Mixed-Mode stacionární fáze v HPLC
1
HPLC kolony
Typy HPLC separací malých molekul
 Normal Phase Chromatography:
Separace molekul založená na jejich rozdílné polaritě.
Dipol-dipol interakce, stacionární fáze je polárnější než mobilní
fáze.
 Reverse Phase Chromatography:
Separace molekul založená na jejich rozdílné hydrofobicitě.
Stacionární fáze méně polární než mobilní fáze.
 Ion-Exchange Chromatography:
Separace iontů na základě jejich interakcí se stacionární fází,
nesoucí opačný náboj.
 Ion-Exclusion Chromatography:
Separace iontů na základě jejich interakcí se stacionární fází,
nesoucí stejný náboj.
2
HPLC kolony
Problémy HPLC s reverzní fází
Retence
polárních
látek
Nedostatečné
rozlišení
Tvar píků
bazických
látek
Volba
rozpouštědla
vzorku
Ion-pairing
reagencie mohou
být částečným
řešením
Malé částice, delší
kolony
Využití aditiv k
maskování
volných silanolů
AQ-type kolon
zlepšuje retenci
ve vodné fázi
Rozpouštědlo
vzorku by mělo
být identické s
počáteční mobilní
fází
Porovnání
několika RP kolon
Použití basedeactivated kolon
Další možnosti
jsou NP, HILIC
kolony nebo
iontová LC
Gradient je
jediná
proměnná
pro separaci
složitých
směsí látek
Použití non-silica
based kolon
3
HPLC kolony
Mixed-Mode stacionární fáze
Stacionární fáze, která umožňuje současně
kontrolovat více než jeden významný separační
mechanismus
4
HPLC kolony
Hydrofobicita
Iontová síla
% Ionizace
% Organické složky mobilní
fáze určuje retenci hydrofobních látek
Iontová síla mobilní fáze
určuje výměnu iontů
pH mobilní fáze ovlivňuje %
ionizace stacionární fáze a
analytů
5
HPLC kolony
Tři generace vývoje mixed mode stacionárních fází
Primesep
OH
OH
OH
OH
Si
Si
Si
Si
Obelisc
6
HPLC kolony
Obelisc R a Obelisc N, dvojice komplementárních kolon
Obelisc columns for reverse phase and normal phase
chromatography with zwitterionic mobile phase
Hydrophobic
linkages
Negatively
charged groups
Obelisc R
Positively
charged
groups
Hydrophilic
linkages
Obelisc N
7
HPLC kolony
Typy interakcí - Obelisc R
Bases
Typy interakcí - Obelisc N
Hydrophobic
Hydrophilic
Acids
O
OH
HO
O
NH
O
OH
Zwitterions
O
O
O
O
OH
O
Acids
NH
OH
O
NH
Zwitterions
NH
Bases
8
HPLC kolony
Charakteristika povrchu HPLC fází
Negative
Primesep
cation
exchange
Cation exchange
SiO2
Diol
CN
C4
C8
C18
Hydrophilic
Hydrophobic
NH2
Primesep
anion
exchange
Anion exchange
Positive
9
HPLC kolony
Charakteristika povrchu kolon Obelisc
Negative
Obelisc N
Hydrophilic
Hydrophobic
Obelisc R
Positive
10
HPLC kolony
SIELC
Mixed-mode
Separation
Reverse phase
separation
HILIC
separation
Normal
phase
separation Ion-exchange
separation
11
HPLC kolony - Primesep
Mixed-Mode Primesep kolony
Anion exchange
Cation exchange
Primesep A
Primesep 100,P
Primesep 200
Primesep C
Primesep 500
% Iontová
afinita
roste
Primesep SB
Primesep B
Primesep D
Primesep B2
12
HPLC kolony - Primesep
SWITCH PhaseTM technology
Primesep A
Primesep 100, P
Primesep 200
Primesep C
Primesep 500
Transition @
Transition @
Transition @
Transition @
Transition @
Primesep C at pH > 4
pH=0
pH=1
pH=2
pH=3.5
pH=5
% Iontová
afinita
roste
Primesep C at pH < 3
13
HPLC kolony - Primesep
Cation- Exchange Capacity
Iontová kapacita Primesep stationárních fází je
daná stupněm ionizace funkčních skupin.
Tato ionizace je závislá na pH mobilní fáze.
Anion-Exchange Capacity
2
3
4
Buffer pH
6
7
Low pH
Primesep B
High pH
Primesep D
14
HPLC kolony - separace
Primesep A
Kys. maleinová
Benzonitril
Benzylamín
Columns: 150 x 4.6 mm x 5 um
Flow rate: 1.0 mL/min.
UV: 210 nm
Mobile phase: Water/MeCN/TFA-60/40/0.1
0
Benzonitrile
Benzylamine
Maleic acid
Common C18
5
10
min
15
15
HPLC kolony – RT, tvar píku
Betaine se projevuje na Primesep kolonách
jako polarizovaná neutrální látka
mAU
80
Column:
Flow rate:
Detection:
mAU
120
Primesep 200
50 x 4.6 mm
1.0 mL/min.
ELSD
70
60
50
Betaine
mAU
40
MeCN/water- 10/90
30
MeCN/water
70/30
70
20
100
60
Změna IS a pH
80
50
MeCN/water-40/60
0
MeCN/water-10/90
0
40
60
10
2.5
5
7.5
min
MeCN/water- 10/90
30
Optimalizace tvaru píku
40
TFA-0.3 %
20
TFA-0.2 %
TFA-0.1 %
TFA-0 %
20
0
TFA-0.1 %
10
HCOOH-0.1 %
0
2
4
min
No acid
0
2
4
min
16
HPLC kolony – hydrofobní amíny
Hydrofobní amíny mohou být separovány na kolonách Primesep® B. Stationární fáze se
stejným nábojem jako analyt vykazuje vynikající tvar píků.
Volné silanoly jsou dokonale maskovány – nedochází k chvostování píků. Výsledkem jsou
úzké symetrické píky a vynikající rozlišení a účinnost kolony.
Bu
Bu
N
Bu
Bu
electrostatic
repulsion
hydrophobic
interaction
Column:
Primesep® B
Size:
150 x 4.6 mm
Mobile Phase:
H2O/MeCN/TFA - 80/20/0.15
Flow rate:
1.0 mL/min
Detector:
ELSD
Peak plate count 9200
Peak symmetry 0.83
Bu
Bu
N
Bu
Bu
Primesep D
0
5
10
15
min
17
HPLC kolony – hydrofobní T-aminy
Primesep B, 150 x 4.6 mm
Flow rate:
1.0 mL/min
Detector:
UV 250 nm
Mobile Phases:
Leading brand C18 column
150 x 4.6 mm x 5 um
Mobile Phase:
H2O/MeCN/TFA - 30/70/0.1
Flow rate:
1.0 mL/min
Detector:
UV 250 nm
Peak Plate count 1640
Peak symmetry
0.19
Cetylpyridinium
140
mAU
120
50
100
40
80
30
60
20
40
10
20
0
0
0
5
MeCN/water/TFA – 55/45/0.1
MeCN/water/TFA – 55/45/0.2
MeCN/water/TFA – 50/50/0.1
MeCN/water/TFA – 50/50/0.2
MeCN/water/TFA – 45/55/0.1
MeCN/water/TFA – 45/55/0.2
mAU
10
min
0
2.5
5
7.5
10
12.5
min
18
HPLC kolony – pH gradient
Nastavený gradient
TFA, %
0.25
Column: Primesep 100 150 x 4.6 mm
Mobile phase: MeCN/H2O–15/85
TFA gradient 0.05 to 0.25% in 15 min
Flow rate: 1.0 ml/min
Detector: UV 210 nm
UV
Norm.
0.20
 Acidické skupiny
kolony Primesep 100
brání vázání kyselého
modifikátoru na
stacionární fázi.
Reálný průběh
gradientu
1000
800
0.15
600
010
Ustálení
základní
linie <2 min
400
200
0.05
0
0
0
5
10
15
20
min
 Výsledkem je rychlé
ustálení rovnováhy,
rovné 2-3 objemům
kolony.
 Acidický gradient je tak
další vhodnou možností
jak separovat látky s
výrazně rozdílnou
hodnotou pKa .
19
HPLC kolony - Primesep
Dextromethorphan Bromide
Stanovení organické i anorganické složky současně
Column: Primesep B2
Size:
150 x 3.2 mm
Flow rate: 0.5 mL/min.
Detection: UV 210 nm
H CO
3
H
Br-
N CH
3
Br-
0
2
4
6
Mobile phase:
MeCN/H2O/TFA – 20/80/0.2%
8
min
0
2
4
6
8
min
Mobile phase:
MeCN/H2O/TFA – 20/80/0.1%
20
HPLC kolony - Obelisc
Každá molekula má z hlediska chromatografie dvě důležité vlastnosti:
hydrofobicitu a stupeň ionizace.
Hydrophilic
molecules
Positively charged
Neutral
Zwitterions
Negatively charged
Inorganic cations,
nucleobases,
neurotransmitters
Sugars, cyclodextrins,
diols
Amino acids
Inorganic anions, DNA,
organosulfates
IC
HILIC
Obelisc R
Obelisc N
Basic dyes, basic drugs
Hydrophobic
molecules
IC
HILIC
RP
NP
IE
RP
NP
Obelisc R
Obelisc N
IC
HILIC
Obelisc N
IC
HILIC
Obelisc N
Aromatics,
nitroaromatics,
chlororganics
e-aminocaproic acid,
peptides, proteins
RP
NP
RP
HILIC
IE
Obelisc R
Ion Chromatography
Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography
Reversed-Phase chromatography
Normal-Phase chromatography
Ion Exchange/Exclusion
Obelisc R
Obelisc N
IC
HILIC
Obelisc N
Obelisc R
Acidic drugs
RP
NP
Obelisc N
Obelisc R
Tradiční řešení
Využití kolon Obelisc
21
HPLC kolony - Obelisc
Separace Xanthinu
3
Caffeine Log P = -0.8
1. Caffeine
2. Methylxanthine
3. Xanthine
1
Column size:
Flow:
Detection:
150 x 4.6 mm
1.0 mL/min
UV 250 nm
2
Column:
Obelisc N
Mobile phase: MeCN 85%,
15 mM AmAc pH 5.0
3
3-Methylxanthine Log P = -1.27
2
1
Xanthine Log P = -1.5
Column:
Obelisc R
Mobile phase: MeCN 5%,
20 mM AmAc pH 5.0
0
2
4
6
8
min
22
HPLC kolony - Obelisc
Separace isomerů kyseliny α-, β-, a γ-aminomáselné
1. α-Aminobutyric acid
2. β-Aminobutyric acid
3. γ-Aminobutyric acid
Column:
Size:
Flow rate:
Detection:
Obelisc N
150 x 4.6 mm
1mL/min
ELSD
1
2
3
Mobile phase: MeCN 75%, AmFm
20 mM pH 3.0
Separace bylo dosaženo
nastavením správné iontové
síly
2
1
3
Mobile phase: MeCN 75%, AmFm
5 mM pH 3.0
0
2
4
6
8
10
min
23
HPLC kolony - Obelisc
Retenční characteristika Dopaminu
Column:
Size:
Flow:
Detection:
HO
Obelisc R
150 x 4.6 mm
1.0 mL/min
ELSD
NH2
HO
Buffer concentration effect.
Mobile phase: MeCN 30%
NH3-HPO4 pH 6.5
MeCN concentration effect
Mobile phase:
50 mM NH3-HPO4 pH 6.5
30%
50 mM
20 mM
20%
10 mM
10%
5 mM
0%
0
5
10
15
20
25
30
min
0
2
4
6
8
10
12
14
16
24
18 min
HPLC kolony – závěr
 Mixed-mód kolony představují účinný nástroj pro separaci
polárních látek a komplexních směsí látek různé polarity
 Při separaci látek se uplatňuje více retenčních principů, což
poskytuje vysokou flexibilitu pro dosažení požadované
separace
 Individuální nastavení retenčních mechanismů nabízí
možnost vytvoření rychlé a účinné isokratické metody i pro
směsi látek s výrazně různou polaritou
 Současně mohou být separovány a analyzovány
anorganické i organické látky za použití vhodné kombinace
detektorů - ELSD / UV
 Mixed-mód kolony jsou kompatibilní s širokým spektrem
mobilních fází a pufrů (100% organic to 100% water/pufr),
ideální pro MS, ELSD
 Mixed-mód kolony jsou vhodné pro preparativní LC. Nabízí
výrazně vyšší kapacitu pro ionizované molekuly ve srovnání
s reverzní fází
25
HPLC kolony
Děkuji za pozornost
26
Download

HPLC kolony