Bio. Sevil ÜNAL
Acıbadem Maslak Hastanesi
Tüp Bebek Laboratuvarı
Rutin semen analizi erkek infertilitesinin
tanımlanmasında sınırlı diagnostik
değere sahiptir ve ART başarısı için
prediktif değildir.
Reviewed by Lewis, 2005 ; Lefievre et al, 2005
in Reproduction; in Top 10 downloaded reviews by
2008 ( ~ x3000)
Sperm DNA Fragmantasyon Testleri
 Acridine Orange (Darzynkiew et al,1975)
 SCSA (Evenson et al,1980)
 Aniline Blue, Toluidine Blue
 TUNEL (Gorczyca et al,1993)
 Chromomycin A3 (Manicardi et al,1995)
 Comet assay (Hughes et al,1996)
 DBD-FISH (Fernandez et al,1998)
 SCD (Fernandez et al,2003)
 Halosperm (Fernandez et al,2005)
Konvansiyonel IVF de artan
DNA hasarı ile döllenme oranı
düşmektedir.
ICSI de ise bu ilişki
gözlenmemektedir.
IVF ve ICSI de artan DNA hasarı
ile embriyo kalitesi arasında bir
ilişki kurulamamıştır.
ICSI’de gebe kalamayan hastaların
oranı, artan DNA hasarı ile anlamlı
olarak yükselmektedir. IVF sonuçlarında
bu ilişki kurulamamıştır. ICSI
sonucunda atlanan doğal döllenme
sürecindeki olayların gebelikte ne kadar
önemli olduğuna işaret etmektedir.
Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin, impact on reproductive
outcome, and analysis
Denny Sakkas,,Juan G. Alvarez
Fertility and Sterility Vol. 93, Issue 4, 1 March 2010, Pages 1027–1036
 Güncel meta-analizler sonucunda, DNA hasarlı
spermlerin IVF ve ICSI sonrası gebelik kayıpları ile de
ilişkili olduğu sonucuna varılmıştır.
 Vurgulanması gereken en önemli nokta:
 Tüp bebek tedavisi gereken hastaların spermlerinde
daha yüksek DNA hasarı bulunma ihtimali yüksektir.
 ICSI işlemleri sırasında, doğal seleksiyon ve sperm
yarışının atlandığı düşünülürse tedavide kullanılacak
hasarlı spermin izole edilmesi veya uzaklaştırılması ve
uygun kalitede sperm seçimi daha da önemli hale
gelmektedir.
SPERM SEÇİM YÖNTEMLERİ
 Spermatogenez süreci ejekülatta yüksek oranda
abnormalite gösteren spermlerin bulunmasına
sebep olmaktadır.
 Bu anomalilere, nuklear ve kromozomal
bozukluklara ek olarak membran, mitokondriyel
sentriyolar bozukluklar da gösterilebilir.
 Bu anomalileri elimine edebilmiş spermatozoa
nasıl seçilebilir?
Sperm hazırlık yöntemleri
Effects of semen storage and separation techniques on
sperm DNA fragmentation
Jackson et al., 2010
İleri sperm seçim yöntemleri
 IMSI
Bartoov et al, 2003, Berkovitz et al, 2005; Hazout et al, 2006, Mauri et al,
2010
 MSOME
Bartoov et al, 2002
 Birefringence
Gianaroli, Magli et al, 2010
 HBA/PICSI/ SpermSlow
Huszar et al, 2007; Nasr-Esfahani et al, 2008; Parmegiani et al. 2010 and b
IVF
Doğal fizyolojiye en yakın in vitro fertilizasyon
yöntemidir. Spermler ve yumurta aynı kültür ortamında
inkübe edilerek döllenme elde edilir.
IMSI
(Intra-cytoplasmic Morphologicallyselected Sperm Injection )
 Yüksek büyütme (6600 x) gücüne
sahip Nomarski modulasyonu ve dijital
görüntüleme sistemi ile desteklenmiş
bir invert mikroskop yardımıyla sperm
seçimi yapılması yöntemidir.
MSOME
 (Motile Sperm Organelle Morphology
Examination) kriterlerine göre sperm
değerlendirilmesi yapılmalıdır.
• Toplam Büyütme Oranı=6600X
19” LCD monitor
DIC condenser
DIC slit
Hot plate
Cam dish
3X objective
Magnifier
DIC polarizer
Camera
– 100x objektif
– Ara büyütme lensi 1.0x, 1.5x, 2.0x
– Video kamera adaptör büyütmesi 0.99x
– 8 mm Diyagonal boyutlu CCD çip ve 355.6 mm diyagonal boyutlu Monitör
– (100 X 1.5 X0.99)x(350/8) = 6600
Büyütme
IMSI
• MSOME yönteminde sperme ait 6 farklı hücre
organeli incelenmektedir.
– Akrozom
– Postakrozomal lamina
– Boyun
– Mitokondri
– Kuyruk
– Çekirdek; ICSI sonucunu etkileyen en
önemli organeldir.
Bartoov et al.,2002
IMSI
 MSOME morfoloji Kriterlerine
Göre normal baş morfolojisi;
 Pürüzsüz
 Simetrik
 Oval şekilde (3-3.5 µm en , 4-4.5
µm boy)
 Çekirdek kromatin kütlesinin
homojen olması (en fazla 1
vakuol ve çekirdeğin %4 den
daha az alan kaplaması)
IMSI
4 step sperm morphology grading system
for IMSI according to
• Head morphology
• Existence or absence of nuclear vacuoles
• No neck,mid-piece and tail abnormalities
Vanderzwalmen et al., 2008
IMSI
Grade I: Normal form and no
vacuoles
Grade II: Normal form and ≤ 2
small vacuoles
SV
%61.4 blastokist
%56.3 blastokist
SV
IMSI
Grade III: Normal form, >2 small
vacuoles or at least one large
vacuole
LV
Grade IV: large vacuole and
abnormal head shapes or other
abnormalities
LV
%0 blastokist
SVs
LV
SVs
%5.1 blastokist
ŞİDDETLİ SPERM MORFOLOJİK DEFEKTLERİNDE IMSI İLE
SPERM SEÇİMİ
Triploidy
TUNEL
Round head
Megalo head
Elongated head
ŞİDDETLİ SPERM MORFOLOJİK DEFEKTLERİNDE IMSI İLE
SPERM SEÇİMİ
İMMATÜR
Tail-stump
Sitoplazmik droplet
IMSI Sonuçlar
 MSOME kriterlerine göre sperm seçiminde ICSI
vakalarında hem fertilizasyon hem de gebelikle doğru
orantılı ilişki gösterilmiştir. (Bartoov, 2002)
 Daha iyi mitokondriyel fonksiyon, düzgün kromatin
yapısı, düşük anöploidi oranı (Garolla et al, 2008)
 3.gün embriyo gelişiminde fark yok fakat blastosiste gidiş
Grade I-II spermler için anlamlı olarak farklı
(Vanderzwalmen, 2008 )
 Embriyo kalitesi ve gebelik sonuçlarındaki iyileşmeye ek
olarak, düşük oranlarını da anlamlı olarak azaltır (Sakkas,
2013)
 IMSI özellikle ŞOAT vakaları mutlaka tercih edilmesi
gereken bir yöntemdir.
ÇİFT KIRILIM
(BIREFRINGENCE)
Sperm post akrozomal bölgesinin, akrozom
yapısındaki değişimlere (akrozom reaksiyonu)
bağlı olarak polarize ışığı kırma özelliğinin
değişmesi esasına dayanmaktadır.
Sperm Çift Kırılım Analizi
 Polarize mikroskopi kullanılarak ICSI için
sperm seçimi ilk olarak Baccetti (2004)
tarafından öne sürülmüştür.
 Spermin protoplasmik yapısında
kaynaklanan çift kırılma özelliğine
dayanmaktadır.
 Bu çift kırılmanın sperm başında sadece
post-akrozomal bölgede gözlemlenmesi
akrozomal reaksiyonun gerçekleştiğini
göstermektedir.
Sperm Çift Kırılım Analizi-Sonuç
 Gianarolli ve ark. (2009) yaptığı çalışmada çift
kırılım özelliğine göre seçilmiş spermlerle yapılan
ICSI sonucunda ŞOAT ve azospermi olgularında
klinik gebelik oranlarının yaklaşık olarak iki katına
çıktığını göstermişlerdir.
 Aynı grubun daha yüksek hasta sayısı ile yaptığı
yeni çalışmada (2010) yumurta toplama başına
canlı doğum oranının çift kırılım grubunda kontrol
grubuna göre 5 kat artığı gösterilmiştir
HYALURONIC ACID
BINDING
ASSAY(HBA)
Fizyolojik olarak fertilizasyonun gerçekleşebilmesi için
spermin, oositi çevreleyen, hyaluronik asit içeren zona
pellusida’ya bağlanabilme özelliği göstermesi
gerekmektedir.
HBA bu fizyolojik yolu modelleme esasına dayanır.
Hyaluronik asite bağlanan spermler düşük DNA
fragmantasyonu ve kromozomal anöploidi gösterirken iyi
morfolojik yapıya sahip olduğu gözlenmiştir.
HBA
 Hyaluronan Özellikleri
 Glycosaminoglycan
 Kümülüs-oophorous kompleksde bulunur
 Olgun Sperm zarının dış yüzeyinde bulunan reseptörlerle
bağlanır.
HBA-PICSI(Physiological ICSI)
Yıkanmış sperm Petri dish
üzerinde bulunan solid HA
bölgesine yerleştirilir.
Oda ısısında 10
dk inkübasyon
Bağlanan spermler ICSI pipetiyle
toplanır
PICSI
HA-BINDING REVIEW
HA-BINDING SONUÇ
 Hyaluronik asite bağlanan spermler düşük DNA
fragmantasyonu ve kromozomal anöploidi gösterirken
iyi morfolojik yapıya sahip olduğu gözlenmiştir.
 Fertilizasyon oranı ve embriyo kalitesini pozitif
etkilediği gösterilmiştir.
Sperm özelliklerine göre ICSI için sperm seçim
yöntemlerinin değerlendirilmesi
Normal
Oligo
Asteno
Terato
Yüksek DNA
hasarı
Yüksek
ROS
Yorum
Sperm örneği hazırlık yöntemleri
Swim-up
+
Density
gradient
+
Testiküler
biyopsi
++
+
+
+
+
+
Density gradient swim-up’a tercih
edilebilir
+
+
++
++
Yüksek DNA hasarı tanımlanmış
vakalarda faydalı olduğu gösterilmiştir
++
++
Blastosiste gidişte, gebelik ve
implantasyon oranında artış
Sperm seçim yöntemleri
IMSI
++
++
Brifringence
++
+
HBA/PICSI
++
++
++
ŞOAT ve azospermi vakalarında klinik
gebelik oranlarında artış
+
++
++
+
Sperm sayısı ve motilitesi düşük olan
vakalarda efektif değil
Deneysel
prosedürler
Sperm RNA analizi / DNA metilasyonu / Proteomik analiz
Yeterli klinik çalışma yoktur
Sonuç:
 Bu sunumda bahsedilen uygulamalar, özellikle ICSI
yönteminin yoğunlukla kullanımı nedeniyle ortaya
çıkabilecek olumsuz etkileri elimine etmeye yönelik
tanımlanmış ve pratikte kullanımı olan uygulamalardır.
 Bu metodların bazıları yaygın kullanılabilmekle birlikte,
bazıları sadece belirli hasta gruplarında tercih edilmelidir.
Metod seçiminin bu doğrultuda yapılması halinde ART
sonuçlarında genel bir iyileşme sağlamaktadır.
TEŞEKKÜRLER...
Prof.Dr.M.BÜLENT TIRAŞ
Dr. AYŞE SALTIK
Dr.EVİS ERTAŞ
Msc.DERYA ATICI
Phd.CİHAN HALICIGİL
Bsc.SEVİL ÜNAL
Bsc. MELDA ATAY
Msc.İDİL BOZKURT
Bsc.BARIŞHAN ARZUL
TEŞEKKÜRLER
Download

Sevil Ünal