Endometriosiz, inflamasyon ve hormon reseptörleri
Orhan Bukulmez, M.D.
Associate Professor and Division Director
Division of Reproductive Endocrinology & Infertility
Practice & Medical Director –IVF program
Department of Obstetrics and Gynecology
University of Texas Southwestern Medical Center
Dallas, Texas
TIME Feb. 23, 2004
İnflamasyon birçok hastalığın
patogenezinde önemli rol oynar
Pulmonary
diseases
Neurological
diseases
Cancer
Cardiovascular
diseases
Inflammation
Autoimmune
diseases
Alzheimer’s
disease
Diabetes II
Arthritis
(NF)-kB/Rel :Transkripsiyon faktörleri
c-Rel
NF-kB1 (p50 ve bunun ön bilesigi p105)
NF-kB2 (p52 ve bunun ön bilesigi p100)
p65 (RelA)
RelB
Klasik NF-kB kompleksi: Heterodimer: p65/RelA and p50 subüniteleri,
hücrelerde inhibitor proteinlere bağlı olarak bulunur: “IkBs”. En bilineni
IkBa olup NF-kB yi sitoplazmada tutup nükleer lokalizasyon dizilimini
maskelemek ve de NF-kB proteinlerinin nükleusdan uzaklaştırılmasında
rol oynar.
Regüle ettiği fonksiyonlar
Proliferasyon
Differensiasyon
Programlı hücre ölümü (Apoptoz)
Tümörigenez
T ve B hücre proliferasyonu ve gelişimi
İnflamasyon
“Master Regülatör” : İnflamasyon & İmmunite
NF-kB
p50 p65
IkBa
Activator
Ubiquitination &
Phosphorylation
IKKa
Nuclear
kB enhancer
p50 p65
import
p50 p65
IkBa
Degradation
IkBa
Nucleus
Cytoplasm
Garg and Aggarwal, Leukemia, 2002
NF-kB Aktivatörleri
ROS inducers
(H2O2, free iron, heme)
Carcinogens
Cytokines
(e.g: TNF, CSC, DMBA)
(TNF family, IL-1,
IL-17, IL-18, EGF)
Infection
(bacterial/viral;
e.g HIV, EBV-LMP,
HTLV1, via TLRs)
NF-kB
(PMA)
Stress
Apoptosis-inducers
Chemotherapeutic
agents & g-irradiation
Tumor Promoters
(pH, hypoxia,stress
heavy metals)
Endotoxin
(LPS)
Aggarwal BB, Cancer Cell, 2004
Anormal NF-kB aktivasyonu gösteren majör hastalıklar
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Kalp yetmezliği; iskemik reperfüzyon hasarı; Kardiak hipertrofi
Multiple sclerosis
Muscular dystrophy
Alzheimer’s
Inkontinentia pigmenti
Ektodermal displazi
Systemic inflammatory response syndrome: Septik şok
Inflammatory bowel disease: Ülseratif kolit, Crohn’s
Renal hastalıklar
Neuropatolojiler
H.Pylori gastriti
Kanser, artrit, AIDS, astım, DM, Yaşlanma, Viral infeksiyonlar, Uyku
apnesi, KOAH, Lupus, ENDOMETRİOSİZ*
Kumar A, Takada Y, Boriek AM, Aggarwal BB. Journal of Molecular Medicine 2004;82:434-48
*Gonzalez-Ramos R et al Fertil Steril 2012;98:520-528
NF-kB’nin regule ettigi genler ve Endometriozis
• Sitokinler (TNFa*, IL-1, IL-6*, vs)
• Kemokinler (IL-8*, macrophage inflammatory protein (MIP)-1a, monocyte
chemotactic protein 1 (MCP1), regulated upon activation normal T cell
expressed and secreted (RANTES), eotaxin) *Periton sıvısında
endometrioizde artan düzeyler.
• Adhezyon molekülleri (E-selectin, vascular cell adhesion molecule 1
(VCAM-1) and intercellular cell adhesion molecule 1 (ICAM-1)
• Inducible enzymes (eg. COX-2, iNOS, caspases, MMP9)
• Cellular inhibitor of apoptosis protein (c-IAP1 &2), TNF-receptorassociated factors (TRAFs), B-cell lymphocyte-leukemia-2 (Bcl-2)
homologs (A1/BFl-1, IEX-IL), Fas, c-myc and cyclin D1.
• NF-kB ayrıca TLRs, TNFa and IL-1β, tarafından da aktive edilir: “pozitif
oto-regulator siklus: Bir kere tetiklendiğinde inflamasyon gittikçe amplifiye
olur ve iltihap cevabının şiddeti artar ve de süresi uzar.
Chen. Nat Rev Mol Cell Biol 2004;5:392. Ghosh S et al. Annu Rev Immunol 1998;16:225. Karin M. Annu Rev
Immunol 2000;18:621-63. Tam WF. Mol Cell Biol 2000;20:2269.Ghosh S. Cell 2002;109S:S81. Khan KN et al.
Gynecol Obstet Invest 2009;68:40-52.
NR4A öksüz (orphan) nükleer reseptörler
Büyüme faktörleri ekspresyonunda rol oynayan erken cevap
genlerindendir (sinir büyüme faktör aktivasyonu)
İnflamasyona neden olan faktörlere çok hızlı cevap verir.
NF-kB ekspresyonlarını artırır. Ekspresyon aktivasyonla korele
• Nur77
• Nurr1
• NOR1
• Nurr1: Timus, osteoblastlar, karaciğer, pituiter bez
• Nor1:Pituiter bez, timus, böbrek, kalp, iskelet kası, adrenal
• Nur77 çoğu hücre sisteminde bulunur: Ekpresyonu NF-kB
aktivasyonu ile koreledir
– Nur77 diğerlerine kıyasla endometriyum ve endometriosizde
saptanabilen yegane NR4A grubu reseptördür
– NFkB aktivasyonunun doğrudan olmayan bir göstergesidir
Pei et al J Biol Chem 2005;29256
Suzuki et al PNAS 2003;100(14):8276
Harant & Lindley Nuc Acid Res 2004;32:5280
Estrogen receptor (ER)
• ER 1986 (ERa)
• ERb 1996
• 17b-E2 her ikisine de eşit duzeyde
bağlanır (ERa ERb)
• ERb yaygın olarak bulunsa da uterus çok
yüksek bir ekspresyon göstermez.
– Prostat, tükrük bezleri, testis, over, vasküler
endotel, düz kas, bazı nöronlar, bağışıklık
sistem hücreleri
Harris Mol Endocrinol 2006
ERb
ERa agonist
E2
Cell line
(HC11) ERb agonist
(lact.mammary gl)
proliferation
no effect
proliferation
Faulds et al. Mol Endocrinol 2004;18:412:421
Expressed in developing uterus, switching to ERa when completed
Keeps uterus quiescent before ovary secretes E2 (3bAdiol)
Cervical ripening, decidualization in adult uterus
Lost in endometrial cancer
Plays important role in elastic recoil of uterus –blockade&prolapse
Highly expressed in granulosa cells
No consensus bERKO mice phenotype
Koehler et al Endocr Rev 2005:26:465
Paul et al Cancer Invest 2004;22:211
Structural domains of the human ERa and ERb
Koehler, K. F. et al. Endocr Rev 2005;26:465-478
ERb nın hayvan modelleri üzerine etkileri
• Non-selektif estrogenler NF-kB aktivasyonuna bazı
sistemlerde engel olabilir
• Estrojenin bu tür anti-inflamatuvar ERb üzerinden
olabilir
• ERb selektif agonistler fare inflamatuvar artrit
modelinde yaralı bulunmuştur
• Yine IBH (UC gibi) modelinde etkilidir
• Travma-kanama modelinde akciğer hasarını IL-6,
iNOS, LDH yı düşürerek azaltır
• MI & sepsis modellerınde yararlı (survivalı artırıyor)
• ERb -/- mice: myeloproliferative disease
• ERa -/- mice: autoimmune disease (GN)
ERb
• Regulasyonu?
• >10 izoform
• E2 verilen sağlıklı sıçanlarda ERb ya
bağımlı genler gösterilememiştir
• Sadece hayvan strese maruz kaldığında
ya da hastalandığında fonksiyonları önem
kazanabilir.
“Challenge hypothesis”
ERb & Endometriozis
•
•
•
•
•
Sıçan Eosiz modelinde sadece ERa görülmüş
ERb babun endometriotik lezyonlarında gösterilmiş
ERb agonist sıçanda Eosis implantlarını yok etmiş i
ERb agonist stimulating macrophages/NK cells ?
İnsan endometriumu: ERb mRNA epithel
hücrelerinde, daha çok proliferatif fazda
• Endometrioma: ERa mRNA dominant ancak ERb
daha artmış bir durumda
• ERa ve PR supresyonunda etkin olabilir
Harris et al Human Reprod 2005;20:936; Matsuzaki et al Fertil Steril 2000;73:1219
Faleabas et al. Fertil Steril 2003;80:820; Bulun et al Semin Reprod Med 2012;30:39
Progesteron Reseptörü
• PR mRNA ekspresyonunu E2 regüle eder
ancak PR promoterinde ERE yoktur
• Promoterde birçok transkripsiyon faktörü
mevcuttur
• PR ekspresyonu ERa tarafından pozitif
yönde regüle edilir
Kastner et al EMBO J 1990;9:1603
Hewitt & Korach Steroids 2000;65:551
Bulun et al Semin Reprod Med 2012;30:39
AUG1 AUG2
PR-B
mRNA
5’
AUG5
1
5’
5
6
7
8
3’
4
5
6
7
8
3’
3
4
5
6
7
8
3’
3
2DBD
4
6 7
5 LBD
8
COOH
3
AUG5
AUG2
PR-A
mRNA
4
2
1
2
3
AUG5
PR-C
mRNA
5’
PR-B
NH2 BUS
PR-A
NH2
PR-C
1
???
2
DBD
NH2
LBD
COOH
LBD
COOH
PROGESTERONE RECEPTOR ISOFORMS
BUS
DBD
LBD
PR-B
PR-A
PR-C
•
•
•
•
PR isoforms (many more): PR-A, PR-B and PR-C.
PR-B (116-kDa) is a strong transactivator of PR target
genes.
PR-A (94-kDa) may inhibit PR-B transcriptional activity in a
cell type and promoter-specific context??
PR-C (64-kDa) may be a suppressor of progesterone action
and forms heterodimers with PR-B which interferes with PRB-DNA binding.-one of the truncated isoforms of PR
PR A&B izoformları
• PRA daha çok endometrial stromada (94-kDa)
–
–
–
–
–
Endometriosis implantlarda daha fazla
ER aktivitesini inhibe edebilir
P4 direncinde rol oynayabilir
Meme kanserinin adhesivitesini artırabilir
Fonksiyonu daha çok P4 yoksunluğu olan durumlarda
ortaya çıkabilir
• PRB daha çok endometrial glandlarda (116-kDa)
– E2 tarafından endometrium ve T47D hücrelerinded
özellikle artılırılan izoform
Attia et al JCEM 2000;85:2897
Jacobsen et al Mol Endocrinol 2005;19:574
PR C (non A, non-B, kesilmiş transkriptler)
•
•
•
•
•
•
> 7 transkript (aynı PR geninden)
Hem nükleer hem sitoplazmik
Tam bir DNA binding domaini yoktur
Nükleus lokalizasyon sinyali mevcuttur
Sitoplazmik fonksiyonu ?, diğer TF lerle ilişkisi ?
P4 u bağlar ama genomik etkisine engel olabilir:
”Functional P4 withdrawal”
• PR B ye bağlanarak (heterodimer) PRE ni etkileme
kapasitesini azaltabilir
Taylor et al Endocrinology 2006;147;687
Condon et al Mol Endocrinol 2006;20:764
Wei et al J Steroid Biochem Mol Biol 1997;62:287
Progesterone Causes a Rapid Induction of IkBa Expression and Blocks
IL-1b-Mediated Degradation of IkBa Protein
(hTERT myometrial cell line)
Control
Progesterone (P4)
IkBa Expression
(Arbitrary Units)
120
100
Q-PCR
80
60
40
20
0
0.25
2
6
12
Time (h)
C
IL-1b
Immunoblot
6h
P4
IL-b + P4
IkBa
(37
kDa)
Progesterone Reduces NF-kB p65 Binding to the Distal COX-2
Promoter in hTERT Myometrial Cells
5’
6
7 8 9 10
3’
aggggattccc Distal
N F -k B p 6 5 B in d in g (F o ld A b o v e C o n tro l)
-447
23 4 5
1TATAAA
4
IL -1 b
P ro g e s te ro n e
IL -1 b + P ro g e s te ro n e
3
2
1
0
2
6
T im e (h )
24
A ro m a ta s e P ro m o te r IIa m R N A E x p re s s io n
(A rb itra ry U n its )
Progesterone Suppresses the IL-1b/cAMP-induced Expression
of Aromatase Promoter IIa mRNA in T47D Breast Cancer Cells.
30
Aromatase
mRNA
V e h ic le
1 0 -7 M P 4
25
20
15
10
5
0
Control
IL-1b
T re a tm e n t
cAMP
Progesterone is Unable to Induce IkBa in PR-A/B Deficient T47D Cells
Treatment
Lipid
PRB1
PRA5
Mismatch
PR-B
PR-A
actin
n=3
[Progesterone] = 100 nM
Ablation of PR-A and PR-B Induces Expression of hCYP19
Promoters IIa and I.3 in T47D Cells
siRNA:
---
PR-B PR-A/B MisM
PR-B
PR-A
E x o n -S p e c ifc C Y P 1 9 E x p re s s io n
(A rb itra ry V a lu e s )
Actin
36
33
30
E x o n 1 .3
E x o n IIa
27
24
21
18
15
12
9
6
3
0
L ip id
P R -B (-/-)
P R -A /B (-/-)
M is m a tc h
Structure of the Human CYP19 Gene:
5’-Untranslated Regions of CYP19 mRNA Transcripts
are Encoded by Unique Tissue-Specific First Exons (5’UTRs)
Exon I.1 Exon I.4
Placenta Adipose
Exon If I.3
Brain
Exon IIa
HBR
Breast Gonads
Cancer
II
III
AATAAA
ATTAAA
IV
V VI
VII VIII
IX
X
ATG
92.6 kb
34.1 kb
The coding region and encoded protein (58kDa), however, are identical regardless of the
promoter used Bulun et al Pharmacol Rev 2005
Endometriotik stromal hücrelerde aromataz ekspresyon regülatörleri
• Negatif/nötral regülatörler
– Chicken ovalbumin upstream promoter transcription
factor 2 (COUP-TF2)
– PGE2 receptor EP1 and EP3?: No change or
suppression in some systems
• Pozitif regülatörler
–
–
–
–
–
–
–
SF-1
cAMP
CREB (cAMP response element binding protein)
PGE2*
PGE2 receptor EP2, EP4 subtypes
COX-2*
Cytokines*: IL-6 &11, TNFa, Cortisol (promoter I.4)
• * NF-kB regulated factors
•Noble et al 1996/1997, Zeitoun et al 1999, Richards&Brueggemeier 2003
Aromataz İndüksiyonu: Lokalize bir olay
Periton sıvısında steroid hormon
düzeylerinde endometriosiz hastlarında
kontrol hastalara kıyasla bir fark
gözlenmemiştir (sitokin verilerinin tersine)
Mahmood & TempletonBr J Obstet Gynaecol. 1991 Feb;98(2):179-83.
Periton Endometriozisi
Vesiküler, saydam, kırmızı lezyonlar
Erken implantlar proliferatif endometriumu andırır
 Düşük sitokeratin and vimentin ekspresyonu
“immaturity” (celllular disorganization)
 Yüksek P.Sıvı sitokin düzeyleri (IL-8)
 Yüksek glandüler mitotik indeks (Ki-67)
 Yüksel MMPs –tüm menstrual fazlarda
 Sonunda kahverengi/siyah ve skarifikasyon

Peritoneal Endometriosis
Black Lesions

Presence of intraluminal debris
 Scarification, decreased vascularization
 No typical Progesterone changes
 Eventual white fibrotic lesions
AROMATAZ: B- Negatif Ktrl red C-Kırmızı D-EU(geç prolif.) E-sıyah F-EU(sekr.)
G-Eoma H-Normal uterin periton (seroza) I-Plasenta
“Lokal yama tarzı aromataz lokalizasyonu, kırmızı implantlarda en yüksek derecede”
Bukulmez et al Endocrinol 2008;149:1190
CYP19IIa Endometrium (A,B) ve İmplant/EU oranı (C)
EU aromataz mRNA<< Eosiz implantlar (Fig C)
Luteal P4 EU aromataz ekspresyonunu suprese ediyor (B)
rASRM evresi EU aromataz ekspresyonunu değiştirmiyor
ancak implant aromataz ekspresyonu evre I-II de artıyor C
CYP19IIa Lezyonlar; morfoloji, menstrual faz, periton
En yüksek aromataz kırmızı implantlarda (A)
Menstrual faza göre implantlarda değişiklik yok (B)
Yani luteal P4 implantlarda aromataz ekspresyonunu
etkilemiyor
D-MPA tx suprese etse de, ekspresyon düzeyleri EU’ya göre
yüksek
İmplantlarda Sınırlı Progestin etkisi
İleri evrede peritonda artmış ekspresyon (C)
m R N A e x p re s s io n a rb itra ry va lu e s
3100
C E B P a lp h a
C O U P -TF II
S F -1
855
3000
Aktivatör
Supresör
Aktivatör
377
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1E
ut
i
op
1R
c
ed
im
a
pl
1B
nt
la
ck
im
a
pl
nt
2E
ut
i
op
2R
c
ed
m
ki
a
pl
2E
nt
nd
om
et
ri
om
a
3E
ut
i
op
3B
c
la
c
m
ki
a
pl
3E
nt
nd
om
et
ri
om
C
a
t
on
ro
lE
M
B
COX-2 mRNA & ERβ mRNA to ERa mRNA oranı
COX-2 en yüksek kırmızı implantlarda-Akut inflamasyon
ERβ/ERa oranı en yüksek endometriomalarda-Kronik inflamasyon
ERβ Immunostaining
A/B Prostat -/+; C-Ctrl sekret endo. D-EU geç sekr, E-Eoma
F-Eoma G-Kırmızı H-Siyah I-Periton (evre II) endotelde
Bukulmez et al Endocrinol 2008;149:1190
PR
No PR-A in endometrioma cyst wall (chronic inflammation)
Ctrl endometrium
(Late prolif)
EU (Secretory)
Red Implant (Acute
Inflammation)
Endometrioma
Nur 77 mRNA: En yüksek endometriomada
Kronik inflamasyon göstergesi mi?
N u r7 7 m R N A E x p re s s io n (A rb itra ry U n its )
1000
800
600
400
200
0
Ct
n= 6
rl
EM
B
Eu
p
to
ic
n= 7
EM
B
Ct
rl
r
Pe
it.
En
n= 5
m
do
.
r
Pe
Bl
it.
k
ac
n= 4
im
a
pl
En
nt
m
do
e
o
tri
m
n=8
Bukulmez O. Minerva Ginecol 2009;61:599
a
n=4
8000
Negatif regülatör
PG
reseptörü
200
150
100
50
E P I2 m R N A exp ressio n arb itrary valu es
E P I1 m R N A e x p re s s io n a rb itra ry v a lu e s
250
6000
4000
300
200
100
0
0
E .S tro m a
E u to p ic
Im p la n t
E .S tro m a
Im p la n t
160
E P I4 m R N A e x p re s s io n a rb itra ry v a lu e s
34000
E P I3 m R N A e x p re s s io n a rb itra ry v a lu e s
E u to p ic
32000
30000
600
500
400
300
200
140
120
100
80
60
40
20
100
0
0
E .S tro m a
E u to p ic
Im p la n t
E .S tro m a
E u to p ic
Im p la n t
Can inflammation affect oocyte quality?
• PLoS one 2012;7:e35535
• IL-6 induced deterioration in microtubule and chromosomal alignment
in mouse oocytes
Inflammation and PTEN-PI3K-Akt-Foxo3 system
Endometriosis &
• P53 alterations
• PTEN (10q) and K-ras mutations
PTEN mutations 12.5% of endometriotic tissues
Increased mismatch repair abnormalities is associated with increased
CRP levels
Remember 10q26 linkage peak in endometriosis
Chronic inflammation associated with mismatch repair abnormalities
•
Genetically modified mouse models with oocyte-specific deletion of genes in
the PTEN (Chr 10)-PI3K-Akt-Foxo3 pathway exhibit premature activation of
all dormant follicles. PTEN inhibition and PI3K activation lead to Akt ‘P’lation
and Foxo3 nuclear export in oocytes in primordial follicles resulting in
follicular activation shown by increased AMH level
Proc Natl Acad Sci U S A 2010;107:10280-4.
Trends Endocrinol Metab 2010;21:96-103.
Eutopic Endometrium
Aromatase
Retrograde menstruation
PF A4,T
E2
Aromatase/Survival
ROS
Attachment
Mesothelial injury
Implantation
NF-kB
PR-C
Nur77
Cytokines- COX-2- ChemokinesAdhesion molecules-Apoptosis inhibitors
Aromatase
E2
ERb
ERa
PR-B
PR-A
Red lesions
Black lesions
Fibrosis
Deep endometriosis
Apoptosis
Sonuç
• Endometrioma kist kapsülü-Kronik inflamasyon: İmplantlara göre
daha düşük aromataz ve COX-2, düşük/yok PRA, yüksek SF-1 ve
CEBPa; yüksek ERβ/ERa oranı, yüksek PR-C, yüksek Nur77
• İmplantlar; kırmızı: Yüksek aromataz, yüksek SF-1, yüksek COX-2,
daha düşük PR-C; implantlarda genel olarak yüksek EP2, EPI3,
EPI4 (cAMP coupled)
• İnflamatuvar cevabın statüsüne göre dokulardaki aromataz ve
nükleer reseptör ekspresyonu değişmektedir.
• Sellüler kompozisyon lezyon morfolojisine göre variyasyon
gösterir: Akut (kırmızı): epitel hücreleri, inflamatuvar sızıntı. Kronik
(Eoma): stromal hücreler, histiositler, fibroblastlar.
• PR-C gibi kesilmiş PR izoformları ve ERβ ekspresyonu kronik
inflamatuvar cevapla korele olabilir
• Endometriozisin hormonal tedavisinin beklenen başarıyı
gösterememesinden lezyonlardaki inflamasyona bağlı değişiklikler
sorumlu olabilir.
Araştırma konusu
Pelvik endomteriosizin medikal ve/veya cerrahi tedavisi
pelvik ve de ovarian inflmasyonu kısıtlıyarak ya da
elimine ederek endometriosizle ilişkilendirilen azalmış
over rezervini engelleyebilir mi?
Teşekkürler!
Download

Orhan Bükülmez