+
MİKOLOJİDE MALDI-TOF UYGULAMALARI
Dr. Işın Akyar
Acıbadem Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D.
Acıbadem Labmed Klinik Laboratuvarları
+
*Maya tanımlama çalışmaları
* Küf tanımlama çalışmaları
* Antifungal ilaç direnç çalışmaları
* Sistemlerarası karşılaştırmalar
+

Fungal enfeksiyonlarda artış:

Geniş spektrumlu antibakteriyel ajanların yaygın kullanımı

Yoğun bakım hastalarının uzun süre hastanede kalmaları

Bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerin sayılarının artması
+ Biyokimyasal testler:
+NAT testleri: rRNA genleri veya “internal transcribed
spacer” (ITS) bölgesi gibi hedef bir geni çoğaltıp dizileme
işlemi yapılır.
+
Bazı türler yalnızca DNA dizi incelemesi ile tanımlanabilir.
Multilokus DNA dizi incelemesi - kesin olarak tanımlama
+
Filamentöz yapılı mantarlarda DNA-dizi incelemesi
kısıtlılık gösterir :

i) Küf hücrelerinin erimeleri zor DNA saflaştırma işlemini düşük
düzeyde

ii) PCR inhibitörleri,

iii) DNA dizi veritabanlarında
tanımlanmamış diziler,

iv) Dizi incelemesi için gereken
maliyet ve zaman yetersizliği.
+
“Matrix-assisted laser desorption
ionization–time of flight mass spectrometry”
(MALDI-TOF MS) yöntemi
Kütle spektrumunun proteomik olarak incelemesi
•
Başta ribosomal proteinler olmak üzere
mikroorganizma içeriğini incelemek ve
mikroorganizmanın parmak izi olarak
+anılan bir spektrum oluşturmak
amacıyla kullanılmaktadır.
•
Bir mikroorganizmanın tanımlanması:
Mikroorganizmaya ait spektrumun
spektra referans kütüphanesindeki
karşılığı
+
+
+
MALDI-TOF
Örnek lazer ışınlarını yardımı ile
asidik bir solüsyon olan matriks
içerisinde iyonize olur, daha sonra
cihaz içerisindeki sensöre doğru
buharlaşır.
 Uçuşun süresi iyonize moleküllerin
moleküler ağırlığına bağlıdır.

+
MALDI-TOF yöntemi ile mantar tanımlamaları

Kısa sürede

Güvenilir

Maliyet-etkin
MALDI-TOF mass spectra (m/z 3,000 to 10,000) of Candida albicans (a), Candida glabrata (b),
Candida tropicalis (c) Candida krusei (d), Candida parapsilosis (e), and Cryptococcus
neoformans (f) revealing differences among the species.
Marklein G et al. J. Clin. Microbiol. 2009;47:2912-2917
+ Mikrobiyal tanımlama amaçları için bir referans kütüphane
kurulması için ≈ bir örneğin birçok sayıda çalışılmış bireysel
spektralarını içeren referans kütle spektrası kullanmıştır.
MALDI-TOF MS - geleneksel yöntemlerle karşılaştırmadafarklılıklar- varyasyonları ayrıntılı gösterebilen “internal
transcribed spacer-2” (ITS-2) dizi analizi ile MALDI-TOF incelemesi
doğrulamıştır.
+

Geleneksel maya tanımlama
yöntemleri ile MALDI-TOF MS
arasındaki korelasyon- yüksek
(%100 cins ve %99.2 tür
düzeyinde).

Küflerdeki korelasyon
mayalardaki kadar başarılı
değildir.

İzolatların %68.7’si cins
düzeyinde, ve %40.6’sı ise tür
düzeyinde korelasyon
göstermiştir.
+
Maya tanımlama çalışmaları
+ Maya türlerinde MALDI-TOF yöntemi ile
yapılan tanımlama çalışmalar:

Candida türleri hastane ile ilişkili dolaşım yolu
enfeksiyonlarının 4. en sık nedenidir.

Candida albicans bu enfeksiyonların yarısından fazlasını
oluşturmaktadır.

C. albicans dışı Candida, Rhodotorula, Trichosporon ve
Malassezia türlerinini sayılarında artış saptanmaktadır.

Cryptococcus neoformans da HIV ile enfekte hastaların
mantarla ilişkili en sık ölüm nedenidir.
+
Gelişmeler: Saflaştırma yöntemleri, skor eşiklerinin
değiştirilmesi, referans kütüphanelerinin genişletilmesi,
antifungal duyarlılık testlerinin yapılabilirliğinin araştırılması
+
MALDI-TOF’da maya kolonilerinin incelenmesinde
kullanılan saflaştırma yöntemleri (tüp, plak)
+
Kan kültürlerinde doğrudan
inceleme
+
+ Sepsityper ile identifikasyon 5.15$, kısaltılmış yöntemler ile
birlikte MALDI-TOF identifikasyonu 0.5 $.
+ Doğrudan kan kültürü şişesinden çalışma: kısa sürede, güvenilir
sonuç
+
+ 48 ve 72 saatlik inkübasyon sonrası MALDI-TOF’da tanımlama
+
+ Fenotipik tanımlama yöntemi ile karşılaştırma: %93.6
uyumlu
+ Nadir bir türün hızlı tanımlanması
+ Birbirine yakın türlerin ayırımı
+

MALDI-TOF MS -12 farklı türde maya -%85 oranında doğru
tanımlama

10-40 dakika (hızlı)

Birbirine çok yakın olan türlerde ayırım başarılabilmiştir:

Candida albicans / C. dubliniensis

C. guilliermondii/C. kefyr

C. metapsilosis/C. orthopsilosis/C. parapsilosis
+
Doğru tanımlama
Doğru ilaç direnç profili
+ITS-dizi analizi ile MALDI-TOF uyumu
+

Artrokonidiyal maya tanımlamalarında -%98 başarılı

Suşların çoğu iyi skor ile (>2) okunmuştur.

Genişletilmiş veritabanı -tanımlama oranı %100
+
Küf tanımlama çalışmaları
+
*


Kolonilerin mantar
besiyerlerinde
makroskopik/mikroskopik
incelenmesi
**

Maldi tof

küf örneklerinde

fenotipik yöntemlerle

tanımlanması güç olan
örneklerin

daha kolay ve kesin
tanımlanmasını sağlayabilir.
Çok deneyimli mikolog

Yavaş ve kompleks bir işleyiş

Deneyimli referans
laboratuvarlarında bile yanlış
tanımlamalar olabilmektedir.
+
Küf türlerinde MALDI-TOF yöntemi
ile yapılan tanımlama çalışmalar:

T. rubrum –Trichophyton- bazı
türlerde MALDI-TOF MS tüm
izolatları tür düzeyinde
tanımlayabilir.

T. tonsurans- türlerin protein
profilleri çok zayıf olarak
saptanabilir-tanımlama çok düşük
skorlar gösterir- cins düzeyinde
bile güvenilir sonuçlar elde
edilmesini engelleyebilir.
+

Heterojenite

Daha geniş veritabanları içeren
sistemler

Daha etkin saflaştırma yöntemleri

Tanımlama skoru 1.7’nin
üzerinde ise tanımlama doğru !!!
+
+ MALDI-TOF MS avantajı

Plak üzerinde görünür hale
gelen koloniler yeterli/Diğer
yöntemler yapısal
karakteristiklere ulaşmış olgun
koloniler gerektiriyor

Fusarium türleri, dermatofitler
-filamentöz mantar
tanımlamalarında

Aspergillus ve
Pseudallescheria/Scedosporiu
m

Endüstri alanında -Penicillium,
Verticillium ve Trichoderma
+ Etkili bir RMS kütüphanesi = Güçlü veritabanı

Tekrar çalışmalarının=
referans meta spektrum (RMS)
oluşturmak için bir kültürden
elde edilip incelenen
spotların;

Kütüphaneyi oluşturmak için
kullanılan bir türün farklı suş
sayılarının yüksek olması ile
tanımlama üzerindeki olumlu
etkileri olduğu gözlenmiştir.

Standardizasyon
Antifungal ilaç direnç
+
çalışmaları
+ Bilinen antifungal ilaç direnç profillerine örnekler…..

Fluconazole dirençli: Candida
glabrata, Candida krusei,
Rhodotorula spp., ve bazı
Trichosporon türleri

Voriconazole doğal dirençli:
Rhodotorula türleri

Echinocandin intrinsik dirençli:
Trichosporon, Cryptococcus, ve
Rhodotorula
+

Şu anda geçerli olan CLSI ve EUCAST rehberi “sıvı
mikrodilüsyon yöntemi (BMD)” kullanımını önermektedir.

Sonuçlar mantar üremelerinin gözlenmesine dayandığı için
subjektif

Sonuçlanma en az 24-72 saate gereksinim gösterebilir.
+
Azol ve ekinokandin
direnci
+ Azol ve ekinokandin direnci

Flukonazolun da içinde bulunduğu azol sınıfı ilaçlara direnç :
Hedef (11 ergosterol biyosentezi [ERG11]) değişikliği ya da
efflux pompa mekanizması ile gerçekleşmektedir.

Genel olarak çoklu ilaca direnç-MDR pompa
ekspresyonunda bir artış flukonazol direncine özgü olarak
saptanmaktadır.

Benzer şekilde ekinokandinlere direnç de bu sınıf ilaçların
hedefi olan 1,3 D-glukan sentazı kodlayan genlerdeki
mutasyonlarla gelişmektedir.
+ MALDI-TOF MS

Proteinlerin spektral profillerinin incelenmesi- belirli
proteinlerin ekspresyonundaki farklılıklar saptanabilir.

Bu farklılık dramatik olmalı, veya protein modifikasyonu
durumunda, protein çok fazla olmalı ve her bir hücrede
eksprese edilen “arkaplan” proteinlerinden ayırt
edilebilmelidir!!!!!!
+
Caspofungin direnci
Caspofungin duyarlılığı
CLSI sıvı mikrodilüsyon
yöntemi ile %94.1 uyumlu
MALDI-TOF MS kullanımı
alternatif olabilir.
+ Kaspofunginin artan konsantrasyonlarına karşı gelişen yanıtta MALDITOF MS ‘in C. albicans, C. glabrata, C. krusei, and C. parapsilosis protein
profillerindeki farklılıkları saptamaktaki başarısı değerlendirilmiştir.
+
Composite Correlation Index (CCI)- Bileşik Bağıntı Göstergesi
MALDI-TOF MS bazlı antifungal duyarlılık testi

Klinik olarak anlamlı Candida ve Aspergillus türlerinin
Caspofungin’e duyarlılığını saptamak için geliştirilmiş.

Güvenilir ve kesin bir şekilde en küçük bir profil değişikliğini
(MPCC) saptayabilen bir yöntem: Klasik MİK değerine
alternatif bir uç değer saptanabilmesini sağlar.

Caspofungin’in seri dilüsyon konsantrasyonları ile 15 saat
inkübe edilmiş fungal hücrelerden çalışılır. (CLSI ve EUCAST
yöntemleri 24 st.)
+ MALDI-TOF MS bazlı antifungal duyarlılık testi (ms-AFST)

15 st  3 st ??

Echinocandin target FKS1 genindeki “hot spot mutasyonlar”ın
varlığı/yokluğunu saptanması

Caspofungin duyarlı/ dirençli Candida albicans türlerini (3 st)
saptayabilmek

ms-AFST : “breakpoint” ilaç konsantrasyon modifikasyonu ile
gerçekleştirilebilir.
+ MALDI-TOF MS bazlı antifungal duyarlılık testi (ms-AFST)

Ms-AFST fks mutasyonu olan ve/veya fungal hücre glukan
kaybına yol açan 1,3 β-D- glukan sentaz enzim kompleksinin
echinocandin duyarlılığının modifikasyonunu doğru bir
şekilde tanımlayabilmektedir.

Fungal hücrelerin maruz kaldığı caspofungin’in indüksiyonu
ile protein bileşimindeki belirgin değişiklikler
saptanabilmektedir.
+ MALDI- TOF MS bazlı antifungal duyarlılık testleri
Avantaj

Antifungal duyarlılık testleri için
güvenilir, tekrarlanabilir ve
geliştirilebilir bir yöntemdir.

Standart protokollere göre
ortalama 1.45 gün daha erken
tanımlama sağlamaktadır (P <
0.001).

Ticari CLSI- veya EUCAST zeminli
yöntemlere göre
mikroorganizmaların
tanımlanmaları için maliyetetkindir.
Dezavantaj

Bu yöntemin etkinlik ve
tekrarlanabilirliğini
değerlendirebilmek için çok
fazla örneği ve farklı maya
türleri ile değişik antifungalleri
de içeren ek çalışmalar
yapılmalıdır.
+
Sistemlerarası karşılaştırmalar
+ %89, %84
Genişletilmiş veritabanı kullanımı ile %100 doğru
tanımlama
+ Biflex III- Biotyper / Axima Saramis
Hatalı tanımlama oranı (skor 1.7):%0.6 (Biflex), %1.3 (Saramis)
+
*Sonuç olarak:
MALDI-TOF MS
*Maya tanımlama çalışmaları
* Küf tanımlama çalışmaları
*Antifungal ilaç direnç
çalışmaları’nda
güçlü bir alternatiftir.
+
Teşekkürler
Download

Işın AKYAR