Adnan Menderes Üniversitesi
Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü
TBY 118
Muavviz Ayvaz
(Yrd. Doç. Dr.)
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü
Laboratuvar
Tekniği
14. Hafta (16.05.2014)
1
14. Haftanın Ders İçeriği
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
• PCR (Polymerase Chain Reactions) yada
(Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)
2
PCR
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
• DNA’nın çoğaltılması tekniği Kary Mullis adlı bir
Amerikalı bir biyokimyacı tarafından geliştirilerek
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) adı verilmiştir.
• Araştırmacı ‘Polimeraz Zincir
Tepkimesini’ keşfinden ötürü
1993 yılında Michael Smith ile
birlikte Nobel Kimya Ödülüne
layık görülmüştür.
Kary Mullis
3
PCR’ın Kullanıldığı Alanlar
• Moleküler biyoloji ve biomedikal araştırmalarda,
• Bakteriyel, viral, fungal ve protozoal hastalık
etkenlerinin teşhis edilmesi,
• Gıda, su ve yiyeceklerde bulunan mikroorganizmaların tanılanmasında,
• Genetik bozukluklar ve kanser taramalarında,
cinsiyet belirlenmesinde,
• Gen tedavisi ve DNA aşılarında,
• Adli tıp’da suçlu teşhisi
• Antropoloji
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
PCR’nin geliştirilmesi, moleküler biyoteknolojinin
ve kullanım alanının da genişlemesine yol açmıştır.
4
PCR için iki önemli gelişme
• Bilgisayar kontrollü termal döngü cihazlarının
geliştirilmesi
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
• Termofilik Thermus aquaticus ‘tan ısıya stabil
DNA polimeraz eldesi
5
PCR için gerekli malzemeler
• Kalıp DNA çift iplikleri ile eşleşebilen primerler
• Dört farklı çeşit dNTP (dATP,dCTP,dGTP,dTTP)
• Termostabil DNA polimeraz enzimi (Taq, Vent)
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
• Hedef diziyi taşıyan kalıp DNA
6
PCR
• Kalıp DNA, Primerler, dNTP’ler ve Polimeraz
Reaksiyon için MgCl2 gereklidir.
• Reaksiyonda DNA’nın
çoğaltılması (amplifikasyonu) ‘Thermal Cycler’
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
enzimi bir tampon çözeltisi içinde karıştırılır.
adı verilen özel bir cihaz yardımıyla
gerçekleştirilir.
7
PCR
• Reaksiyonda DNA’nın çoğaltılması ‘Thermal
cihaz yardımıyla (amplifikasyonu) gerçekleştirilir.
• Thermal Cycler cihazı; DNA’nın çoğaltılması için
gerekli reaksiyon ortamını gerekli
ısı derecelerinde ve istenilen
sürelerde tutmaya yarar.
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
Cycler / Termal Döngü Cihazı’ adı verilen özel bir
8
PCR döngüsü üç aşamada gerçekleşir
1- Hedef DNA’nın denatürasyonu
(95 oC de 5 dak.)
2- Primerlerin bağlanması (42-52 oC de 5 dak.)
örnek 1-2dk bu ısıda tutularak primerlerin (spesifik
sentetik oligonükleotitler) DNA’ daki hedef bölgelere
hibridizasyonu sağlanır.
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
DNA’ nın birkaç saniyede ısı ile ayrılmasıdır.
(döngüye başlamadan 3-5 dk ön ısıtma yapılabilir)
3- Polimerizasyon (65-72 oC de 5 dak.)
Polimeraz enzimi yardımı ile DNA kalıplarına bağlanan
primerlerin 5’ 3’ yönde uzatılmasıdır.
9
PCR döngüsü
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
DNA
3’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
>90°
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
• Hedef DNA’nın denatürasyonu
10
PCR döngüsü
• Primerlerin bağlanması
3’
40–60°
3’
5’
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
5’
11
PCR döngüsü
• Polimerizasyon
3’
72°
3’
5’
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
5’
12
PCR döngüsü
3’
3’
3’
>90°
40–60°
72°
3’
3’
3’
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
5’
5’
5’
5’
5’
5’
13
PCR döngüsü
3’
>90°
40–60°
72°
3’
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
5’
5’
14
>90°
40–60°
72°
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
PCR döngüsü
15
2n x
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
PCR döngüsü
16
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
3 basamağın gösterimi
17
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
3 basamağın gösterimi
18
2n x
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
DNA’nın çoğalması
19
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
Never Stop Thinking !
20
Download

PCR döngüsü - Adnan Menderes Üniversitesi