Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MİKROBİYOLOJİ
STANDARTLARI (UMS)
Mikroskop Kalibrasyonu
(Oküler ölçek ile)
Hazırlayan Birim
Klinik Parazitoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Parazitoloji
Bölüm
Test prosedürleri
Standart No
P-TP-01
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
Mikroskop kalibrasyonu
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
GENEL BİLGİ ................................................................... 3
TEKNİK BİLGİLER ............................................................. 4
1
2
3
4
Asgari laboratuvar koşulları ............................................ 4
Mikroskop kalibrasyonunun yapılması .............................. 5
Sonuçların hesaplanması ............................................... 7
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ............................................... 7
EKLER............................................................................. 8
Ek-1 Mikroskop bakımı ve temizliği ..................................... 8
Ek-2 Köhler aydınlatması .................................................. 9
KAYNAKLAR ................................................................... 11
Sayfa 2 / 11
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-01 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Mikroskop kalibrasyonu
Kapsam ve Amaç
Organizmaların tanım ve sınıflandırmasında pek çok kriter kullanılır; bunlardan
biri de ölçü/büyüklüktür. Ölçümler mikroskobun okülerine yerleştirilmiş ölçekli bir
disk (oküler ölçek / oküler mikrometre) ve üzerinde hassas ölçümlerle çizilmiş
cetvel bulunan özel bir lam kullanılarak yapılır.
Parazitolojide (ve genel olarak mikrobiyolojide) tanı koyma işi yapan her
laboratuvarın hassas ölçümler için kalibre edilmiş en az bir mikroskoba sahip
olması ve mikroskoplarını yılda en az bir kez kalibre etmesi önerilmektedir.
Bu UMS'nin amacı mikroskoptaki cisimlerin boyutlarının doğru ölçümü için,
laboratuvarlara, oküler ölçek ve mikrometreli lam kullanılarak mikroskop
kalibrasyonunun nasıl yapılacağına yönelik bir prosedür vermektir.
Genel Bilgi
Parazitler için alınan numunelerin incelenmesinde iyi bir mikroskop ve ışık
kaynağı şarttır. Organizma tanımlamaları morfolojik özelliklerine göre yapılır ve
çoğunda da normal ışık mikroskopları kullanılır (1,2).
Mikroskop kullanırken zaman zaman incelenen numunelerde ölçüm yapılması
gerekebilir. Bu kadar küçük organizmaların boyutlarını ölçmek yani mikroskopla
ölçüm yapmak için okülere yerleştirilen “oküler ölçeği” kullanılmaktadır. Oküler
ölçeği; yuvarlak, ince ve üzerinde birden yüze kadar sayılarla belirlenmiş
bölüntüleri bulunan okülerin içerisindeki sabit halka diyaframına yerleştirilebilen
bir cam ya da plastik bir disktir. Ölçekteki aralıkların ne kadar olduğunu
bulabilmek için kalibrasyon işlemi yapılması amacıyla üzerinde hassas ölçümlerle
çizilmiş bir cetvel bulunan "mikrometreli lam" kullanılır (2,3,4).
Kalibrasyon işlemi, kullanılacak objektife göre yapılmalıdır. Çünkü kalibrasyon
işlemi, oküler ölçeğindeki bir aralığın, o anda kullanılan objektifin büyütme
derecesine göre kaç mikrona karşılık olduğunun bulunmasıdır (4).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-01 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 11
Mikroskop kalibrasyonu
Teknik Bilgiler
1 Asgari laboratuvar koşulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
“Ulusal Laboratuvar Güvenliği Rehberi”nde belirtilen evrensel güvenlik önlemleri
uygulanmalıdır. Mikroskop ile çalışırken elektrik kaynaklı tehlikelere dikkat
edilmelidir.
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS’yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) uygulamadan önce, amaçlanan
kullanım ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) yapılan işe tüm yönleriyle aşina olmalı,
ve (iii) daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
1.3. Örnek, Donanım
Donanım

Mikroskop - 10, 40 ve 100 objektiflere sahip binoküler normal ışık
mikroskobu (diğer objektif büyütme oranları da kullanılabilir) (2).
(a) Stereo mikroskoplar (total büyütme oranı ≤50) veya
(b) Normal ışık mikroskopları (kuru olanlar; düşük, ≤100 ve yüksek
≤400, yağlı olan; 1000)

Oküler 10 - Parazitolojik incelemede 10 oküler kullanılmalıdır.
Bazıları 5 oküler tercih ediyorsa da, 5 oküler daha az büyütme sağlar
ve inceleme duyarlılığını düşürür (2).
NOT: Bir adet 10 oküler laboratuvardaki bütün mikroskopların
kalibrasyonunu yapmak için kullanılabilir (herhangi bir organizma
ölçüleceği zaman kullanılmak üzere).
Diğer gereçler, standart örnek

Oküler ölçek (Oküler mikrometresi) - Yuvarlak ince ve üzerinde birden
yüze kadar sayılarla belirlenmiş bölüntüleri bulunan okülerin
içerisindeki sabit halka diyaframına yerleştirilebilen bir cam veya
plastik ölçek (çizgi 50 üniteye bölünmüş olarak) (herhangi bir
laboratuvar tedarik distribütöründen; Fisher, Baxter, Scientific Products,
VWR, vb. gibi)

Mikrometreli lam (Objektif/Stage mikrometresi), 0.1-0.01 mm bölümlü
(herhangi bir laboratuvar tedarik distribütöründen; Fisher, Baxter,
Scientific Products, VWR, vb. gibi)

Mercek veya lens kağıdı

İmmersiyon yağı

Lateks veya polistren boncuklar veya Giemsa boyalı periferik yayma
Sayfa 4 / 11
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-01 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Mikroskop kalibrasyonu
1.4. Kalite kontrol

Mikroskobunuzu periyodik olarak kalibre edin. Yoğun kullanımda yılda
bir kez önerilir.

Üç büyütmenin (100, 400, 1000) kalibrasyonunda da en sık eritrosit
ölçümü (7.5 µm) kullanılır. Lateks veya polistren boncuklar da
kalibrasyonda kullanılabilir. 10 µm ve 90 µm boncuklar önerilir.

Nihai çarpım katsayısı ancak ve ancak sizin oküler “0” ve mikrometreli
lam “0” çizgisini kesiştirmedeki görsel kabiliyetiniz kadar iyi olacaktır.

Hesaplamalarda aşağıdaki kurallar geçerlidir:
(a) Yüksek büyütmeli kuru objektif (40) katsayısı, yağlı (100)
objektif katsayısının 2.5 katı olmalıdır.
(b) Düşük büyütmeli objektif (10×) katsayısı ise, yağlı objektif (100×)
katsayısının yaklaşık 10 katı olmalıdır.

Tüm hesaplamalar kalite kontrol raporlarına işlenmelidir.
2 Mikroskop kalibrasyonunun yapılması

Oküler ölçeğinizi
hazırlayın.

Mikrometreli lamınızı
hazırlayın.

Okülerin göz lensinin
vidasını çıkarın ve
oküler ölçeğini
(kazınmış/işaretli
kısım aşağıda kalacak
şekilde) okülere
yerleştirin.

Diski tutmak için
birkaç katlı lens
kağıdı kullanın; tüm
yüzeyleri toz ve
pamuk / bezparçalarından
koruyun.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-01 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 11
Mikroskop kalibrasyonu

Kalibre edilmiş
mikrometreli lamı
mikroskobun
tablasına koyun ve
odaklayın. 0.1 ve
0.01 mm dilimlerin
farkını ayırt
edebilmelisiniz.

Tabla üzerindeki
mikrometreli lam ile
oküler ölçekteki “0”
çizgisi objektif
mikrometresindeki
“0” çizgisinin üstüne
tam hizalanacak
şekilde
konumlandırın.

Bu iki “0” çizgisi
hizalandıktan sonra,
objektif
mikrometresini asla
hareket ettirmeyin.
Oküler ölçek
Mikrometreli
lam

“0” çizgilerinin sağını kontrol ederek bir sonraki çizgi çakışmasının
nerede olduğunu bulun; bu çakışma noktası mümkün mertebe “0”
noktasından uzakta olmalıdır (mesafe, kullanılan objektife göre
değişmektedir).

“0” çizgisi ile bulduğunuz ikinci çakışan çizginin olduğu yer arasındaki
oküler ölçekteki dilimlerin sayısını sayın.

Mikrometreli lam üzerindeki “0” çizgisi ile ikinci çakışma noktası
arasındaki 0.1 mm’lik dilimleri sayın.

Tek bir küçük oküler
ölçek ünitesinin
milimetrenin kaçta
birine denk geldiğini
yandaki formüle göre
hesaplayın.
Sayfa 6 / 11
Mikrometreli lamda
okunan (mm)
Oküler ölçeğinde
okunan ünite
x
1000 µm
1 mm
=
oküler ünite
(µm)
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-01 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Mikroskop kalibrasyonu
3 Sonuçların hesaplanması

Bu formül ile her objektif büyütme oranı için bir katsayı (faktör)
hesaplanır (1 oküler ünite = … µm, şeklinde).

Örneğin;
Düşük objektif (10) için:
0.8 mm
1000 µm
x
= 8.0 µm (faktör)
100 Unite
1 mm
Yüksek kuru objektif (40) için:
0.1 mm
50 Unite
x
1000 µm
= 2.0 µm (faktör)
1 mm
İmmersiyon objektifi (100) için:
0.05 mm
62 Unite
x
1000 µm
= 0.8 µm (faktör)
1 mm

Organizmanın boyu ve eni oküler ölçekteki ünite sayısı ile
belirlendikten sonra bakılan objektifin büyütme oranı katsayısı
kullanılarak organizmanın gerçek boyutları hesaplanır. Bu boyutlar
referans ölçümlerle karşılaştırılarak organizmanın tanımlanması
doğrulanmalıdır.

Örneğin; eğer bir helmint yumurtası 40 objektif ile 15 oküler ünite
(boy) ve 7 oküler ünite (en) ölçülmüş ise, o objektif için bulunan faktör
olan 2.0 µm ile çarpılarak boy ve en sırasıyla 30 ve 14 hesaplanır ve
muhtemelen Chlonorchis sinensis olduğu söylenebilir.

Standart bir nesne (lateks veya polistren boncuklar, eritrositler) farklı
objektiflerle ölçülse de, nesnenin boyutları (bakılan objektifin
büyütmesinden bağımsız olarak) aynı veya birbirine çok yakın olmalıdır.

Her objektif için hesaplanan büyütme oranı katsayısı, diğer
kullanıcıların da bilmesi için, mikroskobun tabanına veya yakın bir
duvar/pano gibi bir yere yazılmalıdır.
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Kalibre edilen mikroskop bir bütün olarak düşünülmelidir. Oküler
ölçeğin kullanılacağı her bir objektif için kalibrasyonun ayrı ayrı
yapılması çok önemlidir.

Oküler ölçek içeren okülerler ve/veya objektifler başka bir
mikroskoptaki karşılık gelen objektif veya okülerlerle değiştirilmemeli,
dönüşümlü kullanılmamalıdır.

Mikroskopların bakımı ve temizliği (bkz. Ek-1) ile Köhler aydınlatması
kontrolü (bkz. Ek-2) düzenli olarak yapılmalıdır.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-01 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 11
Mikroskop kalibrasyonu
Ekler
Ek-1 Mikroskop bakımı ve temizliği5
Tozdan koruyun

Mikroskoplar sıcak ve kuru iklimlerde tozdan, nemli iklimlerde ise mantar
üremesinden etkilenirler. Rutin bakım sayesinde her iki durumun yol
açabileceği hasar azaltılabilir. Mikroskobun kullanılmadığı zamanlarda plastik
örtü altında tutulması tozlanmasını önleyecektir. Hava geçirmez bir kutu
içinde, silika jel (kurutucu, nem alıcı) ile birlikte saklanması da mantar
kolonizasyonunu azaltacaktır.

Optik yüzeyler (kondansatör, objektifler, oküler) yumuşak bir deve tüyü
fırçayla ya da hava üfleyici yardımıyla tozdan temizlenmelidir. Okülerin içine
toz girmişse üst merceği çevirerek açın ve yumuşak bir fırça ya da üfleyici ile
iç kısmı temizleyin.
Yağlı bırakmayın

Mikroskop asla objektiflerin üzerinde yağ ile terk edilmemeli; günün sonunda
mercekler mutlaka temizlenmelidir. Merceklerin üzerindeki yağ mercek
temizleme kağıdı ya da tıbbi pamuk ile giderilmelidir. Normal kağıt peçete ve
mendilleri kullanmayın!

Merceklerin temizlenmesinde asla etanol (%70 ve üzeri) ya da ksilen
kullanılmamalıdır. Çünkü bunlar merceğin yapıştırıcı maddesini eritebilir.

Optik parçalar, hazır optik temizlik solüsyonu ya da %40 petrol eteri, %40
etanol ve %20 eter ile temizlenebilir. Ancak bu solüsyon son derece yanıcıdır;
kullanımı sırasında aşırı dikkat gösterilmelidir!

Optik olmayan parçalar hafif deterjan ya da sabunlu su kullanarak
temizlenebilir. Gres ve yağ, petrol eteri ile giderildikten sonra 50/50 distile su
ve etanol karışımı ile temizlenmelidir (optik parçalar hariç).

Merceklerin yüzeyinde ve vida oyuklarının düzenli şekilde kontrol edilip
temizlenmesi mantar kolonizasyonunu önler.

Mekanik parçalar (kaba ayar, ince ayar, kondansatör odaklama, mekanik raf)
makine yağıyla yağlanmalıdır.
Sayfa 8 / 11
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-01 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Mikroskop kalibrasyonu
Ek-2 Köhler aydınlatması6
Genel Bilgi
August Köhler tarafından 1893’te geliştirilmiş optik mikroskopide, açıklık
diyaframının ayarı ne olursa olsun, nesneyi düzgün biçimde aydınlatmaya
yarayan bir sistemdir. Mikroskopta en kaliteli görüntünün elde edilebilmesi için
ışığın düzgün ayarlanması tekniği olan bu işlem kullanıcının mikroskop başına
her oturuşunda yapılmalıdır.
a. Işık kaynağı
b. Açıklık diyaframı
c. Açıklık lensi
d. Kondansatör diyaframı
e. Kondansatör odaklama
f. Şaryo
g. X-Y eksen kontrolü
h. Objektifler
i. Oküler
j. Makro ve mikro ayar
Işık ayarında mikroskobun bazı bölümleri özel
önem arz etmektedir.
Kondansatör, tablanın altında yer alır. Işık
kaynağından gelen ışınları kırarak cisim
üzerinde odaklayan merceklerden oluşur.
Aşağı yukarı hareket ettirilerek ışığın istenilen
yere odaklanması ve ortamın yeterince
aydınlanmasını sağlar. Objektifin büyütme
gücü ile ilişkili olarak ışığın şiddetini ayarlar.
Diyafram, ışık kaynağından gelen ışık
demetinin çapını kontrol etmek için kullanılır.
Işık kaynağının üstüne veya kondansatörün
altına yerleşir. Işık çapı aracılığı ile en iyi
kontrast ve rezolüsyonu elde etmeyi sağlar.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-01 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 9 / 11
Mikroskop kalibrasyonu
Ayarlanabilir bir kondansatör merceği bulunmayan mikroskoplarda ve 1, 5 gibi
düşük büyütmeli lensler kullanıldığında uygulanamaz. Bu durumda kondansatör
diyaframı tam olarak açılır ve aydınlatma, açıklık diyaframı ile yapılır.
Uygulama

Tablaya preparat yerleştirilir. 10 büyütme ile
preparat objektife yaklaştırılır.

Sadece tek bir gözle okülerden bakılarak
makro/mikro vidalarla preparat odaklanır.

Kondansatör (iris) diyaframı tamamen açılır,
açıklık diyaframı tamamen kapatılır.

Tam ortada çok küçük bir ışık halkası
görülmelidir.

Dikey kondansatör ayar vidası ile aşağı yukarı
hareket ettirilerek ışık halkasının mümkün
olduğunca küçük olması sağlanır. Işık halkasının
kenara itilmemesi için çok dikkatli yapılmalıdır.

Açıklık diyaframı, alanın bir kenarına ışık gelene
kadar açılır. Işık mükemmel şekilde merkezde
toplanmışsa alanda tam bir halka şeklinde
görülür.

Işık halkasının merkezi, kondansatörün önündeki
iki küçük vida ile ayarlanır. Yeterli bulduğunuzda
alan genişletilerek ışığın tamamen dolması
sağlanır. Ancak açıklık diyaframı tamamen
açılmaz.

Bu işlem 20 ve 40 objektifle tekrarlanır. 100
ile yapmak zordur.

20×-100× objektifle çalışırken kondansatör
diyaframının ayarlanması çok önemlidir (özellikle
yarı saydam yapılarda). Diyaframın kapatılması
kontrastı artırır.

Okülerlerden biri çıkarılarak tüpün içerisindeki
ışık alanına çıplak gözle bakılır. Kondansatör
diyaframı, alanın 1/4-1/3’ünü kapatacak şekilde
kapatılır. Bu şekilde en iyi kontrast sağlanır.
Kondansatör diyaframının ayarlanmasından önce
ve sonra preparat incelenir.

Bu işlemin her bir objektif için tekrarlanması
önemlidir. Pratikte preparatın incelenmesi
sırasında oküler çıkarılmadan da ayarlama
yapılabilir.
Sayfa 10 / 11
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-01 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Mikroskop kalibrasyonu

Üstte- Diyafram tam açıkken detaylar çok az
seçilmekte.

Ortada- Diyafram tam olarak kapatıldığında
kontrast artmakta, ancak küçük delikler
olduğundan daha geniş görülmekte.

Altta- Diyafram %25-30 oranında kapatıldığında
kontrast artar ve ışık sapması daha az görülür

En iyi görüntü kalitesini elde ettiğinizi
düşündüğünüz kondansatör diyaframında oküler
çıkarılarak ne kadarlık bir alanın kapalı olduğuna
bakılabilir.

Taze kesit preparatlar büyük büyütmeler için kalın
olmakla birlikte kondansatör diyaframının
ayarlanmasında çok yararlıdır.
Kaynaklar
1
Basic Laboratory Methods in Medical Parasitology. Geneva: World Health Organization (WHO),
1991.
2
Garcia LS. Calibration of microscope with an ocular micrometer. In: Garcia LS, Isenberg HD
(eds). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C.
2007, p. 9.3.2.1-4
3
Çulha G, Miman Ö. Mikroskop. In: Korkmaz M, Ok UZ (eds). Parazitolojide Laboratuvar. 1.
baskı. Parazitoloji Derneği Yayınları, 2011.
4
Garcia LS. Equipment, supplies, safety and quality system recommendations for a diagnostic
parasitology. Laboratory: Factors influencing future laboratory practice. In: Garcia LS (ed).
Diagnostic Medical Parasitology. 4th ed., ASM Press, Washington D.C. 2001, p.894-897
5
Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı. Temel Laboratuvar Yönetimi Eğitimi, Modül 5
Ekipman Yönetimi Eğitim Notları (Türkiye’de Bulaşıcı Hastalıkların Epidemiyolojik Sürveyansı ve
Kontrolünün Güçlendirilmesi Projesi; TR 0403.06). 2007
6
http://www.microscopyu.com/tutorials/java/kohler/index.html (son erişim tarihi: 06.01.2014)
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-01 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 11 / 11
Download

Mikroskop kalibrasyonu - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu