yapılan masalar, ait olduğu grup tarafından temiz bir bezle silinerek bir sonraki çalıĢmaya
hazır halde bırakılmalıdır. Çalışma masalarının ıslak bırakılmamasına dikkat edilmelidir.
c) Deney sonunda eller sabunla iyice yıkanmalıdır.
d) Deney bittikten sonra laboratuarda kesinlikle önlük bırakılmayacaktır.
e) Yapılan deney, föydeki bilgilere ilaveten laboratuarda anlatılanlarla birlikte deney rapor yazım
planına uygun olarak deney sonuç raporu yazılacak ve bir hafta sonraki laboratuar saatinden önce ilgili
deney sorumlularına teslim edilecektir.
f) Söz konusu deney raporları kontrol edilip değerlendirilecek ve eğer varsa eksiklikler belirtilecektir.
Öğrencinin, deney sonuç raporunu hazırlarken, mümkün olduğunca farklı kaynaklara baĢvurması
tavsiye edilmektedir. Sonraki haftalarda yazdığınız raporlarda aynı hataları yapmamanız için gerekli
uyarılar yapılacaktır.
Laboratuar Çalışmalarında Öğrencinin Temin Etmesi Gereken Malzemeler;
1. Laboratuar önlüğü ve ilgili deney föyü
2. Küçük not defteri (Ajanda kullanılması önerilir)
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
DENEY 1- MİKROBİYOLOJİDE KULLANILAN MALZEME VE CİHAZLAR
1. İnkübatör (Bakteriyolojik Etüv)
Mikroorganizmalar ortamlarına ekildikten sonra çoğalmalarını temini için, muayyen bir
ısı derecesinde tutulmaları gerekir. Bu gaye için kullanılan aletlere inkübatör veya etüv
denir. İnkübatör içinde sabit sıcaklık, bütün zamanlarda ve her yerde aynı olmalı veya
en az ±0,5 ºC lik bir farktan büyük olmamalıdır. Sahip olduğu bir regülatör sayesinde
devamlı aynı dereceyi muhafaza eder. Isı kontrolü için sabit bir termometreleri vardır.
Etüvde kullanma alanı maksimuma çıkması halinde bile sıcaklık değişimi yukarıdaki
değer arasında kalmalıdır.
2. Otoklav
Otoklav, doymuş basınçlı su buharı ile100 ºC’nin üstünde çalışan bir sterilizasyon aletidir.
Genellikle yüksek ısıya dayanıklı maddelerin sterilizasyonunda kullanılır. Yani, çözeltiler,
besi yerleri, boş şişe ve pipet gibi cam malzeme ile bez eşyaların sterilizasyonu otoklavla
yapılır. Otoklav içerisindeki su, kapalı bir yerde basınç altında kaynadığı zaman, meydana
gelen buharın oluşturduğu sıcaklık 100 ºC’nin üstüne çıkar. Otoklavlar silindir veya
dikdörtgen şeklinde paslanmaz çelikten yapılmıştır. Silindir veya dikdörtgenin bir
tarafında kapağı vardır. Kapak vidalarla gövdeye bağlanır. İçerisinde ızgara şeklinde
raflar bulunur ve sterilize edilecek eşyalar bunun üstüne yerleştirilir. Kazanda, ızgaraların
altında su konacak bir haznesi vardır. Otoklavın kapağında veya üst kısmında buharın
çıkmasına yarayan bir musluk, içindeki sıcaklığı kontrol etmek için bir termometre,
basıncı kontrol etmek için bir manometre bulunmaktadır. Ayrıca aleti patlamadan
koruyabilen bir emniyet supabı mevcuttur.
Otoklav içindeki hava çok önemlidir. Hava bulunması istenmez. Çünkü otoklavda hava
bulunmasının muhtelif mahzurları vardır. Bu mahzurlar;
1.
Hava ile karışık su buharının sıcaklığı düşüktür.
2. Hava, buharın küçük alanlara girmesine engel olur.
3. Hava buhardan daha ağır olduğundan, otoklavın alt kısmında toplanarak daha
soğuk bir tabakanın oluşmasına sebep olur. Bu kısımdaki eşya istenen sıcaklığa
kadar ısınmaz. Örneğin, üst kısımda sıcaklık 115 ºC’nin iken, alt kısımda 80 ºC
olur.
3. Pasteur Fırını
Altındaki ısıtıcılarla içinde yüksek ısıda kuru sıcak hava meydana getirilir. Yeterli
hacimde ve sterilizasyon sıcaklığının her tarafta eşit ve üniform verecek şekilde yapılmış
olmalıdır. 170 ± 10 ºC Kuru sıcak hava ile çalışır. Uygun bir yerde termometresi
olmalıdır. Pipet, tüp, petri kutusu, porselen süzgeçler, milipor süzme takımı gibi her türlü
cam ve madeni malzemenin sterilizasyonu için kullanılır. Sterilize edilecek malzeme
temizlenmiş ve kurutulmuş olarak sterilizatöre yerleştirilir. Malzemeler yaş olarak
konulmaz ve alet soğumadan, kapağı açılmaz. Her iki durumda da aletin içindeki
cam malzemenin çatlama tehlikesi mevcuttur.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
4. Teraziler
Laboratuarlarda gerekli tartım işlerinde kullanılır. Ayrıca santrifüj tüplerinin karşılıklı
dengelenmesinde kullanılan teraziler de vardır. Laboratuarda kullanılan terazilerin kaba,
hassas tipleri vardır.
Hassas Terazi: 0,001-0,0001 g hassasiyete sahip olan örneklerin hassas tartımı için
kullanılan elektronik tartılardır.
5. Mikroskop
Bakteriler çok küçük olduklarından çıplak gözle görülmezler. Görülebilmeleri için, çok
fazla büyütülmeleri lazımdır. Bu büyütmeyi bize temin eden mikroskop, bakteriyoloji
çalışmalarında en çok kullanılan bir aletidir. Genel anlamda mikroskop, küçük cisimleri
büyüterek görünmelerini temin eden, merceklerden yapılmış bir alet olarak tarif edilebilir.
Sözcük olarak latince; MİCROS (=küçük) ve SKOPEIN (=Müşahade etme)
kelimelerinin birleştirilmesinden meydana gelmiştir. 1674 yılında tek mercekli basit bir
mikroskobu Anton van Leeuwenhoek bulmuş, günümüze kadar geliştirilerek ulaşa
gelmiştir. Mikroskoplar, büyütmeleri kıstas olarak ele alındığında;
a- Işık ( optik ) Mikroskobu
b- Elektron Mikroskobu olarak iki kategoride toplanırlar.
6. Dereceli Pipet ve Pipet Kapları
Pipetler, üzerinde hacim taksimatı bulunan özel olarak yapılmış cam borulardan ibarettir.
0,1 ml'den 50 ml'ye kadar değişen çeşitli boylarda pipetler mevcuttur. Laboratuarda
kültür vasatlarının tüplere taksim olunmasında, çeşitli deneylerin yapılmasında farklı
gayeler için kullanılır.
Alüminyum veya paslanmaz çelikten yapılmış, takriben 40 cm uzunluğunda 5 ila 7,5 cm
çapında silindir veya dikdörtgen kutulardır. Ambalaj kağıdı veya toksik olmayan
kağıtlar da pipetlerin muhafazası için kullanılabilir. Pipet kapları olarak bakır ve bakirli
bileşiklerden oluşan kaplar, sülfatı kağıtlar kullanılmaz.
7. Petri Kutuları
İç içe geçen yuvarlak cam kapaktan ibarettir. Çeşitli büyüklükte olanları vardır.
Yükseklikleri fazla değildir, özellikle katı kültür ortamları petri kutularına konarak daha
geniş bir yüzey elde edilir. Böylece mikroorganizmaların izole edilmelerinde veya koloni
şekillerinin taksim edilmesinde kullanılır. Ayrıca membran filtre tekniği için gevşek
kapaklı 60x15 mm ebadında petri kutuları veya sıkı kapaklı 50x12 mm ebadında plastik
petri kutuları kullanılır. Sterilize işlemleri ambalaj kağıdı, paslanmaz çelik veya
alüminyum kaplar da gerçekleştirilir ve saklanır.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
8. Deney Tüpleri
Mikrobiyoloji laboratuarlarında gerek mikrop kültürlerinin hazırlanmalarında vegerekse
çeşitli testlerin yapılmalarında değişik büyüklüklerde tüpler kullanılır. Bunlar ısıya
dayanıklı camdan yapılmıştır. Laboratuarda tüpler daima temizlenmiş, ağızları pamukla
kapatılmış ve steril edilmiş olarak muhafaza olunur ve ihtiyaç duyuldukça steril olarak
kullanılır. Durheim Tüpü: Çok küçük özel tüplerdir. Karbonhidratlı ortamlarda gaz
çıkıp çıkmadığını kontrol etmek için kullanılır.
9. İğne, Öze
Mikroorganizmaları kültür ortamlarına ekme veya onların lam üzerindeki
preperasyonlarını hazırlamak için, mikrop naklinde kullanılan, ince platin veya nikel
alaşımlı telden yapılmış küçük aletlerdir. Uç kısmında üç milimetre çapında daire olana
öze, düz olana da iğne ismi verilir. Öze ve iğne kullanmadan evvel ve sonra alevde kızıl
dereceye kadar tutulmak suretiyle sterilize edilmelidir.
10. Cam Malzemeler
Numune Şişeleri: Numune alma şişesi olarak 100 ml, 250 mi veya 500 ml'lik renkli cam
kapaklı, borosilikat veya ısıya dayanıklı camdan yapılmış olanlar kullanılır. Kuru sıcak
hava ile sterilize edilir
Balonlar: Vücudu küre şeklindeki altı düz olan, dar silindir şeklinde boynu olan cam
kaplardır. 50 ml den 10 lt. kadar hacmi olabilir. Besiyeri ve çözeltilerin saklanmasında
kullanılır.
Erlenmayerler: Vücudu koni şeklinde ve tabanı düz olan kısa silindir şeklinde bir
boynu olan cam kaptır. Balonların kullanıldığı yerlerde kullanılır.
Balon joje (Volumetrik balon, dereceli balon): Çözelti hazırlanmasında kullanılır.
Beherler: Çözelti ve sıvıların hazırlanmasında ve titrasyon için kullanılır.
Mezür (Dereceli silindir): Silindir şeklinde dereceli cam malzemedir. Sıvıların
ölçülmesinde kullanılır.
11. Lam-Lamel
Mikroskopta objeyi incelerken kullanılan cam malzemelerdir.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
DENEY 2- CAM MALZEMELERİN TEMİZLENMESİ VE STERİLİZASYON 1
Bir mikroorganizmanın teşhisi ancak saf kültür halinde üretilmesi ile mümkündür. Bu da,
besi yeri cam eşya ve diğer aletlerle aseptik şartlarda çalışarak diğer mikroorganizmaların
karışmasını önlemekle olur. Steril bir ortam veya malzeme hiçbir canlı varlık ihtiva etmez.
Bu amaçla sterilizasyon işlemi; mikrobiyoloji laboratuar tekniğinin temel taşlarından
birisidir.
Uygun bir sterilizasyon yapmadan mikrobiyolojik çalışmalar yapılamaz.
Mikroorganizma kontrolünü gerektiren temel sebepleri özetle,
1. Hastalık yapıcı ( patojen) mikroorganizmalarının bulaşmasını önlemek.
2.İstenmeyen mikroorganizmaların büyümesini ve çevreye yayılıp bulaşma ve zarar
vermesini önlemek.
3. Mikroorganizmaların saf kültürlerini elde etmek
4. Mikroorganizmalarca materyallerin çürüme ve bozunmasını engellemek. sıralayabiliriz.
Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon
Canlı organizmaların tümünün kendine has bir yaşama şekli mevcuttur. Tabiattaki en
küçük canlı grubunu oluşturan mikroorganizmalar, hayatlarını idame ettirebilmeleri için
diğer bazı canlıların yok olmalarına sebep olurlar. Bundan dolayı mikroorganizmaların
kontrol altına alınması gerekir. Sterilizasyon, mikroorganizmaların vejetatif ve spor
şekillerinin öldürülmesi olayıdır. Diğer bir ifadeyle, mikrobiyal yaşamın tüm formlarının
yok edilmesidir. "Hemen hemen steril" gibi bir ifade söylemez. Zira tek bir canlı
organizma bile içeren bir obje veya çevre steril değildir. Dış ortamlardan istenmeyen
mikroorganizmaların bulaşmasının önlenmesinde ve laboratuar çalışmaları esnasında
enfekte olan araç ve gereçlerin yeniden kullanılır hale getirilmesinde sterilizasyon
işlemleri büyük önem taşır.
Dezenfeksiyon ise, bir ortamdaki patojen mikroorganizmaları öldürmek veya zararsız hale
getirmek için yapılan işleme denir. Dezenfeksiyon esnasında diğer zararsız
mikroorganizmalar da ölebilir. Fakat bu işlemin gayesi, hastalık yapıcı
mikroorganizmaların zararsız hale getirilmesidir. Dezenfeksiyon için kullanılan maddelere
"dezenfekten madde " ismi verilir.
Dezenfektan maddelerin fazla sulandırarak, insan ve hayvan vücuduna
uygulanmasına antisepsi, bu işlemde kullanılan maddelere antiseptik madde adı verilir.
Yani mikroorganizmaları öldürebilen veya üremelerini durdurabilen maddelere
"antiseptik" denir.
Bakteriyosid, mikrobiyosid, bakteriyosidal, mikrobiyosidal, antibakterial, antimikrobial
kelimelerinin hepsi aşağı yukarı aynı manayı taşıyıp, mikrop öldürücü anlamına
gelmektedir. Bakteriostatik, mikrobiostatik kelimeleri ise, mikroorganizmaların
üremelerini durdurucu tesir anlamında kullanılmaktadır. Bundan başka fungusid, virusid,
sporosid terimleri, sırası ile funguslar, virüsler, sporlar üzerine etkiye sahip manalarına
gelmektedirler. Mikroorganizmaların çeşitli etkenlere karşı dayanırlıklarına rezistans ve
hassasiyetlerine de dispozisyon denir.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
Sterilizasyon Çeşitleri
Mikroorganizmaların kontrol altına alınmasının çeşitli şekilleri mevcuttur. Bu metotlar;
sterilize edilecek malzemenin farklılıklarından, kullanılan fiziksel etkenlerden ve kimyasal
maddelerden kaynaklanmaktadır. Ayrıca kontrol altına alınacak mikroorganizma
türlerinin sayısı, cinsi, ve bulunduğu ortamlar bu çeşitliliği artırmaktadır. Sterilize
edilen eşyanın, mikroplar ile tekrar kirlenmemesi için, dış ortamla ilgisinin kesilmesi
gerekir. Steril eşya açık kalırsa, havadan gelen tozların üzerindeki bakterilerle tekrar
kontamine olur. Tüp, balon gibi cam eşyaların ağzı sterilize işleminden önce pamuklanır.
Bu işte kullanılan pamuk uzun elyaflı ve tozlu olmamalıdır. Bunun için yağı alınmış
pamuk kullanılır. Pipetlerin, ağız kısmı pamuklanır ve teker teker yada birkaçı bir arada
kağıtlara sarılarak sterilize edilebilir. Genellikle pipetler, cam yada madenden yapılmış
silindir şeklindeki kutulara konur ve kutuların ağzı pamuk veya madeni bir kapakla
kapatılarak sterilize edilir.
Sterilizasyon işlemi, genel olarak, fiziksel ve kimyasal olmak üzere iki yolla yapılır.
1. Fiziksel Metotlarla Sterilizasyon
Fiziksel metotla yapılan sterilizasyon işlemi genelde, üç grup altında toplamak
mümkündür.
Bunlar;
1. Isı ile sterilizasyon
2. İyonize eden ışınlarla yapılan sterilizasyon
3. Mekanik olarak yapılan sterilizasyon'dur.
1.1. Isı İle Sterilizasyon
Yapılması kolay ve ucuz olduğundan ve iyi sonuç verdiğinden sterilizasyon da en çok ısı
kullanılır. Yalnız, sterilize edilecek malzemenin ısıya dayanıklı olması lazımdır. Bu husus
daima göz önünde bulundurulmalıdır.
1.1.1. Kuru Sıcak Sterilizasyon İşlemleri
a. Kızıl Dereceye Isıtma
Alevde tutulduğunda bozulmayan, iğne öze ve benzeri madeni aletleri, alevde kızıl
dereceye gelinceye kadar ısıtılması işlemidir. Bu tür aletler soğuduktan sonra kullanılır.
b. Kuru Sıcak Hava Fırını ( Pasteur Fırını )
Kuru sıcak hava ile sterilizasyonda özel yapılmış fırınlar kullanılır. Cam, balon, petri
kutusu, pipet ve cam şişeler gibi cam eşyanın sterilizasyonu için en uygun metottur. Bu
yolla sterilizasyon, 180 ºC de 1 saat veya 160 ºC de 2-2,5 saat fırını çalıştırmak
suretiyle yapılır.
1.1.2. Nemli Isı İle Sterilizasyon İşlemleri
a. Kaynatma
100 ºC de 5-10 dakika kaynatmakla bakterilerin vegetatif şekilleri ve bazı bakterilerin spor
şekilleri ölürler. Fakat kaynatma işlemi, her zaman iyi bir sterilizasyon temin etmez.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
Genellikle cam eşya, pens makas ve benzeri madeni eşya, cam ve madeni kısımları olan
şırıngalar kaynatılarak sterilize edilmesinde uygun metottur.
b. Buharla Sterilizasyon
İyi bir sterilizasyon için su baharı sıcak havadan daha elverişlidir. Zira buharın
öldürücü etkisi daha fazladır ve eşyayı daha çabuk ısıtır. Ayrıca su buharının pamuk, yün,
kumaş, kağıt ve diğer kirli maddelere nüfusu daha kolaydır. Buharla sterilizasyon işlemi,
bilhassa besi yerleri ve çözeltiler için çok uygundur. Ortam yeteri kadar buharlı
olduğundan ısınma esnasında sterilize edilecek sıvılardan buharlaşma ile su kaybı da
olamaz. Buharla sterilizasyon için en çok kullanılan alet otoklav'dır. Otoklavla
sterilizasyon işlemi için 120 ºC 'de 15-45 dakika yeterlidir.
c. Tindalizasyon
Yüksek sıcaklık derecelerinde bozulan maddeler için kullanılan bir metottur. Bu
metotla, birkaç gün arka arkaya 56-100 ºC sıcaklıkla ısıtmakla sterilizasyon işlemi yapılır.
Isıtma süresi günde bir saat olmak üzere en az üç gündür. Bazı sporlu bakteriler
için 8 gündür. Çok az kirli çözeltiler için iyi sonuç verir.
1.2. İyonize Eden Işınlarla Sterilizasyon
Suyun ve mikrobiyoloji de kullanılan bazı maddelerin sterilizasyonu için, iyonize eden
ışınların etkisinden faydalanılır. Genellikle iyonize eden ışınların sterilizasyon işlemi
mikropların haricinde ortama da etkilidir. İyonize ışınlarla sterilizasyon sentetik, polietilen
gibi maddelerden yapılmış alet ve malzemelerin sterilizasyonunda yaygın olarak
kullanılır.
Her canlı hücrenin dış ortama karşı gösterdikleri hassasiyet farklıdır. Radyasyonla
sterilizasyon işleminde her hücre için farklı dozajlara ihtiyaç vardır. Farklı dozaj
uygulanması bu metodun dezavantajını oluşturur. Dolayısıyla kullanılışı sınırlıdır.
Ultraviyole ışının dalga boyu x ışınlarınkinden daha uzun olup, 14 - 400 nm
arasındadır. 300 - 400 nm dalga boyundaki ültraviyole ışınları orta derecede öldürücü
etkiye sahiptir. Güneş ışığı da bu dalga boyundaki ültraviyole ışınlarına sahiptir. Ancak
atmosferde tutuldukları için etkili olamazlar. Şayet 290 nm’nin altındaki ültraviyole
ışınları atmosferde tutulmamış olsaydı yeryüzünde hayat olmazdı. İyonize eden ışınlar
elektromanyetik ve partiküler ışınlar olarak ikiye ayrılır.
A) Elektromanyetik Işınlar
• Ultraviyole Işınları
• X Işınları
• Gama Işınları
B) Partiküler Işınlar
• Beta (katod) Işınları
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
1.3. Mekanik Olarak Yapılan Sterilizasyon
Mekanik yolla yapılan sterilizasyon, sterilize edilecek sıvıların değişik özelliklerdeki
filtrelerden süzülmesi işlemidir. Özellikle ısıtılınca bozulan maddelerin ve serumların
sterilizasyonu filtrasyon ile yapılmaktadır. Bu filtreler, filtrenin cinsine göre
sınıflandırılırlar.
Bunlar;
1. Diyatome toprağı filtreler
2. Porselen filtreler
3. Asbest süzgeçli filtreler
4. Cam tozu filtreler
5. Kollodyum zarlı filtrelerdir. Çevre Mikrobiyolojisi laboratuarında ise, yaygın olarak
membran filtreler kullanılır.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
DENEY 3- CAM MALZEMELERİN TEMİZLENMESİ VE STERİLİZASYON 2
1. Kimyasal Metotlarla Yapılan Sterilizasyon
Muhtelif kimyasal maddeler kullanılarak gerçekleştirilir. Daha çok patojen
mikroorganizmaların kontrol altına alınması için yapılan işlemdir. Dezenfektan ve
antiseptik olarak kullanılan bazı kimyasal maddeler, kullanım alanları ve özellikleri Tablo
1’de verilmiştir.
Tablo 1. Dezenfektan ve Antiseptik Olarak Kullamlan Bazı Kimyasal Maddeler,
Kullanım Alanları ve özellikleri
Etil Alkol
Fenol
Lizol
Kullanılacak Materyaller
•
Pasteur Fırını
•
Otoklav
•
İspirto Ocağı
•
Kalaycı Pamuğu
•
Alüminyum Folyo
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
•
Pipet Kutusu
•
Balon, mezür, pipet, deney tüpleri
•
İğne, öze, petri kabı, spor
• Etil Alkol, Saf su, Sabun
Metot
•
•
•
•
Tüm tezgah ve yüzeyler sabunlu su ile yıkandıktan sonra etil alkol ile silinir.
Tüp, balon gibi cam eşyaların ağzı sterilize işleminden önce kalaycı pamuğu ile
kapatılır ve alüminyum folyo ile sarılır.
Pipetler, paslanmaz çelikten silindir şeklindeki pipet kutulara konur ve kutuların
ağzı pamuk veya madeni bir kapakla kapatılarak sterilize işlemine hazırlanır.
İğne ve öze bek alevinde kızdırılarak strelize edilir.
Otoklavın Kullanılması:
Kazanın içine yeterli miktarda su konur. Sterilize edilecek eşyalar, otoklav içerisine uygun
bir şekilde yerleştirilir. Otoklavın kapağı vidaları karşılıklı sıkıştırılarak İyice kapatılır.
Buhar musluğu açık tutularak alet ısıtılmaya başlanır. Otoklavdaki su ısınınca buhar
çıkmaya başlar. Suyun kaynamasına paralel olarak çıkan buhar miktarı da artar. Bir
müddet buhar hava ile karışık olarak musluktan çıkar. Otoklavdan hava tamamen
çıkığında buhar musluğu kapatılır. Havanın tamamen çıktığı buhar musluğuna takılan
lastik bir hortumun soğuk suya daldırılması sırasında kabarcık çıkmasıyla anlaşılır.
Otoklav içinde oluşan buhar, çıkacak yer bulamadığından aletin içinde basınç
meydana getirir manometre ibresi yükselir. İbre 1 atmosfer basıncı gösterdiği zaman,
otoklavın içindeki sıcaklık 120 ºC ’dir. Bu basınç ve sıcaklığa ulaştıktan sonra 15-45 dk
beklemek suretiyle istenen sterilizasyon işlemi tamamlanır. Isıtıcı kapatılarak aletin
soğuması beklenir. Basınç 0 (sıfır)'a düştüğü zaman, hemen buhar musluğu yavaşça açılır.
Buhar çıkışı durduğunda otoklavın iç basınç ile dış basıncı eşit olur ve hemen kapak açılır.
Basınç yüksek iken buhar musluğu açılırsa, basınç süratle düşer ve otoklav içindeki
sterilize edilmek istenen sıvılar kaynamaya başlar. Netice de bulundukları kaplardan
taşarlar. Aynı şekilde basınç sıfır da iken, otoklavın buhar musluğu açılmazsa, soğumakta
olan otoklavdaki su buharı süratle yoğunlaşır. Bunun sonucu otoklav iç basıncı dış
atmosfer basıncından daha aşağıya düşer. Bu esnada fazla miktarda yoğunlaşan su buharı
otoklavdaki eşyayı ıslatır.
Pasteur Fırının Kullanılması:
180 ºC de 1 saat veya 160 ºC de 2-2,5 saat fırını çalıştırmak suretiyle yapılır.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
DENEY 4- MİKROSKOP KULLANIMI
1. MİKROSKOP
Bakteriler çok küçük olduklarından çıplak gözle görülmezler. Görülebilmeleri için, çok
fazla büyütülmeleri lazımdır. Bu büyütmeyi bize temin eden mikroskop, bakteriyoloji
çalışmalarında en çok kullanılan bir aletidir. Genel anlamda mikroskop, küçük cisimleri
büyüterek görünmelerini temin eden, merceklerden yapılmış bir alet olarak tarif edilebilir.
Sözcük olarak latince; MİCROS ( =küçük ) ve SKOPEIN (= Müşahade etme )
kelimelerinin birleştirilmesinden meydana gelmiştir. 1674 yılında tek mercekli basit bir
mikroskobu Anton van Leeuwenhoek bulmuş, günümüze kadar geliştirilerek ulaşa
gelmiştir. Mikroskoplar, büyütmeleri kıstas olarak ele alındığında;
a- Işık ( optik ) Mikroskobu
b- Elektron Mikroskobu olarak iki kategoride toplanırlar.
Işık mikroskobunda büyütme optik mercekler sistemi ile elde edilir. Başlıca çeşitleri
şunlardır.
123456-
Aydınlık Saha Mikroskobu (Adi Işık Mikroskobu)
Karanlık Saha Mikroskobu
Ultroviole Mikroskobu
Flouresans Mikroskobu
Faz Kontrast Mikroskobu.
Stero Mikroskobu
Elektron mikroskobu, isminden de anlaşılacağı üzere, büyütme ışık dalgaları yerine
elektron şuaları ile sağlanır. Elektron mikroskopları;
1- Transmission Elektron Mikroskobu ( TEM )
2- Scanning Elektron Mikroskobu ( SEM ) olarak iki çeşidi yaygın olarak kullanılır.
Tablo.1. de bazı mikroskop çeşitleri ve özellikleri gösterilmiştir.
Tablo.1 Bazı Mikroskop Çeşitleri ve Özellikleri ( Pelczar ve ark.)
Mikroskop
Tipi
Adi Işık Mikroskobu
Maksimum Büyütme
1000-2000
İncelenen Örneğin
Özelliği
Boyamış veya
boyanmamış örnekler
Karanlık Alan
Mikroskobu
1000-2000
Boyanmamış örnekler
Faz-kontrast
Mikroskobu
1000-2000
Boyanmamış örnekler
Elektron Mikroskobu
200.000 400.000
Cansız yapılar incelenir.
İncelemeden önce
örnekler özel bir işleme
tabi tutulur.
Mikrobiyolojide
Kullanım Alanı
Bakteri, Mantar, Alg ve
Protozoa’nın kabaca
morfolojik özelliklerinin
incelenmesi
Özelleşmiş morfoloji
gösteren
mikroorganizmaların
canlı olarak incelenmesi
Hücrelerdeki
(mikroorgazma) canlı
yapıların incelenmesi
Virüslerin ayrıca
mikroorganizma ince
yapısının incelenmesi
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
Işık Mikroskobu
Öğrenci tatbikatlarında laboratuarlarda mikroorganizmaların incelenmesinde devamlı olarak kullanılan
ve özel bir ışıklandırma sistemine ihtiyaç göstermeyen, yani güneş ışığı veya elektrik ışığı ile çalışan
mikroskoplardır.
2. MİKROSKOP PARÇALARI
Mikroskobik çalışmalarda en iyi sonucu alabilmek için, mikroskop özellikleri, kullanım ve bakımını
iyi bilmek gerekir, Genel olarak ışık mikroskobu Şekil 1’de görüleceği üzere, mekanik, aydınlatma ve
optik olmak üzere üç ana kısımdan oluşur.
Mekanik Kısım
Bu kısım tüp, kol, tabla ve ayaklardan meydana gelir. Aydınlatma ve optik kısmın taşıyıcısıdır. tüp
silindir şeklinde bir parça olup, üst ucunda oküleri alt ucunda objektifleri taşır. Kol mikroskobu
tutmaya, tüp ile ayakları birbirine birleştirmeye ve tablayı tutmaya yarar. Tabla dört köşe veya
yuvarlak olup ortası deliktir İncelenecek preperasyonlar tablaya konur ve delik kısım ışık kaynağından
gelen ışınları geçirmeye yarar. Mikroskobun ayağı genelde U ve V şeklinde yapılmış olup, ağırdır.
Şekil 1. Işık Mikroskobunun Şematik Çizimi ve Kısımları
Aydınlatma : Teferruatlı bir inceleme ve hassas bir çalışma için elektrik lambası ışığı iyi bir sonuç
verir. Preparatı aydınlatmak ve iyi bir ışık ayarı için kondansatör kullanılır
Kondansör: Işığı obje üzerinde odaklar ve yoğunlaştırır, ışığın dağılarak görüntünün bozulmasını önler
ve rezolüsyon arttırır, sıcak lambayı optik bölümlerden ve kullanıcıdan uzak tutar.
Diyafram: Işık kaynağından gelen ışık demetinin çapını kontrol etmek için kullanılır, ışık kaynağının
üstünde ya da kondansörün altında yerleşiktir. Işığın şiddetini azaltmak için değil, en iyi kontrast ve
rezolüsyon elde edilecek ışık çapını ayarlamak için kullanılır.
Optik Kısım: Optik kısmı oküler ve objektifler oluşturur; a-Okuler; Tüp içinde objektif tarafından
oluşturulan görüntüyü büyütür. Zahiri görüntüyü hazırlar. Objektifin ışık kusurlarını düzeltir. oküler
genel olarak 10x büyütmeli olurlar. 5, 7, 15 ve 20x tipleri de vardır.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
b-Objektifler; Mikroskopta ilk büyütmeyi yapan optik kısımdır. Çok sayıda merceğin uygun düzende
bir araya getirilmesi ile oluşur. Objeden gelen ışık demetlerini toplamak ve büyümüş gerçek görüntü
oluşturmaktır. Laboratuarımızdaki mikroskoplarda obje/ görüntü oranı 4, 10, 40 ve 100 X olan 4 adet
objektif bulunmaktadır. 10x objektifi, küçük büyütmeli objektif; 40x orta büyütmeli objektif, 100x ise;
immersiyon objektifi olarak adlandırılır.
3. MİKROSKOP KULLANILIŞI
Mikroskobik inceleme ilk küçük büyütmeli ( 10x ) ojektif ile başlar. Küçük büyütmeli objektif
gözetleme pozisyonuna getirilir, ve preparatın üzerine indirilir. Makro ayar düğmesi İle objektifler
yükseltilerek görüntü odaklanır. Mikro ayar düğmesi ile de görüntü netleştirilir. Diyafram vasıtasıyla
ışık şiddeti kontrol edilir.
Küçük büyütmeli objektiften rovelverin döndürülmesi ile mikroskoptaki görüntü orta büyütmeli
objektifte odaklanır. Şayet görüntü tam olarak görünmüyorsa, makro ayar ile objektifleri biraz aşağıya
indirerek veya mikro ayar düğmesi ile oynayarak görüntünün netleşmesi sağlanır. Orta büyütmeli
objektif lama kesinlikle dokundurulmaz. Mikroskopta görüntü işlemi net değilse, bu durum ayar
düğmelerinin hızlı kullanılmasından kaynaklanmış olabilir. Baştaki işlemler tekrar edilerek net
görüntü sağlanır.
İmmersiyon Objektifi (100x) kullanarak görüntüyü netleştirme işlemi, orta büyütmeli objektif ile
yapılan işlemlerin tekrarıdır. Boyalı preperatların incelenmesi esnasında, rezolusyonu artırmak için
preperat ile objektif arasına immersiyon yağı konur. İmmersiyon objektifi ile incelemede ilk önce
objektif lamın üzerinde 1 cm kadar yükseltilir. İmmersiyon objektifini pozisyona getirmek için
rovelver döndürülür. Preperatın merkezine bir damla immersiyon yağı damlatılır. Objektif yağ ile
temas edinceye kadar yavaşça indirilir. İmmersiyon objektiflerinin çalışma aralığı son derece küçük
olduğundan ilk başlarda görüntünün netleştirilmesinde güçlük çekilebilir Görüntü bulunduğunda
optimum ışıklandırma için diyafram aralığı ayarlanır.
4. MİKROSKOP TEMİZLENMESİ VE MUHAFAZASI
Oküler ve objektifler özel mercek kağıtları ile temizlenir. Mikroskop kullanılmadan önce ve
kullanıldıktan sonra temizlenmelidir. Bilhassa immersiyon objektifi üzerindeki yağ kalıntıları ve tabla
üzerindeki döküntüleri temizlemek için % 30 Ksilen + % 70 Etil alkol çözeltisi kullanılır.
Mikroskop temizlendikten sonra rovelver küçük büyütmeli objektif yerine getirilir. Üzeri örtüsü ile
örtülerek muhafazası içine yerleştirilir.
KULLANILACAK MALZEMELER
•
•
•
•
•
Işık Mikroskobu
Lam
Lamel
Temizleme Çözeltisi ve Bezi
İğne, Öze
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
METOT
Mikrobiyolojide çalışılan neredeyse tüm organizmalar çıplak gözle görülemeyip, tespitleri için
mikroskoba ihtiyaç duyulmaktadır. Mikroorganizma çalışmalarının iyi bir şekilde yürütülebilmesi için
iyi derecede mikroskop kullanımı becerisi gerekmektedir.
Bu laboratuar uygulamasında mikroskobun nasıl çalıştığı ve materyalin mikroskopta nasıl inceleneceği
öğrenilecektir.
Mikroskopta inceleme adımları;
1- Preparatı (lam ve lameli) nesne tablasının üzerindeki sıkıştırma klipslerinin altına yerleştir. (Lamel
olan tarafın daima yukarıda olacaktır)
2- Her zaman için en küçük objektif (10X) ile çalışmaya başla.
3- Kaba ayar düğmesi (Macro Vida) ile nesne tablasını en üst seviyeye çıkartıncaya kadar tablanın
kenarına bak.
4- Okülere bakarak preparattaki görüntü belirinceye kadar kaba ayar düğmesini (Macro Vida) aşağıya
doğru çevir.
5- Kaba ayar yapıldıktan sonra ince ayar düğmesi (Micro Vida) ile keskin bir görüntü alıncaya kadar
ayar yap.
6- Gözlem yaparken gözünüzü okülere yapıştırma.
7- Büyütmeyi arttırmak için hareketli revolveri saat yönünde çevir ve her objektif değişikliğinde
sadece ince ayar düğmesini (Micro Vida) ayarlayarak görüntüyü odakla.
Not 1: Objektif değiştirirken tablayı aşağı indirmeyi unutma!!!
Not 2: Her büyütmede ışığa gereksinim artacağından diyafram daha fazla açılmalıdır.
8- İnceleme işlemi bittikten sonra, objektifi tüpteki oküler ile birlikte en düşük büyütme seviyesine
(10X) getirip bırak.
9- Aydınlatma sistemini kapat.
10-Mikroskop sadece gövde kolu üzerinden tutulmalı ve taşınmalıdır.
11- Toz, mikroskop ve optik aksamın en kötü düşmanıdır. Bu nedenle mikroskobun hassas iç
bölümlerine tozun girmesini engellemek için herhangi bir objektifi veya oküleri kesinlikle mikroskop
üzerinden çıkartma.
12- Eğer mikroskobun gövdesi ve tablası tozlu ise, tozun silinmesi için yumuşak pamuklu bez parçası
kulan.
13-Tüm bu işlemlerden sonra artık mikroskobu koruma örtüsüyle ört.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
DENEY 5- BESİYERİ HAZIRLAMA
Herhangi bir mikroorganizma ile çalışmak için ilk olarak, o organizmanın saf kültürünün
yapılması gerekir. Bir besiyerinde üretilmiş mikroorganizmaların tümüne kültür adı
verilir. Bu sebeple ilk önce besiyeriler hazırlanır. Besiyeri (besi ortamı, ortam, vasat,
kültür ortamı, kültür vasatı, kültür besiyeri) içerisinde mikroorganizmaların büyümeleri
için gerekli olan, farklı sayı ve miktardaki maddeleri ihtiva eden, steril edilmiş
ortamlardır. Besiyeri, mikroorganizma geliştirilmesi, izolasyon, sayım, duyarlılık testleri,
sterilite testleri, su ve çevre kontrolü ve biyolojik ürünlerin elde edilmesi gibi farklı
amaçlara yönelik olabilir.
Herhangi bir mikroorganizma ile çalışmak için ilk olarak, o organizmanın saf kültürünün
yapılması gerekir. Bir besiyerinde üretilmiş mikroorganizmaların tümüne kültür adı verilir. Bu
sebeple ilk önce besiyeriler hazırlanır. Besiyeri (besi ortamı, ortam, vasat, kültür ortamı, kültür
vasatı, kültür besiyeri) içerisinde mikroorganizmaların büyümeleri için gerekli olan, farklı sayı ve
miktardaki maddeleri ihtiva eden, steril edilmiş ortamlardır. Besiyeri, mikroorganizma
geliştirilmesi, izolasyon, sayım, duyarlılık testleri, sterilite testleri, su ve çevre kontrolü ve
biyolojik ürünlerin elde edilmesi gibi farklı amaçlara yönelik o
Besiyeriler kullanım amacına göre değişik şekillerde gruplandırılabilirler:
1. Genel Besiyerler:
Herhangi bir inhibitör madde içermeyen, besin maddelerince yeterli, herhangi bir organizma
grubunun gelişmesini özel olarak desteklemeyen, bazı zor gelişen mikroorganizmaların da dahil
olduğu çok sayıda bakterinin gelişmesini sağlayan besiyerilerdir. Genel besiyeriler başlıca, çeşitli
örneklerdeki toplam mezofil ve psikrofil aerobik bakteri sayımı ve bozulma veya hastalık
etmenlerinin öz izolasyonu amaçları için kullanılır. Tüm bakterilerin gelişebileceği nitelikte bir
genel besiyeri henüz mevcut değildir. Genel besiyeriler, zor gelişen bakterilerin sadece bir
bölümünün gelişmesini sağlayabilir. İnkübasyon şartlarının değiştirilmesiyle psikrofillerin,
mikroaerofillerin, aerotolerantların ve özel inkübasyon koşullarının sağlanmasıyla da kısmen
anaerobların kültüvasyonunda kullanılır. Tryptic soy agar (TSA) ve tryptic soy broth (TSB) en çok
kullanılan besiyerilerindendir.
2. Seçici Besiyerler: Seçici besiyeriler, karışık bir mikrobiyal floradan, gelişmesi istenmeyenleri
baskılamak, ancak gelişmesi istenenler için herhangi bir olumsuz etki yapmamak üzere formüle
edilen besiyerilerdir. Bu nedenle bu tür besiyeriler, çeşitli inhibitörler veya geliştirilmesi istenilen
mikroorganizmaların kullanabileceği, ancak refakatçi flora üyeleri tarafından kullanılmayan çeşitli
besin maddeleri ihtiva ederler. Örneğin, NaCl miktarı yüksek olan bir besiyeri, sadece yüksek tuz
konsantrasyonuna dayanıklı bakterilerin büyümelerini sağlar. Pseudomonas izolasyon agar (PIA),
sadece Pseudomonas cinsi üyelerin büyümesini sağlar. MacConkey (MC) besiyeri de en çok
kullanılan seçici besiyerilerden olup, gram olumlu bakterilerin büyümelerini engellerken, enterik
(gram olumsuz) bakterilerin büyümelerine imkan verir.
3. Ayırt Edici Besiyeriler: İnhibitörlerin, gelişmesi istenen mikroorganizmalara az da olsa zarar
verebilmesi sebebiyle, inhibitör kullanımıyla istenmeyen mikroorganizmaların inhibisyonunun her
zaman mümkün olmaması, bazı inhibitörlerin insan sağlığına zararlı olması gibi nedenlerden
dolayı, seçici besiyeriler her zaman istenilen sonucu vermemektedir. Seçici besiyeriler yerine ayırt
edici besiyerilerin kullanılması daha tatmin edici sonuçlar vermektedir. Ayırt edici besiyerilerinde,
gelişmesi için istenen mikroorganizmaların yanında diğerleri de gelişebilir. Ancak, başta koloni
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
morfolojisi olmak üzere çeşitli farklılıklar ile hedef mikroorganizma diğerlerinden ayrılır. Ayırt
edici besiyeri koloni özelliği, çeşitli pH indikatörleri, boya maddeleri, indirgeyiciler ve diğer
indikatörler gibi maddelerin besiyeriye ilave edilmeleriyle yapılır. En basit olarak, besiyeri
bünyesine, ayırt edilmek istenen mikroorganizmaların kullanabileceği, ancak ortamda bulunan
diğer bakterilerin yararlanamayacağı bir karbonhidrat ilave edilir. Mikroorganizmaların bu
karbonhidratı kullanması da çeşitli indikatörlerle belirlenir. Örneğin, koliform grubu bakteriler için
laktozdan gaz oluşturulması tipik bir ayırt edici özelliktir. Çoğu mikroorganizmalar belirli
karbonhidratları kullanırken asit oluşturur ve bu asitlik pH indikatörü ile rahatlıkla belirlenir. Kan
agar kullanılan kullanılan ayırt edici besiyerilerden biridir.
4. Zenginleştirilmiş Besiyerler: Karışık bir mikrobiyal flora içinde
mikroorganizmayı geliştirmek ve sayısını arttırmak için kullanılan besiyerilerdir.
hedeflenen
bir
5. Tanımlayıcı Besiyeriler: Bir mikroroganizma izolatının tanımlanması için kullanılan
besiyerilerdir. Bunlar, mikroorganizmaların belirli bir besin maddesini kullanıp/ kullanamadığının
tespit edilmesi, belirli bir besin maddesinden metabolizma sonucunda tayin edilebilecek
metabolitlerin oluşturup/ oluşturmadığının belirlenmesi gibi amaçlar için kullanılırlar. Bakterilerin
hareketli olup olmadığının belirlenmesi amacıyla kullanılan yarı katı besiyeriler de tanımlama
besiyerileri sınıfına girer.
6. Diğer Besiyeriler: Antimikrobiyal duyarlılık testlerinde kullanılan agar disk difüzyon
besiyerileriyle minimal inhibisyon konsantrasyon testlerinde, vitamin ve amino asitlerin mikrobiyal
yolla belirlenmesinde ve saf kültürlerin korunması amacıyla kullanılan besiyeriler gibi özel
amaçlara yönelik olarak hazırlanan ve kullanılan besiyeriler de vardır. Besiyeri hazırlanırken
formülasyonuna giren maddeler ayrı ayrı dikkatlice tartılarak deiyonize su içinde çözülürler veya
hazır dehidre besiyeri doğrudan tartılarak yine deiyonize su içinde çözülür. Örneğin, nitrüent broth
besiyerinin bileşimi litrede 5 g pepton ve 3 g et ekstratı şeklindedir. Laboratuarda hazır dehidre
nitrüent broth besiyeri varsa bundan 8 g tartılarak 1 litre suda çözülür. Çalışmalarda hazır
besiyerilerin kullanılması daha uygundur.
Besiyerinin Sahip Olması Gereken Özellikler
• Uygun miktarlarda su ile su aktivitesi yüksek olmalı,
• Mikroorganizma ihtiyaçlarını karşılayabilecek kolayca kullanılabilir besin maddeleri
içermeli,
• Uygun asit-baz dengesine (pH) sahip olmalı,
•
Berraklık, katılık gibi fiziksel özellikleri elverişli olmalı,
• Osmotik basıncı, oksidasyon/ redüksiyon (indirme/ yükseltgenme) potansiyeli
mikroorganizmalara uygun olmalı,
• Steril olmalı, sterilizasyon kontrolü yapılmalı,
• Ekim öncesi sterilizasyon hazırlığı ve sterilizasyon uygulaması titizlikle uygulanmalı,
• Dış ortamdan mikroorganizma kontaminasyonunun önlenmesi için özel kaplarda
hazırlanmalı ve saklanmalı.
B. BESİYERİ ÇEŞİTLERİ
Fiziksel özelliklerine göre laboratuar ortamında kullanılan besiyerleri katı ,sıvı ve özel olmak üzere
3’e ayrılırlar.
I. Sıvı Besiyeri: Bazı besiyerleri sıvıdır. Sıvı besiyerinde bulunan bir bakteri çoğalma özelliğine
girer ve ortam şartlarına bağlı olarak uzunca bir zaman ölmeden kalırlar. Sıvı besiyerinde üreyen
bir bakteri buradaki lüzumlu maddeleri kullanır. Ortama metabolizma ürünlerini bırakır.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
Besiyerinde daha önce bulunmayan bu ürünlerin gösterilmesi bakterinin teşhisine yarar ( indol,
H2S teşkili, karbonhidratlardan gaz ve asit teşkili gibi). Bakteri sıvı besiyerinde homojen bir
bulanıklık meydana getirerek üreyebileceği gibi dipte çöküntü veya yüzeyde zar teşkil ederek de
üreyebilir. Sıvı besiyerlerine Buyyonlu Besiyerleri adı da verilir.
II. Katı Besiyeri: Katı besiyerine ekilen bakteri ancak ekildiği yerde ürer ve koloni teşkil eder.
Meydana gelen koloniler, bakterinin türüne göre özellik gösterirler. Katı besiyerine yaymak
suretiyle bakteri hücrelerine ayırmak ve meydana getirdikleri kolonileri ayrı ayrı elde etmek ( yani
saf kültürlerini ) mümkündür.
Katı besiyerine besin kıymetini değiştirmeyen bir madde ilavesiyle elde edilir. Bunun için en fazla
jeloz (agar) kullanılır. Bundan dolayı katı besiyerlerine jelozlu besiyerleri de denir. Agar, " Agar
agar " adındaki bir deniz yosunundan elde edilir. Jelatin ilavesi ile de katı besiyeri elde edilir.
III. Özel Besiyeri: Mikrobiyoloji laboratuar çalışmalarında kullanılan bir çok besiyeri vardır.
Bazen benzer deneyler için bile farklı besiyerleri kullanılmaktadır. Çoğunlukla özel amaçlar için
hazırlanıp kullanılan besiyerlerine özel besiyerleri adını veriyoruz. Mesela zenginleştirilmiş, tecrit,
ettirici besiyerleri gibi.
C. BESİYERİ HAZIRLAMA
Besiyerleri hazırlanırken aşağıdaki adımlara ve işlemlere dikkat edilir.
a) Kullanılan Suyun Özellikleri
Kültür ortamlarının ve çözeltilerin hazırlanmasında yalnızca distile veya deiyonize su kullanılır.
Distile sudaki toksite florür, fenol v.b.den meydana gelebilir. Toksitenin diğer kaynakları gümüş,
kurşun ve muhtelif tanımlanmamış organik komplekslerdir. Bakiye klor ve kloraminler dahi, klorlu
sudan temin edilmiş distile suda bulunabilir. Distile suda klor bileşikleri bulunduğu zaman, aynı
eşdeğer oranda sodyum sülfit veya sodyum tiyosülfat ilavesiyle nötralize edilmelidir.
Distile su nütrient bulaşmalarından uzak olmalıdır. Şayet bu tür bulaşma varsa, distilasyon
esnasında organiklerin tutulmasını temin eden karbon filtre kolonlarının değiştirilmesi gerekir.
Distile suyu, alglerin büyümesini önlemek için direkt güneş ışığından ve nütrient bulaşmasını
engelleyecek şekilde plastik kaplarda saklama yapılır.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
b) Reaksiyon Uyumu
Kültür ortamının reaksiyonu, pH olarak ifade edilen hidrojen iyonu konsantrasyonu teriminde
belirlenir. Sterilizasyon esnasında (pH'da) hidrojen iyonu konsatrasyonundaki artma veya azalma,
sterilizasyonu yapan ferde bağlı olabilir. pH daki azalma 0,1 ile 0,2 bazen çift kuvvetli ortamlardan
0,3 olarak büyük olabilir. Fosfat gibi tamponlama tuzları hazırlanan ortamda mevcut olduğu
zaman, pH değerlerindeki azalma ihmal edilebilir.
Hazırlanan besiyerlerinin ihtiyaç duyulan pH ayarlamaları pH metre ile yapılır. Uygulamada
standart pH ölçümleri kullanılır. İstenilen pH'a ayarlamak için, NaOH çözeltisi kullanılır. Bilinen
hacimdeki besiyerine, NaOH ile pH ayarlaması yapılır. Daha sonra tüm karışımın pH kontrol edilir
ve uygun pH' a kadar ayarlama uzatılır.
Ticari hazır besi maddelerinin herbirinin, hazırlanırken ihtiyaç duyulan son pH değerleri
verilmiştir. Bu tür besiyerleri hassas tartım ve prosedürüne uygun hazırlandığı zaman pH ayarı
gerekmeyebilir.
c) Besiyerlerinin Sterilizasyonu
Besiyerleri hazırlandıktan sonra, derhal kültür kaplarına (tüp ve şişelere ) dağıtılır ve iki saat içinde
sterilize edilir. Sterilize edilmemiş besi maddeleri saklanmaz. Bütün besi maddeleri, özelliklerine
göre bazıları (MF Koliform broth vb. gibi) hariç tutulursa otoklavda 121oC de 15 dakika sıcaklıkta
1 atmosfer basınç altında tutularak sterilize edilir.
Basınç sıfıra düştüğü zaman otoklavdan ortamları hemen uzaklaştırmak ve çabucak soğutmak
gerekir. Besiyerlerinin ısınmaya maruz kalması vasıtasıyla bozulmasını önlenmelidir. Küçük
kaplarda az miktarlardaki besi maddeleri sterilizasyon esnasında üniform ısınmayı ve çabuk
soğumayı temin eder. Şekerli besi maddeleri 121 oC de 12 ila 15 dakika için sterilize edilmelidir.
Şekerli besi maddelerinin sterilizasyon esnasında maruz kaldıkları maksimum zaman 45 dakikayı
geçmemelidir.
Otoklavın açma-kapama zaman aralığı da çok kısa olmalıdır. İhtiyaç duyulan toplam ısınma
zamanını 45 dakikayı geçmemesi için besiyerlerinin sterilizasyonunda ön ısınmalı çift duvarlı
otoklav kullanılması tercih edilmelidir.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
DENEY 6 – ÇEVREMiZDEKi MiKROORGANiZMALAR VE KATI VASATTA
(STANDART PLATE AGAR) TESPİTLERİ
1. ÇEVREMİZDEKİ MİKROORGANİZMALAR
Çevremizdeki mikroorganizmaları 4 genel grupta inceleyebilir. Bunlar; bakteriler,
protozoalar, mantarlar ve alglerdir.
Bakteriler
Bakterilerin çoğunun çapı bir milimetrenin binde birinden daha büyük değildir. Bu
nedenle de burada ölçüm birimleri olarak mikrometre veya nanometre kullanılır (1
mm=10-3 mm) ve (1nm=10-6 mm).
Sekillerine göre bakteriler dört grubta toplanabilir:
1. Bilya seklinde ve küresel olanlar (*Koklar)
2. Silindirik ve düz olanlar, çubuksular (Bacıllus, Pseudomonas)
3. Kıvrımlı çubuksular, virgül seklinde olanlar (Vibriolar)
4. Vida seklinde olanlar (Spiraller)
*Koklar; diplokok, streptokok ve stafilokoklar olarak ayrılmaktadır.
Saprofit ( zararsız ) Olan Bakteriler:
1. Koliform Bakteriler
a) Escherichia sp.
b) Citrobacter sp.
c) Klebsiella sp.
d) Enterobacter sp.
2. Proteus sp.
3. Pseudomonas sp.
4. Alcaligenes sp.
Patojen Olan Bakteriler:
1. Salmonella sp.
2. Shigella sp.
Mantarımsı Bakteriyal Koloniler
Bakterilerin koloni oluşumu, bir nevi fiziksel kümeleşme olayıdır. Burada büyüme
mekanizması başlangıçta eksponansiyel, daha sonraları ortamın özelliklerine bağlı
olarak karmaşık bir hal almaktadır. Arıtma sistemlerinin kenar yüzeylerinde görülür. En
çok damlatmalı filtrelerde, havuzların kenar yüzeylerinde ve bilhassa kanalizasyon
borularının kenarlarında rastlanır. İki boyutlu olarak hareketli bir biçimde çoğalma söz
konusudur. Bu tür koloniler, sümüksü, müsülajlı bir yapı gösterirler. Bakteriyal
kolonilere benzerler. Ancak mantarımsı bakteriyal koloniler ile bakteriyal koloniler
aralarındaki fark, mantarımsı bakteriyal kolonilerinin amorf yapı özelliği
göstermelerinden dolayı hareket etmeleri ve hücreler arası bağlantıya sahip olmalarıdır.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
Şekil: 10,000 kez büyütülmüs bir Escherichia coli bakteri kolonisi
Koliform Bakteri Grubu
Bu organizmalar patojen olmayıp suda mevcut olmaları dışkı ile bir kirlenmeyi ve buna bağlı olarak
potansiyel bir tehlikeyi işaret eder. Tifo, dizanteri, kolera gibi hastalıklar bir bağırsak enfeksiyonu
olduğundan, koliform bakterilerinin herhangi bir suda bulunması, yukarıdaki hastalıklara sebep olan
bakterilerin o suda var olacağı ihtimalini gösterir. Yani bu bakteriler böylesi bir tehlikenin
indikatörüdürler. Bu sebepten bunların suda olmayışları patojen bakterilerin olmayışının bir
göstergesidir. Dışkının 1 gramında 105 - 106 civarında bakteri mevcuttur ve bunların % 95 'i koliform
grubu bakteriler teşkil etmektedir. Sularda koliform bakterilerinin aranmasının sebebi; bunların
patojen olan bakterilere oranla daha kolay daha ucuz ve daha kısa sürede tesbit edilebilmeleridir.
Koliform grubunu oluşturan bakteriler; tamamı aerobik veya fakültatif anaerobik olan, gram-negatif,
spor oluşturmayan, çomak şeklinde, laktozdan 35 0C’de 48 saat içerisinde gaz ve asit oluşturan
bakteriler olarak tarif edilir. Koliform grubu bakterilerin önemli bir türü olan Escherichia coli, 2-4 µm
boyunda 0,4-0,7 µm eninde, düz, uçları yuvarlak çomak biçiminde bakterilerdir. Hareketleri tifo
basiline (Salmonella typhi ) göre daha yavaştır. Escheria coli fakültatif anaeroptur. Optimal üremesi 35
ºC’dir. Normal besiyerinde kolay ve bol ürerler. Sıvı besiyerinde homojen olarak ürerler ve kültürleri
feçes (dışkı) kokusundadır. Koliform bakterilerin asıl kaynağını insan ve hayvanların (sıcak kanlı
hayvanların) dışkıları oluşturmaktadır. Dolayısıyla, yerleşim merkezlerindeki; kanalizasyon suları ile
bunlarla kirletilmiş olan sıvı atıklar ve katı atık sızıntı suları önemli koliform kaynaklarıdır.
Protozoalar
Şekil: Paramecium sp. (terliksi)
Şekil: Amip, Terliksi, Kamçılı
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
Protozoa ya da bir hücreliler; genellikle mikroskobik, bir hücreli ve ökaryotik canlıları içeren bir
Protista alt alemidir. Tek hücreli olmalarına rağmen, çok hücrelilerde görülen yaşamsal işlevlerin bir
çoğunu yapabilirler. Bu nedenle eski zamanlarda vücut maddesi hücrelere ayrılmamış hayvanlar
olarak kabul edilmiş ve "Hücresizler" adıyla anılmıştır. Sitoplazmalarında bulunan özelleşmis yapılara
"organel" denilmekte, hareket, sindirim, boşaltım gibi hayatsal faaliyetlerini bunlarla sağlamaktadırlar.
Çoğu bir çekirdekli, (Monoenergid), bir kısmı da her zaman çok çekirdek taşıyan (Polienergid)
canlılardır. Bazıları ise yaşamlarının belli bir kısmıda çok çekirdek taşırlar. Organel olarak; çekirdek,
endoplazmik retikulum, ribozom, golgi aygıtı, mitokondri, lizozom, peroksizom, mikrotubuluslar ve
filamentler bulundururlar. Hareket organelleri olarak yalancı ayaklar, kamçılar, siller, sirler ve
tentaküller görülür. Beslenme şekillerinde ototrof, saprozoyik, parazitik, kommensal, miksotrof ya da
heterotrof beslenme görülür. Boşaltımda en belirgin özelliklerinden biri; ritmik olarak sisen ve
küçülen vurgan (kontraktil) kofulların bulunmasıdır. Birçok denizel türde ve parazitlerde bu vurgan
kofullar görülmez. Çoğalmalarında; eşeysiz olarak; boyuna bölünme, çoğa bölünme, enine bölünme,
zırh oluşturduktan sonra ikiye bölünme, hücre dışı tomurcuk oluşturma ve hücre içi tomurcuk
oluşturma görülür. Eşeyli çoğalmalarında; kaynaşma (hologami), merogami ve konjugasyon görülür.
Tek olarak ya da koloni seklinde yasayan tek hücreli canlılardır. Bugüne kadar 60.000 kadar türü
tanımlanmış ve bunların yaklaşık 1/4'ü parazit olarak bilinir.
Mantarlar
Şekil: Mantarlar
Mantarlar kök, gövde, yaprak, çiçek ve klorofile sahip olmayan ökaryotik, heterotrofik çok hücreli
organizmalardır. Klorofilin bulunmaması nedeniyle fotosentez olayına rastlanamaz. Çok hücreli ve
büyük olmaları, üreme tarzları, yasam siklusları, çekirdek etrafında bir zarın bulunması, çok
kromozoma sahip olması, nukleolus içermeleri ve hücre içi organellerin (mitokondrium, golgi aparatı,
endoplasmik retikulum, vesikül, vakuol, vs) bulunmaları gibi nedenlerle prokaryotiklerden ayrılırlar.
Mantarlar dogada (kara ve sularda) çok yaygın bir yaşam spektrumu gösterirler. Büyük bir çogunlugu
saprofitik bir yaşantıya sahip olup kendilerine gerekli gıda maddelerini cansız materyallerden ve basit
organiklerden temin ederler. Bir kısım mantarlar da, insan ve hayvanların yanı sıra, bitki, balık,
kerevit, algler, insektler vs. canlılar üzerinde parazitik, sembiyotik veya komensal bir yasam içinde
bulunurlar. Şimdiye dek 110000' den fazla mantar türü (bunun 30000' den fazlası Basidiomycetes,
30000 den fazlası Deuteromycetes, 30000 den fazlası Ascomycetes sınıflarına aittir) saptanmış olup
bazılarının da karakterleri henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Çok doğaldır ki bu kadar fazla ve
aynı zamanda çeşitlilik gösteren türlerin bütün özelliklerini ayrıntıları ile saptamak, açıklamak oldukça
güç, zaman alıcı olup bazılarının biyokimyasal, sitolojik, fizyolojik ve genetik özellikleri de hala tam
bir açıklığa kavuşturulamamıştır.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
Mantar Koloniler
Mantar kolonileri tamamıyla misel seklinde dallanma gösteren ve büyüme yönleri tek bir yöne doğru
olan koloni seklidir. Bu tür koloniler genellikle koenotik hücre tipine sahiptirler. Mantar kolonileri
dallı bir yapı gösterirler ve çok hücreli bölünme tipine sahiptirler. Mantar kolonileri özellikle düşük
pH ve nütrient eksikliğine sahip atık suların arıtıldığı arıtma sistemlerinde büyüyüp gelişebiliyorlar.
Biyolojik arıtma sistemlerinde çökelme problemine neden oldukları için bulunmaları istenmez. Mantar
kolonilerini oluşturan hücrelerde birbirine bağımlı yasama sekli mevcuttur.
Algler
Şekil: Algler
Algler, gerek yapısal olarak gerekse dış görünüşleri bakımından oldukça farklı görünümdedirler.
Yapısal olarak; eukaryotik (gelişmiş hücre tipi) ve prokaryotik (basit yapılı hücre tipi) olmak üzere iki
büyük gruba ayrılırlar. Buna göre Mavi-Yeşil algler göstermiş oldukları hücre organizasyonları
bakımından prokaryot hücre özelliği taşımaktadırlar. Algler su ortamında primer üretici canlılardır.
Yapılarındaki pigmentleri sayesinde Karbondioksit ve suyu, ışığın etkisi ile karbonhidratlara çevirirler
böylece su ortamındaki besin degerinin ve çözünmüş oksijen oranının artmasını sağlarlar. Sonuçta
kendi gelişimlerini sağlayarak besin zincirinin ilk halkasını oluştururlar. Bu şekilde üretime olan
katkıları ve üst basamaktaki canlılarla olan ilişkileri açısından önem taşımaktadırlar. Alglerin
üretimleri çevresel faktörlerle sınırlanmıştır. Bunlar ışık, sıcaklık ve besindir. Bu sınırlayıcı faktörler
iyileştirilirse, üretim düzeyi artar. Üretim artısının belli bir düzeyi asmasının doğal bir sonucu olarak
da çevresel denge bozulur ve bu gelişime eutrofikasyon adı verilir. Eutrofikasyonun sonuçlarından
birisi de aşırı alg patlamalarının görülmesidir. Bunun anlamı, fitoplankton (alglerin serbest yüzen
formları) populasyonlarının suyun rengini, kokusunu ve ekolojik dengesini bozacak yeterli yogunluga
ulaşmasıdır. Bunun yanı sıra alglerin aşırı gelişmesi, sucul ortamdaki bir çok canlı için toksik etkilere
neden olduğu için ölümler görülebilmektedir. Örneğin, Dinoflagellatlardan Gymnodinium ve
Gonyanlax'a ait türler aşırı çoğalma sonucu, hayvanların sinir sistemlerini etkileyen, yüksek oranda
suda çözünebilen toksik madde üretirler. Diğer patlamalara ise Mavi-Yeşil alglerden Microcystis,
Anabaena, Nostoc,Aphanizomenon, Gloeotrichia ve Oscillatoria, Chrysophyte'den Prymnesium
parvum neden olmaktadır.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
Çevremizdeki Mikroorganizmaların Tespiti
Deney 1
Gerekli Malzemeler
Katı besiyeri (Standart Plate Agar)
Distile su
Otoklav
Steril baget veya ekübuyyon çubuğu
Steril petri kutuları
İsporto Ocagı
Etil alkol
İnkübatör
Koloni Sayacı
Mikroskop
Deneyin Yapılısı
Standart plate agar katı besiyeri hazırlanır (22.5 g/l). 2 saat içerisinde otoklavda steril edilir (120 ºC
sıcaklık,1 atm basınçta 15 dk). Steril olarak hazırlanmıs katı besiyerleri otoklavdan çıktıgında sıvı
haldedir ve bu sekilde steril petri kutularına ispirto ocagı çevresinde aseptik şartlarda dökülerek
sogutulur. Daha sonra incelenecek ortamda petri kutusunun kapağı açılarak 10 dakika beklenir
(tuvaletler, kantinler, yemekhane, derslikler ve laburatuvarlar çevresel ortam olarak seçilebilir). Daha
sonra kapak kapatılır. Steril baget veya ekübuyyon çubuğu steril su ile ıslanır ve incelenecek yüzeye
sürülerek numune alınır, Petri kutusundaki katı vasat üzerine ekim yapılarak kapak kapatılır. Ekim
yapılan petri kutuları etiketlenip ters olarak etüve konarak, 20±2 0C sıcaklıkta inkübasyona tabi
tutulur. 24 ve 48 saat sonra oluşan koloniler gözlenir.
Sonuçlar
Oluşan koloniler sayılır. Mikroskopta koloni tipi ve renk farklılıklarından, türler tespit edilir.
Deney 2
Prokaryotik organizmalardan Mavi-Yesil Alglerin mikroskobik incelenmesi ve morfolojik yapılarını
kabaca gözlemlenmesi.
Gerekli Malzemeler
Mavi-yesil alg kültürü
Steril 1 ml lik pipet
Lam ve Lamel
Mikroskop
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
Deneyin Yapılısı
Temiz bir lam alınır. Üzerine steril 1 ml lik pipet yardımıyla bir damla Mavi-yeşil alg kültürü konur.
Numunenin üzerine lamel kapatılır. Mikroskopta 10x olarak, düşük büyütmeli objektiften başlayarak
incelenir.
Sonuçlar
Mikroskopta Mavi-yeşil alg hücreleri taşıdıkları renk pigmentleri vasıtasıyla morfolojik olarak teşhis
edilir.
Deney 3
Ökaryotik organizmalardan Alglerin, Protozoaların ve Mantarların mikroskobik incelenmesi ve
morfolojik yapılarını kabaca gözlenmek.
Gerekli Malzemeler
Alg, Protoza ve Mantar Kültürleri
Steril 1 ml lik pipet
Lam ve Lamel
Mikroskop
Deneyin Yapılısı
Temiz bir lam alınır. Üzerine steril 1 ml lik pipet yardımıyla incelenecek kültürden bir damla konur.
Numunenin üzerine lamel kapatılır. Mikroskopta 10x olarak, düşük büyütmeli objektiften başlayarak
incelenir.
Sonuçlar
Mikroskopta;
• Alg hücreleri taşıdıkları renk pigmentleri vasıtasıyla tek hücreli veya çok hücreli ipliksi olarak
morfolojik olarak teşhis edilir.
• Protoza türleri, terliksi hayvan, paramesium, amipler ve çan hayvancığı morfolojik olarak gözlenir.
• Mantar hücrelerinden maya hücreleri gözlenir.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
DENEY 7 – MİKROBİYOLOJİDE BOYAMA TEKNİKLERİ: BASİT BOYAMA
1. GİRİŞ
Mikroorganizmaları tanımlama yollarından birisi, onları boyayarak incelemektir. Boyama, kimyasal
bir olaydır. Mikroorganizmaların pek çoğu renksiz olduklarından normal ışık mikroskobu ile
görünmeleri zordur. Mikroorganizmaların mikroskopta görünür hâle getirilmesi için preparat
hazırlandıktan sonra uygun boya çözeltileriyle boyanmaları işlemine “mikroorganizmaların
boyanması” denir.
2-MİKROORGANİZMALARI BOYAMA YÖNTEMLERİ
Kullanılan kimyasal boyaların ana amacı boyanan biyolojik kısımların daha net bir şekilde
mikroskobik incelemelerinin gerçekleştirilebilmesidir. Mikroorganizmaların boyanabilmesi için
mikroorganizma içeren sıvının lam üzerine bir öze yardımıyla yayılması (smear) ve fiksasyon
işleminin yapılması gereklidir.
Mikroorganizmaları boyamanın başlıca avantajları şunlardır:
•
•
•
Mikroorganizmalar ve zemin arasında kontrast oluşturarak onları daha kolay incelemek
Bakterinin hücre duvarı, vakuolleri gibi yapılarını daha kolay incelemek
Değişik morfolojik tipler arasındaki farklılığı ortaya çıkarmak
Boyama işleminde çeşitli boyalar kullanılır. Bunlar doğal ve sentetik boyalar olarak ikiye
ayrılmaktadır.
a) Doğal boyalar: Doğal boyalar bitkisel ve hayvansal orijinli olabilirler. Bunlardan bitkisel orijinli
olanlara hematoksilen ve orcein, hayvansal orijinli olanlara ise carmen örnek gösterilebilir. Doğal
boyalar daha ziyade histolojide kullanılmaktadır.
b) Sentetik boyalar: Bunların sayıları oldukça çoktur. Eosin, asit fuksin, asit pikrik, oranj gelb,
eritrosin, kongo kırmızısı, light green, metilen mavisi, toluidin mavisi, bazik fuksin, jansiyan viyole,
azocarmen, safranin gibi birçok boya sentetik boyalara örnek gösterilebilir. Sentetik boyalar; Ehrlich
tarafından bazik, asid ve nötr boyalar diye üç gruba ayrılmıştır. Serbest asid ve bazlar suda çok az
eridiklerinden sentetik boyalar daima nötr tuzlar halinde kullanılırlar. Nötr tuzlar hem asit köke
(anion) hem de bazik köke (kation) sahiptirler.
i. Bazik boyalar: Bazik boyaların kromofor grubu pozitif yüke sahiptir. Yani, yukardaki açıklamanın
ışığında, bu nötr tuzu meydana getiren bazik kısım (kation , +) renkli buna karşın asid kısım (anion, -)
ise renksizdir. Bu tür boyalara katyonik boyalar da denir. (Örneğin; metilen mavisi bazik bir boyadır
ve terkibi tetramethhyl-thionin-chlorhydrate’tır. Bu terkipte tetramethyl-thionin baz’ı hidroklorik asit
ile nötr bir tuz meydana getirecek şekilde birleşmiştir. Tetramethyl-thionin bazı renklidir ve metilen
mavisi boyasına rengini verir, anion kökü olan hidroklorik asit ise renksizdir.) Bismarck brown y,
crystal violet, methyl green, pararosanilin ( basic fuchsin), resorcin blue diğer bazik boyalara örnek
verilebilir. Bir doğal boya olan hematoksilen de bazik boya tarzında davranır. Bakterilerin yüzeyi
negatif olduğu için ayrıca DNA’da bulunan fosfatların da negatif yüklü olması nedeniyle katyonik
özelliğe sahip olan bazik boyalarla boyanırlar.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
ii. Asit boyalar: Asit boyaların boyayıcı kısımları negatif elektriksel yüke sahiptir. Yani burada tuzun
baz kısmı renksiz asid kısmı ise renklidir. Bu tür boyalara anyonik boyalar da denir. Asitik boyalar
zemini boyamak için kullanılmaktadır. Örneğin; sodium eozinat da eozinat negatif yüklü olup
kromofor özelliktedir. Diğer asidik boyalara acid fuchsin, anilin blue, kongo red, fast green, light
green, erytrosin, orange G, acid pikrik, Phyloxine, alizarin red S, çini mürekkebi, nigrosin, malaşit
yeşili gibi boyalar örnek gösterilebilir.
iii. Nötr boyalar: Nötr boyalar iyonik olmayan boyalardır. Bunlar suda çözünen renkli organik
bileşiklerdir. Burada nötr tuzu meydana getiren asid ve bazın her ikiside renklidir. Hematoloji ve
mikrobiyolojide sık kullanılan bu boyalara Giemsa boyası en güzel örnektir.Bu boyalar parazitlerin
incelenmesinde , rikettsiya ve klamidyaların boyanmasında kullanılmaktadırlar.Wright ve Leisman
boyalarıda bu tip boyalara örnektir. Boyama işlemi basit boyama veya komplex boyama yöntemleri
kullanılarak yapılır. Bu uygulama dersinde basit boyama teknikleri kullanılacaktır.
3 - BASİT BOYAMA YÖNTEMLERİ
Bu yöntemlerde genellikle tek bir boya eriyiği kullanılarak boyama yapılır. Mikroorganizmaların
morfolojisinin incelenmesi amaçlanır. Basit boyalar genellikle birçok amaç ve biyolojik materyal için
kullanılabilir. Tuzla birlikte boya veren bir pozitif iyondan meydana gelirler. Birçok basit boya negatif
yüklü hücre zarlarının boyanmasını sağlar. Fazla boya yıkanarak atıldıktan sonra mikroskop ile
inceleme gerçekleştirilebilir.
a) Negatif Boyama: Bu yöntemde asidik boya kullanılarak zeminin boyanması amaçlanır. Bu
preparatta mikroorganizma boya almaz. Mikroorganizmanın büyüklüğü ve morfolojisi hakkında bilgi
edinmek ve spiroketler gibi zor boyanan bakterilerin gözlenmesi amacıyla kullanılır. Çini mürekkebi
ya da Nigrosin eriyiği kullanılır. Bir damla çini mürekkebi lamın bir kenarına konur. Bir damla bakteri
süspansiyonu ile homojenize edilir ve lama yayılır. Preparat iyice kurutulur. Tespit işlemi yapılmaz ve
immersiyonla mikroskopta incelenir.
b) Löfflerin Metilen Mavisi kullanılarak yapılan basit boyamada Corynebacterium diphtheriae da
daha koyu boyanan metakromatik cisimcikler gözlenebilir.
Herhangi bir bazik boya kullanılarak yapılan basit boyamada bakterin morfolojisi ve büyüklüğü
hakkında bilgi edinmek yanında özellikle direkt materyalden hazırlanan preparatın incelenmesiyle
materyalin uygun alınıp alınmaması hakkında da fikir edinilir. Bol epitel hücresi varlığı materyalin
uygun olmadığını gösterir. Gram boyama kadar etkili olmasa da mikroorganizmaların morfolojisi ve
mikroskop sahasındaki dizilimi göz önüne alınarak hangi besiyerine ekim yapılacağı hakkında bilgi
edinilir.
4. TEMEL BAKTERİ ŞEKİLLERİ
•
•
•
•
Kok: Küresel şekilli hücrelerdir.
Basil (Çubuksu): Çubuk şekilli bakterilerdir. Kırılgan görünümlü silindir şeklinde
hücrelerdir.
Virgül: Virgül şekilli bakterilerdir. Çubuksu bakterilere benzerler ama yarım daire kadar
kıvrılmışlardır.
Spiral: Spiral şekilli bakterilerdir. Çubuksu fakat kıvrımlı ve dönüşleri olan bakterilerdir.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
Bu bakterilerin haricinde farklı veya ara formlarda görülebilir. (coccobacillus, Spirochete) Aynı
zamanda kok bakterilerinin çoğul formları da farklı isimler alabilir. Örneğin ip gibi yan yana dizilen
kok şekilli bakterilere streptokok denirken, kümelenen üzümsü koklara stafilokok adı verilir.
İki tane kok bakterisinin bir arada görülmesi diplokok olarak adlandırılır. Kok şekilli bakterilere örnek
olarak Neisseria ve Branhamella cinslerinin yanı sıra (diplokok), Staphylococcus, Micrococcus,
Streptococcus, Enterecoccus ve Lactobacilluslar verilebilir. Şekilsel olarak farklı kok formlarının
bulunması bölünme planı ile ilişkilendirilmektedir. İki farklı planda bölünen hücreler dörtlü sayıda
tetrad adını alırken, 8’li sayıda sarcinae olarak adlandırılmaktadır.
Çubuksu bakteriler incelendiği zaman, ikili formları diplobacilli, ya da uc uca eklenen tipleri
streptobacilli ya da yan yana gelenleri palisade olarak adlandırılır. Diphteroids, deri ve üst solunum
yolları florasında sıklıkla görülen Corynebacterium ların morfolojik şeklidir. Esasen basit
streptobacilli şeklindedirler ancak bir araya gelerek kümeler meydana getirirler ve palisade tipli
formları meydana getirirler. Virgül ve spiral şekilli bakteriler genellikle tek bulunan hücrelerdir.
Morfolojik farklılıklar genellikle yapmış oldukları kıvrımlardan ötürüdür. Klinik mikrobiyoloji de sık
görülen türlerdendirler.
UYGULAMA
Materyal:
•
•
•
•
•
•
•
Lam
Lamel
Pastör pipeti ,
Öze
İğne
Fizyolojik Serum
Metilen mavisi
Metot:
•
•
•
•
•
•
•
Lamların hazırlanması: Lamı hazırlamadan önce temiz olduklarından emin olun. Temizlemek
için sabun ve su ile bolca yıkayıp toz kalmayacak şekilde silerek kurutabilirsiniz. Etil alkol
sıkıp daha sonra kuruması için beklenen lamlar kullanım için uygundur.
Lamın üzerine cama yazar kalem ile üç tane daire çizin.
Smear hazırlanması: Her bir daire içerisine bir damla bakteri örneği aktarın. Aktardığınız
damlanın küçük olmasına dikkat edin. Eğer yatık agardan örnek alıyorsanız bir damla su veya
serum fizyolojik içerisine örnek aktarılabilir.
Havada örnek kurutulur. Ateşten birkaç kez geçirilen lamın üzerindeki bakteriler cama
sabitlenir.
Örneklerinin boyanması: Boyama için bir tepsi veya kutu kullanılmalıdır. Her bir boya 1 dk
boyunca lamlara uygulanır. Daha sonrasında soğuk su ile yıkanan örnekler havada kurutulur.
Sırasıyla 4x, 10x ve 40x büyütme oranlarında mikroskopta incelenir. Gerekli görülen örnekleri
immersiyon yağı ile 100x’te incelenir.
Sonuçlar rapora kaydedilir.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
DENEY 8 – MİKROBİYOLOJİDE BOYAMA TEKNİKLERİ: GRAM BOYAMA
1. GİRİŞ
Komplex boyama; iki farklı renkteki boyanın aynı preparat üzerinde belli tekniklerle ve art arda
uygulanması ile gerçekleştirilen bir boyama şeklidir. Komplex boyama tekniklerinde, hücreler birinci
boyayla belli bir renge boyanır. Kullanılan bu ilk boyaya primer boya adı verilir. Bu işlemin
fonksiyonu, rengi tüm hücreye dağıtmaktır. Birinci boyamayı takiben preparata genellikle bir renk
giderme (dekolorizasyon) işlemi uygulanmaktadır. Dekolorizasyon işlemini takiben uygulanan
boyalara genel olarak karşıt boya adı verilmektedir. Dekolorize olmuş hücreler karşıt boya ile ilk
boyanın renginden farklı bir renge boyanır.
Boyanmış hücreden boyayı uzaklaştıran etil alkol gibi maddelere renk giderici ajan (dekolorize edici
madde ) denilmektedir. Bazı hücreler diğerlerine göre daha kolay dekolorize olur. Gram boyama ve
diğer komplex boyamalarda bakterilerin birbirinden ayırt edilmesinde dekolorizasyon özelliğinden
yararlanılmaktadır.
Komplex boyamaya; gram boyama yöntemi, spor boyama yöntemleri, flegella boyama yöntemleri,
negatif diferansiyel boyama yöntemi (kapsül boyama), yağ boyama yöntemi gibi yöntemler örnek
gösterilebilir. Bu laboratuar dersinde, gram boyama yöntemi uygulanacaktır.
2. GRAM BOYAMA
Gram boyama, bakterileri hücre duvarlarının kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre iki büyük gruba
(Gram-pozitif, Gram-negatif) ayırmak için kullanılan empirik bir yöntemdir. Bu metodu bulan kişi,
Danimarkalı bilim adamı Hans Christian Gram'dır. Bu metodu, 1884 yılında, pnömokoklar
(Streptococcus pneumoniae) ile Klebsiella pneumoniae bakterilerini ayırt edebilmek için geliştirmiştir.
2.1. Gram Boyamasında Etkili Olan Mekanizmalar
Mikroorganizmaların gram boyamasında, bakteri kültürünün yaşı ve bakteri hücre yapısı ile igili
mekanizmalar etkilidir.
I. Bakteri hücre yapısı
•
•
•
•
•
Gram pozitif bakterilerin hücre çeperinde Gram negatiflere kıyasla oldukça kalın
peptidoglikan tabaka mevcuttur. Bu nedenle, aldıkları boyayı alkolle dekolarizasyonda gram
negatiflere nazaran daha geç bırakırlar.
Gram pozitif bakterilerin hücre çeperinde karbonhidratlar, gram negatiflerde lipidler fazladır.
Karbonhidratlar alkolle dekolarizasyon esnasında dehidratasyona (su molekülü açığa çıkar)
uğrar. Porlar iyice büzüşür , daralır ve boya dışarı çıkamaz. Lipitler için ise alkol çözücüdür ve
hücre çeperinde olan porlar daha çok açılacaktır.
Gram pozitif hücre çeperinde bulunan teikoik asit, bazik boyalarla daha kuvvetli birleşik
oluşmasını sağlar.
Gram pozitif hücre çeperinde bulunan magnezyum ribonucleatın gram boyanmada önemli
fonksiyonları vardır.
Bakteri protoplazmasının pH‘sıda önemlidir. Gram pozitiflerdeki protoplazmanın pH‘sı daha
asidiktir.
II. Bakteri kültürünün yaşı
•
Genel olarak yaşlanmış kültürden elde edilen preparat gramla negatif boyanma eğilimindedir.
Gram boyamada kullanılan değişik boya çözeltileri vardır. Bu boyaların hazırlandığı çözeltiye göre
boyama süresi değişir. (Toz boya distile su içinde hazırlanırsa Kristal Viole ile boyama 1 dakika iken,
amonyum oxalat kullanıldığında kristal viole ile boyamada 30 saniye yeterli olmaktadır.)
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
2.2. Gram Boyama Yönteminin Yararları
•
•
•
•
Mikroorganizmaları gram pozitif ve gram negatif diye iki ana gruba ayırır.
Mikroorganizmaların morfolojisi ve dizilimi esas alınarak ön tanı konur. Buna dayanarak
izolasyon için uygun besiyeri seçimi yapılır.
Örneğin usulüne uygun olup olmadığı hakkında bilgi verir.
Anaerobik mikroorganizma olup olmadığı hakkında bilgi verir. Aeroplarda üreme yok; fakat
mikroskopta polimikrobiyal özellik gözleniyorsa anaerop olduğu anlaşılır.
3. GRAM POZİTİF VE GRAM NEGATİF BAKTERİLER
Hem gram-pozitif bakterilerin hem de gram-neagit bakterilerin S-tabakası denen ayrı bir zarları daha
vardır. Gram-negatiflerde s-katmanı, dış zara yapışıktır. Gram-pozitiflerde ise s-katmanı,
peptidoglikan tabakasına yapışıktır. Gram-pozitiflerin kendilerine has bir özellikleri hücre
duvarlarında teyikoik asit bulundurmalarıdır. Lipoteyikoik asit denen, özel teyikoik asit türünün lipid
kısmı, peptidoglikan tabakasının hücreye ¨demirlenmesine¨ yardımcı olur.
Şekil 1- Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteri hücre yapısının karşılaştırılması.
Gram Pozitifler
Gram-pozitif gram boyama prosedüründen geçtikten sonra, mikroskop altında mavi-siyah, mor renk
alan bakterilerdir. Bu rengin sebebi gram-pozitif bakterilerin hücre duvarlarının kristal viyole/iyot
karışımını tutmasıdır.
•
•
•
•
80 nm hücre duvarı
M protein lipoteikoik asit
Yoğun çapraz bağlar
Çapraz bağlar dekolorizasyona dirençli
Gram-Pozitif bakterilere Actinobakteria Bacillus, Listeria,
Enterococcus, ve Clostridium familyaları örnek verilebilir.
Staphylococcus,
Streptococcus,
Gram Negatifler
Gram-negatif bakteriler, Gram boyama prosedürü sırasında kristal viyole boyasını tutmayan
bakterilerdir. Gram-negatif bakteriler dekolorizasyon işleminden sonra mavi rengi kaybederler ve
ikinci boyanın rengini alarak kırmızı-pembe renge boyanırlar. Gram-negatif bakterilerin pek çoğu
patojendir. Yani, insanlarda hastalık yapma yetisine sahiplerdir. Bu hastalık yapma yetisi, Gramnegatif hücre duvarının bazı özelliklerinden, isim vermek gerekirse LPS (lipopolisakkarit) içeriğinden
kaynaklanmaktadır. LPS'ler endotoksinlerdir.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
•
•
•
•
Hücre duvarı ince
Tek katlı peptidoglikan
Dış membran LPS’leri peptidoglikana bağlanır
Lipid
Gram-Negatif bakteri türleri; Escherichia coli, Salmonella, v.b. Enterobacteriaceae, Pseudomonas,
Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, acetic acid bacteria, Legionella.
UYGULAMA
Materyal:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Lam
Lamel
Öze
İğne
Pasteur Pipeti
İmmersiyon Yağı
Etil Alkol
Gram Boyama Seti
Işık mikroskobu
Metot:
Şekil 2- Gram boyama prosedürünün şematik gösterimi.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir.
Kristal violet (veya metil violet) solusyonu preparat boyanır ve beklenir.
Alkolle dekolorizasyon işlemi yapılır (alkol renksiz akıncaya dek).
Saf su ile yıkanır.
Safranin (veya eosin, sulu fuchsin) ile boyanır ve beklenir.
Saf su ile yıkanarak boya giderilir.
Kurutma kâğıdında (veya havada) kurutulur.
İmmersiyon yağı (Sedir yağı) konarak immersiyon objektifi ile mikroskopta incelenir.
Bu yöntemle mor görülen mikroorganizmalar Gram pozitif ve pembe-kırmızı görülenler de
Gram negatif olarak değerlendirilirler.
Sonuçlar rapora kaydedilir.
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
Şekil 3- Gram (+) ve Gram (-) bakteri hücresinin boyanmasının şematik gösterimi
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
DENEY-9 MİKROSKOPTA MANTAR VE BAKTERİ MORFOLOJİLERİNİN
İNCELENMESİ
DENEY DÜZENEĞİNDE KULLANILAN MALZEMELER
Ekşimiş yoğurt
Lam,Lamel
Mikroskop
Metilen mavisi
İmmersiyon yağı
Damlalık
Diş kiri
Kürdan
Mikroskop
DENEYİN YAPILIŞI
1. Lam üzerine çok küçük bir yoğurt örneği alındı. Ve bir süre bekletildi.
2. Lam mum alevinden birkaç defa geçirildi.
3. Metilen mavisinden birkaç damla üzerine damlatıldı ve birkaç dk bekletildi.
4. Fazla boya musluk suyu ile akıtıldı.
5. Kurutma kağıdı ile lamın etrafı temizlendi. Ve lamel ile üzeri kapatıldı.
6. Hazırlanan preparat mikroskopta incelendi.
7. Aynı preparata immersiyon yağı enjekte edildi ve preparat mikroskopta 100X immersiyon objektifi
ile incelendi.
8. Aynı işlemler diş kirinden alınan örnek için de uygulandı.
9. Aynı işlemler akvaryumdan alınan sucul örnek için de uygulandı
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı
DENEY-10 MİKROSKOPTA ALG VE PROTOZOA MORFOLOJİLERİNİN İNCELENMESİ
DENEY DÜZENEĞİNDE KULLANILAN MALZEMELER
Ekşimiş yoğurt
Lam,Lamel
Mikroskop
Metilen mavisi
İmmersiyon yağı
Damlalık
Diş kiri
Kürdan
Mikroskop
DENEYİN YAPILIŞI
1. Lam üzerine çok küçük bir yoğurt örneği alındı. Ve bir süre bekletildi.
2. Lam mum alevinden birkaç defa geçirildi.
3. Metilen mavisinden birkaç damla üzerine damlatıldı ve birkaç dk bekletildi.
4. Fazla boya musluk suyu ile akıtıldı.
5. Kurutma kağıdı ile lamın etrafı temizlendi. Ve lamel ile üzeri kapatıldı.
6. Hazırlanan preparat mikroskopta incelendi.
7. Aynı preparata immersiyon yağı enjekte edildi ve preparat mikroskopta 100X immersiyon objektifi
ile incelendi.
8. Aynı işlemler diş kirinden alınan örnek için de uygulandı.
9. Aynı işlemler akvaryumdan alınan sucul örnek için de uygulandı
Download

Çevre Mikrobiyolojisi Dersi Laboratuar Deney Föyü