NADÁCIA VÝSKUM RAKOVINY
A ÚSTAV EXPERIMENTÁLNEJ
N
ONKOLÓGIE SAV BRATISLAVA
SÚŤAŽ MLADÝCH
ONKOLÓGOV
2014
ZBORNÍK PREDNÁŠOK
NADÁCIA VÝSKUM RAKOVINY
ÚSTAV EXPERIMENTÁLNEJ ONKOLÓGIE SAV
VLÁRSKA 7, 833 91 BRATISLAVA
6. - 7. MAREC 2014
1
®
SÚŤAŽ MLADÝCH ONKOLÓGOV
pri príležitosti 8. Dňa výskumu rakoviny
Zborník prednášok
6.-7. marec 2014
Nadácia Výskum rakoviny
Ústav experimentálnej onkológie SAV
Vlárska 7, 833 91 Bratislava
2
Zborník tvoria rozšírené abstrakty a abstrakty prác prezentovaných na Súťaži mladých
onkológov 2014. Súťaž organizovala Nadácia Výskum rakoviny v spolupráci s Ústavom
experimentálnej onkológie SAV pri príležitosti 8. Dňa výskumu rakoviny.
Názov:
Zborník prednášok zo Súťaže mladých onkológov
Autori:
Adamkov Marian, Agrawal Khushboo, Balhárek Tomáš, Baranovičová
Lenka, Bártek Jiří, Bárthová Martina, Belobradová Júlia, Benčat Marián,
Benej Martin, Blahovcová Eva, Brahmkshatriya Pathik S, Buliaková
Barbora, Burjanivová Tatiana, Chrenka Bronislav, Chromá Katarína, Chudý
Peter, Chudej Juraj, Csaderová Lucia, Čulka Ľubomír, Danko Ján, Das
Viswanath, Debreová Michaela, Dobrota Dušan, Drahošová Slávka,
Ďurčanská Paulína, Džubák Petr, Fanfrlík Jindřich, Farkašová Anna,
Fedoročko Peter, Frydrych Ivo, Furjelová Martina, Gábelová Alena,
Golierová Lucia, Hajdúch Marián, Hatok Jozef, Hederová Stanislava,
Hiľovská Lucia, Hobza Pavel, Holub Dušan, Holubeková Veronika,
Horváthová Eva, Hudecová Patrícia, Janáková Ľuboslava, Janasová Alžbeta,
Jendželovaká Zuzana, Jendželovský Rastislav, Jurková Katarína, Kajo
Karol, Kapinová Andrea, Kapustová Ivana, Kliková Katarína, Klusová
Veronika, Kopáček Juraj, Kovaľ Ján, Kovalská Mária, Kozics Katarína,
Kramara Juraj, Krečmerová Marcela, Kubatka Peter, Kučerová Lucia,
Kuchárová Barbora, Kúdela Erik, Kuliková Lucia, Kusznierewicz Barbara,
Kviatkovská Zuzana, Lasabová Zora, Lepšík Martin, Lisalová Magdaléna,
Makohusová Miroslava, Matúšková Miroslava, Mendelová Andrea,
Mesárošová Monika, Mešťanová Veronika, Mikeš Jaromír, Mikešová Lucia,
Mistrík Martin, Mojžiš Ján, Moudrý Pavel, Mučaji Pavel, Murín Radovan,
Otmar Miroslav, Pastorek Jaromír, Pastorek Michal, Pastoreková Silvia, Péč
Martin, Perďochová Ľubica, Pilchová Ivana, Pitoňák Michal, Plank Lukáš,
Pleško Marek, Přenosil Ondřej, Proroková Eva, Račay Peter, Radvák Peter,
Radvánszka Monika, Rázga Filip, Repič Marko, Řezáč Jan, Sačková
Veronika, Scaloni Andrea, Sedlačková Eva, Sejnová Daniela, Šelc Michal,
Škovierová Henrieta, Srančíková Annamária, Štefaniková Andrea, Švastová
Eliška, Švecová Iveta, Takáčová Martina, Tomáščová Katarína, Tomková
Kristína, Valicová Lucia, Vargová Jana,Vidličková Ivana, Virdzeková
Gabriela, Vitale Monica, Vnuková Dominika, Vojta Petr, Vreštiaková
Magdaléna, Vulič Radivojka, Výbohová Desanka, Zambrano Nicola,
Zaťovičová Miriam, Zelko Aurel, Zemančíková Katarína, Žúbor Pavol.
Vydavateľ:
Nadácia Výskum rakoviny
Vlárska 7
833 91 Bratislava
www.nvr.sk
Zostavili:
RNDr.Soňa Čierniková, PhD., Ing.Roman Bohovič,
RNDr.Margita Klobušická, CSc., Mgr. Veronika Zahradníková
Recenzenti: RNDr. Soňa Čierniková, PhD., Ing. Roman Bohovič,
RNDr. Ján Sedlák, DrSc., Ing. Jela Brozmanová, DrSc.
3
Tlač:
Tribun EU, s.r.o.
Cejl 892/32
602 00 Brno
Česká republika
www.librix.eu
©
Nadácia Výskum rakoviny a Ústav experimentálnej onkológie SAV
Bratislava 2014
ISBN
978 -80 -971621-0-8
4
Obsah
Príhovor
1
7. marec – Deň výskumu rakoviny
2
RNDr. Margita Klobušická, CSc., prezidentka Nadácie Výskum rakoviny
Víťazi jednotlivých kategórií
3
Členovia hodnotiacich komisií
4
Kategória Študent strednej školy
Vplyv životosprávy na vznik rakoviny
Gabriela Virdzeková
Gymnázium, Hlinská 29, 011 80 Žilina
6
Nárast výskytu ochorenia rakoviny prsníka u žien
Paulína Ďurčanská
Gymnázium Hlinská 29, 011 80 Žilina
10
Rakovina prsníka – prevencia a osveta
Katarína Zemančíková, Kristína Tomková
ESŠ – Evanjelické gymnázium J. Tranovského, Komenského 10, Liptovský
Mikuláš 031 01
14
Cancer and mesenchymal stem cells
Patrícia Hudecová1, Lucia Valicová1
Supervisor Svetlana Školeková2
1
Private Grammar School, Oravská 11, 010 01 Žilina;2Laboratory of
Molecular Oncology, Cancer Research Institute of Slovak Academy of
Sciences, Vlárska 7, 833 91 Bratislava
17
Stem Cells and Cancer Treatment
Júlia Belobradová1, Katarína Tomašcová1, Lucia Golierová1
Supervisor Erika Ďuriníková2
1
Private Grammar School, Oravská 11, 010 01 Žilina;2Laboratory of
Molecular Oncology, Cancer Research Institute of Slovak Academy of
Sciences, Vlárska 7, 833 91 Bratislava
22
Rakovina pažeráka a žalúdka v dnešnej dobe
Alžbeta Janasová
Gymnázium, Hlinská 29, 011 80 Žilina
26
5
Kategória Mladý výskumník do 35 rokov s ukončeným PhD.
štúdiom
Nesteroidné antiflogistiká ako látky modulujúce účinnosť vybraných 31
terapeutických prístupov v liečbe nádorových ochorení. Dokážu pomôcť
alebo nie?
Rastislav Jendželovský, Zuzana Jendželovská, Lucia Hiľovská, Ján Kovaľ,
Jaromír Mikeš, Peter Fedoročko
Univerzita Pavla Jozefa Šafárika v Košiciach, Prírodovedecká fakulta, Ústav
biologických a ekologických vied, Moyzesova 11, 040 01 Košice
Nový potenciálny mechanizmus protinádorovej imunitnej odpovede 35
vyvolaný fotodynamickou terapiou
Lucia Kuliková1,2, Veronika Sačková1, Peter Fedoročko1
1
Ústav biologických a ekologických vied, Prírodovedecká fakulta, Univerzita
P. J. Šafárika v Košiciach, Moyzesova 11, Košice 040 01, Slovenská republika
(experimentálne pracovisko); 2Ústav experimentálnej medicíny, Lekárska
fakulta, Univerzita P. J. Šafárika v Košiciach, Trieda SNP 1, Košice 040 11,
Slovenská republika (súčasné pracovisko)
Onkogénna mRNA expresia na predikciu vážnej dysplázie, resp. 40
karcinómu krčka maternice u HPV16/18 pozitívnych skvamóznych lézií
Veronika Holubeková1, Andrea Mendelová1,2, Pavol Žúbor2, Ivana
Kapustová2, Iveta Švecová2; Erik Kúdela2, Tatiana Burjanivová1, Zora
Lasabová1, Ján Danko2
1
Ústav molekulovej biológie, Jesseniova lekárska fakulta v Martine, Univerzita
Komenského v Bratislave; 2Gynekologicko-pôrodnícka klinika, Jesseniova
lekárska fakulta v Martine, Univerzita Komenského v Bratislave
Effect of spheroid size on the activity of anticancer agents in spheroid 45
cultures of colorectal carcinoma cells
Viswanath Das, Petr Džubák, Marián Hajdúch
Laboratory of Experimental Medicine, Institute of Molecular and
Translational Medicine, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky
University Olomouc, Hněvotínská 5, 779 00 Olomouc, Czech Republic.
6
Kategória Mladý výskumník do 35 rokov, doktorand
Cancer-associated carbonic anhydrase IX facilitates cell adhesion to solid 51
support, potentially contributing to a crucial step of the metastatic
cascade
Michaela Debreová1, Lucia Csaderová1,2, Magdaléna Vreštiaková3, Silvia
Pastoreková1, Eliška Švastová1
1
Department of Molecular Medicine, Institute of Virology, Slovak Academy of
Sciences, Dúbravská cesta 9, 845 05 Bratislava, Slovakia; 2Centre for
Molecular Medicine, Slovak Academy of Sciences, Vlárska 3-7, 831 01
Bratislava, Slovakia; 3BioScience Slovakia s.r.o, Dúbravská cesta 9, 841 04
Bratislava, Slovakia
Depletion of carbonic anhydrase IX leads to the decrease of migration and 56
invasion ability of tumor cells
Peter Radvák, Eliška Švastová, Lucia Csáderová, Martina Takáčová, Silvia
Pastoreková, Juraj Kopáček
Institute of Virology, Department of Molecular Medicine, Slovak Academy of
Sciences, 845 05 Bratislava, Slovak Republic
Impact of Carbonic Anhydrase IX Shedding on Pro-metastatic 61
Characteristics of Tumor Cells
Ivana Vidličková1,2, Miriam Zaťovičová1,4, Lucia Csaderová1,3, Monika
Radvánszka4;
Magdaléna Vreštiaková4; Stanislav Stuchlík2, Jaromír
Pastorek1, Silvia Pastoreková1,4
1
Department of Molecular Medicine, Institute of Virology, Slovak Academy of
Sciences, Dúbravská cesta 9, 845 05 Bratislava, Slovak Republic;
2
Department of Molecular Biology, Faculty of Natural Sciences, Comenius
University, Mlynská dolina, 842 15 Bratislava, Slovak Republic; 3Centre for
Molecular Medicine, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovak
Republic; 4BioScience Slovakia, Bratislava, Slovak Republic
Carbonic anhydrase IX and glycolysis: a potential link revealed by
proteomic profiling
Martin Benej1, Eliška Švastová1, Marko Repič1, Radivojka Vulič2, Monica
Vitale3,4, Nicola Zambrano3,4, Andrea Scaloni5, Juraj Kopáček1, Silvia
Pastoreková1
1
Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Dúbravská cesta 9, 845 05
Bratislava, Slovakia; 2Faculty of Natural Sciences, Commenius University,
Mlynská dolina 842 15 Bratislava, Slovakia; 3Dipartimento di Biochimica
e Biotecnologie Mediche, Università degli Studi di Napoli Federico II, 80131
Napoli, Italy; 4CEINGE Biotecnologie Avanzate, 80145 Napoli, Italy;
5
Proteomics and Mass Spectrometry Laboratory, ISPAAM, National Research
Council, 80147 Napoli, Italy
66
7
ABC transportéry, hypericín a bunky „side population“
70
Jana Vargová, Jaromír Mikeš, Barbora Kuchárová, Lucia Mikešová, Rastislav
Jendželovský, Ján Kovaľ, Ľubomír Čulka, Peter Fedoročko
Univerzita Pavla Jozefa Šafárika v Košiciach, Prírodovedecká fakulta, Ústav
biologických a ekologických vied, Moyzesova 11, 040 01 Košice
Fotoexcitácia 7H-dibenzo[c,g]karbazolu vplyvom UVA žiarenia– indukcia 74
reaktívnych foriem kyslíka a oxidačných poškodení DNA
Eva Sedlačková, Katarína Kozics, Michal Pastorek, Alena Gábelová
Ústav experimentálnej onkológie SAV, 833 91 Bratislava
Histopatologická a imunohistochemická analýza karcinómov mliečnej 79
žľazy u potkana po liečbe Chlorellou pyrenoidosa
Andrea Kapinová1, Peter Kubatka2, Karol Kajo3, Desanka Výbohová4, Martin
Péč2, Marian Adamkov5, Ján Mojžiš6, Dušan Dobrota1
1
Ústav lekárskej biochémie JLF UK v Martine; 2Ústav lekárskej biológie JLF
UK v Martine; 3Onkologický ústav sv. Alžbety v Bratislave; 4Ústav anatómie
JLF UK v Martine; 5 Ústav histológie a embryológie; 6 Ústav farmakológie LF
UPJŠ Košice
Biologické účinky liečivých rastlín z čeľade Lamiaceae
83
1
2
1
3
Annamária Srančíková , Veronika Klusová , Alena Gábelová , Pavel Mučaji ,
Michal Pastorek1, Barbara Kusznierewicz4, Eva Horváthová1, Katarína
Kozics1
1
Ústav experimentálnej onkológie SAV, Vlárska 7, 833 91 Bratislava;
2
Prírodovedecká fakulta, Univerzita komenského, Mlynská dolina, 842 15
Bratislava; 3Farmaceutická fakulta, Univerzita Komenského, Odbojárov 10,
832 32, Bratislava; 4Oddelenie potravinovej chémie, technológie a
biotechnológie, Chemická fakulta, Univerzita Technológie Gdansk, Poľsko
Odpoveď bunkovej línie multiformného glioblastómu na pôsobenie BAF® 88
a temozolomidu
Eva Blahovcová, Henrieta Škovierová, Radovan Murín, Dušan Dobrota, Jozef
Hatok
Ústav lekárskej biochémie, Jesseniova lekárska fakulta, Univerzita
Komenského v Bratislave, Malá Hora 4, 036 01 Martin
Analýza prestavby génu ALK v biopticky vyšetrovanom tkanive 93
nemalobunkového karcinómu pľúc
Anna Farkašová1,2, Martina Bárthová1,2, Tomáš Balhárek1,2, Ľuboslava
Janáková1, Zuzana Kviatkovská2, Lukáš Plank1,2
1
Ústav patologickej anatómie, Jesseniova lekárska fakulta Univerzity
Komenského a Univerzitná nemocnica Martin, Slovensko; 2Martinské
bioptické centrum, s. r. o., Martin, Slovensko
8
Analýza
rizikových
faktorov
vzniku
bakteriémií
u detských 98
onkologických pacientov a ich skorá diagnostika
Pleško M.1, Sejnová D.1, Makohusová M.1, Chrenka B.1, Hederová S.1,
Perďochová Ľ.2, Lisalová M.2
1
Klinika detskej hematológie a onkológie DFNsP, Bratislava; 2HPL,
Bratislava
Bortezomibom indukovaná smrť leukemických buniek je sprevádzaná 103
štiepením HSP90β, IκBα a prokaspázy 3. Úloha kaspázy 8
Katarína Kliková1, Andrea Štefaniková1, Ivana Pilchová1, Jozef Hatok1, Peter
Chudý2, Juraj Chudej 2, Dušan Dobrota 1, Peter Račay1
1
Ústav lekárskej biochémie, Jesseniova lekárska fakulta v Martine, Univerzita
Komenského v Bratislave, Slovenská republika; 2Klinika hematológie
a transfuziológie, Univerzitná nemocnica v Martine, Slovenská republika
Zvýšená expresia survivinu ako rizikový faktor u pacientov s karcinómom 104
prostaty
Katarína Jurková1,2, Veronika Mešťanová1,2, Martina Furjelová1,2, Mária
Kovalská1, Marian Adamkov1
1
Ústav histológie a embryológie, Jesseniova lekárska fakulta Univerzity
Komenského, Malá Hora 4, 036 01 Martin; 2Ústav lekárskej biochémie,
Jesseniova lekárska fakulta Univerzity Komenského, Malá Hora 4, 036 01
Martin
5-azacytidine nucleosides and their derivatives: Molecular hallmarks of 109
drug resistance
Khushboo Agrawal1, Petr Džubák1, Ivo Frydrych1, Dušan Holub1, Petr Vojta1,
Marcela Krečmerová2, Miroslav Otmar2, Marián Hajdúch1
1
Palacky University, Faculty of Medicine and Dentistry, Institute of Molecular
and Translational Medicine, Olomouc, Czech Republic; 2Institute of Organic
Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic,
v.v.i., Prague, Czech Republic
Sustained DNA damage response in proteasome inhibitor treated cancer 115
cell lines
Katarína Chromá1 , Juraj Kramara1, Pavel Moudrý2, Martin Mistrík1, Jiří
Bártek1,2
1
Institute of Molecular and Translational Medicine, Olomouc, Czech
Republic; 2 Danish Cancer Society, Copenhagen, Denmark
9
Využitie in silico metód pri štúdii inhibítorov onkogénnych kináz
122
1,
2
2
Eva Proroková Pathik S Brahmkshatriya , Ondřej Přenosil , Jindřich
Fanfrlík2, Jan Řezáč2, Michal Pitoňák1, Martin Lepšík2, Pavel Hobza2
1
Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra
fyzikálnej a teoretickej chémie, Mlynská dolina CH-1, 84215 Bratislava,
Slovenská Republika;2Ústav organickej chémie a biochémie, Česká akadémia
vied, Flemingovo nám. 2, 166 10, Praha, Česká Republika
Aktivácia ERK1/2, SAPK a p53 signálnych dráh vplyvom nanočastíc 127
magnetitu s rôznou povrchovou úpravou
Barbora Buliaková1, Monika Mesárošová1, Michal Šelc1, Filip Rázga2,
Dominika Vnuková 2, Alena Gábelová1
1
Ústav experimentálnej onkológie SAV, Vlárska 7, 851 02, Bratislava; 2 Ústav
polymérov SAV, Dúbravská cesta 9, 845 41 Bratislava
Abstrakty súťažiacich, ktorí sa nemohli zúčastniť
The cytotoxic effect of CD::UPRT/MSC/5-FC treatment on human 133
ovarian carcinoma cell line SKOV-3 in vitro and in vivo
Lenka Baranovičová,1, 2, Miroslava Matúšková1, Lucia Kučerová1
1
Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Research Institute SAS,
Bratislava; 2Faculty of Medicine, Comenius University, Bratislava
Hypoxiou-indukovaná karbonická anhydráza IX ako možný prognostický 137
a prediktívny parameter nádorového ochorenia mliečnej žľazy
Martina Furjelová1,3, Mária Kovalská1, Katarína Jurková1,3, Marián Benčat2,
Slávka Drahošová2, Marian Adamkov1
1
Ústav histológie a embryológie JLF UK, Martin; 2Laboratórium patologickej
anatómie, Alpha Medical, a.s., Martin; 3Ústav lekárskej biochémie JLF UK,
Martin
Vplyv špecializovaného pohybového programu na svalové a kostné 142
tkanivo a kvalitu života onkologických pacientov s karcinómom prostaty
Aurel Zelko
Katedra Atletiky, Fakulta telesnej výchovy a športu, Univerzita Komenského
v Bratislave
Sponzori
145
10
Príhovor
Milí mladí priatelia,
do rúk sa vám dostáva publikácia, ktorá vznikla na základe vašich prednášok na 4.
ročníku celoslovenskej Súťaže mladých onkológov. Súťaž organizovala Nadácia
Výskum rakoviny v spolupráci s Ústavom experimentálnej onkológie SAV pri
príležitosti 8. Dňa výskumu rakoviny. Už predchádzajúce ročníky tejto súťaže
ukázali potešiteľnú snahu mladých ľudí zamýšľať sa nad závažnými medicínskymi
problémami života a úsilie pomôcť pri riešení mnohých otázok onkologického
výskumu. Cieľom súťaže je umožniť stretnutie mladých nadšencov v oblasti
výskumu nádorových ochorení a poskytnúť im možnosť prezentovať svoj záujem,
vedomosti, idey, ale aj výsledky práce verejne pred odbornou komisiou.
Milí priatelia, vo svojich prezentáciách ste dokázali, že v onkologickej
problematike máte prehľad a onkologickému výskumu sa už venujete alebo v
budúcnosti by ste sa mu mnohí radi venovali profesionálne. Presvedčili ste, že
o budúcnosť onkologického výskumu na Slovensku sa netreba obávať. Ste
ambiciózni, šikovní, dostatočne sebavedomí a vzdelaní mladí ľudia. Riešenie
závažných otázok v tak dôležitej oblasti akou je onkológia bude v dobrých rukách.
Ďakujeme všetkým autorom a spoluautorom za ich príspevky do tejto publikácie.
Editori
Bratislava 2014
1
®
Deň výskumu rakoviny
Nadácia Výskum rakoviny s cieľom upozorniť na priority a potenciál moderného
onkologického výskumu na Slovensku sa v roku 2007 rozhodla iniciovať Deň
výskumu rakoviny – 7. marec, ktorý by každoročne pripomínal laickej i odbornej
verejnosti význam výskumu nádorových ochorení v prospech pacientov. Je
potrebné šíriť dobré meno slovenskej onkologickej vedy a vysvetľovať, na čo je
výskum potrebný.
Posolstvo tohto dňa vyjadruje výzva“ Dnešný výskum pre zajtrajšiu liečbu! “
Nadácia Výskum rakoviny sa snaží prostredníctvom tohto dňa informovať
verejnosť, vedcov, lekárov, pacientov, ale aj politikov a slovenskú vládu, čím
konkrétnym už výskum nádorových ochorení pomáha pacientom, ale zároveň
poukázať aj na mnohé špecifické problémy, s ktorými sa onkologický výskum na
Slovensku stretáva.
Symbolom Dňa výskumu rakoviny je snežienka. Krehký kvietok, ktorý sa aj
napriek nepriazni zimného počasia prediera na svet, len aby ako prvý privítal jar.
Svojim úsilím pripomína slovenský onkologický výskum, ktorý napriek
ťažkostiam, problémom a stálemu nedostatku financií, krok za krokom prináša
nové poznatky, ktoré pomáhajú víťaziť nad rakovinou. I keď sa zdá, že dosiahnuté
pokroky v onkologickom výskume a liečbe sú dostačujúce, nie je to ešte tak. Je
veľa práce, veľa nádejí, ale aj sklamaní. Rakovina je choroba mnohých tvárí
a nevzdáva sa...
RNDr. Margita Klobušická, CSc.
prezidentka Nadácie Výskum rakoviny
2
Víťazi jednotlivých kategórií
Kategória Študent strednej školy
1.miesto: Katarína Zemančíková a Kristína Tomková
Evanjelické gymnázium J. Tranovského, Liptovský Mikuláš
2. miesto: Júlia Belobradová, Katarína Tomaščová, Lucia Golierová
Súkromné gymnázium, Oravská, Žilina
3. miesto: Alžbeta Janasová,
Gymnázium Hlinská, Žilina
Kategória Mladý výskumník do 35 rokov s ukončeným PhD štúdiom
1.miesto: Mgr. Veronika Holubeková, PhD.
Ústav molekulovej biológie Jesseniovej lekárskej fakulty, Martin
2.miesto: RNDr. Lucia Kuliková, PhD.
Ústav biologických a ekologických vied Prírodovedeckej fakulty Univerzity
P.J.Šafárika, Košice
3. miesto: RNDr. Rastislav Jendželovský, PhD.
Ústav biologických a ekologických vied Prírodovedeckej fakulty Univerzity
P.J.Šafárika, Košice
3. miesto - Špecialna cena pre súťažiaceho zo zahraničia:
Mgr. Viswanath Das, PhD., Ústav molekulárnej a translačnej medicíny Palackého
lekárskej fakulty, Olomouc, ČR
Kategória Mladý výskumník do 35 rokov, doktorand
1. miesto: Mgr. Anna Farkašová
Ústav patologickej anatómie Jesseniovej lekárskej fakulty, Martin
2. miesto: RNDr. Martin Benej
Virologický ústav SAV, Bratislava
3. miesto: RNDr. Eva Sedlačková
Ústav experimentálnej onkológie SAV, Bratislava
Špeciálna cena pre súťažiacu zo zahraničia:
Mgr. Khushboo Agrawal, Ústav molekulárnej a translačnej medicíny Palackého
lekárskej fakulty, Olomouc, ČR
Vyhlásenie víťazov Súťaže mladých onkológov 2014 sa uskutočnilo počas Galakoncertu ku Dňu
výskumu rakoviny v piatok 7.marca 2014 v Zrkadlovej sieni Primaciálneho paláca pod záštitou
Milana Ftáčnika, primátora hlavného mesta SR
3
Členovia odbornej hodnotiacej komisie
Kategória Študent strednej školy
Mgr. Janka Alexyová, Evanjelické lýceum, Bratislava
Doc. MUDr. Michal Mego, PhD., II. Onkologická klinika LF UK a NOÚ,
Bratislava
Ing. Július Brtko, DrSc., Ústav experimentálnej endokrinológie SAV
RNDr. Alena Gábelová, CSc., Ústav experimentálnej onkológie SAV
RNDr. Soňa Čierniková, PhD., Ústav experimentálnej onkológie SAV
Kategória Mladý výskumník do 35 rokov s ukončeným PhD štúdiom
RNDr. Soňa Čierniková, PhD., Ústav experimentálnej onkológie SAV
Doc. MUDr. Michal Mego, PhD., II. Onkologická klinika LF UK a NOÚ,
Bratislava
Ing. Július Brtko, DrSc., Ústav experimentálnej endokrinológie SAV
Ing. Zdena Sulová, DrSc., Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky SAV
Mgr. Lucia Kučerová, PhD., Ústav experimentálnej onkológie SAV
Kategória Mladý výskumník doktorand
RNDr. Soňa Čierniková, PhD., Ústav experimentálnej onkológie SAV
Ing. Zdena Sulová, DrSc., Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky SAV
Ing. Július Brtko, DrSc., Ústav experimentálnej endokrinológie SAV
Ing. Katarína Luciaková, DrSc., Ústav experimentálnej onkológie SAV
RNDr. Jozef Bízik, DrSc., Ústav experimentálnej onkológie SAV
RNDr. Miroslav Piršel, CSc., Ústav experimentálnej onkológie SAV
Mgr. Miroslav Chovanec, PhD., Ústav experimentálnej onkológie SAV
4
Kategória
Študent strednej školy
5
Vplyv životosprávy na vznik rakoviny
Gabriela Virdzeková
Gymnázium, Hlinská 29, 011 80 Žilina
Úvod
V súčasnej dobe zomiera na rakovinu ročne viac ako 8 miliónov ľudí. Zhubný
nádor môže vzniknúť v takmer akejkoľvek časti ľudského tela, ale najčastejšie
vzniká v tkanivách, kde sa najviac množia bunky alebo kde sú bunky stimulované
hormónmi. Medzi faktory ktoré vplývajú na vznik rakoviny patrí najmä fajčenie,
strava, dedičné faktory, UV žiarenie, infekcie, ale aj alkohol a drogy.
Strava má výrazný vplyv na vznik malígneho nádoru. Je to významný faktor pre
vznik nádorov, ale taktiež môže pôsobiť ako prevencia. Ďalším faktorom z oblasti
stravovania je obezita a fyzická aktivita.
Elementárne zložky stravy
Ovocie a zelenina
Konzumácia ovocia a zeleniny má zreteľne pozitívny vplyv na rôzne lokalizované
nádory a taktiež sú veľmi prospešné v prevencií voči rakovine. Vedecké výsledky
dokazujú, že zvýšená konzumácia zeleniny znižuje riziko vzniku karcinómu hltanu,
hrtanu, úst, pažeráka, pľúc, žalúdka a hrubého čreva. Dostatočný príjem zeleniny
a ovocia denne teda pôsobí ako prevencia pred vznikom karcinómu.
Fytochemické látky
Vláknina, vitamíny a minerály sú všeobecne známe ako látky, od ktorých závisí
priaznivý účinok ovocia a zeleniny, v prevencií a liečbe rozličných chorôb, ako
napr. aj rakoviny. Protirakovinový účinok ovocia a zeleniny však prevažne závisí
od obsahu fytochemických látok. Fytochemické látky sa prirodzene vyskytujú
v rastlinách a sú zodpovedné za ich sfarbenie, organoleptické vlastnosti a za
udržiavanie zdravia rastlín. Majú vplyv na ochorenia ako rakovina alebo cievna
mozgová príhoda a iné. Rastliny chránia proti škodcom, mikroorganizmom alebo
infekciám. Ich tvorba závisí od potreby rastliny, takže ak je rastlina umelo
chemicky ošetrovaná, nie je potrebné, aby si vytvárala fytochemické látky, čiže jej
prínos pre zdravie človeka je podstatne nižší ako u rastlín, ktoré nie sú chemicky
ošetrované.
V určitých prípadoch sa fytochemická látka vyskytuje len u jednej rastliny. Takéto
látky s výraznou protirakovinovou aktivitou sú však obsiahnuté len v určitých
druhoch potravín. Zreteľne protirakovinovo pôsobí napr. kurkumín v kurkume,
6
resveratrol v hrozne, katechíny v zelenom čaji, indoly v brokolici a izoflavóny
v sójových bôboch.
Vitamíny
Vitamíny nemajú takú veľkú úlohu v prevencií rakoviny ako fytochemické látky,
napriek tomu sú podstatné.
U vitamínov prijímaných v prírodnej forme boli pozorované protirakovinové
účinky najmä u tých, ktoré majú aj antioxidačný potenciál ako napr. vitamín C,
ktorý znižuje riziko karcinómu žalúdka, úst, hltana, pažeráka, pľúc a pankreasu.
Vitamín E mal priaznivé účinky na rakovinu pľúc a - karotén pozitívne vplýval na
nádor pľúc, pažeráku, žalúdku, hrubého čreva a prsníka.
Vitamíny, ktoré sú prijímané ako doplnky výživy vo forme farmaceutických
preparátov, pôsobia však na ľudský organizmus odlišne. Vitamín E pôsobil na
zníženie rizika nádoru prostaty. - karotén naopak zvýšil riziko karcinómu pľúc
u fajčiarov.
Alkohol
Alkohol je všeobecne klasifikovaný ako karcinogén skupiny 1, čiže preukázaný
ľudský karcinogén. Nadmerná konzumácia alkoholických nápojov zvyšuje riziko
karcinómu úst, hltana, hrtana, pažeráka, hrubého čreva a prsníka.
Tuky
Tuky živočíšneho pôvodu zvyšujú riziko vzniku karcinómu prsníka, hrubého čreva,
prostaty, maternice a pľúc. Na rozdiel od toho, oleje rastlinného pôvodu s vysokým
obsahom monoénových a polyénových mastných kyselín znižujú výskyt rakoviny
prsníka, hrubého čreva a prostaty.
Najväčšie problémy sú však zapríčinené nedostatkom esenciálnych mastných
kyselín teda omega-3-mastných kyselín, ktoré majú byť v pomere k omega-6mastným kyselinám 1:1. V súčasnosti je však tento pomer 1:20. Tento
nerovnovážny pomer má negatívne následky na vznik chronických chorôb, ako je
rakovina a kardiovaskulárne choroby. Omega-3- mastné kyseliny znižujú riziko
vzniku srdcových arytmií. Zvýšená konzumácia rýb, bohatých na tieto esenciálne
látky preukazuje pokles rizika vzniku rakoviny prsníka, prostaty a aj hrubého
čreva.
Obezita
Obezita je veľmi dôležitým faktorom pre vznik karcinómov endometria, obličiek,
prsníka, žalúdka a taktiež kolorektálnych karcinómov.
V roku 2001 bola v Lyone konferencia International Agency for Research on
Cancer of the World Health Organisation. Na tejto konferencií bol analyzovaný
vplyv hmotnosti na vznik karcinómov. Záverom bolo, že nadváha výrazne zvyšuje
riziko vzniku karcinómu hrubého čreva, prsníka a v prípade postmenopauzálnych
žien endometria, obličiek a pažeráka. Ďalej bolo klinickými testami dokázané, že
fyzická aktivita jasne znižuje riziko karcinómu hrubého čreva a prsníka.
Výskyt karcinómu prsníka u postmenopauzálnych žien sa lineárne zvýšil pri
stúpaní body mass indexu (BMI) nad 24. Výskyt sa najviac zvýšil v krajinách
s malým výskytom rakoviny prsníka a častý bol taktiež u postmenopauzálnych
7
žien, ktorým sa v dospelosti výrazne zvýšila hmotnosť. Vzťah medzi rakovinou
prsníka a nadváhou je úplne nezávislý na prítomnosti iných rizikových faktorov, je
teda nezávislým rizikovým faktorom.
Priamy vzťah je pozorovateľný taktiež medzi nadváhou a karcinómom maternice.
Riziko endometriálneho karcinómu sa zvyšuje 2 až 3krát u premenopauzálnych
žien aj u postmenopauzálnych žien s hodnotou BMI nad 25. Karcinóm obličiek je
taktiež 2 až 3krát častejší u mužov aj u žien s hodnotou nad 30.
Fyzická aktivita
Fyzická aktivita pôsobí proti vzniku karcinómov dvoma spôsobmi - znižuje výskyt
obezity a taktiež má nezávislý samostatný ochranný účinok. Zaraďuje sa tiež medzi
primárne prostriedky prevencie rakoviny. Najväčší účinok má na kolorektálny
karcinóm a pôsobí tiež ako prevencia pre rakovinu prsníka a hrubého čreva.
Fyzická aktivita znižuje riziko vzniku karcinómu hrubého čreva 40% a taktiež
stimuluje aktivitu imunitného systému, čo má za následok menší výskyt nádorov.
Vlastný pokus
Na pokus sme zvolili dotazník zložený zo 6 otázok týkajúcich sa rakoviny.
Dotazník celkovo vyplnilo 91 ľudí vo veku od 15 do 19 rokov, ktorí navštevujú
gymnázium.
Náš výskum dopadol podľa našich predpokladov. Našim cieľom bolo zistiť,
nakoľko sú adolescenti informovaní o rakovine. Zistili sme, že vedomosti
adolescentov o rakovine sú pomerne slabé. Priemerná úspešnosť bola 27%.
8
Poďakovanie
Za pomoc pri práci by sme radi poďakovali Mgr. Gabriele Čornej a Ing. Jarmile
Turoňovej. Taktiež aj Nadácii Výskum Rakoviny za možnosť zúčastniť sa na
Súťaži mladých onkológov.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Weinberg R.A. 2000. Jediná odrodilá bunka. Bratislava:Archa, 2000.
ISBN 80-7149-361-9
[2]
Schreiber D.S. 2007. Jak čelit rakovině. Praha:Portál,2010.
ISBN 978-80-7367-785-5
[3]
Béliveau R., Gingras D. 2006. Zdravým vařením proti rakovině.
Praha:Vyšehrad,2009. ISBN 978-80-7429-021-3
[4]
Béliveau R., Gingras D. 2005. Výživa ako zbraň proti rakovine.
Bratislava:Balneotherma,2008. ISBN 978-80-969911-1-2
[5]
Adam Z. Obecná onkologie a podpůrná léčba. Praha: Grada Publishing,
2003. ISBN 8024706776
9
Nárast výskytu ochorenia rakoviny prsníka
u žien
Paulína Ďurčanská
Gymnázium Hlinská 29, 011 80 Žilina
Úvod
Nádor ako porucha, predovšetkým vo svojej zhubnej podobe, sprevádza ľudský rod
od začiatku jeho existencie. Všeobecne na vznik rakoviny vplývajú rôzne faktory:
fyzikálne, chemické a biologické. V medicíne doteraz neexistuje pri rakovine
žiadny spôsob, ktorý by vyliečil toto ochorenie. Na jej liečbu je potrebné využiť
chirurgický zákrok, chemoterapiu či rádioterapiu. Zároveň pri týchto technických
postupoch je dôležité si všímať svoju prirodzenú obranyschopnosť, ktorú môžeme
využiť pri zabránení vzniku ochorenia, alebo na zlepšenie priebehu liečby.
Rakovina ženského prsníka je jedným z najčastejších nádorových ochorení
v ženskej populácií. V posledných 20 rokoch pribúda počet ochorení u mladších
žien vo veku od 25 – 45 rokov, zvýšil sa viac ako o 30%. Závažné rizikové faktory
pri vzniku sú: rodinná záťaž, výskyt karcinómu prsníka pri pokrvných členoch
rodiny, teda pri matke alebo pri sestrách. Ďalšie rizikové faktory súvisia
s hormonálnou činnosťou a reprodukčnou funkciou. Znalosť všetkých uvedených
faktorov a stavov je veľmi dôležitá v primárnej zdravotnej starostlivosti.
Zvýšené riziká sú u žien
● ktoré nerodili,
● prvýkrát otehotneli po 30. roku života,
● ktorých blízka príbuzná (matka, sestra) mala rakovinu prsníka,
● ktoré už v minulosti ochoreli na rakovinu prsníka,
● ktoré majú viac ako 50 rokov (všeobecné vekové riziko),
● ktoré majú problémovú mastopatiu. To platí, keď:
- sa pohmatom (palpáciou) zistí hrčkovitá zmena v prsníku,
- mamografia ukáže mikrokalcifikáty v prsníku,
- sa pri operácii v odobratej vzorke tkaniva zistia mikroskopické známky zvýšenej
malignity.
Výskyt: Ak si predstavíme kríž s bradavkou ako centrum môžeme prsník
priestorovo rozložiť do štyroch kvadrantov. Mimoriadne často vzniká rakovina
v hornom vonkajšom kvadrante, obsahuje totiž aj najväčšiu časť prsnej žľazy. Pre
lepšie pochopenie pridávam názorný obrázok 1:
10
Obrázok 1:
http://primar.sme.sk/c/4117102/rakovina-prsnika-karcinom-prsnikovejzlazy.html
Materiál a metódy
Pri svojej práci som využila všetky dostupné informácie na internete, samozrejme
v spolupráci s knižnými dokumentami. Myšlienka venovať sa práve tejto téme
v oblasti onkológie ako takej vznikla na základe poznatkov, ktoré sú svetovo
známe. Touto problematikou sa zaoberajú rôzne inštitúcie a organizácie, ktoré
podporujú práve intenzívnu prevenciu pri hrozbe rakoviny prsníka. Keďže aj ja
som žena a tento problém sa môže o pár rokov tesne dotýkať aj mňa, či niektorého
člena mojej rodiny, je mi táto téma veľmi blízka.
Výsledky a diskusia
Je celosvetovo známe, že počet žien s rakovinou prsníka v posledných rokoch
prudko stúpa. Posledné dostupné štatistiky hovoria, že od roku 2006 pribudlo na
Slovensku asi 2300 prípadov tohto ochorenia. Rakovina prsníka je u žien
najčastejšou formou rakoviny. Štatisticky sa udáva, že až 70% všetkých
rakovinových lézií si nájde žena sama alebo jej partner. Ženy by však pre
vzrastajúci počet ochorení nemali zanedbávať preventívne prehliadky. No aj
napriek apelom gynekológov chodí na pravidelné vyšetrenia len 30% z nich.
„Mnoho žien si myslí, že keď ich nič nebolí, k lekárovi chodiť netreba, pretože sú
zdravé,“ hovorí gynekológ Peter Hrabčák. Mnoho ochorení však prebieha skryto,
bez zjavných problémov. Napríklad v západných krajinách tvorí rakovina prsníka
jednu tretinu zo všetkých onkologických ochorení, na Slovensku je to každé piate
onkologické ochorenie. Výskyt rakoviny prsníka je nižší v Afrike a v Ázií ako vo
vyspelejších krajinách. Slovensko sa nachádza v stredných priečkach štatistických
tabuliek. V dôsledku zlepšenia týchto veľkých čísel vznikajú nielen na Slovensku,
ale aj po celom svete rôzne organizácie, s úlohou osloviť všetkých ľudí, aby
zmenili svoj životný štýl. Ľudia by sa mali zdravo stravovať, nefajčiť a nepiť
alkoholické nápoje, najmä koncentrované. Spôsob života však nie je jediným
spúšťačom onkologického ochorenia prsníka. Ženy by mali v prvom rade poznať
prípady, v ktorých je zvýšené riziko vzniku (tieto riziká sú uvedené vyššie,
v úvode práce). Často krát tak môže žena sama zachytiť ochorenie už
v počiatočnom štádiu. Mnoho žien však samo vyšetrenia ignoruje. Jednou zo
základných príčin nedostatočnej domácej prevencie je, že žena má strach. Mnoho
11
žien si myslí, že ak sa u nich vyskytne niektorý z klinických príznakov, má
rakovinu. V niektorých prípadoch môže ísť len o zápal či iný, menej závažný, typ
ochorenia. Ďalšou z príčin zanedbávania samovyšetrenia je, že žena jednoducho
nevie, ako si ho má spraviť.
Samovyšetrenie by mali robiť ženy po 20. roku života. Pravidelne, raz mesačne
hneď po skončení menštruácie. Vtedy sú prsníky v úplnom pokoji a ľahko sa
vyšetrujú. Ženy po prechode by si mali robiť samovyšetrenie vždy v prvý deň
v mesiaci. Všetky ženy by mali poznať správny postup samovyšetrenia, mala by to
byť pre ne samozrejmosť. Domáca prevencia by mala prebiehať v týchto
konkrétnych krokoch:
Krok č.1
Vyzlečte sa po pás a postavte pred zrkadlo. Obidve ruky voľne pripažte a pri
intenzívnom svetle skúmajte, či nespozorujete spomínané zmeny na svojich
prsiach. Ak nemáte obidva prsníky celkom rovnako veľké, je to prirodzený jav.
Krok č.2
Obidve ramená zdvihnite a pokračujte v predchádzajúcom pozorovaní tak, že sa
pred zrkadlom pomaly otáčate sprava doľava a zľava doprava.
Krok č.3
Uchopte prsníky jeden po druhom medzi svoje dlane a najprv vodorovným, potom
zvislým kĺzavým pohybom ich prehmatajte. Pozorujte, či neucítite zatvrdnuté
miesto alebo hrčku.
Krok č.4
Ľavé rameno spustite dolu, pravou rukou dookola prehmatajte ľavú prsnú bradavku
vo vnútri dvorca, potom ju jemne stlačte, či z nej nepresakuje srvátkový alebo
krvavý výtok. Tým istým spôsobom vyšetrite aj pravý prsník.
Krok č. 5
Ľavý prsník si prehmatajte jemným hladiacim tlakom vnútornou stranou troch
stredných prstov – nie ich končekmi! Začnite zvonka zospodu, krúživými pohybmi
dookola, vždy bližšie k strednej bradavke. Toto urobte dvakrát. Raz majte ruku
založenú pod hlavou a raz voľne pripaženú. Takisto postupujte pri prehmatávaní
pravého prsníka.
Krok č.6
Ľavú ruku si založte pod hlavu a pravou rukou podobnými pohybmi ako v
predchádzajúcom prípade si prehmatajte podpazušie, či v ňom nie je hrčka. Takisto
si vyšetrite aj pravé podpazušie.
Krok č.7
Ľavú ruku voľne pripažte. Pravou rukou si prehmatajte jamku nad kľúčovou
kosťou. Takisto si vyšetrite aj pravú stranu.
Počas tvorby mojej práce som získala veľa zaujímavých informácií. Čísla,
o ktorých som sa dozvedela sú naozaj alarmujúce. Myslím si, že svetové
organizácie prispievajú značnou mierou v boji proti rakovine. No to nie je dosť.
Množstvo žien sa začne zaujímať o rizikové faktory vzniku ochorenia či
12
o prevenciu vzniku až vtedy, keď je už neskoro. A to je najväčšia chyba. To veľké
číslo, ktoré udáva počet onkologických ochorení prsníka u žien, však svedčí o tom,
ako náš životný štýl a životná úroveň klesajú. Množstvo mladých ľudí zanedbáva
varovania, ktoré sú v médiách. Informovanie ľudí, v tomto prípade najmä žien,
o rizikách vzniku o prevencií či o správnom postupe samovyšetrenia by malo
prebiehať už na školách. Mnohé školy to podceňujú. V dôsledku toho nastáva
práve už spomínané, znižovanie hranice vzniku rakoviny prsníka u žien. Je to
predsa zodpovednosť každého z nás, starať sa o vlastné zdravie a pravidelne chodiť
na prehliadky. Malo by sa viac poukázať na spôsoby, akými môžeme ochoreniu
predísť. A to nielen na Slovensku, ale po celom svete. Mnohé ženy v menej
rozvinutých krajinách ani netušia, ako by sa mali správne vyšetriť. V dôsledku
tohto zanedbávania potom vznikajú také vysoké čísla ochorenia žien.
Mojim záverom teda je, že ženy by sa mali viac zaujímať o svoje zdravie
a o prevenciu, ktorú môžu vykonávať aj doma. Na druhej strane by mali aj lekári
a svetové organizácie, ktoré bojujú proti rakovine zvýšiť intenzitu oslovovania ľudí
v otázke rakoviny prsníka. V prvom rade si musia ľudia uvedomiť, akými
bezbrannými sa stávame, keď sa dostatočne nezaujímame o svoje zdravie a nič pre
to nerobíme.
Poďakovanie:
Na záver svojej práce by som chcela poďakovať najmä ľuďom, ktorý si uvedomujú
vážnosť tohto onkologického ochorenia a pomáhajú ostatným v boji proti takej
zákernej chorobe. Verím, že takýchto dobrých ľudí bude ešte pribúdať, svet ich
potrebuje. V druhom rade by som chcela poďakovať svojej rodine a kamarátke za
to, že mi pomohli pri tvorbe tejto práce svojou ohľaduplnosťou a pokorou.
V neposlednom rade by som chcela poďakovať ľuďom, čo každoročne organizujú
túto onkologickú súťaž. Verím, že tým vznikne oveľa viac vzdelaných ľudí, ktorí
budú mať tú česť, pomáhať druhým v ich ťažkom boji s rakovinou.
Zoznam použitej literatúry
[1]
http://diva.aktuality.sk/clanok/25220/special-ako-si-spravne-vysetritprsniky/
[2]
http://www.lpr.sk/subory/publikacie/rakovina-prsnika/rakovina-prsnikanahlad-2011-12.vydanie.pdf
[3]
http://najmama.aktuality.sk/clanok/226281/rakovina-prsnika-karcinomprsnikovej zlazy/
[4]
http://www.gynda.sk/clanok/30/na-slovensku-prib%C3%BAda-2-400
nov%C3%BDch-ochoren%C3%AD-rakoviny-prsn%C3%ADka
[5]
http://zdravie.pravda.sk/zdravie-a-prevencia/clanok/13156-pocet-zien-srakovinou-prsnika-pribuda/
[6]
http://primar.sme.sk/c/4117102/rakovina-prsnika-karcinom-prsnikovejzlazy.html
Knihy: David Servan - Schreiber, Proti rakovine nie sme bezmocní, 2009
Prof. MUDr. Jozef Koutecký, DrSc., a kolektív, Klinická onkologie, 1988
13
Rakovina prsníka – prevencia a
osveta
Katarína Zemančíková, Kristína Tomková
ESŠ – Evanjelické gymnázium
J. Tranovského, Komenského 10,
Liptovský Mikuláš 031 01
Úvod
Stredoškolská odborná práca je venovaná téme rakoviny prsníka, základnej
diagnostike, rizikovým faktorom, no predovšetkým osvete - informovanosti dievčat
a žien rôznych vekových kategórii o tejto často sa vyskytujúcej zhubnej chorobe
žien. Treba však poznamenať, že i napriek tomu, že karcinóm prsníka je v lekárskej
praxi často diagnostikovaný, toto ochorenie, pokiaľ sa skoro zachytí, patrí medzi
najlepšie liečiteľné druhy onkologických ochorení. Fakty ako skorá diagnostika,
lekárske poznatky, liečiteľnosť ochorenia, schopnosť samovyšetrenia, starostlivosť
a zodpovednosť o svoje zdravie a zdravie svojich blízkych, boli základom našej
práce a osvety smerom k verejnosti – tzn. žiakom našej školy a osloveným
návštevníkom nákupného centra v Liptovskom Mikuláši.
Cieľom práce bolo zistiť u vybranej skupiny dievčat a žien úroveň informovanosti
o rakovine prsníka a o možnostiach prevencie tohto ochorenia. Zároveň tiež
navrhnúť a zorganizovať spôsob, ako zvýšiť záujem a dostať túto tému viac do
povedomia dievčat a žien najmä vo veku 15 - 20 rokov. Vychádzajúc z cieľov
práce sme stanovili prieskumné otázky:
1. Ako ovplyvňuje životný štýl (spôsob stravovania, fajčenie, alkohol, fyzická
aktivita) výskyt rakoviny?
2. Ako môže žena u seba čo najskôr odhaliť nádor prsníka? Je nutné zdôrazniť
význam metódy samovyšetrenia, preventívnych prehliadok a zodpovednosti za
svoje zdravie.
Materiál a metódy
Práca v teoretických východiskách prináša dostupné informácie o anatómii prsníka,
o zhubných a nezhubných ochoreniach prsnej žľazy, o rizikových faktoroch
vzniku rakoviny prsníka, o jej diagnostike, terapii a o možnostiach prevencie.
V aplikačnej časti práce navrhujeme formy, ako možno zvýšiť informovanosť
v uvedenej problematike s dôrazom na rizikové faktory a možnosti prevencie.
V rámci realizovania cieľov a aktivít sme do spolupráce prizvali študentský spolok
medikov Lekárskej fakulty Univerzity Pavla Jozefa Šafárika v Košiciach
a organizáciu Liga proti rakovine. Oslovili sme vedenie našej školy a sponzora, tiež
manažment nákupného centra so žiadosťou o poskytnutie verejných prezentačných
14
priestorov. Študentská akcia prebehla 11. 10. 2013. Formy osvety sme realizovali
na svojej škole i v nákupnom centre. Navrhli sme a rozdávali voľne šíriteľný leták
so základnými informáciami o rakovine prsníka, pripravili sme prednášky
a workshop s praktickými aktivitami – nácvik samovyšetrovania prsníkov s
využitím makiet, viedli sme otvorenú diskusiu pre oslovené žiačky a verejnosť.
Popri uvedených aktivitách sme realizovali dotazníkovú anketu. Po prebehnutí
akcie sme vytvorili konto na sociálnej sieti, kde sme on-line zverejnili relevantné
informácie, ktoré sú prístupné všetkým záujemcom.
Výsledky a diskusia
V dotazníkovom prieskume sme zisťovali stupeň informovanosti dievčat v našom
veku 15-20 rokov a žien vo veku 21-40 a 41 a viac rokov. Vytvorili sme dva typy
dotazníkov. Jeden dotazník poslúžil na zber informácií pred realizovaním
študentskej akcie. Vyplnilo ho 227 respondentiek. Na spätnú reflexiu sme použili
druhý internetový dotazník, ktorý vyplnilo 119 respondentiek, z toho 78 dievčat z
Evanjelického gymnázia, ktoré sa zúčastnili prednášok. Dotazníky sme štatisticky
vyhodnotili a výsledky konfrontovali so stanovenými hypotézami. Predpokladali
sme, že dievčatá vo veku od 15 do 20 rokov nebudú dostatočne informované
o možnostiach prevencie rakoviny prsníka a o faktoroch výrazne ovplyvňujúcich
vznik tohto ochorenia. Tento predpoklad sa nám potvrdil na 95 %. Taktiež sme
predpokladali, že ženy staršie ako 40 rokov budú lepšie informované
o možnostiach prevencie ako o faktoroch, ktoré ovplyvňujú vznik rakoviny prsníka
– tento predpoklad sa potvrdil na 50 %. V rámci organizovania a realizácie
tematických prednášok a workshopu sme predpokladali zmenu postoja dievčat k
samovyšetreniu prsníkov a k zdravému životnému štýlu. Po prebehnutí
vzdelávacích aktivít na Evanjelickom gymnáziu J. Tranovského sa až 55 %
opýtaných dievčat anonymne vyjadrilo, že realizuje metódu samovyšetrovania
prsníkov, zatiaľ čo až 60% žien, ktoré na prednáškach neboli si samovyšetrenie
nerobia, čo je až 15%- ný rozdiel v aktivite (obrázok 1). Z toho môžeme vyvodiť
záver, že naše prednášky zvýšili aktivitu a informovanosť dievčat v oblasti
rakoviny prsníka.
Obrázok 1: Vplyv prednášok na informovanosť dievčat v oblasti rakoviny prsníka
15
Našim cieľom bolo hlavne to, aby sme konkrétnymi aktivitami prispeli k zvýšeniu
informovanosti, najmä mladých žien, o rizikových faktoroch ovplyvňujúcich vznik
rakoviny prsníka a o preventívnych opatreniach. Predpokladáme, že zvýšenie
kvality informovanosti môže viesť k skoršiemu záchytu počiatočných štádií
rakoviny, zároveň že populácia mladých žien bude môcť včas realizovať
preventívne opatrenia (hlavne zmenou životného štýlu) a tak u seba znížiť výskyt
rakoviny prsníka v neskoršom veku.
Sme si vedomé toho, že k štatisticky významnému poklesu morbidity a mortality
v prípade rakoviny prsníka môžu viesť len systémové opatrenia. Veríme však, že
naša práca a úsilie pomôžu zmeniť postoj k tejto neľahkej, obávanej a možno i
tabuizovanej téme a to aspoň u dievčat a žien, ktoré sú v našom dosahu – v škole,
v blízkom okolí a na sociálnych sieťach.
Kľúčové slová: rakovina prsníka, diagnostika, prevencia, osveta – rovesnícke
vzdelávanie
16
Cancer and mesenchymal stem cells
1
Patrícia Hudecová, 1Lucia Valicová
Supervisor 2Svetlana Školeková
1
Private Grammar School, Oravská 11, 010 01 Žilina
Laboratory of Molecular Oncology,
Cancer Research Institute of Slovak Academy of Sciences,
Vlárska 7, 833 91 Bratislava
2
Abstract
The aim of our project is to inform about the risk of using mesenchymal
stem/stromal cells in medicine, and the new findings about their role in cancer.
This project contains some basic information about cancer, the main differences
between normal cells and cancer cells, and about cancer development and spread
across the body.
Introduction
We would like to introduce you cancer and the role of mesenchymal stem cells in
tumor microenvironment. We choose to write about risk of using mesenchymal
stem cells in medicine because the mesenchymal stem cells are fascinating due to
their special characteristics which keep us alive but can also help cancer cells to
progress. This topic is very interesting and mostly it should be spread to people.
Material and methods
Cancer
Cancer is a large group of affections characterized by uncontrolled cell growth and
division. Cancer starts when cells in a part of the body start to grow out of control.
It is characterized by creation of malignant cells, which have acquired the ability to
penetrate into the surrounding tissues, where remote tumors are formed. Cancer
cell growth is different from a normal cell growth. Instead of dying, cancer cells
continue to grow and form new, abnormal cells. Cancer cells can also invade into
other tissues, something that normal cells cannot do. Growing out of control and
invading other tissues are what makes a cell a cancer cell. Cells become cancer
cells because of mutation in DNA. DNA is in every cell and it directs all the cell’s
actions. In a normal cell, when DNA gets damaged , the cell either repairs the
damage or the cell dies. In cancer cells, the damaged DNA is not repaired, and the
cell doesn’t die like it should. Instead, the cell goes on making new cells that the
body doesn’t need. These new cells all have the same abnormal DNA as the first
cell does.
Classification of tumors
Tumors can be divided into two groups: benign or malign tumors. Benign tumors
do not grow too fast, remain localized in one place - not metastasized, and after
17
resection not occur again generally. Malign tumors grow fast. Malign tumors
infiltrate neighboring tissues, absorb nutrition of host, secrete toxic products, can
create open sores. Malign tumors have the ability to expand to other parts of the
body and metastasis, after resection often recur.
Tumor microenvironment
The tumor is not composed only from tumor cells but is surrounded by normal
cells, molecules, and blood vessels that interact with and feed a tumor cell. A tumor
can change its microenvironment, and the microenvironment can affect how a
tumor grows and spreads.
Figure 1: Tumor microenvironment is composed of different types of cells (Koontongkaew, 2013)
Tumors constantly interact with different compartments of their microenvironment
and tumor behaviour is largely dictated by tumor stroma. An important component
of tumor stroma are mesenchymal stem cells. An adult stem cell is an
undifferentiated cell that is found among differentiated cells in a tissue or organ, it
can regenerate and can be differentiated in main specialized cell types of the tissue
or organ. The primary role of adult stem cells in a living organism is maintenance
and repair of tissue in which they are located. They have the ability to divide
endlessly into the same cells as they are (proliferate) or (under specific conditions)
to differentiate into the cells of one or more specific types. Human stem cells are
found in the embryo or fetus, in the adult human body and the umbilical cord.
Figure 2: We can find different types of stem cells in our body (sciencefa.com )
18
Mesenchymal stem cells
Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are an important component of tumour
microenvironment that can interact with cancer cells. MSC play the role of repair
cells by entering the wound and replacing damaged tissues. In general, all stem
cells have three general properties: they are capable of dividing and renewing
themselves for long periods; they are unspecialized; and they can give rise to
specialized cell types. MSC are able to find a damage in the body and tumors act as
a damage in our bodies. MSC also travels to places where are tumors are able to
influence the behavior of tumor cells.
As MSC “mistake“ the tumour for normal wound it makes them an ideal tool for
directed therapeutic approach. On the other hand, MSC were also reported to
increase the proliferation and drug resistance of cancer cells which correlate with
progression and spread of cancer. There are many ways in which human MSC can
be used in research and the clinic but there is the need to stay cautious before their
wide use in the context of cancer disease. When some tissue is damaged in the
body mesenchymal stem cells migrate to the place of damage and there due to the
fact that they produce growth factors and can promote the formation of blood coils
are trying to repair this damage. When a MSC enters damaged tissue, will be there
to share or promote itself there existing stem cells.
MSC affect the morphology of tumor cells. Tumor cells in the process of epithelial
- mesenchymal transition acquire the ability of releasing from the place of the
primary tumor and spread via blood and lymphatic system to other parts of the
body.
Figure 3: Tumor cells that undergo the process of epithelial-to-mesenchymal transition can invade
into blood vessels and spread to other parts of body
(http://www.nature.com/leu/journal/v22/n5/fig_tab/leu200848f3.html).
MSC due to their ability to replace damage tissues are used in regenerative
medicine, but also in patients who have had a mastectomy (breast removal in which
it is located tumors) in mammoplasty (MSC are used in order to better wound
19
healing). In the case of the surgery and the treatment does not remove all the tumor
cells, MSC could support tumor cell and cause the return of neoplastic disease by
promoting tumor growth and division.
Results and conclusion
We would like to acquaint you with today development of medicine and with the
new findings about treatment of cancer. We have personally visited the Cancer
Research Institute and we had a chance to meet wonderful people who are working
on research about stem cells.
Figures from the visit of Cancer Research Institute of Slovak Academy of Sciences
20
Scientists from Cancer Research Institute of Slovak Aademy of Sciences
communicated with us without any problem. They showed to us their laboratory
experiments with cancer cells and they tried to explain their research about stem
cells. Thanks to their willingness we understand the stem cell not only through the
theory but also in practice. We hope that the project was interesting to you.
References
[1]
http://www.cancer.org/cancer/cancerbasics/what-is-cancer
[2]
http://www.cancerresearchuk.org/cancer-info/cancerandresearch/all-aboutcancer/what-is-cancer/treating-cancer/
[3]
http://www.medicalnewstoday.com/info/cancer-oncology/
[4]
http://stemcells.nih.gov
[5]
http://www.nature.com/leu/journal/v22/n5/fig_tab/leu200848f3.html)
[6]
sciencefa.com
21
Stem Cells and Cancer Treatment
1
Júlia Belobradová, 1Katarína Tomašcová, 1Lucia
Golierová
Supervisor 2Erika Ďuriníková
1
Private Grammar School, Oravská 11, 010 01 Žilina
Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Research
Institute of Slovak Academy
of Sciences, Vlárska 7, 833 91 Bratislava
2
Abstract
Scientists are interested in stem cells for a longer time. They are fascinated by the
ability of stem cells to differentiate into specialised cell types. This project focuses
on mesenchymal stem cells (MSC) and their potential use in cancer treatment.
MSC are multipotent adult stem cells mainly found in bone marrow, but they can
be easily isolated from adipose tissue. Scientists try to use MSC as some vehicles
to deliver anticancer substances into tumour. This project gives complex
information about stem cells, their exploitation and also about cancer, its
functioning and ways how to treat cancer.
Introduction
Cancer is class of diseases involving abnormal cell growth. This means, that cell
avoids apoptosis and continue in division. These extra cells form lumps or a mass
of tissue called a tumour. There are two basic types of tumours: benign and
malignant. The spread of cancer from one part of the body to another is called
metastasis.
Characteristics of the tumour:
Tumour cells gains self-sufficiency in signalizations which stimulates division and
growth (unlike normal cells). They are insensible to signals that inhibit growth and
can infiltrate to other tissues (through blood or lymphatic system) and create
metastases. Cancer cells have unlimited potential for replication, they are able to
avoid apoptosis and create new vessels that nourish them.
Cancer is difficult to cure because of its ability to spread into different parts of
body. The standard treatment methods consist of chemotherapy, radiotherapy,
surgery, but none of these can be one hundred percent successful. The scientists try
to come out with new methods of treatment, which would be more effective. One
of such a potential treatment is gene therapy using mesenchymal stromal cells as
delivery vehicles for anticancer substances.
22
Material and methods
Stem cells
Stem cells are a class of undifferentiated cells that are able to differentiate into
specialized cell types. Commonly, stem cells come from two main sources:
embryos formed during the blastocyst phase of embryological development
(embryonic stem cells), and adult tissue (adult stem cells). Both types are generally
characterized by their potency, or potential to differentiate into different cell types
(such as skin, muscle, bone, etc.).
Embryonic stem cells
Embryonic stem cells are derived from a four- or five-day-old human embryo that
is in the blastocyst phase of development. Embryonic stem cells (ESC) are
pluripotent, which means that they are able to differentiate into all cell types of
human body, but it is not possible to create a new individual from them. ESC
develops from the zygote, a totipotent stem cell able to differentiate into all
specialised cell types.
Adult stem cells
Adult or somatic stem cells exist throughout the body after embryonic
development, and are found inside of different types of tissue. These stem cells
have been found in tissues such as the brain, bone marrow, blood, blood vessels,
skeletal muscles, skin, and the liver. They remain in a G0 phase until activated by
disease or tissue injury. Adult stem cells divide into one stem cell (identical to
mother cell) and one specialised cell. It is generally thought that adult stem cells
are limited in their ability of differentiation (tissue-specialised), but there is some
evidence to suggest that they can differentiate to become other cell types. They are
multipotent.
Mesenchymal stem cells
MSC are multipotent, adult stem cell, which means that they can differentiate into
various specialised cell types. They are usually isolated from bone marrow or
adipose tissue. They are important cell population with unique properties:
1. MSC can be easily isolated and cultivated in large quantities.
2. They are able to differentiate into a wide variety of specialised cell
types.
3. They have anti-inflammatory properties and they do not provoke
immune reaction.
4. MSC can find and repair damaged tissue.
Thanks to these properties MSC are regarded suitable for gene therapy or
regenerative medicine. It has been found that MSC recognize tumours as injured
tissues, so they try to repair it. This can contribute to tumour growth, but the
scientists of experimental oncology have been trying to use the ability of MSC to
selectively navigate to tumour for delivery of anticancer drugs, genes or viruses.
Gene therapy and MSC
23
Gene therapy is a modality of treatment, when the sequence of DNA, that does not
work properly or is missing, is replaced in genome of the patient. One of the ways
how to integrate DNA to patient`s genome is the use of retroviruses, which contain
the spoiled gene. However, this method of using viruses as vehicles for a
therapeutic gene has shown to have more disadvantages than advantages. The
penetration of virus to the tumour is limited and immune system can start to fight
against the virus. These obstacles can be overcome by use of MSC as vehicles for
therapeutic genes. This potential method of treatment is based on the ability of
MSC to travel towards the tumour.
The therapeutic gene is integrated into MSC by the virus. Modified MSC are
handed to the patient. They get to the tumour and subsequently the non-toxic
prodrug is systemically administered into the patient. The therapeutic gene within
MSC produces enzyme that transfer non-toxic prodrug to highly toxic
chemotherapeutic, which kills tumour cells, and later also the MSC carrying the
gene.
Results and discussion
Our project
The practical part of our project involves co-operation with Cancer Research
Institute. They offered us the information about stem cells, the way how they try to
evolve the treatment and also the information about behaviour of cancer cells. We
had an opportunity to visit the laboratory, tried taking care about cells, and
observed them under the fluorescence microscope.
Figure 1: Maintenance of the cell culture
Figure 2: Observation of cancer cells in the
fluorescence microscope
We organized the field trip to Cancer Research Institute from our school. Our
students had a chance to participate in pipetting competition (Fig. 3 and 4). We saw
different equipment that is used in research and diagnostics of patients` samples.
We also made the video of our visits in Cancer Research Institute and presented
this project in front of students and teachers of Private Grammar School in Žilina.
24
Figure 3, 4: The students` visit of Cancer Research Institute
Conclusions
Cancer remains a disease without ideal cure. It is mainly because there are so many
types of cancer and each of them insists different type of therapy. In summary, the
potential use of MSC in cancer treatment has just started, but as the attempts have
shown, they could be very useful as a part of anticancer therapy in the future. The
gene therapy with the use of MSC seems to be a very promising treatment for a
cancer. One of the biggest positives of this method could be the elimination of the
side effects of chemotherapy, such as nausea or hairloss. We wanted our project to
show off the cancer issue, but mainly we wanted to inform people about efforts to
develop a successful cancer treatment here in Slovakia.
Acknowledgements
Besides co-authors, K. Tomašcová and L. Golierová, I would like to thank to Mgr.
L. Kučerová, PhD., for her permission to visit the Laboratory of Molecular
Oncology, and Mgr. Erika Ďuriníková, who was our consultant and helped us with
our project.
References
[1]
http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/Sites-Types/metastatic
[2]
http://www.medicalnewstoday.com/info/cancer-oncology/
[3]
http://www.cancer.gov/cancertopics/treatment
[4]
http://www.cancerresearchuk.org/cancer-help/about-cancer/what-iscancer/grow/how-a-cancer-spreads
[5]
http://www.cancerresearchuk.org/cancer-help/about-cancer/what-iscancer/grow/how-a-cancer-grows
[6]
http://cancer.stanford.edu/information/cancerTreatment/methods/
[7]
http://www.cancerresearchuk.org/cancer-help/about-cancer/treatment/
[8]
http://en.wikipedia.org/wiki/Cancer
[9]
doc. Ing. Čestmír Altaner, DrSc., Bunková a molekulárna biológia
rakoviny, Liga proti rakovine SR, 2009, ISBN 978-80-89201-40-2
25
Rakovina pažeráka a žalúdka v dnešnej dobe
Alžbeta Janasová
Gymnázium Hlinská 29, 011 80 Žilina
Úvod
Cieľom mojej práce je zamerať sa na príčiny a všeobecné dôsledky vzniku
rakoviny pažeráka a žalúdka. V dnešnej uponáhľanej dobe sa ľudia nepozerajú na
svoj jedálny lístok, nedbajú na zdravý životný štýl, stravujú sa v rýchlych
občerstveniach radšej, než by obedovali teplý obed. Napriek tomu, že je v dnešnej
dobe pomerne dosť rozšírené fitnes, mnohí ľudia trpia na choroby ako obezita,
cukrovka a pod. Mladí ľudia v dnešnej dobe už nedbajú na to, ako ich správanie
a konanie v nočných baroch, puboch alebo iných pohostinstvách pôsobí na ich
zdravie. Fajčenie a pitie alkoholu je dnes medzi mladými považované za skôr
„frajerinu“ a smutné je, že vek, kedy začínajú mladí s pitím a fajčením sa z roka na
rok znižuje. Je všeobecne známe, že práve fajčenie, alkohol, drogy a nesprávne
stravovanie sú faktory, ktoré prispievajú k tvorbe nádorov. Dnešná moderná doba
ponúka mnoho zdrojov informácií, či už na internete alebo v odborných knihách,
ktoré sú voľne dostupné.
Ochorenie postihuje prevažne osoby stredného a vyššieho veku. Závažnosť
choroby je podmienená jej plazivým priebehom, nevýraznými prejavmi v
počiatočných štádiách, čo je príčinou toho, že sa ochorenie zistí neraz v pokročilom
stave. Častá je invalidizácia chorých, ale aj metastázovanie, najmä do pečene. Ani
jedno z týchto ochorení nie je prístupné priamemu vyšetreniu zrakom ani
pohmatom. I to je spolu s nevenovaním dostatočnej pozornosti varovným signálom
ochorenia príčinou, že mnoho chorých prichádza k lekárovi s pokročilejším
ochorením, čím sa zmenšujú vyhliadky na vyliečenie [1].
Materiál a metódy
Vďaka pani Bc. Pavlíne Čierňavovej som mala možnosť čerpať z rôznych
internetových stránok, na ktorých možno nájsť rôzne informácie z hľadiska
zdravotníctva, medicíny, zdravého životného štýlu, výskumov a pod. Boli to aj
zahraničné internetové stránky, ktoré som vďaka odporúčaniu našla a z časti aj
využila. Sú tomu tak napríklad stránka http://www.nczisk.sk/Pages/default.aspx, na
ktorej som mala prístup ku štatistickým zisteniam v priebehu niekoľkých rokov.
26
Takisto zo stránky http://www.lefa.sk/internet/nefajc/fajc_zdrav.htm som mala
možnosť čerpať informácie o percentuálnom výskyte rakoviny a predovšetkým do
akej miery (uvedené v %) vplýva fajčenie na tvorbu rakoviny pažeráka a žalúdka.
Kľúčové slová, ktoré som používala pri hľadaní, či už na internetových portáloch,
ale aj v Mestskej knižnici v Žiline, ďalej už len v knižnici sú: rakovina pažeráka
a žalúdka; štatistika úmrtnosti obyvateľstva na rakovinu žalúdka a pažeráka;
onkologické ochorenia tráviacej sústavy; rakovina. V knižnici som mala možnosť
nájsť mnohé publikácie, využila som: Vladimír Chládek: Rakovina horních
dýchacích a polykacích cest a hrtanu,1985; Ľubomír Marko, Rudolf Moravec,
Čestmír Neoral a kolektív autorov: Chirurgia pažeráka a žalúdka minulosť
a miniinvazívna chirurgia a endoskopia súčasnosti, 2007.
Na nižšie uvedených webových stránkach som si mala možnosť preštudovať
problematiku, potencionálne príčiny, a takisto aj dôsledky rakoviny pažeráka
a žalúdka [1,2,3].
Výsledky
Svojím skúmaním som zistila, že rakovina, teda zhubné nádory, ktoré sa vyskytujú
v oblasti pažeráka a žalúdka tvoria viac ako 13% všetkých zhubných nádorov.
Rakovina žalúdka tvorí takmer 10% z výskytu ostatných druhov rakovín. Smutné
je, že je každoročne zaznamenaný vzostup výskytu rakoviny pažeráka, svetlou
stránkou je, že výskyt rakoviny žalúdka klesá. Prispieva k tomu určite aj
zvyšovanie záujmu ľudí v mladom, strednom ba dokonca už aj v staršom veku
o šport, zdravú stravu, kampaniam proti nadváhe a fajčeniu. Paradoxom je, že
jedným z hlavých dôvodov prečo stúpa výskyt rakoviny pažeráka je ten, že
obyvateľstvo začína v mnohých prípadoch fajčiť už mladom veku a stáva sa
tuhými fajčiarmi. Častí výskyt je zaznamenaný aj u ľudí, ktorých príbuzní na túto
chorobu zomreli, prípade sa počas svojho života na ňu liečili.
Veda napreduje a vedci dokázali, že napr. určité látky, ktoré obsahuje zelený čaj
znižujú riziko tvorby a výskytu rakoviny pažeráka a žalúdka. Zistilo sa, že rakovina
pažeráka sa vyskytuje u strednej a staršej vrstvy obyvateľstva, čo predstavuje vek
od 45 do 70 rokov, pričom rakovina žalúdka sa vyskytuje predovšetkým u staršej
vrstvy obyvateľstva, čo predstavuje vek 60 a viac rokov. Dôvodom je, že rakovina
metastázuje veľmi pomaly a nemá veľa symptómov, často sa jej výskyt zistí
neskoro, keď už napadla iné orgány v tele a rozšírila sa.
Hlavné príčiny tvorby rakoviny pažeráka sú tabak, alkohol, Baretov pažerák, ktorý
je známy ako „pálenie záhy“, strava chudobná na ovocie, zeleninu, vlákninu,
vitamíny a minerály, takisto aj obezita. Štatistiky dokazujú, že v dnešnej dobe
zomiera na rakovinu pažeráka takmer o tretinu viac mužov ako žien.
Symptómy [3]:
 Ťažkosti pri prehltávaní, najmä pri jedení mäsa, chleba alebo surovej zeleniny
dokonca aj pitie tekutiny môže byť bolestivé.
 Tlak a pálenie v hrudníku
 Pocit zlého trávenia a pálenie záhy
27
 Zvracanie
 Časté dusenie sa potravou
 Úbytok hmotnosti
 Kašeľ a chrapot
 Bolesť v hrudnej kosti alebo v hrdle

Najbežnejšou liečbou rakoviny pažeráka je chirurgický zákrok, po ktorom
nasleduje rádioterapia, čiže ožarovanie, a takisto aj chemoterapia. Pri neskorom
zistení výskytu menovaného druhu rakoviny je liečba rádioterapiou a samotnou
chemoterapiou, ktoré pomáhajú zmierniť bolesti pacienta.
Obrázok 1: Pokročilé štádium karcinómu pažeráka
Rakovina žalúdka má taktiež ako rakovina pažeráka vyšší výskyt u mužskej
populácie než ženskej, je to takmer dvojnásobok. Faktory, ktoré vplývajú na vznik
rakoviny žalúdka sú nezdravá strava (presoľovanie jedál, nadmerné konzumácie
jedál – vznik obezity, nedostatok ovocia, zeleniny, vlákniny, vitamínov, minerálov
a pod.), alkohol a tabak, genetické mutácie, chirurgický zákrok žalúdka
v minulosti. V dnešnej dobe je častou príčinou aj pracovná expozícia.
Obrázok 2: Rakovina žalúdka
Symptómy [2]:
 Poruchy trávenia alebo pálenie záhy
 Bolesti brucha alebo dyskomfort
 Nevoľnosť a zvracanie
28
 Hnačka alebo zápcha
 Nafukovanie po jedle
 Nechutenstvo
Symptómy, ktoré sa môžu vyskytnúť v pokročilom štádiu:
 Slabosť a únava
 Zvracanie krvi alebo prímesi krvi v stolici
 Chudnutie
Liečba rakoviny žalúdka je podobná ako pri rakovine pažeráka. Chirurgický zákrok
a následná rádioterapia a chemoterapia. V pokročilom štádiu karcinómu žalúdka sa
rakovina šíri a napáda ďalšie orgány. Lieči sa rovnako ako počiatočné štádium.
Táto liečba taktiež pomáha zmierniť príznaky ochorenia.
Diskusia a záver
Po získaní nových poznatkov o vyššie uvedených ochorenia si myslím, že
v dnešnej „modernej“ dobe je informovanosť a možnosti vyvarovať sa daným
ochorenia vysoká, lenže chybou je, že obyvateľstvo to berie na ľahkú váhu, hoci
vidí alarmujúce čísla. V tejto dobe má populácia obyvateľstva veľké množstvo
možností, ako sa chrániť od nielen týchto ochorení. Dôležité je, aby ľudia začali
dbať o svoje zdravie. Je smutné, že veľmi malé množstvo ľudí tak činí. Pozitívom
je však to, že toto malé množstvo z roka na rok rastie. Určite stojí za zamyslenie
sa, prečo v minulosti sa všeobecne nevyskytovalo v tak veľkej miere ochorenie
karcinómu žalúdka a pažeráka.
Poďakovanie
Moje osobitné poďakovanie patrí pani Ing. Jarmile Turoňovej, ktorá mi dala
podnet, aby som sa podujala napísať túto prácu, takisto pani Bc. Pavlíne
Čierňavovej, ktorá mi poskytla informácie o mnohých internetových a literárnych
zdrojov, z ktorých som mala možnosť čerpať. Samozrejme ďakujem organizátorom
a všetkým, ktorí sa podieľajú na organizácii tejto súťaže. Chcela by som sa ešte
poďakovať mojím spolužiakom Danielovi Žigmundovi a Paulíne Ďurčanskej, ktorí
sa do tejto súťaže rozhodli takisto ísť a nenechali ma v tom samú.
Zoznam použitej literatúry
[1]
http://www.radioterapia.szm.com/info/rakovina_pazeraka_a_zaludka.pdf
[2]
http://www.npop.sk/typy-karcinomu/karcinom-zaludka/
[3]
http://www.npop.sk/typy-karcinomu/karcinom-pazeraka/
[4]
http://www.onkologia.infoma.sk/endoskopicka-liecba-pokrocilehokarcinomu-pazeraka/
[5]
http://kiat-gastrointestinal-surgeon.com/?page_id=396
[6]
Ľubomír Marko, Rudolf Moravec, Čestmír Neoral a kolektív autorov:
Chirurgia pažeráka a žalúdka minulosť a miniinvazívna chirurgia
a endoskopia súčasnosti, 2007
[7]
Vladimír Chládek: Rakovina horních dýchacích a polykacích cest a hrtanu,
1985
29
Kategória
Mladý výskumník do 35 rokov s ukončeným PhD.
30
Nesteroidné antiflogistiká ako látky
modulujúce účinnosť vybraných
terapeutických prístupov v liečbe nádorových
ochorení. Dokážu pomôcť alebo nie?
Rastislav Jendželovský, Zuzana Jendželovská, Lucia
Hiľovská, Ján Kovaľ, Jaromír Mikeš, Peter Fedoročko
Prírodovedecká fakulta, Univerzita Pavla Jozefa
Šafárika v Košiciach, Ústav biologických a ekologických
vied, Moyzesova 11, 040 01 Košice
Úvod
V súčasnosti sa v protinádorovej terapii uplatňuje viacero stále sa zdokonaľujúcich
liečebných postupov, no vzhľadom k rôznorodosti a komplexnosti onkologických
ochorení býva liečba častokrát neúspešná. Jedným z dôležitých faktorov pri zlyhaní
chemoterapeutickej liečby je vznik mnohopočetnej liekovej rezistencie (MDR).
Vznik MDR častokrát úzko súvisí so zvýšenou expresiou a aktivitou ABC
transportných molekúl. Za posledných 12 rokov pribudlo niekoľko dôkazov aj o
vplyve nesteroidných antiflogistík (NSAIDs) na aktivitu transportných proteínov.
Modulácia MDR v dôsledku alterácie transportných proteínov prostredníctvom
NSAIDs by mohla mať významný prínos v protinádorovej terapii. Na základe
predošlých výsledkov dosiahnutých na našom pracovisku, ako aj výsledkov iných
štúdií, je možné predpokladať, že NSAIDs sú schopné obmedziť rezistenciu
nádorových buniek prostredníctvom inhibície transportných proteínov. Naše
predošlé výsledky poukazujú na inhibičný vplyv inhibítora P450 monooxygenáz,
proadifenu, voči transportným proteínom MRP1 a BCRP [1]. Na základe týchto
zistení sme sa rozhodli detailnejšie preskúmať, či inhibíciou aktivity transportných
proteínov dokáže proadifen potlačiť rezistenciu na v praxi často aplikované
chemoterapeutiká, cisplatinu a mitoxantron.
Materiál a metódy
Bunkové línie
V experimentoch boli použité bunkové línie ľudského ovariálneho adenokarcinómu
A2780 (parentálna, senzitívna voči cisplatine), A2780cis (odvodená, rezistentná
voči cisplatine) a ľudskej promyelocytovej leukémie HL-60 (senzitívna voči
mitoxantronu) a PLB-ABCG2 (rezistentná voči mitoxantronu). Bunky boli
kultivované za štandardných podmienok (37°C, 95% vlhkosť, 5% CO2) v médiu
RPMI 1640 obohatenom o 10% fetálne hovädzie sérum (FBS) a antibiotiká
(penicilín, streptomycín, amfotericín). Následne boli bunky vystavené vplyvu
xenobiotík a podrobené procedúram podľa experimentálnej schémy.
Metabolická aktivita buniek
MTT (3-(4,5-dimetyltiazolyl)-2,5-difenyltetrazolium bromid; 0,5 mg.ml-1), ktorý
živé bunky metabolizujú na kryštalický formazán sfarbený do fialova bol k bunkám
31
pridaný v súlade s experimentálnou schémou. Po štvorhodinovej inkubácii bol na
zastavenie metabolizácie MTT a zároveň rozpustenie vzniknutých kryštálov
formazánu pridaný 10% roztok dodecylsulfátu sódneho (SDS). Absorbancia
rozpusteného formazánu bola zmeraná nasledujúci deň spektrofluoroluminometrom
FluoStar Optima pri vlnovej dĺžke 585 nm.
Externalizácia fosfatidylserínu a viabilita
Adherentné a plávajúce bunky boli zozbierané v súlade s experimentálnou
schémou, ofarbené s Annexin V-FITC (0,75 μg.ml-1) 20 min. v tme pri izbovej
teplote, opláchnuté, ofarbené s propídium jodidom (1 μg.ml-1) najmenej 5 min. a
následne analyzované pomocou prietokového cytometra BD FACSCalibur.
Mitochondriálny membránový potenciál
Trypsinizáciou zozbierané bunky boli opláchnuté v PBS (fosfátový pufrovaný
roztok), následne resuspendované v HBSS („Hankov“ soľný roztok) s obsahom 0,1
μmol.dm-3 TMRE (tetrametylénrodamín etyl ester) a inkubované 30 min. v tme pri
izbovej teplote. Po opláchnutí boli bunky resuspendované v 500 μl celkového
objemu HBSS. Fluorescencia bola analyzovaná prietokovým cytometrom BD
FACSCalibur.
Western blot
Lyzáty buniek pre analýzu hladiny proteínov metódou Western blot boli pripravené
v súlade s experimentálnou schémou s využitím komerčnej zmesi inhibítorov
proteáz. Proteíny (30 μg), kvantifikované s využitím komerčnej sady (BioRad
Laboratories) boli oddelené pomocou polyakrylamidovej elektroforézy (SDSPAGE) a transportované na PVDF membrány. Po 1 hod. inkubácii v tlmivom
roztoku obsahujúcom 5% sušeného mlieka rozpusteného v preplachovacom
roztoku (TBS-TWEEN, pH 7,2) boli membrány inkubované 2 hod. pri laboratórnej
teplote (alebo cez noc pri 4 °C) s primárnou protilátkou. Po 20 min. preplachovaní
v roztoku TBS-TWEEN boli membrány inkubované adekvátnou sekundárnou
protilátkou 1 hod. pri laboratórnej teplote. Imunodetekcia hladiny jednotlivých
analyzovaných proteínov bola stanovená pomocou chemiluminiscenčného kitu
ECLplus v tmavej komore na RTG film.
Výsledky a diskusia
V poslednom období pribúda čoraz viac dôkazov o vplyve nesteroidných
antiflogistík na aktivitu ABC transportných proteínov. V prevažnej miere sa jedná
o pôsobenie selektívnych alebo neselektívnych inhibítorov cyklooxygenázy-1
(COX-1) a cyklooxygenázy-2 (COX-2) na expresiu a aktivitu P-glykoproteínu (Pgp) alebo iného proteínu súvisiaceho s MDR (MRP2). Aplikácia týchto látok
(celekoxib, JTE-522, NS-398, indometacín) viedla k zvýšeniu citlivosti nádorových
buniek voči rôznym chemoterapeutikám (doxorubicín, vinkristín, imatinib,
cisplatina, mitoxantron) [2-6].
V experimentoch zameraných na aplikáciu proadifenu a cisplatiny na bunkových
líniách ovariálneho adenokarcinómu A2780 a A2780cis sme zistili, že vplyvom
proadifenu došlo k významnej zmene citlivosti buniek A2780cis na cisplatinu.
32
Dokázali sme, že kombinácia proadifenu s cisplatinou vyvoláva signifikantný
pokles metabolickej aktivity, mitochondriálneho membránového potenciálu a
nárast sekundárne nekrotickej populácie buniek. Tento efekt nebol zaznamenaný v
materskej bunkovej línii A2780. Detekcia hladiny antiapoptotických proteínov
poukázala na koreláciu medzi nárastom bunkovej smrti a poklesom hladiny daných
proteínov. Podobné výsledky sme v prípade markerov bunkovej smrti dosiahli aj
pri kombinácii proadifenu s dobre známym a silným substrátom proteínu BCRP,
mitoxantronom, v rezistentných bunkách PLB-ABCG2.
Napriek pozitívnym zisteniam aj z in vivo modelov [7,8] sú výsledky klinických
testov zaoberajúcich sa COX-2 inhibítormi v kombinácii s chemoterapiou zatiaľ
rozporuplné [9,10]. Na základe nami dosiahnutých výsledkov môžeme
konštatovať, že jedným z kandidátov pre in vivo štúdie je proadifen, NSAID
inhibujúce cytochróm P450 monooxygenázy. Naše doterajšie in vitro štúdie
poukazujú na možné využitie proadifenu ako v monoterapii, tak aj za účelom
zvýšenia citlivosti rezistentných nádorov na aplikované fotosenzibilizátory
(hypericín) a cytostatiká (cisplatina, mitoxantron), ktorých pôsobenie môže byť
negatívne ovplyvnené transportnými proteínmi MRP1, MRP2 a BCRP.
Poďakovanie
Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe
zmluvy č. APVV-0040-10, Vedeckou grantovou agentúrou MŠVVaŠ SR a SAV č.
VEGA 1/0626/11, Nadáciou Výskum rakoviny na základe zmluvy
č. O-12-102/0001-00 a VVGS UPJŠ v Košiciach na základe zmluvy č. VVGS-PF2012-32.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Jendželovský R, Mikeš J, Kovaľ J, Souček K, Procházková J et al. Drug
efflux transporters, MRP1 and BCRP, affect the outcome of hypericinmediated photodynamic therapy in HT-29 adenocarcinoma cells.
Photochem Photobiol Sci. 2009; 8: 1716-1723.
[2]
Kang HK, Lee E, Pyo H, Lim SJ. Cyclooxygenase-independent downregulation of multidrug resistance-associated protein-1 expression by
celecoxib in human lung cancer cells. Mol Cancer Ther. 2005; 4: 13581363.
[3]
Yan YX, Li WZ, Huang YQ, Liao WX. The COX-2 inhibitor Celecoxib
enhances the sensitivity of KB/VCR oral cancer cell lines to Vincristine by
down-regulating P-glycoprotein expression and function. Prostaglandins
Other Lipid Mediat. 2012; 97: 29-35.
[4]
Arunasree KM, Roy KR, Anilkumar K, Aparna A, Reddy GVet al.
Imatinib-resistant K562 cells are more sensitive to celecoxib, a selective
COX-2 inhibitor: role of COX-2 and MDR-1. Leuk Res. 2008; 32: 855-64.
[5]
Suqiura T, Saikawa Y, Kubota T, Suqanuma K, Otani Y et al. Combination
chemotherapy with JTE-522, a novel selective cyclooxygenase-2 inhibitor,
33
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
and cisplatin against gastric cancer cell lines in vitro and in vivo. In Vivo.
2003; 17: 229-233.
Elahian F, Kalalinia F, Behravan J. Evaluation of indomethacin and
dexamethasone effects on BCRP-mediated drug resistance in MCF-7
parental and resistant cell lines. Drug Chem Toxicol. 2010; 33: 113-119.
Awara WM, El-Sisi AE, El-Sayad ME, Goda AE. The potential role of
cyclooxygenase-2 inhibitors in the treatment of experimentally-induced
mammary
tumour: does celecoxib enhance the anti-tumour activity of
doxorubicin? Pharm Res. 2 004; 50: 487-498.
Hattori K, Matsushita R, Kimura K, Abe Y, Nakashima E. Synergistic
effect of with adriamycin and cisplatin on tumor growth. Biol Pharm Bull.
2001; 24: 1214-1217.
Altorki NK, Keresztes RS, Port JL, Libby DM, Korst RJ et al. Celecoxib,
a selective cyclo-oxygenase-2 inhibitor, enhances the response to
preoperative paclitaxel and carboplatin in early-stage non-small-cell lung
cancer. J Clin Oncol. 2003; 14: 2645-2650.
Koch A, Bergman B, Holmberg E, Sederholm C, Ek L et al. Effect of
celecoxib survival in patients with advanced non-small cell lung cancer: a
double blind randomised clinical phase III trial (CYCLUS study) by the
Swedish Lung Cancer Study Group. Eur J Cancer. 2011; 47: 1546-1555
34
Nový potenciálny mechanizmus
protinádorovej imunitnej odpovede
vyvolaný fotodynamickou terapiou
Lucia Kuliková1,2, Veronika Sačková1 a Peter Fedoročko1
1
Ústav biologických a ekologických vied, Prírodovedecká
fakulta, Univerzita P. J. Šafárika v Košiciach,
Moyzesova 11, Košice (experimentálne pracovisko)
2
Ústav experimentálnej medicíny, Lekárska fakulta,
Univerzita P. J. Šafárika v Košiciach, Trieda SNP 1,
Košice 040 11 (súčasné pracovisko)
Úvod
Rakovina sa považuje za ochorenie, ktoré vzniká ako dôsledok neschopnosti
imunitného systému rozpoznať a zničiť nádorové bunky, čo vedie k rozvoju tohto
ochorenia a následne k vzniku metastáz. Nádorové bunky môžu na svojom povrchu
vystavovať určité množstvo špecifických nádorových antigénov. Tento fakt obrátil
pozornosť výskumníkov na imunoterapiu nádorov. Fotodynamická terapia (PDT)
je účinná liečebná metóda používaná v boji proti rakovine nielen pre svoj lokálny
cytotoxický efekt, ale aj pre svoj imunostimulačný, resp. imunomodulačný účinok
v rámci celého organizmu. Molekulové šaperóny, proteíny tepelného šoku
a proteíny regulované glukózou sú spájané so zlou prognózou liečby nádorových
ochorení, pričom niektoré z týchto molekúl majú aj schopnosť sprostredkovať
vystavenie antigénov na povrchu buniek. Takouto pronádorovou molekulou je
vďaka svojej šaperónovej aktivite napríklad proteín regulovaný glukózou
GRP94/gp96, ktorý sa nachádza v endoplazmatickom retikule eukaryotických
organizmov. Zároveň je to proteín, ktorý môže aktivovať antigén-špecifickú
imunitnú odpoveď a prejaviť tak svoj protinádorový účinok. Keď sa po poškodení
bunky fotodynamickým zásahom uvoľní obsah bunky do okolia, komplexy
proteínu GRP94/gp96 a antigénov asociovaných s tumorom môžu aktivovať
imunitný systém cez exogénnu dráhu prezentácie antigénu sprostredkovanej
antigén-prezentujúcimi bunkami, kde nastáva prezentácia antigénu prostredníctvom
HLA-molekúl triedy II. Existuje aj možnosť endogénnej aktivácie imunitného
systému sprostredkovanej HLA-molekulami triedy I. Je možné, že intracelulárne
nádorové antigény, ktoré sú pre imunitný systém nedostupné, by mohli byť
transportované na povrch nádorovej bunky priamo pomocou oligomérnych
molekúl proteínu GRP94/gp96. Presný mechanizmus transportu proteínu
GRP94/gp96 na povrch bunky, ako aj mechanizmus tvorby oligomérov, nebol
doteraz objasnený. Predpokladáme však, že zvýšená hladina negatívneho
prognostického markera GRP94/gp96 by mohla byť využitá v prospech zdravia
pacientov práve pomocou fotodynamickej terapie, ktorá vyvoláva tvorbu
vysokomolekulárnych komplexov/oligomérov GRP94/gp96.
35
Materiál a metódy
Bunková línia
Bunky adenokarcinómu hrubého čreva HT-29 (ATCC, Rockville, MD, USA) boli
kultivované v kompletnom médiu RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA)
doplnenom antibiotikami a 10% fetálnym kravským sérom (FCS; PAA
Laboratories GmbH, Linz, Rakúsko) pri 37°C a 95% vlhkosti v 5% atmosfére CO2.
Aktivácia hypericínu
Fotoaktivácia hypericínu (4,5,7,4´,5´,7´-hexahydroxy-2,2´- dimetylnaftodiantrón;
HPLC grade), AppliChem GmbH, Darmstadt, Nemecko) bolo uskutočnená
svetelným zariadením pozostávajúcim z jedenástich žiariviek L18W/30 (Osram,
Berlín, Nemecko) s maximom emisie zhodujúcim sa s absorpčným maximom
hypericínu ~ 600 nm. Svetelná dávka bola priamo úmerná dĺžke času fotoaktivácie
hypericínu pri výkone 3,15 mW.cm-2.
Experimentálna schéma
Bunky HT-29 boli kultivované 24 h v kompletnom médiu s 10% FCS. Následne
boli 16 h kultivované s hypericínom (60 nM) v tmavých podmienkach. Jednotlivé
analýzy boli prevedené 1 h a 24 h po fotoaktivácii hypericínu jednorázovou
svetelnou dávkou (0, 1, 2, 4, 8 alebo 12 J.cm-2).
V ďalšom experimentálnom modeli bol k bunkám 1 h pred fotoaktiváciou
hypericínu (100 nM) svetelnou dávkou 4,4 J.cm-2 pridaný Manumycín A (15 μM)
a následne boli analýzy prevedené v rôznych časových intervaloch po PDT (1, 3, 6
alebo 24 hod) [1].
Analýza Western blot
Bunky podrobené experimentálnym procedúram podľa experimentálnych schém
boli zozbierané 1, 3, 6 alebo 24 h po fotoaktivácii hypericínu. Bunky boli premyté
studeným PBS a lyzované lyzačným roztokom (100 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1%
SDS; 10% glycerol a proteázový inhibítorový kokteil P2714 (Sigma-Aldrich
Corporation, St. Louis, MO, USA)) 10 min na ľade. Lyzáty boli sonikované a
centrifugované. Na detekciu koncentrácie proteínov bol použitý detergentkompatibilný proteínový test (BioRad Laboratories Inc.). Vzorky boli nariedené na
rovnaký obsah proteínov (30 - 50 μg proteínov) s 0,01% brómfenolovou modrou a
1% 2-merkaptoetanolom, potom boli separované na SDS-polyakrylamidovom géli
a prenesené na nitrocelulózovú membránu (Advantec, Tokyo, Japonsko) alebo
PVDF membránu (Millipore, Bedford, MA, USA) v transfer pufri s obsahom 192
mM glycínu, 25 mM Tris a 10% metanolu. Membrána bola blokovaná v 5%
nízkotučnom mlieku v tlmivom roztoku TBS (20 mM Tris-HCl, pH=7.6; 150 mM
NaCl; 0.05% TWEEN 20, pH=7.4) počas 1 h pri izbovej teplote a potom bola
blotovaná membrána inkubovaná 2 h pri izbovej teplote alebo celú noc pri 4 °C (v
závislosti od použitej protilátky) s primárnou protilátkou anti-GRP94 (sc-1794;
Santa Cruz Biotechnology, Nemecko). Na overenie rovnakej koncentrácie
proteínov vo vzorkách bol použitý β-aktín (A5441, Sigma-Aldrich). Po 30 min
premývania v premývacom roztoku boli membrány inkubované so sekundárnou
protilátkou 1 h pri izbovej teplote (AntiGoat IgG-HRP (1:20 000), AntiMouse IgGHRP, NA931 (1:3000); Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Reaktivita
36
sekundárnej protilátky bola stanovená pomocou chemiluminiscenčného kitu
ECLplus (Amersham) v tmavej komore na RTG filme (FOMA SLOVAKIA s.r.o.,
Skýcov, Slovenská republika). Počas celej experimentálnej procedúry a prípravy
proteínových lyzátov boli vzorky držané pri teplotách nepresahujúcich 37 °C.
Výsledky
Jav oligomerizácie proteínu GRP94/gp96 bol popísaný v podmienkach s vysokými
teplotami [2,3] alebo pôsobením ligandu [2]. My sme však prvýkrát poukázali na
tvorbu
vysokomolekulových
komplexov/oligomérov
GRP94/gp96
za
nedenaturačných podmienok pri PDT s hypericínom v závislosti od svetelného
režimu [4] a svetelnej dávky. Tento jav bol pozorovaný a demonštrovaný analýzou
proteínov pomocou Western blotu v rôznych na sebe nezávislých experimentoch
realizovaných na ľudskej bunkovej línii adenokarcinómu hrubého čreva HT-29.
Vplyv svetelnej dávky na oligomerizáciu GRP94/gp96. So zvyšujúcou sa
svetelnou dávkou (1, 2, 4, 8 alebo 12 J.cm-2) sa zvyšovala aj hladina
vysokomolekulových komplexov proteínu GRP94/gp96 s molekulovou
hmotnosťou výrazne vyššou ako 200 kDa, čo bolo pozorované 1 h až 24 h po PDT.
Je dôležité podotknúť, že v experimentánej skupine, v ktorej nebol hypericín
fotoaktivovaný, sa tieto komplexy nenachádzali. Z výsledku vyplýva, že
oligomerizácia, resp. vznik vysokomolekulových komplexov závisí aj od svetelnej
dávky.
Vplyv zvýšenej syntézy proteínu GRP94/gp96 na jeho oligomerizáciu. Prírodný
produkt, selektívny inhibítor Ras farnezyltransferázy Manumycín A, zvýšil
hladinu proteínu GRP94/gp96 vo všetkých experimentálnych skupinách (24 h
analýza), ale bez tvorby vysokomolekulových komplexov pri monoterapii.
Kombinácia Manumycínu A a hypericínu spôsobila pokles hladiny proteínu
GRP94/gp96 a vysokomolekulových komplexov v porovnaní s hladinou proteínu
resp. vysokomolekulových komplexov v skupine so samotným hypericínom vo
všetkých časových intervaloch analýzy (1, 3, 6 a 24 h). Z výsledku vyplýva, že
zvýšená syntéza proteínu GRP94/gp96 nemusí byť automaticky sprevádzaná aj
vznikom vysokomolekulových komplexov proteínu GRP94/gp96.
Diskusia
Oligomerizácia je sprevádzaná konformačnými zmenami molekúl, zvýšením
šaperónovej aktivity, ako aj zvýšenou schopnosťou viazať proteíny [2]. Na
oligomerizáciu indukovanú tepelným šokom [2,3] alebo väzbou ligandu [2] pôsobí
inhibične napr. ATP alebo iné zlúčeniny obsahujúce adenozín, ktoré stabilizujú
molekulu GRP94/gp96 v inaktívnom stave [5,3]. Tiež je známe, že strata
inhibičného účinku na tvorbu oligomérov sa prejavuje buď len v prítomnosti
dvojmocných katiónov vápnika a horčíka alebo ATP, resp. pri ich neprítomnosti
[3]. Okrem toho bolo preukázané, že schopnosť proteínu GRP94/gp96 viazať
peptidy je regulovaná vápnikom. V rámci linkerovej domény, ktorá spája Cterminálnu doménu so strednou doménou molekuly GRP94/gp96 bolo
identifikované prinajmenšom jedno väzobné miesto s vysokou afinitou pre Ca2+
37
a niekoľko väzobných miest s nízkou afinitou [6]. Vzhľadom na tieto fakty
predpokladáme, že za fyziologických podmienok, kde sa udržiava homeostáza
vápnikových iónov a ATP (vápnikové katióny neutralizujú negatívne nabité
fosfátové skupiny), je oligomerizácia GRP94/gp96 v bunkovom systéme
inhibovaná.
Fotocytotoxický účinok hypericínu však môže deregulovať transport vápnika
oxidatívnym poškodením membrány. Bolo preukázané, že PDT s hypericínom,
ktorý sa kumuluje v membránových štruktúrach bunky, vyvoláva stratu natívneho
Ca2+-ATP-ázového proteínu sarko/endoplazmatického retikula (SERCA2), čo
vedie k poklesu hladiny vápnika. Strata vápnika môže viesť až k bunkovej smrti
[7]. Predpokladáme, že pokles alebo významné zmeny hladiny vápnika
a alebo/ATP v lumene endoplazmatického retikula môžu následne spôsobiť
uvoľňovanie vápnika z väzby so samotným proteínom GRP94/gp96, čím sa
odstráni inhibičný účinok ATP na vznik oligomérov tohto proteínu. Táto strata
vápnika z vápnikových väzobných miest v linkerovej doméne proteínu
GRP94/gp96 môže zároveň vyvolávať konformačnú zmenu molekuly spojenú
s oligomerizáciou a zvýšenou schopnosťou viazať a stabilizovať peptidy.
Ukázali sme, že v našom experimentálnom modeli je tvorba vysokomolekulových
komplexov/oligomérov GRP94/gp96 nezávislá na syntéze samotného proteínu a je
skôr dôsledkom narušenia homeostázy vnútorného prostredia bunky. Domnievame
sa, že GRP94/gp96 by mohol pôsobiť ako senzor citlivý na zmeny koncentrácie
vápnika a/alebo koncentrácie ATP intracelulárneho prostredia indukované
fotodynamickou terapiou s hypericínom, ktoré v konečnom dôsledku môžu viesť
k tvorbe vysokomolekulových komplexov so schopnosťou stimulovať vlastný
imunitný systém organizmu. Cielená, fotodynamickou terapiou riadená
oligomerizácia GRP94/gp96 by mohla byť novým potenciálnym nástrojom pre
moduláciu protinádorovej imunitnej odpovede alebo fotoimunoterapiu pomocou
tzv. "PDT-indukovaných intracelulárnych protinádorových vakcín". Taktiež by
mohla byť týmto spôsobom zvýšená účinnosť súčasných protinádorových vakcín.
Poďakovanie
Táto štúdia vznikla za finančnej podpory Slovenskej agentúry pre výskum a vývoj
v rámci riešenia projektov VVCE-0001-07 a APVV-0040-10.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Sackova V, Kulikova L, Kello M, Uhrinova I, Fedorocko P. Enhanced
antiproliferative and apoptotic response of HT-29 adenocarcinoma cells to
combination of photoactivated hypericin and farnesyltransferase inhibitor
manumycin A. Int J Mol Sci 2011; 12: 8388-8405.
[2]
Wassenberg J J, Reed R C, Nicchitta C V Ligand interactions in the
adenosine nucleotide-binding domain of the Hsp90 chaperone, GRP94. II.
Ligand-mediated activation of GRP94 molecular chaperone and peptide
binding activity. J Biol Chem 2000; 275: 22806-22814.
38
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
Thorne M E, McQuade K L. Heat-induced oligomerization of gp96 occurs
via a site distinct from substrate binding and is regulated by ATP. Biochem
Biophys Res Commun 2004; 323: 1163-1171.
Kulikova L, Mikes J, Hyzdalova M, Palumbo G, Fedorocko P. NF-kappaB
is not directly responsible for photoresistance induced by fractionated light
delivery in HT-29 colon adenocarcinoma cells. Photochem Photobiol 2010;
86: 1285-1293.
Chadli A, Ladjimi M M, Baulieu, E E, Catelli, M G. Heat-induced
oligomerization of the molecular chaperone Hsp90. Inhibition by ATP and
geldanamycin and activation by transition metal oxyanions. J Biol Chem
1999; 274: 4133-4139.
Biswas C, Ostrovsky O, Makarewich C A, Wanderling S, Gidalevitz T et al.
The peptide-binding activity of GRP94 is regulated by calcium. Biochem J
2007; 405: 233-241.
Buytaert E, Callewaert G, Hendrickx N, Scorrano L, Hartmann D, et al.
Role of endoplasmic reticulum depletion and multidomain proapoptotic
BAX and BAK proteins in shaping cell death after hypericin-mediated
photodynamic therapy. FASEB J: official publication of the Federation of
American Societies for Experimental Biology 2006; 20: 756-758.
39
Onkogénna mRNA expresia na predikciu
vážnej dysplázie, resp. karcinómu krčka
maternice u HPV16/18 pozitívnych
skvamóznych lézií
Veronika Holubeková1, Andrea Mendelová1,2, Pavol Žúbor2,
Ivana Kapustová2, Iveta Švecová2; Erik Kúdela2, Tatiana
Burjanivová1, Zora Lasabová1, Ján Danko2
1
Ústav molekulovej biológie, Jesseniova lekárska fakulta
v Martine, Univerzita Komenského v Bratislave
2
Gynekologicko-pôrodnícka klinika, Jesseniova lekárska
fakulta v Martine, Univerzita Komenského v Bratislave
Úvod
Karcinóm krčka maternice je na Slovensku druhé najčastejšie gynekologické
malígne ochorenie u žien vo veku 15-45 rokov. Včasné štádiá ochorenia sa dajú
odhaliť skríningovými metódami v rámci bežnej preventívnej gynekologickej
prehliadky. Počas vyšetrenia sa odoberie cytologický ster z krčka maternice
a farbením podľa Papanicolaoua sa sledujú morfologické zmeny buniek krčka
maternice. Karcinóm krčka maternice je však možné včasne detegovať a liečiť.
Ochorenie spôsobuje pretrvávajúca infekcia ľudským papilomavírusom (Human
Papillomavirus - HPV). Papilomavírusy sa šíria sexuálnym kontaktom a infikujú
bazálne keratinocyty, ktoré prinútia replikovať vírusovú DNA a formovať virióny.
Umožňuje to produkcia vírusových onkoproteínov E6 a E7, ktoré pôsobia na
tumorsupresorové proteíny bunkového cyklu (p53 a pRb). Výsledkom je
akumulácia chýb v bunkovej DNA a nekontrolované delenie buniek krčka
maternice [1]. V spojitosti so zvýšenou E6/E7 mRNA expresiou je aj bunkový
p16INK4a proteín, ktorý v HPV infikovaných bunkách nemá downstream efekt a
kumuluje sa v bunkách [2], zatiaľ čo v normálnych bunkách je v nízkej hladine.
Proteíny E6, E7 a p16INK4a sú sľubnými biomarkermi pri predikcii prenádorových
stavov, prípadne karcinómu krčka maternice.
Prítomnosť papilomavírusu a onkogénnu expresiu dokážu odhaliť len molekulárne
testy. Častejšie sledovanie podozrivých cervikálnych lézií a HPV DNA test je
súčasťou pravidelného skríningu. Na Slovensku je však skríning stále
oportunistický, a teda finančne a ekonomicky neefektívny. Bol tiež zaznamenaný
rastúci trend v mortalite rakoviny krčka maternice, čo je v porovnaní s ostatnými
európskymi krajinami nepriaznivé [3]. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť hladinu
p16INK4a mRNA expresie a prítomnosť E6 mRNA transkripcie u HPV16 a 18
pozitívnych vzoriek. Zamerali sme sa na kľúčovú hladinu, ktorá môže byť spojená
s ťažkou dyspláziou alebo karcinómom krčka maternice (histologicky cervikálna
intraepiteliálna neoplázia stupňa 3+ [CIN3+]).
40
Materiál a metódy
Klinické vzorky a extrakcia nukleových kyselín
Klinické vzorky boli odoberané dracénovým tampónom na Gynekologicko–
pôrodníckej klinike JLFUK a UNM v Martine a vyšetrované na Ústave
molekulovej biológie JLF UK vo Vrútkach. Pacientky boli oboznámené so štúdiou
a podpísali informovaný súhlas. Stery z krčka maternice boli získané od 134 žien
s léziou krčka maternice podľa Bethesda klasifikácie. Súbor tvorili skupiny s
atypickými skvamóznymi bunkami neurčitého významu (ASCUS, n=13),
nízkostupňovou skvamóznou intraepiteliálnou léziou (LSIL, n=55), atypickými
skvamóznymi bunkami, pričom nemožno vylúčiť HSIL (ASC-H, n=5),
s vysokostupňovou skvamóznou intraepiteliálnou léziou (HSIL, n=50) a so
skvamóznym karcinómom (SCC, n=11). Pacientky podstúpili kolposkopiu a odber
biopsie na histologické overenie diagnózy. Druhý súbor tvorilo 132 žien so
skvamóznym epitelom negatívnym na intraepiteliálnu léziu alebo malignitu
(NILM). Nukleové kyseliny boli extrahované pomocou komerčného kitu
(Epicentre Biotech., Madison, WI) a skladované pri -80°C.
Určenie HPV genotypu
HPV genotypy boli zisťované pomocou PCR s L1 špecifickými primermi pre
HPV16 a 18 a zložením PCR reakcie ako uvádza Gravitt et al. [4]. V PCR boli
zahrnuté aj pozitívne kontroly (Caski – HPV16 pozitívna a HeLa – HPV18
pozitívna bunková línia). Sekvencie HPV genotypov boli zistené kapilárnou
elektroforézou a porovnané v internetovej databáze.
p16INK4a a HPV16/18-E6 mRNA analýza
RNA bola reverzne prepísaná do cDNA a úroveň p16INK4a mRNA expresie bola
zistená relatívnou kvantifikáciou (RQ - metóda 2-ΔΔCt). HPV negatívne vzorky z
NILM skupiny (n=71) boli nastavené ako kontrolné a biologické skupiny (ASCUS,
LSIL, ASC-H, HSIL, SCC, Caski, HeLa bunkové línie) boli k nim porovnané.
Druhá časť NILM skupiny (n=61) s HPV infekciou, zápalom alebo slabou
koncentráciou RNA bola vylúčená. HPV16/18 pozitívne vzorky boli testované na
E6 mRNA expresiu s HPV16-E6 a HPV18-E6 primermi [5]. Štandardné krivky
vznikli 10-násobným riedením (108-103) plazmidovej DNA s klonovaným E6
fragmentom. Analýzy boli vykonané na prístroji 7500 Fast RealTime PCR System
(ABI, Foster City, CA) a analyzované v softvéri k prístroju.
Štatistická analýza
Hladiny p16INK4a a E6 mRNA boli hodnotené v ROC analýze na odhad
diagnostickej senzitivity a špecificity testu pre predikciu ťažkej dysplázie alebo
karcinómu (CIN3+). Mann- Whitney test pre nezávislé vzorky bol použitý na
posúdenie počtu E6 mRNA kópií a závažnosti ochorenia krčka maternice; p<0,05
bola považovaná za štatisticky významnú.
Výsledky
HPV DNA bola prítomná u 27,3% (36/132) NILM a 81,4% (109/134) žien s léziou
krčka maternice. Okrem HPV16 a 18 sme zistili aj HPV31, HPV33, HPV39,
HPV45, HPV52, HPV58, HPV66 a HPV67. HPV16 bol najčastejšie prítomný (u
41
13,6% (18/132) NILM a 56% (75/134) žien s léziou krčka maternice). HPV52 bol
druhý najčastejší genotyp (u 6,7% (9/134) žien s léziou krčka maternice), HPV66
bol tretí (u 4,5% (6/132) NILM a 3% (4/134) žien s léziou krčka maternice) a
HPV18 ako štvrtý (u 3,8% (5/132) NILM a 6% (8/134) žien s léziou krčka
maternice). HPV DNA dvoch genotypov bola často nájdená u 14,5% (8/55) LSIL
skupiny, čo by mohlo byť spojené s tvorbou lézií, ktoré sa môžu vyliečiť. HPV
negatívne vzorky boli najmä u 25,5% (14/55) LSIL a 23% (3/13) ASCUS .
V relatívnej kvantifikácii sme zistili približne rovnaké hladiny p16INK4a v ASCUS a
LSIL v porovnaní s NILM (n=71). V HSIL bola hladina p16 INK4a expresie 4,35násobne a v ASC-H 6,44-násobne zvýšená. V SCC, Caski a HeLa bunkových
líniách bola p16INK4a expresia 13,15; 116,77- a 22,8-násobne vyššia, respektíve
(Obrázok 1). Počet p16INK4a mRNA pozitívnych pacientok sa zvyšoval so
závažnosťou lézie (Tabuľka 1) a táto hladina bola významne vyššia u ťažkých
dysplázií, resp. karcinómov v porovnaní s miernymi a strednými dyspláziami
(p=0,0028). Pri hodnote RQ≥1,4569 mal test 82,6% senzitivitu (95% CI=61,295,0%) a 60% špecificitu (95% CI=42,1-76,1%) na predikciu CIN3+ lézie.
HPV16 a 18 pozitívne vzorky boli testované na prítomnosť E6 mRNA expresie so
štandardnými krivkami. Expresia E6 mRNA transkriptov bola nájdená u 65,2%
(15/23) NILM; 57,1% (4/7) ASCUS; 78,1% (25/32) LSIL; 90,6 % (29/32)
HSIL/ASC-H a 100% (9/9) SCC (Tabuľka 1). Počet E6 mRNA kópií bol u ťažkých
dysplázií, resp. karcinómov významne vyšší (p=0,0038) a pri počte 32115,8 E6
mRNA kópií mal test 60% senzitivitu (95% CI=38,7-78,9%) a 80,6% špecificitu
(95% CI=64,0-91,8%) na detekciu CIN3+ lézie. V prípade koinfekcie
HPV16+HPV18 sme zistili zvýšenú hladinu E6 mRNA expresie u jedného
genotypu, čo naznačuje dominanciu jednej infekcie.
Obrázok 1: Grafická sumarizácia výsledkov. Môžeme vidieť vzrastajúci trend v počte E6 mRNA
kópií a vzrastajúcu hladinu p16INK4a mRNA. K NILM skupine (RQ=1, ddCt=0) boli porovnané
skupiny cervikálnych lézií. Čísla nad bodmi reprezentujú namerané hodnoty.
42
Cytológia
NILM
ASCUS
LSIL
HSIL/ASC-H
SCCA
Počet HPV16/18
Počet p16INK4a mRNA
Počet E6 mRNA
pozitívnych pacientok pozitívnych pacientok pozitívnych pacientok
23/132 (17,4%)
7/13 (53,8%)
32/55 (58,2%)
32/55 (58,2%)
9/11 (81,8%)
14/71 (19,7%)
6/13 (46,2%)
24/55 (43,6%)
40/55 (72,7%)
10/11 (90,9%)
15/23 (65,2%)
4/7 (57,1%)
25/32 (78,1%)
29/32 (90,6%)
9/9 (100%)
Tabuľka 1: Súhrn výsledkov zameraných na prítomnosť HPV16 a18 v bunkách krčka maternice,
expresiu p16INK4a a E6 mRNA u HPV16/18 pozitívnych lézií
Diskusia
Včasná detekcia klinicky relevantných CIN2+ a vhodná liečba zlepšuje ochranu
proti vývoju CIN3+ lézie [6]. Zistili sme vysokú prevalenciu HPV infekcie u žien
s ochorením krčka maternice ako aj u žien s normálnou cytológiu. Okrem HPV16
a 18 sme zachytili aj HPV16-príbuzné genotypy (HPV31, 33, 35, 52, 58, 67) a
HPV18-príbuzné genotypy (HPV39, 45, 59, 68 a 70) a prítomnosť HPV DNA u
27,3% (36/132) asymptomatických pacientok naznačuje, že bunky s HPV infekciou
sa môžu javiť cytologicky normálne [7] .p16INK4a (p16) je považovaný za
biomarker HPV infekcie a jeho nadmerná expresia sa stanovuje pomocou
imunofarbenia na bunkách alebo biopsiách. V tejto práci relatívne množstvo
p16INK4a mRNA významne narastalo so zvyšujúcou sa závažnosťou lézie
(p=0,0104). Hladina p16 expresie bola porovnateľná u NILM, ASCUS a LSIL lézií
pravdepodobne preto, lebo väčšina z nich vykazuje malú alebo žiadnu p16
reaktivitu v horných dvoch tretinách epitelu a rozptýlenú alebo silnú p16INK4a
reakciu v dolnej tretine cervikálneho epitelu [8]. RQ odráža aktuálnu expresiu
buniek, no mRNA extrahovaná z cervikálnych sterov je v zmesi dysplastických a
normálnych buniek, čo môže spôsobiť zníženú senzitivitu a špecificitu metódy.
Detekcia E6/E7 mRNA expresie môže stanoviť klinicky významné infekcie. Zistili
sme vzrastajúci trend v hladine E6 mRNA u HPV16/18 pozitívnych pacientok
podľa závažnosti lézie. Pri predikcii ťažkej dysplázie, resp. karcinómu mal test
lepšiu špecificitu, no rozšírením štúdie na všetky vysoko-rizikové genotypy sa
môže zlepšiť senzitivita a špecificita testu, hoci testy s nižšou senzitivitou stále
môžu identifikovať lézie vedúce ku karcinómu [9]. Použitie DNA a mRNA testov
v skríningu ochorenia by vylepšilo celkovú senzitivitu a špecificitu konvenčnej
cytológie, v prípade pozitívnych výsledkov by pacientka okamžite podstúpila odber
biopsie [10]. V tejto štúdii sme testovali dostupné metódy, ktoré by sa dali použiť
v laboratóriách s nižším finančným príjmom. Výhodou testov je neinvazivita
odberu vzoriek, nie je požiadavka na špeciálne školený personál, príp. laboratórne
vybavenie. Náklady na materiál a chemikálie sú prijateľné a výsledky sú
reprodukovateľné pri opakovaných analýzach. Aby bolo možné testy použiť
v bežnej klinickej praxi, museli by byť overené na väčších súboroch a porovnané
s výsledkami komerčných testov. Napriek tomu zvažujeme použitie oboch testov
na vylepšenie senzitivity a špecificity konvenčnej cytológie pri predikcii ťažkej
dysplázie.
43
Poďakovanie
Práca bola podporená projektom ITMS 26110230067 "Zvýšenie možností
kariérneho rastu vo výskume a vývoji v oblasti lekárskych vied" a ITMS
26220220113 "Molekulová diagnostika rakoviny krčka maternice", ktoré sú
spolufinancované zo zdrojov EÚ.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infection and
cervical cancer. Clin Sci (Lond) 2006;110(5): 525-41.
[2]
Cuschieri K, Wentzensen N. Human Papillomavirus mRNA and p16
Detection as Biomarkers for the Improved Diagnosis of Cervical Neoplasia.
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2008;17: 2536–45.
[3]
Ondrusova M, Zubor P, Ondrus D. Time trends in cervical cancer
epidemiology in the Slovak Republic: reflection on the non-implementation
of screening with international comparisons. Neoplasma 2012;59: 121–8.
[4]
Gravitt PE, Peyton CL, Alessi TQ, Wheeler CM, Coutlée F, et al. Improved
amplification of genital human papillomaviruses. J Clin Microbiol 2000;
38: 357–61.
[5]
Murphy PG, Henderson DT, Adams MD, Horlick EA, Dixon EP, et al.
Isolation of RNA from cell lines and cervical cytology specimens stored in
BD SurePathTM preservative fluid and downstream detection of
housekeeping gene and HPV E6 expression using real time RT-PCR.
J Virol Methods 2009;156: 138–44.
[6]
Rijkaart DC, Berkhof J, Rozendaal L, van Kemenade FJ, Bulkmans NW, et
al. Human papillomavirus testing for the detection of high-grade cervical
intraepithelial neoplasia and cancer: final results of the POBASCAM
randomised controlled trial. Lancet Oncol 2012;13: 78–88.
[7]
Iftner T, Germ L, Swoyer R, Kjaer SK, Breugelmans JG, et al. Study
Comparing Human Papillomavirus (HPV) Real-Time Multiplex PCR and
Hybrid Capture II INNO-LiPA v2 HPV Genotyping PCR Assays. J Clin
Microbiol 2009;47: 2106–13.
[8]
Klaes R, Friedrich T, Spitkovsky D, Ridder R, Rudy W, et al.
Overexpression of p16(INK4A) as a specific marker for dysplastic and
neoplastic epithelial cells of the cervix uteri. Int J Cancer 2001;92(2):
276-84.
[9]
Szarewski A, Ambroisine L, Cadman L, Austin J, Ho L, et al. Comparison
of Predictors for High-Grade Cervical Intraepithelial Neoplasia in Women
with Abnormal Smears. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2008;17:
3033–42.
[10] Tropé A, Sjøborg K, Eskild A, Cuschieri K, Eriksen T, et al. Performance
of human papillomavirus (HPV) DNA and mRNA testing strategies in
women with and without cervical neoplasia. J Clin Microbiol 2009;47:
2458–64.
44
Effect of spheroid size on the activity
of anticancer agents in spheroid cultures
of colorectal carcinoma cells
Viswanath Das, Petr Džubák, Marián Hajdúch
Laboratory of Experimental Medicine,
Institute of Molecular and Translational Medicine,
Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University
Olomouc, Hněvotínská 5, 779 00 Olomouc, Czech Republic
Abstract
Limited tissue penetration and homogenous distribution of anticancer drugs in the
tumor tissue remain a key challenge in the treatment of solid tumors. The
heterogeneity within the tumor microenvironment significantly affects diffusion of
anticancer drugs in tumors, and limits effective treatment of cancer using small
molecule therapeutics. Multicellular cancer cell spheroids that accurately
recapitulate the tumor microenvironment are an attractive model for studying tissue
penetration of anticancer agents. In this study, we present a simple in vitro model
system of colorectal carcinoma spheroids for evaluating the activity DNA
hypomethylating agents, which are an important class of antitumor drugs at various
spheroid depths.
Introduction
Cancer is a global menace that affects vast majority of people each year, and solid
tumors account to 85% of these cases [1]. One of the key challenges in the effective
treatment of solid tumors is the inability of drugs to penetrate deeper inside tumors
and attain a lethal concentration to induce cytotoxic effect [2]. Poor blood flow and
altered interstitial pressure within the tumor limits spatial distribution of drugs,
resulting in the treatment of only 10% of the tumor [1]. Notably, the tumor
microenvironment that modulates efficacy of anticancer drugs is significantly
influenced by the shape and size of the tumor [1]. Lately, multicellular spheroids
(MCS) of cancer cells have gained significant interest as a model system for
studying tissue penetration depths of anticancer compounds [3]. MCS with radii of
200 µm and more characteristically mimic in vivo properties of solid tumors [4].
For example, MCS have an inner dormant region of hypoxic cells, which is
surrounded by a quiescent zone of viable cells, and an outer most layer of
proliferating cells. And similar to tumors, with increase in size, MCS generate a
gradient of oxygen, carbon dioxide, waste and nutrients. These tumor-like cellular
properties make MCS more resistant to anticancer agents than cell cultured in 2D
monolayer [5].
The goal of the present study was to establish an MCS model system for evaluating
the enhanced permeability and retention (EPR) effect of DNA hypomethylating
45
agents in solid tumors. Additionally, using MCS of two different size, we show that
the demethylating activity of hypomethylating agent, LEM-791, a stereoisomer of
decitabine is greatly influenced by the size of MCS. Although our in vitro MCS
screening system is still in an early stage of development; nevertheless, it presents
a robust system for characterizing tissue penetration depth of potential
hypomethylating agents.
Materials and Methods
Cell line
The human colorectal carcinoma cells (HCT116) were obtained from the ATCC,
and maintained in McCoy’s 5A (Invitrogen) complete growth medium containing
10% fetal calf serum, and supplemented with 3 mM L-glutamine, 50 μg/mL
streptomycin and 100 U/mL penicillin in a humidified atmosphere of 5% CO2 at
37oC. Reporter HCT116 cell line (HCT116-pFLJ-H2B) with fused EGFP and
TagRFP as fluorescent detection system for characterizing the activity of
hypomethylating agents, was developed as described previously [6]. HCT116pFLJ-H2B constituently express RFP, however, GFP is expressed only when cells
undergo demethylation.
Multicellular spheroid generation
MCS of HCT116-pFLJ-H2B cells were generated using a modified version of the
liquid-overlay culture method [7] in a flat-bottom 384-well tissue culture plate.
Cell density per well was adjusted to generate large and small-sized MCS of the
diameter of 550-600 µm and 250-300 µm, respectively, by the 4th day of
initiation of MCS culture.
Compound and drug treatment
LEM-791 was synthesized and provided by Drs. Marcela Krečmerová and Miroslav
Otmar of the Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of
Sciences of the Czech Republic, Prague. The compound was dissolved in
dimethylsulfoxide at a final concentration of 50 mM. MCS were treated with LEM791 at a concentration of 37.5 μM for 6 days. This concentration of LEM-791 was
selected based on pilot studies, and showed no significant cytotoxicity in MCS.
Images were captured every 48 h following drug treatment for 6 days. Final
concentration of vehicle added to control wells was below 0.1%.
Image acquisition and image analysis
To monitor tissue penetration and the extent of demethylation caused by LEM-791
at different z-plane heights, MCS were imaged on the Carl Zeiss Axio Observer Z.1
inverted confocal microscope using a 10× air objective (numerical aperture 0.3),
and appropriate filters for EGFP (excitation/emission: 488 nm/509 nm) and RFP
(excitation/emission: 545 nm/572 nm) in xyz plane. 150 z-stack images of MCS
were acquired at an interval of 1.5 µm spacing and image aspect ratio of 484 × 512
pixel using ZEN 2012 (Blue edition) imaging software. Throughout the
experiment, MCS in the 384-well plate were maintained at 37oC in a live-cell
culture chamber (Model: XL S1; Carl Zeiss), and supplied with 5% CO2. Laser
46
intensity was adjusted to reduce phototoxicity. The images were saved in .CZI
format and analyzed using NIH image analysis software, ImageJ. Briefly,
fluorescence intensity of RFP signal was determined starting from 0 to 100 µm zplane height, and normalized to the area of RFP signal of each plane. Thereafter,
intensity of GFP signal was determined and normalized to RFP signal of respective
plane, and presented as % demethylation. % demethylation from z-plane 0 to 65 m
is only shown in Fig. 1. Fluorescent intensity in z-plane beyond 100 µm height was
discarded because of lack of clarity of fluorescent signals.
Results
Demethylation of large and small-sized MCS at different z-plane height
Size of the MCS greatly affected the demethylating activity, and presumably tissue
permeability and retention of LEM-791 over 6 days in culture. There was no
difference in the pattern of demethylation caused by LEM-791 at different z-plane
planes in large and small-sized MCS following 2 days of drug treatment (Fig. 1A).
However on day 4, LEM-791 was able to effectively penetrate deeper into smaller
MCS than large MCS (Fig. 1B). Although the percent of demethylation was same
in first few outer z-planes in both large and small MCS, cells in deeper z-planes of
smaller MCS were demethylated more than large MCS (Fig. 1B). At day 6, there is
a gradual decrease in demethylation from 0-65 mm z-planes in large MCS (Fig.
1C). In smaller MCS, demethylation that was higher at day 4 in deeper z-planes
(Fig. 1B) starts to drop from day 6 in the deeper z-planes (Fig. 1C).
Figure 1: Pattern of demethylation caused by LEM-791 at different z-plane planes in large and
small-sized MCS
47
Representative images of demethylation caused by LEM-791 in large and small
MCS at 0 and 65 µm z-plane height over 2, 4 and 6 days of drug treatment are
presented in Fig. 2.
Figure 2: Demethylation caused by LEM-791 in large and small MCS at 0 and 65 µm z-plane
height
Discussion
In this study, we have presented our first preliminary data on the use of MCS
generated from HCT116-pFLJ-H2B cells as a model reporter system to study EPR
effect of potential demethylating agents. Various possibilities that are beyond the
scope of discussion here exist that could have resulted in the pattern of
demethylation seen in large- and small-sized MCS. Large MCS have slower
growth rate (data not presented) than smaller MCS, and presumably this could
influence their response to LEM-791. Additionally, hypoxic core that usually
develop in MCS that grow beyond 500 µm in diameter, are known to alter MCS
response to anticancer agents. It is possible that due to the presence of larger
hypoxic core, our large MCS were less sensitive to LEM-791 than smaller MCS.
Currently, we are working on addressing several issues that will help us to improve
our spheroid screening system, and obtain clearer explanation for the findings
observed.
Acknowledgement
This work was supported by internal grant of Palacky University (LF_2013_016),
BIOMEDREG (CZ.1.05/2.1.00/01.0030) and Ministry of Industry and Trade of the
Czech Republic (FR-TI4/625).
References
[1]
Soltani M, Chen P. Effect of tumor shape and size on drug delivery to solid
tumors. J Biol Eng 2012; 6: 4.
48
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
Tannock IF, Lee CM, Tunggal JK, Cowan DSM, Egorin MJ. Limited
penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of
resistance of solid tumors to chemotherapy. Clin Cancer Res 2002; 8: 878884.
Ma H, Jiang Q, Han S, Wu Y, Tomshine JC et al. Multicellular tumor
spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of
chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol Imaging
2012; 11: 487-498.
Mehta G, Hsiao AY, Ingram M, Luker GD, Takayama S. Opportunities and
challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and
efficacy. J Control Release 2012; 164: 192-204.
Wenzel C, Riefke B, Grundemann S, Krebs A, Christian S et al. 3D high
content screening for the identification of compounds that target cells in
dormant tumor spheroid regions. Exp Cell Res 2014. Epub ahead of print.
doi:10.1016/j.yexcr.2014.01.017.
Agrawal K, Frydrych I, Džubák P, Hajdúch M. Study of epigenetic 5azacytidine nucleosides and their derivatives. Biomed Pap Med Fac Univ
Palacky Olomouc Czech Repub 2012; 156: S117-S126.
Friedrich J, Seidel C, Ebner R, Kunz-Schughart LA. Spheroid-based drug
screen: considerations and practical approach. Nat Protoc 2009; 4: 309324.
49
Kategória
Mladý výskumník do 35 rokov, doktorand
50
Cancer-associated carbonic anhydrase IX
facilitates cell adhesion to solid support,
potentially contributing to a crucial
step of the metastatic cascade
Michaela Debreová1, Lucia Csaderová1,2, Magdaléna
Vreštiaková3, Silvia Pastoreková1 and Eliška Švastová1
1
Department of Molecular Medicine, Institute of Virology,
Slovak Academy of Sciences, Dúbravská cesta 9, 845 05
Bratislava, Slovakia
2
Centre for Molecular Medicine, Slovak Academy
of Sciences, Vlárska 3-7, 831 01 Bratislava, Slovakia
3
BioScience Slovakia s.r.o, Dúbravská cesta 9, 841 04
Bratislava, Slovakia
Introduction
Focal adhesions (FAs) mediates interactions between cell and extracellular matrix
(ECM) proteins. Formation and release of FAs represent a fundamental step in
migration and expansion of tumor cells during the metastatic pathway. However,
FAs in migrating cells completely differs from that in quiescent cells. Migratory
cycle is based on the repetitive assembly and disassembly of focal structures at the
protruding as well as trailing end. On the other hand, initial adhesion and spreading
involving the formation and maturation of focal contacts (FCs) possibly enhances
release of tumor cells from circulation and favor the establishment of secondary
metastatic nests [1]. The attachment to the substrate is often executed by cell
surface receptors integrins which connect to the actin filaments by multiprotein
complexes [2]. The membrane-associated carbonic anhydrase IX (CA IX)
possesses an unique cell surface-exposed proteoglycan-like region (PG) showing
38% homology with keratan-sulfate domain of a large proteoglycan aggreccan,
which can bind with ECM protein collagen, therefore it is conceivable that CA IX
could contribute to the cell adhesion [2,3]. Hypoxia-induced CA IX is expressed in
a broad spectrum of solid benign and malignant human tumors and absent from
corresponding healthy tissues. Close relationship to tumor lesions indicates its
potential clinical utility as a biomarker, prognostic/predictive factor and therapeutic
target. Through catalyzing the reversible hydration of CO2 to proton and
bicarbonate ion, CA IX actively participates in pH regulation supporting cancer cell
survival. It also facilitates generation of polarized pH gradient at the protruding
fronts of motile cells increasing their migration velocity. Moreover, CA IX can
perturb E-cadherin-mediated intercellular contacts demonstrating importance of
this multifunctional protein in tumor biology [4]. Only recently, we have found that
CA IX enhances the initial cell adhesion and spreading via extracellular PG domain
in quiescent cells thus revealed a new role of this cancer-related molecule.
51
Material and Methods
Cell culture
MDCK, C-33A (C33) cells and their transfected variants were cultured in DMEM
with 10% fetal calf serum (Lonza BioWhittaker) at 37◦C in humidified air with 5%
CO2. Hypoxic experiments were conducted at anaerobic chamber (Ruskinn
Technologies) in 2% O2, 2% H2, 5% CO2, 91% N2 atmosphere at 37◦C. Preparation
of MDCK cells transfected with full length CA IX and with its deletion mutant
(ΔPG) as well as C33 cell line with constitutive expression of wild type (wt) CA IX
has been described elsewhere [5,6].
Immunofluorescence
Cells seeded on glass coverslips with or without collagen coating were fixed in 4%
paraformaldehyde (PFA) for 10 min and permeabilized with 0.1% Triton X-100 for
4min. Immunofluorescence staining and subsequent analysis by confocal
microscopy were carried out as described elsewhere [6]
Quantification of focal adhesions in immunofluorescence assays
C33 CA IX-expressing and control neo cells were seeded on collagen coated
coverslips at sparse density in serum-free culture medium, left to attach for 4h,
fixed and stained for paxillin and nuclei. Images of FCs visualized through paxillin
were taken by Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope at 400× magnification,
zoom 3× at the same settings for each sample. The length and area of paxillin at the
cell periphery corresponding to FAs were evaluated using intensity thresholding in
ImageJ and spread morphology of cells was defined from DIC images using
ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Significance of differences between
samples was determined by t-test.
Cell spreading assay
MDCK and C33 cells, their derivatives and corresponding controls were seeded on
uncoated or collagen-covered coverslips and let to attach for 15 min, 30 min, 1h,
and 2h in duplicates. Subsequently, media were removed and adhered cells were
washed with PBS, fixed in 4% PFA, stained with 0.5% Coomassie blue for 5min at
RT. At least 200 cells were analyzed for each sample using ImageJ software
(http://rsb.info.nih.gov/ij/) and cell spreading areas were calculated and compared
by t-test. All the time, the mean cell diameter of trypsinized cells in suspensions
was measured for each variant used by the cell counter (Beckman Coulter) before
seeding. When M75 antibody was applied to block the PG domain of CA IX, live
cells were preincubated with M75 antibody (10μg/ml) for 1h at 37◦C at the rotary
shaker. Then cells were washed 3 times in serum-free medium, counted, seeded,
fixed at indicated time intervals, and stained as described above. Control
counterparts were subjected to the same procedure.
Results and Discussion
Contribution of CA IX to the process of initial adhesion and spreading was
investigated using C33 cells transfected either with cDNA encoding wt CA IX or
with the mock plasmid. As we deduced the role of CA IX in adhesion process on
the basis of its structure, CA IX-positive cells exhibited larger spreading area on
52
collagen substrate compared to control cells (Figure 1A, B). Furthermore, C33 CA
IX-expressing cells displayed greater and more elongated FCs in comparison to
control neo cells which showed smaller and more circular focal structures as
revealed by analysis of the length and number of FAs by immunofluorescence
paxillin staining (Figure 1C). The overall number of FAs in C33-CA IX cells was
also larger in contrast to C33-neo. Interestingly, in spreading HT1080 and SiHa
cells CA IX distributed to focal structures where it colocalizes with paxillin from
the early phase of the cell adhesion till the acquisition of the fully spread and
flattened morphology demonstrating its active participation in FCs formation (data
not shown). Our results suggest that CA IX is implicated in the formation of focal
contacts and enhances the maturation of adhesion plaques thereby facilitating cell
anchoring on a solid support.
The CA IX-mediated enhancement in cell spreading by improvement of the FCs
maturation could be at least partially attributed to its impact on the protein level of
RhoA-associated protein kinase 1 (ROCK1) since in HT1080 and HeLa cells CA9
silencing led to the significant downregulation of the ROCK1 [6] which plays a
substantial role in the myosin II-driven maturation of the FAs through recruitment
of adaptor proteins to strengthen the linkage between actin cytoskeleton and ECM
proteins [7].
Figure 1: Analysis of FCs and spreading of C33 cells in regard to CA IX expression based on
paxillin staining. (A) Immunofluorescence analysis of paxillin pattern of C33 CA IX-expressing
cells and their neo controls, 4h after seeding on collagen-covered coverslips in serum-free medium.
CAIX-positive cells performed larger FAs indicating more mature status of focal structures thus
stronger adhesion to the substrate. Scale bar 10μm. (B, C) In individual cells the spreading area was
measured (n = 20, t-test, **p < 0.01) and also the average length of FCs visualized through paxillin
staining was evaluated (n = 20, t-test, **p < 0.01). C33 CA IX-expressing cells exhibited larger
spreading area as well as length of FCs enhancing cell adhesion to the solid support.
The modification in the form of keratan-sulfate glycosaminoglycan chain
attachment to Thr115 of CA IX further reinforces the proposed function of PG in
cell-substrate adhesion, in analogy to the metastasis-associated protein CD44,
which disposes similar keratan-sulfate alteration modulating its ability to bind
hyaluronate [8]. To elucidate the engagement of PG region to the CA IX-enhanced
53
spreading, we carried out the short time adhesion experiment including
preincubation with PG-directed monoclonal antibody M75. The presence of M75
impaired the CA IX influence on the cell spreading in C33 cells as well as in
MDCK cells (data not shown). Interestingly, the MDCK cells with ectopic
expression of PG-lacking variant of CA IX protein spread in a similar manner like
the control cells, but the extent of their spreading was in between the areas of the
wt CA IX-positive cells and the mock controls (Graph 1). This findings indicates
that PG region is needed for the full performance of CA IX on the cell spreading.
Graph 1: The effect of CA IX on the cell adhesion and spreading in stably transfected MDCK
cells. The cells were seeded on collagen-coated coverslips and fixed at indicated time periods. The
full length CA IX increased spreading area compared to control neo cells. Expression of ΔPG
mutant form of CA IX decreased spreading area in contrast to cells with the wt CA IX protein. Cell
area was normalized to compensate for various cells sizes of transfection derivatives as well as
control cells (t-test, **p < 0.01).
Conclusions
The tumor-associated CA IX is functionally involved in the FA process facilitating
especially the focal contacts maturation in a PG-dependent manner. In the context
of tumor progression, via enhancing cell adhesion and spreading CA IX may confer
advantage during the initial formation of metastatic lesions.
Acknowledgement
This work was supported by the following grants: 7th Framework program of EU
(Collaborative project METOXIA), Research and Development Support Agency
(APVV-0658-11 and APVV-0108-10), VEGA 2/0130/11, 2/0129/11, Centre of
Excellence, Slovak Academy of Sciences (CEMAN).
First author would like to thank Eliška Švastová and Silvia Pastoreková for their
time, advice, patience and fruitful discussions.
54
References:
[1]
Parsons JT, Horwitz AR, Schwartz MA Cell adhesion: integrating
cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat Rev Mol Cell Biol 2010;
11: 633-643.
[2]
Opavsky R, Pastorekova S, Zelnik V, Gibadulinova A, Stanbridge EJ et al.
Human MN/CA9 gene, a novel member of the carbonic anhydrase family:
structure and exon to protein domain relationships. Genomics 1996; 33:
480-487.
[3]
Hedlund H, Hedbom E, Heinegardi D, Mengarelli-Widholm S, Reinholt FP
et al. Association of the aggrecan keratan sulfate-rich region with collagen
in bovine articular cartilage. J Biol Chem 1999; 274: 5777-5781.
[4]
Svastova E, Pastorekova S Carbonic anhydrase IX: a hypoxia-controlled
“catalyst” of cell migration. Cell Adh Migr 2013; 7: 226-231.
[5]
Svastova E, Hulikova A, Rafajova M, Zatovicova M, Gibadulinova A, et al.
Hypoxia activates the capacity of tumor-associated carbonic anhydrase IX
to acidify extracellular pH. FEBS Lett 2004; 577: 439-445.
[6]
Csaderova L, Debreova M, Radvak P, Stano M, Vrestiakova M et al. The
effect of carbonic anhydrase IX on focal contacts during cell spreading and
migration. Front Physiol 2013; 4: 1-12.
[7]
Pasapera AM, Schneider IC, Rericha E, Schlaepfer DD, Waterman CM
Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through
FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol 2010; 188: 877-890.
[8]
Takahashi K, Stamenkovic I, Cutler M, Dasguptai A, Tanabe KK Keratan
sulfate modification of CD44 modulates adhesion to hyaluronate. J Biol
Chem 1996; 271: 9490-9496.
55
Depletion of carbonic anhydrase IX leads to
the decrease of migration and invasion ability
of tumor cells
Peter Radvák, Eliška Švastová, Lucia Csáderová,
Martina Takáčová, Silvia Pastoreková and Juraj Kopáček
Institute of Virology, Department of Molecular Medicine,
Slovak Academy of Sciences, 845 05 Bratislava
Introduction
Development of solid tumors is often accompanied with the formation of acidic
cell microenvironment and tumor hypoxia. Therefore, these two features contribute
to creation of the selective pressure resulting in adaptation of cells with the
aggressive phenotype to hostile conditions. There are many genes involved in the
hypoxic cell response that are helping cancer cells to survive and sustain in the
proliferative state. One of them is also the carbonic anhydrase IX (CA IX) that
serves as an intrinsic marker of tumor hypoxia owing to its association with the
most types of cancers [1,2]. The CA IX protein is embedded in plasma membrane
with the catalytic domain exposed to an extracellular space and participates in
hydration of CO2 to HCO3- and H+. Therefore it is expected that CA IX enzyme
helps to preserve the intracellular pH by producing HCO3- which is subsequently
imported to the cytoplasm and at the same time CA IX contributes to characteristic
acidification of the extracellular pH by producing protons [3]. This has an
important influence on a cancer progression and outcome in a pro-metastatic
behaviour of cancer cells.
It was found that CA IX has also implications in the cell movement processes. The
PG domain, a unique proteoglycan-like domain of the CA IX, is probably involved
in intercellular communication and ability to attach to the cell surface. The PG
domain abrogation by a specific antibody influences in attachment of cells to the
surface [4]. Moreover, the CA IX protein is able to influence the strength of
intercellular contacts. MDCK cells expressing CA IX has reduced cell-cell
adhesion capacities due to destabilization of intercellular contacts by decreased
levels of E-cadherine molecules linked to β-catenins and cytoskeleton filaments. It
is possible that CA IX can reduce the cell adhesion capacity through the
competition with E-cadherin and β-catenins interactions. Disruption of intercellular
contacts may have a sign in the enhanced invasiveness of tumor cells [5]. CA IX is
also interacting functionally and physically with bicarbonate transporters as anion
exchanger 2 (AE2) well as related exchangers (AE3; AE1). Together they form a
kind of the bicarbonate transport metabolon to augment maximum rates of acid
secretion [6]. Moreover, the CA IX is involved in migration processes coupled with
the regulation of pericellular pH gradient [7].
56
Material and Methods
Cell culture handling
The HT-1080 cell line was cultivated in DMEM medium supplemented with a 10%
FCS (Lonza BioWhittaker). Cells were cultivated at 37 °C in humidified
atmosphere using air thermostat with 5% CO2. All hypoxic experiments were
performed as was described previously [8].
Microarray analysis
Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST (Affymetrix) was used for the
microarray analysis following the standard protocol as was described before [8].
Wound-healing assay
The HT-1080 cells were pre-cultivated, treated with HGF (Sigma-Aldrich) and
analysed as was described previously [8].
Trans-well invasion assay
The assays were performed in BD Falcon HTS FluoroBlok 8.0 µm colored PET
Membrane Inserts for 24-well plates (BD Biosciences). FluoroBloks were coated
with mixture of matrigel (BD Biosciences) and cells were labelled with a lipophilic
fluorescent dye DiO (Invitrogen) as was described previously [7].
Results and discussion
CA IX diminution by RNAi
To better understand the relative importance of CA IX in regard to molecular
pathways we sought to determine the effect of CA IX depletion in the HT-1080 cell
line. Previously prepared lentiviral particles, encoding the CA9 or Scr shRNA,
were transduced to the cells. The subsequent selection of stable clonal cell lines
was done according to the percentage of the successfully diminuted CA IX protein
(Fig. 1). In comparison of the CA9 and control Scr shRNA interference system, the
cells with depleted CA IX protein showed lower ability to acidify the cultivation
media (data not shown). This data has confirmed our successful hindrance of CA9
gene expression. Therefore, such a cell model can be utilized in further experiments
focused on CA IX enzyme.
Figure 1: Suppression of the CA IX protein detected by immunoblotting. HT-1080 cells were seeded and
pre-cultivated in the absence or presence of Dox (0.5 μg/ml) in normoxic conditions for 3 days. CA IX
expression was induced by hypoxia (2% O2) for 24 hours. Cell lysates were analysed by the immunoblotting
method and CA IX was detected by the M-75 monoclonal antibody. Samples with presence of Dox express anti
CA9 shRNAs thus level of the CA IX protein is lower when compared with samples that represent cells without
Dox or control samples with the scrambled shRNA sequence.
57
Gene expression profiling of CA9 depleted HT-1080 cells
The functional CA9shRNA system in HT-1080 cell model was suitable for the
analysis of the whole genome expression profile. To reveal some molecular
signatures and pathways affected by CA IX protein deficiency we have utilized the
microarray analysis. The gene expression profiling was carried out with hypoxic
cells bearing the CA9 shRNA and Scr shRNA. The result reported 109 genes with
the significantly modified expression, thereof 47 upregulated and 62
downregulated genes. Figure 2 shows data of several genes with amendment
expression that are involved in cell processes like migration and invasion.
Changes in gene expressions were reflected in inhibition of focal adhesion
pathway. Cell focal adhesions represent an important step in the cell attachment to
the extracellular matrix and it was revealed that CA IX participate in cell migration
via pH regulation [7]. Microarray data complexly indicates that CA IX is also
involved in formation of focal adhesion sites.
Figure 2: List of selected genes deregulated upon silencing of the CA IX protein. All of them
are implicated in formation of focal adhesions (FA) and interactions with the extracellular matrix.
Gene FERMT2 is involved in formation of cell connections between actin cytoskeleton and ECM
adhesion points. ROCK1 and ROCK2 genes are involved in actin cytoskeleton organization, stress
fiber and FA formation. DOCK9 acts as a guanine nucleotide-exchange factor and activates Cdc42
GTPase that has a role in the extension and maintenance of thin cell filopodias. Metallopeptidase
protein ADAM10 is associated with cleavage of membrane bound proteins to mature soluble form.
Col4α2 and Itgβ3 are genes involved in formation of structural components of ECM or receptors for
various extracellular matrix glycoproteins.
CA IX deficient HT-1080 cells showed decrease of migration and invasion capacity
The microarray analysis uncovered inhibition of the focal adhesion pathway that is
associated with the cell migration. To reveal these findings, we have performed the
wound healing assay to test HT-1080 cells migration capacity. Area covered by
HT-1080 cells with depleted CA IX (after 8h) was considerably smaller, nearly one
third lower than control Scr shRNA cells (Fig. 3).
58
Figure 3: Migration of HT-1080 cells. Cells with deregulated protein CA IX (CA9 shRNA + Dox)
covered smaller area when compared to cells normally expressing CA IX. Cells with control RNAi
system (Scr shRNA) showed also no significant differences in their migration potential.
Another approach how to confirm microarray indications was to test the invasion
ability of HT-1080 cells with the suppressed CA IX. Decreased expression of genes
like MMP9, Itgβ3, Itgα6 gave us the argument to assume to think that the cell
invasiveness could be affected. We tried to mimic invasion of HT-1080 cells across
the basement membrane - matrigel. Cells with the downregulated CA IX protein
were slower when compared to the control Scr shRNA cells. Potential of
invasiveness was decreased in case of CA IX silenced cells (data not shown).
Conclusions
Established HT-1080 clonal cell lines with shCA9 RNAi system have proved to be
a suitable model for analysis of response of CA IX depleted cell in hypoxic
conditions. These cells were used for the whole genome expression profiling by
microarray analysis. The main point of this analysis was in detection of 109 genes
with significantly deregulated expression. Many of them are involved in cancerrelated pathway. Additional microarray analysis revealed significantly amended
focal adhesion signalling pathway. In additions, the alterations in gene expression
with consequences in focal adhesion pathway were clearly mirrored in functional
assays. Thus we can say that our study provided the molecular insight into
downstream signal transduction pathways driven by CA IX in tumour fibroblasts
using an inducible RNAi approach. These findings support the evidence collected
during two decades upon the discovery that CA IX protein acts in different stages
of tumour development via its pH regulatory capacity, as well as ability to modify
intercellular contacts and its pro-metastatic propensity.
Acknowledgements
This study was supported by grants no. 2/0194/09 and 2/0130/11 from the
Scientific Grant Agency of the Ministry of Education of the Slovak Republic and
the Slovak Academy of Sciences, from the Research and Development Support
Agency (contracts APVV -0108-10 and DO -7RP-0017-09) and from EU (7FP
Collaborative project METOXIA) and from the Research and Development
59
Operational Program funded by ERDF (project PV -INF-PAT, ITMS
26240220032).
References
[1]
Saarnio J, Parkkila S, Parkkila AK, Haukipuro K, Pastorekova S, et al.
Immunohistochemical study of colorectal tumors for expression of a novel
transmembrane carbonic anhydrase, MN/CA IX, with potential value as a
marker of cell proliferation. Am J Pathol 1998; 153(1): 279-85.
[2]
Pastorekova S. and Zavada J. Carbonic anhydrase IX (CA IX) as a potential
target for cancer therapy. Cancer Therapy 2004; 2: 245 – 262.
[3]
Supuran CT, Carbonic anhydrases. Catalytic mechanisms, distribution and
physiological roles. In Supuran CT, Scozzafava A, Conway J. editors.
Carbonic Anhydrase: Its Inhibitors and Activators. Boca Raton-LondonNew York- Washington, DC: CRC Press. 1–24. 2004.
[4]
Zavada J, Zavadova Z, Pastorek J, Biesova Z, Jezek J, et al. Human
tumourassociated cell adhesion protein MN/CA IX: Identification of M75
epitope and of the region mediating cell adhesion. Br J Cancer 2000;
82:1808–1813.
[5]
Svastova E, Zilka N, Zatovicova M, Gibadulinova A, Ciampor F, et al.
Carbonic anhydrase IX reduces E-cadherin-mediated adhesion of MDCK
cells via interaction with beta-catenin. Exp Cell Res 2003; 290: 332-345.
[6]
Morgan PE, Pastorekova S, Stuart-Tilley AK, Alper SL, Casey JR.
Interactions of transmembrane carbonic anhydrase, CA IX, with bicarbonate
transporters. Am J Physiol Cell Physiol 2007; 293(2): C738-48.
[7]
Svastova E, Witarski W, Csaderova L, Kosik I, Skvarkova L, et al.
Carbonic anhydrase IX interacts with bicarbonate transporters in
lamellipodia and increases cell migration via its catalytic domain. J Biol
Chem 2012; 287(5): 3392-402.
[8]
Radvak P, Repic M, Svastova E, Takacova M, Csaderova L, et al.
Suppression of carbonic anhydrase IX leads to aberrant focal adhesion and
decreased invasion of tumor cells. Oncol Rep 2013; 29(3): 1147-53.
60
Impact of Carbonic Anhydrase IX Shedding
on Pro-metastatic Characteristics of Tumor
Cells
Ivana Vidličková1,2, Miriam Zaťovičová1,4, Lucia
Csaderová1,3, Monika Radvánszka4; Magdaléna
Vreštiaková4; Stanislav Stuchlík2, Jaromír Pastorek1,
Silvia Pastoreková1,4
1
Department of Molecular Medicine, Institute of Virology,
Slovak Academy of Sciences, Bratislava; 2Department
of Molecular Biology, Faculty of Natural Sciences,
Comenius University, Bratislava; 3Centre for Molecular
Medicine, Slovak Academy of Sciences, Bratislava;
4
BioScience Slovakia, Bratislava, Slovak Republic
Introduction
Insufficient oxygen supply, hypoxia, is recently one of the most intensively studied
characteristics of solid tumors. The research focuses mainly on proteins that are
regulated by hypoxia, including the transmembrane protein carbonic anhydrase IX
(CA IX). CA IX is a hypoxia-induced [1] catalytically active carbonic anhydrase
isoform frequently expressed in solid tumors [2]. CA IX is involved in two
phenomena important for the development of tumor phenotype - pH regulation
[3,4] and control of cell adhesion [5]. Extracellular domain (ECD) of this protein
can be shed to extracellular space in a controlled manner [6,7]. Posttranslational
cleavage, shedding, is an important regulatory mechanism for many
transmembrane receptors and adhesion proteins. It may cause a significant
reduction of the protein abundance on the cell surface, potentially leading to
inhibition of its function. Moreover, released soluble extracellular domains may
have effector functions and shedding may also be a prerequisite for launching the
signal transduction mediated by the cytoplasmic part of the shed protein. Shedding
is a process responding to various physiological stimuli with typical ability to
modulate cellular characteristics such as migration, adhesion and proliferation [8].
In our laboratory it was previously showed that the basal shedding of the CA IX
ECD affects roughly 10% of the CA IX molecules and that it can be markedly
elevated by severe hypoxia, activation with modulators of the phosphorylation
signaling and inducers of cell death. CA IX ECD is also detectable in body fluids
of cancer patients. Metalloproteinase TACE/ADAM17 was identified as a protease
responsible for the activated release of the CA IX ECD [9]. One approach how to
reveal the importance of CA IX shedding for cell biology can be the investigation
of cells incapable to shed this protein.
61
Material and methods
Cell lines
Eukaryotic cell lines MDCK (Madin-Darby Canine Kindney epithelial cells) and
C-33 A (human epithelial cells derived from cervical carcinoma) have been stably
transfected with CA IX protein. Three types of transfectants were prepared from
both of them - first expressing full-length form of CA IX protein (FL-CA IX),
second expressing non-shed variant of the CA IX with 10aa deletion in the
membrane-proximal region (NS-CA IX) and third was mock-transfected with
plasmid carrying neomycin resistance (neo). Stable cell lines were prepared using
immunomagnetic cell selection with MAb M75 (IS SAS).
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
The capture antibody V/10 (10 µg/ml, IS SAS) was immobilised on the surface of
microplate wells overnight at RT. After blocking and washing, the cell
extracts/media diluted in PBS were added to the coated wells for 2 h at RT. The
attached antigen was then allowed to react 2h with biotinylated MAbs M75+IV/18
diluted 1:7500 (200 ng/ml; IS SAS) in 1% BSA in PBS. The amount of bound
detector antibody was determined after 1 h incubation with the peroxidaseconjugated streptavidin (Pierce) using a substrate orthophenylene diamine (SigmaAldrich). Absorbance was measured at 492 nm (Synergy HT, BioTek).
Flow cytometry
Detached cells were first incubated for 10 min at RT with MAb M75 (IS SAS)
diluted in DMEM cultivation medium with 10% FCS to final concentration
1µg/ml. Then the antibody was removed by centrifugation and washing two times
with versen. Secondary anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody (Invitrogen) diluted
1:3000 in DMEM cultivation medium with 10% FCS was added for 10 min at RT.
After antibody removal and second washing step, CA IX membrane expression
was analysed on Guava easyCyte 6HT (Millipore) flow cytometer.
Immunoblotting
The cells plated at a density of 50 000 cells/cm2 were incubated for 48 h in
normoxia or hypoxia (2% O2, Ruskin Technologies) at 37°C. Then were the cells
rinsed and extracted with the RIPA extraction buffer. The extracts were centrifuged
(10 min at 13000 rpm) and total protein concentrations in supernatants were
determined by BCA assay. Samples of 50 µg total proteins were separated using
electrophoresis in the 10% SDS-PAGE and blotted onto the PVDF membrane
(Millipore). Before immunodetection, the membrane was blocked in blocking
buffer containing 5% non-fat milk in PBS with 0,2% Nonidet P-40 for 1 h.
Followed by incubation for 1 h with MAb M75 culture medium (IS SAS) diluted
1:2 in the blocking buffer. Then the membrane was washed, incubated for 1 h with
anti-mouse secondary antibody (Sigma-Aldrich), washed again and developed with
the ECL detection system.
xCELLigence – proliferation and migration assay
Proliferation and migration assays was performed using the xCELLigence RTCA
DP Instrument (Roche). Impedance measurements were performed in E-Plates 16
(Roche) for the proliferation assay and in CIM-Plates 16 (Roche) for the migration
62
assay. Experiments were set up according to the manufacturer's instructions. The
chemotactic signal for the migration assay was provided by suspending the cells in
serum-free medium in the upper chamber and supplying 10% FCS in the lower
chamber. Cell index was monitored every 15 min for the duration of the
experiment.
Results
Characterization of NS-CA IX versus FL-CA IX cell line
The level of CA IX shedding can be determined using ELISA assay. We have
shown, that in cell lines expressing the NS-CA IX form the proportion of released
CA IX ECD is close to zero. In normoxic and hypoxic conditions, not only basal
but also activated shedding (PMA induction) is inhibited. The number of CA IXpositive cells in population was monitored using flow cytometry. Truncation of the
NS-CA IX form was confirmed by immunoblotting. We demonstrated also correct
membrane localization by immunofluorescense. (Fig.1)
a)
b)
cell line
% CA IX positive
cells in population
C-33 neo
C-33 FL-CA IX
C-33 NS-CA IX
MDCK neo
MDCK FL-CA IX
MDCK NS-CA IX
0,29
97,12
98,35
0,36
97,50
91,71
c)
d)
Figure 1: NS-CAIX cell lines characterization a) ELISA assay, results were illustrated as % of
the total amount of CA IX in cell lysates (NO - normoxia; PMA - Phorbol 12-myristate 13acetate). b) Flow cytometry analysis of the transfected cell lines. c) Immunoblotting; C-33 cell
lysates; 1/2 – neo NO/HY; 3/4 – FL-CA IX NO/HY; 5/6 – NS-CA IX NO/HY. d)
Immunofluorescence, MDCK NS-CA IX cells, MAb VII/20 (IV SAS) + Alexa Fluor 488
(Invitrogen), Zeiss LSM 510, 40x.
63
Pro-metastatic characteristics of the NS-CA IX cells
We evaluated the pro-metastatic features of the NS-CA IX cells in real-time
settings. In this way we were able to demonstrate that NS-CA IX cells exhibit
faster migration compared to FL-CA IX cells. Differences in migration rate were
confirmed for both cell lines in normoxic and also hypoxic conditions using
xCELLigence and wound-healing assays. (Fig.2)
Figure 2: xCELLigence migration assay Cell index of the C-33 cells (left) and MDCK cell
(right), normoxia. Green trace represents FL-CA IX cells, red trace NS-CA IX cells and blue
trace is for control sample with sefum-free medium in lower chamber. Traces show the average
of quadruplicate wells.
Discussion and Conclussions
As CA IX belongs to the proteins significantly associated with tumor phenotype, its
physiological properties are intensively studied. In order to understand the process
of shedding, a typical post-translational modification of CA IX, we have prepared a
series of deletants in the membrane-proximal region of the protein, where the
cleavage should occur. According our findings, the deletion of 10 amino acids in
CA IX molecule (393-402aa) almost completely prevents cleavage of the protein. It
is questionable whether this deletion encompasses the natural cleavage site for
metalloproteinase ADAM-17 or causes a conformational change of CA IX protein,
which sterically prevents the access of the proteinase. However, the preparation of
the non-shed form of CA IX allowed us to investigate the impact of the CA IX
shedding on cells. We confirmed differences in migration rate in normoxic and also
hypoxic conditions using xCELLigence and wound-healing assays. This finding
points to the important physiological role of CA IX shedding, which is likely to be
relevant in the context of metastasis. Impaired CA IX shedding could theoretically
also affect pH regulation, expression level of other proteins or invasiveness of
cancer cells. Potential unique features of NS-CA IX cell lines are currently being
investigated.
64
Acknowledgement
Grant Support: 7FP project METOXIA, APVV-0658-11, APVV-DO7RP-0017-09,
Slovak Scientific Grant Agency (VEGA 2/0134/12), Research and Development
Operational Program funded by the ERDF (project ITMS 26240220062).
References
[1]
Wykoff CHC, Beasley NJP, Watson PH, Turner K.J, Pastorek JH, et al.
Hypoxia-inducible regulation of tumor-associated carbonic anhydrases.
Cancer Res. 2000; 60: 7075–7083.
[2]
Pastorekova S, Zavada J. Carbonic anhydrase IX (CA IX) as a potential
target for cancer therapy. Cancer Therapy 2004; 2: 245–262.
[3]
Svastova E, Hulikova A, Rafajova M, Zatovicova M, Gibadulinova A et al.
Hypoxia activates the capacity of tumor-associated carbonic anhydrase IX
to acidify extracellular pH. FEBS Letters 2004; 577: 439–445.
[4]
Ditte P, Dequiedt F, Svastova E, Hulikova A, Ohradanova-repic A et al.
Phosphorylation of carbonic anhydrase IX controls its ability to mediate
extracellular acidification in hypoxic tumors. Cancer Research 2011; 71:
7558–67.
[5]
Svastova E, Zilka N, Zatovicova M, Gibadulinova A, Ciampor F et al.
Carbonic anhydrase IX reduces E-cadherin-mediated adhesion of MDCK
cells via interaction with β-catenin. Experimental Cell Research 2003; 290:
332–345.
[6]
Zavada J, Zavadova Z, Zatovicova M, Hyrsl L, Kawaciuk I. Soluble form
of carbonic anhydrase IX (CA IX) in the serum and urine of renal
carcinoma patients. British Journal of Cancer 2003; 89: 1067–1071.
[7]
Zatovicova M, Pastorekova S. Modulation of cell surface density of
carbonic anhydrase IX by shedding of the ectodomain and endocytosis.
Acta virologica 2013; 57: 257–264.
[8]
Reiss K, Ludwig A, Saftig P. Breaking up the tie: disintegrin-like
metalloproteinases as regulators of cell migration in inflammation and
invasion. Pharmacology & therapeutics 2006; 111: 985–1006.
[9]
Zatovicova M, Sedlakova O, Svastova E, Ohradanova A, Ciampor F et al.
Ectodomain shedding of the hypoxia-induced carbonic anhydrase IX is a
metalloprotease-dependent process regulated by TACE/ADAM17. British
Journal of Cancer 2005; 93: 1267–1276.
65
Carbonic anhydrase IX and glycolysis: a potential
link revealed by proteomic profiling
Martin Benej1, Eliška Švastová1, Marko Repič1, Radivojka
Vulič2, Monica Vitale3,4, Nicola Zambrano3,4, Andrea
Scaloni5, Juraj Kopáček1, Silvia Pastoreková1
1
Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences,
Bratislava, 2 Faculty of Natural Sciences, Commenius
University, Bratislava, 3 Dipartimento di Biochimica e
Biotecnologie Mediche, Università degli Studi di Napoli
Federico II, 80131 Napoli, Italy, 4 CEINGE Biotecnologie
Avanzate, 80145 Napoli, Italy, 5 Proteomics and Mass
Spectrometry Laboratory, ISPAAM, National Research
Council, 80147 Napoli, Italy
Introduction
Hypoxia is one of the key factors defining the tumor microenvironment. As the
demand of rapidly increasing tumor mass for oxygen exceeds the supply capacity
of the poor tumor vasculature, hypoxic regions start to emerge within the solid
tumor tissue. In order to sustain the energetic need, the tumor cells gradually shift
their metabolism from oxidative phosphorylation towards anaerobic glycolysis.
The increased glycolytic metabolism leads to excessive production of lactic acid,
carbon dioxide and protons. Extrusion of these acidic metabolic products preserves
neutral intracellular pH and causes acidification of the extracellular tumor
microenvironment. Hypoxia and related acidosis represent environmental stress
factors, which tumor cells address by triggering the expression of multiple genes
that function in angiogenesis, glucose transport and pH regulation, among others.
Carbonic anhydrase IX (CA IX) is a zinc metalloenzyme that catalyzes reversible
hydration of carbon dioxide to bicarbonate ions and protons [1]. In cooperation
with bicarbonate transporters, the catalytic activity of CA IX contributes to
neutralization of the intracellular pH, and, simultaneously, to significant
acidification of the extracellular pH [2]. Hypoxia and acidosis support the
aggressive/metastatic potential of tumor cells. The role of CA IX in this process
goes beyond its contribution to extracellular acidosis; it was proven that the protein
is involved also in cell migration as a part of the metastatic cascade [3]. Finally, the
expression of CA IX has also a great value as a diagnostic/prognostic factor in
numerous types of solid tumors. In this study, we present evidence describing a
potential relationship between CA IX and glycolytic metabolism.
Material and Methods
Cell lines
For the study, we used HeLa cancer cell line derived from cervical cancer tissue,
namely HeLa clones after stable transfection with doxycycline-inducible ca9
shRNA silencing system (described previously in [4]).
66
Proteomic profiling
For proteomic experiments, 1.5x106 HeLa cells were seeded on 10 cm Petri dishes,
incubated 48h in DMEM media containing 1mM DMOG with concurrent 48h
serum starvation (0.5% fetal calf serum). shRNA-mediated silencing of CA IX
expression was induced by addition of 250 pg doxycycline into growth media 72
hours prior to seeding. Cell lysates were prepared according to standard protocols
for proteomic experiments. Briefly, growth media were removed and cell cultures
were washed with ice-cold PBS, incubated on ice for 20 minutes with 600 μl of
lysis buffer, scratched and resuspended. Prior to centrifugation, the lysates were
passaged through insulin syringes to discard nuclear DNA. Supernatants were
precipitated in acetone:methanol (ratio 9:1) solution and incubated overnight.
Resulting precipitates were centrifuged, air-dried and resuspended in 7M Urea/2M
Thiourea/4% CHAPS (UTC) solution. Protein concentrations were determined
using standard Bradford assay.
For proteomic profiling, we used 2D-Differential In-Gel Electrophoresis (2DDIGE). 50 μg of each sample in triplicate was labelled with 400 pmol of Cy3 or
Cy5 fluorescent dye, according to the experiment setup. As internal standard, 25 μg
of all sample replicates were mixed and labelled with 400 pmol of Cy2 dye. The
labelling reaction was stopped by addition of 1/10 volume of 10 mM lysine after 30
minutes of on-ice incubation in the dark. Corresponding Cy-labelled replicates of
HeLa ca9 RNAi and HeLa control samples were then mixed with 1/3 volume of
Cy2-labelled internal standard, mixed with loading buffer and rehydrated overnight
on pH 3-10 non-linear IPG strips. Rehydrated IPG strips were subjected for
isoelectric focusing (IEF). After one-dimensional separation according to the
isoelectric point (pI), the IPG strips were equilibrated for 2x15 minutes with
equilibration solutions containing sodium dodecyl sulfate (SDS) and either
dithiothreitol (DTT, solution 1) or iodoacetamide (IAA, solution 2). Equilibrated
IPG strips were placed on top of 12% polyacrylamide (PAGE) gels and separated
in the second dimension according to the molecular weight of the proteins in the
sample. Resulting two dimensional profiles of the HeLa proteome were obtained
by high resolution scanning of each channel (Cy2, Cy3 and Cy5, separately).
Alterations of protein abundance with respect to CA IX silencing were determined
by biostatistic comparison of proteomic profiles using DeCyder 6.0 software (GE
Healthcare). Protein spots of interest were excised from the gel using automated
spot picker. Excised spots were digested with trypsin, purified and analyzed using
Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometer. Resulting
data were analyzed using bioinformatic tools and clustered according to their
functional annotations harbored in respective databases. Candidate proteins were
verified by immunoblotting.
Immunoblotting
To validate the proteomic results, 1x106 of HeLa clones after 72h incubation
with/without 250 pg doxycycline were seeded on 6 cm Petri dishes. On the
following day, the cells were incubated 48h in 2% hypoxia (2% O2, 5% CO2) and
concurrently serum-starved for 48h (0.5% fetal calf serum). Protein lysates were
67
prepared according to standard protocols. Protein concentrations were determined
using BCA kit (Thermo Scientific). For immunoblots, 100 μg of proteins were
separated on 10% PAGE gel and blotted 5h at 300 mA. After overnight blocking in
5% milk containing either 0,2% NP-40 (for CA IX) or 0,1% Tween 20, desired
proteins were incubated in primary antibodies, corresponding secondary antibodies
conjugated with horseradish peroxidase and developed in Enhanced
chemiluminiscence (ECL) solution using Kodak In Vivo Imaging System (Kodak).
Results
Comparison of HeLa proteome profiles with respect to CA IX silencing revealed
32 proteins with significantly altered expression pattern (Table 1). Most prominent
changes reflecting CA IX silencing affected glycolytic metabolism, metabolism of
nucleic acids, proteins and lipids; and components of the translational machinery.
To investigate the potential relationship between CA IX and the glycolytic
metabolism, the proteomic results were validated using immunoblotting. Western
blot results confirmed altered levels of all four of the analyzed glycolytic enzymes
(alpha-enolase, phosphoglycerate kinase 1, aldolase A and lactate dehydrogenase)
relative to CA IX silencing.
Cytoskeleton (3)
Upregulated
Actin
Prelamin-A/C
Downregulated
Profilin-1
Metabolism (9)
Upregulated
Prolyl endopeptidase
Serpin B6
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H
Cytochrome b-c1 complex subunit 1
Superoxide dismutase
Downregulated
Peroxiredoxin-6
Cathepsin B heavy chain
GTP cyclohydrolase 1 feedback regulatory protein
Prolyl 4-hydroxylase subunit alpha-1
HeLa ca9 RNAi vs. HeLa control
Glycolysis (9)
Translation (4)
Upregulated
Upregulated
Gamma-enolase
Histidine-tRNA ligase
L-lactate dehydrogenase B chain
Eukaryotic initiation factor 4A-I
Downregulated
Glycyl-tRNA synthetase
Triosephosphate isomerase
Downregulated
Phosphoglycerate kinase
60S acidic ribosomal protein P0
Phosphoglycerate mutase 1
Fructose-bisphosphate aldolase A
L-lactate dehydrogenase A chain
Phosphoacetylglucosamine mutase
Enolase-1
Chaperones (2)
Signaling (1)
Upregulated
Upregulated
Stress-70 protein
Rho GDP-dissociation inhibitor 1
Downregulated
60 kDa heat shock protein
Transport (4)
Upregulated
Annexin A6
Protein NDRG1
Annexin A5
Downregulated
Annexin A2
Table 1. Data clustering according to functional annotations
Discussion with conclusions
In this study, we present evidence describing the impact of CA IX silencing on the
whole proteome of HeLa cancer cell line. Proteomic profiling revealed several
aspects of tumor phenotype which are significantly affected by silencing of CA IX
expression, most prominent of which is the glycolytic pathway. As the shift
towards glycolytic metabolism represents cancer cells´ adaptation to unfavorable
hypoxic conditions, a link between hypoxic marker CA IX and glycolytic
metabolism may provide invaluable insight into the dynamics of cancer cell
adaptation to limiting conditions. Our results demonstrate the relation between CA
IX levels and the levels of four glycolytic enzymes. As for future perspectives,
68
responsible regulatory event is being investigated; however, further
experimentation is required in this matter. These data are expected to contribute to
better understanding of the role of CA IX in cancer, which is necessary for the
design of potential CA IX-targeted therapy strategies.
Acknowledgement
We thank Research and Development Support Agency (APVV-0658-11), 7th
Framework program of EU (Collaborative project METOXIA), Slovak Scientific
Grant Agency (VEGA 2/0130/11), Research and Development Operational
Program funded by the ERDF (project ITMS 26240220062) for financial support.
References
[1]
Pastorekova S, Zavadova Z, Kostal M, Babusikova O, Zavada J. A novel
quasi-viral agent, MaTu, is a two-component system. Virology 1992; 187
(2):620-626.
[2]
Svastova E, Hulikova A, Rafajova M, Zat'ovicova M, Gibadulinova A, et al.
Hypoxia activates the capacity of tumor-associated carbonic anhydrase IX
to acidify extracellular pH. FEBS letters 2004; 577 (3):439-445.
[3]
Svastova E, Witarski W, Csaderova L, Kosik I, Skvarkova L, et al.
Carbonic Anhydrase IX Interacts with Bicarbonate Transporters in
Lamellipodia and Increases Cell Migration via Its Catalytic Domain. J Biol
Chem 2012; 287 (5):3392-3402.
[4]
Radvak P, Repic M, Svastova E, Takacova M, Csaderova L et al.
Suppression of carbonic anhydrase IX leads to abberant focal adhesion and
decreased invasion of tumor cells. Oncol Rep 2013; 29 (3)1147-1153.
69
ABC transportéry, hypericín a bunky
„side population“
Jana Vargová, Jaromír Mikeš, Barbora Kuchárová,
Lucia Mikešová, Rastislav Jendželovský, Ján Kovaľ,
Ľubomír Čulka, Peter Fedoročko
Univerzita Pavla Jozefa Šafárika v Košiciach,
Prírodovedecká fakulta, Ústav biologických
a ekologických vied, Moyzesova 11, 040 01 Košice
Úvod
Rezistencia a recidíva sa ako dva najzávažnejšie aspekty nádorových ochorení
spájajú vo svetle najnovších poznatkov s existenciou zriedkavých subpopulácií
buniek označovaných aj ako kmeňové bunky nádorov (CSC). Jednou z metodík na
identifikáciu CSC je analýza tzv. „side population“ (SP), založená na zvýšenej
schopnosti týchto buniek zbavovať sa xenobiotík, vrátane fluorescenčného farbiva
Hoechst 33342, a to vďaka intenzívnemu efluxu sprostredkovaného ABC
transportérmi. Hypericín (HYP) je známym fotosenzibilizátorom, no účinným je aj
bez aktivácie svetlom [1]. Na jednej strane pôsobí ako inhibítor molekúl kľúčových
pre udržanie vlastností kmeňových buniek[2], na strane druhej je pravdepodobným
substrátom, a zároveň stimulátorom niektorých z ABC transportných proteínov
[3,4].
Zamerali sme sa preto na preskúmanie účinku neaktivovaného HYP na zastúpenie
subpopulácie SP buniek, ako aj vlastností ním ovplyvnených buniek pľúcneho
karcinómu A549. Tiež sme zisťovali vplyv stimulovanej aktivity transportných
proteínov (BCRP, MRP1 a MDR1/P-gp) na kinetiku inkorporácie HYP, farbiva
Hoechst 33342, ako aj na výslednú veľkosť SP subpopulácie.
Materiál a metódy
Použité bunkové línie
Bunková línia pľúcneho adenokarcinómu (A549), promyelocytárna leukemická
línia HL-60 a subklony s nadmernou expresiou génov pre vybrané transportné
proteíny (HL-60/MDR1, HL-60/MRP1 a PLB-ABCG2) boli kultivované v
príslušných médiách (F-12K a RPMI 1640) doplnených o 10% fetálneho
hovädzieho séra, pri konštantných podmienkach (37°C, 95% vlhkosti a 5%
podielom CO2).
Experimentálna schéma
Pri štúdiu vplyvu neaktivovaného hypericínu bola experimentálna schéma
nasledovná: 24 hod po nasadení buniek A549 na Petriho misky (3000 buniek/cm2)
k nim bol pridaný HYP (1 µM), resp. čerstvé médium so sérom. Po ďalších 16 hod
bolo v príslušnej skupine vzoriek médium buď vymenené za čerstvé (skupiny
70
„kontrola s výmenou“ a „hypericín s výmenou“), alebo ponechané až do analýzy
(skupiny „kontrola bez výmeny“ a „hypericín bez výmeny“) (48 hod).
Analýza „side population“
Metodiku „side population“ sme aplikovali na základe štandardného postupu [5],
s použitím finálnej koncentrácie Hoechst 33342 5 µg/ml v SP pufri (HBSs, 2 mM
HEPES, 2% FBS). Ako negatívna kontrola slúžil rezerpín (5 mM) a pred
samotným meraním bol ku každej vzorke pridaný propídium jodid (PI) (1 µg/ml)
pre elimináciu mŕtvych buniek. Takto pripravené vzorky boli vyhodnocované, resp.
sortrované pomocou prístroja BD FACSAriaII SORP.
Test klonogenicity
Klonogénna schopnosť buniek A549 bola sledovaná dvojakým spôsobom.
V prvom prípade bola použitá technika „FACS“ (fluorescenciou aktivovaný
sorting) (6), kedy sme jednotlivé skupiny sortrovali metódou 1 bunka/jamku do 96jamkovej platničky s vopred pripraveným čerstvým alebo čerstvým
a kondiciovaným (1:1) médiom so sérom. Po 7-dňovej inkubácii bola klonogénna
schopnosť vyhodnotená na základe metabolickej aktivity buniek s resazurinom.
Ako druhú sme použili klasickú metódu výsevu 500 živých buniek/jamku v
6-jamkovej platni. Po 7-dňovej inkubácii bola klonogénna schopnosť vyhodnotená
totožne ako v prvom prípade, s použitím resazurinu.
Kinetika inkorporácie Hoechst-u 33342 a HYP
K suspenzii buniek A549, HL-60, HL-60/MDR1, HL-60/MRP1 a PLB-ABCG2
(koncentrácia 1x106/ml SP pufru) bol pridaný PI (1 µg/ml). Takto pripravené
vzorky boli merané prietokovým cytometrom (pozri ďalej) po dobu 3 min
a následne bol k nim pridaný Hoechst 33342 alebo HYP o výslednej koncentrácii 5
µg/ml, resp. 1 µM. Bunkové suspenzie boli v prípade farbenia s Hoechst-om 33342
merané prístrojom BD FACSAriaII SORP za neustáleho miešania pri 37°C po
dobu 45 min. V prípade sledovania kinetiky inkorporácie HYP boli vzorky merané
za občasného miešania po dobu 45 min prietokovým cytometrom FACSCalibur.
Výsledky a diskusia
Koncept existencie nádorových kmeňových buniek otvoril dvere alternatívnym
prístupom vo vyvíjaní efektívnej protinádorovej liečby. CSC majú vlastnosti
podobné fyziologickým kmeňovým bunkám, no ich spoločným menovateľom je
predovšetkým schopnosť vytvoriť nádor de novo. Preto ich precízna identifikácia,
ako aj odhalenie procesov podieľajúcich sa na ich determinácii, regulácii
a proliferácii sú základným konceptom pre rozvoj selektívnej terapie. Analýza
„side population“ predstavuje jednoduchý spôsob identifikácie buniek schopných
efektívnej eliminácie rôznych xenobiotík. Tento fenomén je po molekulárnej
stránke spájaný so zvýšenou hladinou ABC transportných proteínov, predovšetkým
BCRP a Pg-p.
Hypericín (HYP) je látka prírodného pôvodu produkovaná napr. ľubovníkom
bodkovaným (Hypericum perforatum L.), ktorého výťažky sa v ľudovej medicíne
hojne používajú pri zmiernení úzkostných stavov. V onkológii je vďaka svojim
fotosenzibilizačným
vlastnostiam
známy
predovšetkým
v spojitosti
71
s fotodynamickou terapiou (PDT), protinádorovými účinkami však disponuje aj v
neaktivovanom stave [1]. Jeho pôsobenie bez aktivácie svetlom sa uskutočňuje
prostredníctvom dráh, ktoré zahŕňajú inhibíciu molekúl kľúčových pre udržanie
vlastností kmeňových buniek [2]. Iná štúdia však poukázala na silnú stimulačnú
schopnosť hypericínu na hladinu efluxného proteínu P-gp na modeli buniek
intestinálneho karcinómu [3]. Podobné výsledky priniesla aj jedna z našich štúdií, v
ktorej inkubácia s 0,1 µM HYP vyvolala nárast hladín transportných proteínov
BCRP a MRP1 v bunkách HT-29. Hypericín bol aj na základe akumulačných
štúdií zároveň označený ako ich možný substrát [4], čo naznačuje jeho potenciálne
pleiotropný účinok na vlastnosti CSC. Nakoľko je metodika SP úzko prepojená
s množstvom a aktivitou ABC transportných proteínov, overili sme zmeny
v zastúpení SP populácie po pôsobení tejto látky. Hoci sme pozorovali výrazné
prepojenie SP frakcie a populácie so zníženým obsahom HYP (88% zhoda), ďalšie
výsledky boli v rozpore s naším predpokladom. HYP totiž potlačil SP fenotyp
buniek A549, a to koncentračne závislým, avšak reverzibilným spôsobom.
Predpokladáme, že popísaný dej môže prebiehať prostredníctvom dráh, ktoré HYP
inhibuje v tme, a zároveň sú kľúčové aj pre udržanie vlastností typických pre
kmeňové bunky nádorov. Je to napríklad proteín Hsp90, ktorý je účinkom HYP
v tme polyubikvitinovaný, čím sa oslabuje jeho „šaperónová“ aktivita a dochádza
k destabilizácii klientskych proteínov [2]. Prepojenie CSC s touto molekulou bolo
preukázané v prípade chronickej myeloidnej leukémie, keď použitie inhibítora
Hsp90, IPI-504, viedlo k potlačeniu subpopulácie CSC [7].
Zamerali sme sa preto aj na sledovanie zmien klonogénnej schopnosti takto
ovplyvnených buniek. V klasickom modeli sa klonogénna schopnosť účinkom
HYP zvýšila, avšak po vyhodnotení klonogénnej expanzie jednotlivých SP buniek
sme pozorovali zaujímavý paradox. Skupina ovplyvnená HYP síce nevykazovala
signifikantné zvýšenie klonogenicity, avšak vytvorené kolónie boli najväčšie.
Sledované rozdiely môžu súvisieť so zvýšenou závislosťou buniek na faktoroch
prostredia, tzv. „niché“ nádoru. Pre overenie tohto tvrdenia sme zvolili sorting do
kondiciovaného média, ktoré výrazne podporilo klonogénnu schopnosť
predovšetkým SP buniek, a tým aj náš predpoklad.
Pri skúmaní vplyvu jednotlivých transportných systémov (BCRP, MRP1 a Pgp/MDR-1) ako na SP fenotyp, tak aj na kinetiku inkorporácie HYP, sme využili
leukemickú líniu
HL-60, subklony s nadmernou expresiou génov kódujúcich
tieto efluxné pumpy (HL-60/MDR1, HL-60/MRP1) a leukemickú líniu
s nadmernou expresiou génu ABCG2 (PLB-ABCG2). Výsledky potvrdili
významný podiel proteínov BCRP a P-gp na „výskyte“ SP fenotypu, nakoľko
zastúpenie SP buniek sa pri štandardných podmienkach pohybovalo v línii HL-60
na úrovni 12%, pričom v líniách HL-60/MRP1, HL-60/MDR1 a PLB-ABCG2 to
bolo 6%, 62% a 98% SP. Na kinetike HYP sa už počas prvých 45 min
signifikantne podieľa predovšetkým proteín BCRP, nakoľko obsah tejto látky bol v
línii PLB-ABCG2 niekoľkonásobne nižší, ako v porovnaní s líniou HL-60 a aj
zvyšnými dvoma líniami (HL-60/MDR1, HL-60/MRP1). Rovnaký efekt bol
pozorovaný 16 hod po inkubácii s 0,1 µM HYP [4].
72
Dosiahnuté výsledky prezentované v tejto práci korešpondujú s predchádzajúcimi
zisteniami našej pracovnej skupiny a podporujú predpoklad, že hypericín je
potenciálnym substrátom ABC transportných púmp, a to predovšetkým proteínu
BCRP, ktorého hladina (spolu s hladinou P-gp) je hlavným determinantom SP
fenotypu. Zlyhanie terapie založenej na fotodynamických účinkoch hypericínu
(napr. HYP-PDT) tak môže mať úzky súvis s existenciou CSC. Na druhej strane,
neaktivovaný HYP stimuluje agresívne vlastnosti nádorových buniek, a teda
užívanie prípravkov s obsahom tejto látky by v praxi mohlo negatívne vplývať na
priebeh onkologických ochorení.
Poďakovanie
Práca bola finančne podporená grantovými agentúrami pri plnení cieľov
nasledujúcich projektov: APVV-0040-10, SEPO-II (ITMS 26220120039), VEGA
1/0626/11, VVGS-PF-2013-110 a VVGS-2013-115.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Blank M, Lavie G, Mandel M, Hazan S, Orenstein A et al. Antimetastatic
activity of the photodynamic agent hypericin in the dark. Int. J. Cancer.
2004; 111: 596-603.
[2]
Blank M, Mandel M, Keisari Y, Meruelo D, Lavie G. Enhanced
ubiquitinylation of heat shock protein 90 as a potential mechanism for
mitotic cell death in cancer cells induced with hypericin. Cancer Res. 2003;
63: 8241-8247.
[3]
Perloff MD, von Moltke LL, Störmer E, Shader RI, Greenblatt DJ. Saint
John's wort: an in vitro analysis of P-glycoprotein induction due to extended
exposure. Br J Pharmacol. 2001; 134: 1601-1608.
[4]
Jendželovský R, Mikes J, Koval' J, Soucek K, Procházková J et al. Drug
efflux transporters, MRP1 and BCRP, affect the outcome of hypericinmediated photodynamic therapy in HT-29 adenocarcinoma cells.
Photochem Photobiol Sci. 2009; 8:1716-1723.
[5]
Goodell MA, Brose K, Paradis G, Conner AS, Mulligan RC. Isolation and
functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating
in vivo. J Exp Med. 1996; 183: 1797-1806.
[6]
Fedr R, Pernicová Z, Slabáková E, Straková N, Bouchal J et al. Automatic
cell cloning assay for determining the clonogenic capacity of cancer and
cancer stem-like cells. Cytometry A. 2013; 83: 472-482.
[7]
Peng C, Brain J, Hu Y, Goodrich A, Kong L et al. Inhibition of heat shock
protein 90 prolongs survival of mice with BCR-ABL-T315I-induced
leukemia and suppresses leukemic stem cells. Blood. 2007; 110: 678-685.
73
Fotoexcitácia 7H-dibenzo[c,g]karbazolu
vplyvom UVA žiarenia – indukcia reaktívnych
foriem kyslíka a oxidačných poškodení DNA
Eva Sedlačková, Katarína Kozics, Michal Pastorek,
Alena Gábelová.
Ústav experimentálnej onkológie SAV, 833 91 Bratislava
Úvod
Ultrafialové žiarenie (UV žiarenie) sa považuje za hlavný etiologický faktor
v incidencii rakoviny kože. Podľa údajov svetovej zdravotníckej organizácie WHO
z roku 2007 je každoročne diagnostikovaných viac ako 2 milióny nových prípadov
nemelanómových foriem rakoviny kože, z ktorých vyše stotisíc pripadá na malígne
melanómy. UVA žiarenie je absorbované molekulou DNA minimálne, preto sa
jeho účinky dlhé roky nepovažovali za karcinogénne [1]. V súčasnosti je UVA
žiarenie zaradené do skupiny dokázaných karcinogénov [2]. UVA svetlo vyvoláva
škodlivé biologické účinky nepriamo, prostredníctvom endogénnych molekúl,
fotosenzibilizátorov, ktoré sú schopné absorbovať svetelnú energiu. Ich
fotoaktivácia vedie k vzniku reaktívnych intermediátov, ktoré poškodzujú DNA
a iné dôležité makromolekuly v bunke. Vďaka kondenzovaným aromatickým
jadrám, pôsobia mnohé organické environmentálne polutanty, napr. benzo(a)pyrén
(BaP), ako exogénne fotosenzibilizátory. Predpokladá sa, že spolupôsobenie
slnečného žiarenia a chemických látok v znečistenom prostredí významnou mierou
prispieva k zvýšenej incidencii rakoviny kože. Fotoaktivácii chemických látok sa
doteraz venovala pomerne malá pozornosť, preto je nedostatočne preskúmaná.
7H-Dibenzo[c,g]karbazol (DBC), potenciálny karcinogén a mutagén, je
neoddeliteľnou súčasťou mnohých komplexných zmesí organických látok, akými
sú výfukové plyny, sadze alebo v cigaretový dym. Hoci množstvo DBC napr.
v cigaretovom dyme je menšie ako BaP, DBC je silnejší pľúcnych karcinogén ako
BaP [3]. O fotoexcitácii DBC nie sú známe žiadne informácie, preto bolo cieľom
našej práce zistiť schopnosť UVA žiarenia aktivovať DBC. Koža predstavuje
prirodzenú bariéru voči expozícii chemickými látkami a UVA žiareniu. Z tohto
dôvodu sme v našich experimentoch použili imortalizovanú líniu ľudských
keratinocytov HaCaT. Poznatky získané pri štúdiu týchto procesov môžu byť
využité pri vývoji nových postupov v prevencii i liečbe onkologických ochorení
kože.
74
Materiál a metódy
Kultivácia buniek
Spontánne imortalizovanú bunkovú líniu HaCaT sme udržiavali v DMEM médiu
obohatenom o 10% FBS a antibiotiká (penicilín 200 U/ml) v termostate pri 37°C
vo zvlhčenej atmosfére 5% CO2.
Ovplyvňovanie a ožarovanie buniek
Bunky sme ovplyvňovali v exponenciálnej fáze rastu rôznymi koncentráciami BaP
a DBC v bezsérovom médiu (0% FBS) počas 60 min. Pri kombinovanom pôsobení,
bunky exponované BaP alebo DBC boli ožiarené dávkou 2,4 J/cm2 UVA svetlom.
Dávku UVA svetla sme zvolili na základe predchádzajúcich experimentov v našom
laboratóriu. Táto dávka zodpovedá intenzite žiarenia v životnom prostredí v lete po
celom svete [4]. Bunky boli ožarované v simulátore ultrafialového žiarenia so
šiestimi trubicami emitujúcimi UVA svetlo s vlnovou dĺžkou  = 365nm
(Crosslinker Biolink, Vilber Lourmat, Francúzsko).
MTT test
Životaschopnosť buniek sme detegovali kolorimetrickou metódou - MTT testom
(3-(4,5-dimetyl tiazol-2-yl)-2, 5-difenyl tetrazolium bromid), podľa Mosmanna [5]
s menšími modifikáciami. Vzorky sme spektrofotometricky vyhodnocovali pri
vlnových dĺžkach 540 nm a 690 nm pomocou prístroja Bio-Rad xMarkTM
microplate spectrophotometer a pomocou softvéru Microplate Manager 6 (BioRad, Česká republika).
Jednobunková gélová elektroforéza (SCGE)
Na detekciu jednovláknových zlomov DNA sme zvolili postup podľa Collinsa
a kol. [6] s modifikáciami podľa Gábelová a kol. [7]. Oxidačné poškodenia DNA
sme detegovali pomocou modifikovaného kométového testu, ktorý využíva
špecifickú endonuklázu, formamidopyrimidín DNA glykozylázu (Fpg). Vzorky
sme hodnotili fluorescenčne mikroskopom Axio Imager a využitím softvéru
Metafer 3.6 (MetaSystem GmbH; Altussheim, Nemecko).
Mikrojadrový test (MNT)
Na sledovanie poškodených chromozómov sme používali postup podľa Fenecha
[8]. Tvorba mikrojadier je nepriamym indikátorom chromozómových zlomov
(klastogénny efekt) alebo dysfunkcie deliaceho vretienka (aneugénny efekt).
Detekcia intracelulárnych reaktívnych druhov kyslíka (ROS)
Hladinu intracelulárnych reaktívnych druhov kyslíka (iROS) sme detegovali
pomocou fluorescentnej próby H2DCFH-DA. Fluorescenciu, ktorá vznikla pri
oxidácii DCF-DA sme merali pri 485/520 nm na prístoji PolarStar Optima (BMG
Labtech, Nemecko).
Bunkový cyklus a apoptóza
Bunkový cyklus a podiel apoptických/nekrotických buniek sme stanovovali
pomocou prietokovej cytometrie na prístroji FACS Altra (Beckman-Coulter) a
analyzovali programom FCS Express (De Novo Software).
75
Výsledky a diskusia
Vplyv UVA žiarenia na prežívanie buniek ovplyvnených rôznymi koncentráciami
BaP (A) alebo DBC (B) je znázornený na Obrázku 1. UVA žiarenie nepôsobilo na
bunky cytotoxicky v porovnamí s neožiarenou kontrolou. Ovplyvňovanie buniek
BaP a DBC v koncentračnom rozpätí 0 – 2,5 μM spôsobilo iba mierne zníženie
životaschopnosti buniek v porovnaní s kontrolou. Kombinovaný vplyv (karcinogén
1h + UVA) spôsobil exponenciálne zníženie viability v ovplyvnených buniek.
Obrázok 1: Cytotoxicita chemických karcinogénov BaP (A) a DBC (B) v bunkách HaCaT v tme
a po ožiarení UVA svetlom (2,4 J/cm2).
Ožiarenie ovplyvnených buniek UVA nielen znížilo viabilitu buniek, ale pôsobilo
tiež genotoxicky, čo sa prejavilo zvýšením hladín DNA zlomov (Tab.1)
a mikrojadier (výsledky neuvádzame). Tvorba zlomov DNA patrí medzi štandardné
biomarkery poškodenia DNA spôsobené genotoxickými faktormi [9]. Zvýšené
hladiny zlomov DNA v bunkách ovplyvnených BaP a DBC potvrdili, že HaCaT
bunky sú schopné metabolizovať tieto karcinogény. Hoci ožiarenie buniek UVA
zvýšilo hladinu poškodení DNA, po kombinovanom vplyve bola hladina zlomov
DNA vyššia ako hladiny poškodení, ktoré indukovali jednotlivé karcinogény alebo
UVA samotné (Tab.1).
Oxidačný stres a tvorba reaktívnych kyslíkatých radikálov sa považuje za hlavný
mechanizmus poškodenia buniek vplyvom UVA svetla [4]. V súlade s týmto
predpokladom, ožiarenie buniek UVA svetlom zvýšilo signifikantne hladinu
oxidačných poškodení DNA a iROS. Po kombinovanom vplyve (karcinogén +
UVA) hladina iROS (Obr.2) a oxidačných poškodení DNA (Tab.1) sa signifikantne
zvýšila.
76
DNA v chvoste (%)
llátka
Kontrola
BaP
DBC
Konc.
(µM)
0
0,1
0,25
0,5
0,1
0,25
0,5
ssb
Fpg site
0 J/cm2
2,4 J/cm2
0 J/cm2
2,4 J/cm2
10,94 ± 1,80
15,19 ± 1,69 *
19,39 ± 1,78 ***
21,16 ± 2,51 ***
11,62 ± 0,95
17,24 ± 1,81 **
19,59 ± 1,54 ++
16,03 ± 0,96
25,23 ± 1,66 ++
28,71 ± 2,68 ++
23,83 ± 1,51 +++
29,07 ± 1,74 +++
15,78 ± 2,23
18,40 ± 0,91
23,48 ± 1,67 ***
24,39 ± 2,68 ***
21,17 ± 1,28 **
27,65 ± 2,78 ***
33,12 ± 2,87 ***
25,74 ± 2,65 +++
25,48 ± 2,58 +++
47,29 ± 3,79 +++
49,63 ± 3,10 +++
35,21 ± 1,56 +++
40,73 ± 3,50 +++
46,31 ± 1,90 +++
27,58 ± 1,54 ***
33,12 ± 2,58 ++
Tabuľka. 1: Hladiny jednovláknových zlomov DNA (ssb) a oxidačných poškodení (Fpg site)
vyjadrené ako % DNA v chvoste, detegované kométovým testom. Hodnoty predstavujú
priemerné hodnoty ± smerodajná odchýlka. Štatisticky preukazné rozdiely medzi kontrolnými
bunkami a bunkami ovplyvnenými chemickými karcinogénmi *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.
Štatisticky preukazné rozdiely medzi karcinogénom ovplyvnenými bunkami držanými v tme a po
ožiarení s UVA svetlom ++p < 0,01 a +++p < 0,001.
Obrázok. 2: Hladiny intracelulárnych reaktívnych druhov kyslíka v bunkách ovplyvnených
BaP a DBC v tme a po ožiarení UVA svetlom (2,4 J/cm2). Štatisticky preukazné rozdiely medzi
vzorkami po kombinovanom vplyve (karcinogén + UVA) a karcinogénom ovplyvnenými bunkami
držanými v tme ++p < 0,01 a +++p < 0,001.
UVA žiarenie ani samotné karcinogény výrazne neoplyvnili bunkový cyklus
HaCaT buniek. Na rozdiel od týchto výsledkov, UVA v kombinácii s chemickými
karcinogénmi spôsobili zastavenie bunkového cyklu v G1 fáze. Ožiarenie
ovplyvnených buniek tiež viedlo k signifikantnému zvýšeniu hladín apoptických
a nekrotických buniek.
Naše výsledky jednoznačne ukázali, že environmentálny polutant a karcinogén
DBC, je fotoaktivovaný UVA žiarením.
Poďakovanie
Táto práca bola podporená bilaterálnym Slovensko - poľským projektom č. 17.
Táto štúdia vznikla vďaka podpore v rámci operačného programu Výskum a vývoj
77
pre projekt: TRANSMED, ITMS: 26240120008 a projekt: ITMS: 26240220071,
spolufinancované zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Patel RV, Clark LN, Lebwohl M, Weinberg JM. Treatments for psoriasis
and the risk of malignancy. J Am Acad Dermatol 2009;60(6):1001-1017.
[2]
El Ghissassi F, Baan R, Straif K et al. A review of human carcinogens--part
D: radiation. The lancet oncology 2009;10(8):751-752.
[3]
Hecht SS. DNA adduct formation from tobacco-specific N-nitrosamines.
Mutation research 1999;424(1-2):127-142.
[4]
Zhao Y, Xia Q, Yin JJ, Yu H, Fu PP. Photoirradiation of polycyclic
aromatic hydrocarbon diones by UVA light leading to lipid peroxidation.
Chemosphere 2011;85(1):83-91.
[5]
Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of
immunological methods 1983;65(1-2):55-63.
[6]
Collins A, Gedik C, Vaughan N et al. Measurement of DNA oxidation in
human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radical Bio
Med 2003;34(8):1089-1099.
[7]
Gabelova A, Slamenova D, Ruzekova L, Farkasova T, Horvathova E.
Measurement of DNA strand breakage and DNA repair induced with
hydrogen peroxide using single cell gel electrophoresis, alkaline DNA
unwinding and alkaline elution of DNA. Neoplasma 1997;44(6):380-388.
[8]
Fenech M. The in vitro micronucleus technique. Mutation research
2000;455(1-2):81-95.
[9]
Andreoli C, Gigante D, Nunziata A. A review of in vitro methods to assess
the biological activity of tobacco smoke with the aim of reducing the
toxicity of smoke. Toxicology in vitro : an international journal published
in association with BIBRA 2003;17(5-6):587-594.
78
Histopatologická a imunohistochemická
analýza karcinómov mliečnej žľazy
u potkana po liečbe Chlorellou pyrenoidosa
Andrea Kapinová1, Peter Kubatka2, Karol Kajo3,
Desanka Výbohová4, Martin Péč2, Marian Adamkov5,
Ján Mojžiš6, Dušan Dobrota1
1
Ústav lekárskej biochémie JLF UK v Martine, 2 Ústav
lekárskej biológie JLF UK v Martine, 3 Onkologický
ústav sv. Alžbety v Bratislave, 4 Ústav anatómie JLF UK
v Martine, 5 Ústav histológie a embryológie, 6 Ústav
farmakológie LF UPJŠ Košice
Úvod
Niekoľko predklinických i klinických štúdií preukázalo zjavný antineoplastický
potenciál fytochemikálií u rôznych typov nádorov. V našej chemopreventívnej
štúdii sme sa zamerali na štúdium antineoplastickej aktivity fytochemikálií
obsiahnutých v riase Chlorella pyrenoidosa v prevencii experimentálnej rakoviny
prsníka u samíc potkanov, nakoľko v takomto modeli doposiaľ ešte examinované
neboli. Jedným z cieľov našej štúdie bola histomorfologická a imunohistochemická
analýza, ktorá môže viesť k logickým záverom pri posudzovaní efektívnosti farmák
a ich vplyvu na diferenciáciu a prognózu nádorov počas dlhodobej liečby.
Materiál a metódy
Experimentálnu vzorku zvierat tvorilo 75 samíc potkana kmeňa Sprague-Dawley
vo veku 32-36 dní, ktoré boli rozdelené do troch experimentálnych skupín (25
zvierat na skupinu). Prvá skupina slúžila ako skupina kontrolná (bez
chemoprevencie). V druhej skupine bolo fytofarmakum aplikované zvieratám
v koncentrácii – 3 g/kg potravy (skupina CHLO 0.3) a v skupine tretej v
koncentrácii 30 g/kg potravy (skupina CHLO 3). Chemoprevencia začala 7 dní
pred aplikáciou karcinogénu a trvala kontinuálne až do ukončenia experimentu (14
týždňov). Pre indukciu mamárnej karcinogenézy sme použili N-metyl-Nnitrozoureu, ktorú sme aplikovali intraperitoneálne v jednorázovej dávke 50mg/kg
hmotnosti zvieraťa v priemere na 42. postnatálny deň. Počas pitvy zvierat na konci
experimentu, bola uskutočnená excízia mamárnych nádorov. Na základe
histologického vyšetrenia boli nádory klasifikované podľa medzinárodných kritérií
pre klasifikáciu nádorov u potkanov. Vyhodnotili sme zmeny v histologickej
typizácii a grading nádorov po aplikácii chlorelly. Vzorky tkaniva mamárnych
nádorov boli rozdelené do dvoch skupín - dobre diferencované (low grade, LG)
a slabo diferencované (high grade, HG). Kritéria pre kategorizáciu – solidizácia,
bunková atypia, mitotický index, nekróza, boli zvolené na základe štandardných
diagnostických metód klasifikácie. Na základe imunohistochemickej analýzy sme
79
stanovili expresiu význammých markerov pre apoptózu (kaspáza-3,-7) proliferáciu
(Ki-67) a angiogenézu (VEGF, VEGFR-2). Štatisticky sme vyhodnotili taktiež
základné parametre mamárnej karcinogenézy.
Výsledky
Chlorella vo vyššej dávke bola vysoko efektívna - potlačila frekvenciu nádorov o
61 % (P<0.02) a predĺžila ich latenciu o 12.5 dňa (P<0.02) v porovnaní s kontrolou.
V skupinách liečených zvierat bol pozorovaný pokles pomeru HG/LG karcinómov
(kontrolná skupina -27/36,skupina CHLO 0.3 -14/33 a skupina CHLO 3 -10/18).
Skupina
Percento všetkých
označených buniek
Percento buniek so slabou a miernou/silnou
imunoreaktivitou
+
++/+++
Kaspáza-3
KONT
6.66±0.82
6.01±0.77
0.65±0.10
CHLO
6.78±0.80
6.18±0.76
0.60±0.09
Kaspáza-7
KONT
5.03±0.47
4.45±0.38
0.58±0.14
CHLO
8.73±0.67***
7.03±0.47***
1.70±0.50*
Ki67
KONT
16.48±1.62
12.25±1.14
4.24±0.66
CHLO
15.42±1.40
11.92±1.10
3.50±0.41
VEGF
KONT
14.51±1.77
13.31±1.65
1.20±0.36
CHLO
14.99±1.05
13.77±1.00
1.22±0.18
VEGFR-2
KONT
27.46±2.66
20.34±1.58
7.12±1.36
CHLO
22.29±1.50
16.70±0.94*
5.59±0.70
Tabuľka 1: Morfometrická analýza – stanovenie expresie kaspázy-3, -7, Ki-67, VEGF, VEGFR2 v mamárnych nádorových bunkách po liečbe Chlorellou pyrenoidosa.. Dáta sú vyjadrené ako
priemery ±SEM. Skupina CHLO označuje skupinu so signifikantným antineoplastickým účinkom
(CHLO 3). Intenzita imunoreaktivity: slabá +, mierna ++, silná +++. Signifikantný rozdiel * P<0.05
vs KONT *** P<0.001 vs KONT.
KONT, zv. 20x10
CHLO3, zv. 20x10
Obrázok 1: Porovnanie imunohistochemických charakteristík v kontrolnej skupine a v skupine
CHLO 3. Signifikantný nárast expresie kaspázy-7 v liečenej skupine približne o 74% v porovnaní s
kontrolou.
80
Imunohistochemická analýza preukázala v skupine CHLO 3 signifikantné takmer
74 % zvýšenie expresie kaspázy-7 a štatisticky významný takmer 19 % pokles
v expresii VEGFR-2, v porovnaní s kontrolou. Štatisticky významné zmeny
v expresii kaspázy-3, Ki-67 a VEGF neboli pri porovnaní skupín pozorované.
Diskusia
V posledných rokoch sa v experimentálnej ako aj klinickej onkológii zvýšil záujem
o látky prírodného pôvodu vyznačujúce sa možným antineoplastickým účinkom.
Epidemiologické, in vitro a in vivo štúdie zamerané na výskum nádorových
ochorení zreteľne poukazujú na protektívne účinky bioaktívnych nenutričných
rastlinných zložiek – fytochemikálií. Sladkovodná riasa Chlorella pyrenoidosa je
zaujímavá obsahom rôznych druhov fytochemikálií, a to hlavne karotenoidov [1]
a polyfenolov [2]. Chemopreventívne účinky chlorelly boli zaznamenané voči
chemicky indukovanej hepatokarcinogenéze u potkanov [3], ako i v ďalšich
experimentálnych prácach [4,5,6,7].
V prípade našej štúdie ide o prvú zmienku o účinku Chlorelly pyrenoidosa
v experimentálnej mamárnej karcinogenéze in vivo. Výsledky preukázali výrazný
protinádorový
účinok
chlorelly
a
naznačujú
jej
pro-apoptotický
a antiangiogenetický efekt v karcinómoch mliečnej žľazy u potkana. Sú však
potrebné ďalšie klinické a predklinické štúdie, ktoré stanovia presnú úlohu
chlorelly, či iných fytofarmák, v procese karcinogenézy, ich dávkovanie a výber
vhodných pacientov.
Perspektívne histologická analýza nádorov umožňuje zhodnotiť riziká dlhodobej
aplikácie nových chemopreventívnych látok u žien. Poskytuje tiež informáciu
o stupni diferenciácie, prognóze mamárneho nádoru a účinnosti liečby. Významný
pokrok v bioptickej diagnostike predstavuje imunohistochemická analýza. Z tohto
pohľadu a na základe našich výsledkov sa nám Chlorella pyrenoidosa javí ako
perspektívne fytofarmakum pre využitie v klinickej praxi..
Poďakovanie
Práca bola finančne podporovaná z Grantu VEGA (č. 1/0043/12). Povolenie
k experimentu bolo udelené ŠVPS (č. Ro-1759/11-221) a Etickou komisiou JLF
UK (č. EK 991/2012).
Zoznam použitej literatúry
[1]
Inbaraj BS, Chien JT, Chen BH. Improved high performance liquid
chromatographic method for determination of carotenoids in the microalga
Chlorella pyrenoidosa. J Chromatogr A. 2006 Jan 13;1102(1-2):193-9.
[2]
Li HB, Cheng KW, Wong CC. Evaluation of antioxidant capacity and total
phenolic content of different fractions of selected microalgae. Food
Chemistry 102, 2007. 771–776.
[3]
Takekoshi H, Mizoguchi T, Komasa Y, Chubachi H, Inoue Y et al.
Suppression of glutathione S-transferase placental form-positive foci
81
[4]
[5]
[6]
[7]
development in rat hepatocarcinogenesis by Chlorella pyrenoidosa. Oncol
Rep. 2005; 14(2):409-14.
Kanouchi H, Tachibana H, Oka T, Yamada K. Recombinant expression of
perchloric acid-soluble protein reduces cell proliferation. Cell Mol Life Sci.
2001; 58(9):1340-3.
Cha KH, Koo SY, Lee DU. Antiproliferative effects of carotenoids
extracted from Chlorella ellipsoidea a Chlorella vulgaris on human colon
cancer cells. J. Agric Food Chem. 2008; 56(22):10521-6.
Chon JW, Sung JH, Hwang EJ, Park YK. Chlorella methanol extract
reduces lipid accumulation in and increases the number of apoptotic 3T3-L1
cells. Ann N Y Acad Sci. 2009 Aug;1171:183-9.
Cheng FC, Feng JJ, Chen KH, Imanishi H. Receptor Binding Activities of
Chlorella on Cysteinyl Leukotriene CysLT, Glutamate AMPA, lon
Channels, Purinergic P(2Y), Tachykinin NK(2) Receptors and Adenosine
Transporter. Phytotherapy research 2009; 24,1:43-48.
82
Biologické účinky liečivých rastlín z čeľade
Lamiaceae
Annamária Srančíková1, Veronika Klusová2, Alena
Gábelová1, Pavel Mučaji3, Michal Pastorek1, Barbara
Kusznierewicz4, Eva Horváthová1, Katarína Kozics1
1
Ústav experimentálnej onkológie SAV, Vlárska 7,
833 91 Bratislava; 2Prírodovedecká fakulta, Univerzita
Komenského, Bratislava; 3Farmaceutická fakulta,
Univerzita Komenského, Bratislava; 4Oddelenie
potravinovej chémie, technológie a biotechnológie,
Chemická fakulta, Univerzita Technológie Gdansk, Poľsko
Úvod
Mnohé liečivé rastliny sa stávajú predmetom štúdia vďaka svojim
chemopreventívnym účinkom. Predpokladá sa, že chemopreventívny potenciál
prírodných látok je založený z časti na indukcii obranného systému organizmu
zahrňujúci detoxikačné a antioxidačné enzýmy a na druhej strane na ich
protizápalovej aktivite, schopnosti zasahovať do bunkového cyklu a vyvolať
apoptózu [1].
Rastliny čeľade Lamiaceae, Salvia officinalis a Thymus vulgaris, sú známe ako
aromatické rastliny, ktoré sa používajú dlhé storočia v ľudovom liečiteľstve ako aj
pri príprave jedál. Tieto rastliny vykazujú široké spektrum biologických účinkov,
vrátane antioxidačného účinku, ktorý je pripisovaný fenolovým zložkám,
protizápalových a antiproliferačných vlastností [2].
Cieľom našej práce bolo zistiť ochranný účinok rastlinných extraktov z čeľade
Lamiaceae pred oxidačnými poškodeniami v ľudských pečeňových bunkách
HepG2, ako aj stanovenie antioxidačného potenciálu samotných extraktov a vplyv
extraktov na antioxidačné enzýmy bunky. Ďalej sme sa zamerali na štúdium
mechanizmov účinku rastlinných extraktov, ich vplyv na bunkovú signalizáciu a
bunkový cyklus.
Materiál a metódy
Rastlinné extrakty
V experimentoch sme použili suché extrakty z listov Salvia officinalis L. a vňate
Thymus vulgaris L. vyextrahované 40% etanolom (Calendula, Stará Ľubovňa,
Slovensko), ktoré sme pred použitím rozpúšťali v kultivačnom médiu na
požadované koncentrácie.
Bunková línia
Na testovanie účinku rastlinnýxh extraktov sme použili ľudské pečeňové nádorové
bunky HepG2, ktoré boli kultivované v RPMI 1640 médiu s pridaním 10%
fetálneho bovinného séra a antibiotík (penicilín 200U/ml, streptomycín 100 µg/ml,
kanamycín 100 µg/ml) (Gibco, C-Consulting LabTechnologies Slovensko)
v termostate pri 37 °C a 5% CO2.
83
Použité koncentrácie
Exponenciálne rastúce HepG2 bunky sme ovplyvnili rastlinným extraktom S.
officinalis s výslednou koncentráciou 0.5 - 4 mg/ml alebo T. vulgaris 0.1 - 2 mg/ml
po dobu 24h. Po ukončení vplyvu boli bunky dvakrát premyté PBS a spracované.
Meranie antioxidačného potenciálu
Antioxidačná aktivita rastlinných extraktov sa stanovila pomocou metód
založených na schopnosti vychytávať voľné radikály (DPPH a ABTS test). Na
stanovenie bioaktívnych zložiek v rastlinných extraktoch sme využili
chromatografický HPLC-DAD-MS systém.
Jednobunková gélová elektroforéza
Na detekciu jednovláknových zlomov DNA sme zvolili postup podľa Singh a kol.
[3] s modifikáciami podľa Slameňová a kol. [4]. Bunky ukotvené v 0,75% LMP
agaróze v PBS pufri (bez Ca2+ a Mg2+) boli vložené do lyzujúceho roztoku (2,5 M
NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 10 a 1% Triton X-100) na 1
hodinu pri 4°C. Sklíčka boli potom prenesené do elektroforetickej nádoby a zaliate
alkalickým roztokom (300 mM NaOH, 1 mM Na2EDTA, pH>13). Po 40 minútach
odvíjania nasledovala elektroforéza (300 mA, 25V) počas 30 minút pri 4°C.
Sklíčka boli neutralizované roztokom Tris-HCl (0,4 M, pH 7,4) počas 3x5 minút a
následne zafarbené 20 µl etídium bromidom (EtBr, 10 µg/ml). Oxidačné
poškodenia DNA sme detegovali pomocou modifikovaného kométového testu,
ktorý využíva špecifickú endonuklázu, formamidopyrimidín DNA glykozylázu
(Fpg). Vzorky sme hodnotili fluorescenčne mikroskopom Axio Imager a využitím
softvéru Metafer 3.6 (MetaSystem GmbH; Altussheim, Nemecko).
Stanovenie aktivity antioxidačných enzýmov
Pre stanovenie aktivity superoxiddismutázy (SOD) sme použili 1,5x104 HepG2
buniek a stanovili podľa kitu RANSOD. Metóda spočíva v reakcii xantínoxidázy
(XO) so xantínom (X) za vzniku superoxidového radikálu, ktorý reaguje s 2-(4jódfenyl)-3-(4-nitrofenol)-5-fenyl tetrazólium chloridom (INT) za vzniku
nerozpustného červeného monoformazánu. Aktivita glutatiónperoxidázy (GPx) sa
stanovila kolorimetrickou metódou podľa Paglia a Valentine [5] použitím
substrátu kumén hydroperoxid.
Bunkový cyklus
Adherentné aj plávajúce bunky boli zozbierané, premyté chladeným PBS
a rozsusupendované v 300 µl roztoku PBS s 0.05% Triton X-100 spolu s Rnázou A
(200 µg/ml Sigma-Aldrich, Germany) a inkubavané 20 minút pri teplote 37 °C.
Následne boli vzorky zafarbené s propídium jodidom (20 µg/ml; Sigma-Aldrich,
Germany) a inkubované v tme pri 4 °C po 15 min. Obsah DNA v bunkách bol
analyzovaný prietokovým cytometrom FACS Altra (Beckman-Coulter) a
analyzovali programom FCS Express (De Novo Software).
DNA syntézy
Po ukončení vplyvu boli bunky kultivované v médiu obsahujúceho [14C]tymidín
(1µCi/ml) rôzne dlhé intervaly (4h, 8h, 24h). Po ukončení postkultivácie bunky
boli premyté SSC pufrom (0,15 M chlorid sodný , 0,015 M citrát sodný, pH 7,4)
a následne ľadovo vychladenou 5% kyselinou trichloroctovou. Na ďalší deň boli
84
bunkové precipitáty prefiltrované cez 0,45 µm nitrocelulózovú membránu, premyté
a vysušené. Rádioaktivitu sme merali pomocou scintilačného prístroja Tri-Carb
2910TR, PerkinElmer.
Western blot
Bunkové lyzáty pre analýzu hladiny proteínov metódou Western blot sme pripravili
v súlade s experimentálnou schémou popísanou v publikácii Valovicova a kol. [6]
použitím lyzačného pufra (50mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1%
Triton X-100, inhibítory fosfatáz a inhibítory proteáz). Proteíny (20 µg) boli
separované pomocou elektroforézy v 10% polyakrylamidovom géli (SDS PAGE),
prenesené na PVDF membránu (GE Healthcare, Švédsko). Membrány boli
inkubované
s príslušnými
primárnymi
a sekundárnymi
protilátkami
a imunodetekcia hladiny proteínov bola stanovená pomocou chemiluminiscencie.
Výsledky a diskusia
Rastliny z čeľade Lamiaceae (šalvia, tymián) sa odpradávna využívajú v ľudovej
medicíne a je známe, že obsahujú protizápalové, antioxidačné a imunomodulačné
látky. V našej práci sme pomocou metód založených na schopnosti vychytávať
voľné radikály stanovili prítomnosť látok s antioxidačnými vlastnosťami
a najväčšie zastúpenie spomedzi fenolových zlúčenín mala práve kyselina
rozmarínová.
Rastlinné extrakty bohaté na polyfenolové zložky inhibujú tvorbu zlomov v DNA
a vznik 8-oxo-G indukovaných oxidačnými činidlami [7]. V našej práci sme zistili
protektívny účinok pred oxidačným poškodením indukovaným H2O2 a 2,3dimetoxy-1,4-naftochinón (DMNQ)
po vplyve extraktov vyizolovaných zo S. oficinalis a T. vulgaris.
Biologicky aktívne látky môžu pôsobiť ako priame antioxidanty zvyšovaním
hladiny glutatiónu a/alebo zvyšovaním aktivity antioxidačných enzýmov, medzi
ktoré patrí kataláza GPx a superoxiddismutáza SOD. Rastlinné extrakty S.
oficinalis a T. vulgaris zvyšovali hladinu GPx, kým hladina SOD klesala pod
vplyvom extraktov.
Presný molekulárny mechanizmus účinku rastlinných extraktov S. officinalis a T.
vulgaris na nádorové pečeňové bunky nie je dosiaľ známy. Výsledky našej práce
potvrdili zmeny v replikácii DNA vplyvom týchto extraktov. Obidva rastlinné
extrakty S. officinalis a T. vulgaris znížili syntézu DNA dávkovo závislým
spôsobom v HepG2 bunkách počas 24h postkultivácie. Obnovenie syntézy DNA
bola detekovaná vo vzorkách ovplyvnených S. officinalis po 24h postkultivácie v
čerstvom médiu, ale nie vo vzorkách ovplyvnených T. vulgaris. V súlade s
výsledkami syntézy DNA sme zaznamenali zastavenie bunkového cyklu v HepG2
bunkách ovplyvnenými obidvoma rastlinnými extraktami. Na základe výraznej
akumulácie buniek v G0/G1 fáze a následneho poklesu buniek v S fáze môžme
predpokladať, že chemoprotektívny účinok S. officinalis a T. vulgaris môže byť
sprostredkovaný inhibíciou proliferácie ovplyvnených buniek.
Pre zhodnotenie procesov v bunkách, ktoré môžu byť potenciálne vyvolané
rastlinnými extraktmi sme sa zamerali na štúdium proteínkináz aktivované
85
mitogénom (MAPK), konkrétne na expresiu a aktiváciu kinázy regulovanej
extracelulárnym signálom 1/2 (ERK 1/2). Táto kináza sa uplatňuje v rôznych
bunkových procesoch ako je regulácia bunkovej proliferácie, diferenciácie,
odpoveď bunky na stres a apoptóza. Expozícia HepG2 buniek rastlinnými
extraktmi S. officinalis a T. vulgaris mala za následok zvýšenie fosforylácie
ERK1/2 v závislosti na dávke bezprostredne po vplyve. Pri najvyšších
koncentráciách bola úroveň fosforylácie ERK1/2 porovnateľná alebo dokonca
vyššia ako u pozitívnej kontroly. Okrem toho zvýšená aktivácia ERK1/2 dobre
koreluje s mierou inhibície syntézy DNA. Na dôkaz účinku rastlinných extraktov
na aktiváciu ERK1/2 v HepG2 bunkách boli bunky predopvplyvnené PD98059,
špecifickým inhibítorom MEK, pred vplyvom S. officinalis a T. vulgaris. PD98059
po naviazaní na MEK zabraňuje fosforylácii ERK1/2. Znížená aktivácia ERK1/2 v
dôsledku predovplyvnenia vzoriek s PD98059 jasne preukázala úlohu rastlinných
extraktov v aktivácii ERK1/2.
Záver
Výsledky našej práce jednoznačne potvrdili protektívny potenciál S. oficinalis a T.
vulgaris voči oxidačným činidlám, ako je H2O2 a DMNQ a vplyv extraktov na
hladinu enzýmových antioxidantov (superoxiddismutázy a glutatiónperoxidázy) v
pečeňových bunkách. Ďalej, rastlinné extrakty S. officinalis a T. vulgaris inhibovali
replikáciu DNA a spôsobili zastavenie bunkového cyklu v HepG2 bunkách. Naše
predbežné výsledky ukazujú, že aktivácia ERK1/2 by mohla vysvetľovať
antiproliferačný účinok týchto extraktov. V súlade s našimi výsledkami práca Kim
a kol. [8] popisuje, že kampferol, flavonoid vyskytujúci sa v ovocí a zelenine,
indukoval zastavenie bunkového cyklu a diferenciáciu v nádorových bunkách
prsníka. Ďalšie štúdie sú nevyhnutné pre pochopenie mechanizmov podieľajúcich
sa na chemoprotektívnom účinku týchto rastlinných extraktov.
Poďakovanie
Táto štúdia vznikla vznikla za podpory grantu VEGA 2/0012/12 a v rámci
operačného programu Výskum a vývoj pre projekt: TRANSMED, ITMS:
26240120008 a projekt: ITMS: 26240220071, spolufinancované zo zdrojov
Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Pan MH, Ho CT. Chemopreventive effects of natural dietary compounds on
cancer development. Chem Soc Rev 2008; 37: 2558-2574.
[2]
Ramos AA, Azqueta A, Pereira-Wilson C, Collins AR. Polyphenolic
compounds from Salvia species protect cellular DNA from oxidation and
stimulate DNA repair in cultured human cells. J Agric Food Chem 2010;
58: 7465-7471.
[3]
Singh N P, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple technique for
quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res
1988; 175: 184–191.
86
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
Slamenova D, Gabelova A, Ruzekova L, Chalupa I, Horvathova E et al.
Detection of MNNGinduced DNA lesions in mammalian cells: validation of
comet assay against DNA unwinding technique, alkaline elution of DNA
and chromosomal aberrations. Mutat Res 1997; 383: 243–252.
Paglia D E, Valentine WN. Studies on the quantitative and qualitative
characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Medicine
1967; 70: 158–169.
ValovicovA Z, Marvanova S, Meszarosova M, Srancikova A, Trilecova L
et al. Differences in DNA damage and repair produced by systemic,
hepatocarcinogenic and sarcomagenic dibenzocarbazole derivatives in a
model of rat liver progenitor cells. Mutat Res. 2009; 665: 51-60.
Ramos AA, Azqueta A, Pereira-Wilson C, Collins AR. Polyphenolic
compounds from Salvia species protect cellular DNA from oxidation and
stimulate DNA repair in cultured human cells. J Agric Food Chem 2010;
58: 7465-7471.
Kim BW, Lee ER,Min HM, Jeong HS,Ahn JY et al. Sustained ERK
activation is involved in the kaempferol-induced apoptosis of breast cancer
cells and is more evident under 3-D culture condition. Cancer Biol Ther
2008; 7: 1080–1089.
87
Odpoveď bunkovej línie multiformného
glioblastómu na pôsobenie BAF®
a temozolomidu
Eva Blahovcová, Henrieta Škovierová, Radovan Murín,
Dušan Dobrota, Jozef Hatok
Ústav lekárskej biochémie, Jesseniova lekárska fakulta,
Univerzita Komenského v Bratislave, Malá Hora 4,
036 01 Martin
Úvod
Vznik nádorového ochorenia je zložitý viackrokový proces. V súčasnosti sa v
liečbe využíva najmä chirurgická liečba, chemoterapia a rádioterapia alebo
kombinácia týchto liečebných metód v závislosti od typu a štádia nádorového
ochorenia ako aj od individuálnych akútnych a neskorých reakcií pacienta na liečbu
[1]. Glioblastóm (GBM) je najčastejším, najzhubnejším a biologicky
najagresívnejším druhom nádoru mozgu u dospelých [2]. Jednotlivé podtypy GBM
reagujú na rádioterapiu a chemoterapiu odlišne, pričom prognóza pre pacientov je
horšia v porovnaní s inými typmi nádorov mozgu.
Deriváty biologicky aktívnych fosfolipidov (BAF®) sa využívajú v klinickej praxi
ako podporná liečba u onkologických pacientov už niekoľko desaťročí, no
mechanizmus ich účinku nie je presne známy. Popisovaný je ich podporný efekt
v liečbe viacerých patologických procesov a pozitívny vplyv na inhibíciu
nádorového rastu ako aj metastázovania nádorových buniek [3]. Fosfolipidy
podporujú pozitívny výsledok liečby bez prejavu vedľajších účinkov, pričom môžu
dokonca zmierňovať vedľajšie účinky niektorých liekov. Rezistencia nádorových
buniek predstavuje v súčasnosti hlavné obmedzenie efektivity chemoterapie [4].
Testovali sme in vitro citlivosť glioblastómových buniek voči dostupným
cytostatikám a taktiež prežívanie buniek pri rôznych koncentráciách. V klinickej
praxi sa na liečbu GBM využíva najmä chemoterapeutická alkylačná látka
temozolomid (TMZ). TMZ je schopný prechádzať cez hematoencefalickú bariéru a
je stabilný pri kyslom pH, čo umožňuje jeho perorálne podanie [5]. Súčasťou našej
práce bolo aj sledovanie vplyvu BAF® v kombinácii s TMZ na glioblastómovú
bunkovú líniu T98G in vitro.
Materiál a metódy
Bunková línia
Pri kultivácii bunkovej línie multiformného glioblastómu T98G (Europian
Collection of Cell Cultures, Sigma, Bratislava) boli dodržané štandardné kultivačné
podmienky. Bunkovú líniu sme inkubovanli v CO2 inkubátore (5% CO2) pri
teplote 37°C, podľa potreby 1-2 x do týždňa pasážovali a kultivovali v kultivačnom
88
médiu Dulbecco’s modified Eagle’s medium (PAA, Rakúsko) obohatenom o 10%
fetálne teľacie sérum (Gibco, USA) a 1% penicilín/streptomycín (PAA, Rakúsko).
Zmes fosfolipidov
Základné zmesi biologicky aktívnych fosfolipidov BAF® (Areko, ČR) s obsahom
15% sme používali v dvoch formách. Neaktívnu formu zmesi fosfolipidov nBAF®
(APLC-E-111018) a aktívnu formu zmesi fosfolipidov aBAF® (APLC-E-111017)
sme riedili pri in vitro experimentoch na obsah 0,025% - 0,3%.
Cytostatiká
Na ľudskej bunkovej línii glioblastómu sme sledovali vplyv rôznych koncentrácií
cytostatík: 6-tioguanín, 6-TG, 0,49 µg/ml - 500 µg/ml (Sigma, Nemecko),
dakarbazín, DAK, 0,49 µg/ml - 500 µg/ml (Lachema, ČR), etopozid, VP-16, 0,05
µg/ml - 50 µg/ml (Ebewe, Rakúsko), karboplatina, k-Pt, 0,1 µg/ml - 100 µg/ml
(Ebewe, Rakúsko), temozolomid, TMZ, 31,25 µg/ml - 1000 µg/ml (Merck,
Kanada) a vinkristín, VNC, 0,05 µg/ml - 50 µg/ml (Lachema, ČR).
Metyl-tiazol tetrazoliový test
Na testovanie počtu viabilných buniek in vitro sme použili metyl-tiazol
tetrazoliový (MTT) test v 96 jamkových platničkách. Princíp MTT testu je
založený na mitochondriálnej enzymatickej redukcii žltej rozpustnej tetrazoliovej
soli MTT (Sigma, Nemecko) enzýmom sukcinátdehydrogenázou viabilných buniek
na nerozpustný modrý formazán6. Po pôsobení dodecylsulfátu sodného SDS
(Sigma, Nemecko) sa formazán rozpustil a následne sme merali optickú denzitu pri
540 nm (Microplate reader, Bio-Rad, Germany).
Farbenie podľa May-Grünwalda a Giemsa-Romanowski
Základné histologické farbenie pomocou May-Grünwald/Giemsa-Romanowski
(Sigma, Nemecko) sme využili ako kontrolnú metódu pre sledovanie prežívania
glioblastómovej bunkovej línie po ovplyvnení s BAF® v koncentráciách od 0,025%
do 0,2%.
Fluorescenčné farbenie pomocou DAPI
Na detekciu živých buniek sme použili 4,6-diamíno-2-fenylindol – DAPI (Vector
Laboratories, UK), a následne sme pomocou fluorescenčnej mikroskopie
(mikroskop Olympus FluoView FV10i, Tokyo, Japan) zisťovali prítomnosť jadier
buniek multiformného glioblastómu po pôsobení BAF®.
Výsledky
Pomocou MTT testu sme na 96 jamkových platniach sledovali rastový profil a
prežívanie bunkovej línie T98G po ovplyvnení rôznymi koncentráciami BAF®
(0,025% - 0,3%) v určitých časových intervaloch (0 hod, 24 hod, 48 hod, 72 hod).
Výrazný pokles v prežívaní buniek ovplyvnených aBAF® sme zaznamenali už po
24 hod inkubácii (obr. 1).
89
Obrázok 1: Pôsobenie rôznych koncentrácií BAF® počas 24 hod kultivácie.
Na základe histologického farbenia May-Grünwald/Giemsa-Romanowski sme
určili hustotu populácie buniek. Po 72 hodinovej kultivácii sme zaznamenali
výrazný úbytok v prežívaní glioblastómových buniek in vitro pri koncentráciach
aBAF® vyšších ako 0,075% (obr. 2).
Obrázok 2: Sledovanie hustoty buniek v jamke pomocou farbenia May-Grünwald/GiemsaRomanowski.
Obrázok 3: Morfologické sledovanie hustoty buniek
Pomocou farbenia May-Grünwald/ Giemsa-Romanowski
.
Obrázok 4:Fluorescenčné farbenie jadier
glioblastómových pomocou DAPI
90
Zvolili sme percentuálne koncentrácie, ktoré sa ukazovali za účinné pre
histologické štúdium BAF® na nádorových bunkách (obr. 3). Podobný efekt BAF®
sme sledovali aj pomocou fluorescenčného DAPI farbenia jadier buniek
multiformného glioblastómu (obr. 4).
Zamerali sme sa aj na sledovanie vplyvu BAF® pred in vitro podaním TMZ
(bunková línia T98G bola citlivá na TMZ in vitro). Predkultiváciou 24 hodín
s 0,05% BAF® a následnou kultiváciou glioblastómových buniek 48 hodín s TMZ
sme zaznamenali významný rozdiel medzi aBAF® nBAF® a samotným TMZ
v porovnaní s intaktnou kontrolou (obr. 5).
BAF® [24 hod] TMZ [48 hod]
prežívanie buniek [%]
100
TMZ
N-BAF® TMZ
A-BAF® TMZ
75
50
25
0
31,3
62,5
125
250
koncentrácia TMZ [ug/ml]
500
1000
Obrázok 5: Vplyv BAF® na pôsobenie TMZ v in vitro podmienkach.
Diskusia a závery
Na základe našej štúdie vplyvu BAF® na bunkovú líniu ľudského multiformného
glioblastómu T98G v in vitro podmienkach môžeme zhodnotiť nasledovné závery.
V in vitro podmienkach má aBAF® inhibičný efekt na prežívanie bunkovej línie
T98G, pričom proliferácia buniek je ovplyvnená už pri kultivácii 24 hodín s aBAF®
v porovnaní s nBAF® a intaktnou kontrolou. Aplikácia koncentrácií aBAF® vyšších
ako 0,075% spôsobovala úplný cytolytický efekt na bunky multiformného
glioblastómu in vitro.
Glioblastómové bunky vykazujú rôznu citlivosť na cytostatiká. Na nami testované
cytostatiká bola bunková línia T98G rezistentná - prežívanie buniek nad 50% pri
maximálnej koncentrácii cytostatika (6-TQ, DAK, k-Pt, VP-16), vnímavá prežívanie buniek od 25% do 50% pri maximálnej koncentrácii cytostatika (VNC)
alebo citlivá - prežívanie buniek od 0% do 25% pri maximálnej koncentrácii
cytostatika (TMZ).
V klinickej praxi sa využíva TMZ pri liečbe multiformného glioblastómu [5]. V in
vitro podmienkach predovplyvnenie 24 hodín 0,05% aBAF® významne znižuje
prežívanie glioblastómových buniek už pri najnižšej testovanej koncentrácii TMZ
48 hodín (31,25 µg/ml). Pri intaktnej kontrole a predovplyvnení s nBAF® sme
pokles prežívania buniek T98G po 48 hodinovej inkubácii s TMZ zaznamenali až
91
pri koncentráciách vyšších ako 125 µg/ml. V in vitro podmienkach má teda aBAF®
inhibičný charakter na prežívanie glioblastómových buniek a zvyšuje citlivosť
buniek T98G voči TMZ. Zmes biologicky aktívnych fosfolipidov aBAF® má
protinádorový účinok. Objasnenie mechanizmu ich pôsobenia môže znamenať
významný prínos v liečbe nádorových ochorení.
Poďakovanie
Táto práca bola podporená grantom APVV-0224-12. Zmes fosfolipidov poskytla
firma AREKO, spol. s r.o., Praha 4, ČR.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Lowe SW, Lin AW. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis 2000; 21: 485495.
[2]
Diba ChS, Pleško I, Hlava P. Incidencia zhubných nádorov v Slovenskej
republike 2007. Bratislava: NHIC. 2012. ISBN 978-80-89292-27-1.
[3]
Küllenberg D, Taylor LA, Schneider M, Massing U. Health effects of
dietary phospholipids. Lipids Health Dis 2012; 11:3.
[4]
Redmond KM, Wilson TR, Johnston PG, Longley DB. Resistance
mechanisms to cancer chemotherapy. Front Biosci 2008; 13: 5138-5154.
[5]
Zhang J, Stevens MF, Bradshaw TD. Temozolomide: mechanisms of
action, repair and resistance. Curr Mol Pharmacol 2012; 5: 102-114.
[6]
Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods
1983; 65: 55-63.
92
Analýza prestavby génu ALK v biopticky
vyšetrovanom tkanive nemalobunkového
karcinómu pľúc
Anna Farkašová1,2, Martina Bárthová1,2, Tomáš
Balhárek1,2, Ľuboslava Janáková1, Zuzana Kviatkovská2,
Lukáš Plank1,2
1
Ústav patologickej anatómie, Jesseniova lekárska fakulta
Univerzity Komenského a Univerzitná nemocnica Martin,
Slovensko, 2Martinské bioptické centrum, s. r. o., Martin,
Slovensko
Úvod
Karcinóm pľúc ako závažný zdravotnícky problém v SR aj vo svete [1] sa
rozdeľuje na malobunkový a nemalobunkový karcinóm pľúc (z angl. small-cell
/SCLC/, resp. non-small cell lung cancer /NSCLC/) [2]. NSCLC tvorí 80 – 85 %
všetkých a delí sa na tri hlavné podtypy: adenokarcinóm (AC), epidermoidný
karcinóm (EP) a veľkobunkový karcinóm. NSCLC a najmä AC je charakteristický
špecifickými genetickými zmenami buniek, ktoré súvisia so vznikom a progresiou
ochorenia a zároveň ovplyvňujú ich rozdielnu citlivosť na dnes klinicky významnú
cielenú terapiu [2]. Najčastejšie sú (v AC) aktivujúce mutácie v géne pre
epidermálny rastový faktor (EGFR) [3], zriedkavejšia je prestavba génu pre kinázu
anaplastického lymfómu (z angl. anaplastic lymphoma kinase gene, ALK) [4]. Pri
nej vzniká fúzia N-terminálneho konca génu pre proteín typu 4 asociovaného
s mikrotubulami ostnatokožca (z angl. the echinoderm microtubule-associated
protein-like 4 gene, skratka EML4) s intracelulárnym signálnym koncom génu pre
ALK. Táto fúzia je výsledkom inverzie v krátkom ramienku chromozómu 2
(vrátane oblastí 2p21 a 2p23, približne 12 Mb časť) [2]. Dnes je v AC známych už
viacero chimérických variantov fúzie ALK-EML4, pričom aj keď fúzia obsahuje
variabilné skrátenia EML4 (vyskytujúce sa pri exónoch 2, 6, 13, 14, 15, 18 a 20),
tak fúzie vo všetkých z nich začínajú v časti kódovanej exónom 20 v géne kinázy
[2,3]. ALK-EML4 je aberantný fúzny gén, ktorý sa vyznačuje ziskom nových
abnormálnych funkčných vlastností génu a ním kódovaného proteínu [2]. Tento
gén kóduje cytoplazmatický chimérický proteín s konštitutívnou ALK tyrozínovoukinázovou aktivitou, dôsledkom je kaskáda zmien s abnormálnym prenosom
bunkových signálov v nádorových bunkách [3]. Gén ALK môže vytvárať fúzie aj s
inými zriedkavejšími translokačnými partnermi, ako napr. s génmi KIF5B, TFG
a KLC1 [3,5]. Prestavba v géne ALK sa vo všeobecnosti vylučuje s mutáciami
EGFR alebo KRAS [1,2,3], takže molekulové podskupiny NSCLC definované
prostredníctvom mutácií uvedených génov sú vo väčšine prípadov odlišné
a neprekrývajú sa [1]. Vznik ALK-EML4 onkogénu je relatívne zriedkavý (v 2 – 7
% všetkých prípadov NSCLC) [3], avšak jeho identifikácia je biologicky
významná. Pozitívni pacienti sú rezistentní voči cielenej terapii zameranej na
93
EGFR mutácie [2] a majú nižšiu rýchlosť odpovede na chemoterapiu na báze
platiny ako pacienti s EGFR mutáciou [1]. Súčasne ALK-EML4 onkogén
reprezentuje jeden z molekulových cieľov liečby NSCLC, lebo cielená inhibícia
ALK génu u genotypizovaných pacientov môže viesť k potlačeniu signalizácie
prežitia bunky a k apoptickej odpovedi [2] a prispieť tak k ich lepšiemu prežívaniu.
Materiál a metódy
Do našej štúdie sme zaradili 329 konzekutívnych biopsií NSCLC bez mutácie génu
EGFR (vyšetrených počas posledných 2 rokov): a to 268 prípadov AC, 6 prípadov
EC a 55 prípadov kategórie bližšie neurčeného NSCLC. Najčastejšie boli resekáty
a lobektómie pľúc (n = 143), resp. extirpácie metastáz (n = 61) a klieštové biopsie
(n = 70), zriedkavé boli punkcie (n = 9) a cytologické stery (n = 7) a pri 39
vzorkách nebol druh odberu definovaný. Na analýzu metódou fluorescenčnej in
situ hybridizácie (FISH) boli použité 3 µm parafínové rezy, spracované podľa
odporúčania výrobcu použitých sond, výsledky boli odčítané na fluoroscenčnom
mikroskope Olympus BX61. Na zhodnotenie statusu ALK génu sme použili: a) tzv.
zlomovú sondu od firmy Zytovision [ZytoLight® SPEC ALK Dual Color Break
Apart Probe] a/alebo od firmy Abbott/Vysis [The Vysis ALK Break Apart FISH
Probe Kit (CE Analytical)], detekujúcu prestavby v oblasti 2p23, kde je
lokalizovaný ALK gén, a b) tzv. fúznu sondu od firmy Zytovision [ZytoLight®
SPEC ALK/EML4 TriCheck™ Probe], detekujúcu inverziu medzi génmi ALK
a EML4. Za pozitívny výsledok pri použití zlomovej sondy bol akceptovaný výskyt
separovaných červených a zelených alebo samostatných červených signálov
v jadrách nádorových buniek. V prípade použitia fúznej sondy výskyt
separovaných červených a zelených signálov, príp. výskyt samostatných červených
signálov, z ktorých každý mal v blízkosti modrý signál. Hranica pozitivity bola
stanovená na hodnotu ≥ 15 % nádorových buniek vzorky a hodnotených bolo
minimálne 100 jadier nádorových buniek 2 examinátormi. Prípady, v ktorých
nebola prekročená hranica 15 %, sa považovali za negatívne, zahŕňajúc aj vzorky
so samostatným zeleným signálom bez korešpondujúceho červeného signálu, alebo
vzorky so zvýšeným množstvom kópií ALK génu, ktoré však neboli v prestavbe.
Výsledky a diskusia
85 % (281/329) prípadov bolo bez prestavby ALK génu, tá bola detekovaná v 13 %
(41/329) prípadov a 2 % (7/329) prípadov nebolo hodnotiteľných FISH metódou
pre slabú intenzitu signálov. Zastúpenie pozitívnych prípadov, v ktorých prevládali
separované červené a zelené signály zodpovedajúce klasickej prestavbe ALK génu
a prípadov, v ktorých prevažovali samostatné červené signály zodpovedajúce
prestavbe s následnou deléciou časti ALK génu, bolo porovnateľné (23 verzus 16).
Vyššie zastúpenie ALK pozitívnych prípadov nášho súboru v porovnaní s inými
môže súvisieť so „selekciou“ súboru, keďže sme testovali len prípady NSCLC bez
mutácie EGFR. 37/41 pozitívnych prípadov bolo verifikovaných aj ALK/EML4
fúznou sondou, len 4 z 41 pozitívnych prípadov nebolo možné ďalej analyzovať
pre nedostatok materiálu. Okrem toho v 43 % (141/329) prípadov sme zistili
94
zvýšenú amplifikáciu ALK génu (v ≥ 15 % jadier nádorových buniek bolo
prítomných 4 a viac kópií ALK génu) (obr. 1).
Obrázok 1: Príklad amplifikácie ALK génu v karcinóme pľúc
Obrázok 2: Využitie fúznej ALK/EML4 sondy v sporných prípadoch. V oboch prípadoch
vzdialenosť červených a zelených signálov (v krúžku) nestačí na to, aby sa potvrdil jednoznačne
pozitívny výsledok (A1 a B1). V prípade A sme však detekovali 2 samostatné signály pre EML4 gén
(A2), kým v prípade B bol prítomný len 1 signál EML4 génu (B2). Môžeme teda konštatovať, že v
prípade A nastala inverzia medzi génmi ALK a EML4 a tento prípad je pozitívny na prestavbu ALK
génu, v prípade B však nenastala inverzia a tento prípad je negatívny na prestavbu ALK génu.
A1
B1
A2
B2
95
Vzhľadom na to, že sme v mnohých prípadoch identifikovali v nádorových
bunkách prítomnosť samostatného červeného signálu rôznej veľkosti, ALK/EML4
sondou sme analyzovali aj prípady s hraničnou pozitivitou (cut off 12 – 14 %) a
sporné prípady, v ktorých vzdialenosť červených a zelených signálov nebola
dostatočná alebo kde nebolo jasné, či samostatný červený signál v jadre znamená
skutočne pozitívnu bunku, alebo ide o nejaký artefakt či nešpecifický zlom v inom
mieste v ALK géne (obr. 2).
Od februára do augusta 2013 sme všetky vzorky NSCLC AC vyšetrovali paralelne
obomi dostupnými ALK zlomovými sondami. Týmto spôsobom bolo vyšetrených
75 vzoriek. Hodnotená bola intenzita zelených signálov, kvalita červených signálov
a celková hodnotiteľnosť FISH preparátu. Výrazne lepšie výsledky v intenzite
zelených signálov a celkovej hodnotiteľnosti preparátu preukázala sonda A. Tá
však mala dlhší úsek značený červenou fluorescenčnou farbou, na ktorom sa
vyskytovalo viacero zlomových miest, čo sťažilo vyhodnotenie prípadov
v dôsledku možných falošne pozitívnych nálezov a vyžadovalo retestovanie
vzoriek fúznou sondou ALK/EML4. Tento nedostatok však firma odstránila
dodaním novej sondy so skrátením spomínaného úseku z 800 kb na 200 kb.
Záver
Naše výsledky ukazujú, že v prvom kroku vyšetrovania je výhodné použiť zlomovú
sondu na detekciu prestavby ALK génu a v špecifických (pozitívnych alebo
nejednoznačných) prípadoch doplniť výsledok o detekciu prípadnej ALK-EML4
fúzie. Vzhľadom na častú amplifikáciu ALK génu, množstvo iných translokačných
partnerov ALK génu, ako aj vyššie náklady a zvýšenú časovú náročnosť pri
vyhodnocovaní preparátu s použitím trojfarebnej sondy nepovažujeme za vhodné
analyzovať všetky prípady len tzv. fúznou sondou. Vo všeobecnosti však
považujeme FISH metódu za štandard pri vyšetrovaní prestavby ALK génu
v prípadoch NSCLC a toto vyšetrenie hodnotíme ako významné z hľadiska cielenej
terapie a celkovej prognózy pacientov s NSCLC.
Poďakovanie
Podporené grantom MZ SR 2012/24-UKMA-1 „Detekcia prediktívne relevantných
parametrov v diagnostickom algoritme bioptického vyšetrenia karcinómu hrubého
čreva a pľúc“, ako aj projektmi CEPVII (ITMS: 26220120036) a MBRKM (ITMS:
26220220113), ktoré sú spolufinancované zo zdrojov EÚ.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Shaw AT, Yeap BY, Mino-Kenudson M, Digumarthy SR, Costa DB et al.
Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer
who harbor EML4 ALK. J Clin Oncol 2009; 27: 4247-4253.
[2]
Horn L and Pao W. EML4-ALK. Honing in on a new target in non-smallcell lun cancer. J Clin Oncol 2009; 27(26): 4232-4235.
96
[3]
[4]
[5]
Kwak EL, Bang Y-J, Camidge DR, Shaw AT, Solomon B et al. Anaplastic
lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med
2010; 363: 1693-703.
Soda M, Choi YL, Enomoto M, Takada S, Yamashita Y et al. Identification
of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer.
Nature 2007; 448 (7153): 561-6.
Togashi Y, Soda M, Sakata S, Sugawara E, Hatano S et al. KLC1-ALK. A
novel fusion in lung cancer identified using a formalin-fixed paraffinembedded tissue only. PLoS ONE (2012); 7(2): e31323.
97
Analýza rizikových faktorov vzniku bakteriémií
u detských onkologických pacientov a ich skorá
diagnostika
Pleško M.1, Sejnová D.1, Makohusová M.1, Chrenka B.1,
Hederová S.1, Perďochová Ľ.2, Lisalová M.2
Školiteľ: 1. Doc. MUDr. Emília Kaiserová, CSc.
1
Klinika detskej hematológie a onkológie DFNsP,
Bratislava, 2 HPL, Bratislava
Úvod
Infekcie sú najčastejšie komplikácie onkologického ochorenia aj onkologickej
liečby. Iné ako bakteriálne patogény, sú iba veľmi zriedkavo príčinou iniciálnej
infekčnej epizódy u detských onkologických pacientov [1]. Preto sa v predkladanej
práci zaoberáme rizikovými faktormi vzniku bakteriémií a v diskusii rozoberáme
možnosti ich skorej diagnostiky. V metaanalýzach zahraničných prác sa
dokumentovaná
mortalita
počas
febrilnej
neutropénie
u pacientov
s hematologickými malignitami pohybuje na úrovni 11% [2]. Viaceré americké
štúdie potvrdili, že u detských onkologických pacientov hospitalizovaných na JIS,
u ktorých sa rozvinula bakteriémia a následne septický šok, bola mortalita 13,5 –
17% [3,4,5] najdôležitejšie rizikové faktory vzniku septikémie boli identifikované,
okrem hematologických malignít, aj neutropénia trvajúca viac ako 7-10 dní a
zavedený centrálny venózny vstup [6]. Na analýzu týchto rizikových faktorov sú
zamerané prvé výsledky našej práce.
Materiál a metódy
Retrospektívna analýza výskytu bakteriémií u detských onkologických pacientov,
ktorí sa liečili v období r. 2009 – 2011 na Klinike detskej hematológie a onkológie
v Bratislave. Sústredili sme sa na analýzu rizikových faktorov vzniku infekcie
u detských onkologických pacientov: typ CVK, dĺžka zavedenia CVK, prítomnosť
neutropénie a febrility nad 38,5°C v čase odberu hemokultúry, trvanie neutropénie
s absolútnym počtom neutrofilov (ANC) ≤ 0,5. x 109/l a s absolútnym počtom
neutrofilov (ANC) v rozsahu 0,5. x 109/l - 1,0. x 109/l. Do súboru pacientov boli
zaradení pacienti s hematologickými malignitami, aj so solídnymi tumormi.
Zdrojom zbieraných údajov bola nemocničná elektronická dokumentácia.
Neutropéniu sme zadefinovali ako absolútny počet neutrofilov ≤ 0,5. x 109/l alebo
≤ 1,0. x 109/l s predpokladom poklesu pod 0,5. x 109/l. Horúčka bola definovaná
ako výstup telesnej teploty nad 38.5 °C v jednom meraní.
Výsledky
V rokoch 2009-2011 bolo na Klinike detskej hematológie a onkológie DFNsP v
Bratislave počas 3154 hospitalizácií hospitalizovaných 350 pacientov s miernou
98
prevahou dievčat (1,4:1). Vekový rozsah bol 0 – 259 mesiacov (priemer 102
mesiacov, medián 82,5 mesiaca). Odber hemokultúr (HK) sa realizoval u 216
(61,7%) pacientov. 45,5% pacientov, u ktorých bola izolovaná pozitívna HK,
tvorili pacienti s ALL a AML (s prevahou ALL nad AML v pomere 2,4:1) podrobnejšie spektrum dokumentovaných diagnóz vizualizuje graf 1.
Graf 1: Spektrum diagnóz u pacientov s dokumentovanou pozitívnou HK (n=116)
U 116 pacientov z celkového počtu 350 (33,1%) bola HK pozitívna, u 90 (25,7%)
negatívna. Bakteriémie tvorili až 94,8% prípadov pozitívnej HK (v ostatných
prípadoch šlo o mykotické infekcie). Jednalo sa najmä o gram pozitívne koky,
ktoré boli diagnostikované 527-krát (78,3%) u 92 pacientov (79,3%). Podiel
jednotlivých typov patogénov zhrňuje graf 2.
Graf 2: Z hemokultúr izolované patogény (n= 673)
99
V skupine pacientov s dokumentovanou pozitivitou HK (n=116) bolo
implantovaných 165 centrálnych venóznych katétrov (v priemere 1,7 CVK na
jedného pacienta), z toho 75 krát sa jednalo o Port-a-cath, 63 krát CVK typu
Hickman, 25 krát dialyzačný CVK, 5 pacientov CVK nemalo zavedený. Priemerná
dĺžka zavedenia bola 165,5 dňa (rozsah: 1 – 1258 dní). Spolu sa v sledovanej
skupine pacientov uskutočnilo 154 exrakcií CVK, z toho najčastejšou príčinou
vybratia bola infekcia krvného prúdu so suspekciou na infikovaný CVK (39 krát –
25,3%), druhou najčastejším dôvodom explantácie bolo ukončenie terapie (29 krát
– 18,8%) a tretím nefunkčnosť katétra (18 krát – 11,7%). Priemerný počet dní od
implantácie CVK do záchytu prvej pozitívnej HK bol 212,3 dní (medián 99 dní).
U 53 pacientov s pozitívnou HK sme v čase jej odberu detekovali neutropéniu. U
36 pacientov sme zaznamenali 63 epizód febrilnej neutropénie (FN).
Neutropenická epizóda sa u pacientov objavila v priemere 3,5 dňa od začiatku
hospitalizácie (medián 3 dni). FN, s nálezom pozitívnej HK, rozvinuli pacienti v
priemere 23 dní (medián 18 dní) od začiatku hospitalizácie (v priemere sa jednalo o
6 hospitalizáciu v poradí). Trvanie neutropenickej epizódy s ANC ≤ 0,5. x 109/l
bolo v priemere 47 dní, medián 30 dní; trvanie neutropenickej epizódy s ANC
v rozsahu 0,5. x 109/l - 1,0. x 109/l malo priemer aj medián 5 dní. V prípade
neutropénie s ANC ≤ 0,5. x 109/l sme zaznamenali vyšší podiel febrilít v čase
odberu HK (96%), v porovnaní s neutropenickými epizódami s ANC v rozsahu 0,5.
x 109/l - 1,0. x 109/l (4%), čo dokumentuje graf 3.
Graf 3: Percento pacientov s febrilnou epizódou v závislosti od ANC
Diskusia
V súlade s literárnymi údajmi, v sledovanej skupine pacientov s dokumentovanou
pozitivitou HK, temer polovicu tvorili pacienti s hematologickými malignitami [4].
V priebehu niekoľkých dekád nastala zmena v spektre izolovoných baktériálnych
agensov v prípadoch FN z gram-negatívnych na gram-pozitívne baktérie.
Popisovaných až 70% pozitívnych izolátov [2], korešponduje aj s našimi
výsledkami. Vysvetľuje sa to zvýšením intenzity chemoterapie, ktorej dôsledkom
je narušenie prirodzených imunitných slizničných bariér (mukozitída), ale aj
nárastom používania centrálnych venóznych katétrov (CVK) [2]. Zaznamenali sme
intenzívne vyžívanie centrálnych venóznych vstupoch aj na našom pracovisku.
100
Výsledky našej práce tiež naznačujú, že ANC ≤ 0,5. x 109/l je jeden z
najdôležitejších rizikových faktorov pre rozvoj febrilnej epizódy s protrahovaným
trvaním neutropénie, čím sa zvyšuje pravdepodobnosť výskytu bakteriálnej
infekčnej komplikácie, predovšetkým bakteriémie.
V pokračovaní našej práce, ktorú realizujeme v súčasnosti, rozširujeme analýzu
rizikových faktorov bakteriémie o sledovanie hladín cytokínov (IL-6, Il-10, TNFα)
ako skorých markerov bakteriémie. Porovnávame ich pozitívnu a negatívnu
prediktívnu hodnotu s konvenčnými markermi infekcie – s CRP a prokalcitonínom.
Zámerom štúdie je určiť význam cytokínov ako skorých markerov bakteriálnych
infekčných komplikácii u detských onkologických pacientov. Z týchto komplikácii
je v centre nášho záujmu bakteriémia zaznamenaná u pacientov s hematologickými
malignitami. Užitočnosť cytokínov spočíva predovšetkým v schopnosti správne
identifikovať neprítomnosť bakteriémie (vysoká negatívna prediktívna hodnota)
počas febrilnej neutropénie [7,8]. Tento údaj, ktorý je k dispozícii ešte pred
dokumentovanou pozitivitou/negativitou hemokultúry môže prispieť k
racionalizácii ATB liečby a zníženiu selektovania rezistentných kmeňov baktérií.
Za zváženie taktiež stojí preskúmanie ďalších perspektívnych možností skorej
diagnostiky sepsy u detských onkologických pacientov a pediatrických pacientov
vôbec, a to v prípadoch diagnostických modalít, kde je pre detský vek minimum
dát. Na základe adultných štúdií tieto podmienky spĺňa napr. nový biomarker sepsy
- presepsin, alebo PCR analyzačný systém SeptiFast.
Poďakovanie
Ďakujem za vedenie mojej školiteľke doc. MUDr. Emílií Kaiserovej, CSc., za
konzultácie a inšpiráciu doc. MUDr. Helene Hupkovej, PhD., za pripomienkovanie
a nasmerovanie pani primárke MUDr. Daniele Sejnovej, PhD., za neoceniteľné
rady a komentáre kolegovi MUDr. Jozefovi Šuvadovi, PhD., MPH.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Hakim H, Gaur A. H. Initial Management of Fever and Neutropenia in
Child with Cancer – The Past, the Present and the Future. Clinical
Emergency Medicine. 2011; 2, 3: 174 – 184.
[2]
Naurois D.E, Novitzky-Basso I., Gill M.J. Management of febrile
neutropenia: ESMO Clinical Practice Guidelines. Annals of Onclogy. 2010;
21, 5: 252-256
[3]
Field R. Bloodstream infections in cancer patients with febrile neutropenia.
Intenational Journal of Antimicrobial Agnets. 2008; 32, 1: 30 – 33.
[4]
Fiser R.T., West K.N., Bush A.J. Outcome of severe sepsis in paediatric
oncology patients. Pediatric Crit Care Med. 2005, 6, 5: 531 – 536.
[5]
Krutko M.C., Calarco M.P., Flaherty M.B. Mortality rates in pediatric septic
shock with and without multiple organ system failure. Pediatric Crit Care
Med. 2003, 4, 3: 333 – 337.
[6]
Drgoňa Ľ. Praktický pohľad na diagnostiku a liečbu infekcií onkologických
pacientov. Via pract. 2007, 4, 2: 24 – 30.
101
[7]
[8]
Miedema K.G., De Bont E.S., Elferink R.F. The diagnostic value of CRP,
IL-8, PCT, and STREM 1 in the detection of bacterial infection in pediatric
oncology patients with febrile neutropenia. Support Care Cancer. 2011, 19,
10: 1593 – 1600.
Vänskä M., Koivula I., Jantunen E. IL-10 combined with procalcitonin
improves early prediction of complications of febrile neutropenia in
hematological patients. Cytokine. 2012, 60, 3: 787 – 792.
102
Bortezomibom indukovaná smrť
leukemických buniek je sprevádzaná štiepením
štiepením HSP90β, IκBα a prokaspázy 3.
Úloha kaspázy 8
Kliková K.1, Štefaniková A.1, Pilchová I.1, Hatok J.1,
Chudý P.2, Chudej J. 2, Dobrota D. 1, Račay P.1
1
Ústav lekárskej biochémie, Jesseniova lekárska fakulta v
Martine, Univerzita Komenského v Bratislave, Slovenská
republika,2 Klinika hematológie a transfuziológie,
Univerzitná nemocnica Martin, Slovenská republika
Abstrakt
Správne fungovanie intracelulárneho prostredia tzv. homeostázy závisí od presnej
kontroly vnútrobunkových procesov, kam môžeme zaradiť systémovú a vysoko
regulovanú degradáciu bielkovín, ktoré sú zodpovedné za bunkové delenie, rast či
smrť bunky (Schwartz a Davidson, 2004). Ak dôjde k narušeniu týchto procesov,
dochádza k akumulácii regulačných bielkovín v intracelulárnom prostredí.
V eukaryotických bunkách existujú dva mechanizmy degradácie chybných alebo
pre bunku toxických bielkovín. Prvým z nich je proces autofágie a druhým
procesom je proteozomálny systém degradácie bielkovín (Lamark a Johansen,
2010). Jedným z našich cieľov bolo sledovať vplyv reverzibilného
proteozomálneho inhibítora 20S podjednotky s chymotrypsín podobnou aktivitou
bortezomibu (PS -341, Velcade®) na citlivosť a prežívanie u dvoch leukemických
línií HL-60 a K-562. Bortezomib indukoval rýchlejšiu bunkovú smrť u HL-60 v
porovnaní s K-562. Pre HL-60 bola hodnota LC50 stanovená po 24h 39.3±4.5, po
48h 16.3±0.8 a po 72h 13.4±0.9 nmol/l bortezomibu. Pre K-562 bola stanovená
hodnota LC50 až po 72h 20.3±1.9 nmol/l bortezomibu. Zároveň sme sledovali
zmeny hladín vybraných bielkovín (HSP90β, IκBα, kaspázy 3) po pôsobení
bortezomibu u línií HL-60, K-562 a glioblastómovej línii T98G. Po 16 hod.
inkubácii HL-60 s bortezomibom došlo k štiepeniu HSP90β za vzniku 50 kDa
veľkého fragmentu a pri K-562 až po 48 hod. inkubácii. Zároveň sa zvýšila hladina
antiapoptotickej bielkoviny HSP70 u oboch línií ako dôsledok proteozomálneho
stresu. Okrem toho došlo ku štiepeniu IκBα ako aj proteolytickej aktivácii kaspázy
3 u HL-60 a proteolytickej degradácii prokaspázy 3 u K-562. Zo získaných
výsledkov sme hľadali odpoveď na otázku: „Ktorá z bunkových proteáz je
zodpovedná za štiepenie spomínaných bielkovín?” Zamerali sme sa na niekoľko
proteáz t.j. katepsín B a D, granzým B, kaspázu 3, 8 a 9 a íné. Esenciálnu úlohu v
rámci bortezomibom indukovaného štiepenia HSP90β a IκBα u oboch línii ako aj
aktivácie kaspázy 9 a 3 u HL-60 zohrávala kaspáza 8.
103
Zvýšená expresia survivinu ako rizikový faktor
u pacientov s karcinómom prostaty
Katarína Jurková1,2, Veronika Mešťanová1,2,
Martina Furjelová1,2, Mária Kovalská1, Marian Adamkov1
1
Ústav histológie a embryológie, Jesseniova lekárska
fakulta Univerzity Komenského, Malá Hora 4, 03601
Martin 2Ústav lekárskej biochémie, Jesseniova lekárska
fakulta Univerzity Komenského, Malá Hora 4, 03601
Martin
Úvod
Včasná diagnostika akéhokoľvek nádorového ochorenia je základom úspešnej
terapie. Karcinóm prostaty je na Slovensku štvrtým najčastejšie diagnostikovaným
malígnym ochorením mužskej populácie. Najčastejšie sa diagnostikuje u mužov
vo veku nad 65 rokov [1]. V posledných desaťročiach sa pozornosť
zainteresovaných odborníkov sústreďuje na poruchy regulačných mechanizmov
apoptózy (programovanej bunkovej smrti). Potlačenie apoptotických procesov je
všeobecne jedným zo základných predpokladov vzniku nádoru. Existuje množstvo
mechanizmov, ktoré vedú ku vzniku nádoru. Apoptóza môže byť inhibovaná
vysokou expresiou anti-apoptotických proteínov a naopak produkcia proapoptotických proteínov môže byť potlačená. Zmeny v expresii týchto proteínov
môžu viesť k vzniku nádorového ochorenia a ovplyvňovať odpoveď nádorových
buniek na terapiu [2]. Nádorové bunky sú v princípe transformované z normálnych
buniek. Transformácii predchádza obvykle genetická mutácia protoonkogénov
a/alebo tumor supresorových génov. Transformované nádorové bunky strácajú
schopnosť normálnej regulácie bunkového delenia [3]. V zložitých regulačných
mechanizmoch apoptózy hrá jednu z kľúčových úloh aj anti-apoptotický proteín
survivin. Survivin je multifunkčný proteín, ktorý inhibuje apoptózu, zúčastňuje sa
regulácie bunkového cyklu a stimuluje novotvorbu ciev. Je exprimovaný v rôznych
typoch nádorových ochorení, pričom v normálnom tkanive sa nenachádza alebo len
v minimálnych množstvách. V dôsledku rôznej expresie v nádorovom
a nenádorovom tkanive sa javí ako možný prognostický a diagnostický marker.
Zvýšená expresia survivinu je často spojená s agresívnejším rastom nádoru,
skráteným prežívaním a zhoršenou odpoveďou na chemoterapiu [4].
Materiál a metódy
Vyšetrili sme archívny materiál vo forme parafínových bločkov zo 150 punktátov
tenkou ihlou. Punktáty boli odobraté v rámci diagnostického vyšetrenia tenkou
ihlou z tkaniva prostaty. Vzorky boli histologicky a imunohistochemicky
vyšetrené dvoma patológmi a ku každému malígnemu nádorovému tkanivu bolo
priradené Gleason skóre a grading nádoru (stupeň diferenciácie buniek). Náš
skúmaný súbor tvorilo 19 prípadov benígnej hyperplázie prostaty a 131 prípadov
104
adenokarcinómu prostaty (grade: 1-3). Z každého parafínového bločku sme
narezali 4m hrubé rezy, ktoré sme ďalej použili na imunohistochemický dôkaz
survivinu použitím peroxidázovej techniky. Monoklonálna protilátka proti
survivinu (DAKO, Clone 12C4) bola riedené 1:50. Reakcie bola po inkubácii
vyzualizovaná DAB (3,3´-diaminobenzidín) chromogénom (DAKO, Clone
K3467). Všetky rezy sme v koncovej fáze dofarbili Mayerovým hematoxylínom
(modré jadrá buniek) (DAKO). Výsledné farbenia boli pozorované svetelným
mikroskopom, pričom pri interpretácii získaných imunohistochemických vyšetrení
sme semikvantitatívne hodnotili nasledovné parametre:
Subcelulárna lokalizácia
a) v jadre bunky- N
b) v cytoplazme bunky- C
c) kombinovaná jadrová a cytoplazmová pozitivita- NC
Intenzita reakcie
a) absentujúca alebo sotva detekovateľná- A
b) slabá- +
c) stredná- ++
d) silná- +++
Percento pozitívne farbených buniek
a) 0-10%
b) 11-50%
c) 51-100%
Pozorovania sme štatisticky vyhodnotili použitím Chí- kvadrát testu. Všetky
štatistické výpočty boli spracované programom Microsoft Excel (2007).
Výsledky
Benígne lézie
Pri hodnotení tkaniva benígnej hyperplázie prostaty bola expresia survivinu
prítomná v 4/19 prípadoch (21%) v cytoplazme. Intenzita imunoreakcie survivinu
bola vo všetkých pozitívnych prípadoch slabá s lokalizáciou v cytoplazme, pričom
percento pozitívnych buniek sa pohybovalo v rozmedzí 0-50%.
Malígne lézie
Survivin bol exprimovaný v 99/131 prípadoch (75,6%). Pozorovali sme tri
subcelulárne lokalizácie imunohistochemickej pozitivity: N- jadrovú (obr. 1B) Ccytoplazmovú, NC- kombinovanú jadrovú a cytoplazmatickú pozitivitu (obr. 1 A).
A
B
Obrázok 1: A- kombinovaná jadrová a cytoplazmová pozitivita survivinu
B- jadrová pozitivita survivinu v malígnom tkanive prostaty
105
Survivin bol v šiestich prípadoch lokalizovaný len v jadre (4,6%), v dvoch
prípadoch (1,5%) bol prítomný iba v cytoplazme a v 91 prípadoch (69,5%) bola
pozitivita kombinovaná, jadrová a zároveň cytoplazmová. Vo vzorkách s viac ako
10% pozitívnych nádorových buniek bol exprimovaný v 59 prípadoch (45,0%).
V 68 prípadoch (51,9%) sme hodnotili intenzitu reakcie survivinu ako slabú, v 28
(21,4%) ako strednú a v troch prípadoch (2,3%) ako silnú.
benígne
malígne
p
A
15
32
+
++
4
0
68
28
1,8e-4
+++
0
3
N
0
6
C
NC
4
0
2
91
4e-8
0-10
2
40
11-50 51-100
2
0
35
24
2,3e-4
Tabuľka 1: Hodnotené parametre expresie survivinu v malígnych a benígnych léziách prostaty
Vek
n=131
60
61-70
70
p
Grage
G1
G2
G3
p
A
+
3
10
19
12
22
34
A
3
23
6
++
5
11
12
0,965
+
++
7
1
46
19
15
8
0,981
+++
N
C
NC
0-10
11-50
51-100
0
2
1
4
1
1
13
34
44
10
13
17
N
0
3
3
NC
8
62
21
0-10
4
26
10
5
14
16
0,703
11-50
3
23
9
0,998
2
8
14
+++
0
2
1
0
0
2
0,965
C
0
2
0
0,936
51-100
1
18
5
Tabuľka 2: Vzťah medzi expresiou survivinu a klinicko-morfologickými parametrami (vek, grade)
Diskusia a záver
Anti-apoptotický proteín survivin môže byť lokalizovaný v jadre, v cytoplazme
alebo súčasne v jadre a cytoplazme. Je známe, že survivin je vysoko exprimovaný
v mnohých premalígnych léziách a malígnych nádoroch, no len veľmi zriedka ho
nachádzame v normálnom diferencovanom tkanive dospelého človeka. V našom
súbore sme pozorovali imunoreakciu survivinu v 99/131 prípadoch
adenokarcinómu (75,6%). Vo všeobecnosti je pre malígne nádorové ochorenia
charakteristická jadrová pozitivita imunohistochemického farbenia [4]. Podľa Mc
Eleny a kolektív [5] sa survivin nenachádza v normálnom sekrečnom epiteli
prostatických buniek. V našom súbore adenokarcinómov dominovala v 91
prípadoch (69,5%) kombinovaná jadrová a cytoplazmová pozitivita survivinu, v 6
prípadoch (4,6%) výlučne jadrová a v 2 prípadoch (1,5%) iba cytoplazmová
pozitivita survivinu. Youssef, Hewedi a Raboh [6] popísali expresiu survivinu v 65
prípadoch karcinómu prsníka, pričom expresia survivinu bola o niečo vyššia ako
v našom súbore. Pozitívnych na survivin bolo 78,5% prípadov, pričom dominovala
rovnako ako v našej vzorke, kombinovaná cytoplazmová a jadrová pozitivita
(44,62%). Štatistická analýza potvrdila horšiu prognózu nádorového ochorenia
asociovanú s expresiou tohto proteínu v nádorovom tkanive prsnej žľazy. Priľahlé
106
normálne tkanivo prsníka bolo hodnotené ako imunonegatívne [6]. K podobným
výsledkom dospeli Ko a spol. [7]. Venovali sa imunohistochemickej štúdii
adenokarcinómov v oblasti hlavy a krku. V týchto prípadoch prevládala
cytoplazmová pozitivita survivinu (83,8%), avšak jadrová pozitivita sa spájala
s agresívnejšou formou nádoru. Presný mechanizmus inhibície apoptózy
survivinom nie je doposiaľ úplne objasnený. Apoptotické mechanizmy sú závislé
na faktore, ktorý spúšťa apoptózu, na fáze bunkového cyklu a tiež na type buniek
[8]. Adamkov a spol. [9] sledovali expresiu survivinu v tkanive 25 prípadoch
malígnych melanómov. Výsledky štúdie poukázali na fakt, že survivin bol v týchto
tkanivách asociovaný s horšími histologickými parametrami, čo sa však v našom
súbore nepotvrdilo. V benígnom tkanive prostaty našej skupiny pacientov, survivin
absentoval v 15 prípadoch (79%). V iných typoch benígnych nádorov však bola
pozorovaná vyššia expresia survivinu. Das, Tan a Smith [10] popisujú až 94%
pozitívnych prípadov expresie survivinu v tkanive benígnych meningiómov.
Na základe výsledkov našej štúdie môžeme konštatovať, že pre malígne bunky je
skôr charakteristická jadrová a kombinovaná jadrová a cytoplazmová pozitivita
a pre benígne lézie, ak je prítomná, tak cytoplazmová pozitivita survivinu. Ďalej na
základe získaných výsledkov je možné považovať jadrovú a kombinovanú jadrovú
a cytoplazmovú pozitivitu za dôležitý diagnostický a prognostický marker
karcinómu prostaty. V našom súbore bola uvedená pozitivita survivinu detekovaná
v 75,6%.
Poďakovanie
Autori si dovoľujú poďakovať pani M. Kondekovej, pani A. Rešetárovej a
pani S. Drahošovej za technickú spoluprácu.
Práca bola podporená grantovým projektom VEGA 1/0050/11.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Ondrušová M, Ondruš D. Výskyt a úmrtnosť na karcinóm prostaty na
Slovensku a v zahraničí. Onkológia 2009; 4(5): 272-274.
[2]
Kehinde EO, Maghrebi MA, Anim JT. The importance of determing the
aggressiveness of prostate cancer using serum and tissue molecular markers.
Can J Urol 2008; 15: 3967-3974.
[3]
Shin S, Sung BJ, Cho YS. An anti-apoptotic protein human survivin is
a direct inhibitor of caspase-3 and caspase-7. Biochemistry 2001; 40: 11171123.
[4]
Duffy MJ, O´Donovan N, Brennan DJ, Gallagher WM, Ryan BM. Survivin:
A promisingTumor Biomarker. CancerLett 2007; 249: 49-60.
[5]
Mc Eleny KR, Watson WG, Coffey RNT, O´Neil AJ, Fitzpatrick JM.
Inhibitors of Apoptosis Proteins in Prostate Cancer Cell Lines. Prostate
2002; 51: 133-140.
[6]
Youssef NS, Hewedi IH, Abd Raboh NM. Immunohistochemical
Expression of Survivin in Breast Carcinoma: Relatioship with
107
[7]
[8]
[9]
[10]
Clinicopathological Parameters, proliferation and Molecular Classification.
J Egypt Natl Canc Inst 2008; 20(4): 348-357.
Ko YH, Roh SY, Won HS, Jeon EK, Hong SH et al. Prognostic
Significance of nuclear survivin expression in resected adenoid Cystic
Carcinoma of the Head and Neck. Head Neck Oncol 2010; 2:30.
Hoffman WH, Biade S, Zilfou JT, Chen J, Murphy M. Trancriptional
repression of the Anti-apoptotic survivin Gene by wild type p53. J Biol
Chem 2002; 277: 3247-3257.
Adamkov M, Lauko Ľ, Rajčáni J, Bálentová S, Rybárová S et al.
Expression of antiapoptotic protein survivin in malignant melanoma.
Biologia 2009; 64(4): 840-844.
Das A, Tan WL, Smith DR. Expression of the inhibitor of apoptosis protein
survivin in benign meningiomas. Cancer Lett 2003; 193: 217-223.
108
5-azacytidine nucleosides and their
derivatives: Molecular hallmarks of drug
resistance
Khushboo Agrawal1, Petr Džubák1, Ivo Frydrych1,
Dušan Holub1, Petr Vojta1, Marcela Krečmerová2,
Miroslav Otmar2, Marián Hajdúch1
1
Palacky University, Faculty of Medicine
and Dentistry, Institute of Molecular
and Translational Medicine, Olomouc,
Czech Republic 2Institute of Organic Chemistry
and Biochemistry, Academy of Sciences
of the Czech Republic, v.v.i., Prague, Czech Republic
Abstract
Purpose: Resistance to DNA methylation inhibitors, 5-azacytidine (azacytidine)
and 2'-deoxy-5-azacytidine (decitabine) is one of the major barriers forefending the
successful epigenetic therapy. Therefore, the purpose of this study was to test the
wide range of newly synthesized epigenetic drugs for demethylation activity, to
search for alternative drugs targeting methylation, and to uncover the molecular
mechanisms of resistance to decitabine.
Methods: We utilized the endogenous promoter CGI of the FLJ32130 gene which
was found to be 95% methylated in human colorectal cancer cell line, HCT116, to
establish a detection system for screening demethylating agents. In addition, to
investigate the mechanisms of resistance, we developed several HCT116 p53 wildtype cell clones, resistant towards decitabine. Principal methods used during the
study of resistance were MTT cytotoxicity assays, flow cytometry based analyses
and molecular profiling of the resistant clones which included RNA sequencing
based transcriptomics and mass spectrometry based proteomics.
Results: In the quest for more potent drugs targeting methylation, the newly
synthesized epigenetic drug, LEM-789 showed significant demethylation activity
in preclinical studies. During resistant studies, flow cytometry based analyses
revealed significant up-regulation of DNA and RNA synthesis. Molecular profiling
of the resistant clones unveiled the affected cellular pathways involving genes and
proteins which were differentially expressed compared to the parental cell line,
determining the molecular hallmarks of drug resistance.
Introduction
DNA methylation at the site of CpG islands is one of the fundamental mechanisms
that results in transcriptional silencing of genes responsible for cell death and/or
differentiation [1] and has remained a persistent hallmark due to its occurrence in
majority of cancers [2]. The prototypical inhibitors of DNA methylation,
azacytidine and decitabine which function by inhibiting DNA methyltransferases
have shown substantive efficacy in treatment of myeloid malignancies and have
109
been approved by the food and drug administration as the potential therapeutics for
myelodysplastic syndromes [3]. However, like many other anti-cancer drugs
resistance to these demethylating agents remains a major obstacle in the successful
therapy. Despite encouraging results in vitro, the clinical trials fail to accomplish
the intended results due to persistent chemo-resistance varying with individual
molecular pathology. Most patients suffer with primary resistance and do not
respond to the drug while others responding initially, eventually relapse during
long term and develop secondary resistance [4]. The present study is directed
towards the screening of the new epigenetic drugs with the main focus on 5azacytidine nucleosides and their derivatives, to search for alternative therapeutic
drugs targeting DNA methylation. Furthermore, the study also relates with
uncovering the molecular mechanisms of resistance to decitabine.
Materials and methods
Cell culture
Human colorectal cancer cell line, HCT116 (Horizon Discovery Ltd., Cambridge,
United Kingdom) was cultured in McCoy’s 5A medium (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO) supplemented with 10% fetal bovine serum (PAN-Biotech GmbH,
Aidenbach, Germany), 3 mM L-glutamine, 50 μg/mL streptomycin (SigmaAldrich) and 100 U/mL penicillin (Biotika, Slovenská Ľupča, Slovak Republic) at
37°C and 5% CO2.
Screening of new epigenetic drugs for demethylation
Establishment of the detection system
The promoter CGI of the FLJ32130 gene was found to be 95% methylated in
human colorectal cancer cell line, HCT116 [5]. To generate the reporter cell line
for demethylation, a vector construct, where a part of exon 3 of the FLJ32130 gene
was replaced with the fusion of IRES, Hygromycin and EGFP was targeted to
HCT116 cells, to achieve homologus recombination, using electroporation (Neon
Transfection System, Invitrogen, Carlsbad, CA). The stable transfectants were then
generated by selection with 500 μg/mL neomycin. To establish a sensitive
detection system, numerous neomycin resistant clones were tested by the flow
cytometry for the anticipated green fluorescence after the addition of decitabine.
Finally, one clone with no EGFP expression before treatment and responding to the
low dose of decitabine (0.5 μM) was isolated. Furthermore, to facilitate the high
content cellular imaging and continuous visualization of chromosomal degradation
in response to the drug, reporter cell line was transduced with the TagRFP fused
with histone H2B, using lentiviral system (LentiBrite Histone H2B-RFP Lentiviral
Biosensor, EMD Millipore, Billerica, MA).
High content cellular imaging
To test the newly synthesized epigenetic drugs, the reporter cell line (HCT116pFLJ-H2B) was plated at the density of 1.5 × 103 cells per well in 96 well plates.
After 24 h, drugs were added. Following the treatment with the drugs, images were
110
captured at every 24 h intervals until 5 days under appropriate wavelengths for
excitation/emission (EGFP: 458 nm/525 nm, RFP: 555 nm/584 nm) using high
content imaging system (Operetta, PerkinElmer, Waltham, MA). Images were then
analyzed using image analysis software (Columbus, PerkinElmer). Cytotoxicity of
the drugs was determined by counting the number of viable cells in each well with
the help of TagRFP fused with histone H2B in the cell nucleus. However,
demethylation activity of the drugs was assayed by quantifying the intensity of
EGFP fluorescence in each well.
Study of mechanism of resistance
Development of decitabine resistant cell lines
For the development of decitabine resistant cell lines, two methods were used for
which HCT116 cells were seeded into two petridishes at a density of 1 × 106
cells/10 cm dish. The cells in dish A were initially treated with 1x IC50
concentration of the decitabine (0.28 µM) which was gradually increased up to 10x
IC50 in following passages whereas, the cells in dish B were directly exposed to 5x
IC50 concentration of the decitabine which was further doubled to 10x IC50. After
long term exposure of the cells to cytotoxic dose of the decitabine, resistant cell
population was cloned resulting in isolation of six resistant cell lines, R1, R2, R3,
R4 (petridish A) and R5, R6 (petridish B). To confirm the resistance to decitabine,
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) based
cytotoxicity assays were performed [6] and resistance index was evaluated as the
fold increase in the IC50 of the resistance cell lines compared with their genetically
identical drug sensitive counterpart or the parental cell line, HCT116. Each of the
six resistant cell lines thus analyzed exhibited high resistance (>100x IC50).
Cell cycle analysis
Cell cycle was analyzed using flow cytometry based cellular assays and data was
generated from three independent experiments. To distinguish the cells in different
phases of the cell cycle, phospho-histone H3 (ser10) staining was done [7]
however, to analyze the cells actively synthesizing DNA and RNA, BrdU and BrU
cell proliferation assays were performed respectively [8]. To monitor the changes
in the cell cycle, each of the resistant cell lines were compared with the HCT116
parental cells.
RNA sequencing (RNA-Seq) based transcriptomics
For characterization of resistant cell lines at transcript level, mRNA was isolated
from sub-confluent monolayer culture of HCT116 parental and the resistant cell
lines (Ambion RiboPure Kit, Life Technologies, Carlsbad, CA) which was further
used to construct the cDNA library (TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit,
Illumina, San Diego, CA). The cDNA library hence prepared was validated and
quantified (Agilent High Sensitivity DNA Kit, Agilent Technologies, Santa Clara,
CA). The samples with different indexes were then pooled together and sequenced
using massively parallel signature sequencing (HiSeq 2500, Illumina) and aligned
111
to annotated human reference genome (HG19) followed by quantification of
transcript level expression [9]. Four independent experiments were performed and
the differential expressions were reported by comparing each of the resistant cell
lines with HCT116 parental cells. The statistical significance was determined by
the binomial test.
Mass spectrometry based proteomics
For the proteome wide analysis of the resistant cell lines, stable isotope labelling by
amino acids in cell culture (SILAC) was used [10]. HCT116 parental cells were
cultured for 8 doublings in SILAC medium (Thermo Scientific, Waltham, MA)
substituted with heavy Lys-13C6 and Arg-13C6 and dialyzed fetal bovine serum
(Sigma-Aldrich). The labelled parental cells were then mixed with each of the nonlabeled resistant cell lines in 1:1 ratio followed by cellular lysis. The SILAC
mixtures thus prepared were then separated by the preparative gel electrophoresis
(Mini Prep Cell, Bio-Rad, Hercules, CA) at constant power of 1W followed by
reduction [tris-(2-carboxyethyl)phosphine], alkylation (iodoacetamide) and
enzymatic in-gel digestion (Trypsin Gold, Promega, Madison, WI). The digested
peptide mixtures were then extracted from the gel and purified. The purified
peptides were then finally subjected to LC-MS/MS analysis and the mass spectra
were acquired in a data dependent manner, using high performance liquid
chromatography coupled to an Orbitrap Elite Mass Spectrometer (Thermo
Scientific). The Raw MS files were then analyzed and MS/MS spectra were
searched against the UniprotKB/Swiss-Prot-human database followed by
quantification of protein level expression. Three independent experiments were
performed and the differential expressions were reported by comparing each of the
resistant cell lines with HCT116 parental cells. The statistical significance was
determined by calculating the p-value with a Benjamini-Hochberg multiple
hypothesis testing correction.
Results
Screening of the new epigenetic drugs
After screening 76 newly synthesized epigenetic drugs, LEM-789 (Marcela
Krečmerová, Miroslav Otmar, IOCB, ASCR, v.v.i., Prague, Czech Republic) was
identified as the potential candidate for demethylation. Fig. 1 represents the
cytotoxicity and demethylation profile of LEM-789 for 5 days in comparison with
well characterized drugs, decitabine, alpha anomer of decitabine (a-DAC) and
vidaza. Furthermore, the demethylation activity of LEM-789 was observed to be
nearly constant from day 1 to day 5 indicating towards the stability of the drug
during the treatment.
112
Figure 1: (A) Cytotoxicity and (B) Demethylation profile of epigenetic drugs
Flow cytometric analysis
No significant changes were observed in the distribution of cells in different phases
of the cell cycle (Fig. 2A). However, cell proliferation assays, BrU and BrdU
revealed the significant up-regulation of DNA [HCT116 vs R1-R6 (p ˂0.0001)]
and RNA synthesis [HCT116 vs R1-R4 (p ˂0.0001), HCT116 vs R6 (p ˂0.001)] in
the resistant cell lines (Fig. 2B).
Figure 2: Flow cytometry (A) Cell cycle analysis (B) Cell proliferation assays
RNA sequencing and proteome wide analysis
RNA sequencing based transcriptomics and mass spectrometry based proteome
wide analysis unveiled 8011 genes and 4343 proteins respectively which were
differentially expressed (ANOVA p<0.05) in drug resistant cell lines compared
with the HCT116 parental cells. The major affected cellular pathways were (i)
DNA damage (ii) Transcription: role of heterochromatin protein 1 (iii) Cell cycle:
regulation of G1/S transition and initiation of mitosis (iv) Apoptosis and survival:
granzyme A signaling.
Discussion
Despite, tremendous advancement in the field of cancer epigenetics dogged
persistence of chemotherapeutic resistance remains a major barrier in successful
113
eradication of the disease. This consistently focuses on the paramount importance
of investigating the mechanisms of drug resistance, crucial for identification of
targets for novel anti-cancer drugs which may selectively eliminate the resistance
to a particular chemotherapeutics and avoid potential therapy failure by opening the
doors for combinatorial therapy and better tailor the therapeutic regimen depending
on the individual molecular pathology. The present study will aid further insight to
the molecular basis of acquired tumor resistance to 2’-deoxy-5-azacytidine and
help in predicting the clinical response to the same. It will also facilitate the
introduction of novel therapeutics targeting methylation.
Acknowledgement: This work was supported by internal grant of Palacky
University (LF_2013_016), BIOMEDREG (CZ.1.05/2.1.00/ 01.0030) and Ministry
of Industry and Trade of the Czech Republic (FR-TI4/625).
References
[1]
Grant S. Targeting Histone Demethylases in Cancer Therapy. Clinical
Cancer Research 2009; 15: 7111-13.
[2]
Rodríguez-Paredes M, Esteller M. Cancer epigenetics reaches mainstream
oncology. Nature Medicine 2011; 17: 330-39.
[3]
Saba H.I. Decitabine in the treatment of myelodysplastic syndromes.
Therapeutics and Clinical Risk Management 2007; 3: 807-17.
[4]
Qin T, Castoro R, Ahdab SE, Jelinek J, Wang X et al. Mechanisms of
Resistance to Decitabine in the Myelodysplastic Syndrome. PLoS ONE
2011; 6: e23372.
[5]
Takada EO, Ichimura S, Kaneda A, Sugimura T, Ushijima T. Establishment
of a detection system for demethylating agents using an endogenous
promoter CpG island. Mutation Research 2004; 568: 187-94.
[6]
Dzubak P, Hajduch M, Gazak R, Svobodova A, Psotova J et al. New
derivatives of silybin and 2,3-dehydrosilybin and their cytotoxic and Pglycoprotein modulatory activity. Bioorg. Med. Chem. 2006; 14: 3793-810.
[7]
Fabienne H, Stefan D. Histone H3 phosphorylation and cell division.
Oncogene 2001; 20: 3021-27.
[8]
Rothaeusler K, Baumgarth N. Assessment of Cell Proliferation by 5Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling for Multicolor Flow Cytometry.
Current Protocols in Cytometry 2001; 7-31.
[9]
Hasmats J, Gre´en H, Orear C, Validire P, Huss M et al. Assessment of
Whole Genome Amplification for Sequence Capture and Massively Parallel
Sequencing. PLoS ONE 2014; 9: e84785.
[10] Mann M. Functional and quantitative proteomics using SILAC. Nature
Reviews Molecular Cell Biology 2006; 7: 952-58.
114
Sustained DNA damage response in proteasome
inhibitor treated cancer cell lines
Chromá K.1 , Kramara J.1, Moudrý P.2, Mistrík M.1,
Bártek J.1,2
1
Institute of Molecular and Translational Medicine,
Olomouc, Czech Republic; 2 Danish Cancer Society,
Copenhagen, Denmark
Introduction
The DNA-damage response (DDR) is a complex network pathway critical for
maintenance of genome integrity by sensing a diverse group of DNA lesions [1]. It
is regulated by several posttranslational modifications involving ubi uitination,
sumoylation, acetylation, methylation and phosphorylation targeting histones and
an extensive number of mediators and effectors performing DNA repair [2]. Of the
many types of DNA lesions, DNA double-strand breaks (DSBs) are considered to
be the most harmful. One left unrepaired is sufficient to trigger growth arrest, cell
death or lead through gross chromosomal rearrangements in malignant
transformation. Eukaryotic cells have two main repair pathways to deal with DSBs:
non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination (HR).
Important regulators in choice of DSB signalling pathway are the tumorsupressors
53BP1 promoting NHEJ and BRCA1 required for efficient HR [3,4]. Both are
known to accumulate rapidly in the vicinity of DSBs. Their recruitment is
dependent on a signalling cascade terminating with two E3 ubiquitin ligases- RNF8
and RNF168, which mark the DSB flanking chromatin with ubiquitin. 26S
proteasome is a multisubunit complex performing degradation of misfolded and
toxic proteins with an indirect role in the ubiquitin dependent DDR signalling.
After treatment with proteasome core inhibitors, such as Bortezomib (PS341) or
MG132, Ub molecules are captured in high molecular weight conjugates without
compensation in increased level of Ub transcription. As a consequence the pool of
free Ub is diminished and Ub conjugation events are prevented. The Ub shortage
also affects the DDR sinalling, namely formation of Ub dependent nuclear foci of
BRCA1 and 53BP1before or shortly after induction of DNA damage [5]. This is
due to the inability of DNA repair ligases to ´fire´ under Ub starvation resulting in
failure of the damage response to progress. However, we have identified several
cancer cell lines exhibiting 53BP1 recruitment even after proteasome inhibition. In
this work we demonstrate the importance of the E3 ubiquitin ligase RNF168 level
in sustained DNA damage response and persistence of 53BP1foci under the
condition of proteasome inhibition.
Key words: Proteasome inhibition, 53BP1 foci, E3 ubiquitin ligase RNF16
115
Material and Methods
Cell Culture and generation of DSBs
The human cell line MCF7 was cultured in RPMI 1640, cell lines MDA-MB-231,
U2OS, MDA-MB-436, Cal51, Hela were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s
medium, supplemented with 10% fetal bovine serum (PAA) and
penicillin/streptomycin (Sigma) in a humidified atmosphere of 5% CO2 at 37°C.
All lines except for U2OS GFP RNF168 have been purchased from ATCC. The
RNF168 GFP fusion overexpressing U2OS line (Doil et al., 2009) was a gift from
our sister laboratory at Danish Cancer Society, Copenhagen, Denmark. X-ray
irradiation was done with a XYLON.SMART 160E/1.5 device (150 kV, 6 mA;
YXLON. International A/S) delivering 11.8 mGy per second.
Plasmid transfection and RNA interference
Transfection of plasmid pAcGFP-C1-RNF168 siRNAr (Copenhagen) with the
point mutation in the RING domain (*RING; C16S) was performed using FuGENE
6 (Roche) according to the manufacturer’s instructions. siRNA transfection was
performed using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). siRNAs were purchased
from Ambion: siCON-negative control, siRNA #1 (ID#4390843), siRNF168 (ID
#126171).
Chemicals and antibodies
Proteasome inhibitors Bortezomib (PS-341), MG-132 as well as inhibitor of UBA1
Pyr-41 were obtained from Sigma and used at 5μM concentration. Antibodies used
in this study included mouse monoclonal antibodies γH2AX (Milipore), RNF8 (B2) (Santa Cruz Biotechnology), Ubc13 (Zymed), HERC2 (BD Transduction
Laboratories), USP34 (Abcam), JMJD2A (KDM4A) (Thermo), GAPDH (GT239)
(GeneTex) and Polyclonal rabbit- KAP-1 (phospho S824) (Bethyl), antibody
against 53BP1 (Santa Cruz Biotechnology), RNF169, RNF168 (N. Mailand,
Copenhagen University)), TRIP12 (Abcam), Ubr5 (Sigma), RNF168(Cph).
Immunoblotting
Cells were lysed with LSB buffer and whole cell lysates were separated by 10%
SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membranes (GE Healthcare). The
membranes were blocked with 5% (w/v) dry milk in 0.1% (v/v) Tween-20 in PBS
and probed with the primary antibodies listed above, followed by HRP-labeled
secondary antibodies (Vector Laboratories and Santa Cruz Biotechnology) and
visualization using ECL detection reagents (GE Healthcare).
Immunofluorescence staining, microscopy analysis
Cells grown on 12-mm coverslips were fixed with 4% paraformaldehyde in PBS
for 15 min and then permeabilized with PBS containing 0.2% Triton X-100 for 5
min. The fixed cells were blocked with 5% fetal bovine serum for 30 minutes and
incubated overnight at 4 °C with primary antibodies (diluted in PBS containing 5%
bovine serum albumin). Coverslips were washed 3 times in PBS+0,1% Tween 20,
once with PBS and then incubated with an appropriate secondary antibody for 45
minutes at RT. Slips were then washed as above and mounted onto slides using the
Vectashield mounting reagent containing DAPI (Vector Laboratories). A series of
116
random fields were recorded automatically using the ScanR imaging workstation
(Olympus; with an EM charge-coupled device camera [C9100; Hamamatsu
Photonics], a U Plan S Apochromat 40×/0.9 NA objective, and an image resolution
of 200 × 200 nm/pixel). The number and intensity of IR-induced nuclear foci were
quantified using the ScanR image analysis software (Olympus).
Results
Sustained DDR in MDA-MB-231 after proteasome inhibition.
In mammalian cells, inhibition of the proteasome abrogates the recruitment of
multiple DDR players to sites of damage including the 53BP1 protein. However,
our observation of persisting 53BP1 foci in the breast cancer cell line MDA-MB231 after proteasome inhibition followed by gamma irradiation (Fig.1) contradicts
this generally believed phenomenon. Firstly, we asked, whether some of upstream
53BP1 regulators is not up- or downregulated in the examined cell line thus
affecting 53BP1 recruitment to the DNA damage sites.
We probed the levels of various 53BP1 positive and negative regulators which
could affect the IR induced 53BP1 recruitment in the presence of proteasome
inhibitor (Fig.2A). MDA-MB-231 protein levels were compared to those of the
U2OS cell line, that does not exhibit persisting 53BP1 foci under the described
conditions. Within the selected set of proteins there were several variations
between the two cell lines. Our attention was drawn mainly by the extreme
upregulation of the RNF168 protein in MDA-MB-231 as this E3 ubiquitin ligase is
critical for this branch of the DDR (Fig.2B).
Crucial role of RNF168 in persistence of 53BP1 foci upon proteasome inhibition
Since the RNF168 E3 ubiqutin ligase is essential for 53BP1 accumulation at sites
of DNA damage, we hypothesized that RNF168 knock down would reduce
accumulation of 53BP1 after proteasome inhibition following DNA damage in the
MDA MB 231 cell line. Performed siRNA mediated knock-down in MDA-MB231 cell line using different concentrations of interfered RNA resulted in
significant decrease in number of nuclei with 53BP1 foci (Fig.2B). To the same
conclusion, and the essential role of RNF168 in this context led us U2OS cell line
U2OS GFP RNF168 stable expressing about 10 times higher level of RNF168
(data not shown) restoring the DDR after treatment with MG132 and IR almost to
the same level as just in case of DNA damage.
To understand the structural underpinnings of the RNF168 in this process we
silenced endogenous RNF168 by siRNA, reintroduced into these cells 2 forms of
GFP-tagged (and siRNA-resistant) RNF168, and tested their ability to accumulate
at the DSB sites. Wild-type RNF168 in contrast to its variant bearing an
inactivating mutation in the catalytic RING domain (*RING), regained the ability
to generate ubiquitin conjugates at the DSB site and restored studied phenotype
(IRIF 53BP1 foci) after proteasome inhibition.
117
Overall, we conclude from these results that execution of the DSB-induced
chromatin response and retention of repair protein 53BP1 under condition of
ubiquitin starvation is dependent on the catalytic activity and level of E3 ligase
RNF168.
Level of E3 and E2 affects DNA damage response in proteasome inhibitor
treated cancer cell line
To independently test our hypothesis about the emerging epistatic effect of
RNF168 level on 53BP1 DSB association after loss of free ubiquitin we checked
the described phenotype in several cancer cell lines in comparison to level of
RNF168 as well as its upstream interplayers E3 RNF8 and E2 Ubc13 meassured by
Western blotting (Fig. 3A, 3B). Our results indicate strong correlation between
RNF168 upregulation and counted 53BP1comprised nuclei, with an additive role of
its upstream enzymes. These data are consistent with a model in which Ubc13,
RNF8 and RNF168 operate on a shared pathway that facilitates ubiquitinationdependent recruitment of DDR factors to DSB.
Figure 1. Persistence of 53BP1 foci in MDA-MB-231 after proteasome inhibition followed by
induction of DNA damage. A) U2OS and MDA-MB-231 cells were treated with 5 μM MG132 2h
before irradiation with 2 Gy and 1h later stained with 53BP1 antibody. Scale bar 10 μM. B)
Quantification of images from (A). Cells with >5 53BP1 foci were counted. At least 200 cells were
scored in each experiment.
118
Figure 2. A) Level of 53BP1 recruitment regulators in MDA-MB231 compared to U2OS. B)
Knock-down of RNF 168 using different concentrations of siRNA impairs cellular response to DSB
in MDA-MB-23. Cell lysates were analyzed by immunoblot.
Figure 3. Level of E3 and E2 enzymes affects DNA damage response in proteasome inhibitor
treated cancer cell lines A) Quantification of RNF168, RNF8 and Ubc13 protein level from total
cell extracts by immunobloting. B)Indicated cells were treated with 5 μM MG132 2h before
irradiation with 2 Gy and 1h later stained with 53BP1 antibody. Scale bar 10 μM. Cells with >5
53BP1 foci were counted. At least 200 cells were scored in each experiment.
Discussion
53BP1 is recruited to sites of damage via interaction of its tandem Tudor domains
with methylated histones, in particular the H4K20me2. In addition, it is known,
that the recruitment of 53BP1 also requires action of two E3 ubiquitin ligasesRNF8 and RNF168, raising a question of how a ubiquitin ligase promotes the
accumulation of a methylated histone binding protein at sites of DNA damage.
Current models of 53BP1 recruitment to DSB sites propose that 53BP1 is a
119
bivalent histone reader recognizing mononucleosomes containing dimethylated
H4K20 (H4K20me2) and H2A ubiquitinated on the Lys15 (H2AK15ub), the latter
being the product of RNF168 action on chromatin [6].
There are several possible scenarios in which RNF168 may promote 53BP1 DSB
association even under conditions of ubiquitin starvation. First, it is possible that
ubiquitin ligation in response to DNA damage is not completely perturbed and
RN168 still monoubiquitinates H2AK15 thus forming efficient docking site for
53BP1. We think that elevated number of RNF168 molecules may efficiently
compete for residual ubiquitin pool (after proteasome inhibition) and perform
H2AK15 monoubiquitination sufficient for 53BP1 recruitment (provided that the
H4K20 modification is present at the site of damage). This hypothesis could be
verified in an experiment where effect of 53BP UDR (Ubiquitination dependent
recruitment motif) mutant expression on the number of 53BP1 IRIFs in irradiated
and proteasome inhibitor treated cells is examined. In a complementary
experiment, one may transiently express GFP-tagged ubiquitin in the target
proteasome inhibitor treated cells. Labelled Ub co-localisation with γH2AX at
DNA damage sites following γ-irradiation would confirm the presence of the
ubH2AK15 platform required for the 53BP1 DSB association.
In the second scenario, ubiquitin might be replaced by ubiquitin-like protein
NEDD8 thus bypassing the proteasome inhibition induced ubiquitin starvation.
NEDD8 bears an 80% homology with ubiquitin and was shown to be involved in
certain pathways of DNA damage signalling [7]. Moreover, it has been shown that
under accute Ub starvation ubiquitin-like molecules may also take over the
canonical roles of Ub. Under such circumstances, ubiquitin ligases were shown to
be capable of utilizing the NEDD8 ubiquitin like molecule [8]. Consequently, upon
proteasome inhibition and subsequent Ub starvation, NEDD8 might become a
substrate for the E2-E3 ligases involved in the 53BP1 recruitment and replace Ub
in this pathway. Nevertheless, experiments using MLN4924, a novel inhibitor of
NAE (NEDD8 activating enzyme), in combination with a proteasome inhibitor
MG132 did not alter the 53BP1 persistence phenotype in MDA-MB-231 after
gamma irradiation (data not shown) thus ruling out the possibility that NEDD8
mimicks Ub in DDR upon Ub starvation. This result was further corroborated by
combined treatment with MG132 and PYR41, an inhibitor of the E1 ubiquitin
activating enzyme UBA1 that is common for both ubiquitinylation and neddylation
pathways. The treatment also did not abolish 53BP1 DSB accumulation indicating
that NEDD8 is not involved in this phenotype (data not shown).
Intriguingly, under the same experimental setup, depletion of enzymes TRIP12 and
UBR5 previously reported to control RNF168 accumulation, showed increased
number of 53BP1 IRIF in MDA-MB-231, U2OS GFP RNF168 and some foci
emerging in U2OS cell line. Gudjonsson et al. found, depletion of these two HECT
domain ubiquitin E3 ligases allows accumulation of RNF168 to supraphysiological
levels, followed by massive spreading of ubiquitin conjugates and
hyperaccumulation of ubiquitin-regulated genome caretakers such as 53BP1 and
BRCA1 [9]. However, in their hands, depletion of free ubiquitin by MG132
120
treatment (10µM) abrogated 53BP1 focus formation 1 hour after IR in U2OS cell
line irrespective of TRIP12/UBR5 depletion, suggesting TRIP12, UBR5 control
RNF168 turnover through direct/indirect interaction with the proteolytic
machinery! This contradiction in our results may be due to lower dose of MG132
used in our case, allowing persistence of some residual ubiquitin which can be still
utilized by the abundant RNF168 molecules in absence of TRIP12 and UBR5 for
establishment of the ubH2AK15 53BP1 docking site.
Overall, our results suggest that in the presence of elevated levels of the RNF168
ligase, recruitment of 53BP1 and its retention at DNA damage sites is less sensitive
to quantity of free ubiquitin molecules than previously thought.
References
[1]
Jackson SP, Bartek J. The DNA-damage response in human biology and
disease. Nature. 2009; 461:1071-8.
[2]
Lukas J, Lukas C, Bartek J. More than just a focus: The chromatin response
to DNA damage and its role in genome integrity maintenance. Nat Cell Biol
2011; 13:1161-9.
[3]
Delacote F. and Lopez B.S. Importance of the cell cycle phase for the
choice of the appropriate DSB repair pathway, for genome stability
maintenance: the trans-S double-strand break repair model. Cell Cycle
2007; 7:33-38.
[4]
Moynahan M.E., Chiu J.W., Koller B.H., Jasin M. Brca1 controls
homologous/directed DNA repair. Mol. Cell 1999; 4: 511-518.
[5]
Dantuma NP, Groothuis TA, Salomons FA, Neefjes J. A dynamic ubiquitin
equilibrium couples proteasomal activitz to chromatin remodeling. J Cell
Biol 2006; 173: 19-26.
[6]
Fradet-Turcotte A, Canny MD, Escribano-Díaz C, Orthwein A, Leung CC,
Huang H, Landry MC, Kitevski-LeBlanc J, Noordermeer SM, Sicheri F,
Durocher D. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15
ubiquitin mark. Nature 2013; 499:50-4.
[7]
Huang D.T., Miller D.W., Mathew R., Cassel R., Holton J.M., Roussel
M.F., Schulman B.A. A unique E1/E2 interaction recquired for optimal
conjugation of the ubiquitin-like protein NEDD8. Nat. Struct. Mol. Biol.
2004; 11: 927-935.
[8]
Duda D.M., Borg L.A., Scott D.C. Hunt H.W., Hammel M., Schulman B.A.
Structural insight into NEDD8 activation of cullin-RING ligases:
conformational control of conjugation. Cell 2008; 134: 995-1006.
[9]
Gudjonsson T., Altmeyer M., Savic V., Toledo L., Dinant C. et al. TRIP12
and UBR5 suppress spreading of chromatin ubiquitylation at damaged
chromosomes. Cell 2012; 150(4):697-709.
121
Využitie in silico metód pri štúdii inhibítorov
onkogénnych kináz
Eva Proroková1, Pathik S Brahmkshatriya2, Ondřej Přenosil2,
Jindřich Fanfrlík2, Jan Řezáč2, Michal Pitoňák1, Martin
Lepšík2, Pavel Hobza2
1
Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká
fakulta, Katedra fyzikálnej a teoretickej chémie, Mlynská
dolina CH-1, 84215 Bratislava, Slovenská Republika
2
Ústav organickej chémie a biochémie, Česká akadémia
vied, Flemingovo nám. 2, 166 10, Praha, Česká Republika
Úvod
Modelovanie liečiv nástrojmi molekulovej a kvantovej mechaniky, sa v posledných
rokoch stalo neodmysliteľnou súčasťou syntézy liečiv. Využíva sa hlavne pre
potreby rýchleho a efektívneho skríningu. Cieľom našej práce je výskum v oblasti
tzv. in silico chémie zameraný na vývoj a aplikáciu skórovacej funkcie založenej
na semiempirickej kvantovo-chemickej výpočtovej metóde PM6-D3H4X [1] (PM6
rozšírená o empirické korekcie na správny popis disperznej energie, vodíkových
väzieb a na výpočet halogénových väzieb). Základný prístup zvolený pri výpočte
skóre je založený na báze QM/MM výpočtov (quantum mechanic/molecular
mechanic), kde časť makromolekuly, v ktorej dochádza k interakcii s ligandom je
počítaná presnejšími (najčastejšie semiempirickými) kvantovo-mechanickými
metódami, zvyšok makromolekuly je počítaný časovo menej náročnými a menej
presnejšími metódami molekulovej mechaniky. QM oblasť je počítaná metódou
PM6-D3H4X.
Autormi skórovacej funkcie sú členovia výskumnej skupiny prof. Pavla Hobzu z
ÚOCHB Praha. Skórovacia funkcia bola aplikovaná na sériu 22 komplexov
enzým-ligand, ku ktorým boli známe experimentálne dáta IC50 dostupné v
publikácii M.S. Coumara a kol.[2]. Jedná sa o sériu potenciálnych inhibítorov
serín-treonínovej kinázy Auróry A, ktorá je regulátorom procesu mitózy. Zvýšená
aktivita Auróra kináz bola preukázaná vo viacerých druhoch ľudských malígnych
nádorov, a preto sa stali atraktívnym cieľom pre modelovanie liečiv potláčajúcich
vznik nádorových ochorení. Výpočtová procedúra ligand-proteínovej interakcie
zahŕňa okrem interakčnej energie aj solvatačnú energiu (komplex je uvažovaný vo
vodnom prostredí), deformačnú energiu a entrópiu. Skórovacia funkcia je
aproximatívnym vyjadrením termodynamickej veličiny voľnej väzbovej energie
komplexu, čo umožňuje koreláciu teoreticky získaných hodnôt s experimentálnymi
IC50. Pre lepšie pochopenie QSAR (Quantitative structure–activity relationship)
boli vyhodnocované IE (interakčné energie) vo vákuu pre líšiace sa fragmenty
ligandov.
122
Materiál a metódy
Na výpočty proteín-ligandových interakcií sme použili skórovaciu funkciu
založenú na báze semiempirickej metóde PM6-D3H4X. Skóre je vyjadrením
voľnej väzbovej energie ∆Gw komplexov ligand-enzým. Je sumou niekoľkých
čiastkových členov, ktoré popisujú jednotlivé energetické vstupy tvoriace celkovú
energiu výslednej väzbovej afinity. Sú to:
2. interakčná energia ∆ Gint,w
3. proteínová a ligandová desolvatačná energia ∆∆Gsolv(L)
4. proteínová a ligandová deformačná energia ∆ Gconf,w (L), ∆ Gconf,w (P)
5. príspevky väzbovej entropie T∆ Sint
Procedúra skóringu je aplikovaná na optimalizované štruktúry komplexov podľa
nasledovnej schémy:
∆Gw = ∆Gint,w + ∆∆Gsolv (L) + ∆Gconf,w (L) + ∆Gconf,w (P ) − T ∆Sint (1.1)
Kde jednotlivé členy rovnice predstavujú:
 ∆Gint,w = ∆Eint + ∆∆Gint, solv ⇒ ∆Eint je interakčná energia v plynnej
fáze počítaná v geometrii optimalizovanej PM6-D3H4X/MM použitím
implicitného solventu metódou QM/MM. Term ∆∆Gint, solv zodpovedá
desolvatačnej interakčnej energii v gemoetrii proteín-ligandového (PL)
komplexu. Ako solvatačný model bol použitý implicitný GBM
(Generalised Born Model) obsiahnutý vo výpočtovom balíku AMBER
(Assisted Model Building and Energy Refinment) [3]. Po prebehnutí
procedúry bola desolvatačná interakčná energia prepočítaná implicitným
solvatačným modelom COSMO (Conductor-like Screening Model), ktorý
je súčasťou balíka MOPAC2009 [4]. V oboch prípadoch bolo vodné
prostredie vyjadrené relatívnou permitivitou ε= 78,4.

∆∆Gsolv(L) = ∆GsolvSMD − ∆GsolvGB ⇒ tento člen predstavuje
korekciu na použitý solvatačný model. Výber vhodného solvatačného
modelu závisí aj od veľkosti systému PL. Model GBM je vhodný pre
veľké systémy a v prípade skóringu je použitý pre celý systém PL
komplexu. Zatiaľ čo pre solvatáciu samotného ligandu je možné použiť
presnejší, ale výpočtovo náročnejší model SMD (kvantovo-mechanický
kontinuálny univerzálny model). Preto musel byť zavedený člen
∆∆Gsolv(L), ktorý reprezentuje rozdiel medzi solvatačnou voľnou
energiou počítanou na vyššej úrovni (SMD) a na nižšej úrovni (GBM)
teórie.

∆Gconf ,w(P ) = ∆Edef (P ) + ∆∆Gconf, solv(P ) ⇒ člen ∆Gconf w(P )
rovnice 1.1 reprezentuje deformačnú energiu proteínu. Pozostáva z energie
proteínu počítanej v PL geometrii a z energie izolovaného proteínu
optimalizovaného vo vodnom prostredí na úrovni QM/MM modelu. MM
123
časť proteínu počítaná molekulovou mechanikou bola optimalizovaná
chladením z 300 K na 0 K po 2 ps.

∆Gconf, w(L) = ∆Edef (L) + ∆∆Gconf, solv(L) ⇒ tento člen rovnice 1.1
znázorňuje voľnú deformačnú energiu ligandu. ∆Edef (L) predstavuje
optimalizovanú energiu ligandu počítanú vo vodnom prostredí
simulovaným implicitným modelom SMD. Člen ∆∆Gconf, solv(L)
predstavuje energiu ligandu počítanú v geometrii PL.

T ∆Sint posledný člen rovnice 1.1 reprezentuje zmenu entropie
prislúchajúcu počtu voľne rotujúcich väzieb ligandu. Tento term je veľmi
náročné vyjadriť presne [5,6] . Možná odchýľka 1 kcal/mol na voľne
rotujúcu väzbu je porovnateľná s bežnými skórovacími funkciami. [7].
Výpočet IE fragmentov jednotlivých ligandov:
Všetky ligandy obsahujú rovnaký skelet na báze substituovaného pyrazolu (obr.
1.1), ktorý tvorí kľúčové vodíkové väzby so študovaným enzýmom v aktívnom
mieste. Ligandy 12b-12w (tab. 1.1) sa líšia substituentami R1 a X, ktorých IE boli
počítané samostatne, výpočtovou metódou PM6-D3H4X vo vákuu. Substituenty
R1, X boli vyňaté z ligandov pomocou vizualizačného programu PyMol (ver. 1.4)
nahradením väzby X-CO metylovou skupinou (X-CH3). Ligandy poskytujúce
viacero orto- a meta- polôh na terminálnom fenylovom kruhu boli študované vo
všetkých variantách.
Výsledky
Uvedenou skórovacou funkciou bolo vyhodnotených 22 ligandov s pyrazolovým
skeletom (obr 1).
Obrázok 1: Skelet ligandov 12b - 12w
124
Ligand
X
R1
IC50[µM]
12b
-NH-
-CH2Ph
1.580
-22.4759
-15.229416
12c
-NH-
-CH2 CH2Ph
1.350
-26.3978
-21.046348
12d
-NH-
-CH2CH2 CH2Ph
1.942
-22.9985
-23.22169
12e
-NH-
-Ph
0.804
-25.6819
-13.825762
12f
NCH3-
-Ph
>50
-17.0748
-18.388519
12g
NCH3-
-CH2Ph
>50
-16.1010
-20.493176
12h
-NH1.484
-22.8416
-21.462332
1.937
-24.2069
-16.977547
1.071
-27.9078
-26.742175
12i
12j
Score [kcal/mol] IE R1 [kcal/mol]
-NH-
-NH-
12k
-NH-
-CH2(Ph-4-OCH3)
1.623
-24.4927
-25.418138
12l
-NH-
-CH2(Ph-3-OCH3)
0.838
-22.1485
-26.319874
12m
-NH-
-CH2(Ph-3-NHCOCH3)
1.746
-23.3131
-30.572372
12n
-NH-
-CH2CH2(Ph-4-OCH3)
1.580
-25.2960
-27.773278
12o
-NH-
-CH2CH2(Ph-3-OCH3)
2.895
-22.6516
-24.27315
12p
-NH-
-Ph-4-OCH3
0.460
-21.9063
-21.438086
12q
-NH-
- Ph-3-OCH3
0.449
-25.4417
-20.390261
12r
-NH-
- Ph-2-OCH3
1.087
-23.8675
-15.608735
12s
-NH-
- Ph-3,4-di-OCH3
0.960
-22.3956
-27.860132
12t
-NH-
-Ph-4-N(CH3 )2
1.568
-22.9201
-21.187097
12u
-NH-
-Ph-4-F
1.447
-25.5695
-14.189024
12v
-NH-
-Ph-4-NHCOCH3
0.719
-26.8839
-24.090921
12w
-NH-
-Ph-3-NHCOCH3
0.033
-31.7374
-34.091526
Tabuľka 1: Séria vyhodnocovaných ligandov
Diskusia
Záverečné skóre bolo prepočítané s interakčnými energiami v solvatačnom modeli
COSMO a nahradené interakčnými energiami počítanými modelom GBM, nakoľko
sa tento solvatačný model ukázal byť vyhovujúcejší pre výpočet proteín-ligandovej
125
interakcie.
Interakčné energie fragmentov ligandov boli počítané výpočtovou metódou PM6D3H4X vo vákuu. Výsledné energie slúžia na lepšie pochopenie proteínligandových interakcií v oblasti, ktorou sa jednotlivé ligandy líšia (tab. 1.1). V
prípade ligandov, kde X = -NH dochádza k vytvoreniu významnej intramolekulovej
vodíkovej väzby s pyrazolovým kruhom, ktorá ovplyvňuje geometriu celého
ligandu v prospech väzbovej afinity PL. Absencia tejto interakcie sa prejavila v
nízkej hodnote skóre. Najnižšia IE fragmenu bola napočítaná pre ligand 12e, ktorý
má R1 = -Ph a nevytvára s okolitým proteínom žiadne významnejšie interakcie.
Výsledná korelácia skóre a experimentálnych hodnôt voľnej väzbovej energie bola
vyhodnotená metódou najmenších štvorcov. Bola dosiahnutá zhoda s
experimentom na úrovni R2= 0,72. Vo výslednej korelácii neboli uvažované
ligandy 12f a 12g, nakoľko experimentálne hodnoty IC50 boli mimo stanovovanú
škálu a teda neboli k dispozícii ich skutočné inhibičné konštanty.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Rezac J, Hobza P. Advanced Corrections of Hydrogen Bonding and
Dispersion for Semiempirical Quantum Mechanical Methods. J. Chem.
Theory. Comput.,2012, 8, 141-151.
[2]
Coumar MS, Leou JS, Shukla P et al. J.Med.Chem. 2009, 52, 1050-1062.
[3]
Case DA, Darden TA, Cheatham TE et al. .AMBER 11, University of
California, San Francisco. 2010
[4]
Stewart JJP. Optimization of parameters for semiempirical methods V:
Modification of NDDO approximations and application to 70 elements. J.
Mol. Model. 2007, 13, 1173–1213
[5]
Zhou H.-X, Gilson M.K. Theory of free energy and entropy in noncovalent
binding. Chem. Rev. 2009, 109, 4092–4107.
[6]
Diehl C, Engström O, Delaine T, Hakansson M, Genheden S, Modig K,
Leffler H, Ryde U, Nilsson UJ, Akke M. Protein Flexibility and
Conformational Entropy in Ligand Design Targeting the Carbohydrate
Recognition Domain of Galectin-3. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 14577–
14589.
[7]
Ishchenko AV, Shakhnovich E I. Small Molecule Growth 2001
(SMoG2001): an improved knowledge-based scoring function for proteinligand interactions. J. Med. Chem. 2002, 45, 2770–2780.
126
Aktivácia ERK1/2, SAPK a p53 signálnyvh
dráh vplyvom nanočastíc magnetitu s rôznou
povrchovou úpravou
Barbora Buliaková1, Monika Mesárošová1, Michal Šelc1,
Filip Rázga2, Dominika Vnuková2, Alena Gábelová1
1
Ústav experimentálnej onkológie SAV, Vlárska 7, 83371,
Bratislava; 2Ústav polymérov SAV, Dúbravská cesta 9,
Bratislava
Úvod
Rakovina pľúc je druhou najčastejšou príčinou úmrtia ľudí na zhubné ochorenia na
Slovensku a prvou vo svete [1]. Lokálna liečba rakoviny pľúc priamou aplikáciou
cytostatík vo forme aerosolov (inhalačná terapia) do respiračného systému pacienta
predstavuje perspektívnu neinvazívnu formu liečby karcinómov [2]. Chemoterapia
vo forme aerosolu s využitím nanočastíc ako nosičov liečiv nezaťažuje celý
organizmus pacienta, zabezpečuje doručenie liečiva do blízkosti nádorového
tkaniva, minimalizuje vedľajšie toxické účinky chemoterapie a zabraňuje
predčasnej biotransformácii cytostatika v porovnaní so systémovým podávaním
terapeutík [3,4]. V centre intenzívneho výskumu zameraného na klinické využitie
nanočastíc sú magnetické nanočastice oxidov železa, ako je napr. magnetit (MNPs,
Fe3O4. MNPs sa už mnoho rokov využívajú ako kontrastné činidlá pri magnetickej
rezonancii [5] a nachádzajú taktiež uplatnenie pri inhalačnej terapii [4,6].
Reaktívny povrch MNPs má za následok tvorbu agregátov, preto sa častice obaľujú
rôznymi syntetickými, organickými alebo prírodnými polymérmi [7]. Obaľovanie
častice stabilizuje, znižuje ich toxicitu, predĺžuje čas ich cirkulácie v periférnej krvi
a taktiež slúži na zníženie adsorpcie sérových proteínov (opsonizáciu), čím sa
zabráni ich predčasnému rozpoznaniu a odstráneniu bunkami RES, napr.
makrofágmi [8,9]. Ďalšou funkcionalizáciou, t.j. naviazaním ďalších molekúl ako
špecifických ligandov, protilátok, liečiv a pod., sa môže zlepšiť terapeutický efekt
[10].
Hoci sa MNPs považujú za netoxické a biokompatibilné, ich efekt na základné
bunkové funkcie ako je proliferácia, bunkový cyklus, bunková signalizácia alebo
apoptóza nie je dostatočne preštudovaný. Z tohto hľadiska je nevyhnutné podrobne
preskúmať možné nepriaznivé účinky MNPs na ľudský organizmus. Cieľom našej
práce bolo štúdium vplyvu MNPs s rôznou povrchovou úpravou na aktiváciu MAP
kinázových dráh (ERK1/2 a SAPK/JNK) a tumor supresorový proteín p53, ktoré
zohrávajú dôležitú úlohu v regulácii bunkového cyklu, bunkovej proliferácie a
odpovedi bunky na stress.
127
Materiál a metódy
Nanočastice magnetitu.
MNPs boli pripravené a detailne charakterizované rôznymi fyzikálno-chemickými
metódami na Ústave experimentálnej fyziky SAV v Košiciach. V experimentoch
sme používali 3 typy nanočastíc magnetitu: 1) MNPs obalené oleátom sodným
(SO-MNPs); 2) MNPs obalené oleátom sodným a polyetylén glykolom (SO-PEGMNPs) a 3) MNPs obalené oleátom sodným, polyetylén glykolom a kyselinou
poly(mliečno-ko-glykolovou) (SO-PEG-PLGA-MNPs).
Koloidná stabilita MNPs v kultivačnom médiu
Distribúcia nanočastíc a zeta potenciál MNPs s rôznou povrchovou modifikáciou
(rôzna koncentrácia MNPs) bol meraný v DMEM bunkovom médiu pomocou
dynamic laser light scattering (DLS) metódou na prístroji Zetasizer Nano-ZS
(Malvern Instruments, UK) tvorenom 4-mW hélium/neón laserom (= 633nm) pri
teplote 37 °C na Ústave merania SAV.
Bunky.
Alveolárna adenokarcinómová bunková línia A549 bola kultivovaná v DMEM
médiu obohatenom o 10% fetálne teľacie sérum (FBS) a antibiotiká (penicillin 200
U/ml, streptomycin 100µg/ml) pri 37°C vo zvlhčujúcej atmosfére 5% CO₂. Počas
ovplyvňovania MNPs boli bunky kultivované v DMEM médiu s 2% FBS.
Ovplyvňovanie buniek.
A549 bunky boli ovplyvňované rôznymi koncentráciami MNPs s rôznou
povrchovou úpravu (SO-MNPs, SO-PEG-MNPs, SO-PEG-PLGA-MNPs) rôzne
časové intervaly (30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h and 24 h). Po ovplyvnení boli bunky
premyté 2x v PBS.
Western Blot.
ERK1/2, SAPK a p53 proteín (celkový p53 proteín a p53 fosforylovaný na Ser-15),
boli stanovené v bunkových lyzátoch. Bunky boli lyzované v lyzujúcom pufri (50
mM TrisHCl ph 7.4, 1% Triton X, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA a inhibitory
proteáz a fosfatáz). Koncentrácia proteínov v lyzátoch bola stanovená
Bradfordovou metódou použitím Bio Photometer. Izolované proteíny boli
separované v SDS-PAGE, prenesené na PVDF membránu a imunodetegované
použitím vhodných primárnych a sekundárnych protilátok (Cell Signaling
Technology, BioTech Ltd., Slovensko) a vizualizované ECL chemickými
reagenciami (0.1 M Tris-HCl pH 8.8, 250 mM Luminol, 45 mM p-Coumaric acid,
30% peroxid vodíka). Na kontrolu nanesenia proteínov sme použili ERK1/2 a
SAPK natívne protilátky. Intenzita bandov bola meraná denzitometrickou analýzou
použitím programu ImageJ 1.44p. Množstvo expresie pERK1/2, pSAPK, celkovej
p53 and fosforylovanej p53 bolo stanovené semikvantitatívne ako pomer intenzít
bandov indukovanej hladiny ku kontrolnej. Použité pozitívne kontroly boli:
epidermálny rastový factor (EGF) (50-150 ng/ml; 5-15 min), UVC (40-100 J/m2;
postkultivácia 15 min) a proteínový lyzát z C33 bunkovej línie, ktorá má vysokú
hladinu expresie celkovej a fosforylovanej p53.
128
Výsledky a diskusia
Distribúcia veľkosti MNPs v kultivačnom médiu a zeta potenciál
Hydrodynamická veľkosť všetkých typov MNPs sa zvýšila v médiu kvôli adsorpcii
sérových proteínov na povrch častíc. Zeta potenciál všetkých typov MNPs sa zvýšil
tiež a ako najmenej stabilné sa ukázali SO-PEG-PLGA-MNPs, ktoré sú najväčšie a
sedimentovali najrýchlejšie.
Vplyv MNPs na aktivitu ERK1/2
Zistili sme rozdiely v hladinách fosforylácie ERK1/2 v bunkách A549 v závislosti
od použitých MNPs (Graf 1). SO-PEG-MNPs významne zvýšili aktivitu ERK1/2 v
30-tej min ovplyvňovania buniek v porovnaní s kontrolou. V neskorších časových
intervaloch bola aktivita pERK1/2 porovnateľná s hladinou v kontrolných bunkách.
Mierne zvýšenie fosforylovanej ERK1/2 vyvolali aj SO-PEG-PLGA-MNPs častice
počas 6 h ovplyvňovania buniek. V 24 h bola hladina pERK1/2 porovnateľná s
kontrolou. Na druhej strane SO-MNPs spôsobili výrazné zníženie ERK1/2 aktivity
v bunkách počas celej doby ovplyvňovania buniek.
Fosforylácia ERK1/2
3
RI
2
SO+PEG+MNPs
SO+MNPs
1
SO+PEG+PLGA+MNPs
0
NTC
PC
30'
1h
2h
4h
6h
24h
Časový vplyv MNPs
Graf 1. Aktivácia ERK1/2 v A549 bunkách ovplyvnených MNPs s rôznou povrchovou
modifikáciou v rôznych časových intervaloch. RI (relatívna intenzita bandov), je pomer
indukovanej intenzity bandu ku kontrolnej
Vplyv MNPs na aktivitu SAPK/JNK
Najvýraznejšie zmeny v aktivite SAPK/JNK sme opäť zistili po vplyve SO-PEGMNPs (Graf. 2). Aktivácia SAPK/JNK vplyvom SO-PEG-MNPs mala sinusoidný
charakter. Fosforylácia SAPK/JNK postupne stúpala a najvyššiu hodnotu dosiahla
v 2 h ovplyvňovania buniek, potom klesala a v 24 h sa dostala na úroveň kontroly.
Signifikantné zvýšenie aktivity SAPK/JNK vplyvom SO-MNPs sme pozorovali v
30-tej min, hladina fosforylácie následne klesala na úroveň kontroly. SOP-PEGPLGA-MNPs mali minimálny efekt na aktivitu SAPK/JNK.
129
Fosforylácia SAPK/JNK
9
8
7
RI
6
5
SO+PEG+MNPs
4
SO+MNPs
3
SO+PEG+PLGA+MNPs
2
1
0
NTC
PC
30'
1h
2h
Časový vplyv MNPs
4h
6h
24h
Graf 2. Aktivácia SAPK/JNK v A549 bunkách ovplyvnených MNPs s rôznou povrchovou
modifikáciou rôznymi časovými intervalmi.
Vplyv MNPs na celkovú hladinu p53
Pozorovali sme len veľmi mierne zvýšenie celkovej hladiny tumor supresorového
proteínu p53 v bunkách počas 1 h, 2 h a 4 h vplyvu SO-PEG-PLGA-MNPs. V
prípade SO-PEG-MNPs a SO-MNPs sme nezaznamenali zvýšenie celkovej p53
(výsledky neuvádzame).
Vplyv MNPs na fosforyláciu p53 na seríne 15
Najvýraznejšie zmeny v hladinách fosforylácie p53 na seríne 15 sme zistili po
vplyve SO-PEG-MNPs počas celej doby ovplyvňovania buniek (Graf 3). Priebeh
aktivácie p53 Ser-15 mal sínusoidný charakter. Najvyšiu hladinu fosforylácie p53
Ser-15 sme pozorovali v 4 h ovplyvňovania buniek. Zvýšenú hladinu fosforylácie
p53 Ser-15 oproti kontrole sme zistili ešte aj pri 24 h ovplyvňovania. V bunkách
ovplyvnených SO-PEG-PLGA-MNPs mal priebeh aktivácie p53 Ser-15 taktiež
sínusoidný charakter. Hladina fosforylácie stúpala (max pri 2 h) a klesala (min pri 4
h). Zvýšená hladina fosforylácie bola pozorovaná aj pri 24 h vplyve MNPs.
Podobne ako pri ERK1/2, SO-MNPs neovplyvnili významnou mierou fosforyláciu
p53 Ser-15.
RI
Aktivácia p53 v Ser 15
7
6
5
4
3
2
1
0
SO+PEG+MNPs
SO+MNPs
SO+PEG+PLGS+MNPs
NTC PC
30'
1h
2h
4h
6h
24h
Časový vplyv MNPs
Graf 3. Aktivácia p53 v A549 bunkách ovplyvnených MNPs s rôznou povrchovou modifikáciou
rôznymi časovými intervalmi.
130
Záver
Zistili sme zmeny v aktivite ERK1/2, SAPK/JNK a p53 Ser-15 vplyvom MNPs s
rôznou povrchovou úpravou. Najvýraznejšie zmeny sme zistili v prípade
polymérnych obalov, ktoré sa využívajú pri klinických aplikáciách. Naše výsledky
naznačujú, že interakcie MNPs s bunkami by mohli ovplyvniť reguláciu
bunkového cyklu a bunkovú proliferáciu.
Poďakovanie
Táto práca vznikla za podpory VEGA grantov 2/0051/09, 2/0143/13, 2/0163/12a
APVV-0658-11.
Zoznam použitej literatúry
[1]
European Cancer Observatory, http://eu-cancer.iarc.fr/
[2]
Patton JS, Byron PR. Inhaling medicines: delivering drugs to the body
through the lungs, Nat Rev Drug Discov 2007; 6: 67-74.
[3]
Gagnadoux F, Hureaux J, Vecellio L, Urban T, Le Pape A et al. Aerosolized
chemotherapy, J Aerosol Med Pulm Drug Deliv 2008; 21: 61-70.
[4]
Upadhyay D, Scalia S, Vogel R, Wheate N, Salama RO et al. Magnetised
thermo responsive lipid vehicles for targeted and controlled lung drug
delivery. Pharm Res 2012; 29: 2456–2467.
[5]
Cole AJ, Yang VC, David AE. Cancer theranostics: the rise of targeted
magnetic nanopartices. Trends in Biotechnology 2011; 29: 323-332.
[6]
Dames P, Gleich B, Flemmer A, Hajek K, Seidl N et al. Targeted delivery
of magnetic aerosol droplets to the lung. Nature nanotechnology 2007; 2:
495-499.
[7]
Shubayev VI, Pisanic TR, Jin S. Magnetic nanoparticles for theragnostics.
Adv Drug Deliv Rev; 2009; 61: 467-477.
[8]
Barakat NS. Magnetically modulated nanosystems: A unique drug- delivery
platform. Nanomedicine 2009; 4: 799-812.
[9]
Del Pino P, Pelaz B, Zhang Q, Maffre P, Nienhaus GU et al. Protein corona
formation around nanoparticles – from the past to the future. The Royal
Society of Chemistry 2013.
[10] Lammers T, Kiessling F, Hennink WE, Storm G. Drug targeting to tumors:
Principles, pitfalls and (pre-) clinical progress. Journal of Controlled
Release 2012; 161: 175–187.
131
Rozšírené abstrakty súťažiacich, ktorí sa pre neočakávané
okolnosti nemohli zúčastniť
132
The cytotoxic effect of CD::UPRT/MSC/5-FC treatment on human
ovarian carcinoma cell line SKOV-3 in vitro and in vivo
Lenka Baranovičová1, 2, Miroslava Matúšková1, Lucia Kučerová1
1
Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Research Institute SAS, Bratislava,
Slovakia ; 2Faculty of Medicine, Comenius University, Bratislava, Slovakia
Introduction
Human ovarian carcinoma is the leading cause of the death from gynecological
malignancies due to late detection of tumor development, formation of metastases,
chemoresistance and recurrence of the disease [1]. Epithelial ovarian cancer is a
chemoresponsive disease in the majority of cases, although relapse often occurs
and resistance eventually develops to the most forms of treatment. The platinum
compounds are the single most active drugs in the treatment. Drug resistance to
therapy remains one of the major obstacles in the treatment [2].
Mesenchymal stem cells (MSC) are unique heterogenous population of cells
capable of self-renewal and regenerative potential. Nowadays they represent a novel
approach in the field of regenerative medicine but also in so-called gene directed prodrug
enzyme therapy (GDEPT). Their tropism to tumor mass makes them very successful
vehicles for therapeutic genes, which code for special enzyme. The enzyme is able
to convert non-toxic molecule to a highly toxic chemotherapeutic in the vicinity of
the tumor.
In Laboratory of Molecular Oncology we use adipose tissue from healthy donors as
a source of MSC (AT-MSC). We genetically modify them and they carry the gene
for: 1. Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk), which phosphorylates
non-toxic ganciclovir (GCV) to its toxic metabolites, and 2. bacterial cytosine
deaminase (BCD) or yeast cytosine deaminase::uracil phosphoribosyltransferase
(CD::UPRT),
being
able
to
convert
5-fluorocytosine (5-FC) to highly toxic chemotherapeutic 5-fluorouracil (5-FU).
Synthesized toxic compounds induce apoptotic process and together with bystander
effect increase the eradication of tumor cells [3,4].
We have chosen a model of chemoresistant human ovarian carcinoma cell line
SKOV-3 to examine the cytotoxicity of our therapeutic approach. The
chemosensitivity of SKOV-3 cells was evaluated after co-cultivation with
HSVtk/MSC, BCD and CD::UPRT/MSC in the presence of different
concentrations of prodrugs GCV or 5-FC. Also an experiment in vivo was done by
using CD::UPRT/MSC + 5-FC therapeutic approach on nude mice.
Material and Methods
Human ovarian carcinoma cell line SKOV-3/GFP was seeded in quadruplicates on
96-well plates. The next day, the media with concentration gradient of 5-FU and
cisplatin was added. The effect of chemotherapeutics was evaluated by using
fluorimetric assay [3], chemoluminescence assay (CellTiter-Glo® Luminescent
133
Cell Viability Assay) and cell kinetic imaging (IncuCyte ZOOMTM Kinetic
Imaging System) after 6 days. Values were expressed as relative fluorescence
(RFU), luminescence (RLU), and proliferation, where RFU/RLU and 100%
proliferation of untreated cells was taken as a reference.
We compared the efficiency of bacterial and yeast cytosine deaminase (CD::UPRT
respectively). SKOV-3/GFP cells were seeded on 96-well black plate (8x105
cells/well) and co-cultivated with BCD/MSC or CD::UPRT/MSC in different ratio
of therapeutic cells by using stable concentration of 5-FC (50µg/ml). The
fluorimetric assay was performed at the day 7. In vivo experiment was performed
on immunodeficient mouse model. SKOV-3/GFP cells were injected
subcutaneously with or without CD::UPRT/MSC cells. Animals were treated with
5-FC solution intraperitoneally since the day 0 or day 3, every day during the
consequent two weeks. Tumors were measured every two days and the efficiency
of therapy was evaluated by statistic methods. Data were analyzed using SPSS
version 19., we used ANOVA post-hoc LSD test. We tested the differences among
groups of treated animals on the significance level α = 0.05.
Results and Discussion
The fluorimetric and chemoluminescence assay, and cell kinetic imaging revealed
chemoresistance of SKOV-3 cells to cisplatin. It was confirmed by many scientific
groups that human ovarian carcinomas are resistant to the treatment by cisplatin or
its salts, therefore the chemoresistance represents a major obstacle in the further
treatment of patients [1,6].
On the other hand, high doses of 5-FU exert limited efficiency in elimination of
cancer cells, and CD::UPRT/MSC/5-FC therapeutic approach provides higher
efficiency in eradication of SKOV-3 cells. The fluorimetric assay revealed almost
similar cytotoxicity using BCD/MSC and CD::UPRT/MSC treatment. 60-80% of
SK OV-3 cells were eliminated using CD/MSC + 5-FC treatment, remarkably the
ratio of tumor to therapeutic cells was 1:160 (Figure 1). The CD::UPRT/5-FC
treatment is also very promising in eradication of chemoresistant medullary thyroid
carcinoma [7]. It seems that it will be likewise helpful in destroying chemoresistant
SKOV-3 cells.
Figure 1. Cytotoxic effect of CD/MSC + 5-FC treatment on SKOV-3/GFP cells.
134
In vivo data show significant (p < 0.05) efficiency of CD::UPRT/MSC + 5-FC
treatment on SKOV-3 xenotranplants, when the 5-FC was administered at the day 0
in comparison to a control group or the group where 5-FC was administered at the
day 3 (Figure 2).
*
Figure 2. In vivo experiment on nude mice treated with CD::UPRT/MSC + 5-FC treatment.
Conclusion
The fluorimetry, chemoluminescence assay, and cell kinetic imaging revealed
different chemosensitivity of tumor cells upon exposure to 5-FU and cisplatin. We
evaluated also the chemosensitivity of SKOV-3 cells to the treatment mediated by
therapeutic AT-MSC. The CD::UPRT/MSC + 5-FC treatment showed to be very
efficient in elimination of tumor cells. We also detected that very low number of
therapeutic AT-MSC is able to eliminate cancer cells.
In vivo experiment confirmed inhibition of tumor growth in therapeutic group in
comparison to a control group, but there is still need of further investigation of this
therapeutic approach.
Acknowledgement
Financial support: VEGA grant 02/0088/11; 2/0171/13; Slovak Research and
Development Agency under the contract No. APVV-0230-11 and Slovak Cancer
Research Foundation.
References
[1]
Colombo, N., Van, G. T., Parma, G., Amant, F., Gatta, G., Sessa, C., et al.
Ovarian Cancer Critical Reviews Oncology/Hematology, 2006, 60(2), 159–
179.
[2]
DeVita VT Jr, Hellman S, Rosenberg SA: Cancer: Principles and Practice
of Oncology, 9th ed. Philadelphia, USA: Lippincott Williams & Wilkins,
2011.
135
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
Matuskova M, Baranovicova L, Kozovska Z, Durinikova E, Pastorakova A,
et al. Intrinsic properties of tumour cells have a key impact on the bystander
effect mediated by genetically engineered mesenchymal stromal cells. J
Gene Med, 2012; 14: 776-787.
Kucerova L, Matuskova M, Pastorakova A, Tyciakova S, Jakubikova J, et
al. Cytosine deaminase expressing human mesenchymal stem cells
mediated tumour regression in melanoma bearing mice. J Gene Med; 2008;
10, 1071-1082.
Matuskova M, Hlubinova K, Pastorakova A, Hunakova, Altanerova V:
HSV-tk expressing mesenchymal stem cells exert bystander effect on
human glioblastoma cells. Cancer Lett, 2010; 290: 58-67.
Romero I, and Bast RC Jr. Minireview: human ovarian cancer: biology,
current management, and paths to personalizing therapy. Endocrinology,
2012, 153(4), 1593–1602.
Kucerova, L., Feketova, L., Matuskova, M., Kozovska, Z., Janega,P. et al.,
Local bystander effect induces dormancy in human medullary thyroid
carcinoma model in vivo. Cancer Letters, 2013, 335(2):299-305.
136
Hypoxiou-indukovaná karbonická anhydráza IX ako možný
prognostický a prediktívny parameter nádorového ochorenia
mliečnej žľazy
Martina Furjelová1,3, Mária Kovalská1, Katarína Jurková1,3, Marián Benčat2, Slávka
Drahošová2, Marian Adamkov1
1
Ústav histológie a embryológie JLF UK, Martin; 2Laboratórium patologickej
anatómie, Alpha Medical, a.s., Martin; 3Ústav lekárskej biochémie JLF UK,
Martin
Úvod
Karcinóm mliečnej žľazy je genotypicky, fenotypicky a klinicky heterogénne
onkologické ochorenie. Výber prognostických a prediktívnych faktorov je v
súčasnosti založený na hodnotení tradičných morfologických a niektorých
biologických parametrov. Z morfologických ukazovateľov sú to rozsah a veľkosť
nádoru, jeho histologický typ, stupeň diferenciácie a tiež stav lymfatických uzlín. Z
biologických parametrov sa vyselektovali nasledovné markery, a to stav
hormónových receptorov (estrogénový receptor - ER, progesterónový receptor PR) a HER-2 (receptor epidermálneho rastového faktora 2). Tieto parametre nie sú
úplne dostatočné na vyjadrenie nádorovej heterogenity a individuálnej podstaty
nádorového ochorenia, ako aj pre následný terapeutický manažment. Onkologický
výskum je v súčasnosti charakterizovaný najmä hľadaním novej prognostickej
a prediktívnej informácie. Aj z tohto dôvodu je v centre intenzívneho medicínskeho
výskumu karbonická anhydráza IX (CA IX). Najvýznamnejším znakom tohto
metaloenzýmu je jeho abnormálna expresia v širokom spektre nádorov a jeho
absencia v korešpondujúcich normálnych tkanivách. Je silne indukovaný
nádorovou hypoxiou [1]. Celkovo je hypoxia pozorovaná asi u jednej tretiny
malígnych
nádorov, vrátane karcinómov mliečnej žľazy [2]. Pacienti
s hypoxickými nádormi majú horšiu prognózu ochorenia a preto je veľmi dôležitá
stratifikácia práve takýchto pacientov. Možnosť použiť prirodzený bunkový marker
hypoxie je teda veľmi žiaduca. Ako jeden z najnádejnejších markerov tohto
fenoménu sa ukazuje práve CA IX (1). Na základe týchto vlastností je hlavným
predmetom nášho záujmu práve táto anhydráza kyseliny uhličitej a jej význam pri
nádorovom ochorení mliečnej žľazy.
Materiál a metódy
Imunohistochemicky sme vyšetrili parafínový materiál z 84 vzoriek malígnych
lézií mliečnej žľazy (myšacia monoklonálna protilátka proti CA IX, klon M75,
Lambda Life a.s.). Z každej vzorky boli pripravené dva 4 µm hrubé rezy na
imunohistochemické reakcie na dôkaz CA IX s použitím peroxidázovej techniky.
Reakcia bola vizualizovaná DAB chromogénom (DAKO). Jadrá boli dofarbené
hematoxylínom (DAKO). Negatívne kontroly sme realizovali bez použitia
primárnej protilátky. Pri interpretácii získaných imunohistochemických vyšetrení
137
sme semikvantitatívne (MF, MA) hodnotili subcelulárnu lokalizáciu
imunohistochemickej reakcie (membránová (M), cytoplazmatická (C) a
kombinovaná lokalizácia na membráne aj v cytoplazme bunky (MC)). Ďalej sme
analyzovali intenzitu reakcie (slabá, stredná, silná) a percento pozitívnych buniek
(<10%, 11-50%, >50%). Imunohistochemické charakteristiky expresie CA IX sme
korelovali s klinicko-morfologickými (vek, stage, grade a veľkosť nádoru,
vaskulárna invázia, metastázy v lymfatických uzlinách) a biologickými
parametrami (ER, PR, HER-2) rutinne vyšetrovanými v dennej klinickej praxi. Na
určenie korelácie bol použitý „chi-square“ (χ2) test.
Výsledky
CA IX bola exprimovaná v 34/84 prípadoch (41%) karcinómov mliečnej žľazy.
Celkovo sme zistili tri druhy imunohistochemickej pozitivity na subcelulárnej
úrovni. Samotná membránová pozitivita (Obrázok 1) bola prítomná v 29/84
prípadoch (35%) a iba v 1/84 prípade (1%) sme pozorovali výlučne
cytoplazmatickú pozitivitu. Kombinovaná membránová a cytoplazmatická
pozitivita (Obrázok 2) bola prítomná v 4/84 prípadoch (5%). Intenzita
imunoreakcie sa menila od slabej až po silnú. Celkovo dominovala stredná až silná
pozitivita (31/84-37%), slabú pozitivitu imunoreakcie vykazovali 3/84 prípady
(4%). Menej ako 50% CA IX-pozitívnych buniek bolo prítomných v 29/84
prípadoch (35%). Viac ako 50% CA IX-pozitívnych buniek sme detekovali v
5/84 prípadoch karcinómov (6%). Vzhľadom k tomu, že nádorové bunky často
vykazovali heterogénnu intenzitu reakcie, sme pre celkovú expresiu tohto proteínu
hodnotili podľa dominujúcej imunoreakcie.
Dokázali sme štatisticky signifikantnú koreláciu medzi vekom pacientok a
subcelulárnou lokalizáciou CA IX (p<0,05). Ďalšie signifikantné korelácie sme
preukázali medzi grade-om a subcelulárnou lokalizáciou CA IX, intenzitou
imunoreakcie a percentom pozitívnych buniek (p<0,05). Grade 3 bol asociovaný
najmä s membránovou a kombinovanou (membránová a cytoplazmatická)
lokalizáciou CA IX ako aj so strednou až silnou intenzitou imunoreakcie.
Významné korelácie sme ďalej potvrdili medzi expresiou estrogénových a
progesterónových receptorov a všetkými hodnotenými imunohistochemickými
charakteristikami expresie CA IX (p<0,05). V prípadoch, ktoré boli ER pozitívne,
bola nami sledovaná anhydráza prítomná v 21/81 prípadoch (26%) a neprítomná v
45/81 prípadoch (56%). V prípadoch, ktoré boli ER negatívne, bola CA IX
detekovaná v 12/81 prípadoch (14%) a 3/81 prípady (4%) boli CA IX negatívne. V
prípade PR bola situácia podobná, teda v prípadoch s pozitívnymi PR bola CA IX
detekovaná v 19/82 prípadoch (23%) a neprítomná v 45/82 prípadoch (55%). V
prípadoch s negatívnymi PR bola CA IX prítomná v 14/82 prípadoch (17%) a
neprítomná v 4/82 prípadoch (5%). Ostatné morfologické a biologické parametre
(stage a veľkosť nádoru, metastázy LU, vaskulárna invázia a expresia HER-2)
nekorelovali s imunohistochemickými charakteristikami expresie CA IX (p>0,05).
Sumarizáciu získaných výsledkov znázorňuje Tabuľka 1.
138
Expresia CA IX
Vek (n=79)
<40
41-50
51-60
61-70
71-80
>80
Hodnota p
Grade (n=79)
1
2
3
Hodnota p
Veľkosť nádoru (n=81)
<11mm
11-20mm
>20mm
Hodnota p
Stage (n=75)
T1
T2
T3
T4
p-value
Metastázy LN (n=66)
Positive
Negative
Hodnota p
Vaskulárna invázia
(n=82)
Positive
Negative
Hodnota p
ER (n=81)
Pozitívne
Negatívne
Hodnota p
PR (n=82)
Pozitívne
Negatívne
Hodnota p
HER-2 (n=82)
Pozitívne
Negatívne
Hodnota p
Subcelulárna
lokalizácia
A
Intenzita
Immunoreakcie
+++
Percento pozitívnych
buniek
11>50
<10%
50%
%
C
MC
M
+
++
1
9
14
9
13
0
0
1
0
0
0
0
1
0
0
0
1
1
0.036
1
5
8
6
8
1
0
1
0
0
1
0
0
3
5
3
6
1
0.481
2
2
3
4
1
1
0
2
4
2
5
0
2
4
3
4
2
1
0.231
0
0
1
1
1
1
16
15
15
0
1
0
0
0
3
0.029
5
5
19
0
2
0
2
3
13
0.008
3
1
9
3
1
9
2
5
9
0.041
0
0
4
16
16
18
0
1
0
0
0
3
0.108
3
11
13
0
1
1
1
7
8
0.399
2
4
7
2
5
5
1
7
7
0.104
0
0
4
31
9
1
2
1
0
0
0
0
2
0
1
0.291
14
8
1
5
1
0
0
1
8
5
1
3
0.333
6
5
0
2
6
3
0
3
9
4
1
2
0.137
0
3
0
1
15
24
0
1
0
2
0.603
8
16
0
2
5
10
0.702
3
7
0
10
6
8
0.063
2
1
25
24
0
1
0
3
0.276
14
15
1
1
6
12
0.592
7
6
5
8
7
9
0.857
2
2
45
3
1
0
0
3
0.000094
20
9
2
0
13
5
0.000045
6
7
9
4
12
4
0.000024
0
4
45
4
1
0
0
3
0.00012
18
11
2
0
12
6
0.00024
5
8
9
4
10
6
0.000051
0
4
16
33
0
1
1
2
0.118
17
12
1
1
12
6
0.094
5
8
9
4
8
8
0.102
2
2
Tabuľka 1. Korelácie medzi expresiou CA IX s morfologickými a biologickými parametrami
karcinómu mliečnej žľazy.
A- absentujúca, C- cytoplazmatická, M- membránová, MC- kombinovaná membránová a
cytoplazmatická pozitivita
LN- lymfatická uzlina
ER- estrogénový receptor
PR- progesterónový receptor
HER-2- receptor epidermálneho rastového faktora 2
139
Obrázok.1:Membránová pozitivita CA IX
Obrázok.2: Kombinovaná (membránová a
cytoplazmatická) pozitivita CA IX
Diskusia
Imunohistochémické metódy dnes nesporne predstavujú dôležitý diagnostický
nástroj pri karcinóme mliečnej žľazy v rutinnej praxi. Doteraz sa vyselektovali tri
dôležité ukazovatele (ER, PR, HER-2), ktoré sú detekovateľné práve
imunohistochemicky. Karcinóm nami sledovaného orgánu nepredstavuje ochorenie
len s heterogénnou expresiou ER, PR alebo HER-2, ale ide o skupinu molekulovo
odlišných neoplastických lézií prsníka. Veľkú perspektívu má využitie
multiparametrických vyšetrení. Komplexné zhodnotenie všetkých klinických,
morfologických alebo biologických parametrov poskytuje presnejšiu informáciu
o nádorovom ochorení konkrétneho pacienta a zároveň predstavuje sofistikované
riešenie prognostifikácie a individualizácie liečby pri karcinóme prsníka [3].
Spoločným záverom štúdií zameraných na detekciu CA IX je, že expresia proteínu
CA IX je v karcinómoch prsníka signifikantne asociovaná s nekrózou, so zlou
prognózou nádorového ochorenia, ako aj so skráteným časovým intervalom medzi
relapsami a zhoršeným celkovým prežívaním pacientov [4,5,6,7]. Brennan a kol.
[5] a Chia a kol. [6] dospeli k záverom, že v nádoroch prsníka je expresia CA IX
asociovaná s vysokým stupňom malignity a s negatívnymi estrogénovými a
progesterónovými receptormi. Naše výsledky sú v súlade s výsledkami týchto
štúdií. Span a kol. [8] a Generali a kol. [9] preukázali pozitívnu koreláciu medzi
expresiou CA IX a HER-2. Túto koreláciu sme v našej štúdiu nepotvrdili. Vo
všeobecnosti sa pokladá prítomnosť expresie proteínu CA IX za prejav progresie
ochorenia [6,8].
Naše výsledky poukazujú na to, že pozitívna imunoreakcia na CA IX môže
korelovať so stupňom malignity ako aj s expresiou hormonálnych receptorov pri
karcinóme mliečnej žľazy. Nami sledovaný proteín by mohol priniesť novú
prognosticko-prediktívnu informáciu pre diagnosticko-terapeutický manažment
tohto závažného onkologického ochorenia. Zároveň by sme chceli zdôrazniť
potrebu overiť načrtnuté trendy na rozsiahlejších súboroch.
140
Poďakovanie
Táto práca bola financovaná z grantu VEGA 1/0050/11 a grantu UK/93/2013.
Autori si dovoľujú poďakovať p. A. Rešetárovej, p. M. Kondekovej, p. M.
Letrichovej a p. S. Drahošovej za technickú spoluprácu.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Kajo, K., Žúbor, P.: Prognostické a prediktívne faktory pri karcinóme prsnej
žľazy-súčasný stav poznatkov a ich uplatnenie v praxi. Slov Gynek Pôrod
2010; 17: 146-51.
[2]
Harris AL. Hypoxia – a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev
Cancer 2002; 2:38-47.
[3]
Kajo, K., Plank, L.: Význam analýzy génovej expresie v predpovedi
prognózy a liečebnej odpovede pri karcinóme prsnej žľazy. Onkológia
2008; 4: 224-9.
[4]
Pastoreková, S.:Molekulárna biológia rakoviny. 2009, str. 5-65. ISBN 97880- 224-1114-1.
[5]
Brennan DJ, Jistrom K, Kronbland A, Millikan RC, Landberg G et al.: CA
IX is an independent prognostic marker in premenopausal breast cancer
patients with one to three positive lymph nodes and a putative marker of
radiation resistance. Clin Cancer Res 2006; 12: 21-64.
[6]
Chia SK, Wykoff CHC, Watson PH, Han CH, Leek RD et al.: Prognostic
significance of novel hypoxia-regulatedmarker, carbonic anhydrase IX, in
invasive breast carcinoma. J Clin Oncol 2001; 19: 3664-6.
[7]
Wykoff C, Beasley N, Watson P, Turner KJ, Pastorek J et al.: Hypoxiainducible regulation of tumor-associated carbonic anhydrases. Cancer Res
2000; 60: 7075-83.
[8]
Span PN, Bussink J, Manders P, Beex LV, Sweep CG: Carbonic anhydrase9 expression levels and prognosis in human breast cancer: association with
treatment outcome. Br J Cancer 2003; 89: 271-276.
[9]
Generali D, Fox SB, Berruti A, Brizzi MP, Campo L, Bonardi S, et al. Role
of carbonicanhydrase IX expression in prediction of the efficacy and
outcome of primary epirubicin/tamoxifen therapy for breast cancer. Endocr
Relat Cancer 2006; 13: 921-30.
141
Vplyv špecializovaného pohybového programu na svalové a kostné
tkanivo a kvalitu života onkologických pacientov s karcinómom
prostaty
Aurel Zelko
Katedra Atletiky, Fakulta telesnej výchovy a športu, Univerzita Komenského
v Bratislave
Úvod
Karcinóm prostaty je druhým najčastejším onkologickým ochorením mužskej
populácie sveta [1]. Demografické zmeny, stále stúpajúca incidencia v Európskej
populácií mužov a výrazný pokrok v oblasti liečby tohto ochorenia rezultujú
v kontinuálny rast počtu bývalých onkologických pacientov. Slovensko je
v svetovom poradí miery incidencie karcinómu prostaty v populácií priemernou
krajinou, v roku 2003 bolo diagnostikovaných 1130 prípadov karcinómu prostaty,
čo predstavuje incidenciu 33,3 prípadov na 100 000 jedincov v populácií. Na
celkovom počte diagnostikovaných onkologických ochorení na SR sa karcinóm
prostaty podieľal 9,3 % [2].
Tkanivo prostaty je špecificky vysoko senzitívne na androgénnu signalizáciu.
V bunkách tkaniva prostaty je testosterón premieňaný na 5-α-dihydrotestosterón,
ktorý je približne desať krát silnejším androgénnym stimulantom vo
vnútrobunkovej signalizácií ako materská molekula [3]. Tento poznatok tvorí
základ pre indikovanie hormonálnej terapie pri liečbe karcinómu prostaty.
Androgén deprivačná terapia je indikovanou terapiou približne v polovici
diagnostikovaných prípadov. Stále väčšia pozornosť je venovaná kvalite života
pacientov a možnostiam špecializovanej starostlivosti pre prevenciu vedľajších
účinkov onkologickej liečby. Deprivácia androgénov je spojená s výrazným
poklesom objemu svalovej hmoty, minerálnej denzity kostí, so zvyšovaním rizík
vzniku metabolického syndrómu, kardiovaskulárnych ochorení, diabetu a ďalších
ochorení spojených so zníženou aktivitou androgénov [4]. V klinickej štúdií
účinkov 6-12 mesačného užívania androgén deprivačnej terapie bol preukázaný
pokles svalovej hmoty o 4-10 % a pokles minerálnej denzity kostí o 2-4 % [5].
Využitie špecializovaného pohybového programu v starostlivosti o pacientov s
karcinómom prostaty môže znížiť dopad ADT na svalové a kostné tkanivo a zvýšiť
kvalitu života pacientov. Silový tréning zvyšuje objem svalovej hmoty a denzitu
kostí v skupinách starších i mladších, žien i mužov [6]. Referencie o účinnosti
silového zaťaženia sa líšia, avšak prevažná časť štúdií uvádza nárast objemov
svalovej hmoty o 5 – 40 % [7] a nárast minerálnej denzity kosti o 1 až 4% [8].
Tieto východiská boli základom pre prípravu štúdie, ktorej cieľom je analyzovať
vplyv špecializovaného pohybového programu na svalové, kostné tkanivo a kvalitu
života pacientov s karcinómom prostaty.
142
Materiál a metódy
Subjekty štúdie budú získavané na Urologickom oddelení v Nemocnici svätého
Cyrila a Metóda v Bratislave a následne po overení spôsobilosti pre zaradenie do
skupín výskumného sledovania budú subjekty randomizovaným výberom zaradené
do experimentálnej a kontrolnej skupiny výskumu. Experimentálna skupina bude
vykonávať špecializovaný pohybový program podľa odporúčaní pre tvorbu
a realizáciu pohybových programov pre onkologických pacientov vydaných
pracovnou skupinou „American College of Sports Medicine“ v roku 2010 (9). Na
rozdiel od odporúčaní uvedeného zdroja budeme v štúdií využívať dlhšie obdobie
intervencie pohybovým programom, namiesto dvanástich týždňov intervencie budú
subjekty realizovať šestnásť týždňový pohybový program. Kontrolná skupina bude
počas trvania štúdie vykonávať bežné denné aktivity, po ukončení štúdie bude
kontrolnej skupine ponúknutá možnosť absolvovať identický pohybový program.
V období pred začiatkom a po ukončení aplikácie pohybového programu bude
každý subjekt štúdie podrobený diagnostike sledovaných parametrov (metóda):
minerálna denzita kostí (DEXA), stavba a funkcie svalového tkaniva (analýza
bioptickej vzorky svalového tkaniva s využitím metód molekulárnej biológie,
telesná a motorická zdatnosť), imunologické a onkologické parametre
(hematologické analýzy), psycho-sociálne funkcie (aplikácia štandardizovaných
psychologických dotazníkov).
Výsledky
Očakávame, že výsledky štúdie rozšíria poznatky v oblasti špecializovanej
starostlivosti o onkologických pacientov a potvrdia účinnosť špecializovaného
pohybového programu pri zmierňovaní vedľajších účinkov androgén deprivačnej
terapie u pacientov s karcinómom prostaty.
Diskusia a záver
Vedecká štúdia o vplyve špecializovaného pohybového programu na pacientov s
karcinómom prostaty prinesie pre prax overenie metódy s potenciálom znižovania
vedľajších účinkov liečby a zvyšovania kvality života pacientov.
Zoznam použitej literatúry
[1]
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, et al. Estimates of
worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer.
2010; 127(12): 2893-917.
[2]
Ondrušová, M., Ondruš, D. Výskyt a úmrtnosť na karcinóm prostaty na
Slovensku a v zahraničí. Onkológia (Bratisl.), 2009; 4(5): 272–274.
[3]
Silver RI, Wiley EL, Davis DL, Thigpen AE, Russell DW, et al. Expression
and regulation of steroid 5 alpha-reductase 2 in prostate disease. J Urol.
1994; 152(2):433-7.
[4]
Collins L, Basaria S. Adverse effects of androgen deprivation therapy in
men with prostate cancer. Asian J Androl. 2012 Mar; 14(2):222-5.
143
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
Cheung AS, Pattison D, Bretherton I, Hoermann R, Lim Joon D, et al.
Cardiovascular risk and bone loss in men undergoing androgen deprivation
therapy for non-metastatic prostate cancer: implementation of standardized
management guidelines. Androlog. 2013; 1(4):583-9.
Abe T, Kojima K, Kearns CF, Yohena H, Fukuda J. Whole body muscle
hypertrophy from resistance training: distribution and total mass. Br J
Sports Med. 2003; 37(6):543-5.
Hunter R, Mccarthy JP, Bamman M. Effects of resistance training on older
adults. Sports Med. 2004; 34:329-348.
Vincent R, Braith W. Resistance exercise and bone turnover in elderly men
and women. Med Sci Sports Exerc. 2002; 34:17-23.
Schmitz KH, Courneya KS, Matthews C, Demark-Wahnefried W, Galvão
DA, et al. American College of Sports Medicine: American College of
Sports Medicine roundtable on exercise guidelines for cancer survivors.
Med Sci Sports Exerc. 2010; 42(7):1409-26.
Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu
výskumu a vývoja na základe Zmluvy č. APVV-0518-12.
144
Sponzori Súťaže mladých onkológov 2014:
Nadácia Výskum rakoviny:
podporila víťazov jednotlivých kategórií finančným darom
zakúpila odborné knihy:
Klinická onkológia autorov Juraja Kaušitza a Čestmíra Altanera
Ústav experimentálnej onkológie SAV
venoval ročné predplatné časopisu Neoplasma
K-Trade, spol. s r.o – Váš špecialista pre laboratórium
ocenil víťazov jednotlivých kategórií tabletom
Vydavateľstvo Slovart, spol. s r.o
poskytol odbornú literatúru pre víťazov
Západoslovenská energetika, a.s.
darovala USB kľúče pre všetkých súťažiacich a
vecné ceny pre víťazov
Medirex, a.s.
venovala zápisníky a perá pre všetkých súťažiacich
145
ISBN 978-80-971621-0-8
EAN 9788097162108
146
Download

Zborník prednášok - Nadácia výskum rakoviny