SBORNÍK PŘEDNÁŠEK
květen 2013
1
2
Best servis Ústí nad Labem
Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v. v. i., Praha
Biofyzikální ústav AV ČR, v. v. i., Brno
UNESCO laboratoř elektrochemie životního prostředí na
Přírodovědecké fakultě Univerzity Karlovy v Praze
Sborník přednášek
mezinárodní odborné konference
XXXIII.
Moderní Elektrochemické Metody
Jetřichovice 20. – 24. května 2013
Uspořádali:
Navrátil Tomáš, Fojta Miroslav a Karolina Pecková
ISBN 978-80-905221-1-4
1
Tato publikace je určena pro účastníky konference a členy pořádajících organizací.
Za obsah veškerých textů nesou plnou zodpovědnost autoři. Publikace neprošla
odbornou ani jazykovou úpravou. Zveřejněné informace mohou být dále použity za
předpokladu úplného citování původního zdroje. Přetiskování, kopírování či
převádění této publikace do jakékoliv tištěné či elektronické formy a její prodej je
možný pouze na základě písemného souhlasu vydavatele. (Bona fide vědečtí
pracovníci si mohou pořídit jednotlivé kopie pro vlastní potřebu).
Název:
Vydal:
Autor:
Počet stran:
Náklad:
Vydání
Formát:
XXXIII. Moderní Elektrochemické Metody
Srsenová Lenka - Best servis Ústí nad Labem
kolektiv autorů
256
80
1.
A5
ISBN:
978-80-905221-1-4
2
Best servis Ústí nad Labem
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Prague
Institute of Biophysics of the AS CR, v.v.i., Brno
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Prague
Collection of Conference Proceedings
International Conference
Modern Electrochemical Methods
XXXIII
Jetřichovice, Czech Republic
May 20th - May 24th, 2013
Editors:
Navrátil Tomáš, Fojta Miroslav, and Karolina Pecková
ISBN 978-80-905221-1-4
3
4
Obsah
Lenka Bandžuchová, Renáta Šelešovská, Jaromíra Chýlková, and Tomáš Navrátil
Voltammetric Determination of Herbicide Triasulfuron using Mercury Meniscus
Modified Silver Solid Amalgam Electrode
Str.
9
Lenka Bandžuchová, Renáta Šelešovská, Tomáš Navrátil, and Jaromíra Chýlková
Voltammetric Behavior of Folates and Related Substances Using Silver Solid
Amalgam Electrode
14
Martin Bartošík, Mojmír Trefulka, and Emil Paleček
Novel Electrochemical Assay for MicroRNA Detection Using Electroactive Complex
of Six-Valent Osmium and Magnetic Beads
19
Lenka Benešová, Jan Klouda, Adéla Patáková, Kateřina Pišnová, Karel Nesměrák,
Jiří Barek, and Karolina Pecková
Electrochemistry of Selected Bile Acids and Phytosterols at Bare Electrodes
24
Jana Bulíčková and Romana Sokolová
Adsorption of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine on Au(111) and HOPG
29
Ales Danhel, Hana Pivonkova, Veronika Raindlova, Michal Hocek,
and Miroslav Fojta
Nitro-Hydrazine DNA Redox Labels in Electroanalysis of Nucleic Acids at m-AgSAE
32
Hana Dejmkova, Barbora Fahnrichova, Jiri Barek, and Jiri Zima
Utilization of Carbon Paste Electrodes for Amperometric Detection in HPLC with
Gradient Elution
37
Vlastimil Dorčák, Veronika Ostatná, and Emil Paleček
Roles of Amino Acid Residues in Peptide-Catalysed Hydrogen Evolution
40
Jan Fischer, Mariya Kyrylenko, Anastasios Economou, and Jiří Barek
Voltammetric Determination of Pesticide Paraquat on Meniscus Modified Silver
Solid Amalgam Electrode
44
Lukáš Fojt and Thomas Doneux
Adsorption and Two–Dimensional Condensation of Cytosine Derivatives at Mercury
and Gold Single Crystal Electrode
47
Miroslav Gál, Lucia Hrnčiariková, Kamil Kerekeš, and Ján Híveš
Electrochemical Synthesis of Ferrates(VI) in Molten NaOH
51
Vladimir Halouzka, Petr Jakubec, Jan Hrbáč, and Libuše Trnková
Carbon Fiber Microelectrodes Modified by Silver for Determination of Hydrogen
Peroxide
56
Luděk Havran, Pavlína Vidláková, Hana Pivoňková, Iva Kejnovská
Electroanalytical Methods – Sensitive Tools for DNA Structure Transitions Analysis
60
Šárka Honsová and Tomáš Navrátil
Continuous Glucose Monitoring by Real Time Sensor in Interstitial Fluid
63
Eva Horáková, Vlastimil Vyskočil, and Jiří Barek
Voltammetric Determination of 4-Nitrobiphenyl at a Mercury Meniscus Modified
Silver Solid Amalgam Electrode
68
Jan Hrbac, Vladimir Halouzka, Petr Jakubec, Libor Kvitek, Vlassis Likodimos,
Athanassios G. Kontos, Kyriakos Papadopoulos, Polycarpos Falaras
Nanostructured Ag films on Silicon Wafers for Electrochemical and SERS Sensing
Deposited by Electrochemical/Electrophoretic Method
73
5
Jana Jaklová Dytrtová, Tomáš Navrátil, Michal Jakl, and Kateřina Nováková
Detection of Thiram Pesticide Using Copper Affinity Electrochemical Separation
Electrospray Ionization Mass Spectrometry
76
Bohdan Josypčuk, Jiří Barek, and Oksana Josypčuk
Flow Electrochemical Biosensors for Measurements at High Negative Potentials
80
Oksana Josypčuk, Jiří Barek, and Bohdan Josypčuk
Construction and Application of Tubular Detector and Porous Flow-through
Detector/Reactor of Silver Solid Amalgam for Electrochemical Measurements in
Flow Systems
84
Tereza Kadlecová, František Opekar, and Petr Tůma
Simplified Pressure-Controlled Sample Introduction into Separation Capillary in
Laboratory-Made Electrophoretic Apparatus
88
Mahmoud Khodari, Ekram Rabie, and Omina Fahmy
Voltammetric Quantification of the Pollutants Nitro Compounds using Glassy Carbon
Electrode
92
Tomáš Křížek, Romana Velvarská, Veronika Doubnerová, Helena Ryšlavá,
and Pavel Coufal
Applications of Capillary Electrophoresis in Enzyme Assays
96
Štěpánka Lachmanová, Magdaléna Hromadová, Lubomír Pospíšil,
and Philippe P. Lainé
Electrochemical Properties of Branched Pyridinium Cations
102
Jana Matějčková, Eva Samcová, and Petr Tůma
Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Damage
105
Jan Mika, Jiří Barek, Jiří Zima, and Hana Dejmková
Determination of Thymol Using Flow Injection Analysis on New Coulometric
Detector with Renewable Working Material Based on Glassy Carbon Microparticles
110
Tomáš Mikysek, Robert Jirásko, Michal Holčapek and Karel Vytřas
Electrochemical Generation of Drug Metabolites
114
Rudolf Navrátil, František Jelen, and Libuše Trnková
Pencil Graphite Electrodes as a Tool for Analysis of Xanthine and 8-Methylxanthine
118
Tomáš Navrátil, Sergey Zakharov, Daniela Pelclová, and Karolina Mrazová
Short Information on Methanol Outbreak in the Czech Republic in the year 2012
123
Kateřina Nováková, Tomáš Navrátil, and Jaromíra Chýlková
Characterization of Electrochemical Behavior of Lecithin-Cholesterol Mixture in
Formation of Model Phospholipid Membranes
128
Jakub Opršal, Renáta Petráňková, Ladislav Novotný, and Miloslav Pouzar
Impact of the Silver Nanoparticles on Carpio Embryos, evaluation of their gradual
agglomeration
132
Petr Orság, Hana Pivoňková, Luděk Havran, Petra Horáková, Eva Šimková,
Miloslava Fojtová, Hana Macíčková-Cahová, Michal Hocek, and Miroslav Fojta
Monitoring of Activities of DNA-Processing Enzymes by Electrochemical Methods
135
Martina Parisová, Tomáš Navrátil, Ivana Šestáková, and Jiří Barek
Characterization of Liposomes Used as Model System of Biological Membranes by
Glassy Carbon Electrode
139
6
Václav Pavlíček and Petr Tůma
Very Fast Electrophoretic Determination of Creatinine and Uric Acid in Human Urine
using a Combination of Two Capillaries with Different Inner Diameters
144
Iveta Pilařová, Zdeňka Balcarová, and Libuše Trnková
Adsorptive Transfer Stripping Voltammetry in DNA and RNA Oligomer Research
149
Medard Plucnara, Petra Ménová, Jana Balintová, Hana Macíčková-Cahová,
Luděk Havran, Michal Hocek, and Miroslav Fojta
Preparation of DNA Probes for Electrochemical Bioassays by Sequence-Specific
Incorporation of a Single or More Redox Labels into a DNA-Strand
154
Petr Pořický
Evaluation of Measured Data – Validation of a New Analytical Method
158
Šárka Ramešová, Romana Sokolová, and Ilaria Degano
Electrochemical Study of Rhamnazin
163
Zdeněk Samec, Jan Langmaier, Eva Samcová, and Petr Tůma
Effect of tetraalkylammonium cations on amperometric detection of heparin at a
polarized water/ionic liquid membrane interface
167
Ernst Dietmar Schachinger, Roland Braidt, and Achim Walter Hassel
Blister Formation on Polymer Coated Galvanised Steel during Immersion in
Oxidizing Alkaline Solutions
172
Barry R. Silver, Karel Holub, and Vladimir Mareček
Ion current enhancement at glass microcapillaries
177
Jozef Sochr, Ľubomír Švorc, Miroslav Rievaj, Dušan Bustin, and Ján Labuda
Electrochemical Determination of Adrenaline in Human Urine by Boron-doped
Diamond Film Electrode
182
Romana Sokolová, Jana Bulíčková, Martina Parisová, Tomáš Navrátil,
and Miroslav Gál
The Adsorption of Phospholipids at the Interface
187
Hanna Sopha, Samo B. Hočevar, and Ivan Švancara
Applicability of Novel Antimony- and Bismuth-Based Electrodes in Advanced
Electroanalysis
191
Matěj Stočes, Iveta Ksandrová, and Ivan Švancara
Determination of Nicotine at a Carbon Paste Electrode Using Square-Wave
Voltammetry
196
Jana Svítková, Ľubomír Švorc, Miroslav Rievaj, Dušan Bustin, and Ján Labuda
Use of New Electrode Materials for Tasks of Food, Clinical and Environmental
Analyzes
201
Ivana Šestáková, Martina Parisová, Kateřina, Nováková, and Tomáš Navrátil
The Influence of Labile Complexes on Cadmium Transport across Artificial
Phospholipid Membrane
206
Jan Špaček, Ece Eksin, Gulsah Congur, Luděk Havran, Petra Horáková,
Arzum Erdem, and Miroslav Fojta
Enzyme-linked Electrochemical Detection of DNA Hybridization at the Surface of
Pencil Graphite Electrode
211
7
Ľubomír Švorc, Miroslav Rievaj, and Dušan Bustin
Sensitive electrochemical determination of selected opiates using a boron-doped
diamond film electrode
214
Markéta Tomášková, Jaromíra Chýlková, Vladimír Jehlička, Tomáš Navrátil,
and Renáta Šelešovská
Direct Voltammetric Determination of Antioxidant Butylated Hydroxyanisol in
Biodiesel
219
Libuše Trnková, Nuria Serrano, and Iveta Pilařová
A New Method of Apparent Protonation Constant Evaluation from Voltammetric
Data
224
Petr Tůma, Václav Pavlíček, Klára Málková, and Eva Samcová
The Use of Large Volume Sample Stacking with Acetonitrile for Determination of
Neurotransmitters by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity
Detection
227
Veronika Vargová, Marko Zivanović,Vlastimil Dorčák, Veronika Ostatná,
and Emil Paleček
Electrocatalysis in Proteins and Polyamino Acids
231
Radim Vespalec
Novel Analytical Subject Matter: Cluster Compounds of Boron
234
Pavlína Vidláková, Jana Balintová, Petra Ménová, Luděk Havran, Michal Hocek,
and Miroslav Fojta
Voltammetric Analysis of DNA Multiply Labeled with Anthraquinone and Nitro Tags
237
Lada Vítová and Radim Vespalec
Electrophoretic Separation of Short Oligonucleotides from their Complexed
Osmates
241
Ryan M. West, Mira Josowicz, and Jiří Janata
Deterministic and Stochastic Analysis of Organic Semiconductor Doping
244
Brigita Zámečníková, Hana Vodičková, Daniela Miholová, Zorka Kotíková,
and Jaromír Lachman
The Use of the Conductometric Method for Indication of Damage Plant Tissues by
Cadmium
248
8
Voltammetric Determination of Herbicide Triasulfuron using Mercury Meniscus
Modified Silver Solid Amalgam Electrode
(Voltametrické stanovení herbicidu triasulfuronu s využitím rtuťovým meniskem
modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrody)
Lenka Bandžuchová a, Renáta Šelešovská a, Jaromíra Chýlková a, and Tomáš Navrátil b
a
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and
Chemical Engineering, Studentská 537, CZ-532 10 Pardubice, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
b
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23
Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Voltammetric behavior of triasulfuron (TS), which belongs to sulfonylurea herbicide family,
was studied using two working electrodes: mercury meniscus modified silver solid amalgam
electrode (m-AgSAE) and hanging mercury drop electrode (HMDE) for comparison. It was
found that TS provided one reduction peak on both used working electrodes. The highest
response was observed in the environment of Britton-Robinson buffer (BR) of pH 3
(m-AgSAE) and 2.5 (HMDE), respectively. Working parameters of differential-pulse
voltammetry (DPV) were optimized and this method was applied in analysis of agricultural
formula and river water.
Key words: Triasulfuron, Mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode,
Voltammetry, Determination, Hanging mercury drop electrode.
Introduction
Triasulfuron (TS, Fig 1.) belongs to the group of sulfonyluera herbicides. These herbicides are
wide-spread used in all over the world in more than 40 countries 1. The main reasons for their
rapid acceptance are very low acute and chronic mammalian toxicity but extremely high
phytotoxicity against weeds, low application rate and broad-spectrum weed control 2, 3. This
type of herbicides acts through an inhibition of the enzyme acetolactate synthase (EC
4.1.3.18), which is a key enzyme in the biosynthesis of branched-chain amino acids (valine,
leucin, isoleucine). The inhibition leads to rapid break cell division and growth 2-4. TS is
commonly used in commercial preparations for protection of barley, oat, wheat or rye 5. TS
degradation in the environment, especially in the soils, was studied in many papers, e.g 6-8.
The papers especially dealt with the influence of types of soil, pH and a depth of soils, a
presence of microorganisms, an application rate of the herbicide or rainfalls 6-8. It was found
that degradation time of TS was longer under laboratory conditions (e.g. 31-44 days for
removing of 50 % TS) than under field conditions (e.g. 12-13 days for degradation of 50 % of
TS) 7 but it is obvious, that TS could stay many days after its application in the environment
and its determination in environment samples is important.
Fig. 1. The chemical structure of triasulfuron.
Voltammetry presents cheap, time saving and sensitive method for determination of various
compounds. Voltammetric methods in connection with solid amalgam made from silver or
another metal have been already successfully utilized in analysis and determination of various
9
bioactive or environmentally important substances 9-12 including various types of pesticides
(e.g. in 13, 14). The voltammetric behavior of herbicide triasulfuron has been examined using
m-AgSAE in the present paper. Various voltammetric techniques were applied for
voltammetric determination of this herbicide. All results were compared with them obtained
on HMDE.
Experimental
All chemicals used for preparation of supporting electrolytes, standard solutions and other
solutions were of p.a. purity. All solutions were prepared in distilled water. The BrittonRobinson buffers (BR) of pH values from 1.8 to 9 were prepared by mixing of the alkaline
component consisting of 0.2 mol L-1 NaOH (Lachema, Brno, Czech Republic) with the acidic
component which consisted of 0.04 mol L-1 H3PO4, 0.04 mol L-1 H3BO3 and 0.04 mol L-1
CH3COOH (all p.a., Lachema, Brno, Czech Republic). 0.04 mol L-1 H2SO4 (pH 1.3) was
prepared by dissolution of an appropriate amount of 96 % H2SO4 (Penta, Czech Republic)
with distilled water. Triasulfuron (Sigma-Aldrich) was dissolved in 50 % acetonitrile (Lachnner, Czech Republic). The solution of 2 mol L-1 KCl was prepared by dissolution of the
appropriate amount of KCl (Lachema, Brno, Czech Republic). Herbicide formula “Logran ®
20WG” with content of TS 200 g/kg was provided by Syngenta (Syngenta Crop Protection
AG, Basel, Swiss). The river water was sampled from the river Elbe in Pardubice, Czech
Republic.
All voltammetric measurements were carried out with the computer controlled Eco-Tribo
Polarograph PC-ETP (Eco Trend Plus, Prague, Czech Republic) which was equipped by
software POLAR.PRO (version 5.1) for Windows XP. All measurements were provided in a
3-electrodes set up, where m-AgSAE or HMDE (both Eco Trend Plus, Prague, Czech
Republic) served as the working electrode, silver/silver chloride/saturated KCl (Ag/AgCl/KCl
(sat.)) as the reference and platinum wire as the auxiliary electrode (both Monokrystaly,
Turnov, Czech Republic). Air oxygen was removed by bubbling with nitrogen (purity class
4.0; Linde, Prague, Czech Republic) for 5 minutes before every analysis. The pH values were
measured by pH-meter Hanna 221 (Hanna Instruments, Inc., USA). Solution of “Logran ® 20
WG” was prepared using ultrasonic bath Bandelin Sonorex (Schalltec GmbH, Germany). All
the measurements were carried out at laboratory temperature.
The working surface of the AgSAE, which was used for preparation of m-AgSAE, was first
abraded with a soft emery paper and then polished using a polishing kit (Electrochemical
Detectors, Turnov, Czech Republic) which consisted of a polishing polyurethane pad, Al2O3
suspension (particle size 1.1 µm) and Al2O3 powder (particle size 0.3 µm). The mercury
meniscus covering the electrode surface was prepared by immersion of the prepared AgSAE
into the pot with liquid mercury. Before the first measurement of the day as well as after
every pause longer than one hour, the electrode surface was electrochemically activated in the
solution of 0.2 mol L-1 KCl by application of the potential -2200 mV for 300 s while stirring.
The parameters of the electrochemical regeneration of the amalgam electrode surface before
each measurement were incorporated directly into the controlling software. Optimum
conditions found for the surface regeneration of m-AgSAE in BR buffer (pH 3) were 30
regeneration cycles between 0 and -1400 mV in cycles (the limiting potentials were kept
constant for 0.3 s in each cycle).
CV (cyclic voltammetry) was used for investigation of dependence between voltammetric
response of TS and pH of supporting electrolyte. DCV (direct current voltammetry) was
utilized for studying the effect of scan rate on voltammetric behavior of TS. DPV (differential
pulse voltammetry) with pulse height of -50 mV, pulse width 80 ms, scan rate (v) 20 mV s-1,
10
initial potential (Ein) 0 mV and final potential (Efin) -1200 mV was used for the rest of
analysis. Other parameters depended on the used working electrode. The potential of
accumulation (Eacc) 0 mV was found to be optimal for m-AgSAE and -400 mV for HMDE.
The applied time of accumulation (tacc) depended on the TS concentration in the analyzed
medium.
Baseline correction method was applied for simplification of the evaluation of TS peak
recorded on m-AgSAE. The studied compound provided one reduction signal at potential
about -1100 mV (vs. Ag/AgCl in BR of pH 3). The peak shape was affected by partly
overlapping signal of the supporting electrolyte decomposition. The limits of decision (CC),
detection (LD) and quantification (LQ) were calculated as described in 11 and the parameters
of calibration curves (e.g., slope, intercept) were calculated using software Excel 2010
(Microsoft, USA).
Results and discussion
The relation between pH of supporting electrolyte and response of TS was examined on both
used working electrodes using CV. It was found that TS (5×10-6 mol L-1 (m-AgSAE) and
1×10-5 mol L-1 TS (HMDE), respectively) provided only one reduction signal in medium of
pH from 1.3 to 6 on m-AgSAE and on HMDE as well. These results coincided with results
presented by Sarigul and Inam in the paper 12, where the voltammetric behavior of TS on
SMDE was studied. The highest current response of TS was registered in BR buffer of pH 3
(m-AgSAE) and 2.5 (HMDE), respectively. The potential of the followed peak shifted
linearly to negative values with increasing value of pH on both used working electrodes.
The effect of scan rate (from 10 to 500 mV s-1) was investigated applying DCV. Different
relations between current response and scan rate, which depended on used working electrode,
were observed. While the Ip of 1×10-5 mol L-1 increased linearly with increasing v on HMDE,
which suggests the adsorption controlled process, Ip of 5×10-6 mol L-1 increased linearly with
v1/2 on m-AgSAE (Fig. 2.), which corresponds to diffusion controlled process.
Fig. 2 Voltammetric response of TS depending on scan rate recorded on m-AgSAE. Method:
DCV; parameters: Ein = 0 Vm, Efin = -1300 mV, v = 10-500 mV s-1, Ereg = -1000 mV,
treg = 30 s; supporting electrolyte: BR of pH 3; c(TS) = 5×10-6 mol L-1. Inset: Dependence of
height of TS peak (Ip) on square root of scan rate (v1/2).
DPV, as a sensitive voltammetric method, was chosen for analysis and determination of TS.
Therefore, the working parameters of this method were optimized. On the beginning,
parameters of electrochemical regeneration of working surface of m-AgSAE were
11
investigated because the working surface of m-AgSAE could not be regularly renewed after
every analysis as a working surface of HMDE. It was found that the regeneration in cycles
with limiting potentials 0 and -1400 mV provided the best results for the regeneration of the
working surface and showed good repeatability of measurements. Obtained relative standard
deviation of 11 repeated measurements (RSDM(11) = 0.5 %) is fully comparable with this
calculated for repeated measurements on HMDE (RSDM(11) = 0.4 %). The potential of
accumulation (Eacc) 0 mV (m-AgSAE) and -400 mV (HMDE), respectively, found to be
optimal. The applied time of accumulation (tacc) depended on the TS concentration in the
analyzed medium.
DPV with found working parameters was applied for repeated determinations of TS in model
solutions. Relative standard deviations of 5 repeated determinations (RSDD(5)) were equal or
lower than 4 % for both used working electrodes, which show high reproducibility of reached
results. Limit of decision (CC(m-AgSAE) = 32 nmol L-1; CC(HMDE) = 1.4 nmol L-1), limit
of detection (LD(m-AgSAE) = 64 nmol L-1; LD(HMDE) = 2.7 nmol L-1) and limit of
quantification (LQ(m-AgSAE) = 97 nmol L-1; LQ(HMDE) = 4.1 nmol L-1) were calculated
using K*Sigma method 15.
The applicability of proposed method was verified by analysis of two types of real samples:
agricultural formula “LOGRAN® 20 WG” and fortified river water. A content of TS in the
agricultural formula was declared by producer as 200 g TS in 1 kg of the preparation. The
content of the herbicide was determined using standard addition method and the
determination was 5 times repeated. Results are summarized in the Table I. River water was
only fortified with particular volume of the standard solution of TS, mixed with BR and
analyzed. The amount of TS was also determined using standard addition method and every
determination was 5 times repeated. Obtained results are shown in the Table I.
Table I.
Results of determination of TS in herbicide preparation “LOGRAN® 20 WG“ and in spiked
river water using m-AgSAE and HMDE.
m-AgSAE
Declared
[g/kg]
LOGRAN
200
Added
[mol L-1]
River
water
*
1×10-5
Found*
[g/kg]
HMDE
RSDD(5)
[%]
205.40±6.95
Found*
[mol L-1]
5.1
RSDD(5)
[%]
(1.02±0.02)×10-5
3.2
Declared
[g/kg]
Found*
[g/kg]
RSDD(5)
[%]
200
203.18±5.32
3.9
Added
[mol L-1]
Found*
[mol L-1]
RSDD(5)
[%]
2×10-7
(1.99±0.06)×10-7
4.3
average of 5 times repeated determinations
Conclusion
Voltammetric behavior of triasulfuron, wide-spread used herbicide from sulfonylurea family,
has been examined using m-AgSAE and HMDE in present paper. It was found that TS
provided one reduction signal on both used working electrodes. Working parameters of DPV
were found for both working electrodes and our proposed method was used for analysis of
model solutions. Both used electrodes showed high sensitivity for determination of TS and
12
they were applied in analysis of two types of real samples with very good results. It can be
concluded, that voltammetric method for determination of TS introduced in this paper can be
considered as effective tool in analysis of triasulfuron.
Acknowledgement
Financial support was provided by The Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech
Republic (project No. CZ.1.07/2.3.00/30.0021 “Strengthening of Research and Development
Teams at the University of Pardubice” and project No. CZ.1.07/2.2.00/15.0353) and by the
GA CR (project No. P208/12/1645).
References
1. http://www2.dupont.com/Phoenix_Heritage/en_US/1975_detail.html, Downloaded 14th
February 2013.
2. Brown H. M.: Pestic. Sci. 29, 263 (1990).
3. Pusino A., Braschi I., Gessa C.: Caly. Clay Miner. 48, 19 (2000).
4. Fahl G. M., Kreft L., Altenburger R., Faust M., Boedecker W., Grimme L. H.: Aquat.
Toxicol. 31, 175 (1995).
5. Biljon J. J. van, Hugo K. J., Iwanzik W.: Appl. Pl. Sci. 2, 49 (1988).
6. Sarmah A. K., Kookana R. S., Alston A. M.: Weed Res. 39, 83 (1999).
7. James T. K., Holland P. T., Rahman A., Lu Y. R. Weed Res. 39, 137 (1999).
8. Sarmah A. K., Kookana R. S., Alston A. M.: Aust. J. Soil Res. 38(3), 617 (2000).
9. Bandžuchová L., Šelešovská R., Navrátil T., Chýlková J.: Electrochim. Acta 56, 2411
(2011).
10. Bandžuchová L., Šelešovská R., Navrátil T., Chýlková J.: Electroanalysis 25, 213 (2013).
11. Jiránek I., Pecková K., Králová Z., Moreira J. C., Barek J.: Electrochim. Acta 54, 1939
(2009).
12. Šelešovská-Fadrná R., Fojta M., Navrátil T., Chýlková J.: Anal. Chim. Acta 582, 344
(2007).
13. Barek J., Fischer J., Navrátil T., Pecková K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19,
2003 (2007).
14. Yosypchuk B., Barek J.: Cr. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009).
15. Miller J. N., Miller J. C.: Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry. Person
Education. Harlow 2005.
16. Sarigul T., Inam R.: Bioelectrochemistry 75, 55 (2009).
13
Voltammetric Behavior of Folates and Related Substances Using Silver Solid Amalgam
Electrode
(Voltametrické chování folátů a látek souvisejících s využitím stříbrné pevné
amalgámové elektrody)
a
Lenka Bandžuchová , Renáta Šelešovská a, Tomáš Navrátil b, and Jaromíra Chýlková b
a
Institute of Environmental and Chemical Engineering, University of Pardubice, Studentská
573, 532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23
Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
The possibility of application of silver solid amalgam electrode in voltammetric analysis of
compounds with folate structure (folic acid, methotrexate, leucovorin) and substances, which
play an important role in its metabolism (riboflavin, hydroxocobalamin) has been
investigated. Cyclic voltammetry, DC voltammetry and Elimination voltammetry with linear
scan has been used for study of voltammetric behavior of mentioned substances and for
elucidation of electrochemical reactions. Differential pulse voltammetry has been applied for
development of sensitive methods of determination for investigated electroactive compounds.
The proposed methods were successfully applied for real samples analysis. Obtained results
have been compared with those achieved using HMDE.
Key words: Silver solid amalgam electrode, Folic acid, methotrexate, Leucovorin,
Riboflavin, Hydroxocobalamin
Úvod
Foláty jsou biologicky aktivní látky odvozené od kyseliny listové (FA). Jejich strukturním
základem je 6-methylpterin navázaný přes 4-aminobenzoovou kyselinu na několik zbytků
glutamové kyseliny γ-peptidovou vazbou. FA patří do skupiny ve vodě rozpustných vitamínů
B (B9). Struktura nejjednodušší formy kyseliny listové je uvedena na Obr. 1. Nejčastěji
obsahuje 2-7 zbytků kyseliny glutamové. FA, resp. foláty jsou v organismu enzymaticky
transformovány na tetrahydrofoláty (THF), které patří mezi přenašeče jednouhlíkových (C1)
zbytků. THF jsou schopny přenášet uhlík v různých oxidačních stupních a proto jsou na rozdíl
od jiných přenašečů považovány za univerzální 1. FA a foláty hrají klíčovou roli
v metabolismu aminokyselin, při syntéze nukleových kyselin (NK), při dělení a syntéze buněk
a při tvorbě červených krvinek. Hlavním projevem nedostatku FA je megaloblastická anémie,
při které je narušena produkce červených krvinek a objevuje se nadbytek megaloblastů 2.
Obr. 1. Struktura kyseliny listové.
Leukovorin (LV) patří do skupiny redukovaných metabolitů kyseliny listové – THF. Má
široké uplatnění v současné medicíně. Může být aplikován samostatně při léčbě
megaloblastické anemie s prokázaným deficitem FA nebo v kombinaci s protinádorovými
léčivy, jejichž cytostatický účinek buď zvyšuje (5-fluorouracil) nebo naopak působí jako
jejich antidotum (metotrexát) 3. Metotrexát (MTX) je vzhledem ke svým účinkům
14
v organismu řazen do skupiny látek označovaných jako antifoláty. Od kyseliny listové se liší
pouze v methylové skupině navázané na aminoskupinu 4-aminobenzoové kyseliny (N(10)) a
nahrazením hydroxyskupiny aminoskupinou na C(4) pyridinového kruhu. Vzhledem
k obdobné struktuře je MTX schopen inhibovat celý metabolismus FA. Tento mechanismus je
využíván při léčbě psoriázy, revmatoidní artritidy, Crohnovy choroby, zhoubných nádorů
buněk imunitního systému, nádorů vznikající v děloze v příčinné souvislosti s těhotenstvím
nebo maligních kostních nádorů 3,4. MTX je ve srovnání s ostatními antitumorózními léčivy
méně toxický. Navíc je to jediné cytostatikum, které má antagonistu – LV.
Kobalaminy jsou komplexní sloučeniny se 4 pyrolovými jádry, které svírají jeden atom
kobaltu. Stejně jako foláty patří do skupiny ve vodě rozpustných vitamínů B (B12). Jako
hlavní funkce tohoto vitamínu je uváděn jeho antiperniciózní účinek (tzn. předcházení vzniku
megaloblastické anémie), je kofaktorem syntézy NK, podílí se na krvetvorbě, na syntéze
myelinu a nukleoproteinů. Při porovnání účinků kobalaminů a folátů na lidský organismus je
zřejmé, že reakce poskytované těmito látkami spolu souvisí a ovlivňují se. Dietou jsou
přijímány především hydroxokobalamin (OH-B12) a kyanokobalamin (CN-B12). V posledních
letech je OH-B12 využíváno jako antidota při otravách kyanidy 5,6. Riboflavin (RF) patří stejně
jako foláty a kobalaminy mezi ve vodě rozpustné vitamíny B (B2). Základem RF je
heterocyklické isoalloxazinové jádro, na které je připojen alkohol ribitol. Většina RF je
v organismu ve formě FAD (flavinadenindinukletid), v menší míře jako FMN
(flavinmononukletid). Základními funkcemi RF jsou transport aktivovaných vodíků
v citrátovém cyklu, účast na metabolismu aminokyselin, sacharidů a purinů, integrita buněčné
membrány a erytrocytů nebo působení v antioxidační ochraně organismu. Zmíněné kofaktory
se podílejí i na enzymaticky katalyzovaná reakci 5,10-methylen THF na 5-methyl THF. Mezi
projevy deficitu RF patří: záněty spojivek, sklon k zánětům epitelu na přechodu kůže do
sliznice a nervové poruchy. Ve vyspělých zemích je nedostatek RF velmi vzácný.
Vzhledem ke své biologické aktivitě a hojnému využití v lékařství je problematika stanovení
FA, LV, MTX, RF a OH-B12 velmi důležitá. Tato práce je zaměřena na studium
voltametrického chování těchto látek a návrh vhodných voltametrických metod stanovení
s využitím rtuťovým meniskem modifikované (m-AgSAE) a leštěné stříbrné pevné
amalgámové elektrody (p-AgSAE). Amalgámové elektrody kombinují výhody rtuťových
a pevných pracovních elektrod. Jejich velkou výhodou je vysoké vodíkové přepětí srovnatelné
s HMDE, vysoká citlivost pro stanovení redukovatelných látek, možnost elektrochemické
regenerace povrchu elektrody, jednoduchá příprava před měřením a v neposlední řadě
i netoxický elektrodový materiál, neomezená doba životnosti nebo dobrá mechanická
odolnost apod. V minulosti již byly tyto elektrody s různě modifikovaným povrchem použity
pro stanovení řady anorganických 7,8 i organických látek 9,10, v analýze peptidů 11 nebo DNA
12-14
.
Experimentální část
Pro voltametrická měření byl požit Eco-Tribo Polarograf PC ETP (EcoTrend Plus, Praha, ČR)
se software Polar 5.1. Analýzy probíhaly v tříelektrodovém zapojení při teplotě 23±2°C. Jako
měrné elektrody sloužily HMDE s povrchem kapky 0,73 mm2, m-AgSAE s pracovním
povrchem 0,39 mm2 a p-AgSAE s pracovní plochou 0,28 mm2 (všechny od EcoTrend Plus
s.r.o., Praha, ČR). Jako referentní sloužila nasycená argentchloridová elektroda
(Ag/AgCl/KCl(satur.)) a jako pomocná platinový drátek (obě od firmy Monokrystaly s.r.o.,
Turnov, ČR). Kritická úroveň (LC), limit detekce (LD) a mez stanovitelnosti (LQ) byly
počítány metodou 3*Sigma (ACS) 15 pomocí software QC Expert v. 2.5 (Trilobyte, ČR).
Parametry kalibračních přímek byly získány pomocí MS Excel 2010 (Microsoft, USA).
15
Všechny chemikálie použité pro přípravu standardních roztoků a základních elektrolytů byly
čistoty p.a. (Lachema, Brno, ČR). Jako základní elektrolyt byly používány roztoky 0,05M
acetátového pufru o pH 5 nebo roztoky Britton-Robinsonova (B-R) pufru o různém pH.
Přehled základních elektrolytů vhodných pro stanovení jednotlivých látek je uveden v tabulce
I. Roztoky LV, OH-B12 a RF (Sigma Aldrich) byly připravovány rozpuštěním v destilované
vodě. Vzhledem k lepší rozpustnosti v alkalickém prostředí byly roztoky FA (Sigma Aldrich)
a MTX (Sigma Aldrich) připravovány rozpuštěním v 0,01M NaOH (Lachema, Brno, ČR).
Pro studium závislosti proudové odezvy na pH byla využita CV (počáteční potenciál
Ein = 200 mV, potenciál obratu Efin = -1400 mV, rychlost polarizace v = 100 mV∙s-1)
V případě LV byl nejprve proveden záznam ve směru anodickém a poté byla sledována
zpětná redukce. Pro studium závislosti voltametrické odezvy na rychlosti polarizace byla
použita DCV. Pro objasnění řídících dějů jednotlivých elektrodových reakcí byla využita
EVLS. Pro stanovení daných látek byla optimalizována DPV (v = 20 mV∙s-1, výška pulzu: -50
mV a šířka pulzu: 80 ms.), která byla kombinována s AdSV. Nalezené optimální Ein a Eacc pro
stanovení jednotlivých látek jsou pro všechny tři pracovní elektrody shrnuty v tabulce II.
Optimální parametry regenerace pracovního povrchu amalgámových elektrod byly rovněž
zjištěny experimentálně a jsou uvedeny v tabulce III.
Tabulka I.
Složení základních elektrolytů pro voltametrické stanovení jednotlivých látek.
p-AgSAE
m-AgSAE
HMDE
FA
acetátový pufr (pH 5)
acetátový pufr (pH 5)
B-R pufr (pH 8)
+ methanol (9:1)
LV
acetátový pufr (pH 5)
B-R pufr (pH 4)
acetátový pufr (pH 5)
MTX
acetátový pufr (pH 5)
B-R pufr (pH 5)
B-R pufr (pH 8)
OH-B12 B-R pufr (pH 6)
acetátový pufr (pH 5)
B-R pufr (pH 6)
RF
B-R pufr (pH 3)
acetátový pufr (pH 5)
acetátový pufr (pH 5)
Tabulka II.
Optimální hodnoty Ein a Eacc pro jednotlivé látky a použité pracovní elektrody.
Ein [mV]
Eacc [mV]
p-AgSAE m-AgSAE HMDE
p-AgSAE m-AgSAE HMDE
FA
0
-200
-200
0
-200
-200
LV
0
0
0
200
200
200
MTX
0
0
0
0
0
0
OH-B12
-400
-400
-400
-1200
-400
-400
RF
300
100
100
0
100
-100
Tabulka III.
Parametry regenerace povrchu p-AgSAE a m-AgSAE pro jednotlivé analyty.
p-AgSAE
m-AgSAE
cykly treg1
treg2 Ereg1
Ereg2
cykly treg1 treg2
Ereg1
FA
30
0,3
0,3
0
-2000 30
0,3
0,3
0
LV
30
0,3
0,3
0
-1000
1
30
---1000
MTX
30
0,3
0,3
0
-1600
1
30
---1600
OH-B12
1
20
--- -1800
--30
0,3
0,3
0
RF
1
30
--- -2000
--30
0,3
0,3
0
Výsledky a diskuse
16
Ereg2
-1200
-----1400
-1500
Voltametrické chování zmíněných látek bylo studováno s využitím p-AgSAE, m-AgSAE a
HMDE. Nejprve byl testován vliv pH prostředí na proudové odezvy jednotlivých látek
metodou CV. Bylo zjištěno, že FA a strukturně obdobný MTX poskytují v kyselém prostředí
na HMDE a m-AgSAE 3 katodické a 1 anodický signál. Na p-AgSAE byly pouze 2 katodické
a 1 anodická odezva. V alkalickém prostředí byl naměřen pouze 1 katodický a 1 anodický pík
na všech pracovních elektrodách. Pro další analýzy byl pro obě varianty AgSAE vybrán
redukční pík 1 poskytovaný FA i MTX (Ep = -400 mV) a prostředí o pH 5. Pro rtuťovou
pracovní elektrodu byl zvolen roztok B-R pufr o pH 8. V případě LV byly zaznamenány na
obou modifikacích AgSAE 2 redukční signály po předcházející oxidaci. Pro stanovení byl
zvolen acetátový pufr o pH 5 (p-AgSAE, HMDE) resp. B-R pufru o pH 4 (m-AgSAE), ve
kterém byl redukční pík 1 oxidovaného LV největší. Kyselé prostředí bylo vhodné i pro
analýzy OH-B12 a RF, kde byl zaznamenán nejvyšší katodický pík. Obě látky poskytovaly
pouze 1 katodický. RF navíc poskytoval i jeden oxidační pík.
Dalším sledovaným parametrem byla rychlost polarizace s využitím DCV. Ze získaných
výsledků byly určeny řídící děje probíhajících elektrodových reakcí. Získaná data byla
porovnána s výstupy z EVLS. Pro nejednoznačnost výsledků byla pro LV a RF vyhodnocena i
závislost log(Ip) na log(v). Výsledkem bylo, že všechny sledované redukční reakce probíhaly
úplně nebo částečně v adsorbovaném stavu, takže bylo možné zvýšit citlivost stanovení všech
zmíněných látek zařazením akumulačního kroku (tab. II).
Navržené metody pro stanovení jednotlivých látek byly ověřovány na modelových roztocích.
Získané výsledky se vždy velice dobře shodovaly s přidaným množstvím analyzovaných
látek. Z 5-ti opakovaných stanovení jednotlivých látek při různých koncentracích byly
spočítány relativní směrodatné odchylky, které se pohybovaly pod 5% hranicí pro všechny
použité pracovní elektrody. Pro všechny látky byly také vypočteny některé chemometrické
parametry, z nichž lze usuzovat na citlivost optimalizovaných metod (tabulka IV). Získané
LD pro amalgámové elektrody jsou i přes menší pracovní povrch srovnatelné (MTX a OHB12) a v případě LV dokonce nižší než LD dosažené s využitím HMDE. Pouze pro stanovení
kyseliny listové a riboflavinu byla použitá rtuťová elektroda výrazně citlivější než m-AgSAE
a p-AgSAE.
Tabulka IV.
Statistické parametry pro navržené metody stanovení jednotlivých látek 15-20.
p-AgSAE
m-AgSAE
HMDE
LC
LD
LQ
LC
LD
LQ
LC
LD
LQ
nmol/l nmol/l nmol/l nmol/l nmol/l nmol/l nmol/l nmol/l nmol/l
FA
0,29
0,57
0,86
0,10
0,27
0,78 0,019 0,036 0,054
LV
25,00 50,00 75,00 11,00 22,00 33,00 409,00 980,00 1500,0
MTX
0,04
0,08
0,11
0,12
0,25
0,37
0,23
0,44
0,64
OH-B12
1,10
3,30
6,5
0,70
1,50
2,20
1,20
2,40
3,6
RF
1,20
1,30
3,60
0,52
0,76
0,93
0,15
0,31
0,46
Možnosti aplikace navržených metod byly ověřeny na reálných vzorcích. FA, RF a OH-B12
byly stanoveny s velmi dobrými výsledky ve vitamínových preparátech. Obsah FA byl navíc
stanoven i v multivitamínových džusech. Z analýzy multivitamínového přípravku s obsahem
FA i RF je zřejmé, že po vhodné úpravě vzorku je možné správně stanovit oba přítomné
vitamíny a jejich stanovení není navzájem ovlivněno. LV a MTX byly úspěšně stanoveny
v léčivech.
17
Závěr
Vzhledem k obsahu kapalné rtuti a vzniku odpadů s tímto toxickým kovem při práci s HMDE
je důležité stále hledat nové elektrodové materiály, které nebudou nadále rizikem pro životní
prostředí. Z dosažených výsledků je zřejmé, že testované pracovní elektrody z netoxického
stříbrného amalgámu mohou konkurovat nebo úplně nahradit rtuťové elektrody v analýze
vybraných bioaktivních molekul.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy prostřednictvím
projektů č. CZ.1.07/2.3.00/30.0021 a č. CZ.1.07/2.2.00/15.0353 a Grantové agentury ČR
(projekt GAČR P208/12/1645).
Literatura
1. Voet D., Voetová J. G.: Biochemie. Victoria Publishing, Praha 1994.
2. Vávrová J., Pechová A., Wilhelm Z., Kazda A., Friedecký B., Jabor A.: Vitamíny a
stopové prvky 2007, Česká společnost klinické biochemie ČLS JEP, Pardubice 2007.
3. Martínková J., Chládak J., Mičuda S., Chládková J.: Farmakologie – Pro studenty
zdravotnických oborů. Grada Publishing, Praha 2007.
4. www.sukl.cz/download/pil/PI108557.doc, Downloaded 27th December 2011.
5. Hall A. H., Dart R., Bogdan G.: Ann. Emerg. Med. 49, 806 (2007).
6. Borron S. W., Baud F. J., Mégarbane B., Bismuth C.: Am. J. Emerg. Med. 25, 551 (2007).
7. Yosypchuk B., Novotný L.: Chem. Listy 96, 756, 2002.
8. Fadrná R.: Anal. Lett. 37, 3251 (2005).
9. Barek J., Fischer J., Navrátil T., Pecková K., Yosypchuk B.: Sensors 6, 445 (2006).
10. Šelešovská-Fadrná R., Navrátil T., Vlček M.: Chem. Anal. (Warsaw) 52, 911 (2007).
11. Šelešovská-Fadrná R., Fojta M., Navrátil T., Chýlková J.: Anal. Chim. Acta 582, 344
(2007).
12. Fadrná R., Yosypchuk B., Fojta M., Navrátil T., Novotný L.: Anal. Lett. 37, 65 (2004).
13. Fadrná R. Cahová-Kuchaříková K., Havran L., Yosypchuk B., Fojta M.: Electroanalysis
17, 452 (2005).
14. Yosypchuk B., Fojta M., Havran L., Heyrovský M., Paleček E.: Electroanalysis 18, 186
(2006).
15. Bandžuchová L., Šelešovská R., Navrátil T., Chýlková J.: Electrochimica Acta 56, 2411
(2011).
16. Bandžuchová L., Šelešovská R.: Acta Chim. Slov. 58, 776 (2011).
17. Šelešovská R., Bandžuchová L., Navrátil T.: Electroanalysis 23, 177 (2011).
18. Šelešovská R., Bandžuchová L., Navrátil T., Chýlková J.: Electrochimica Acta 60, 375
(2012).
19. Bandžuchová L., Šelešovská R., Navrátil T., Chýlková J., Novotný L.: Electrochimica
Acta 75, 316 (2012).
20. Bandžuchová L., Šelešovská R., Navrátil T., Chýlková J.: Electroanalysis 25, 213 (2013).
18
Novel Electrochemical Assay for MicroRNA Detection Using Electroactive Complex of
Six-Valent Osmium and Magnetic Beads
Martin Bartošík a,b, Mojmír Trefulka a, and Emil Paleček a,b
a
Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic
b
Masaryk Memorial Cancer Institute, Žlutý kopec 7, 656 53 Brno, Czech Republic,
E-mail: [email protected], [email protected]
Abstract
microRNAs (miRNAs) are short non-coding RNAs capable of regulating gene expression by
binding to mRNAs. It was shown that altered expression levels of specific microRNAs
(miRNAs) were observed in certain cancer cells, and thus their detection is of great
importance. Here we present simple and specific assay for electrochemical detection of
miRNA by using electroactive complex composed of osmium(VI) and nitrogenous ligand,
such as bipyridine, which specifically binds to the 3’-end of the RNA. By combining labeling
step with a magnetic beads-based hybridization procedure, we were able to specifically
determine microRNA at subnanomolar concentrations.
Key words: microRNA, Hybridization, Electrochemical detection, Mercury and solid
amalgam electrodes, Regulation of gene expression, Electroactive labeling, Osmium,
Bipyridine.
Introduction
One of the main goals of current research in cancer diagnostics is to develop sensitive, fast
and inexpensive methods for biomarkers detection. One of these biomarkers could be
microRNAs (miRNAs), i.e. short noncoding RNA molecules (20 – 25 nucleotides) regulating
gene expression by binding to mRNA and thus blocking protein synthesis 1. Cancer cells often
exhibit altered expression levels of various miRNAs – lower levels may lead to
overexpression of oncogenes, while higher levels block synthesis of tumor suppressors 2.
These findings had a great impact on quick development of different techniques for detection
of specific miRNA sequences, relying in most cases on hybridization between the miRNA
and a complementary DNA oligonucleotide (cODN), followed by an end-point (usually
optical) detection of the created duplex. In the early days, miRNAs were mostly analyzed
using Northern blotting, and later with microarrays with optical detection. These are standard
robust methods, however they are still rather laborious and/or expensive 3, 4. Fast, inexpensive
and relatively simple bioassays for miRNA detection might be attainable using
electrochemical (EC) end-point detection. The method is also amenable for microarray
construction because electrodes are easily miniaturized. It was therefore only a matter of time
before first papers started to appear 5-7.
Here we report a sensitive assay for EC detection of specific miRNA. For this purpose, we
utilized an electroactive six-valent osmium in complex with nitrogenous ligand,
2,2’-bipyridine (bipy), shortly Os(VI)bipy, which specifically binds to diol groups, including
3’-end of a ribose in RNA. The specificity of the assay was achieved by hybridizing the target
miRNA with the cODN attached to the magnetic beads. We also show that miRNA can be
determined down to picomolar concentrations due to an electrocatalytic nature of a resulting
EC signal at hanging mercury drop electrode (HMDE). Besides HMDE, solid amalgam
electrodes (SAEs) can also be applied as detection platforms, making this assay attractive for
point-of-care applications.
19
Experimental
Used material: potassium osmate dihydrate, pyridine (py) and 2,2´-bipyridine (bipy) from
Sigma (USA). Oligodeoxynucleotides (ODNs) and miRNA-2115 (5’- AGC UUC CAU GAC
UCC UGA UGG A -3’) synthesized in VBC Biotech GmbH (Austria). Centrifugal filters for
purification (Millipore, USA), magnet and magnetic beads (MB) covered with oligo(dT)25 for
hybridization procedure (Life Technologies, USA); other chemicals of analytical grade, all
aqueous solutions prepared from deionized water.
Modification of miRNA with electroactive complex Os(VI)bipy was performed via ligand
exchange: incubation of miRNA with 1 mM Os(VI)py for 10 min at 20 °C, followed by
addition of 2 mM bipy and further incubation for 10 min at 20 °C. Adducts were purified by
centrifugation through membrane to remove free Os(VI)bipy.
During a hybridization procedure, magnetic beads covered with oligo(dT) 25 were hybridized
with adenine tail at the end of a capture probe, creating a duplex. Then the labeled miRNA
was added, hybridizing with a complementary part of the capture probe, forming a sandwich
with the miRNA being the third, outer component. After both hybridizations, thorough
washing was necessary to remove any unbound Os(VI)bipy which would otherwise contribute
to the resulting signal. The miRNA and the capture probe were finally released from the
magnetic beads by short heating and transferred into the background electrolyte for EC
measurement.
Measurements were carried out with Autolab with VA-Stand 663 (both Metrohm Autolab,
Switzerland). HMDE, mercury meniscus-modified solid amalgam electrode (m-SAE) and
pyrolytic graphite electrode (PGE) were working electrodes, Ag/AgCl/3M KCl was reference
electrode and platinum wire was an auxiliary electrode. Differential pulse voltammetry (DPV)
was applied at HMDE and square wave voltammetry (SWV) at PGE. Background electrolyte
was degassed before each measurement by a stream of argon.
Results and discussion
We have previously shown that Os(VI)bipy is specific towards oligodeoxynucleotide
containing a ribose residue at the 3’-end of the molecule, demonstrated by well-developed
voltammetric peaks at PGE and HMDE 8. This contrasted with a negligible response from the
oligodeoxynucleotide having no ribose residue. Based on these findings, we applied
Os(VI)bipy also to modify actual miRNA and reached similar results. At PGE, oxidation
peaks of miRNA-Os(VI)bipy adduct (peaks α and β) were obtained, with peak potentials (EP)
of ~ −0.1 V and ~ −0.5 V for α and β, respectively (Fig. 1C). When the same Os(VI)bipymodified miRNA was adsorbed at the HMDE, we observed single, well-resolved peak at ~
−1.2 V (Fig. 1B), which increased with decreasing pH, suggesting that it could be due to a
catalytic hydrogen evolution reaction. As a negative control we also used an
oligodeoxynucleotide having the same length and sequence as miRNA-2115 (except that it
contained deoxyribose and thymine), and in agreement with the reaction scheme shown in
Fig. 1A, modification of deoxyribose at the 3’-end of the oligonucleotide did not proceed as
indicated by the absence of oxidation peaks at the PGE and electrocatalytic peak at the
HMDE (Fig. 1B-C). To ensure that the resulting signal did not arise from unreacted
Os(VI)bipy reagent, it was necessary to remove it after a modification step by centrifuging the
sample solution through a membrane with a proper cutoff limit (3 kDa). Measurement with
only a free Os(VI)bipy (i.e. no miRNA) after the purification step did not lead to any peak,
suggesting its sufficient removal.
20
Fig. 1. (A) Simplified scheme of 3’-end modification of RNA with an electroactive Os(VI)L
complex. (B-C) Voltammograms of (a) Os(VI)bipy-modified miRNA-2115, (b) Os(VI)bipymodified ODN, (c) unmodified miRNA-2115 and (d) free Os(VI)bipy. All samples were
purified by centrifuging through proper-sized membrane. (B) HMDE. Concentration of
miRNA-2115 and ODN was 10 nM. Background electrolyte: Britton-Robinson buffer, pH
4.5. AdS DPV: accumulation time, tA 60 s (with stirring), accumulation potential, EA −0.7 V.
(C) PGE. Concentration of miRNA and ODN was 2 µM. 0.2 M acetate buffer, pH 5.0. SWV:
tA 60 s, EA OCP, frequency 500 Hz, baseline corrected.
Due to the catalytic nature of a voltammetric peak at the HMDE, depicted concentration of
Os(VI)bipy-modified miRNA-2115 (10 nM; Fig. 1B) could be substantially lowered.
Concentrations of 500 pM and 250 pM were still easily distinguishable from the background,
without a need for baseline correction. The concentration range span three orders of
magnitude, from about 80 nM down to 150 pM (Fig. 2). At about 20 nM concentration, no
more increase in peak height was observed with increasing concentration, perhaps due to a
saturation of the electrode surface. Besides conventional adsorptive stripping voltammetry
used above, we have also applied adsorptive transfer stripping (AdTS) technique9 (ex situ)
from 5 µl drop and in that way detected 2.5 nM modified miRNA-2115; this concentration
corresponds to only 12.5 fmol of miRNA. AdTS voltammetric peaks (as compared to AdS)
are generally lower because the sample is adsorbed from a quiescent solution (unstirred drop),
and so the mass transfer equation does not include a contribution from the convection part
(i.e. forced convection). This can be usually adjusted by increasing accumulation time.
21
Fig. 2. (A) Dependence of peak current on concentration of Os(VI)bipy-modified miRNA2115 at HMDE. Measurement was performed in situ. Other conditions as in Fig. 1B. Inset:
Peaks of (a) 500 pM Os(VI)bipy-modified miRNA-2115 (thin solid) with the error bar
showing the RSD from four independent measurements (~ 7 %) and (b) 2.5 nM Os(VI)bipymodified miRNA-2115 (bold solid) after the adsorption from 5 µl drop and transfer into a
blank electrolyte. No baseline correction needed. Britton-Robinson buffer, pH 4.5 (dashed).
Next logical step in our work was to “capture” miRNA with a desired sequence, otherwise the
protocol would not be very useful. For this purpose, we employed (i) cODN specifically
designed to hybridize with the miRNA-2115 and (ii) magnetic beads for removal of
interfering species (see Experimental for details). Fig. 3 shows the electrocatalytic peak of
Os(VI)bipy-labeled miRNA-2115 when the complementary capture probe was used (curve a),
while no peak was obtained when using noncomplementary capture probe (curve b),
suggesting that the hybridization did not occur under these conditions; if any nonspecifically
bound molecules were attached to the magnetic beads, they were removed during the washing
step. When working with magnetic beads, we have used unpurified samples (no membranebased purification required), which saves time. However, we had to perform another control
experiment containing only free Os(VI)bipy (i.e. no miRNA) to make sure that washing step
after hybridization is sufficient for its removal (curve c). Indeed, free Os(VI)bipy yielded only
negligible response in this case.
Our results indicate that the HMDE is well-suited for a highly sensitive determination of
Os(VI)bipy-labeled miRNAs. Despite the advantages of liquid mercury electrodes (e.g.
excellent reproducibility, atomically smooth surface or highly cathodic potential window),
their possible use in sensors is rather inconvenient. We have thus carried out our EC assay
also in combination with m-SAE (Fig. 3, inset), which possesses similar properties like
HMDE but is more suitable for sensor applications. Our results obtained with m-SAE are
similar as with HMDE in Fig. 3, although higher concentrations of miRNAs were necessary
for analysis due to a lower sensitivity of the m-SAE surface. Nevertheless, we were still able
to easily distinguish nM concentrations of complementary and noncomplementary target
miRNAs using the hybridization protocol.
22
Fig. 3. Detection of miRNA-2115 using magnetic beads-based protocol and DPV at HMDE
and m-SAE. miRNA-2115 hybridized with (a) complementary cODN and (b)
noncomplementary ODN; (c) negative control without any miRNA-2115 (only free
Os(VI)bipy reagent); concentrations at HMDE: 100 nM, m-SAE: 200 nM.
Conclusion
In this work we show that 3'-end of miRNA is labeled with electroactive Os(VI)bipy and that
this adduct produces peaks at HMDE, m-SAE as well as PGE. When the labeling step is
combined with hybridization protocol and magnetic beads, miRNA with specific sequence
(complementary to the cODN) can be detected. Further experiments will be focused on
optimization of the protocol for its application to detection of real miRNA isolated from
human cancer cells.
Acknowledgment
This work was supported by a grant from RECAMO CZ.1.05/2.1.00/03.0101, GACR
P301/11/2055 and by institutional research plan AV0Z50040702.
Literature
1. Bartel D. P.: Cell 136, 215 (2009).
2. Iorio M. V., Croce C. M.: Carcinogenesis 33, 1126 (2012).
3. Cissell K. A., Deo S. K.: Anal. Bioanal. Chem. 394, 1109 (2009).
4. Hunt E. A., Goulding A. M., Deo S. K.: Anal. Biochem. 387, 1 (2009).
5. Gao Z. Q., Yu Y. H.: Biosens. Bioelectron. 22, 933 (2007).
6. Kilic T., Topkaya S. N., Ariksoysal D. O., Ozsoz M., Ballar P., Erac Y., Gozen O.:
Biosens. Bioelectron. 38, 195 (2012).
7. Pohlmann C., Sprinzl M.: Anal. Chem. 82, 4434 (2010).
8. Trefulka M., Bartosik M., Palecek E.: Electrochem. Commun. 12, 1760 (2010).
9. Palecek E., Bartosik M.: Chem. Rev. 112, 3427 (2012).
23
Electrochemistry of Selected Bile Acids and Phytosterols at Bare Electrodes
Lenka Benešová a, Jan Klouda a, Adéla Patáková a, Kateřina Pišnová a, Karel Nesměrák a,
Jiří Barek a,b, and Karolina Pecková a,b
a
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 128 43, Prague 2
b
Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre
"Supramolecular Chemistry", Department of Analytical Chemistry, Albertov 6, 128 43,
Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
In electrochemistry-related research bile acids and phytosterols do not belong among
frequently studied compounds, because they are inactive under variety of conditions and
electrode materials. In this contribution, several examples of their redox activity including
electrochemical reduction of bile acids at mercury and silver solid amalgam electrodes and
electrochemical oxidation of phytosterols and bile acids at platinum, glassy carbon and borondoped diamond electrodes in non-aqueous media are presented.
Key words: Bile Acids, Boron doped diamond electrode, Mercury electrodes, Phytosterols,
Silver solid amalgam electrode, Supramolecular assemblies.
Introduction
The bile acids occurring in humans are mostly hydroxylated derivatives of the steroid-5cholan-24-oic acids. In the form of their conjugates they are amphipathic end products of
cholesterol metabolism with multiple physiological functions, mainly in digestion and
absorption of fats. Cholesterol is a C27 sterol with a double bond at C5 and an isooctane C8
side chain. Bile acids possess the C3 hydroxy group of cholesterol and a C7 hydroxy or oxo
group, because the rate limiting step in their biosynthesis from cholesterol is cholesterol 7 hydroxylase 1. The last hydroxyl functionality may appear at C12. Chemical structures of
cholesterol and common bile acids are shown in Fig. 1. The most abundant bile acids in
human bile are chenodeoxycholic acid (45%) and cholic acid (31%).
Bile acid anions are surface-active molecules due to their amphipathic character – they have a
hydrophobic side (the  face of the bile acid molecule) containing no substituents and a
hydrophilic side (the  face) containing the hydroxy groups. Bile acid anions self-associate
over a fairly narrow concentration range to form micelles. The critical micellization
concentration (CMC) in aqueous media of C24 bile acids has been intensively studied 2. The
values range from 9 mmol L−1 (chenodeoxycholic acid) to 60 mmol L−1 (ursocholic acid) in
water at 25 °C. Depending on their structure and pH values, the bile acids and their conjugates
are in ionic/protonized form. Bile acid dissociation constants are independent of the
substituents in the steroid nucleus, since inductive effects of the hydroxyl groups on the
steroid nucleus are too distant from the acidic group at the end of the side chain to influence
its ionization, nevertheless, they are influenced by derivatization of the carboxyl group at the
C24. While for unconjugated bile acids the pKa values are 5.0±0.1, the amidation of bile acids
with glycine lowers the pKa value to 3.9±0.1 because of the proximity of the amide bond to
the terminal carboxyl group 3. The conjugation with taurine leads to substantial incerase in
acidity, e.g. the sulfo group of TUDCA has the pKa value of 1.5, and it is negatively charged
in wide range pH values under physiological conditions.
The other important class of compounds derived from cholesterol includes the plant sterols −
phytosterols. Their chemical structure differs from that of cholesterol by the presence of
modified side chains at carbon C24 and they are metabolized differently, so that mammals are
24
not capable of their synthesizing. Phytosterols and their esters are used clinically to reduce
low density lipoprotein cholesterol and atherosclerotic risk 4.
The complex composition of naturally occuring steroid compounds and the small structural
differences between individual components demand a “fit for purpose” analytical technique.
The common techniques for the assay of these compounds in biological and physiological
matrices include mainly chromatographic procedures, but also electrophoretic, enzymatic, and
immunological methods as summarized in several reviews 5-7. The arched skeleton of bile
acids with about ten chiral carbons and multiple hydrogen-bonding groups makes these
compounds ideal for intermediate assemblies which relate to supramolecular properties, such
as hostguest, inclusion, reaction, chirality, recognition, dynamics, information, and so on 8, 9.
(A)
Bile acid
(B)
A ring
B ring
C ring
Cholic
3OH
7H
Chenodeoxycholic
3OH
7H
Deoxycholic
3OH
Ursodeoxycholic
3OH
7H
Ursocholic
3OH
7H
Lithocholic
3OH
Glycocholic
3OH
7H
Tauroursodeoxycholic
3OH
7H
Fig. 1. Chemical structure of steroid skeleton (A) and
cholesterol (B).
12OH
12OH
12OH
12OH
12OH
selected
D ring
17C(CH3) CH2 CH2COR
R=OH
R=OH
R=OH
R=OH
R=OH
R=OH
R= NHCH2COOH
R=NHCH2 CH2SO3H
bile acids (in the table), and
The redox activity of bile acids and phytosterols is rather limited. For oxidation it relies on the
oxidation of the hydroxyl groups at the bile acid / phytosterol skeleton. Approaches, based on
their indirect electrochemical oxidation using PbO2, platinum and carbon anodes producing
various keto derivatives, were described 10. Further, sterols can be directly electrochemically
oxidized at the glassy carbon electrode using high anodic potential in non-aqueous solvents 11,
12
presumably with the hydroxyl group at the 3-position of cholesterol as a target of
electrochemical oxidation. This has been utilized in a number of analytical methods aiming on
the determination of cholesterol and its steroidal metabolites and precursors 13, 14 and
phytosterols 15 using direct electrochemical detection in HPLC. Moreover, direct
electrooxidation of cholesterol succeeded also at the boron-doped diamond (BDD)
electrode 16. Electrochemical reduction of bile acids is enabled by the presence of the carboxyl
group at C24 or C27 and was investigated at dropping mercury electrode 17. It is known that
aliphatic and aromatic carboxyl acids which are not strongly activated by electron25
withdrawing groups and do not contain more easily reducible groups give a well-developed
polarographic wave in aqueous 18 or nonaqueous 19, 20 solvents, but this is usually due to
reduction of protons to hydrogen.
In this contribution we focused on the characterization of electrochemical behaviour of
selected bile acids and phytosterols. Several examples of their redox activity including
electrochemical reduction of bile acids at mercury and meniscus-modified silver solid
amalgam electrodes (m-AgSAE) and electrochemical oxidation of phytosterols and bile acids
at platinum, glassy carbon and BDD electrodes in non-aqueous media are presented and
discussed with respect to their potential use for characterization of supramolecular systems
based on these compounds and their utilization for electroanalytical purposes.
Experimental
The following stock solutions were prepared: 1·10–3 mol L–1 of tauroursodeoxycholic acid
(TUDCA) in deionized water (Milli-Qplus system, Millipore, USA); 1·10–3 mol L–1 cholic
acid, deoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, dehydrocholic acid, ursodeoxycholic acid
(UDCA), lithocholic acid, and stigmasterol in methanol and acetonitrile. All the solutions
were stored in the dark. Britton-Robinson buffers were prepared in a usual way, i.e. by mixing
a solution of 0.04 mol L–1 in phosphoric acid, 0.04 mol L–1 in acetic acid and 0.04 mol L–1 in
boric acid with the appropriate amount of 0.2 mol L–1 sodium hydroxide solution. For
measurements in non-aqueous media acetonitrile Chromasolv (Sigma Aldrich) with water
content below 2·10–3 vol.% (determined by gas chromatography) was used. Sodium
perchlorate purity for HPLC (Fluka) served as a basic electrolyte. All other chemicals were of
gradient grade purity (Lach-Ner, Neratovice, CZ).
Measurements were carried out using a computer driven Eco-Tribo Polarograph with PolarPro
software, version 5.0 (both Polaro-Sensors, Prague). For experiments in aqueous or mixed
media the following conditions were used: Three electrode arrangement with classical
dropping mercury electrode (DME), hanging mercury drop electrode (HMDE) UME
(Polaro-Sensors, Prague), m-AgSAE, or BDD electrode (3 mm diameter, Windsor Scientific,
UK) as indicator electrodes and platinum wire auxiliary electrode and silver / silver chloride
(3M KCl) reference electrode. In differential pulse techniques, the pulse amplitude of ±50 mV
and the pulse width of 100 ms were used. The indicator electrodes were activated as follows:
BDD was activated at the beginning of each working day in 0.1 mol L–1 H2SO4 by applying
the potential of +2.4 V for 60 s. Before starting the work, as well as after every pause longer
than one hour, the electrochemical activation of m-AgSAE was carried out in
0.2 mol L−1 KCl at –2500 mV under stirring of the solution for 300 s. For measurements in
non-aqueous media the working electrode was a platinum rotating disk electrode (active
surface area 6.2 mm2) or a glassy carbon rotating disk electrode (active surface area 9.4 mm2);
constant rotation speed was kept at 1226 rpm. The reference electrode was a silver plate
immersed in a solution of 0.01 M AgNO3 in 1 mol L−1 NaClO4 in acetonitrile and separated
from measured solution by a salt bridge filled with 0.5 mol L−1 NaClO4 in acetonitrile. The
platinum rod served as a counter electrode. For DC voltammetry the scan rate of 10 mV s–1
was used. pH was measured using Conductivity & pH meter Jenway 4330 (Jenway, England).
Results and Discussion
We tested the possibility of reduction of selected bile acids using DME, HMDE and mAgSAE in pH range 2-12 in aqueous or mixed methanol-aqueous media. Previously the only
bare electrode material succeeding has been the classical dropping mercury electrode (DME)
– it was used for differential pulse polarographic determination of cholic, deoxycholic,
ursodeoxycholic, chenodeoxycholic and lithocholic acid in human bile or pharmaceutical
products 17. Figure 2A presents DP voltammograms of TUDCA at HMDE and
26
chenodeoxycholic acid at m-AgSAE. On this example the pH-independence of the reduction
process can be demonstrated. Tested bile acids are reduced at far negative potential at ca
−1200 mV and the reduction potential shifts with increasing concentration to more negative
values, presumably due to the adsorption of the bile acids at the electrode surface. At mAgSAE, slightly more negative potentials were observed. At both electrodes, for investigation
of their electrochemical behavior weakly acidic to basic media are suitable because of the
possible interference of the signal of bile acids and the onset of the voltammetric curve due to
the hydrogen evolution.
The electrochemical oxidation of bile acids represents an unexploited field, attention was paid
more frequently to cholesterol and related compounds 11, 13, 14, 16, 21 and phytosterols 15. It was
proved for cholesterol that in nonaqueous media the hydroxyl group at the 3-position is the
target of electrochemical oxidation and its oxidation in acetonitrile at carbon electrode
proceeds via a four-electron, four-proton transfer to cholesta-4,6-dien-3-one 12. The hydroxyl
group at the 3-position is characteristic for all sterols, therefore related compounds as
fytosterols and bile acids exhibit similar behavior. In our experiments cholic acid,
ursodeoxycholic acid, dehydrocholic acid, tauroursodeoxycholic acid, deoxycholic acid,
chenodeoxycholic acid, and lithocholic acid yield a single, very drawn-out anodic wave in
0.1 mol L−1 NaClO4 in acetonitrile at rotating platinum and glassy carbon electrode. The halfwave potentials on the platinum electrode were in the range of +1790 mV to +1840 mV,
dependent on the structure of the compound. The half-wave potentials on the glassy-carbon
electrode were ca. +50 mV more positive. Further, BDD electrode was tested for oxidation of
stigmasterol and its intensive oxidation recognizable as steep onset of the voltammetric curve
at about +1630 mV, i.e. 300 mV more positive than the onset of supporting electrolyte was
observable (Fig. 2B).
Conclusions
Obviously, the possibilities of electrochemistry for characterization and detection of
cholesterols, phytosterols, bile acids and related compounds are rather limited. Nevertheless,
utilization of electrochemical methods for characterization of the newly prepared
supramolecular systems based on steroid subunits and for investigation of interactions
involved in the self-assembling process can broaden the knowledge about their stability and
monitored interactions. Further, for analytical chemists the redox activity of sterols in anodic
region provides basis for development of methods based on their direct detection in liquidflow techniques.
Acknowledgements
The research was financially supported by Grant Agency of the Czech Republic (project
P206/12/G151). KP thanks to the company LʼOreal Czech Republic for the “Stipendium
LʼOreal For Women in Science 2012” supporting this research.
27
I, nA A
-200
I, nA B
1
2
2
2000
3
4
-100
1
0
-2000
-4000
0
-500
-1000
-1500
-2000 -1000
E, mV
0
1000 E, mV
Fig. 2. (A) Selected DP voltammograms of TUDCA (c = 1·10–4 mol L–1) at HMDE electrode
in Britton-Robinson buffer pH 5.0 (1); 9.0 (2); 12.0 (3) and DP voltammogram of
chenodeoxycholic acid (c = 1·10–4 mol L–1) in the mixture BR buffer pH 9.0 − methanol (4);
(B) Cyclic voltammograms of stigmasterol at BDD electrode in the mixture methanolacetonitrile-phosphate buffer pH 3.0 (50:49:1); c = 0 mol L–1 (1) and c = 5·10–4 mol L–1 (2).
References
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Hofmann A. F., Hagey L. R.: Cell. Mol. Life Sci. 65, 2461 (2008).
Hofmann A. F., Roda A.: J. Lipid Res. 25, 1477 (1984).
Fini A., Roda A.: J. Lipid Res. 28, 755 (1987).
Patel M. D., Thompson P. D.: Atherosclerosis 186, 12 (2006).
Scalia S.: J. Chromatogr. B-Biomed. Appl. 671, 299 (1995).
Griffiths W. J., Sjovall J.: J. Lipid Res. 51, 23 (2010).
Griffiths W. J., Sjovall J.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 396, 80 (2010).
Miyata M., Tohnai N., Hisaki I.: Molecules 12, 1973 (2007).
Mukhopadhyay S., Maitra U.: Current Science 87, 1666 (2004).
Medici A., Pedrini P., De Battisti A., Fantin G., Fogagnolo M., Guerrini A.: Steroids 66, 63
(2001).
Hojo K., Hakamata H., Kotani A. I. A., Furukawa C., Hosokawa Y. Y., Kusu F.: J.
Chromatogr. A 1166, 135 (2007).
Hosokawa Y. Y., Hakamata H., Murakami T., Aoyagi S., Kuroda M., Mimaki Y., Ito A.,
Morosawa S., Kusu F.: Electrochim. Acta 54, 6412 (2009).
Hojo K., Hakamata H., Takahashi A., Hosokawa Y. Y., Kusu F.: Biomed. Chromatogr. 24,
600 (2010).
Hojo K., Hakamata H., Kusu F.: J. Chromatogr. B 879, 751 (2011).
Ito N., Hakamata H., Kusu F.: Anal. Methods 2, 174 (2010).
Kotani A., Hakamata H., Nakayama N., Kusu F.: Electroanalysis 23, 2709 (2011).
Ferri T., Campanella L., Deangelis G.: Analyst 109, 923 (1984).
Korshunov I. A., Kuznetsova Z. B., Shchennikova M. K.: Zhurnal Fiz. Khimii 23, 1292
(1949).
Coetzee J. F., Kolthoff I. M.: J. Am. Chem. Soc. 79, 6110 (1957).
Lund H.: Acta Chem. Scand. 17, 972 (1963).
Luo H. X., Shi Z. J., Li N. Q., Gu Z. N., Zhuang Q. K.: Anal. Chem. 73, 915 (2001).
28
Adsorption of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine on Au(111) and HOPG
(Adsorpce 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholin na Au(111) a HOPG)
Jana Bulíčková a, Romana Sokolová a
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23
Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Atomic force microscopy (AFM) was used to study the formation of layers of
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) on Au(111) and highly oriented
pyrolytic graphite (HOPG) in microscopic level. Both substrates were found to support the
DPPC layers. The nanoshaving technique was applied to determine the layer thickness. In
addition, the influence of deionized water on the DPPC ordering at the substrates was studied
by ex-situ and in-situ AFM intermittent contact mode measurements.
Key words: Phospholipid, Adsorption, Atomic force microscopy, Surface topography.
Úvod
Molekula 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DPPC) (Obr. 1.) 1 patří mezi fosfolipidy
(zwitterion fosfoglycerid), které jsou používané pro přípravu liposomálních monovrstev.
Obr. 1. Strukturní vzorec 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholinu (C40H80NO8P, DPPC).
V literatuře se stále setkáváme se snahou vytvořit modelové membrány buněk, tak abychom
byli schopni pochopit jejich mechanismus a kinetiku vzniku a následně je mohli využit
v biotechnologických aplikacích 2,3.
Mezi oblíbené techniky studia adsorpce fosfolipidů, na různých substrátech (slída, vysoce
orientovaný pyrolytický uhlík (HOPG) a monokrystalické zlato), patří i mikroskopie
atomárních sil (AFM) 4,5,6,7. AFM poskytuje detailní strukturní informace s nanometrovým
rozlišením. Na rozdíl od rastrovací tunelové mikroskopie (STM) mohou být vzorky nevodivé
a díky potlačení laterálních sil v magneticky řízeném přerušovaně kontaktním režimu AFM
(TM AFM) nedochází ani k porušení “měkkých“ biologických vzorků. Oproti tomu
v kontaktním režimu AFM (CM AFM) lze molekuly (vrstvy), při působení určité přítlačné
síly na hrot, posouvat.
Experimentální část
Jako substrát slouží vyžíhané monokrystalické zlato Au(111) na slídě dodávané od firmy
Agilent Technologies (USA) nebo adhezivní páskou čistě očištěný vysoce orientovaný
pyrolytický uhlík (HOPG, Structure Probe Inc., USA).
Destilovaná voda byla získána z Milli-Q RG systému (18 MΩ.cm, Millipore Co., USA).
29
Látka 1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DPPC) byla zakoupena od firmy Avanti
Polar Lipids (Alabaster, USA). Jako rozpouštědlo byl použit roztok absolutního ethanolu
(AppliChem, Germany 99,8 %, GC – dodavatel Chemos, Cítov, ČR) a n-heptanu (p.a., Penta
– Švec, Pentachemicals, Praha, ČR), v poměru 1:10 (v/v).
Depozice 10mM roztoku DPPC na Au(111) na slídě probíhala za tepla ve vodní lázni, při
působení roztoku po dobu 6 minut. Po té byl substrát omyt teplým roztokem samotných
rozpouštědel a vysušen pod proudem argonu. Depozice 10mM roztoku DPPC na HOPG
probíhala pokrytím celého povrchu teplým roztokem po dobu 6 minut. Po té byl substrát omyt
teplým roztokem samotných rozpouštědel, dále omyt absolutním ethanolem a vysušen pod
proudem argonu.
Všechna měření technikou mikroskopie atomárních sil (AFM) byla provedena na přístroji
Agilent 5500 SPM (Agilent Technologies, USA). Jako sonda sloužil hrot typu “Type II MAC
lever” (Agilent Technologies, USA) s nominální resonanční frekvencí fN = 75 kHz a
hodnotou nominální silové konstanty kN = 2,8 N/m. Nosič Type II MAC lever je vhodný pro
zobrazovaní povrchu pomocí “tapping“ módu (TM AFM), tedy zobrazení plochy
v magneticky řízeném přerušovaně kontaktním režimu. U vzorku naneseném na Au(111) byl
také použit hrot typu “Point Probe Plus – Non-Contact – long” (PPP-NCL, Agilent
Technologies, USA) s nominální resonanční frekvencí fN = 190 kHz a hodnotou nominální
silové konstanty kN = 48 N/m, který je vhodný pro zobrazení topografie pomocí řídícího
mechanismu AAC.
Vzorky byly měřeny jak ex-situ, tak in-situ pod deionizovanou vodou. Získaná data byla
zpracována v programu Gwyddion (Český metrologický institute, ČR) a Origin 7,5
(OriginLab Corporation, USA).
Výsledky a diskuze
Experimentem bylo zjišťováno, jak se DPPC adsorbuje na různé povrchy, tedy hydrofobní
HOPG a hydrofilní Au(111). Vzniklé adsorbované vrstvy DPPC byly měřeny ex-situ
technikou TM AFM. Zároveň bylo pozorováno, jak se mění uspořádání povrchových struktur
při působení deionizované vody, pomocí in-situ TM AFM. Pro získání informace o výšce
vrstvy na povrchu jednotlivých substrátů byla využita technika „nanoshaving“ 8 v kontaktním
módu AFM (NS-CM AFM). Nejprve je nutné zobrazit danou vhodnou oblast v magneticky
řízeném přerušovaně kontaktním režimu (TM AFM). Poté je část vrstvy na povrchu substrátu
přemístěna hrotem se zadanou přítlačnou silou v módu CM AFM. Nakonec je stejná oblast
zobrazena znovu technikou TM AFM. S analýzy profilů povrchu před a po přemístění pomocí
NS-CM AFM lze odečíst výšku vrstvy.
Analýza výšky povrchových struktur topografie vzorku DPPC na HOPG (histogram
neukazován) ukázala, že jsou struktury vysoké cca 3,5 nm. Jak je patrné na první pohled
z topografie (Obr. 2), povrchové struktury netvoří souvislou vrstvu.
Patrná změna nastane u vzorku DPPC na HOPG pokud je vzorek vystaven působení vody po
několik dnů. U vrstvy DPPC došlo k přeorganizování, je kompaktnější, i když jsou stále
patrná nepokrytá místa oválného tvaru (možnost nanobublin 9). Výška vrstvy z analýzy
povrchu vychází přibližně 3 nm.
30
3
2
y / nm
1
0
-1
-2
-3
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
x /m
Obr. 2. Topografie DPPC na HOPG měřená ex-situ technikou TM AFM, velikost zobrazení
1x1 μm, z = 6,8 nm; na pravé straně je ukázán profil linie 1 z levého obrázku.
Při adsorpci DPPC na zlatý povrch hraje roli nejen samotný povrch Au(111), ale i
koncentrace roztoku, teplota nanášeného roztoku a doba adsorpce (s tím souvisí doba
působení roztoku na substrát). Při krátké depozici (po dobu několika sekund) DPPC na
Au(111) byla z histogramu distribuce výšky povrchových struktur odečtena výška 2,8 nm,
která odpovídá monovrstvě. Oproti tomu při 6 minutové depozici byla vrstva vysoká 5,8 nm.
Tato výška odpovídá fosfolipidové dvojvrstvě nanesené na povrchu, tj. vytvořily se tzv.
panely.
Závěr
Oba substráty (Au(111) a HOPG) podporují adsorpci a tvorbu vrstvy DPPC. Z analýzy profilů
po NS-CM AFM vznikl histogram distribuce výšky povrchových struktur. U vzorku DPPC na
HOPG byla odečtena jako nejvíce se vyskytující hodnota 3,5 nm. Po působení vody na vzorek
vyšla hodnota kolem 3 nm. U vzorku DPPC na Au(111) se při kratší depozici vytvořila
monovrstva o výšce 2,8 nm. Při šesti minutové depozici DPPC vytvořil panely vysoké 5,8
nm, které odpovídají povrchem podporované dvojvrstvě.
Acknowledgement
This work was supported by the the Academy of Sciences of the Czech Republic
(M200401201).
Literatura
1. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4329?lang=en&region=CZ,
Downloaded 26th March 2013.
2. Giocondi M.-C., Yamamoto D., Lesniewska E., Milhiet P.-E., Ando T., Le Grimellec C.:
Biochim. et Biophys. Acta 1798, 703 (2010).
3. Richter R. P., Brisson A. R.: Biophys. J. 88, 3422 (2005).
4. Richter R. P., Brisson A. R.: Langmuir 19, 1632 (2003).
5. Hui S. W., Viswanathan R., Zasadzinski J. A., Israelachvili J. N.: Biophys. J. 68, 171
(1995).
6. Spangenberg T., de Mello N. F., Creczynski-Pasa T. B., Pasa A. A., Niehus H.: Phys.
Stat. Sol. 201, 857 (2004).
7. Diculescu V. C., Chiorcea-Paquima A.-M., Tugulea L., Vivan M., Oliveira-Brett A.-M.:
Bioelectrochem. 74, 278 (2009).
8. Kolivoška V., Gál M., Lachmanová Š., Janda P., Sokolová R., Hromadová M.: Collect.
Czech. Chem. Commun. 76, 1075 (2011).
9. Kolivoška V., Gál M., Hromadová M., Lachmanová Š., Pospíšil L.: Biointerphases 6, 164
(2011).
31
Nitro-Hydrazine DNA Redox Labels in Electroanalysis of Nucleic Acids at m-AgSAE
Ales Danhel a, Hana Pivonkova a, Veronika Raindlova b, Michal Hocek b, and Miroslav Fojta a
a
Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Kralovopolska 135, 61265 Brno, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
b
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, AS CR, v.v.i., Flemingovo nam. 2,
166 10 Prague 6, Czech Republic
Abstract
Electrochemical behaviour of the model single stranded (ss) and double stranded (ds) DNA,
prepared by primer extension procedure using enzymatic incorporation of the
deoxycytidinetriphosphate (dCTP) conjugates with novel redox DNA labels:
2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) and N-methyl-4-hydrazino-7-nitrobenzofurazane (NBF),
into the selected template (oligonucleotide consisted of 31nt) and primer (15nt) is discussed in
this work. Yielding ssDNA-DNPH and dsDNA-NBF, respectively, were studied using cyclic
voltammetry, adsorptive stripping voltammetry and transfer stripping voltammetry at mercury
meniscus modified silver solid amalgam electrode. Together with the labeled DNAs,
electrochemical properties of the involved compounds, such as DNPH, NBF, dCDNPHMP, and
dCNBFMP were also studied and advantageous utilization of the silver solid amalgam
electrode was confirmed.
Key words: DNA, Nitrobenzofurazan, Nitrophenylhydrazine, Primer extension, Redox
labels, Silver solid amalgam and voltammetry.
Introduction
Nucleic acids (NAs) are apparently the most studied but still quite unexplored biopolymers
and together with proteins essential for all known living forms of life securing encoding,
transmitting and expressing of the genetic information 1. Next to this natural necessity, NAs
have found many application utilities in booming field of bio-sensing 2 taking advantages in
novel methods and approaches 3. Increase of sensitivity, selectivity and signal response
diversity in electrochemical assays may be, among the others, raised by utilization of various
redox labels 4. Next to the increase of specificity of the recently designed NA redox labels,
they allow utilization of novel electrode materials, which do not offer such wide cathodic
potential windows like the mercury electrodes, in development of various novel bio-sensors
and bio-assays. The short potential window is not the case of mercury meniscus modified
silver solid amalgam electrode (m-AgSAE) offering comparable potential window with
mercury electrodes, advantageous mechanical stability and sufficient sensitivity 5,6. And just
the mechanical stability and its simplicity allow utilization of this solid electrode in
application for development of novel sensors and detection systems with potential use in
biological, toxicological and/or medicinal bio-assays.
An enzymatic incorporation of the deoxyribonucleotidtriphospahtes (dNTPs) bearing the
redox labels amino-/nitro-phenyl7 or mediators for post synthetic modification, such as
formylthiophene and ethynyl, directly bounded to the nucleobases is one of the promising
approaches in NA redox labeling. Incorporation of the bulky redox labels, such as
antraquinon 8, ferocene or osmiumtetraoxide complexes 9, may be proceeded when the bulky
label is attached to the nucleobases via a proper linker (e.g. ethynyl, m-/p-phenylene,
formylthiophene) 4. According to requirements of the proposed methods, such as polymerase
chain reaction (PCR), primer extension (PEX) or tail labeling, proper enzymes, e.g. DNA
polymerases and/or terminal transferase 8, used to be applied, respectively. One of the
recently designed labeling systems is base on PCR/PEX incorporation of formylthiophene
labeled dCTP (dCFTTP) into the DNA, which can be easily further modified by “Hydrazon
formations” reaction utilizing carbonyl specific dyes: 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) and
32
N-methyl-4-hydrazino-7-nitrobenzofurazane (NBF), or enzymatic incorporation of such a
labeled dNTPs (e.g. dCDNPHTP, dCNBFTP, Fig. 1) into the DNA using PEX reaction10,11.
Systematic study of the electrochemical behaviour of the individual compounds: DNPH,
NBF, dCDNPHMP, dCNBFMP and short model ssDNA-DNPH and dsDNA-NBF is the topic of
this work. For this purpose, cyclic voltammetry (CV), adsorptive stripping voltammetry
(AdS-CV) and open circuit transfer stripping voltammetry (TS-CV) at m-AgSAE were used.
NH2
OH
O P OO
O
O P O P O
O
O-
(A)
N
O
O
OH
S
N
O N
N
NO2
N
N
H
NO2
OH
O P OO
O
O P O P O
O
O-
(B)
NH2
N
O
S
N
N
NO2
N
CH3
O
OH
Fig. 1. Structure formulae of via formylthiophene DNPH and NBF labeled dCTP:
A) dCDNPHTP, B) dCNBFTP.
Experimental
The enzymatic incorporation of the labeled dCTP (dCDNPHTP and dCNBFTP) into the DNA
respectively was carried out by PEX following procedure published by V. Raindlova
et al. 10,11, in 2 ml Eppendorf tubes using thermomixer Comfort (Eppendorf, USA). The PEX
reaction mixture was composed of: natural/labeled dNTPs: dCTP/dCDNPHTP/dCNBFTP, dATP,
dGTP and dTTP (>97%, Sigma-Aldrich, Germany), Termopol buffer (#B9004), biotinilated
template (31nt) 4BAS II Bio or 4BAS II (when dCDNPHTP or dCNBFTP was used,
respectively), primer no-A (15nt), DNA polymerase Vent(exo-) (all BioLabs, New England),
and deionized water (Milli-Q plus, Millipore, USA). After an incubation during 45 min at
60°C without stirring in thermomixer, prepared ssDNA-DNPH and/or dsDNA-NBF were
further purified using magneto-separation by Streptavidine modified magnetic beads (DBStv,
Dynabeads, Invitrogen, USA) and magnetoseparator (Dynal, Norway) or QIAquick
Nucleotide Removal Kit (QIAGEN, Germany) following original Quick-Start protocol using
centrifuge (miniSpin plus, Eppendorf, USA), respectively. Prepared labeled DNAs were
eluted by 30 μl of water, stored in 2 ml Eppendorf tubes and kept on ice during the
measurements to prevent their decomposition, otherwise stored at 5°C in a lab refrigerator.
Next to the prepared ssDNA-DNPH and dsDNA-NBF in aqueous solutions, single DNPH and
NBF (p.a. Sigma-Aldrich, Germany) dissolved in DMSO and such a labeled dCMPs
(dCDNPHMP and dCNBFMP) dissolved in water were used as stock solutions for next
electrochemical studies carried out by electrochemical workstation CHI440 (CH Instruments,
USA) utilizing a three electrode system consisted of platinum wire auxiliary electrode, silver
chloride reference electrode (Ag|AgCl|3M KCl, both Monokrystaly, Czech Republic) and mAgSAE in aqueous buffer. All the voltammetric measurements were carried out in a
supporting electrolyte, 0.3M ammonium formate/phosphate buffer (AFP buffer) pH 6.95
(prepared from ACS grade chemicals, Sigma-Aldrich, Germany). Observed solutions were
5 min deaerated by Argon (99.998 %, Air Products, Czech Republic) to remove the oxygen
prior each measurements. The m-AgSAE was electrochemically treated by procedure
proposed by B. Yosypchuk between individual voltammetric measurements of observed
analytes. Application of constant potential −2.0 V during 120 s in 0.2 mol·l−1 KCl solution
preserves repeatable analysis with relative standard deviation (RSD) up to 10 % 6,12. The CV,
AdS-CV and TS-CV methods were used at scan rates within 0.1 – 100 V s–1 using different
potential windows.
33
Results and discussion
Cyclic voltammetry
Selected DNA redox labels, DNPH and NBF, and via formylthiophene linker DNPH and NBF
labeled dCMPs were individually studied by CV at m-AgSAE within properly delimited
potential windows in 0.3M AFP buffer pH 6.95. Due to small sample volume and
concentration, ssDNA-DNPH and dsDNA-NBF were studied only by open circuit TS-CV. All
the following CVs were measured using scan rates: 0.1, 1.0, 5.0, 10, 50, and 100 V s–1.
Measured voltammograms starts at potential +0.1 V and negative vertex potential was placed
just behind the observed signals to observed possible reversible or quasi reversible addition
signals in backward anodic and consequent cathodic scans. According to this results and
previous studies of analogous compounds, mechanism of their electrochemical
reduction/oxidation could be proposed. Thanks to the presence of nitro- groups and/or
benzofurazan heterocycle, more positive signals, than simple DNA may offer by CV at
mercury based electrodes, were observed. These signals correspond to four or six electron
electron reduction, respectively. While benzofurazan is irreversibly reduced to its
diaminobenzene derivative, nitro- groups of DNPH and also NBF are quasireversibly reduced
to hydroxylamines-, which offer reversible anodic and consequent cathodic signals by its
changeover to nitroso- groups and back to hydroxylamines in shortened potential windows.
However these additional signals may be well observed using high scan rates over 10 V s–1.
Next to the signals mention above, the dCDNPHMP and dCNBFMP provide four electron
cathodic signals corresponding to reduction of hydrazon group, yielding appropriate amines.
DNPH, NBF, dCDNPHMP and dCNBFMP may be determined with limits of detection (LOD,
S/N = 3) 5, 3, 2, and 2 μmol l–1, respectively, using the CV with scan rate 100 V s–1 at mAgSAE in 0.3M AFP buffer pH 6.95.
Adsorptive stripping voltammetry
To evaluate a process of the electrochemical reduction of the studied compounds, the
influences of the peak heights on scan rate were observed by CV. Thanks to the obtained
linear dependences, it was possible to conclude, that the electrode processes are directed by
adsorption. Therefore the AdS-CV could be advantageously applied for determination of
lower concentrations of the studied compounds. Accumulation potential (Eacc) and time (tacc)
were separately optimized for the studied compounds mentioned above, starting with 60 s tacc
and changing Eacc and then changing tacc with optimal Eacc using concentration 30 or
40 μmol l–1 in 0.3M AFP buffer pH 6.95. However, tacc have been further optimized using
even lower concentration of the analytes during measurements of concentration dependences.
Optimal accumulation parameters for sensitive determination of DNPH, NBF, dCDNPHMP and
dCNBFMP were found as follows (Eacc/tacc): −0.1 V/30 s, −0.1 V/30 s, −0.1 V/30 s, and
0.1 V/60 s, respectively. DNPH, NBF, dCDNPHMP and dCNBFMP may be determined with
LOD 0.1, 0.02, 0.02, and 0.03 μmol l–1, respectively, using the AdS-CV including above
mention Eacc and 300s tacc, scan rate 100 V s–1 at m-AgSAE in 0.3M AFP buffer pH 6.95.
Transfer stripping voltammetry
The open circuit TS-CV method could be used due to adsorption affinity of the studied
compounds to the mercury meniscus of the m-AgSAE. Thanks to the mechanical stability of
the m-AgSAE, it can be easily immersed to the sample and sample consumption do not
exceed 0.5 μl (only remaining sample on the electrode) or, in case of small sample volume
about 2 μl, it may be transferred on the electrode surface by automatic pipette and for
repeatable measurements carefully sack out back by the pipette after appropriate tacc. In
comparison with HMDE where 3 μl of the sample volume is real lower limit for single
adsorption, the m-AgSAE has a big advantage in this case. Sample adsorptions were carried
out from their aqueous solution at appropriate concentration containing 0.2M NaCl increasing
34
ionic strength and the affinity of the analytes to mercury meniscus, by immersion of the mAgSAE into the small Eppendorf tubes. Concentration dependences were measured using tacc
60 s, during this time, the electrode surface became almost saturated by the analytes at the
highest observed concentrations, and when obtained signals reached LODs, the tacc was
proportionally increased. At the lowest concentration ranges even 10 min tacc did not have a
positive effect in some cases, so finally LODs for DNPH, NBF, dCDNPHMP, dCNBFMP,
ssDNA-DNPH and dsDNA-NBF were determined as follows (tacc): 10 (30 s), 0.03 (300 s),
0.04 (60 s), 0.04 (300 s), 0.3 (300 s), and 0.5 μmol l–1 (300 s), respectively, using the TS-CV
with scan rate 100 V s–1 at m-AgSAE in 0.3M AFP buffer pH 6.95. A comparison of the
obtained voltammograms of the prepared ssDNA-DNPH and dsDNA-NBF with unmodified
ssDNA is depicted on Figure 2.
-150
c
I, A
-100
c
F+H
CA
c
H
CA
p-NO2
dsDNA-NBF
G
o-NO2
c
-50
p-NO2
c
CA
ssDNA-DNPH
G
0
ssDNA
G
0.0
-0.5
-1.0
-1.5
E,V
Fig. 2. Cyclic voltammograms of: 5 μM ssDNA (blue), 0.26 μM ssDNA-DNPH (red) and
0.63 μM dsDNA-NBF (green) at m-AgSAE in 0.3M AFP buffer pH 6.95, scan rate
100 mV s−1 (co-NO2…reduction peak of nitro-group in (o-) position, cp-NO2…reduction peak of
nitro-group in (p-) position, cH…reduction peak of hydrazon group, cF+H…coincide reduction
peak of furazan heterocycle and hydrazon group, CA…coincide reduction peaks of cytosine
and adenine, G…oxidation peak of previously reduced guanine to 7,8-dihydroguanine).
Even though the incorporation of the redox labels influences their electrochemical properties
and the labels do not offer additive anodic signals what quite decrease their potential signal
response diversity, it is evident that labeled DNA offers advantageous more positive cathodic
signals than unlabeled DNA. This difference could be further used for identification of such a
labeled from unlabeled DNA samples in a simple diagnostic tools utilizing also modern
biochemical techniques such as, PCR, PEX and magnetic beads.
Conclusion
DNA redox labels based on DNPH and NBF were found to be convenient alternatives to
previously studied labels (nitro-/amino-phenyl, anthraquinone etc.) and may be enzymatically
incorporated to the DNA structure by PEX using proper DNA polymerase. In combination
with very sufficient electrochemical detection at m-AgSAE, their application in development
35
of novel sensors and detectors was confirmed. Even if the PEX preparation of the labeled
DNA is not sufficient enough to incorporate adequate number of the labeled dNTPs to exceed
signals of the unlabeled DNA, they sufficiently indicate the presence of the studied
oligonucleotide. However, there is still the post synthetic modification of the DNA, prepared
by PCR using formylthiophene labeled dNTPs and further labeled by DNPH or NBF, what
seems to be much promising approach with obvious usage in various biological, toxicological
or medicinal applications.
Acknowledgment
Financial support from project OPVK CZ.1.07/2.3.00/30.0019, The Czech Science
Foundation GACR (project P206/12/G151), and GA ASCR (IAA400040901) is gratefully
acknowledged.
References
1. Palecek E., Bartosik M.: Chem. Rev. 112, 3427 (2012).
2. Palecek E.: Electroanalysis 21, 239 (2009).
3. Labuda J., Brett A. M. O., Evtugyn G., Fojta M., Mascini M., Ozsoz M., Palchetti I.,
Palecek E., Wang J.: Pure Appl. Chem. 82, 1161 (2010).
4. Fojta M., Havran L., Pivonkova H., Horakova P., Hocek M.: Curr. Org. Chem. 15, 2936
(2011).
5. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009).
6. Yosypchuk B., Heyrovsky M., Palecek E., Novotny L.: Electroanalysis 14, 1488 (2002).
7. Cahova H., Havran L., Brazdilova P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.:
Angew. Chem.-Int. Edit. 47, 2059 (2008).
8. Horakova P., Macickova-Cahova H., Pivonkova H., Spacek J., Havran L., Hocek M.,
Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 9, 1366 (2011).
9. Fojta M., Kostecka P., Pivonkova H., Horakova P., Havran L.: Curr. Anal. Chem. 7, 35
(2011).
10. Raindlova V., Pohl R., Klepetarova B., Havran L., Simkova E., Horakova P., Pivonkova
H., Fojta M., Hocek M.: ChemPlusChem 77, 652 (2012).
11. Raindlova V., Pohl R., Sanda M., Hocek M.: Angew. Chem.-Int. Edit. 49, 1064 (2010).
12. Fadrna R., Cahova-Kucharikova K., Havran L., Yosypchuk B., Fojta M.: Electroanalysis
17, 452 (2005).
36
Utilization of Carbon Paste Electrodes for Amperometric Detection in HPLC with
Gradient Elution
Hana Dejmkova, Barbora Fahnrichova, Jiri Barek, and Jiri Zima
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2,
Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Method for the determination of benzophenone-1 and benzophenone-3 was developed, using
HPLC with amperometric detection on glassy carbon paste electrode. Due to the utilization of
gradient elution including high content of methanol, attention was paid to the stability of the
electrode material and to the influence of these conditions on the determination parameters.
Key words: Glassy carbon paste electrode, Benzophenone, HPLC, Gradient elution.
Introduction
Benzophenones belong to the family of compounds used as additives and preservatives of
various products, particularly cosmetics – their structure enables them to block UV light and
thus protect the materials sensitive to such an influence 1. On the other hand, these compounds
are in the same time endocrine disruptors, compounds which interact adversely with
endocrine system of organisms, damaging their hormonal balance 2. For that reason, it brings
these compounds to the center of attention concerning their occurrence and connected
determination method for their monitoring.
Electrochemistry provides interesting possibilities in such monitoring due to its sensitivity,
relative selectivity, and low instrumental demands 3. Among various electrode materials,
carbon paste is advantageous in some electrochemical parameters (potential window,
background current) and in variability and versatility 4; on the other hand, due to its structure
it is also vulnerable towards some influences, particularly towards presence of organic
solvents 5. Utilization of glassy carbon microparticles as the carbonaceous component of the
paste provides some resistance to it 6.
This paper deals with the development of the determination method of benzophenone-1 (BP1) and benzophenone-3 (BP-3) using HPLC with amperometric detection. High retention of
these compounds offers an interesting possibility to observe the behavior of the glassy carbon
paste electrode (GCPE) in extreme conditions combining the high content of methanol and
flow technique.
Experimental
Stock solutions of 100 mol L-1 benzophenone-1 (BP-1, CAS No. 131-56-6, Sigma-Aldrich)
and benzophenone-3 (BP-3, CAS No. 131-57-7, Sigma-Aldrich) in methanol were prepared.
HPLC measurements were performed using high pressure pump Beta 10, injector valve with
20 L loop, UV/VIS detector Sapphire 800 (all Ecom, Czech Republic) and amperometric
detector ADLC 2 (Laboratorní přístroje, Czech Republic) connected in series. Kromasil 100 –
7 μm, 150×4,6 mm, RP-18 column (Merck) was used for the separation. Mobile phase
consisted of methanol and phosphate-acetate buffer. All chemicals used for buffer preparation
were of analytical grade purity and obtained from Lachema Brno, Czech Republic. Detection
wavelength of 288 nm and flow rate of 1.0 mL min-1 was set.
The working carbon paste electrode was prepared from mineral oil (Fluka) and spherical
microparticles of glassy carbon with a diameter from 0.4 to 12 m (Alfa Aesar, Germany). It
was adjusted against the outlet capillary in “wall-jet” arrangement and immersed in the
37
overflow vessel together with a platinum wire auxiliary electrode and an Ag/AgCl (3 M KCl)
reference electrode RAE 113 (Monokrystaly Turnov, Czech Republic).
All measurements were made in triplicate. Analyte concentration of 100 mol L–1 was used
during optimization measurements, unless stated otherwise. Calibration dependences were
evaluated by least squares linear regression method. The quantification limits were calculated
as the concentration of the analyte which gave a signal ten times the standard deviation of the
lowest evaluable concentration.
Results and Discussion
Firstly, behavior of BP-1 and BP-3 was observed under the isocratic conditions in order to
find a suitable pH of the mobile phase; pH 6 was selected as optimal, but in the same time,
high retention and resolution of the compounds showed the necessity to use gradient elution.
Steep gradient was selected, starting on 30 % of methanol and reaching 91 % of methanol in
5 min. Under these conditions, a reasonable peak distribution was obtained, ensuring
appropriate separation of the analytes from the system peak, which can be expected in the real
samples, and in the same time minimizing the resolution of the peaks. Nevertheless,
the stability of the GCPE might be questionable under such conditions.
Therefore, three carbon paste electrodes varying in the content of pasting liquid were prepared
and the repeatability of the electrode response during repetitive injections was observed. Two
gradient programs were employed: steeper, described in the previous paragraph, and slower,
ending in fifth minute on methanol concentration of 85 %. Such a decrease prolonges the
separation, but it prevents GCPE from the contact with the highly methanolic mobile phase.
Table 1 shows the resulting relative difference in the peak height of the first and tenth
measurement. It can be clearly seen that the increasing proportion of pasting liquid protects
the electrode from the deterioration. On the other hand, hydrodynamic voltammograms of
BP-3 (Fig. 1) in the same time show the shift of the electrode response to higher potentials
with increasing proportion of pasting liquid; preparation of unnecessarily thin carbon paste is
not recommendable.
Table I.
Relative difference in the peak height of the first and tenth measurement obtained using
various gradient programs and electrode composition.
Electrode composition
250 mg carbon:
250 mg carbon:
250 mg carbon:
50 μL oil
90 μL oil
120 μL oil
Gradient program
Relative increase of peak
From 30 % to 91 % of
methanol in 5 min
From 30 % to 85 % of
methanol in 5 min
BP-1
BP-3
BP-1
---
---
21.7%
11.6%
2.9%
-4.0%
-14.8%
-13.7%
1.7%
-2.7%
-4.7%
-4.4%
38
BP-3
BP-1
BP-3
1200
1200
I, nA
hP, nA
1000
1000
800
800
600
600
400
400
200
200
0
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
0
E, V
Fig. 1. Hydrodynamic voltammograms of BP-3 obtained on the electrodes with proportion of
carbon to mineral oil 250 mg : 50 μL (), 250 mg : 90 μL (), and 250 mg : 120 μL () and
the background currents of these electrodes(corresponding empty symbols). HPLC-ED on
CPE, Kromasil 100 – 7 μm, 150×4,6 mm, RP-18 column, mobile phase of methanol and
phosphate-acetate buffer pH 6, proportion of methanol increasing from 30 % to 85 % in
5 min.
Conclusions
The performed measurements confirmed the importance of the relative amount of the pasting
liquid for the stability of GCPE. This influence further supports the idea that one of the
important reasons of GCPE stability is low porosity of carbonaceous particles and therefore
the relative abundance of the pasting liquid on the electrode surface.
Acknowledgement
This work was performed in the framework of Specific university research (SVV 267215).
Financial support from the Grant Agency of Charles University (project no. 684213) is
gratefully acknowledged.
References
1. Janjua N. R., Kongshoj B., Andersson A. M., Wulf H. C.: J. Eur. Acad. Dermatol.
Venereol. 22, 456 (2008).
2. Study on enhancing the Endocrine. Disrupter priority list with a focus on low production
volume chemicals.
http://ec.europa.eu/environment/endocrine/documents/final_report_2007.pdf, Downloaded
30th March 2013.
3. Zima J.; Svancara I.; Peckova K.; Barek J.: Carbone paste electrodes for the
determination of detrimental substances in drinking water. In Progress on Drinking Water
Research (Lefebvre M. H.; Roux M. M., eds.), Nova Science Publishers, New York, 2008.
4. Zima J., Svancara I., Barek J., Vytras K.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 204 (2009).
5. Svancara I., Vytras K., Renger F., Smyth M. R.: Electrochim. Acta 37, 1355 (1992).
6. Dejmkova H., Mika J., Barek J., Zima J.: Electroanalysis 24, 1766 (2012).
39
Roles of Amino Acid Residues in Peptide-Catalysed Hydrogen Evolution
Vlastimil Dorčák a, Veronika Ostatná a, and Emil Paleček a,b
a
Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Kralovopolska 135, 612 65 Brno, Czech Republic
b
Masaryk Memorial Cancer Institute, Zluty kopec 7, 656 53 Brno, Czech Republic
Abstract
We analysed several peptides, differing in amino acid composition and chain length, as a
model system at hanging mercury drop electrode to explore the participation of their amino
acid residues in the catalysis of hydrogen evolution pronounced by chronopotentiometric
stripping peak H in weakly alkaline, neutral, and weakly acidic media. The active roles of
cysteine thiol, lysine -ammonium, and arginine guanidinium groups were confirmed while
the contribution of histidine imidazolium group was very weak under the given conditions. In
addition, possible involvement of hydroxyl groups at side chains of tyrosine and serine
residues is suggested.
Key words: Constant-current chronopotentiometric stripping, Peptides, Catalytic hydrogen
evolution, Mercury electrode.
Introduction
Chronopotentiometric stripping (CPS) peak H, due to the peptide/protein-catalysed hydrogen
evolution at Hg-based electrodes, is known since 1998 1. Mostly proteins were analysed and a
number of research papers (reviewed in ref. 2) illustrates its versatility in solving of various
specific tasks important in biochemistry and medicine offering thus a novel powerful versatile
label-free electroanalytical method. In comparison to other methods (commonly used in
analysis of peptides/proteins), determinations based on the measurement of CPS peak H
provides lower detection limits (allowing convenient analysis of peptides/proteins at
submicromolar concentrations) 1, 3-13 and remarkable sensitivity to local and global changes in
protein structures (native, denatured, aggregated, reduced, and oxidized) 6-8, 10-16, and specific
binding of protein to DNA 7, low molecular-weight compounds 11, 17 and metal 13. Despite this
broad range of practical applications only a little is known about the contribution of individual
amino acid (aa) residues in the resulting catalytic process. Their identification is thus of a high
importance for further advances in this method not only at the fundamental level, but it will be
also useful in investigations of specific binding properties of peptides and proteins.
The phenomenon of catalytic hydrogen evolution is known since the times very close to those
of the invention of the polarography 18. It consists of a set of reactions during which the
peptide/protein molecule in adsorbed state via functional groups (capable of proton exchange
reaction) mediates the transfer of protons from the solution onto negatively charged electrode
surface where they subsequently combine in more stable molecules, the gaseous hydrogen
H2↑ (reviewed in ref. 19). Several bioactive as well as synthetic peptides were studied mostly
as a protein-like model to better understand the catalytic behaviour of much larger and
complex protein molecules and to identify which aa residues are responsible for the
appearance of CPS peak H. Up to date, only cysteine (Cys) thiol 9, 11, lysine (Lys)
-ammonium 20, arginine (Arg) guanidinium 20, 21, and histidine (His) imidazolium 21 groups
had been unambiguously confirmed.
Herein, we present the results of the CPS study of the catalytic ability of several peptides
(Table I) at a hanging mercury drop electrode (HMDE) in weakly alkaline, neutral, and
weakly acidic media. In addition to the above functional groups, possible involvement of
hydroxyls at side chains of tyrosine (Tyr) and serine (Ser) residues is discussed.
40
Table I.
List of investigated peptides with their abbreviations and sequences in 3-letter aa code. Bold
aa residues indicate those with functional groups bearing at pH 6 exchangeable protons.
Experimental details
Reagents
Peptides were purchased from Bachem and Sigma-Aldrich. Other chemicals and water were
ACS reagents from Sigma-Aldrich and Merck.
Apparatus
Chronopotentiometric measurements were carried out with an Autolab analyser (Eco Chemie)
in connection with VA-stand 663 (Metrohm). The three-electrode system consisted of an
HMDE (area of 0.4 mm2) as a working electrode, Ag|AgCl|3 M KCl as a reference electrode,
and Pt wire as a counter electrode.
Procedures
All measurements were carried out at room temperature. Peptides were adsorbed on the
electrode from unstirred solutions exposed to air for a 60 s accumulation time at open circuit
potential (ocp). Then a stripping current (Istr) was applied to record chronopotentiograms from
+0.1 V.
Results and discussion
Earlier, we showed that in some peptides/proteins predominantly free SH-groups of Cys
residues are responsible for the appearance of CPS peak H in weakly alkaline media 9, 11. In
the case of those with S–S-bond/s, they are generated from the cleavage of S–S-bonds during
the cathodic stripping. Figure 1A shows well-developed CPS peak H of 1 M nonapeptide VP
at pH 9.3 while its structural analogue OT (with exchanged two aa residues, Table I) behaves
as catalytically inactive under the same conditions. But at neutral pH (Fig. 1B) both peptides
produced peak H at the same potential (-1.73 V) and a new one appeared by about 10 mV
negatively in the case of VP. On the other hand, responses of one aa residue longer SS38
(differing greatly from the aa composition of VT and OT, Table I) were very similar to those
of VP at both pH’s (Fig. 1A&B).
41
Fig. 1. CPS responses of 1 M VP, OT, and SS38 in weakly alkaline (A: 50 mM sodium
borate, pH 9.3) and neutral (B: ¼ McIlvaine buffer, pH 7) media (solid lines); blank
electrolyte (dotted lines). For aa composition of indicated peptides see Table I. Istr = -25 A,
more details are in section Procedures.
Our recent findings 20, 21 with some peptides lacking Cys residues (under the similar
conditions as shown in Figure 1B) suggest that Lys and Arg residues might be involved in the
catalytic process pronounced by the second peak of VP and SS38, respectively (Fig. 1B).
Examples of the catalytic activity of the peptides with Lys or Arg residues at pH 6 shown in
Figure 2 support this finding. Removing of Arg residue from the ATIII (Table I) molecule
resulted in cancelling the catalytic activity (ATIV in Fig. 2A) while its exchange by Lys
residue in the peptide BB (Table I) has only small effect (K3BB in Fig. 2B), and the
replacement of the dipeptidic moiety Leu-Arg in hLHRH by Trp-Leu (Table I) caused
considerably decrease of peak H and its shift towards more negative potentials (sLHRH in
Fig. 2C).
Fig. 2. CPS responses of 500 nM peptides in ½ McIlvaine buffer, pH 6 (solid lines); blank
electrolyte (dotted lines). For aa composition of indicated peptides see Table I. Istr = -20 A,
more details are in section Procedures.
There is no doubt about the catalytic activity of His residues as we shown on the example of
hexaHis at pH 7 21. But we did not notice their contribution in other His-containing peptides
even at pH 6 where the amount of the catalytically active imidazolium group is considerably
increased due to its low pKA ~ 6. All the peptides shown in Figure 2 are containing His
residues (Table I) but only sLHRH (Fig. 2C) could indicate their involvement in the catalysis.
However, except of His residue, there are further two with hydroxyl groups at side chains of
42
Tyr and Ser residues in the sLHRH molecule (Table I) that might also act as a proton donor in
the catalysis of hydrogen evolution. Replacement of leucine (Leu) in BB molecule by Tyr
(Table I) caused significant increase of peak H and its shift towards less negative values
indicating enhancement of the catalytic process (Y4BB in Fig. 2B).
Conclusion
The active roles of Cys, Lys, and Arg residues in the catalytic hydrogen evolution pronounced
by CPS peak H at HMDE were confirmed in weakly alkaline, neutral and weakly acidic
media. However, it appears that solving the problem of participation of His, Tyr, and Ser
residues will require more work.
Acknowledgements
This work was supported by grants from GACR P301/11/2055 and RECAMO
CZ.1.05/2.1.00/03.0101.
References
1. Tomschik M., Havran L., Fojta M., Palecek E.: Electroanalysis 10, 403 (1998).
2. Palecek E., Ostatna V.: Electroanalysis 19, 2383 (2007).
3. Tomschik M., Havran L., Palecek E., Heyrovsky M.: Electroanalysis 12, 274 (2000).
4. Kizek R., Trnkova L., Palecek E.: Anal. Chem. 73, 4801 (2001).
5. Trnkova L., Kizek R., Vacek J.: Bioelectrochemistry 56, 57 (2002).
6. Masarik M., Stobiecka A., Kizek R., Jelen F., Pechan Z., Hoyer W., Jovin T.M.,
Subramaniam V., Palecek E.: Electroanalysis 16, 1172 (2004).
7. Palecek E., Masarik M., Kizek R., Kuhlmeier D., Hassmann J., Schulein J.: Anal. Chem.
76, 5930 (2004).
8. Ostatna V., Uslu B., Dogan B., Ozkan S., Palecek E.: J. Electroanal. Chem. 593, 172
(2006).
9. Dorcak V., Palecek E.: Electroanalysis 19, 2405 (2007).
10. Palecek E., Ostatna V., Masarik M., Bertoncini C.W., Jovin T.M.: Analyst 133, 76 (2008).
11. Dorcak V., Palecek E.: Anal. Chem. 81, 1543 (2009).
12. Ostatna V., Cernocka H., Palecek E.: J. Am. Chem. Soc. 132, 9408 (2010).
13. Palecek E., Ostatna V., Cernocka H., Joerger A.C., Fersh A.R.: J. Am. Chem. Soc. 133,
7190 (2011).
14. Ostatna V., Kuralay F., Trnkova L., Palecek E.: Electroanalysis 20, 1406 (2008).
15. Ostatna V., Palecek E.: Electrochim. Acta 53, 4014 (2008).
16. Palecek E., Ostatna V.: Chem. Commun. 1685 (2009).
17. Havran L., Billova S., Palecek E.: Electroanalysis 16, 1139 (2004)
18. Heyrovsky J., Babicka J.: Coll. Czech. Chem. Commun. 2, 370 (1930).
19. Heyrovsky M.: In Electrochemistry of Nucleic Acids and Proteins; Palecek E., Scheller F.,
Wang J., Eds.; Elsevier: Amsterdam, 2005; Vol. 1, pp 657-687.
20. Zivanovic M., Aleksic M., Doneux T., Palecek E.: Electroanalysis 22, 2064 (2010).
21. Dorcak V., Ostatna V., Palecek E.: Electrochem. Commun. (2013), doi:
10.1016/j.elecom.2013.03.016.
43
Voltammetric Determination of Pesticide Paraquat on Meniscus Modified Silver Solid
Amalgam Electrode
a
Jan Fischer , Mariya Kyrylenko b, Anastasios Economou b, and Jiří Barek a
a
Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre UNCE
"Supramolecular Chemistry", Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of
Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 128 43 Prague 2, Czech Republic,
Email: [email protected]
b
Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, University of Athens,
Athens 15771, Greece, Email: [email protected]
Abstract
New electroanalytical methods for voltammetric determination of paraquat were developed
using DC voltammetry (DCV) and differential pulse voltammetry (DPV) at a meniscus
modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE). Optimal conditions were found in
Britton-Robinson (BR) buffer pH 11 without regeneration of working electrode within the
concentration range 1.10-4 – 1.10-7 mol.l-1.
Key words: Paraquat, DC voltammetry, Differential pulse voltammetry, Meniscus modified
silver solid amalgam electrode
Introduction
Pesticides are widely used in agricultural treatments to boost productivity. Bipyridylium
herbicides, mainly represented by paraquat, are commonly employed for use in nonselective
weed control. Paraquat is one of the most widely used herbicides of toxicological class I in
about 130 countries and also frequently used as an efficient electron transfer-reagent 1.
Unfortunately, Paraquat is pesticide hazardous for human health 2. Chronic exposure to
agricultural chemicals such as this pesticide has been shown to induce neurotoxic effects or to
result in accumulation of various toxic metabolic products. Currently, it has been well
established that in case of this pesticide chronic exposure may result in nigrostriatal neuronal
damage and parkinsonian-like symptoms 3.
The main objective of this work was the development of the electroanalytical procedure for
the determination of paraquat using DPV on silver amalgam electrode. Heterocyclic moiety in
paraquat structure is easy to reduce on surface of modern electrodes and different
electrochemical methods for determination of paraquat have been proposed 4. Therefore, it is
beneficial to use for determination of this substance modern nontoxic amalgam electrode,
which could replace common mercury electrodes 5.
Experimental
A stock solutions of 1.10-3 mol.l-1 paraquat dichloride was prepared by dissolving 0.0186 g of
the substance (C. A. S. Registry Number: [1910-42-5]; grade PESTANAL – analytical
standard, Sigma-Aldrich, Czech Republic) in 50 ml of deionized water. Britton–Robinson
buffer was used as a supporting electrolyte. Deionized water was produced by a Milli-Q plus
system. Other chemicals were obtained from Lachema Brno (Czech Republic) in p.a. purity.
All the chemicals were used without any further purification.
Voltammetric experiments were performed using computer controlled Eco-Tribo Polarograph.
The working electrode was meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE) 5.
The polished silver solid amalgam electrode was immersed into a small volume of liquid
mercury and agitated for 15 seconds to form m-AgSAE. This process, denoted as
amalgamation, was repeated every week. Before starting the experiment for each new surface
of m-AgSAE the electrochemical activation was carried out in 0.2 mol.l-1 KCl at –2200 mV
44
under stirring of the solution for 300 s followed by rinsing with distilled water. Work with mAgSAE was carried out at a scan rate of 20 mV.s-1, pulse amplitude of –50 mV, pulse
duration of 100 ms, sampling time of 20 ms beginning 80 ms after the onset of the pulse and
interval between pulses of 100 ms.
Results and discussion
The selection of suitable medium plays important rule in sensitivity and selectivity of
developed voltammetric methods. Therefore, as the first step the effect of pH in range 2 – 12
of Britton-Robinson buffer on the voltammetric signal of paraquat was investigated. For
further measurements pH 11 was used, where the substance gave two well-developed
waves/peaks for both voltammetric techniques, DCV and DPV. Passivation of the working
electrode surface is common problem of solid electrodes. Therefore, repeatability of
measurements at m-AgSAE was checked. For DCV the repeatability was on acceptable level,
but for DPV at pH 11 the signal of second peak was not stable for repeated measurements
after the activation of the electrode (see Fig. 1). For this reason just the signal of the first peak
was used for analytical application. The found optimal conditions were used for measuring of
calibration dependences in the concentration range from 1.10-4 to 2.10-6 mol.l-1 with DCV and
from 1.10-4 to 2.10-7 mol.l-1 with DPV. According to the obtained results, DPV seems to be
more sensitive and gives more linear calibration curves then DCV, as can be seen in Table I.
1
-90
Ip, nA
-60
2
-30
0
0
20
N
40
Fig. 1. Dependence of the first (1) and the second (2) peak current of paraquat (c = 10-4 mol.l1
) on serial number of repetitive measurements (N) using DPV at m-AgSAE in BrittonRobinson buffer pH 11.
45
Table I.
Comparison of developed methods for the determination of paraquat in Britton-Robinson
buffer pH 11 on m-AgSAE.
Method Calibration range,
LOD,
mol.l-1
mol.l-1
DCV
2.10-6 – 1.10-4
7.2.10-7
DPV
2.10-7 – 1.10-4
1.0.10-7
Conclusions
These newly developed methods could be applied for the determination of paraquat in simple
environmental matrix such as drinking and river water. The m-AgSAE showed for this
substance good response and acceptable reproducibility without any surface regeneration.
This indicates, that m-AgSAE is a suitable sensor for the determination of this substance. The
limit of determination was on submicromolar level for both used voltammetric techniques;
sensitivity of these methods could be further increased by a preconstruction step. 3
Acknowledgements
Financial support from Technology Agency of the Czech Republic (project TA01020565) is
gratefully acknowledged.
References
1. Mai N. N., Liu X. Y., Wei W. Z., Luo S. L., Liu W.: Microchim. Acta 174, 89 (2011).
2. de Souza D., Machado S. A. S., Pires R. C.: Talanta 69, 1200 (2006).
3. Karuppagounder S. S., Ahuja M., Buabeid M., Parameshwaran K., Abdel-Rehman E.,
Suppiramaniam V., Dhanasekaran M.: Neurochem. Res. 37, 1102 (2012).
4. Fischer J., Barek J., Dejmkova H.: Curr. Org. Chem. 15, 2923 (2011).
5. Barek J., Cabalkova D., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Environ.
Chem. Lett. 9, 83 (2011).
46
Adsorption and Two–Dimensional Condensation of Cytosine Derivatives at Mercury
and Gold Single Crystal Electrode
Lukáš Fojt a and Thomas Doneux b
a
Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
b
Chimie Analytique et Chimie des Interfaces, Faculté des Sciences, Université Libre de
Bruxelles, Boulevard du Triomphe, 2, CP 255, B-1050 Bruxelles, Belgium
Abstract
Nucleic acids bases are well known for their extraordinary high ability of self-association at
electrodes surfaces. Formation of self assembled monolayers with specific molecular
orientation – two dimensional (2D) condensations – is allowed by this ability. The 2D
condensation of different substituents of cytosine, namely 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine
and 5-iodocytosine, was studied using hanging mercury drop and gold single crystal
electrode. We have found, that all of these derivatives form 2D capacitance pits for different
pH`s.
Keywords: 2D Condensation, Capacitance pit, Hanging mercury drop electrode, Cytosine
derivatives, Self-assembly, Gold single crystal electrode.
Introduction
It was found that purine and pyrimidine derivatives currently occurring in nucleic acids posses
an extraordinary high ability of self-association at the electrode surface and can form there by
a two-dimensional (2D) condensation a monomolecular layer 1. This property was probably
significant for the origin of life at the earth 2. 2D condensation, initially observed at dropping
mercury electrode 3 has been studied at different electrode surfaces, such as hanging mercury
drop electrode 4, mercury film electrodes 5, or gold 6,7 and silver single crystal 8 electrodes. At
mercury based interfaces, 2D condensed films are mainly studied using measurement of the
differential capacitance (Cd) of the electrode double layer. When a compact film of molecules
is formed, all solvent molecules are replaced from the electrode surface by the condensed
molecules and the differential capacitance Cd of the electrode double layer is depressed
considerably, giving rise to characteristic “pit” in the capacitance–potential curves. In the case
of single crystal electrodes, the presence of 2D layer is associated with the presence of sharp
spikes in the cyclic voltammograms. The formation of 2D condensed monolayers, which
exhibit supramolecular organizations, is a complex mechanism driven by a long-range
ordering underlain by different intermolecular interactions. These stabilization forces are
mainly driven by hydrogen bonding between “flat-lying” adsorbates, stacking between
“vertically” oriented molecules, dispersion and electrostatic interactions. Dipole orientation in
the external electric field can lead to the reorientation of the adsorbed molecules at the
electrode surface, which may lead to the formation of different 2D condensed layers
depending on the electrode potential 9,10.
Therefore, in our present study, the effects of different electrode surfaces, pH values and
substituents on the 2D condensation of cytosine were studied. For our experiments, we used
three halogen derivatives of cytosine: 5-fluorocytosine (5FC), 5-bromocytosine (5BC) and
5-iodocytosine (5IC).
Experimental
Electrochemical measurements were done using a conventional three electrode system with a
platinum wire (diameter 1 mm) as the counter electrode and a Ag|AgCl|3 M KCl reference
electrode, controlled by an AUTOLAB electrochemical system PGSTAT 302 (EcoChemie,
Utrecht, Netherlands) equipped with a frequency–response analyzer module (FRA2). The
47
specific area capacitance (Cd) – electrode potential (E) curves were measured (if not stated
otherwise) at a scan rate of 5 mV.s–1, the frequency 37 Hz and amplitude of the sinusoidal
perturbation 10 mV. A hanging mercury drop electrode (HMDE) system (Metrohm VA stand
663, Switzerland) with drop surface area of 0.4 mm2 was used for the experiments conducted
at the hanging mercury drop electrode. The gold single crystal electrode in (111) orientation
(Au(111)) was grown, oriented, cut and polished using the procedure developed by Hamelin
11
. Before each experiment, it was flame annealed during a few seconds and allowed to cool
down just above the surface of ultrapure water. Temperature was controlled using Huber
CC2–K6 thermostat.
Britton–Robinson buffer with 0.5 M NaCl and tri–distilled water was used with the mercury
working electrode, 0.1 M potassium perchlorate salt was the electrolyte used with the Au(111)
working electrode. All chemicals were of the highest available purity (Sigma–Aldrich, USA).
Results and discussion
The adsorption behavior of cytosine and some its derivatives was previously studied 4 on
mercury based electrodes. These studies revealed a complex adsorption behavior at this
interface, each investigated compound producing various adlayers depending on the electrode
potential, pH or the concentration. Therefore, we chose all available halogen derivates of
cytosine at 5 positions for our present study.
Fig 1 displays all used derivates, 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine and 5-iodocytosine at two
different pHs. Fig. 1A shows situation for low pH (pH = 3) and Fig. 1B for neutral pH.
Concentrations of all derivatives were close to their saturation concentrations. All the
derivates are able to condensate at low pH, whereas the condensation ability of 5FC at neutral
pH was not observed. In acidic medium, the three derivatives form a condensed adlayer at
potentials slightly more negative than the point of zero charge of the mercury electrode (≈
−0.45 V). This fact suggests that the pit is stabilized at slightly negatively charged electrode
by positively charged adsorbates. Only 5FC is able to form a second adlayer more negatively
(around E = -1.2 V to -1.4 V). This 2D condensed pit is observable only at high ac
perturbation frequencies – around 10 kHz – where the faradaic signal from 5FC reduction is
minimized. Interestingly, this pit is very probably formed due to dipole orientation at very
negative potentials. All other observed 2D pits seem to be stabilized by dispersion forces and
hydrogen bonding should be considered, as well as electrostatic interactions. The relative
amplitude of each contribution strongly depends on the pH.
2D condensation could be observed at single crystal electrodes. In our case, we used Au(111)
single crystal electrode. Fig. 2 shows the behavior of the three cytosine derivatives at this
surface using cyclic voltammetry. Unfortunately, due to the huge reduction peak of 5IC (blue
curve on Fig. 2), we were not able to detect any sign of 2D condensation on Au(111). For the
other compounds, some region of interest on the cyclic voltammograms could be recognized
according to the literature 8. Region I was assigned to a disordered, gaslike adsorption of the
molecule. Charge transfer takes place in the electrode potential Region III, corresponding to
the transition from a physisorbed layer to a chemisorbed layer. In Region IV is this layer
compact. Sharp spikes corresponding to formation of adsorbed layer could be observed on of
the negative-going sweep for 5BC (E = -0.4 V), and in both scanning directions around
E = -0.6 V in the case of 5FC. These spikes are of particular interest since their presence
reflects a phase transition between the dilute adlayer in Region I and a 2D condensed layer in
Region II.
48
Fig. 1. Differential capacitance - potential curves of 5-cytosine derivatives at different pH’s
and close to their saturation concentrations, hanging mercury drop electrode, T = 278 K. Grey
chain line – electrolyte (BR buffer with 0.5 M NaCl addition); red dashed line – 45 mM 5fluorocytosine, ac frequency 9943 Hz; blue dotted line – 3 mM 5-iodocytosine; green solid
line – 10 mM 5-bromocytosine. Fig. 1A displays situation at pH = 3, Fig. 1B. pH = 7.
j / A.cm-2
10
5
III
I
IV
II
0
-5
-10
-15
-0,7
-0,3
0,1
0,4
E (vs. Ag|AgCl) / V
Fig. 2. The plot of current density, j, as a function of electrode potential, E, for Au(111) in the
presence of 10 at 298 K in an electrolyte (0.1 M KClO4 – grey chain line). Red dashed line –
10 mM 5-fluorocytosine; blue dotted line – 3 mM 5-iodocytosine; green solid line – 10 mM
5-bromocytosine. Scan rate υ = 20 mV s−1. For different region descriptions see the text.
49
Conclusion
We found that all used halogen derivatives of cytosine are able to undergo 2D condensation
on hanging mercury drop and gold single crystal electrode. We found interesting effect of ac
perturbation frequency on measurement of 5FC, where the 2D condensed layer is while
measured at lower frequencies hidden under faradaic signal of 5FC reduction.
Acknowledgement
This work was supported by Czech Science Foundation (Grant P205/10/2378, P206/12/G151
and P206/12/2378).
References
1. Vetterl V.: Collect. Czech. Chem. Commun. 31, 2105 (1966).
2. Sowerby S.J., Cohn C.A., Heckl W.M., Holm N.G.: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98,
820 (2001).
3. Buess-Herman, C.: Prog. Surf. Sci. 46, 335 (1994).
4. Fojt L., Vetterl V., Doneux T.: Collect. Czech. Chem. Commun. 74, 1611 (2009).
5. Hasoň S., Simonaho S. P., Silvennoinen R., Vetterl V.: Electrochim. Acta 48, 651 (2003).
6. Scharfe M., Hamelin A., Buess-Herman C.: Electrochim. Acta 40, 61 (1995).
7. Doneux T., Fojt L.: ChemPhysChem 10, 1649 (2009).
8. Hö1zle M. H., Krznaric D., Kolb D. M.: J. Electroanal. Chem. 386, 235 (1995).
9. Fojt L., Vetterl V., Doneux T.: Bioelectrochemistry 75, 89 (2009).
10. Fojt L., Doneux T., Vetterl V.: Electrochimica Acta 73, 141 (2012).
11. Hamelin A.: Modern Aspects of Electrochemistry, vol.16, pp. 1–101.Plenum Press. New
York. 1985.
50
Electrochemical Synthesis of Ferrates(VI) in Molten NaOH
Miroslav Gál, Lucia Hrnčiariková, Kamil Kerekeš, and Ján Híveš
Department of Inorganic Technology, Faculty of Chemical and Food Technology, Slovak
University of Technology in Bratislava, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovakia,
E-mail: [email protected]
Abstract
Cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy were used to study
ferrate(VI) synthesis in the molten sodium hydroxide at pure iron (Fe), silicon-rich steel
(FeSi) and white cast iron (FeC) electrodes. Transpassive iron dissolution, including
ferrate(VI) production together with massive oxygen evolution occurs after passivity region.
Impedance data confirm model of the polarized interphase based on the concept of two
macro-homogeneous sublayers. Parameters of equivalent circuit confirm that layers are
getting thinner or more disintegrated by strong anodic dissolution and/or massive oxygen
evolution. The number of exchanged electrons during ferrate(VI) formation reaction was z = 3
for all electrode materials used.
Key words: Ferrate(VI), Impedance spectroscopy, Sodium Hydroxide melt, Anodic
dissolution, Electrochemical synthesis.
Introduction
Electrochemical DC (direct current) and AC (alternating current) techniques are suitable for
interfacial and metal dissolution studies in both aqueous and molten solutions 1-16. Iron is
typically found as ferrous(II) and ferric(III) ions. However, other not very stable states have
been also observed, e.g. ferrate(VI) 17. Stahl prepared K2FeO4 by oxidation of iron filings in
molten KNO3 in 1715 17. Fremy assumed that the violet color of this product was caused by
the presence of FeVI O3 17. Poggendorf in 1841 17, 18 electrochemically prepared ferrates(VI)
by anodic oxidation of iron in alkaline electrolyte.
-II
High oxidation potential of ferrates(VI) allows the decomposition even very stable chemical
and biological contaminants. Moreover, Fe(OH)3, product of ferrate(VI) reduction does not
burden the environment, is non-toxic and is excellent coagulant and flocculant. In most cases,
ferrates(VI) provides a complete degradation of the pollutant without harmless by-products 19.
Therefore, it can be nominated as a „green” environmental friendly oxidant 20. Another
utilization of ferrates(VI) is in organic synthesis, especially for the selective oxidation of
primary and secondary alcohols to aldehydes and ketones 21. In the field of the corrosion
protection, ferrates(VI) are used for passivation of aluminum, zinc and iron products, or to
dissolve resistant layer of deposits 17.
Three methods of ferrates(VI) synthesis are listed in literature 17: dry oxidation, wet oxidation
and electrochemical preparation. During dry oxidation iron or iron oxide is heated to a high
temperature in the melt of alkali metal compounds. A principle of wet oxidation is absorption
of chlorine in solution of concentrated sodium hydroxide and subsequent reaction of the
resulting hypochlorite ferric ion to form ferrates(VI). Electrochemical method is based on
anodic oxidation (dissolution) of iron or cast iron in concentrated hydroxide solutions or
melts. In the case of a melt suitable temperature for ferrates(VI) synthesis is up to 200 ºC. In
water solutions the typical temperature range is from 20 to 70 °C 17. Electrochemical method
produces high purity ferrates(VI).
Stability of ferrate(VI) in the presence of water remains the weak point of electrochemical
approach. Even a small amount of water decomposes ferrate(VI) within hours. An
51
electrochemical treatment of iron in low-temperature binary hydroxide melt, e.g. KOH-LiOH,
NaOH-KOH, CsOH-LiOH, KOH-RbOH has been proposed for ferrates(VI) preparation to
increase their stability 22. Additionally, reaction rate can be easily and continuously controlled
by adjusting temperature in order to achieve the optimum anodic dissolution conditions. Híveš
et al. 22 reported the minimal thermal decomposition of ferrates(VI) during their
electrochemical preparation.
Ferrates(VI) formation can be detected easily by observing color change of the electrolyte.
Titration, chemical precipitation, spectral and electrochemical methods can be used for the
quantitative determination of ferrates(VI) concentration 21.
This contribution describe the preparation of ferrates(VI) by transpassive dissolution of pure
iron (Fe), silicon-rich steel (FeSi) and white cast iron (FeC) electrodes in the molten sodium
hydroxide.
Experimental
An oil thermostat with calibrated sensor, stainless steel box and PTFE crucible with sodium
hydroxide (p.a., Mikrochem Ltd. Pezinok, Slovakia) was used for our experiments. Reference
connection of thermocouple was immersed in a Dewar flask with ice-water. Electrochemical
measurements were performed using a three-electrode electrochemical system and PGSTAT
20 with FRA2 module (ECO Chemie, The Netherlands). Working electrodes (WE) were
made from: pure iron (Fe) (99.95 wt.% Fe, 0.005 wt.% C, 0.0048 wt.% Ni and 0.0003 wt.%
Mn), silicon steel (FeSi) (3.17 wt. % Si, 0.47 wt.% Cu, 0, 23 wt.% Mn, 0.03 wt.% Ni), and
white cast iron (FeC) (3.17 wt.% C in the form of Fe3C, 0.44 wt.% Mn and 0.036 wt.% Ni).
The geometric area of the working electrodes varied from 0.2 to 0.7 cm2. The same material
served as the reference electrode (RE). Counter electrode (CE) was made from mild steel
(steel class 11). The temperature was varied in the range 70 ºC to 160 ºC. The lower
temperature was limited temperature of eutectic NaOH-NaOH.H2O which is 62.5 °C at the
composition of 74 wt. %. Impedance measurements were carried out in the same systems
immediately after CV measurements. Frequency range used for the impedance measurements
was from 10 Hz to 100 kHz. Perturbation signal had a sinusoidal shape with amplitude of
5 mV.
Results and discussion
In Fig. 1 cyclic voltammograms of Fe, FeSi and FeC electrodes in the molten NaOH at 80 °C
are plotted. All curves are characterized by the presence of several anodic and cathodic
current peaks. On the anodic part of the cyclic voltammograms two, well separated, current
peaks A(I) and A(II) are observed. Peak A(I) corresponds to the Fe(II) formation according to
equation:
Fe 2OH-
Fe(OH)2 2e-
(1)
Further oxidation process (A(II) peak) can be described as follows:
Fe(OH)2 OH- Fe(OH)3 eFe(OH)2 OH- FeOOH H2 O e2Fe(OH)2 2OH- Fe2 O3 3H2 O 2e-
(2)
(3)
(4)
52
40
A(I)
A(II)
A(IIa)
A(IIb)
0
C(II)
250
C(III)
j / mA cm-2
j / mA cm-2
20
-20
200
A(III)
150
100
50
-40
C(I)
0
1.5
0.0
0.5
1.6
1.0
E/V
1.7
1.5
E/V
Fig. 1. Cyclic voltammograms of pure iron (solid line), FeSi (dashed line), and FeC (dotted
line) WE at t = 80 °C; v = 400 mV s-1; arrows indicate the potential sweep direction.
Nonstochiometric species similar to the magnetite with good protecting properties are
probably also formed. Due to its specific insulating properties and some kinetic limitation of
such process current peak A(II) is less pronounced than A(I) one 4. The higher is the
temperature the higher current densities are observed. At 120 °C A(I) and A(II) peaks are not
well separated and at 160 °C they form single doubled-peak. In the passivity region at about
850 mV vs. RE broad, not perfectly visible current peak A(IIb) is observed. This peak,
together with peak A(IIa), is assigned to the restructuring, formation and/or transformation of
an anodic solid surface layer. After passivity region a transpassive iron dissolution, together
with ferrate(VI) formation (current peak/shoulder A(III)) and oxygen evolution occurs. A
hysteresis in the course of voltammetric curve in the transpassive potential region was
observed. It is probably connected with either diminution of an inhibition of electrode surface
toward dissolution at high potentials or massive oxygen evolution causing the mechanical
disruption of the anode surface.
In the cathodic direction a peak corresponding to ferrates(VI) reduction (peak C(III)) occurs.
Compare to all faradaic anodic peaks, this one is badly pronounced. Other cathodic peaks
(C(II) and C(I)) are assigned to the reduction of Fe(III) to Fe(II) and Fe(II) to Fe(0),
respectively.
Linear dependences of current density on square root of scan rate were found indicating that
the electrode reaction kinetic is controlled by mass transport under the semi-infinitive linear
diffusion conditions. In the case of FeC electrode, current density at high temperature after
reaching a certain maximum at about 400-500 mV s-1 decreases with increasing polarization
rate. It seems, that a chemical step become rate determining when scan rate reach ca.
400 mV s-1. Our observation is in agreement with previous results in the hydroxide melts 22
and strong alkaline aqueous solutions 23-25.
In order to deeply characterize ferrate(VI) electrochemical synthesis EIS was used. An
example of impedance spectra obtained for pure iron (Fe) electrode at several potentials is
shown in Fig. 2.
53
12
8
1.2
6
0.8
-Z" / Ohm
-Z" / Ohm
10
4
2
0.4
0.0
-0.4
-0.8
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
2.4
Z' / Ohm
0
5
10
Z' / Ohm
15
Fig. 2. Nyquist plots of impedance spectra for pure iron (Fe) electrode at t = 150 °C and at
chosen potentials vs. RE: □ 1.4 V; ○ 1.5 V;  1.6 V.
Two time constants are recognized. The electrochemical behavior of electrodes in molten
NaOH was modeled according proposed equivalent circuit. The physical model based on the
concept of two macrohomogeneous surface layers was used to find the best equivalent circuit
representation of our results. Two parallel R-Q (constant phase element) impedance elements
characterizing individual layers (inner, outer) connected in series together with one resistant
(RS) and one inductance (L) element compose the simplest equivalent circuits that fit our
experimental data with acceptably low χ2. Constant phase element (Q) was used instead of
pure capacitance element (C) to underline the nonlinearity of the dissolution process.
Resistances of both inner and outer layer decrease with increasing applied potential, therefore
either both layers are getting thinner with increasing potential or disintegrate by strong anodic
potential and/or an oxygen evolution. Resistance of outer layer is lower than resistance of
inner one. The capacitances of inner and outer layer increase with increasing potential.
Capacity of inner layer is slightly lower than capacity of outer one. This is in agreement with
resistances measurements meaning that inner layer is either thicker and/or more compact than
outer one. Additional information can be gained from n parameter of constant phase element.
In the case of outer layer n decreases almost ideal behavior to imperfect one with increasing
applied potential. This means the quality of the outer layer is changing and the specific
surface is increasing and is getting more porous. Bearing in mind the previous conclusions
about Rout and Qout, one should think about the disintegration of the outer layer rather than
reduction in its thickness. ninn is almost unchanged for all potential applied. Therefore, the
conclusions made for Rinn and Qinn are connected to the reduction in thickness of the inner
layer rather than its disintegration.
The number of electrons was calculated from the slope of the dependence of the current
densities on potentials in ferrate(VI) formation region (static polarization curve). This analysis
gave number of electrons z  3 for all electrodes.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge the financial support for this research by the Ministry of
Education, Science, Research and Sport of the Slovak Republic within project
54
VEGA 1/0985/12 and by the Research & Development Operational Program funded by the
ERDF within project ITMS 26240220073.
References
1. Bouzek K., Flower L., Roušar I. and Wragg A. A.: J. Appl. Electrochem. 29, 569 (1999).
2. Bouzek K. and Roušar I.: J. Appl. Electrochem. 23, 1317 (1993).
3. Dytrtova J. J., Jakl M., Schroder D. and Navratil T.: Curr. Org. Chem. 15, 2970 (2011).
4. Hives J., Benova M., Bouzek K., Sitek J. and Sharma V. K.: Electrochim. Acta 54, 203
(2008).
5. Naumowicz M., Petelska A. D. and Figaszewski Z. A.: Electrochim. Acta 54, 1089
(2009).
6. Naumowicz M., Petelska A. D. and Figaszewski Z. A.: Cell Biochemistry and Biophysics
61, 145 (2011).
7. Naumowicz M., Petelska A. D. and Figaszewski Z. A.: Steroids 76, 967 (2011).
8. Novotny L., Navratil T., Sander S. and Basova P.: Electroanalysis 14, 1105 (2002).
9. Novotny L., Navratil T., Sander S. and Basova P.: Electroanalysis 15, 1687 (2003).
10. Petelska A. D., Naumowicz M. and Figaszewski Z. A.: Langmuir 28, 13331 (2012).
11. Sestakova I. and Navratil T.: Bioinorganic Chemistry and Applications 3, 43 (2005).
12. Huskova R., Matisova E., Svorc L., Mocak J. and Kirchner M.: J. Chromatogr. A 1216,
4927 (2009).
13. Mackulak T., Olejnikova P., Prousek J. and Svorc L.: Chemical Papers 65, 835 (2011).
14. Svorc L., Sochr J., Svitkova J., Rievaj M. and Bustin D.: Electrochim. Acta 87, 503
(2013).
15. Svorc L., Sochr J., Tomcik P., Rievaj M. and Bustin D.: Electrochim. Acta 68, 227
(2012).
16. Svorc L., Tomcik P., Svitkova J., Rievaj M. and Bustin D.: Food Chem. 135, 1198
(2012).
17. Macova Z., Bouzek K., Hives J., Sharma V. K., Terryn R. J. and Baum J. C.:
Electrochim. Acta 54, 2673 (2009).
18. Poggendorf J. C.: Pogg. Ann. 54, (1841).
19. Licht S., Yang L. and Wang B. H.: Electrochem. Commun. 7, 931 (2005).
20. Sharma V. K.: Advances in Environmental Research 6, 143 (2002).
21. Delaude L. and Laszlo P.: J. Org. Chem. 61, 6360 (1996).
22. Hives J., Benova M., Bouzek K. and Sharma V. K.: Electrochem. Commun. 8, 1737
(2006).
23. Macova Z. and Bouzek K.: J. Appl. Electrochem. 41, 1125 (2011).
24. Macova Z. and Bouzek K.: J. Appl. Electrochem. 42, 615 (2012).
25. Macova Z., Bouzek K. and Sharma V. K.: J. Appl. Electrochem. 40, 1019 (2010).
55
Carbon Fiber Microelectrodes Modified by Silver for Determination of Hydrogen
Peroxide
a,b
Vladimir Halouzka , Petr Jakubec a, Jan Hrbáč a, and Libuše Trnková b
a
Department of Physical Chemistry, Palacký University, tr. 17. listopadu 12,
771 46 Olomouc, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Department of Chemistry, Masaryk University, Kamenice 5, 625 00 Brno, Czech Republic
Abstract
Carbon fiber microelectrodes coated with a silver and Nafion layers constitute sensitive H2O2
sensors. The silver at the electrode is composed of porous, partially aggregated and crystalline
deposits of silver nanoparticles. A wide concentration range (from 1x10–5 up to 0.1 M H2O2)
is achieved when using amperometry in stirred solution at 0 mV (vs. Ag/AgCl).
Key words: Carbon fiber microelectrode, Silver, Sensor.
Introduction
Electrodes containing silver nanoparticles as an active material have recently gained a great
deal of interest as sensors for H2O2 amperometric determination in the cathodic region of
potentials (e.g. 1, 2). A one approach to achieve nanostructuring of the electrode surface is the
electrodeposition from the mixture of target metal salt and a suitable structure directing agent.
This technique was first described by Evans et al. 3 who prepared platinized platinum
electrode from the aqueous solution containing K2PtCl6 and octaethyleneglycol
monohexadecyl ether. In this contribution we have found that Pluronic F127 is an effective
structure directing agent for coating carbon fiber microelectrode with silver. The properties of
the electrode prepared this way are presented.
Experimental
Microelectrode fabrication
Carbon fiber (diameter 7 μm, Ten Cate Advanced Composites, Amsterdam, The Netherlands)
is glued using conductive silver epoxy (Epotek H20E, Polytec, Germany) onto copper wire,
the junction is then cured at 170 °C for 10 min. The fiber with copper contact attached is
fitted into the glass capillary, about 5 mm of the fiber is left protruding from its contracted
end. Both sides of the capillary (fiber and wire) are glued using epoxy resin (CHS Epoxy
1200, Sindat Pilsen, Czech Republic). Prior to use, the protruding fiber is cut to the length of
approx. 1 mm by lancet, the fiber end of the electrode is briefly sonicated in dichloromethane
in order to remove grease.
Microelectrode coating and sensor testing
For electrochemical measurements the CH Instruments 660C workstation with Pt wire as an
auxilliary, Ag/AgCl as a reference and microelectrode sensor as a working electrode.
Amperometry in stirred solution was used to test the microelectrode sensors. H2O2 aliquots
were introduced into the cell using an autosampler. For testing the selectivities of the sensor,
aliquots of selected interference compounds were introduced into the cell using Hamilton
microsyringes.
Results and Discussion
In our efforts to find optimum coating method, we tested a range of surfactants including
Pluronic F127, which proved itself to be an optimum structure tuning agent. The
electrodeposition of silver onto carbon fiber was therefore performed from 0.08 M silver
nitrate solution containing 25 % of Pluronic F127 at –300 mV vs. Ag / AgCl for 60 sec in
quiescent solution, amperogram recorded during electrodeposition processes is shown in
Fig. 1. The electrodes were then covered with Nafion using a “dip–dry (1h at 80°C)” method.
56
Amperometric curves for H2O2 reduction are shown in Fig. 2 for two operational potentials,
calibration curve for H2O2 determination on silver coated carbon fiber electrode using
constant potential amperometry in stirred solution at 0 mV vs. Ag/AgCl is shown in Fig. 3.
When the electrode is biased at 0 mV, a broad usable concentration range is achieved, at the
expense of some current sensitivity.
15
3
10
2
5
1
0
0
100
200
300
400
I (  A)
I (  A)
Fig. 1. Amperogram recorded during electrodeposition processes of silver, deposition from
AgNO3 (0.08 M) in the presence of Pluronic F127 (25 % (w/w)).
0
500
Time (s)
Fig. 2. Amperometric response curves of carbon fiber microelectrodes covered with silver and
Nafion at –400 mV (left axis) and 0 mV (right axis) in stirred BR buffer (PH=7), each
addition corresponded to 1 mM H2O2.
57
4
r2= 0,9967
I (A)
3
2
r2= 0,9974
1
0
0
10
20
30
40
50
c H2O2 (mM)
Fig. 3. Calibration curve for H2O2 determination on silver coated carbon fiber electrode using
constant potential amperometry in stirred solution at 0 mV vs. Ag/AgCl.
As the potential employed (0 mV) is less cathodic than −400 mV used by most of the authors
working in the field could make the measurement susceptible to interferences by easily
oxidizable compounds, we tested representative species for interferences. We have found that
ascorbic acid, uric acid and acetaminophen do not produce significant response, shown in
Fig. 4.
0.35
I (A)
0.30
hydrogen
peroxide
0.25
buffer
0.20
uric acid
0.15
ascorbate
0
300
600
acetaminophen
900
1200
1500
1800
Time (s)
Fig. 4. Amperometric measurement performed at pH 7 in stirred solution with silver coated
carbon fiber electrode biased at 0 mV vs. Ag/AgCl. Ascorbate, uric acid, acetaminophen and
hydrogen peroxide.
58
Conclusion
We have shown that carbon fiber coated with a silver layer electrodeposited from silver
nitrate / Pluronic F127 solution and subsequently stabilized by Nafion layer can be used as
sensor for hydrogen peroxide amperometric monitoring.
Acknowledgement
Financial support from the "Postdoc I", reg. No. CZ.1.07/2.3.00/30.0009 (The project is cofinanced by the European Social Fund and the state budget of Czech Republic) is gratefully
acknowledged.
References
1. Guascito M. R., Filippo E., Malitesta C., Manno D., Serra A., Turco A.: Biosens.
Bioelectron. 4, 24 (2008).
2. Welch C. M., Banks C. E., Simm A. O., Compton R. G.: Anal. Bioanal. Chem. 1, 382
(2005).
3. Evans S. A. G., Elliott J. M., Andrews L. M., Bartlett P. N., Doyle P. J., Denuault G.:
Anal. Chem. 6, 74(2002).
59
Electroanalytical Methods – Sensitive Tools for DNA Structure Transitions Analysis
(Elektroanalytické metody – citlivé nástroje pro analýzu strukturních přechodů DNA)
Luděk Havran a, Pavlína Vidláková a, Hana Pivoňková a, Iva Kejnovská a,
Michaela Vorlíčková a, Libuše Trnková b, and Miroslav Fojta a
a
Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
b
Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5,
625 00 Brno, Czech Republic
Abstract
The nucleic acids, depending on their nucleotide sequences, can exhibit a variety of
conformational transitions and adopt different secondary structures such as hairpins, triplexes,
left-handed Z-DNA or quadruplexes. Nucleic acids are electroactive species producing set of
intrinsic voltammetric signals at different types of working electrodes. Some of these are
sensitive to DNA structure changes. In this contribution we studied influence of forming of Gquadruplexes on electrochemical behavior synthetic ODN at mercury and carbon electrodes.
Key words: DNA structure transitions, DNA secondary structures, G-quadruplex,
Electroanalytical methods, Mercury electrodes, Carbon electrodes.
Úvod
Konformace DNA a její změny jsou biologicky významné a hrají důležitou roli v některých
onemocněních způsobených genetickými poruchami nebo poškozením DNA. Nukleové
kyseliny mohou v závislosti na jejich nukleotidové sekvenci a vnějších podmínkách zaujímat
různé sekundární struktury, jako jsou například vlásenky, DNA triplexy, křížové struktury
nebo G-tetraplexy 1. Tyto sekundární struktury se také vyskytují v přirozené DNA, kde jsou
stabilizovány negativním nadšroubovicovým vinutím 2. Jedním z nástrojů pro studium těchto
jevů jsou i elektroanalytické techniky. DNA je přirozeně elektroaktivní látka poskytující řadu
vlastních elektrochemických signálů na různých typech pracovních elektrod 3. Některé
z těchto signálů, především na rtuťových elektrodách, jsou velmi citlivé ke změnám struktury
DNA.
V tomto příspěvku budou prezentovány výsledky studia elektrochemického chování
syntetických oligonukleotidů (ODN) tvořících G-tetraplexy na rtuťových a uhlíkových
elektrodách.
Experimentální část
Použité ODN byly zakoupeny od firmy VBC-Biotech Service GmbH (Rakousko). Všechna
elektrochemická měření byla prováděna pomocí potenciostatu/galvanostatu Autolab
(Metrohm-Autolab, Holandsko) a elektrodového systému 663 VA-stand (Metrohm,
Švýcarsko) v tříelektrodovém zapojení. Jako referenční elektroda byla použita Ag/AgCl/3M
KCl a jako pomocná elektroda platinový drát. Jako pracovní elektroda byla použita visící
rtuťová kapková elektroda (HMDE) anebo elektroda z pyrolytického grafitu (PGE).
Elektrochemická měření byla prováděna adsorptivní přenosovou rozpouštěcí cyklickou
voltametrií (AdTS CV), adsorptivní přenosovou rozpouštěcí voltametrií s vnuceným
pravoúhlým napětím (AdTS SWV) a adsorptivní přenosovou rozpouštěcí voltametrií
s vnuceným střídavým napětím (AdTS ACV).
Výsledky a diskuse
Zbytky bází DNA podléhají redukci při dostatečně negativních potenciálech na HMDE.
Cytosin a adenin poskytují při katodickém scanu společný redukční signál – pík CA 3.
K redukci guaninového zbytku dochází při velmi negativních potenciálech (negativnějších
60
než -1,6 V), kdy je proud způsobený touto redukcí překryt proudem spojeným s vylučování
vodíku z roztoku základního elektrolytu. Pokud použijeme CV, pak můžeme v následném
anodickém scanu naměřit voltametrický signál příslušející oxidaci redukčního produktu
guaninu – 7,8-dihydroguaninu zpět na guanin (pík G) 4. CA pík je citlivý ke změnám ve
struktuře DNA a lze jej použít k rozlišení jednořetězcové DNA (ssDNA) od dvouřetězcové
(ds DNA) formy DNA. Použijeme – li fázově citlivou ACV, můžeme na HMDE naměřit
tenzametrické signály DNA (způsobené adsorpcí/desorpcí nebo reorientací DNA na povrchu
HMDE). Ty mohou být například použity pro analýzu strukturních přechodů plasmidové
DNA, kdy lze rozlišit superhelikální – nadšroubovicovou DNA od otevřené kružnicové formy
DNA (Obr. 1.). Další aplikací těchto signálů jsou pak elektrochemické senzory poškození
DNA 5.
1.0
0.9
0.8
I [A]
0.7
0.6
3
0.5
1
2
3
sc DNA
oc DNA
ss DNA
0.4
0.3
0.2
2
e
1
0.1
-1.4
-1.2
-1.0
-0.8
E [V]
Obr. 1. AdTS ACV záznamy různých forem DNA na HMDE. Frekvence 230Hz, Ei = -0,6 V,
Eend = -1,6 V, ta = 60s, elektrolyt: 0,3M NaCl + 50mM Na2HPO4.
G – bohaté ODN mohou za určitých podmínek tvořit čtyřřetězcové struktury stabilizované
guaninovými tetrádami – guaninové tetraplexy 6. Na HMDE a PGE byla studována série
ODN obsahujících oligo G úsek se vzrůstajícím počtem G (0-15). Pokud byly tyto ODN
analyzovány na PGE, voltametrický pík oxidace guaninu (Gox) lineárně rostl se zvyšujícím se
počtem guaninových zbytků v molekule ODN (Obr. 2). Naproti tomu pík G měřený na
HMDE vykazuje v závislosti na počtu guaninových zbytků maximum (Obr. 2). Toto
maximum, pro ODN obsahující 5 guaninových zbytků, koreluje s výsledky měření spekter
cirkulárního dichroismu. Pomocí této metody byla potvrzena tvorba guaninového tetraplexu
s paralelním uspořádáním řetězců u ODN s oligo G úsekem o délce 5 a více guaninových
zbytků. Během strukturního přechodu – tvorby tetraplexu pravděpodobně dochází ke změnám
v dostupnosti guaninových zbytků pro interakci s pracovní elektrodou a tudíž k poklesu píku
G s rostoucí počtem G v molekule ODN. Se vzrůstajícím počtem G navíc dochází také ke
změnám, které mohou mít vliv na pokles píku G na HMDE.
61
0.08
30
0.06
0.04
10
Gox Ip[A]
G Ip[A]
20
0.02
0.00
0
0
2
4
6
8
10
12
14
počet G
Obr. 2. Závislost výšky píku G () a píku Gox () na počtu guaninových zbytků v molekule
ODN.
Závěr
Experimenty na HMDE a PGE byla jasně dokumentována aplikace elektroanalytických metod
jako nástrojů pro detekci a analýzu strukturních přechodů DNA. Především rtuťové pracovní
elektrody jsou, vzhledem ke svým specifickým vlastnostem, pro tyto účely vhodné.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektů GAČR (P206/12/2378, P206/12/G151) a projektu
OPVK CZ.1.07/2.3.00/30.0019.
Literatura
1. Blackburn G. M., Gait M. J.: Nucleic acids in chemistry and biology. Oxford university
press, Oxford, 1996.
2. Paleček, E.: Crit. Rev. in Biochem. Mol. Biol. 26, 151 (1991).
3. Paleček E., Bartošík M.: Chemical Reviews 112, 3427 (2012).
4. Studničková M., Trnková L., Zetěk J., Glatz Z.: Bioelectrochem. Bioenerg.21, 83 (1989).
5. Fojta M.: Electroanalysis, 14, 1449 (2002).
6. Phan A. T., Kuryavyi V., Patel D. J.: Curr. Opin. Struct. Biol. 16, 288 (2006).
62
Continuous Glucose Monitoring by Real Time Sensor in Interstitial Fluid
(Kontinuální monitoring glukózy pomocí Real Time Sensoru v intersticiální tekutině)
Šárka Honsová a and Tomáš Navrátil b
a
Charles University in Prague, Faculty of Physical Education and Sport, José Martího 31,
162 52 Prague 6, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23
Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
The aim of this contribution is to compare the differences between accuracy claimed by the
manufacturer in continuous glucose monitoring using the MiniMed Paradigm REAL-Time
system with the results obtained in a patient during physical activity. Electrochemical glucose
sensor measures the glucose oxidase reaction products. Measurement accuracy was
determined using Clarke Error Grid analysis. It can be concluded that in the normal glucose
range (4.4 to 10.0 mmol/ l) was more accurate than the measurements given by the
manufacturer, in the opposite case; hyperglycemia is less precise than declared.
Key words: Continuous Glucose monitoring, Continuous Glucose Error Grid Analysis,
Glucose Oxidase response.
Úvod
Diabetes mellitus (dále DM) je chronické metabolické onemocnění. V současnosti je v České
republice evidováno cca 8 % populace jako diabetici. V roce 2011 to bylo 758 719 DM 2,
55 542 DM 1, 11 121 Sekundární diabetes 1. Člověk bez klinických obtíží má koncentraci
glukózy v krvi (glykemie) za fyziologických podmínek v rozmezí hodnot 3,9 − 5,6 mmol/l
nalačno a po jídle nižší než 10 mmol/l. Podrobné hodnoty a způsoby stanovení jsou
zpracovány v literatuře 2.
Kontinuální monitoring glykémie (CGM) je zejména u diabetiků 1. typu základní možností
zlepšení stavu a kvality života 3. Pro dobrou kompenzaci si diabetici 1. typu mají měřit
glykemii nejméně 4x denně. CGM je založen nejčastěji na elektrochemickém principu, u
některých typů senzorů se provádí měření na mikrodialyzačním principu nebo na principu
reverzní iontoforézy, na fluorescenčním nebo viskozimetrickém principu, nově na principu
Ramanovy spektroskopie 4, 5.
Nejčastěji používané CGM fungují na principu jehlového senzoru, který elektrochemicky
měří produkty glukózooxidázové reakce. V ČR jsou to senzory firmy Medtronic a DexCom.
Senzor je převážně tvořen platinovou elektrodou povlečenou glukózooxidázou, ta je pak
překryta semipermeabilní membránou. Po jejím zavedení do podkoží je senzor zvlhčen
intersticiální tekutinou a následně se začíná inicializovat. Senzor vyžaduje cca dvouhodinovou
inicializaci, pak generuje stabilní elektrický proud v rozsahu 10 – 100 nA. Tato hodnota
převážně přímo úměrná koncentraci glukózy v podkoží. Glukóza a kyslík z intersticiální
tekutiny difundují přes semipermeabilní membránu a reagují s glukózooxidázou na povrchu
elektrody senzoru za vzniku peroxidu vodíku a kyseliny glukonové. Peroxid vodíku pak
difunduje až na elektrodu, kde vlivem napětí dochází k jeho rozkladu na vodík a kyslík;
přenesené elektrony vytvářejí elektrický signál ISIG (Input Signal of Glucose) a tento signál
je úměrný koncentracím glukózy 2,2 - 22,2 mmol/l 6..Pomocí Minilinku každých 10 sekund
odesílá senzor hodnotu generovaného proudu i napětí do monitoru (pumpy). V pumpě je 1 x 5
minut vypočítávána průměrná hodnota z 30 měření, tu si pumpa uloží do paměti a zobrazuje
uživateli. Za 24 hodin se do monitoru uloží 288 hodnot koncentrace glukózy 7.
Glukometry se řídí ISO 15197:2003 8, ta udává, že 95 % změřených výsledků musí být v
rozmezí ±20 % od skutečnosti v hodnotách glykémie nad 4,17 mmol/l. a odchylku maximálně
63
0,83 mmol při glykemii pod 4,17 mmol/l. Pro CGM jsou podobné standardy ve vývoji a
neexistuje platná shoda na metodě hodnotící přesnost systémů CGM. Nejčastěji jsou
využívány matematické metody lineární regrese, chybové analýzy a střední absolutní
odchylky senzoru proti odpovídající referenční hodnotě měřené glukometrem.
Nejpoužívanější metodou je Clarkova chybová analýza využívající vztahu senzorem
měřených hodnot proti analyzátoru. Přesnost metody je závislá na tom, ve kterých čtvercích
se body nacházejí, nejvyšší přesnost má metoda s maximem hodnot ve čtvercích A a B. Pokud
se naměřené hodnoty dostanou do zón D a E, jedná se o klinicky nepoužitelnou metodu 9.
Každý senzor má svou životnost ta se odvíjí od zánětlivé odpovědi na přítomnost senzoru
v těle, životnosti jeho baterií, rychlostí degradace enzymu i vlastní elektrody, tvorby biofilmu
a mnoha dalších faktorů. Hlavními faktor životnosti a přesnosti senzoru jsou zánět v oblasti
vpichu senzoru a tvorba biofilmu. Vyvíjejí se tedy tzv. modifikátory tkáňové odpovědi, jimiž
bývá potažen povrch senzoru. Nejčastěji dexamethason, vazodilatační oxid dusnatý, VEGF,
antikoagulanty a další.
Cílem této práce bylo navázat na předchozí měření 10 a porovnat větší množství vzorků
zejména při fyzické zátěži a srovnat přesnost měření CGM versus glukometr uváděnou
výrobcem.
Experimentální část
Do porovnání byly zařazeny vzorky jednoho pacienta a pro všechna měření byly použity dva
Minilinky (transmiter). Ve třetině sledovaného období byla provedena výměna inzulínové
pumpy, dle technických informací výrobce 11 inzulínová pumpa přesnost kontinuálního
měření glykémie neovlivňuje.
Data pocházejí z CGM získaná v průběhu čtyř let, celkem bylo využito 48 kontinuálních
glukózových senzorů MMT-7002 a provedeno celkem 672 kalibrací senzoru. Došlo
k vyřazení všech měření, která neměla dobu mezi posledním stanovením glykémie MMT7002 a kalibračním měřením glukometrem Freestyle mini kratší než 10 min. (7,6 %) Do
zpracování postoupilo 621 párů hodnot glykémie (senzor – glukometr). Měření byla převážně
prováděna při zvýšené fyzické zátěži při sportu a při nestandardních situacích, když se
nedařilo dosáhnout cílových hodnot glykémie. Pacientova hladina glykovaného hemoglobinu
(HbA1c) se v rámci celého sledovaného období vešla do intervalu 4,8–5,4 %.
Referenční hodnoty k CGM byly pořízeny glukometrem Freestyle mini firmy Abbott, ten
pracuje na principu elektrochemického coulometru. Měří se výsledný náboj anody, ten je
úměrný množství glukózy v původním vzorku. Dle studie Institut für Diabetes-Technologie
Forschungs - und Entwicklungs Gesellschaft mbH mají tyto glukometry přesnost 98 -100 % 7.
Celková odchylka byla pro tento případ definována jako rozdíl mezi hodnotami glykémie
zjištěnými senzorem a glukometrem. Shoda mezi párovanými hodnotami byla určena jako
rozdíl mezi hodnotou naměřenou senzorem a hodnotou naměřenou glukometrem. Rozdíl je
procento hodnoty glukometru (střední absolutní odchylka v procentech). Přesnost měření
senzorů byla hodnocena prostřednictvím metody Clarkovy analýza chybové mřížky, protože
tato metoda byla užita výrobcem 11.
Pomocí Clarkovy analýza chybové mřížky u CG-EGA continuous glucose-error grid analysis
byly analyzovány hodnoty primární metody glykémie ze senzoru MMT-7002 a referenční
metody glukometru Freestyle mini v čase a trendu poklesu či vzestupu glykémie. Výsledky
jsou zobrazeny v mřížkovém pětizónovém grafu. Zóna A poskytuje u analyzovaných hodnot
nejvyšší přesnost, zóna E obsahuje zcela chybné hodnoty, ty vedou ke zcela chybným a
64
nebezpečným rozhodnutím pacienta, v zóně B se hodnoty liší o více než 20 % od referenční
metody, ale klinická rozhodnutí na základě měření nevedou k výraznějším chybám, hodnoty
v zóně C by mohly vést pacienta k nadměrné korekci normální glykémie, hodnoty v zóně D
reprezentující nesprávnou detekci klinicky významné glykémie nebo změny glykémie a
nesprávnou korekci. U změn glykémie rychlejších nebo pomalejších o více než
1,1 mmol/l/min, je nutno posunout hranice některých zón 12.
Výsledky a diskuse
Do analýzy byly zahrnuty všechny páry měření bez ohledu na rychlost změny glykémie.
Výrobce provádí analýzu dat podle původní Clarkovy metody 12 také bez ohledu na rychlost
změny glykémie. V našem vzorku byla sledována i rychlost změny glykémie, při rychlejší
změně glykémie než 1,1 mmol/l/min provedeno 19 % kalibrací. Při sportovních aktivitách, při
kterých byla převážná část vzorků získána, není možné čekat na ustálení hodnoty glykémie. Z
621 párů měření se 5 hodnot měřených glukometrem dostalo pod hranici 2,2 mmol/l proto je
počet párů v hladinách glykémie stanovených výrobcem 616.
Základní popis dat (Tabulka I) ukazuje, že senzory MMT-7002 většinou vykazují nižší
hodnoty. Střední absolutní odchylka zásadně ovlivní krajní hodnoty, maximální rozdíl byl
250 %, (většinou chyba kalibrace). Výrobce 11 uvádí střední absolutní odchylku menší
o 2,7 % a směrodatná odchylka (SD) je menší o 4,9 %.
Tabulka I.
Základní popis dat.
počet použitých párů měření
střední absolutní odchylka v procentech (α=0.05)
celková odchylka
621
22,5±2,7 %
151,5 mmol/l
Dle údajů výrobce je v rozsahu glykémie 4,5–6,7 99,9 %, naše zjištění se shodují 100 % párů.
Senzor tedy poskytuje vždy v tomto rozsahu glykémie správnou hodnotu.(v zóně A nebo B).
Korelogram klinické relevance odchylek měření mezi senzorem a glukometrem pomocí Clarkovy
analýzy chybové mřížky je na (Obr. 1) a Tabulka II.
Tabulka II.
Četnost spárovaných měření v jednotlivých zónách A-E* podle rozsahů koncentrací glukózy.
rozsah absolutn relativn A+ A+B A
A
B
B
C
C
D
D
glykémi í četnost
í
B
[%]
[%]
[%]
[%]
[%]
e
měření četnost
[mmol/l]
měření
[%]
2,2-4,4 155
25,2
112 72,3 77
49,7 35 22,6 0
0,0 43 27,7
4,5-6,7 174
28,2
174 100,0 118
67,8 56 32,2 0
0,0 0 0,0
6,8-13,3 263
42,7
253 96,2 184
70,0 69 26,2 10
3,8 0 0,0
>13,3
24
3,9
11
45,8
6
25,0 5 20,8 0
0,0 13 54,2
celkem 616
100,0
550 89,3 385
62,5 165 26,8 10
1,6 56 9,1
*
V zóně E se nenacházejí žádné hodnoty, proto není v tabulce uvedena.
65
Obr. 1. Korelogram Clarkovy analýzy chybové mřížky.
Tabulka III
Porovnání hodnot uváděných výrobcem s naměřenými
rozsah
A+B
A+B
glykémie
[%]
[%] dle
[mmol/l] naměř. výrobce
2,2-4,4
70,8
76,1
4,5-6,7
100,0
99,9
6,8-13,3
96,2
99,6
>13,3
45,8
86,8
Výrobce 11, námi získané hodnoty i další studie 13, 14 ukazují trend, že čím glykémie dosahuje
extrémnějších hodnot, tím je přesnost senzoru menší.
Závěr
Dospěli jsme k závěru, že CGM významně pomáhá při prevenci akutních komplikací u
pacienta s DM a to i v nadměrné zátěži. V pásmech normální glykémie jsou měření senzoru
přesnější, než udává výrobce. V pásmech hypoglykémie a hyperglykémie však dochází
k větším chybám měření, než udává výrobce, to je ovlivněno větším rozptylem hodnot
glykémie, protože pacient se chová jemu obvyklým, zažitým způsobem, nikoli způsobem
předepsaným klinickou studií. Práce se zaměřovala zejména na fyzické aktivity a s tím
související rychlé změny glykémie. Metoda kontinuálního monitoringu glykémie je
významnou pomocí u kompenzace a zjišťování trendů u pacienta s DM 1. typu a umožní tím
zmírnění nebo odsunutí druhotných následků DM.
66
Poděkování
Tato práce vznikla s institucionální podporou UK FTVS a s podporou grantů GA ČR
(č. P208/12/1645 a č. P206/11/1638).
Literatura
1. UZIS: Péče o nemocné cukrovkou. ÚZIS ČR, Prague 2011.
2. Friedecky B., Zima T., Kratochvil A., Springer D.: Diabetes mellitus - laboratorní
diagnostika a sledování stavu pacientů.
http://www.cskb.cz/res/file/doporuceni/DM_verze%202012.pdf, Downloaded:
27. 3. 2013.
3. Mueller A. J., Hasslacher C., Krivanek R., Knuth M., Nikolaus K. S., Kuester F., Theinert
S.: Diabetes Technol. The. 15, A68 (2013).
4. English B. E.: European Endocrinology 8, 18 (2012).
5. Broz J.: DIAstyl 5, 24 (2009).
6. Jirkovska A.: Remedia 2, 1 (2009).
7. Pickova K.: Přesnost měření glukometrů. http://www.mojecukrovka.cz/clanek/presnostmereni-glukometru/, Downloaded: 7. 2. 2013.
8. ISO 15197:2003 In vitro diagnostic test systems -- Requirements for blood-glucose
monitoring systems for self-testing in managing diabetes mellitus (2003).
9. Zourek M.: Zdravotnicke noviny 3, 2 (2012).
10. Honsova S., Navratil T.: Modern Electrochemical Methods XXXI: Evaluating the
Accuracy of Continuous Glucose Monitoring by the Patient through Continuous Glucose
Error Grid Analysis, Jetrichovice, (Navratil T., Barek J., Eds.) Best servis, Jetrichovice
2011, p. 59.
11. Medtronic: Guardian® REAL-Time Continuous Glucose Monitoring System.
http://ebookbrowse.com/guardian-real-time-user-guide-pdf-d445424236, Downloaded:
4. 3. 2011.
12. Kovatchev B., Anderson S., Heinemann L., Clarke W.: Diabetes Care 31, 1160 (2008).
13. Hasanbegovic S.: HealthMED 4, 615 (2010).
14. Clarke W. L., Anderson S., Kovatchev B.: Cur. Diabetes Rev. 4, 193 (2008).
67
Voltammetric Determination of 4-Nitrobiphenyl at a Mercury Meniscus Modified Silver
Solid Amalgam Electrode
Eva Horáková, Vlastimil Vyskočil, and Jiří Barek
Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre UNCE
"Supramolecular Chemistry", Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of
Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
A mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE) was used as
a working electrode for voltammetric study of electrochemical behavior and determination of
4-nitrobiphenyl (4-NBP). Optimal conditions for its determination in the concentration range
from 2⋅10–7 to 1⋅10–4 mol L–1 at the m-AgSAE using DC voltammetry (DCV) and differential
pulse voltammetry (DPV) were found in a mixture of 0.25 mol L–1 acetate buffer of pH 4.8
and methanol in a volume ratio of 7:3. Moreover, application of adsorptive stripping
differential pulse voltammetry (AdSDPV) was tested to achieve a lower limit of
quantification. The applicability of the developed methods was tested on model samples of
drinking and river water.
Key words: 4-Nitrobiphenyl, DC voltammetry, Differential pulse voltammetry, Adsorptive
stripping differential pulse voltammetry, Mercury meniscus modified silver solid amalgam
electrode, Supramolecular electrochemistry, Nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons.
Introduction
The studied compound – 4-nitrobiphenyl (4-NBP) – belongs to the group of nitrated
polycyclic aromatic hydrocarbons (NPAHs), which are known mutagenic agents 1. They can
be found in coal fly ash, engine exhaust, waters, sediments, tobacco smoke etc. 2,3. Many
NPAHs are also known as carcinogens. Therefore, there is an ever growing interest in their
monitoring in the environment 4-6. They are metabolically reduced to nitroso compounds,
hydroxylamines and amines, which can react with cellular macromolecules 1,7,8. The studied
compound is biologically active compound – according to the IARC 9, 4-NBP is ranked in the
group 3, i.e., its carcinogenic effects were established on animals 7,10. For the separation of
4-NBP from complex samples and its following determination, chromatographic and
spectrophotometric methods, respectively, were primarily described 10-13. Nevertheless,
electrochemical methods can represent a less expensive alternative with a similar
sensitivity 14-16, with the limits of quantification being in submicromolar ranges. A mercury
meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE) used in this work is very
suitable for the determination of the studied compound, mainly because of the effort to limit
the use of liquid mercury in analytical laboratories 17.
Experimental
The stock solution of 4-NBP (c = 1∙10–3 mol L–1) was prepared by dissolving 0.0199 g of
4-NBP (99%, Merck, Prague, Czech Rep.) in 100 mL of methanol. Solutions of lower
concentrations were prepared by diluting the stock solution with methanol (99.9%, p.a. purity,
Merck, Prague, Czech Republic). The stability of the stock solution was monitored by UVVis spectrophotometric measurements. Stock solution was kept in the dark and at the
laboratory temperature.
Boric acid, phosphoric acid (85%), sodium dihydrogen phosphate hydrate, disodium hydrogen
phosphate heptahydrate, sodium acetate trihydrate (all p.a. purity, Lachema, Brno, Czech
Rep.), sodium hydroxide and acetic acid (99.8%) (both p.a. purity, Lach-Ner, Neratovice,
Czech Rep.) were used for the preparation of appropriate buffer solutions. Britton-Robinson
68
(BR) buffers (c = 0.04 mol L–1) were prepared in a usual way. Acetate buffer (AB,
c = 0.25 mol L–1, pH 4.8) was prepared from appropriate amounts of sodium acetate trihydrate
and acetic acid dissolved in deionized water 18. Deionized water produced by a Milli-Q Plus
system (Millipore, Billerica, MA, USA) was used. All solutions were stored in glass bottles in
the dark at the laboratory temperature. Measurements of pH were carried out using the pH
meter Jenway 4330 (Jenway, Chelmsford, UK) with a combined glass electrode. It was
calibrated by standard calibration buffers of pH 4.00, 7.00 and 10.00 (Sigma-Aldrich,
Steinheim, Germany).
Voltammetric measurements were carried out with the computer-controlled Eco-Tribo
Polarograph driven by the Polar Pro 5.1 software (both Eco-Trend Plus, Prague, Czech Rep.)
operating under the operating system Microsoft Windows 98. The measurements were
performed in a three-electrode system with a m-AgSAE working electrode (Eco-Trend Plus,
Prague, Czech Rep.), which was pretreated using previously described methods 19, a Ag|AgCl
(1.0 mol L–1 KCl) reference electrode and a platinum wire auxiliary electrode (both
Monokrystaly, Turnov, Czech Rep.). All potentials are referred to the above-mentioned
reference Ag|AgCl electrode. For both DC voltammetry (DCV) and differential pulse
voltammetry (DPV), the polarization rate was 20 mV s–1, for DPV and adsorptive stripping
differential pulse voltammetry (AdSDPV), the modulation amplitude was –50 mV and the
pulse duration was 100 ms.
Samples were prepared by adding an appropriate volume of stock solution into a 10-mL
volumetric flask, methanol was added to the volume of 3.0 mL, and the solution was filled up
to 10.0 mL with a buffer solution. Model samples of drinking and river water were prepared
using water from the public water line in Prague or from the Vltava river in Prague,
respectively. 9.0 mL of drinking/river water spiked with an appropriate amount of 4-NBP
were filled up to 10.0 mL with a buffer solution. The prepared solution was mixed, transferred
to the electrochemical cell, and the oxygen was removed by bubbling with nitrogen for five
minutes prior to a measurement.
All voltammograms were measured three times and the peak current (Ip) values for the
construction of calibration curves were calculated as arithmetic averages. All figures and
mathematical operations were carried out using the Origin Pro 8.0 software (OriginLab
Corporation, Northampton, MA, USA).
Results and Discussion
Initially, the stability of the analyzed solution in dependence on the volume ratio of aqueous
Britton-Robinson (BR) buffer and methanol was studied. The optimal ratio of BR buffer and
methanol was found to be 7:3 (using DCV, DPV and UV-Vis spectrophotometry). As the next
step, the dependence of the peak current (Ip) and peak potential (Ep) of 4-NBP on pH of the
BR buffer used was investigated in the pH range of 2.0 – 12.0 using DCV and DPV at the
m-AgSAE with the application of electrochemical regeneration prior to each measurement 20.
It was found that the optimal medium (for both DCV and DPV) is the BR buffer of pH 7.0 in
the mixture with methanol (7:3) (with the resulting pH of 7.5). However, because of trace
impurities present in the BR buffer, it was not possible to evaluate voltammetric peaks of
4-NBP correctly at its concentrations lower than 4·10–6 mol L–1, and it was necessary to find
another suitable buffer. The following aqueous supporting electrolytes were tested:
tetrabutylammonium iodide (pH 8.0, c = 0.05 mol L–1), phosphate buffer (pH 7.0, c = 0.10 mol L–1),
acetate buffer (pH 4.8, c = 0.25 mol L–1), BR buffer (pH 8.0, c = 0.04 mol L–1), borate buffer
(pH 8.0, prepared by mixing of 0.25 mol L–1 sodium tetraborate and 0.10 mol L–1
hydrochloric acid) and sodium tetraborate (pH 9.2, c = 0.05 mol L–1). The acetate buffer
69
(pH 4.8, c = 0.25 mol L–1) was chosen as the optimal one, i.e., the one without the presence of
interfering voltammetric signals of trace impurities.
The repeatability of measurements for both voltammetric techniques was tested with and
without application of an electrochemical regeneration step 20. Observed results showed that
for DCV, it is not necessary to apply electrochemical regeneration, and, for DPV, the optimal
regeneration potentials, that significantly enhanced the repeatability, were Ereg,1 = 0 mV and
Ereg,2 = –1300 mV.
The aforementioned optimal conditions were used for measuring calibration curves in the
concentration range from 2⋅10–7 to 1⋅10–4 mol L–1 of 4-NBP. DC and DP voltammograms of
4-NBP and the appropriate calibration curves obtained in the lowest measurable concentration
range (2 – 10)∙10–7 mol L–1 are depicted in Fig. 1. The limit of quantification (LQ) of 4-NBP
reached for both techniques was 2∙10–7 mol L–1. Parameters of the calibration straight lines are
then summarized in Table I.
Fig. 1. DC (A) and DP (B) voltammograms of 4-NBP at the m-AgSAE in the AB – methanol
(7:3) medium. DC voltammograms measured without electrochemical regeneration, DP
voltammograms measured using the regeneration potentials Ereg,1 = 0 mV, Ereg,2 = –1300 mV.
c(4-NBP): 0 (1), 2 (2), 4 (3), 6 (4), 8 (5) and 10 (6) (∙10–7 mol L–1). Insets: the dependences of
the peak current of 4-NBP on its concentration.
Furthermore, the developed methods for the determination of 4-NBP at the m-AgSAE were
tested on model samples of drinking and river water. The DC and DP voltammograms of
4-NBP were measured in the concentration range from 1∙10–7 to 1∙10–6 mol L–1 in solutions of
spiked water (drinking or river) – AB (9:1). Selected voltammograms of 4-NBP plotted in
dependence on its concentration are depicted in Fig. 2 for the sake of an illustration. In Table I,
parameters of the calibration straight lines for the determination of 4-NBP in model samples
of drinking and river water are summarized as well.
Finally, an attempt to utilize the AdSDPV at the m-AgSAE was made to reach a lower LQ of
the studied compound. This technique was tested in buffer – methanol (9:1 or 249:1) solutions
containing 4-NBP in the concentration of 4∙10–7 mol L–1. The examined buffers were as
follows: AB of pH 4.8, 0.10 mol L–1 phosphate buffer of pH 7.0, BR buffers of pH 2.1, 7.0
and 13.0. Suitable accumulation potentials were tested (their values were selected as
Ep + (0, 100, 200 and 300 mV)) with the accumulation time of 60 s. However, under the
70
examined conditions, the effect of the adsorption was not sufficient to significantly increase
the voltammetric response of 4-NBP.
Fig. 2. Voltammograms of 4-NBP recorded at the m-AgSAE in spiked river water – AB (9:1)
using DCV (A) and in spiked drinking water – AB (9:1) using DPV (B). DC voltammograms
measured without electrochemical regeneration, DP voltammograms measured using the
regeneration potentials Ereg,1 = 0 mV, Ereg,2 = –1300 mV. c(4-NBP) in the model water sample:
0 (1), 1 (2), 2 (3), 4 (4), 6 (5), 8 (6) and 10 (7) (∙10–7 mol L–1). Insets: the dependences of the
peak current of 4-NBP on its concentration.
Table I.
Parameters of the calibration straight lines and the LQs values for the determination of 4-NBP in
the concentration range from 2∙10–7 to 1∙10–4 mol L–1 using DCV and DPV at the m-AgSAE.
Concentration
Slope
Intercept
LQ
Method
Matrix
R2
[mol L–1]
[nA mol–1 L]
[nA]
[mol L–1]
DCV
AB – methanol (7:3)
(2 – 10)∙10–5
–4.5∙106
37.4
0.9945
––
AB – methanol (7:3)
(2 – 10)∙10–6
–2.7∙106
–0.22
0.9736
––
AB – methanol (7:3)
(2 – 10)∙10–7
–5.0∙106
0.33
0.9893
2∙10–7
DPV
AB – methanol (7:3)
(2 – 10)∙10–5
–6.1∙106
64.5
0.9794
––
AB – methanol (7:3)
(2 – 10)∙10–6
–3.6∙106
0.02
0.9970
––
AB – methanol (7:3)
(2 – 10)∙10–7
–5.1∙106
0.99
0.9606
2∙10–7
DCV
Spiked DW – AB (9:1)
(2 – 10)∙10–7
–6.0∙106
0.13
0.9983
2∙10–7
DPV
Spiked DW – AB (9:1)
(2 – 10)∙10–7
–6.2∙106
–0.48
0.9990
1∙10–7
–7
6
DCV
Spiked RW – AB (9:1)
(2 – 10)∙10
–3.2∙10
0.25
0.9943
1∙10–7
–7
6
DPV
Spiked RW – AB (9:1)
(2 – 10)∙10
–2.9∙10
–0.31
0.9866
2∙10–7
AB – 0.25 mol L–1 acetate buffer of pH 4.8, DCV – DC voltammetry, DPV – differential pulse voltammetry,
DW – drinking water, LQ – limit of quantification (10σ), R2 – coefficient of determination, RW – river water.
Conclusions
It was shown in this contribution that the electrochemical response of the m-AgSAE towards
4-NBP is sufficient enough to be used for its sensitive determination. Using DCV and DPV
for the determination of micromolar and submicromolar concentrations of 4-NBP, the
m-AgSAE was exhibited to be a suitable alternative to mercury electrodes. It is also possible
to apply the newly developed methods on real matrices like drinking and river water. All the
dependences of the peak current of 4-NBP on its concentration were linear and the limits of
quantification were about 2⋅10–7 mol L–1. The methods of voltammetric determination of
71
4-NBP utilizing the m-AgSAE can thus offer reliable results comparable to those obtained by
other methods (Table II).
Table II.
A survey of methods for the determination of 4-NBP and their limits of quantification.
Method
LQ [mol L–1]
Method
LQ [mol L–1]
DPV at m-AgSAE
2∙10–7
HPLC-ED 13
4∙10–6
AdSDPV at HMDE 16
AdSSWV at HMDE 14
3∙10–8
6∙10–10
HPLC-UVD 13
HPLC-FD 13
3∙10–7
3∙10–7
AdSDPV – adsorptive stripping differential pulse voltammetry, AdSSWV – adsorptive stripping square-wave
voltammetry, DPV – differential pulse voltammetry, HMDE – hanging mercury drop electrode, HPLC-ED –
HPLC with electrochemical detection, HPLC-FD – HPLC with fluorescence detection, HPLC-UVD – HPLC
with UV spectrophotometric detection, LQ – limit of quantification (10σ), m-AgSAE – mercury meniscus
modified silver solid amalgam electrode.
Acknowledgement
This research was carried out within the framework of the Specific University Research
(SVV 2013). Financial support from the Grant Agency of the Czech Republic (Project
P206/12/G151) is gratefully acknowledged.
References
1. Moreira J. C., Barek J.: Quim. Nova 18, 362 (1995).
2. Havey C., Dane A. J., Abbas-Hawks C., Voorhees K.: Environ. Chem. Lett. 7, 331 (2009).
3. Tokiwa H., Ohnishi Y.: Crit. Rev. Toxicol. 17, 23 (1986).
4. Feilberg A., Nielsen T.: Environ. Sci. Technol. 35, 108 (2001).
5. Morris H. P., Dubnik C. S., Johnson J. M.: J. Natl. Cancer Inst. 10, 1201 (1950).
6. Senturk Z.: Curr. Drug. Deliv. 10, 76 (2013).
7. Ning S., Xiaobai X.: Carcinogenesis 18, 1233 (1997).
8. Heflich R. H., Howard P. C., Beland F. A.: Mutat. Res. 149, 25 (1985).
9. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Volume 4: Some
Aromatic Amines, Hydrazine and Related Substances, N-Nitroso Compounds and
Miscellaneous Alkylating Agents. International Agency for Research on Cancer. Lyon 1974.
10. Crimmins B. S., Baker J. E.: Atmos. Environ. 40, 6764 (2006).
11. Jinhui X., Lee F. S. C.: Anal. Chim. Acta 416, 111 (2000).
12. Chen X., Li M. J., Yi C. Q., Tao Y. ,Wang X. R.: Chromatographia 58, 571 (2003).
13. Prchal V., Krejčová J., Vyskočil V., Pecková K., Fischer J., Zima J., Barek J.: Int. J.
Electrochem. Sci. 8, 2524 (2013).
14. Hernández P., Galan-Estella F., Hernández L.: Anal. Chim. Acta 271, 217 (1993).
15. Barek J., Berka A., Müller M., Zima J.: Collect. Czech. Chem. Commun. 50, 2853 (1985).
16. Štěpán R., Barek J., Mejstřík V., Zima J.: Sensors 3, 43 (2003).
17. http://www.europarl.europa.eu/meetdocs/2004_2009/documents/pr/585/585664/585664cs.pdf,
Downloaded October 28th 2012.
18. Lambert J., Muir T. A.: Practical Chemistry. Heinemann Educational Publishers. London 1947.
19. Mikkelsen O., Schroder K. H.: Electroanalysis 15, 679 (2003).
20. Vyskočil V., Navrátil T., Polášková P., Barek J.: Electroanalysis 22, 2034 (2010).
72
Nanostructured Ag films on Silicon Wafers for Electrochemical and SERS Sensing
Deposited by Electrochemical/Electrophoretic Method
a
Jan Hrbac , Vladimir Halouzka a,b, Petr Jakubec a, Libor Kvitek a, Vlassis Likodimos c,
Athanassios G. Kontos c, Kyriakos Papadopoulos c, Polycarpos Falaras c
a
Department of Physical Chemistry, Palacky University, Faculty of Science, tr. 17. listopadu
12, 771 46 Olomouc, Czech Republic, e-mail: [email protected]
b
Masaryk University, Faculty of Science, Department of Chemistry, Kamenice 5, CZ-625 00
Brno, Czech Republic
c
Institute of Physical Chemistry, NCSR 'Demokritos', 15310 Agia Paraskevi Attikis, Athens,
Greece
Abstract
Electrolysis of ultrapure water in a two-electrode cell with silver anode and conductive
substrate (Si wafer) as a cathode leads to the formation of nanostructured silver layers
deposited on cathode. The results of the present study open a new, extremely simple and ultralow cost way to prepare nanostructured silver films on conducting and semiconducting
substrates. The prepared nanosilver coated silicon substrates exhibit high performances as
amperometric sensors for hydrogen peroxide and also as SERS substrates. As a by-product,
silver nanoparticles are produced during the process.
Key words: Electrophoretic deposition, Amperometry, SERS; 2D nanostructures; Silver
nanoparticles; Si wafer.
Introduction
Deposition of nanostructured metallic layers (including noble metals) on conductive and/or
semiconducting substrates is a specific issue of contemporary research, targeted into the
development of novel, highly sensitive electrochemical and surface enhanced Raman
scattering (SERS) sensors 1,2. Of the above, silver, especially in the form of nanoparticles, is a
highly effective electrocatalyst for cathodic hydrogen peroxide sensing. Silver films also find
an ideal application as substrates for surface-enhanced Raman spectroscopy.
Experimental
The deposition was carried out in a two-electrode cell composed of 20 mL quartz beaker
containing Si wafer as a cathode and Ag wire (diameter = 1 mm) as anode. The electrolyte
was a Millipore water (R > 15 MΩ.cm). The area of Si wafer immersed in water was
20 x 20 mm, silver wire anode was placed at the distance of 10 mm from Si wafer. The cell
was connected to a stabilized power supply (E = 10–30 V) for a desired period of time. The
current flowing through the cell was monitored using Metex M-3890D multimeter connected
to PC via USB. Simultaneously, temperature was monitored by Pt 1000 sensor interfaced to
USB-6009 (National Instruments, Austin, U.S.A.) multifunction card and controlled by
dedicated LabView software (L-Chem, Czech Republic). After deposition, the wafers were
rinsed with water and dried in the air.
Results and Discussion
Progressive dissolution of silver anode during the electrolysis of ultrapure water in a twoelectrode cell with Si wafer as leads to nanosilver coated silicon substrates exhibiting high
performances as amperometric sensors for hydrogen peroxide and also as SERS substrates.
During the electrosynthesis, the silver oxide is formed as a primary product of the silver
anode dissolution and fills the interelectrode space by the diffusion, electrophoresis and
convection induced by the temperature gradients induced by the electrolysis. Silver oxide is
partially soluble, forming silver cations and hydroxide anions, resulting in the pH increase up
to the value of 10.5. Silver cations are reduced on the Si wafer cathode. Direct decomposition
73
of silver oxide to silver nanoparticles accompanies the experiment, as can be proved by
spectrophotometry after dissolution of silver oxide in ammonia, revealing plasmonic peak at
422 nm. The SEM image of silver layer, amperograms of H2O2 sensing and SERS spectrum
of Rhodamine 6G are shown in Fig. 1.
Fig. 1. A: SEM image of Si wafer with deposited silver (Eapplied = 10 V, t = 20 min.); B:
Amperometric response curves of hydrogen peroxide on bare silicon wafer (a) and on silicon
wafer equipped with a silver layer. The measurements were performed in stirred B-R buffer,
pH=7. Each addition corresponded to 1.0 mM H2O2. The amperogram (c) shows the response
at low hydrogen peroxide concentrations (5x 1µM, 2x 10 µM H2O2). C: Raman spectra of
Rhodamine 6G acquired on a bare silicon wafer (a: cR6G=1 µM, b: cR6G=10 µM) and (c)
silver coated wafers cR6G=0.1 µM). 1µL drop of R6G solution was placed onto the substrate
surface and allowed to dry. Inset: Raman spectra in dependence on R6G concentration.
74
Conclusion
A simple method for the preparation of the silver nanostructures is suggested and application
potential is demonstrated in two well-known applications – as electrochemical and SERS
sensors. The preparation process can be regarded as „clean“, since the starting materials are
silver metal and water only. Excellent electrocatalytical activity towards hydrogen peroxide
electrochemical reduction and high SERS activity are achieved.
Acknowledgment
Financial support from the Grant Agency of the Czech Republic (project no. P206/12/0796),
and from the student project No. PrF_2012_028 is gratefully acknowledged.
References
1. Plowman B. J., Bhargava S. K., O’Mullane A. P.: Analyst 136, 5107 (2011).
2. Halouzka V., Jakubec P., Kvitek L., Likodimos V., Kontos AG., Papadopoulos K.,
Falaras P., Hrbac J: J. Electrochem. Soc. 160, B54-B59 (2013).
75
Detection of Thiram Pesticide using Copper Affinity Electrochemical Separation
Electrospray Ionization Mass Spectrometry
Jana Jaklová Dytrtová a, Tomáš Navrátil b, Michal Jakl c, and Kateřina Nováková b, d
a
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i.,
Flemingovo náměstí 2, 166 10 Prague 6, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3,
182 23 Prague 8, Czech Republic
c
Czech University of Life Sciences Prague, Faculty of Agrobiology, Food and Natural
Resources, Department of Agro-Environmental Chemistry and Plant Nutrition, Kamýcká 129,
165 21 Prague – Suchdol, Czech Republic
d
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and
Chemical Engineering, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic
Abstract
The detection of pesticides in environmental matrices has a purpose in analytical chemistry
and it is important for understanding their role in the environment 1-3. Direct detection of
pesticides in environmental matrices is complicated due to many occurring interactions with
metals (e.g., Ca, Cu, Mg, Zn). The experimental utilization of combining electrochemical cell
with mass spectrometry is shown in the case of thiram (T). The method is based on high
affinity of copper cations to many ligands.
Key words: EC-ESI-MS, Fungicide, Copper, Sulfur, Complexes.
Introduction
The presence of pesticides in soil may cause significant changes of plant nutrition uptake as
well as other changes on physiological level (e.g., expression of phytochelatin synthesis
owing to masking of heavy metals via complexation with pesticides). Presence of pesticides
has a negative impact on the environment 4-11. Moreover, pesticides strongly interact with
heavy metals (Pb, Cd), nutrients (Ca, Mg), and some essential metals (Cu, Zn). Pesticides are
a very wide group of chemicals with several types of functional groups which enable to create
complexes with cations 12.
Thiram (T, C6H12N2S4, Fig. 1) is a fungicide with two S= groups. The S= group has similar
characteristics as the O= group and it is able to create stable coordination-covalent bonds 13 14.
T is highly toxic compound causing reduction of ceruloplasmine activity, and bone strength,
and suppression of humoral immunity 15. Moreover, T causes rapid depletion of intracellular
reduced glutathione; this depletion is explained by T oxidation of glutathione 16. The effect of
T activity can be suppressed via CuSO4, ZnSO4 or MnSO4 addition 15.
The aim of this study is to prepare Cu/T complexes 17 in situ via electrochemical generation of
copper cations with on-line detection by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS).
Experimental
The electrochemical cell (EC) 18-21 was designed for the sample flow rates of about
0.4 mL h-1, suitable for ESI-MS 19. The cell body is built from a peak cross (P-729 PEEK
Cross 0.020” thru-hole with F-300 Fittings completed, Upchurch Scientific Rheodyne, IDEX
Health & Science, USA) with a sweep volume of 0.72 µL. The sample inlet and outlet consist
of capillary PEEK Tubing 0.25 mm (Upchurch Scientific Rheodyne, IDEX Health & Science,
USA). The electrochemical cell works in a two-electrode arrangement using a computercontrolled polarographic/voltammetric analyzer PC-ETP (Polaro-Sensors, Czech Republic)
with the Multielchem 2.3 software (JH IPC ASCR, v.v.i., Czech Republic) 22 and
POLAR.PRO software v. 5.1 (Polaro-Sensors, Czech Republic). Copper wire (diameter
76
1 mm, Lachema, Czech Republic) and silver wire (diameter 1 mm, Goodfellow, USA) were
used as working electrode (WE) and reference electrode (RE), respectively, depending on the
actual voltage applied.
The ESI-MS experiments were performed with a Finnigan LCQ Advantage ion-trap mass
spectrometer (ThermoFinnigan, USA) fitted with an electrospray ionization source operating
in positive and negative-ion mode 23. The sample solutions of T were introduced into the ESI
source via a fused-silica capillary at a flow rate of 0.45 mL h-1 maintained using a syringe
pump (KDScientific, USA). Nitrogen was used as the nebulizer gas. The operating conditions
were set as follows: spray voltage 5.4 kV, capillary voltage -60 V and tube lens offset -70 V,
heated capillary temperature 230°C, sheath gas flow rate, and auxiliary gas flow rate 10–50
arbitrary units.
Results and discussion
Fig. 1 shows the MS spectrum of T solution. The creation of the Cu/T complexes was
initiated in EC during the electrolysis. Copper cations generated during the electrolysis
created with T two stable complexes: [Cu(T)]+ and [Cu(T)2]+. Their presence was confirmed
voltammetrically (Fig. 2). In both complexes Cu was present as Cu+. During the nebulization
in the electrospray process any Cu2+ was reduced to Cu+, as it was demonstrated and
explained in previous studies 12.
In the spectrum, T is present also as protonated (TH+) and as an adduct with potassium cation
(K(T)+). Additional presence of these two T species, except Cu/T species, caused any
utilization of copper affinity electrochemical separation electrospray ionization mass
spectrometry (CuAES/ESI-MS) to T detection in environmental matrices inapplicable,
because the affinity of copper cations to T is lower than affinity of, e.g., triazolic compounds
6, 7, 18
.
5
3x10
[Cu(T)]
+
Intensity
5
2x10
[K(T)]
+
5
1x10
TH
+
+
[Cu(T)2]
0
240
260
280 m/z 300
546
560
Fig. 1. Mass spectrum of T (10-4 mol L-1) in EtOH/H2O (1/1) solution, ammonium acetate
(0.05 mol L-1), -100 mV was applied at the Cu electrode.
77
30
-20
B
A
20
-15
I [A]
I [µA]
10
-10
0
-10
-5
-20
0
-200
-400
-600
-800
-1000
E [mV]
-1200
-30
-1000
-800
-600
-400
E [mV]
-200
Fig. 2A. DPV voltammogram of T (10-4 mol L-1) in EtOH/H2O (1/1) solution, ammonium
acetate (0.05 mol L-1) at Cu working electrode, Ein= -100 mV, scan rate 100 mV/s.
Fig. 2B. Cyclic voltammogram of T (10-4 mol L-1) in EtOH/H2O (1/1) solution, ammonium
acetate (0.05 mol L-1) at Cu working electrode, scan rate 100 mV/s.
Conclusion
The application of copper affinity using electrochemical separation electrospray ionization
mass spectrometry for the detection of T in environmental matrices is relatively complicated,
because the readiness of sulfur to create coordination bond with Cu2+ is too week to compete
with other T adducts creation.
Acknowledgement
This work was supported by the Grant Agency of the Czech Republic (projects No.
13-21409P, No. P208/12/1645, and No. P206/11/1638), by the University of Pardubice
(project No. SGFChT05/2012), by the Ministry of Education of the Czech Republic (S grant).
References
1. Hromadova M., Sokolova R., Pospisil L., Fanelli N.: J. Phys. Chem. B 110, 4869 (2006).
2. Sokolova R., Gal M., Valasek M.: J. Electroanal. Chem. 685, 33 (2012).
3. Sokolova R., Pospisil L., Hromadova M., Ludvik J., Gal M., Giannarelli S.: Modern
Electrochemical Methods Xxx, 154 (2010).
4. Barek J., Cabalkova D., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Environ.
Chem. Lett. 9, 83 (2011).
5. Cabalkova D., Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Chem. Listy
103, 236 (2009).
6. Skopalova J., Navratil T.: Chem. Anal.-Warsaw 52, 961 (2007).
7. Sokolova R., Hromadova M., Pospisil L.: J. Electroanal. Chem. 552, 53 (2003).
8. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19,
2003 (2007).
9. Pelclova D., Navratil T., Mrazova K., Rakovcova H., Fenclova Z., v knize: Pesticides in
the Modern World - Pesticides Use and Management; (Stoytcheva M., ed. InTech,
Rijeka, 2011.
10. Pelclova D., Prazny M., Skrha J., Fenclova Z., Kalousova M., Urban P., Navratil T.,
Senholdova Z., Smerhovsky Z.: Hum. Exp. Toxicol. 26, 705 (2007).
11. Pelclova D., Fenclova Z., Urban P., Ridzon P., Preiss J., Kupka K., Malik J., Dubska Z.,
Navratil T.: Neuroendocrinology Letters 30, 219 (2009).
78
12. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D., Cadkova E., Komarek M.: Rapid Commun.
Mass Spectrom. 25, 1037 (2011).
13. Schulze O., Voss J., Adiwidjaja G., Olbrich F.: Carbohydr. Res. 339, 1787 (2004).
14. Norkova R., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D.: Water, Air, Soil Pollut. 223, 2633
(2012).
15. Wu W., Cook M. E., Smalley E. B.: Nutr. Res. 10, 555 (1990).
16. Cereser C., Boget S., Parvaz P., Revol A.: Toxicology 163, 153 (2001).
17. Novakova K., Navratil T., Jaklova Dytrtova J., Chylková J.: J. Solid State Electrochem.,
accepted (2013).
18. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D., Norkova R.: Int. J. Mass Spectrom. 338, 45
(2013).
19. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Norkova R., Navratil T.: Modern Electrochemical Methods
XXXII: Optimization of a Flow Rate for a Hyphenation of Voltammetry with Electrospray
Ionization Mass Spectrometry, Jetrichovice, (Navratil T., Fojta M., Eds.),
www.bestservis.eu/upload/file/Sbornik_metody12.pdf, Best servis, Jetrichovice 2012, p.
54.
20. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D.: Modern Electrochemical Methods XXXI: The
oxidation of ferrocene; a hyphenation of voltammetry with electrospray ionization mass
spectrometry,
Jetřichovice,
(Navratil
T.,
Barek
J.,
Eds.),
www.bestservis.eu/upload/file/Sbornik_metody11.pdf, Best servis, Ústí nad Labem,
Jetřichovice 2011, p. 69.
21. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D.: Modern Electrochemical Methods XXX:
Electrochemistry with mass spectrometry as a tool of metal complexes with organic
ligand
studies,
Jetrichovice,
(Navratil
T.,
Barek
J.,
Eds.),
www.bestservis.eu/upload/file/Sbornik_metody10.pdf, Best servis, Usti nad Labem,
Jetrichovice 2010, p. 89.
22. Navratil T., Yosypchuk B., Barek J.: Chem. Anal.-Warsaw 54, 3 (2009).
23. Tintaru A., Roithova J., Schroder D., Charles L., Jusinski I., Glasovac Z., EckertMaksic M.: J. Phys. Chem. A 112, 12097 (2008).
79
Flow Electrochemical Biosensors for Measurements at High Negative Potentials
(Biosenzory pro elektrochemická měření v průtokových systémech při vysokých
negativních potenciálech)
Bohdan Josypčuk a, Jiří Barek b, and Oksana Josypčuk a, b
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Department of Biophysical
Chemistry, Dolejskova 3, Prague, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Charles University in Prague, Faculty of Science, University research center UNCE
“Supramolecular chemistry”, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of
Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 28 43 Prague 2, Czech Republic
Abstract
Flow amperometric enzymatic biosensors were constructed. The biosensors consist of a flow
reactor based on porous silver solid amalgam (AgSA) and a flow tubular detector based on
compact AgSA. All chemical components of the reactor surface are mutually connected by
covalent bonds. Decrease of oxygen concentration (directly proportional to the concentration
of the substrate) during enzymatic reaction was amperometrically measured on the tubular
detector under flow injection conditions. The described procedure should be universal and it
was successfully used, e.g., for deposition of glucose oxidase, cholesterol oxidase and
sarcosine oxidase at the surface of the porous AgSA-reactor.
Key words: Flow analysis, Amperometry, Solid amalgam, Porous reactor, Electrochemical
biosensors, Glucose.
Úvod
Elektrochemická detekce (ED) při analýzách v průtokových systémech (FA), zvlášť ve
spojení s biosenzory, je široce používána 1-4. Detekční (pracovní) elektroda (WE) je základem
a jediným zdrojem analytického signálu v elektrochemických metodách. Nejlepší možnosti
pro zajištění elektroredukčních procesů, zvlášť při vysokých negativních potenciálech,
poskytují elektrody rtuťové a amalgámové. Vysoké přepětí vodíku na těchto materiálech
dovoluje s nimi pracovat ve vodných roztocích až do –2 V. Pevné 5-8 a pastové 9-11
amalgámové elektrody se konstrukčně neliší od elektrod z jiných materiálů a jsou vhodné pro
FA. Velkou užitnou přednosti pevných amalgámů je možnost připravení elektrod potřebného
rozměru a tvaru. Detektory ze stříbrného pevného amalgámu (AgSA) byly použity pro práci
ve wall-jet 12, 13 a thin-layer 12 uspořádání. Zavedení AgSA tubulárního detektoru velmi
zjednodušilo konstrukci průtokové elektrochemické cely a podstatně zvýšilo spolehlivost a
reprodukovatelnost měření 14.
Pevné amalgámy se ukázaly být vhodnou podložkou pro thiolové monovrstvy (ML) 15-17, na
základě kterých se dají připravit různé typy biosenzorů. Pokud je thiol navázaný na amalgám
ukončen karboxylovou skupinou, dá se pomoci EDC-NHS technologie vytvořit amidová
vazba mezí –COOH thiolu a –NH2 vhodné bílkoviny. Touto bílkovinou může být např. avidin
nebo streptavidin a připravený biosenzor se dá použit pro selektivní měření interakcí
(strept)avidin–biotin 16. Podobné navázání enzymu nebo protilátky na thiol dovoluje připravit
enzymatický nebo imunologický biosenzor. Citlivost enzymatického biosenzoru záleží na
ploše, která je pokrytá enzymem. Detekční elektrody mají relativně malou plochu a jedním ze
způsobů jejího zvětšení je použití enzymatického reaktoru (ER). Aktivní povrch ER je
mnohonásobně větší, než u detekční elektrody a tento reaktor je umístěn v průtokovém
systému před detektorem. Detektor potom zaznamenává buď koncentraci produktu
enzymatické rekce, nebo např. zmenšení koncentrace kyslíku v roztoku. Velkou plochu ER
mohou zajišťovat porézní nebo práškovité materiály 18-20. My jsme pro tyto účely připravili
stříbrný pevný amalgám jako porézní hmotu.
80
Cílem této práce bylo navržení, příprava a testování enzymatického biosenzoru na základě
porézního reaktoru ze stříbrného pevného amalgámu v průtokovém systému. Dlouhodobou
stabilitu biosenzoru mělo zajišťovat zakotvení enzymu na povrchu amalgámu pomocí
kovalentních vazeb 16. Použitý postup přípravy biosenzoru by měl být universální a měl by
být vhodný pro navázání různých proteinu nebo jiných sloučenin obsahujících –NH2 skupinu.
Experimentální část
Amperometrická měření byla prováděna s využitím počítačového analyzátoru řízeného
softwarem MultiElchem v. 2.3 (Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i.) a
elektrochemického stojánku (Polaro-Sensors, Praha). Tubulární detektor ze stříbrného
pevného amalgámu 14 byl použit jako pracovní elektroda. Jako referentní sloužila nasycená
kalomelová elektroda připravená na základě stříbrného pastového amalgámu 9, 21. Pomocnou
elektrodu tvořil Pt drátek o průměru 1,0 mm a délce 15 mm. Měření byla prováděna při
laboratorní teplotě. Pro přípravu roztoků byla použita voda redestilovaná v křemenné
aparatuře. Všechny použité chemikálie byly čistoty p. a.
Výsledky a diskuse
Pro testování navrženého amalgámového reaktoru byla zvolena glukóza oxidáza (GOx) jako
jeden z velmi prozkoumaných a stabilních enzymů. V průběhu enzymatické oxidace glukózy
se pro obnovení aktivity GOx spotřebovává kyslík. Snížení koncentrace O2 v mobilní fázi
(MP), která je úměrná koncentraci glukózy, se dá registrovat elektrochemickou cestou. Při
použití platinové, zlaté nebo jiné elektrody s nízkým přepětím vodíku, se rozpuštěný v MP
kyslík redukuje na peroxid vodíku během dvou elektronové reakce. Výhodou použitého
amalgámového detektoru je možnost pracovat ve vodných roztocích při potenciálech až do
–2 V. V oblasti potenciálů nad –1 V se při redukci molekuly kyslíku spotřebovávají
4 elektrony a v praxi to vede ke dvojnásobnému zvýšení píku (citlivosti).
Vliv potenciálu detekce na odezvu biosenzoru je znázorněn na Obr. 1A. Jak je vidět, proud
píku roste se zvýšením negativního potenciálu do –1 V a potom se prakticky nemění až do
–1,5 V. Při vyšších potenciálech se podstatně zhoršuje reprodukovatelnost měření zřejmě
kvůli zesilujícímu se vylučování vodíku, který na povrchu detektoru tvoři mikrobubliny a
nekontrolovatelně mění aktivní plochu detektoru. Je nutné se zmínit, že zvýšení potenciálu
detekce vede ke zvýšení proudu základní linie. Tento jev se neprojevuje negativně na
citlivosti měření, protože šum celého systému je zhruba stejný a proud základní linie se
odečítá z proudu píku. Potenciál detekce (Ed) –1,1 V byl zvolen jako optimální, zajišťující
maximální citlivost a jak bude uvedeno dále i nejlepší reprodukovatelnost měření. Tento
potenciál detekce byl použit pro všechny další experimenty.
Rychlost pohybu roztoku (v) v celém průtokovém systému podstatně ovlivňuje účinnost
enzymatického reaktoru a odezvu detektoru. Enzymatická reakce má určitou rychlost a záleží
na době kontaktu enzymu se substrátem. Dá se předpokládat, že čím menší bude průtok, tím
více se zmenší koncentrace kyslíku v roztoku. Rychlost průtoku ovlivňuje také odezvu
detektoru, přičemž pro různé látky tato závislost múze mít opačný průběh 14. Maximální
proud píku byl pozorován při v = 0,04 ml min–1 (doba scanu tscan = 360 s). Jenom při nejmenší
zkoušené rychlosti (v = 0,02 ml min–1; tscan = 600 s) se odezva zmenšila a podstatně se
zhoršila reprodukovatelnost a tvar píku, což bylo způsobeno pravděpodobně nestabilitou
průtoku. Pro zvolení optimální rychlosti se hledal kompromis mezi odezvou biosenzoru a
dobou trvaní jednoho měření. Musela se taky brát v potaz doba obnovení aktivity enzymu po
každém měření glukózy. Bylo zjištěno, že jestli doba mezí nástřiky glukózy byla menší než
220–240 s, odezva biosenzoru se postupně zmenšovala. Doba scanu 240 s je dostatečná pro
81
spolehlivý záznam celého píku při v = 0,10 ml min–1, a proto tato rychlost byla zvolená jako
optimální a byla použitá pro další měření.
Obr. 1. (A) Závislost proudu píku Ip na potenciálu detekce Ed. (B) FIA-ED záznamy glukózy
v mobilní fázi a v modelových roztocích v rozsahu koncentrací 2,01052,0103 mol l1 (ve
vloženém obrázku je znázorněn kalibrační graf). Experimentální podmínky: MP [0,10 mol l–1
octanový pufr; 0,001 mol l–1 Na2EDTA; pH 6,5]; objem dávkovací smyčky Vinj = 50 µl; v =
0,10 ml min1. (A) c(glukóza) = 4,0104 mol l1. (B) Ed = 1,10 V.
Opakovatelnost paralelních měření modelových roztoků glukózy v MP (c = 4,0104 mol l1,
n = 11 měření) byla dobrá a relativní směrodatná odchylka (RSD) měla hodnotu 1,83 %.
Dlouhodobá stabilita účinností enzymatického porézního reaktoru se studovala tak, že
připravený reaktor se uchovával v mikrozkumavce s mobilní fází v lednici při 4 °C. Jednou za
3–5 dnů se reaktor zapojil do průtokového systému, provedlo se 5–7 paralelních měření
5×10–4 mol l–1 standardního roztoku glukózy a potom se reaktor znova umístil do lednice.
Během 35 dnů se odezva biosenzoru zmenšila o 23 %. Tuto změnu nepovažujeme za
kritickou, protože s biosenzorem se dá úspěšně pracovat dál, jen pro hodnocení výsledků
analýzy by se měla používat buď metoda standardního přídavku, nebo porovnání výsledků
měření vzorků s měřením standardního roztoku glukózy.
Měření koncentrační závislosti je obvykle závěrečným krokem optimalizace parametrů
analýzy. Pro hodnocení výsledků analýzy vzorku se kromě kalibrační křivky může použit i
metoda standardního přídavku nebo metoda porovnání odezvy biosenzoru s roztokem vzorku
a roztokem se známou koncentrací. Podmínkou aplikace dvou posledních metod hodnocení je
použití lineárního úseku koncentrační závislosti a minimální hodnota úseku. Proudová odezva
navrženého biosenzoru se měřila v koncentračním rozsahu glukózy od 0,02 do 2,0 mmol l–1.
Lineární koncentrační závislost byla pozorována v rozmezí 0,02–0,80 mmol l–1 glukózy (R =
0,9997; Ip= –0,04 – 5,03c). Amperometrické píky a kalibrační graf jsou zobrazeny na
Obr. 1.B. Velmi dobré parametry linearity potvrzují, že podmínky měření byly zvoleny
správně, a že uvedený biosenzor je vhodný pro měření koncentrace (obsahu) glukózy v
reálných vzorcích. Při stanovení glukózy, fruktóza a sacharóza patří mezí nejčastější možné
interferenty. Nástřiky 1 mmol l–1 roztoků sacharózy a fruktózy prakticky neovlivňovaly
průběh základní linie.
Měření obsahu glukózy ve vzorcích medu bylo dalším krokem v testování biosenzoru.
Množství glukózy v medu záleží na mnoha podmínkách a obvykle kolísá mezí 30 a 40 %.
Použitý postup analýzy byl velmi jednoduchý a rychlý. Bylo vzato 7 navážek tekutého medu
(jedna kapka medu - jedna navážka) a rozpuštěno ve vodě (10 ml). Alikvotní objem roztoku
medu (0,1 ml) byl smíchán s mobilní fází (1,9 ml) a nastřikován do systému. Amperometrické
82
píky roztoků vzorků medu se porovnávaly s píkem 0,5 mmol l–1 standardního roztoku glukózy
ve stejné mobilní fázi. Obsah glukózy v analyzovaném medu se rovnal 35,5±1,0 % (n = 7; SD
= 1,2 %; RSD = 3,2 %). Tento výsledek se dobře shoduje s údaje z literárních zdrojů.
Závěr
Byl navržen, přípraven a otestován enzymatický porézní reaktor ze stříbrného pevného
amalgámu. Kovalentní vazby amalgám–thiol–enzym účinně přispívají dlouhodobé stabilitě
biosenzoru. Velká plocha pórů zajišťovala vysokou enzymatickou aktivitu biosenzoru.
Zapojení reaktoru do průtokového systému bezprostředně před tubulárním AgSA-detektorem
dovolilo přesně měřit spotřebu kyslíku během enzymatické reakce. Vysoké přepětí vodíku na
AgSA-detektoru umožnilo aplikovat potenciál detekce negativnější než –1,0 V a zvýšit tím
citlivost měření kyslíku. Byla provedena optimalizace parametrů měření a dosažená mez
detekce byla 0,01 mmol l–1 glukózy při dobré opakovatelnosti paralelních měření (RSD =
1,3 %). Proudová odezva biosenzoru byla lineární v koncentračním rozsahu glukózy od 0,02
do 0,8 mmol l–1 (R = 0,9997). Testovaný biosenzor byl použit pro stanovení obsahu glukózy
v medu.
Poděkování
Autoři děkují za finanční podporu GA ČR (projekty čís. P206/11/1638 a P206/12/G151) a GA
Univerzity Karlovy v Praze (projekt 282111/2001/B-Ch/PrF) Tato práce vznikla v rámci
Specifického vysokoškolského výzkumu.
Literatura
1. Tessema M., Ruzgas T., Gorton L., Ikeda T.: Anal. Chim. Acta 310, 161 (1995).
2. Chi Q., Dong S.: Anal. Chim. Acta 278, 17 (1993).
3. Hasebe Y., Takamori K., Uchiyama S.: Anal. Chim. Acta 282, 363 (1993).
4. Choi B. G., Im J., Kim H. S., Park H.: Electrochim. Acta 56, 9721 (2011).
5. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009).
6. Yosypchuk B., Fojta M., Barek J.: Electroanalysis 22, 1967 (2010).
7. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis 15, 121 (2003).
8. Čížková P., Navrátil T., Šestáková I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007).
9. Yosypchuk B., Sestakova I.: Electroanalysis 20, 426 (2008).
10. Danhel A., Yosypchuk B., Vyskocil V., Zima J., Barek J.: J. Electroanal. Chem. 656, 218
(2011).
11. Niaz A., Fischer J., Barek J., Yosypchuk B., Sirajuddin, Bhanger M. I.: Electroanalysis
21, 1786 (2009).
12. Danhel A., Shiu K. K., Yosypchuk B., Barek J., Peckova K., Vyskocil V.: Electroanalysis
21, 303 (2009).
13. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19,
2003 (2007).
14. Yosypchuk O., Barek J., Yosypchuk B.: Electroanalysis 24, 2230 (2012).
15. Yosypchuk B., Marecek V.: J. Electroanal. Chem. 653, 7 (2011).
16. Josypčuk B., Fojta M., Yosypchuk O.: J. Electroanal. Chem. 694, 84 (2013).
17. Josypčuk B., Barek J., Josypčuk O.: Anal. Chim. Acta,
DOI: 10.1016/j.aca.2013.03.055 (2013).
18. Wang Y., Hasebe Y.: Materials Science and Engineering C 32, 432 (2012).
19. Ducey Jr. M. W., Meyerhof M. E.: Electroanalysis 10, 157 (1998).
20. Curey T. E., Salazar M. A., Oliveira P., Javier J., Dennis P. J., Rao P., Shear J. B.:
Analytical Biochemistry 303, 42 (2002).
21. Yosypchuk B., Barek J., Yosypchuk O.: Electroanalysis 23, 2226 (2011).
83
Construction and Application of Tubular Detector and Porous Flow-through
Detector/Reactor of Silver Solid Amalgam for Electrochemical Measurements in Flow
Systems
Oksana Josypčuk a,b, Jiří Barek a, and Bohdan Josypčuk b
a
Charles University in Prague, Faculty of Science, University research center UNCE
“Supramolecular chemistry”, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of
Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic
E-mail: [email protected]
b
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Department of
Biophysical Chemistry, Dolejskova 3, Prague, Czech Republic
Abstract
This paper presents the preparation and application of two new arrangements of silver solid
amalgam (AgSA) electrodes for measurements in flow systems  tubular detector based on
compact AgSA, and flow-through detector (or reactor) prepared from porous AgSA. Both
electrodes were tested for electrochemical determinations of reducible inorganic (Cd2+, Zn2+)
and organic (4-nitrophenol, lomustine) compounds under FIA with amperometric detection
(Cd2+, Zn2+, 4-nitrophenol) and flow-DPV (lomustine). Furthermore, by combination of the
porous reactor with immobilized enzyme and tubular detector the flow amperometric
enzymatic biosensor was constructed for determination of glucose in a sample of honey and
cholesterol and sarcosine in model samples.
Key words: electrochemical detector, amperometric detector, silver solid amalgam,
enzymatic biosensor.
Introduction
The silver solid amalgam electrodes have been commonly used in a batch arrangement 1,2 and
as a wall-jet or thin layer detector for HPLC/FIA 3-5 of reducible organic compounds.
Although the wall-jet and thin layer cells are the most widely used for amperometric detection
in flow systems 6,7 both of them have some disadvantages. In the case of the wall-jet
arrangement, it is necessary to have the working electrode in well-fixed position at a defined
distance from the inlet capillary for obtaining good results, what puts high demands on the
precision of the cell construction. Similarly, the thin-layer cell requires precise and sometimes
relatively expensive construction. Thus we decided to construct the flow detectors with
simpler and robust cell design. The very useful advantage of solid amalgam is the possibility
of preparing electrodes of required size and shape. In this presentation, the tubular detector
based on compact silver solid amalgam and flow-through detector/reactor based on porous
silver solid amalgam are described and tested.
Apparatus, methods and chemicals
Amperometric and voltammetric measurements were carried out using computer driven
electrochemical stand (Polaro-Sensors, Czech Republic) with program MultiElchem v. 2.3
(J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Czech Republic).
The FIA apparatus with electrochemical detector comprised of a linear syringe pump
NE-1000 (New Era Pump Systems, USA) and sample injector Upchurch Scientific Valve V451, (USA) with laboratory-made injecting loop of 20, 50 and 100 µl.
The three-electrode detector system consisted of a tubular detector of compact silver solid
amalgam (inner diameter 0.5 mm) or flow-through detector of porous silver solid amalgam as
a working electrode, a saturated calomel electrode based on silver paste amalgam 8
(laboratory-made, it has the same potential as saturated calomel electrode) and platinum wire
84
as auxiliary electrode. At the beginning of each working day an electrochemical activation of
2.200 V during 300 s in mobile phase was applied.
For determination of 4-nitrophenol and lomustine, oxygen was removed from mobile phase
and measured solutions by bubbling with nitrogen. All measurements were performed at the
room temperature.
All chemicals were of p. a. grade and were purchased from Sigma-Aldrich.
Results and discussions
Preparation of the tubular detector and porous detector/reactor is described in detail in our
papers 9,10 (Fig. 1A, B). Briefly, in case of the tubular detector a silver powder was strongly
pressed into the Teflon tube (ID 1.5 mm, OD 2.1 mm) and a hole of the same diameter as the
inner diameter of the inlet capillary (0.5 mm) was formed along the central part of the silver
column. Into the Teflon tube with the silver column mercury was added and after about two
hours an excess of mercury was removed. The inner diameter of the used tubular detector is
the same (0.5 mm) as the inner diameter of connecting capillaries and the solid amalgam is a
continuation of the inlet capillary.
In a case of the porous detector (with contact) or reactor (without contact) a piece of Teflon
capillary was inserted into the Teflon tube in the place of the planned beginning of the silver
solid amalgam column. The Teflon tube and Teflon capillaries had the same parameters as it
was mentioned above. A silver powder (particles size –100 mesh, Alfa Aesar, Germany) was
gradually added into the upper hole of the tube and was mildly pressed by another piece of the
Teflon capillary. As soon as the length of the silver powder column was 10 mm (or other if it
was needed), it was rinsed 3 times by 2 mol dm3 HClO4 and then mercury was added into
this tube to convert silver powder into amalgam. After about 5 min, an excess of mercury was
carefully removed from the reactor.
The tubular detector was tested under flow injection analysis (FIA) conditions with
amperometric detection10. 4-Nitrophenol, Cd2+ and Zn2+ were used as model reducible
analytes. Following parameters of FIA-ED determination were optimized with respect to
amperometric response: the supporting electrolyte (MP), its concentration and pH, the
potential of detection (Ed), the flow rate (v), the sample volume injection (Vinj), and the length
of an electrochemically active part of the silver solid amalgam. Under optimal condition
(MP(Zn2+, Cd2+) 0.02 M AcB (pH 4.8), MP(4-NPh) 0.01 M HCl; Ed(Zn2+) = 1.500 V,
Ed(Cd2+) = 1.700 V and Ed(4-NPh) = 1.200 V; v = 1.00 ml min1; Vinj(Zn2+, Cd2+) = 100 µl
and Vinj(4-NPh) = 20 µl) the calibration dependences were obtained over the concentration
range 1.5·1061.5·104 mol dm3 (0.1010.0 ppm) for Zn2+, 8.9·1078.9·105 mol dm3
(0.1010.0 ppm) for Cd2+ and 1.8·1063.6·105 (0.2510.0 ppm) for 4-NPh. The limits of
detections of 4-nitrophenol, Zn2+, and Cd2+ are 5.0·107, 1.4·106, and 7.0·107 mol dm3,
respectively. The obtained results proved the long-term stability of the detector with RSD of
the determination of 4-nitrophenol, Zn2+ and Cd2+ 0.8, 0.8 and 0.9 % (n = 10; cZn = 7.7·105
mol dm3, cCd = 4.5·105 mol dm3 and c4-NPh = 3.6·105 mol dm3, e. i. 5 ppm for all
substances).
Moreover, we would like to show that tubular detector could be applied as an electrode in less
frequently used methods in flow  voltammetric techniques. For this purpose the
antineoplastic drug lomustine was measured by difference pulse voltammetry in flowing
system (flow-DVP). The following parameters were optimized: composition of the mobile
85
phase (pH of the buffer, concentration of the buffer and the amount of methanol), the flow
rate of the mobile phase and the modulation amplitude. The best results were obtain in [0.1 M
MES, 2.0 M NaCl, pH 6.0]:EtOH (9:1) with the flow rate of 0.10 ml min1 and modulation
amplitude of 70 mV. The limits of detections of lomustine is 1·107 mol dm3 and RSD of
repeatability was 1.6 % (n = 25; c = 1·106 mol dm3). Proposed optimized procedure was
successfully used for determination of lomustine in real samples of the medicinal drug
CeeNU Lomustine.
At this moment, the testing of porous flow-through detector is incomplete, but first results
show, that it provides the signal of Cd2+ about four times higher than the tubular detector.
This fact is caused by substantially larger surface area of the porous flow-through detector in
comparison with the tubular detector.
By combination of the porous reactor with immobilized enzyme and tubular detector the flow
amperometric enzymatic biosensor was constructed (Fig. 1C). The first step in preparation of
biosensor is formation of self-assembled monolayer of 11-mercaptoundecanoic acid (MUA)
at the surface of the porous reactor. Then, the enzyme was covalently attached to MUAmonolayer by EDC/NHS chemistry (N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carboimide and Nhydroxysuccinimide) (Fig. 1D). For now, three types of biosensor were prepared by
immobilization glucose oxidase from Aspergillus niger (GOx), cholesterol oxidase from
Brevibacterium (ChOx) and sarcosine oxidase from Bacillus sp. (SOx) for determination of
glucose, cholesterole and sarcosine. During enzymatic reactions of all of these enzymes
oxygen is consumed. This decrease of oxygen concentration, which is directly proportional to
the concentration of glucose, cholesterol or sarcosine was amperometrically measured on the
tubular detector under flow injection conditions. For now, the conditions of determination of
glucose in real sample of honey are completely optimized. More detailed information is given
in presentation of Bohdan Josypčuk and in our paper 9. The biosensors with immobilized
cholesterol oxidase and sarcosine oxidase are under testing.
Fig. 1. The schematic diagram of the (A) tubular detector and (B) porous detector/reactor of
silver solid amalgam (AgSA); (C) FIA system with biosensor; (D) the scheme of covalent
immobilization of enzyme (glucose oxidase, cholesterole oxidase, sarcosine oxidase) using
EDC/NHS chemistry onto porous AgSA surface with 11-mercaptoundecanoic acid
monolayer.
86
Fig. 2. (A) FIA-ED recordings of 4-nitrophenol (3.6·105 mol dm3) in 0.01 M HCl; Ed =
1.200 V; Vinj = 20 µl; v = (1) 2.40, (2) 1.60, (3) 1.00, (4) 0.60 and (5) 0.20 ml min1; (B)
DPV voltammograms of lomustine in [0.1 M MES, 2.0 M NaCl, pH 6.0]:EtOH (9:1); v =
0.10 ml min1 and modulation amplitude of 70 mV in concentration range
1·1061·104 mol dm3.
Conclusion
It was demonstrated that the tubular detector and porous flow-through detector/reactor based
on solid silver amalgam (compact and porous) are the effective and low cost devices suitable
for monitoring reducible organic and inorganic analytes in flow systems. Moreover, by
combination of the porous reactor with immobilized enzyme and tubular detector the flow
amperometric enzymatic biosensor could be constructed. The detectors and biosensors show
good baseline stability, good repeatability, long-term stability and possibility of measurement
at highly negative potentials.
Acknowledgements
This work was financially supported by Grant Agency of the Czech Republic (Project
P206/11/1638 and Project P208/12/1645), Grant Agency of Charles University in Prague
(Project 282111/2001/B-Ch/PrF), and Charles University in Prague (project SVV267215).
References
1.
Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009).
2.
Barbosa A. M. J., de Araujo T. A., Trindade M. A. G., Ferreira V. S.: J. Electroanal.
Chem. 68, 127 (2012).
3.
Danhel A., Shiu K.K., Yosypchuk B., Barek J., Peckova K., Vyskocil V.,
Electroanalysis 21, 303 (2009).
4.
Yosypchuk O., Karásek J., Vyskočil V., Barek J., Pecková K., TSWJ 2012, DOI:
10.1100/2012/231986 (2012).
5.
Jiranek I., Peckova K., Kralova Z., Moreira J.C., Barek J., Electrochim. Acta 54, 1939
(2009).
6.
Trojanowicz M., Anal. Chim. Acta 653, 36 (2009).
7.
Trojanowicz M., Anal. Chim. Acta 688, 8 (2011).
8.
Yosypchuk B., Barek J., Yosypchuk O.: Electroanalysis 23, 2226 (2011).
9.
Josypcuk B., Barek J., Josypcuk O.: Anal. Chim. Acta (2013), DOI:
10.1016/j.aca.2013.03.055.
10. Yosypchuk O., Barek J., Yosypchuk B.: Electroanalysis 24, 2230 (2012).
87
Simplified Pressure-Controlled Sample Introduction into Separation Capillary in
Laboratory-Made Electrophoretic Apparatus
(Tlakem řízené hydrodynamické dávkování vzorku do separační kapiláry
v laboratorních elektroforetických aparaturách)
Tereza Kadlecová a, František Opekar a, and Petr Tůma b
a
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
Albertov 2030, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Institute of Biochemistry, Cell and
Molecular Biology, Ruská 87, CZ-100 00 Prague 10, Czech Republic,
E-mail:[email protected]
Abstract
Standard and most frequently used method of introducing sample into the separation capillary
in laboratory electrophoretic apparatus is based on elevation of the vessel with the sample
solution sufficiently to generate gravity flow of solution into the sampling end of the capillary
which is immersed in the sample vessel. The sample vessel is held in certain elevated position
for a defined period of time and then returned to the basic position and replaced with the
vessel containing separation buffer. The other modes of hydrodynamic injection require the
application of positive pressure to the sample vessel or a negative pressure to the outlet vessel;
these methods are common in commercial apparatus. A simplified pressure-controlled method
usable in laboratory apparatus is described. It markedly accelerates sample introduction into a
separation capillary. Without moving the capillary, sample is introduced by a pressure applied
for a defined time-period into a vessel with the sample solution. The pressure is generated by
a membrane pump. Except for the manual replacement of the vessel with separation
electrolyte for the vessel with sample solution, all other sampling steps are controlled by a
computer. The results were compared with those obtained by a standard sampling method
utilizing an elevation of the capillary sampling end. Repeatability of the sampling expressed
as RSD is for a peak area about one half of that obtained for the standard method. The basic
analytical and separation parameters are quite comparable for both methods under identical
sampling parameters, 50 mbar/4 s and 10 cm/20 s. The method was tested on the separation of
0.5 mM K+, Na+ and tyramine mixture.
Key words: Capillary electrophoresis, Hydrodynamic sampling, Pressure-controlled
sampling, Laboratory-made apparatus.
Úvod
Nejběžnější dávkovací technikou v kapilární elektroforéze (CE) je hydrodynamické
dávkování1, u kterého je postupováno tak, že nádobka (vialka) se separačním elektrolytem,
v níž je ponořen dávkovací konec kapiláry, je vyměněna za nádobku s roztokem vzorku. Poté
je zvýšen tlak nad roztokem vzorku, případně snížen tlak v nádobce koncové. Po nadávkování
vzorku je nádobka se vzorkem opět nahrazena nádobkou se separačním pufrem; u komerčních
přístrojů se běžně dávkuje tlakem 25 až 100 mbar po dobu 0,5 – 10 s.
V laboratorních elektroforetických sestavách, které jsou stále hojně používány v základním
výzkumu2 i ve školních laboratořích, je zvýšení hydrodynamického tlaku v nádobce se
vzorkem realizováno vesměs tak, že experimentátor zvedne na definovanou dobu dávkovací
konec kapiláry i s nádobkou se vzorkem do určité výšky oproti výstupnímu konci kapiláry v
koncové nádobce3. Vzorek je nadávkován tlakovým rozdílem p = Δhg, kde Δh je rozdíl
výšek hladin u dávkovacího a výstupního konce kapiláry (obvykle 5 – 10 cm),  je hustota
roztoku vzorku a g je gravitační zrychlení. Po nadávkování vzorku vrátí experimentátor
dávkovací konec kapiláry do základní polohy a nádobku se vzorkem nahradí nádobkou s
elektrolytem. Celý postup dávkování je tak ovlivněn subjektivním přístupem experimentátora.
88
V této práci je vyvinuta a testována metoda pro dávkování zvýšeným tlakem nad hladinou
roztoku v nádobce s roztokem vzorku využitelná i v laboratorních elektroforetických
aparaturách. Tlak je generován pumpou, takže dávkovací konec kapiláry je stále ve stejné
poloze. Dobu dávkování lze přesně řídit vhodným počítačovým programem, takže subjektivní
přístup experimentátora je minimalizován. Jeho činnost spočívá pouze ve výměně nádobek se
vzorkem a elektrolytem u dávkovacího konce kapiláry. Zvýšením tlaku nad roztokem
v dávkovací nádobce lze řešit i promývání kapiláry mezi jednotlivými separacemi. Jde v
podstatě o zjednodušený systém používaný v komerčních elektroforetických sestavách.
Experimetální část
Principiální schema dávkovací (a promývací) části aparatury je na obr. 1. V plexisklovém
bločku (1) je plynotěsně (použitím vhodného těsnění) upevněn dávkovací konec separační
kapiláry (2), vialka se separačním elektrolytem nebo roztokem vzorku (3) a elektroforetická
elektroda (4). Trubičkou (5) je prostor nad roztokem ve vialce spojen zdrojem tlaku tvořeným
dvěma membránovými pumpami (6) a (7) a třícestnými elektromagneticky ovládanými
ventily (8) a (9). Na výstupech z pump jsou jednoduché mechanické manostaty pro nastavení
a udržování požadovaného tlaku, který tak lze podle potřeby měnit. Dávkovací tlak
generovaný pumpou (7) byl kontrolován elektronickým tlakoměrem (10), přesná hodnota
promývacího tlaku generovaného pumpou (6) není důležitá.
Obr. 1. Schéma dávkovací a promývací části laboratorní elektroforetické aparatury. (1)
plexisklový bloček, (2) dávkovací konec kapiláry, (3) nádobka s roztokem vzorku či
elektrolytu (vialka), (4) elektroforetická Pt elektroda, (5) vstup pro připojení ke zdoji tlaku,
(6) a (7) membránové pumpy, (8), (9) elektromagneticky ovládané třícestné ventilky, (10)
měřidlo tlaku. (A), (B) a (C) jsou jednotlivé pracovní pozice třícestných ventilků – aktuální
otevřená cesta je vyznačena tučně (klidový stav ventilků je znázorněn na obr. B); šipka značí
výstup do atmosféry.
Dávkovací zařízení pracuje takto: Membránové pumpy jsou v činnosti, manostaty udržují na
jejich výstupech konstantní tlak a aparatura může být v jednom ze tří stavů:
89
a) Po přepnutí ventilku (9) z klidové do aktivované polohy je vzorek nadávkován
tlakem přivedeným po definovanou dobu nad hladinu roztoku vzorku. Tlak je generován
pumpou (7), obr. 1A.
b) Po skončení dávkování se ventilek (9) vrací do klidové polohy a tlak v nádobce
prakticky ihned klesne na hodnotu tlaku atmosférického, obr. 1B. Po výměně nádobky se
vzorkem za nádobku se separačním elektrolytem je spuštěna separace.
c) Při promývání kapiláry po skončené separaci je na definovanou dobu přepnut do
aktivované polohy ventilek (8), takže na hladinu roztoku v nádobce s promývacím roztokem
působí tlak generovaný pumpou (6), obr. 1C. Po skončení promývání se ventilek (8) vrací do
klidové polohy a tlak v nádobce klesne na hodnotu tlaku atmosférického.
V testované aparatuře bylo přepínání ventilků řízeno časovými pulsy generovanými
programem vytvořeným v prostředí LabView a odebíranými z universální převodníkové
desky PCI-6034E (National Instruments, USA). Je zřejmé, že k jejich přepínání lze použít i
jiných způsobů generace potřebných pulsů. Dávkovací zařízení bylo upraveno tak, aby
umožňovalo dávkovat i standardním způsobem, tj. zvednutím dávkovacího konce kapiláry,
takže oba typy dávkování, testované a standardní, mohly být porovnány.
Výsledky a diskuse
Z optimalizačních měření vyplynulo, že vhodnými dávkovacími parametry jsou tlak 50 mbar
po dobu 4 s. Za těchto podmínek je v použité kapiláře délka nadávkované zóny rovná asi 1 %
z celkové délky kapiláry – tato hodnota je v souladu s učebnicovým doporučením pro
praktické CE analýzy, podle kterého by délka nadávkované zóny neměla překročit 1 - 2 %
z celkové délky kapiláry4. Promývání bylo prováděno tlakem 1000 mbar po dobu 40 s.
Základní analytické parametry získané z elektroferogramů změřených za těchto podmínek
byly srovnávány s parametry získanými při standardním způsobu dávkování se srovnatelnými
parametry, tj. zvednutím dávkovacího konce kapiláry do výšky 10 cm na dobu 20 s. Ilustrační
elektroferogramy jsou na obr. 2.
Tabulka I.
Porovnání základních analytických parametrů standardního a testovaného hydrodynamického
dávkování roztoku vzorku o ekvimolární koncentraci 0,5 mM draselného a sodného iontu.
Výsledky jsou z pěti opakovaných měření, statistické hodnocení je uvedeno pro hladinu
významnosti 95 %. Experimentální podmínky měření: křemenná kapilára o vnitřním průměru
75 m, celkové délky 57 cm, délky k detektoru 49 cm, separační pufr 20 mM MES/His (pH
6,17), separační napětí/proud, 25 kV/7 A, detekce bezkontaktní vodivostní (C4D).
Analyt
K+ ion
Na+ ion
a
Podíl ploch píků
1,09  0,03
1,05  0,02
a
Podíl výšek píků
1,05  0,01
1,05  0,02
Podíl výšek teoretického patraa
0,99  0,01
0,99  0,12
b
RSD v %, plochy píků
1,29 (2,41)
1,20 (2,46)
RSD v %, výšky píkůb
0,80 (1,22)
1,20 (1,54)
a
) Podíl: standardní dávkování/testované dávkování.
b
) V závorce jsou uvedeny RSD pro standardní dávkování.
90
Obr. 2. Elektroferogramy ekvimolární směsi 50 M draselného (1), barnatého (2),
vápenatého (3), sodného (4), hořečnatého (5) a lithného (6) iontu získané při testovaném (A) a
standardním (B) dávkování. Experimentální podmínky viz text u tab. I.
Z dat v tab. I a obr. 2 je evidentní, že oba způsoby dávkování jsou zcela ekvivalentní.
Relativní směrodatné odchylky (RSD) pro plochu píku jsou pro testované dávkování cca o 50
% nižší v porovnání se standardním dávkováním, což jednoznačně dokládá, že u testovaného
dávkování je do značné míry eliminován vliv činnosti experimentátora. Dalšími výhodami
testovaného dávkování je např. vysoká rychlost dávkování, což umožňuje analýzu většího
počtu vzorků za jednotku času a parametry dávkování (tlak, doba) lze velice snadno a
reprodukovatelně měnit (především při využití počítačem asistované obsluhy).
Závěr
Popsaná metoda výrazně usnadňuje a urychluje dávkování vzorku do separační kapiláry
v laboratorně sestavovaných elektroforetických aparaturách. Lze ji vřadit do počítačového
programu řídícího separační proces – ovládání vysokonapěťového zdroje, sběr a zobrazování
dat z detektoru atp., a tím minimalizovat „lidský faktor“ při provádění analýz.
Poděkování
Práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a sportu České republiky,
projekt MSM 0021620857, a Grantové Agentury České republiky, grant č. P206/10/1231.
Literatura
1. Jorgenson J. W., Lukacs K. D.: Anal. Chem. 53, 1298 (1981).
2. Vochyánová B., Opekar F., Tůma P., Štulík K.: Anal. Bioanal. Chem. 404, 1549 (2012).
3. Lauer H. H., Rozing G. P.: High Performance capillary Electrophoresis, A Primer.
Agilent Technologies, Germany 2010.
4. Altria K. D., Fabre H.: Chromatographia 40, 313 (1995).
91
Voltammetric Quantification of the Pollutants Nitro Compounds using Glassy Carbon
Electrode
Mahmoud Khodari, Ekram Rabie, and Omina Fahmy
South Valley University, Faculty of Science, Chemistry Department, Qena, Egypt
E-mail: [email protected]
Abstract
The voltammetric behavior of some nitro aromatic compound, such as p-nitrobenzoic acid, pnitrobenzaldhyde and p-nitroaniline, was investigated and the method was developed for the
simultaneous determination of these compounds. Adsorption of p-nitrobenzoic acid, pnitrobenzaldhyde and p-nitroaniline at glassy carbon electrode has been studied using cyclic
voltammetry and linear sweep techniques, it was found that p-nitrobenzoic acid in NaH2PO4
(0.05M) as a supporting electrolyte (pH=2), p-nitrobenzaldhyde in Na2HPO4 (pH=10) and pnitroaniline in NaNO3 (0.05M) supporting electrolyte (pH=2), give one defined reduction
peak and one oxidation peak. The effect of different parameters on the peaks response as
supporting electrolyte, pH, deposition time, accumulation potential and scan rate were
examined. A detection limit of 1x10-5 mol l-¹ was obtained under the optimum conditions for
three compounds.
Key words: Nitro compounds, Linear sweep Voltammetry, Supporting electrolyte, pnitrobenzoic, p-nitroaniline, p-nitrobenzaldehyde, Glassy carbon electrode.
Introduction
The determination of Nitro-aromatic compounds is important. These compounds are stable,
persistent and toxic Most of these compounds (i) are considered as poison by ingestion,
subcutaneous, intraperitoneal and intramuscular routes, (ii) exhibit human mutagenic and
carcinogenic potential, (iii) decompose to emit toxic fumes of NOx, and (iv) are potent
uncouplers of oxidative- and photo phosphorylation. While those properties render them
valuable feedstock for industry.
The better electrochemical technique to study the reduction of nitro compound is the cyclic
voltammetry. In fact, in aqueous medium, in the absence of inhibitor substances, only one
irreversible cyclic voltammetric peak. As glassy carbon (GC) electrodes have been widely
used for electrochemical measurements, the effects on the electrochemical responses, of
various surface states driven by various surface pretreatments have been studied [1]. Besides
polishing the surface with alumina powder, a generally known surface preparation method,
other procedures such as heating, electrochemical and chemical oxidations, and laser
activation have been employed [2-8]. Regarding these pretreatments, explanations of different
electron transfer kinetics from different surface states were suggested [9-13]. It was reported
that the activity of the electrode degraded with time because of the adsorption of impurities on
the surface [3]. Xiao et al [14] studied the adsorption of p-nitrobenzoic acid (PNBA) at an Au
electrode in 0.1 M HCIO4 solutions has been studied by combining cyclic voltammetry,
electrochemical quartz crystal microbalance (EQCM), in situ Fourier transforms infrared
spectroscopy (FTIRS) and surface enhanced Raman spectroscopy (SERS). Jiri Barek et al.
[15] studied the possibilities of electrochemical detection of various explosives containing
electrochemically active nitro group. Attention is paid both to the use of traditional mercury
electrodes and non-traditional, recently developed electrodes based on mercury amalgams,
bismuth films, boron-doped diamond films and carbon films in voltammetric and
amperometric mode.
92
Experimental
Preparation of solutions
1- p-nitrobenzoic acid, p-nitrobenzaldhyde and p-nitroaniline solutions:
Stock solution (0.1M) of each (p-nitrobenzoic acid, p-nitrobenzaldehyde and p-nitroaniline)
was prepared daily, the solutions of lower concentration for experiments were freshly
prepared by appropriate dilution from stock solution prior to each run.
The supporting electrolytes and buffers such as disodium hydrogen phosphate, sodium
chloride, acetate buffer, and sodium nitrate were prepared using double distilled water.
Ten ml of the selected buffer solution was studied in absence and presence of the mentioned
compounds using cyclic and linear voltammetric technique at glassy carbon electrode
Electrochemical cell and instrumentation
A three electrode cell was used consisting of the GC working electrode, a Ag/AgCl reference
electrode and a Pt wire auxiliary electrode.
A computer-aided electrochemistry system used in the voltammetric studies consists of
potentiostat model 263(EG&GPARC) Princeton applied corporation (made in USA) and
electroanalytical software model 270/250 version 4.0 (PARC).
Parameters for CV and LSV
The parameters of cyclic voltammetric measurements at GC electrode were as follows: start
potential +0.1 V, end potential -1.0 V, scan rate of 50 mV/s
Results and discussion
Voltammetric determination of p-nitrobenzoic acid, p-nitrobenzaldhyde and p-nitroaniline
was studied using glassy carbon electrode. Different parameters in which affect the peak
current and potentials were studied.
Electrochemical behavior of the studied compounds
The cyclic voltammetric measurement of p-nitrobenzoic acid showed one reduction peak at 0.312 V and oxidation peak at 0.253 V. The repetitive cyclic voltammograms of
1x10-4 M of p-nitrobenzoic acid in sodium dihydrogen phosphate buffer (pH 2.00) showed
that the reduction peak current decreased in the second cycle.(Fig 1) indicating the rapid
desorption of the adsorbed form. The same behavior was observed for
p-nitrobenzaldhyde in which the reduction peak was observed at -0.527 V and the oxidation
one at 0.125 V. in the case p-nitroaniline, the reduction peak was detected at -0.456 and the
oxidation one at 0.402 V.
Effect of Supporting, Electrolyte, pH, and scan rate
The influence of different supporting electrolytes was examined (sodium chloride, sodium
dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium nitrate and B.R). The results
showed that, sodium dihydrogen phosphate buffer gave the best peak also the effect of pH
(Fig 1) and the concentration of the supporting or the buffer solution was examined. The
collected data for the optimum conditions to determine the mentioned compounds are listed in
Table I.
93
2
30
4
8
20
IP()
12
10
0
-10
1000
500
0
-500
-1000
EP(mV)
Fig. 1. Effect of pH on the peak response of p-nitrobenzoic, sodium dihydrogen phosphate,
(0.05 M) and scan rate of 50mV/s.
Effect of Concentration and Calibration Curve
The effect of concentration of p-nitrobenzoic acid on the peak current was investigated. The
peak current was increased by increasing concentration. Fig. 2 shows the linear sweep
voltammograms for different concentrations p-nitrobenzoic acid, 50 mVs-1 scan rates in
sodium dihydrogen phosphate buffer (pH 2.00).
On plotting concentration of p-nitrobenzoic acid versus the peak current, a linear behavior
was observed with standard deviation of 0.53 and correlation coefficient of 0.9887.
35
30
25
IP()
20
(a)buffer
(b)2x10-4 mol/l
(c)3x10-4 mol/l
(d)4x10-4 mol/l
(e)5x10-4 mol/l
(f)6x10-4 mol/l
(g)7x10-4 mol/l
(h)8x10-4 mol/l
(i)8x10-4 mol/l
(j)9x10-4 mol/l
(k)1x10-3 mol/l
k
j
i
h
g
f
e
15
d
10
c
5
b
a
0
-5
-100
-150
-200
-250
-300
-350
-400
-450
-500
EP(mV)
Fig. 2. Effect of the concentration on the peak response of p-nitrobenzoic, sodium dihydrogen
phosphate (0.05 M) and scan rate of 50 mV/s.
Analytical applications
94
By applying the selected conditions for each compound, the mentioned nitro compounds were
determined in industrial waste water and in tap water by spiking.
Table I.
The optimum conditions for the determination of the compounds of interest.
Compound
p-nitrobenzoic
p-nitrobenzaldhyde
p-nitrobenzene
acid
Supporting or buffer
Dihydrogen
Dihydrogen
Nitric acid
phosphate
phosphate
pH
2.0
10.0
2.0
Scan rate (mV/s)
50
50
50
Deposition time (s)
80
1.77
10
Deposition potential (V)
0.0
-0.05
-0.05
Determination of the studied compounds in one run:
The results indicated the possibility of determination both of p-nitrobenzaldhyde and
p-nitroaniline in which two separate peaks were observed. In the presence of
p-nitrobenzoic, the peak of p-nitrobenzaldhyde increased indicating that the first peak
corresponds p-nitroaniline and the second one corresponds to the other compounds.
Conclusion
Linear sweep voltammetry can be applied for the determination of the p-nitrobenzoic acid, pnitrobenzaldhyde and p-nitroaniline using glassy carbon electrode and the method was applied
for the determination of the mentioned pollutants in different water samples.
References
1. McCreery R. L. In: A. J. Bard (Ed.), Electroanalytical Chemistry, Vol. 17, Marcel
Dekker, New York 1991, p. 221.
2. Zak J., Kuwana T.: J. Am. Chem. Soc. 104, 5514 (1982).
3. Hu F., Karweik D. H., Kuwana T.: J. Electroanal. Chem. 188, 59 (1985).
4. Fagan D. T., Hu I. F.: Kuwana T.: Anal. Chem. 57, 2759 (1985).
5. Engstrom R. C.: Anal. Chem. 54, 2310 (1982).
6. Engstrom R. C., Strasser V. A.: Anal. Chem. 56, 136 (1984).
7. Poon M., McCreery R. L., Engstrom R.: Anal. Chem. 60, 1725 (1988).
8. Jaworski R. K., McCreery R. L.: J. Electroanal. Chem. 369, 175 (1994).
9. Cabaniss G. E., Diamantis A. A., Murphy W. R., Linton R. W., Meyer T. J.: J. Am.
Chem. Soc. 107, 1845 (1985).
10. Chen M. P. C., Frying M. A., McCreery R. L.: Anal. Chem. 67, 3115 (1995).
11. Chen P. C., McCreery R. L.: Anal. Chem. 68, 3958 (1996).
12. Kuo T. C., McCreery R. L. L.: Anal. Chem. 71, 1553 (1999).
13. Rusling J. F.: Anal. Chem. 56, 575 (1984).
14. Xiao, X. Y., Sun, S. G., Electrochimica Acta,:45, 2897 (2000).
15. Barek J., Fischer J., Wang J.: Voltammetric and Amperometric Detection of Nitrated
Explosives. In. Sensing in Electroanalysis Vol. 6.; (Kalcher K., Metelka R., Svancara I.,
Vytras K., Eds.), Vol. 6 University Press Centre, Pardubice, 2011. p. 139.
95
Applications of Capillary Electrophoresis in Enzyme Assays
Tomáš Křížek a, Romana Velvarskáa, Veronika Doubnerová b, Helena Ryšlavá b,
and Pavel Coufal a
a
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
Albertov 2030, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Biochemistry, Albertov
2030, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic
Abstract
In this work, we present several applications that manifest the potential of capillary
electrophoresis in enzyme assays. Capillary electrophoresis was employed to perform offline
and online assays of -N-acetylhexosaminidase for three different substrates. Offline assays
were successfully utilized to monitor the enzyme reaction and to determine parameters such
as pH and temperature optimum. The offline assay was also used to compare activities of the
enzyme towards the natural and chromogenic substrates. Finally, an online enzyme assay was
developed and proved to be highly beneficial for inhibitor screening.
Key words: Capillary electrophoresis, Enzyme activity, -N-acetylhexosaminidase,
Chitotriose, Chitobiose, Electrophoretically mediated microanalysis.
Introduction
Determination of enzyme activity is an essential research tool in biochemistry and molecular
biology. Enzyme assays are also utilized in medicine because an abnormal activity of certain
enzymes can be used for diagnosis of many diseases including metabolic, infectious and
cancer 1,2. Capillary electrophoresis (CE) is a well-suited technique for enzyme assays due to
its high separation power, extremely low sample consumption and versatility of experimental
design. The first offline enzyme assay (enzyme reaction was performed outside the CE
system) was published in 1991 3. The first online assay (enzyme reaction was performed
inside the capillary) was reported one year later 4. Online CE enzyme assays are frequently
referred to as Electrophoretically Mediated Microanalysis (EMMA). Numerous works on
offline and online enzyme assays have been published since then 5,6. Nowadays, at-inlet
reaction technique, introduced into EMMA by van Dyck et al. 7, is the prevailing approach.
Enzyme and substrate are mixed inside the inlet part of the capillary, either electrophoretically
or by diffusion. Then reaction proceeds for a specified period of time followed by
electrophoretic separation of products and remaining substrate. One of the recent
developments in EMMA is so called Transverse Diffusion of Laminar Flow Profiles (TDLFP)
model introduced by Krylov et al. 8 TDLFP enables in silico prediction and optimization of
the at-inlet mixing of substrate and enzyme. Here, we present an EMMA assay developed
using the TDLFP model.
Enzyme assays presented in this work were developed for -N-acetylhexosaminidase (Hex,
EC 3.2.1.52). The enzyme in question hydrolyzes terminal -linked N-acetyl-D-glucosamine
(GlcNAc) and N-acetyl-D-galactosamine residues of oligosaccharides and glycoconjugates.
Hex is found in fungi and bacteria as a part of binary chitinolitic systems. Furthermore, it is
present in humans. Certain mutations of human Hex genes cause inborn metabolic
malfunctions known as Tay-Sachs and Sandhoff disease. In our study, dimer and trimer of
GlcNAc, i.e. N,N‘-diacetylchitobiose (chitotriose) and N,N‘,N‘‘-triacetylchitotriose
(chitobiose), served as substrates for Hex. Unlike UV/VIS spectrometry, CE enabled us to
work directly with these natural substrates. Furthermore, 4-nitrophenyl-N,N‘-diacetyl--Dchitobioside (NP-chitobiose) was used as a substrate in order to compare the activity of Hex
towards the O-glycosidic bonds in natural and chromogenic substrates.
96
Experimental
Sodium tetraborate, p.a., citric acid, p.a., and sodium hydroxide, p.a., were purchased from
Lachema (Czech Republic). N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), >99%, N,N‘diacetylchitobiose (chitobiose), >96%, N,N‘,N‘‘-triacetylchitotriose (chitotriose), >95%, 4nitrophenyl-N-acetyl--D-glucosaminide (NP-GlcNAc), >99%, and 4-nitrophenyl-N,N‘diacetyl--D-chitobioside (NP-chitobiose), >95%, were ordered from Sigma-Aldrich (USA).
-N-acetylhexosaminidase (Hex) from A. oryzae was isolated following the procedure
described in ref. 9. All samples and background electrolytes (BGE) were prepared using
deionized water produced by a Mili-Q system, Millipore (USA).
CE experiments were performed on a G1600 CE instrument (Agilent Technologies,
Germany). A fused-silica capillary of 75 m i.d. (CACO, Slovakia) was cut to 65.0 cm total
length (56.5 cm to the detection window). Prior to the first use, capillary was rinsed with 1 M
NaOH for 20 min and then with water for 10 min using a pressure of 100 kPa. Between
consecutive runs, capillary was rinsed for 2 minutes with BGE. Capillary was tempered to
25 °C using an air-cooling system. The 200 nm wavelength was used for data evaluation
using the ChemStation software (Agilent Technologies, Germany). Separation voltage was
12 kV (15 kV for the pH 9.2 buffer), samples were injected using a voltage of 5 kV for 5 s.
25 mM tetraborate buffer was used as the BGE. The pH of BGE was adjusted to 9.2, 10.0 and
10.3 depending on the mixture of analytes to be separated. All samples were dissolved in
50 mM citrate buffer, pH 4.5, in which enzyme reactions were performed, too.
To optimize the EMMA assay, TDLFP program 10 was used. In the optimized method, all the
zones were injected using a pressure of 5 kPa in the following order: reaction buffer (3 s),
enzyme (3 s), substrate (3 s), enzyme (3 s) and reaction buffer (9 s). All the injected zones had
the matrix of reaction buffer. After completing the injection sequence, reaction proceeded for
10 min and then separation voltage of 12 kV was applied. 25 mM tetraborate buffer, pH 10.0
was used as BGE.
Results and Discussion
To perform enzyme assays with chitobiose, chitotriose and NP-chitobiose as substrates, three
different sets of analytes had to be separated. 1) Chitobiose and GlcNAc, 2) chitotriose,
chitobiose and GlcNAc, 3) NP-chitobiose, chitobiose, NP-GlcNAc, and GlcNAc. Separation
of the first set was achieved in simple 25 mM sodium tetraborate, pH 9.2. To separate
chitotriose from chitobiose in the second set, pH had to be elevated to 10.0, so that the
increased dissociation of hydroxyl groups of the analytes in combination with the
electroosmotic flow (EOF) slowing down enabled baseline separation. In order to separate
analytes in the third set, the pH value had to be further elevated to 10.3. However, the pH
value was kept as low as possible in all cases because increasing pH resulted in prolonging
analysis times and decreasing separation efficiency caused by slowing EOF and increasing
current in the capillary. Separations of the three sets of analytes are shown in Figure 1.
The three separation methods were utilized for offline enzyme assays of Hex. Enzyme
reaction was performed in a sample vial in a total volume of 40 L. Reaction was terminated
by injection to the capillary. Therefore, the reaction could continue in the rest of the reaction
mixture. This was utilized for completely automated monitoring of the composition of
reaction mixture during the reaction (Figure 2). Separation was shortly interrupted every
5 minutes and a new sample of the same reaction mixture was injected. Using this method,
10 separations were achieved in 60 minutes even though one separation lasted 15 minutes.
97
NP-B
NP-G
10 mAU
B
G
pH 10.3
T B
pH 10.0
B
G
G
pH 9.2
6
8
10
12
14
16
tmig [min]
Fig. 1. Separation of substances, intermediates, and products of Hex enzyme in 25 mM
tetraborate buffer of varied pH. Peak identification: NP-B, NP-chitobiose; NP-G,
NP-GlcNAc; T, chitotriose; B, chitobiose; G, GlcNAc. Concentration of analytes: 1 mmol/L.
Changes in concentrations of chitotriose as substrate, chitobiose as intermediate and GlcNAc
as final product are depicted in Fig. 2B. The offline assay was also utilized to explore the
differences in activity of Hex towards natural and chromogenic substrates. In chromogenic
substrates, O-glycosidic bond between two saccharide units is simulated by O-glycosidic
bond between one saccharide unit and 4-nitrophenyl moiety. The enzyme hydrolyzes this
bond and releases 4-nitrophenol whose absorbance is utilized for UV spectrometric
determination. We performed the offline Hex hydrolysis of NP-chitobiose that contains both,
natural and chromogenic O-glycosidic bonds. Figure 3 shows that no chitobiose appeared
during the reaction. Hence, the natural O-glycosidic bond is strongly preferred by the enzyme,
giving rise to NP-GlcNAc and GlcNAc. NP-GlcNAc is consequently cleaved to GlcNAc and
4-nitrophenol in a significantly lower rate. 4-nitrophenol was impossible to determine using
our method because its electrophoretic mobility was too high and its overall motion in the
capillary was towards the anode. Analyte thus escaped from the capillary inlet. Nevertheless,
determination of 4-nitrophenol was not necessary to draw the conclusions stated above.
The EMMA assay of Hex for chitobiose as a substrate was developed using the TDLFP
model 11. Results of in silica optimization were in an excellent agreement with the results of
experiments. First, the order of injected zones was optimized. According to the TDLFP
model, the most efficient mixing of the reagents occurs when a sequence substrate-enzymesubstrate or enzyme-substrate-substrate is injected using equal injection pressures and times.
After this, a zone of reaction buffer is to be injected for a three times longer period of time.
Both model and experiment, showed that the enzyme-substrate-enzyme order is more efficient
due to the higher diffusion coefficient of the substrate. Injection time was the second
parameter optimized. The predictions of the model were in agreement with experiment in this
case, too. The longer injection time, the higher were peaks and thus the higher was
measurement sensitivity. On the other hand, while the injection times were increased from 3
to 5 s the zones became too long to be efficiently mixed. The injection pressure was kept the
highest value available in the instrument (5 kPa) in order to fulfill the presumption of TDLFP
model – parabolic profile of injected zones.
98
15
A
A.10
3
10
5
0
0
20
30 40
tmig [min]
50
60
70
B
-1
c.10 [mol.L ]
1.5
10
3
1.0
0.5
0.0
0
10
20
30
40
50
treaction [min]
Fig. 2. Monitoring of enzymatic cleavage of chitotriose. Offline assay with injections of the
reaction mixture repeated in 5-minute intervals. (A) Electropherogram. (B) Composition of
reaction mixture during the reaction. (♦) Chitotriose, (■) chitobiose, (▲) GlcNAc. 25 mM
tetraborate buffer, pH 10.0, separation voltage 12 kV, injection 5 kV×5 s.
The online enzyme assay brings remarkable advantages of extremely low consumption of
enzyme and substrate (tens of nanoliters per run) and complete automation. This kind of assay
is very well suited especially for comparative enzyme assay, i.e. comparing activity of
different samples and/or activities measured under different conditions. An example of such
comparative measurement is screening for inhibitors of enzymes that is frequently performed
in pharmaceutical research. Figure 4 shows the decrease of Hex activity with increasing
concentration of N,N-dimethylformanide (DMF) in reaction mixture monitored using the
EMMA assay.
99
NP-B
NP-G
5 mAU
G
10 min
NP-G
G
NP-B
30 min
NP-G
G
50 min
10
11
12
13
14
15
16
tmig [min]
Fig. 3. Separation of reaction mixture components during the hydrolysis of NP-chitobioside
with Hex after 10, 30 and 50 minutes of reaction. Peak identification: (NP-B) NP-chitobiose,
(NP-G) NP-GlcNAc, (T) chitotriose, (B) chitobiose, (G) GlcNAc. 25 mM tetraborate buffer,
pH 10.3, separation voltage 12 kV, injection 5 kV×5 s.
DMF
A
100
5 mAU
B
B
80
% activity
G
0.1 % DMF
0.2 % DMF
0.5 % DMF
8
9
60
40
20
0
10
11 12
tmig [min]
13
0.0
14
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
% (v/v) DMF
Fig. 4. Monitoring of inhibition of Hex enzyme by DMF using the online assay.
(A) Electropherograms of reaction mixture containing varied concentration of DMF.
(B) Proportion of original Hex activity in presence of different concentrations of DMF. Peak
identification: (DMF) N,N-dimethylformamide, (B) chitobiose, (G) GlcNAc. 25 mM
tetraborate buffer, pH 10.0, separation voltage 12 kV.
Conclusion
The versatility of capillary electrophoresis allowed us to tune the separation conditions in
order to perform enzyme assays with different substrates and to achieve different goals.
Offline assays were successfully employed for monitoring of enzyme reaction, its
intermediates and final products. For comparative measurements of enzyme inhibition, we
utilized online assay with high degree of automation and extremely low sample consumption.
Acknowledgement
This work was financially supported by Charles University in Prague, projects GAUK 710
and SVV 267215, by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic,
project MSM0021620857 and by the Czech Science Foundation, project P206/12/G151.
100
References
1. Raja M. M. M., Raja A., Imran M. M., Santha A. M. I., Devasena K.: Biotechnology 10,
51 (2011).
2. Zhao Y., Liu H., Riker A. I., Fodstad O., Ledoux S. P., Wilson G. L., Tan M.: Fron.
Biosci. 16, 1844 (2012).
3. Krueger R. J., Hobbs T. R., Mihal K. A., Tehrani J., Zeece M. G.: J. Chromatogr. 543, 451
(1991).
4. Bao J. M., Regnier F. E.: J. Chromatogr. 608, 217 (1992).
5. Glatz Z.: J. Chromatogr. B 841, 23 (2006).
6. Fan Y., Scriba G. K. E.: J. Pharm. Biomed. Anal. 53, 1079 (2010).
7. Van Dyck S., Van Schepdael A., Hoogmartens J.: Electrophoresis 22, 1436 (2001).
8. Okhonin V., Liu X., Krylov S. N.: Anal. Chem. 77, 5925 (2005).
9. Slámová K., Bojarová P., Petrásková L., Křen V.: Biotechnol. Adv. 28, 682 (2010).
10. Krylov S. N.: TDLFP program, York University, Toronto, Canada,
http:yourku.ca/skrylov/Research/index.html. Downloaded on 2nd July 2012.
11. Křížek T., Doubnerová V., Ryšlavá H., Coufal P., Bosáková Z.: Anal. Bioanal. Chem.
405, 2425 (2013).
101
Electrochemical Properties of Branched Pyridinium Cations
(Elektrochemické vlastnosti rozvětvených pyridiniových kationtů)
Štěpánka Lachmanová a, Magdaléna Hromadová a, Lubomír Pospíšil a, and Philippe P. Lainé b
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23
Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, ITODYS, UMR 7086 CNRS,
15 rue Jean­Antoine de Baif, 75205 Paris, France
Abstract
The electrochemical properties of branched extended pyridinium cations depend strongly on
the structure of the molecule. This work is focused on the redox processes of the electron
transfer of four derivatives of pyridinium. The electron transfer mechanism was studied by
various electrochemical methods. Although the structures of the studied molecules seem to be
quite similar, 1-N-methyl-2,4,6-triphenylpyridinium and 1',3',5'-trimethyl-2,4,6-triphenyl-1,4'bipyridine-1,1'-diium are reduced in two separate one-electron transfer steps. On the other
hand,
1'-methyl-2,4,6-triphenyl-1,4'-bipyridine-1,1'-diium
and
1',3,5-trimethyl-2,4,6triphenyl-1,4'-bipyridine-1,1'-diium accept two electrons, but in a single two-electron transfer.
The heterogeneous rate constants of the electron-transfer processes were determined.
Key words: Pyridinium cation, Electron transfer, Heterogeneous rate constant, Phasesensitive AC voltammetry, Electrochemical impedance spectroscopy, DC polarography,
Cyclic voltammetry.
Úvod
Vlastnosti prodloužených pyridiniových molekul jsou v současné době hojně studovány
zejména pro jejich možné využití v elektronice. I poměrně malé změny v jejich struktuře
mohou vést k významným rozdílům v jejich chování 1-3. V této práci byly studovány čtyři
molekuly, jejichž struktura je znázorněna na Obr. 1 za účelem určení heterogenních
rychlostních konstant procesu přenosu elektronů.
Obr. 1. Strukturní vzorce studovaných pyridiniových kationtů.
Experimentální část
Veškerá elektrochemická měření byla prováděna za použití potenciostatu s rychlou odezvou,
který byl zkonstruován v Ústavu fyzikální chemie J. Heyrovského AVČR, v.v.i., v Praze.
Spojení potenciostatu s počítačem zajišťovalo IEEE rozhraní (PC-lab, AdvanTech Co., Model
PCL-848). Digitalizace měřených výstupů byla provedena za využití PCL-818 karty o 12
102
bitové přesnosti (AdvanTech Co., USA). Pro AC voltametrii a elektrochemickou impedanční
spektroskopii byl výše uvedený potenciostat použit v kombinaci s dvoufázovým lock-in
zesilovačem SR 830 (Stanford Research Systems, USA).
Měření probíhala v elektrochemické cele v tříelektrodovém zapojení. Jako pracovní elektrody
byly použity statická (SMDE) a visící rtuťová kapková elektroda (HMDE, Laboratorní
přístroje Praha). Jako pomocná elektroda sloužila platinová síťka. Referentní
argentochloridová elektroda Ag | AgCl | 1M LiCl byla od měřeného roztoku oddělena solným
můstkem. Rozpuštěný kyslík byl z roztoků před měřením odstraňován proudem argonu,
samotná měření probíhala pod argonovou atmosferou. Získaná data byla zpracována
v programu Origin 8 (OriginLab Co., USA).
Postup syntézy a charakterizace studovaných látek 1-N-methyl-2,4,6-trifenylpyridinium (látka
A), 1',3',5'-trimethyl-2,4,6-trifenyl-1,4'-bipyridin-1,1'-diium (B), 1'-methyl-2,4,6-trifenyl-1,4'bipyridin-1,1'-diium (C) a 1',3,5-trimethyl-2,4,6-trifenyl-1,4'-bipyridin-1,1'-diium (D) byly již
popsány.1,2 Měřené roztoky byly vždy připraveny rozpuštěním odpovídajícího množství
analytu v roztoku 0,1M hexafluorofosfátu tetrabutylamonného (TBAPF6, Fluka, čistota
minimálně 99 %, před použitím dosušen při teplotě 60 - 80 °C) zbaveného rozpuštěného
kyslíku. Dimethyl sulfoxid (DMSO) byl dodán firmou Sigma-Aldrich, USA o čistotě p. a. a
byl po dodání uchováván pod inertní atmosférou. Bezvodý acetonitril byl také dodán firmou
Sigma-Aldrich, USA o čistotě 99,8 %.
Výsledky a diskuze
Elektrochemická analýza všech studovaných látek byla provedena ve dvou rozpouštědlech –
acetonitrilu a DMSO. Látky vykazují v DMSO vyšší rozpustnost, ale zároveň je v tomto
rozpouštědle znesnadněné měření při vysokých frekvencích. Rozpustnost látek v acetonitrilu
byla pro měření dostačující, nicméně se látky v tomto rozpouštědle silně adsorbovaly na
povrch pracovní elektrody a tím docházelo ke zkreslení výsledných dat. Vliv adsorpce je
obecně při studiu prodloužených pyridiniových molekul nezanedbatelný 4. Mnoho
prodloužených pyridiniových molekul je přímo syntetizováno pro dosažení co nejsilnější
adsorpce pro jejich snadnější studium některými metodami 5. Nicméně v tomto případě je
žádoucí volit takové podmínky, aby byla adsorpce analytů co nejslabší.
Látka A se v potenciálovém rozsahu ­ 0,2 V až ­ 1,5 V redukuje celkem dvěma elektrony,
přičemž se jedná o oddělené reverzibilní jednoelektronové přenosy. Počet přenesených
elektronů byl potvrzen nejen porovnáním výšky signálu se signálem ferrocenu, ale také
úplnou elektrolýzou roztoku. Dva po sobě následující procesy přenosu jednotlivých elektronů
byly zaznamenány v acetonitrilu i v DMSO.
Obdobně jako látka A se v obou použitých rozpouštědlech chová i látka B, která také přijímá
dva elektrony v oddělených krocích. Rozdíl ve struktuře těchto látek se projevil nejen
posunem redukčních signálů do méně negativních potenciálových oblastí, ale i přítomností
třetí redukční vlny v daném potenciálovém rozsahu, která je způsobena redukcí lutidylového
substituentu látky B.
Pro látky C a D bylo oproti předchozím případům zaznamenáno značně odlišné
elektrochemické chování. Obě tyto látky vykazují obdobné redoxní chování, v potenciálovém
rozsahu ­ 0,2 V až ­ 1,0 V se redukují dvěma elektrony, nicméně v pouze jednom
dvouelektronovém procesu. Tento jev je pozorovatelný v acetonitrilu i v DMSO. Strukturní
rozdíly mezi látkami C a D se projevily v odlišné reverzibilitě procesu elektronového
transportu. Látka C vykazuje při cyklické voltametrii v DMSO reverzibilní přenos obou
103
elektronů při rychlostech polarizace elektrody 0,06 V/s až 2 V/s. Látka D se však redukuje
reverzibilně až při rychlosti polarizace elektrody vyšší než 0,5 V/s. Tento jev ukazuje na
probíhající strukturní změnu během procesu.
Všechny zde uvedené látky byly studovány i za využití fázově citlivé AC voltametrie a
elektrochemické impedanční spektroskopie (EIS). Vypočítané hodnoty heterogenní rychlostní
konstanty ukazují na velice rychlý proces elektronového přenosu v obou krocích redukce
látek A a B. U látek C a D dochází v DMSO v porovnání s předchozí dvojicí látek k výrazně
pomalejšímu přenosu prvního elektronu.
Závěr
Přenos prvního elektronu na molekulu látky A i B je velice rychlý proces spojený se změnou
struktury látky. Po překonání energetické bariéry vložením negativnějšího potenciálu
na elektrodu dochází k rychlému přenosu druhého elektronu. U látek C a D je přenos prvního
elektronu velice pomalý, ale redukce druhým elektronem probíhá velmi rychle a prakticky
okamžitě, bez nutnosti překonat energetickou bariéru jako u předchozí dvojice látek. Z tohoto
důvodu dochází ke kompresi potenciálů a tím i ke splynutí signálů přenosu jednotlivých
elektronů.
Acknowledgement
This work was supported by the Academy of Sciences of the Czech Republic (M200401202).
Literatura
1. Fortage J., Peltier C., Perruchot C., Takemoto Y., Teki Y., Bedioui F., Marvaud V.,
Dupeyre G., Pospisil L., Adamo C., Hromadova M., Ciofini I., Laine P.: J. Am. Chem.
Soc. 134, 2691 (2012).
2. Fortage J., Peltier C., Nastasi F., Puntoriero F., Tuyeras F., Griveau S., Bedioui F.,
Adamo C., Ciofini I., Campagna S., Laine P.: J. Am. Chem. Soc. 132, 16700 (2010).
3. Fortage J., Tuyeras F., Peltier C., Dupeyre G., Calborean A., Bedioui F., Ochsenbein P.,
Puntoriero F., Campagna S., Ciofini I., Laine P.: J. Phys. Chem. A 116, 7880 (2012).
4. Hromadová M., Kolivoška V., Sokolová R., Gál M., Pospíšil L., Valášek M.: Langmuir
26, 17232 (2010).
5. Kolivoska V., Valasek M., Gal M., Sokolova R., Bulickova J., Pospisil L., Mezsaros G.,
Hromadova M.: J. Phys. Chem. Lett. 4, 589 (2013).
104
Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Damage
(Malondialdehyd jako biomarker oxidativního poškození)
Jana Matějčková, Eva Samcová, and Petr Tůma
Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Department of Biochemistry, Cell
and Molecular Biology, Ruská 87, CZ-100 00 Prague 10, Czech Republic
E-mail: [email protected]
Abstract
The level of malondialdehyde (MDA) as the most abundant metabolite of lipoperoxidation
was determined by an optimized HPLC method with UV detection in blood plasma. Two
groups of patients along with healthy controls were examined, diabetics (found the average
concentration of MDA 9 M in Diabetes mellitus I, and 7 M in Diabetes mellitus II) and
patients with gynaecological cancer (11 M). Another study verified that surgical removal of
the tumour led to increase plasmatic concentration of MDA and vitamin E was shown as
a suitable supplement in the surgical procedure. The other examined group were vegans,
which was found the lowest level of MDA i. e. 5 M concentration of MDA in blood plasma.
Key words: Malondialdehyde, Diabetes mellitus, Vegans, Gynaecological cancer, vitamin E
Úvod
Jedním z biomarkerů oxidativního poškození biomembrán je malondialdehyd (MDA) 1. MDA
vzniká při peroxidaci polyenových mastných kyselin. Neenzymatická peroxidace lipidů je
vyvolána nespecifickým, mnohdy patologickým, faktorem. Při této reakci se řetězce
modifikovaných mastných kyselin snadno štěpí na kratší produkty, včetně uhlovodíků, které
vydechujeme (ethan, pentan) a toxických aldehydů jako je MDA (Obr. 1).
Obr. 1. Peroxidace lipidů a vznik malondialdehydu.
Peroxidací lipidů dochází ke změně propustnosti membrán, zvyšuje se membránová
propustnost pro ionty a tím působí lýzu buněk a snižuje se membránový potenciál.
Lipoperoxidací uvolněný MDA se kovalentně váže přes aminovou nebo thiolovou skupinu na
proteiny a nukleové kyseliny a tím je poškozuje. U proteinů dochází k agregaci a stávají se
citlivější k proteolytické degradaci 2,3.
Vysoká hladina MDA byla nalezena v souvislosti s četnými akutními i chronickými
patologickými procesy v organismu. Vysoké hladiny MDA byly prokázány u pacientů
s Diabetes mellitus 4-6, neurodegenerativním onemocněním (Alzheimerova a Parkinsonova
choroba) 7,8, u preeklampsie 9,10, u rakovinného bujení 11,12, ale také např. u kuřáků 13.
105
Experimentální část
Klinický experiment
Hladina MDA byla sledována u několika skupin pacientů. Všechny vzorky krve byly
odebírány do odběrových zkumavek Vacuette s antikoagulantem EDTA (Greiner Bio-one,
Německo) a následně byly centrifugovány 4 min. při zrychlení 1780 g. Vzorky krevní plazmy
byly dlouhodobě uchovány při teplotě –20 oC.
Sledované skupiny pacientů:
1. Diabetes mellitus Do studie bylo zahrnuto 22 pacientů s indikovaným diabetes mellitis I.
typu a 28 pacientů s Diabetes mellitus II. typu léčených na II. interní klinice Fakultní
nemocnice Královské Vinohrady v Praze. Pacienti přišli na odběr krve v ranních hodinách,
nalačno.
2. Onkologické pacientky: celkem 19 pacientek s indikací karcinomu endometria, cervicis
nebo ovarií léčené na Gynekologicko-porodnické klinice Fakultní nemocnice Královské
Vinohrady v Praze. Do studie bylo zahrnuto 7 zdravých kontrol stejného věku.
Pacientky podstoupily chirurgické odstranění karcinomu a byly rozděleny do dvou skupin.
První den, 24 hodin před plánovanou operací (ve 13 hodin), byl každé pacientce odebrán
vzorek venózní krve. Jedné skupině bylo 18 hodin před plánovanou operací podáno 1200 mg
vitaminu E (Zentiva – Sanofi, Česká Republika). Kontrolní skupina byla bez suplementace
vitaminem E. Druhý den podstoupily pacientky operaci, kdy jim byl nádor chirurgicky
odstraněn a hned po operaci (opět ve 13 hodin) jim byl odebrán další vzorek krve. Následující
den, tj. 24 po operaci, byl odebrán poslední vzorek krve.
3. Vegani: 13 vzorků krve bylo získáno od veganů ze studie „Vegge“, která probíhala na II.
interní klinice Fakultní nemocnice Královské Vinohrady. Odběr byl proveden v ranních
hodinách, pacienti byli na lačno.
HPLC stanovení
HPLC měření byla provedena na přístroji HPLC (Schimadzu, Japonsko), zahrnujícím pumpu
LC-10ADvp, autosampler SIL-10ADvp, UV/Vis detektor SPD-10Avp. Použita byla kolona
Ascentis Express C18 (Sigma-Aldrich / Supelco, Německo) o rozměrech 100 x 3,0 mm
s velikostí částic 2,7 m, která byla termostatována na 30 oC. Mobilní fáze byla míchána
z acetonitrilu (LachNer, 99%) a deionizované vody (okyselené CH3COOH) v poměru 40:60
(v/v) po celou dobu analýzy. Průtok mobilní fáze byl 0,4 ml/min s maximálním tlakem
27 MPa. Odezva detektoru byla zaznamenávána při vlnové délce 307 nm. Pro ovládání
přístroje a vyhodnocení chromatogramů byl použit software LCSolution verze 1.11SP1.
Vzorky krevní plazmy byly připraveny použitím 100 l rozmražené krevní plazmy, která byla
smíchána se 100 l interního standardu methylmalondialdehyd (MeMDA, 50 M) a 400 l
1,5 mol l-1 NaOH. Takto připravená směs pro alkalickou hydrolýzu biologického materiálu
byla zahřívána při teplotě 60 oC po dobu 60 min. Po vychladnutí bylo ke směsi přidáno 200 l
35% HClO4. Směs byla protřepána a centrifugována po dobu 4 min při zrychlení 7000 g.
Veškerý supernatant byl odebrán a derivatizován 50 l 5 mM 2,4-dinitrofenylhydrazinem (po
dobu 30 min při 60 oC) a následně extrahován dvakrát do 2 ml hexanu. Extrakt byl vysušen
proudem dusíku při 40 oC, rozpuštěn v 250 µl mobilní fáze a 5 µl takto připraveného vzorku
bylo nadávkováno na kolonu 14.
106
Výsledky a diskuse
Diabetes mellitus I. a II. typu
Diabetes mellitus (DM) je vždy provázen oxidačním stresem. V krvi a tkáních diabetiků je
prokazatelná vyšší tvorba reaktivních forem kyslíku a lipoperoxidů 2. To bylo potvrzeno
i naším měřením, kdy pacienti s DM I měli o 50 % a pacienti s DM II mají o 25 % vyšší
hladinu MDA než kontrolní skupina (Tabulka I). Tyto rozdíly jsou na hladině významnosti
0,05 statisticky významné dle testu ANOVA i t-testu. MDA způsobuje zesíťování (cross
linking) s kolagenem a ten může být posléze glykován a takto glykovaný kolagen způsobuje
další peroxidaci lipidů a tím další vznik MDA 5,15.
Tabulka I.
Koncentrace MDA u pacientů s DM I, DM II a zdravých kontrol.
Parametr
DM I
DM II
8,9
±
2,8
7,4
± 2,2
Průměrná koncentrace MDA, M
5,2 – 13,3
4,4 – 12,4
Koncentrační rozmezí MDA, M
Průměrný věk pacientů, roky
43,9 ± 14,9
64,9 ± 11,3
Počet jedinců
22
28
Kontrola
5,9 ± 0,8
4,8 – 7,7
42,3 ± 10,6
11
Pacientky s indikací gynekologického karcinomu
U pacientek s gynekologickým karcinomem je průměrná hladina koncentrace MDA 10,7 M
a u zdravých kontrol byla koncentrace MDA 6,9 M (Tabulka II). Koncentrace MDA
u pacientek s karcinomem je o 55 % vyšší než u zdravých kontrol. Tento rozdíl je statisticky
významný na hladině významnosti 0,05, což bylo prokázáno použitím testu ANOVA i t-testu.
Zvýšená hladina MDA u pacientek s karcinomem je způsobena zvýšenou mírou oxidativního
stresu v průběhu karcinogeneze, který se projevuje zvýšenou lipoperoxidací 16,17. Pacienti
mají sníženou antioxidační ochranu, protože karcinom antioxidanty spotřebovává. MDA
může podporovat vznik a růst nádoru, protože může reagovat s funkčními skupinami dalších
buněčných složek a ty mohou poté působit další růst karcinomu 18.
Tabulka II.
Koncentrace MDA u pacientek s karcinomem a zdravých kontrol.
Parametr
Karcinom
10,7 ± 1,5
Průměrná koncentrace MDA, M
8,2 – 13,1
Koncentrační rozmezí MDA, M
Průměrný věk pacientů, roky
65,2 ± 11,6
Počet jedinců
19
Kontrola
6,9 ± 1,8
4,3 – 9,0
55,6 ± 12,3
7
Vliv podání vitaminu E u pacientek s gynekologickým karcinomem
Na začátku sledování měly obě skupiny (s vitaminem E i kontrolní skupina) srovnatelnou
hladinu MDA. Statisticky významný rozdíl (p > 0,05, ANOVA, t-test) se potvrdil mezi
skupinami již u druhého vzorku (1 hod po operaci). I druhý den po operaci byly hodnoty
koncentrace MDA u obou skupin statisticky rozdílné. Zároveň byl odhalen i rozdíl u skupiny
bez vitaminu E mezi odběrem 24 hodin před operací a hodinu po operaci, stejně tak i 24 hodin
po operaci, tzn. chirurgický zákrok vedl ke zvýšení hladiny MDA. Výsledky ukazují, že
jednorázové podání vitaminu E několik hodin před operací účinně ovlivnilo negativní účinek
operace na poškození biomembrán. Tento výsledek potvrzuje výsledky studie účinků
vitaminu E na snížení hladiny MDA u pacientů s DM I 19.
107
Tabulka III.
Koncentrace MDA v průběhu operace odstranění gynekologického karcinomu u pacientek
s podaným vitaminem E a bez něj.
Parametr
Vitamin E
Kontrola
10,1 ± 1,2
10,1 ± 1,0
1. odběr – 24 hod. před operací, MDA, M
11,2 ± 1,2
13,8 ± 2,9
2. odběr – 1 hod. po operaci; MDA, M
10,2 ± 1,5
13,1 ± 1,8
3. odběr – 24 hod. po operaci; MDA, M
Počet jedinců
10
8
Vegani
Hladina MDA byla proměřena u veganů, kteří minimálně tři roky nepožívali žádné živočišné
produkty. Vegani nekonzumují žádné maso, ale ani vejce a mléčné výrobky 20. Většina
veganů suplementovala vitamin B12 a vitamin D2.
Koncentrace MDA u kontrolní skupiny (5,8 ± 0,8 M) je o 20 % vyšší než průměrná
koncentrace MDA u veganů (4,9 ± 0,8 M). Tento rozdíl je na hladině významnosti 0,05
statisticky významný podle obou testů – ANOVA i t-testu. Průměrný věk obou skupin je
srovnatelný a také je téměř stejná hodnota body mass indexu (BMI). Nižší hladina MDA
může být způsobena veganskou stravou, která obsahuje vysoké množství rostlinných bílkovin,
polysacharidů, vlákniny, hořčíku, draslíku, kyseliny listové a antioxidantů, jako je vitamín C
a E a tím chrání lipidy před lipoperoxidací 20.
Tabulka IV.
Koncentrace MDA veganů a kontrolní skupiny.
Parametr
Průměrná koncentrace MDA, M
Koncentrační rozmezí MDA, M
Průměrný věk, roky
Průměrné BMI, kg m-2
Počet jedinců
Vegani
4,9 ± 0,8
3,8 – 6,7
29,1 ± 4,8
22,4 ± 2,82
13
Kontrola
5,8 ± 0,8
5,1 – 8,0
28,1 ± 3,6
22,8 ± 3,4
16
Závěr
Optimalizovaná metoda HPLC umožňuje provádět rychlý screening indikátoru MDA v krevní
plasmě. Provedené klinické studie odhalily zvýšenou hladinu MDA u pacientů s Diabetes
mellitus a u pacientek s nádorem vaječníků, děložního čípku a endometria. Naopak u veganů,
kteří po tři roky nekonzumovali masné výrobky, je hladina MDA nižší. Dále bylo prokázáno,
že plazmatická hladina MDA se zvyšuje po provedení chirurgického zákroku v podobě
operace. Tento nežádoucí efekt lze účinně potlačit jednorázovým podáním vitamínu E před
operací.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektu PRVOUK 31.
Literatura
1. Nielsen F., Mikkelsen B. B., Nielsen J. B., Andersen H. R., Grandjean P. P: Clinical
Chemistry 43, 1209 (1997).
2. Štípek S.: Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a nemoci, Grada Publishing. Praha
2000.
3. Murray R. K., Grayer D. K., Mayes P. A., Rodwell V. W.: Harperova biochemie, H&H,
Praha 1998.
108
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Kesavulu M. M., Rao B. K., Giri, R., Vijaya J., Subramanyam G., Apparao C.: Diabetes
Research and Clinical Practice 53, 33 (2001).
Slatter D. A., Bolton C. H., Bailey A. J.: Diabetologia 43, 550 (2000).
Su Y., Liu X. M., Sun Y. M., Jin H. B., Fu R., Wang Y. Y., Wu Y., Luan Y.:
International Journal of Clinical Practice 62, 877 (2008).
Dib M., Garrel C., Favier A., Robin V., Desnuelle C.: Journal of Neurology 249, 367
(2002).
Casado A., Lopez-Fernandez M. E., Casado M. C., de la Torre R.: Neurochemical
Research 33, 450 (2008).
Rudra C. B., Qiu C. F., David R. M., Bralley J. A., Walsh S. W., Williams M. A.:
Clinical Biochemistry 39, 722 (2006).
Kaur G., Mishra S., Sehgal A., Prasad R.: Molecular and Cellular Biochemistry 313, 37
(2008).
Cirak B., Inci S., Palaoglu S., Bertan V.: Clinica Chimica Acta 327, 103 (2003).
Esme H., Cemek M., Sezer M., Saglam H., Demir A., Melek H., Unlu M.: Respirology
13, 112 (2008).
Lykkesfeldt J.: Clinica Chimica Acta 380, 50 (2007).
Matejckova J., Samec M., Jacek M., Tuma P.: Chemicke Listy 105, 375 (2011).
Bhatia S., Shukla R., Madhu S. V., Gambhir J. K., Prabhu K. M.: Clinical Biochemistry
36, 557 (2003).
Looi M. L., Dali A. Z. H. M., Ali S. A. M., Ngah W. Z. W., Yusof Y. A. M.: European
Journal of Cancer Prevention 17, 555 (2008).
Beevi S. S., Rasheed M. H., Geetha A.: Clinica Chimica Acta 375, 119 (2007).
Buzby G. P., Mullen J. L., Stein T. P., Miller E. E., Hobbs C. L., Rosato E. F.: Cancer 45,
2940 (1980).
Jain S. K., Mcvie R., Smith T.: Diabetes Care 23, 1389 (2000).
McEvoy C. T., Temple N., Woodside J. V.: Public Health Nutrition 15, 2287 (2012).
109
Determination of Thymol Using Flow Injection Analysis on New Coulometric Detector
with Renewable Working Material Based on Glassy Carbon Microparticles
Jan Mika, Jiří Barek, Jiří Zima, and Hana Dejmková
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
UNESCO Laboratory of Enviromental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2,
Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Application of coulometric detectors in HPLC might be complicated by the passivation of the
working material and its difficult renewal. This paper deals with the new type of coulometric
detector with renewable working material based on spherical microparticles of glassy carbon.
Detector was tested by determination of hydroquinone and thymol using flow injection
analysis. The obtained results confirmed that this detector can be successfully applied for flow
measurements.
Key words: Coulometry, Flow injection analysis, Hydroquione, Thymol, Glassy carbon
microparticles.
Introduction
In modern analytical chemistry, there is a great requirement for the determination in flow
arrangement, especially for HPLC and flow injection analysis (FIA) 1; these requirements are
connected with the demands on detectors, such as low price of an individual analysis,
sensitivity, reproducibility etc. Electrochemical detectors meet these conditions well and thus
they are suitable candidates 2. Amperometry and coulometry are the most common
electrochemical detection techniques. Coulometry works with high conversion degree and so
the working material must have sufficiently large active surface 3. It can be accomplished by
using porous material or material based on microparticles, such as crushed vitreous carbon 4.
Nevertheless, passivation is a serious problem for these materials, especially in case of
determination of samples with complex matrix. The working material must be then
periodically and reproducibly renewed. Mechanical cleaning is almost impossible 5 and
electrochemical cleaning does not always guarantee sufficient repeatability of working
material surface; therefore, the replacement of whole working material is often necessary,
which is expensive and time-consuming. Special design of detectors, such as “jet ring”
detector, tried to enable faster and cheaper replacement of passivated working material 6-8.
This work attempts to test new coulometric detector with renewable working material based
on glassy carbon microparticles for determination of electrochemically well-known substance,
hydroquinone, and to develop new electrochemical method for the determination of thymol,
component of herbs and some pharmaceutical preparations with antibacterial and antiseptic
effects 9.
Experimental
Chemicals
Appropriate amount of hydroquinone (Fig. 1A, Lachema Brno, Czech Republic) was
dissolved in distilled water to prepare stock solutions of concentration 1 10–3 mol L–1; thymol
(Fig. 1B, Thymolum, Tamda, Czech Republic) was dissolved in methanol (Merck, Germany,
≥ 99,9%) to prepare stock solution of concentration 1 10–2 mol L–1. Solutions of lower
concentrations were obtained by their dilution with Britton-Robinson (B-R) buffer. Alkaline
component of B-R buffer was prepared from sodium hydroxide (98%, Lach-Ner, Czech
Republic) and acidic component from phosphoric acid (85%, Lach-Ner, Czech Republic),
boric acid (99,5%, Lach-Ner, Czech Republic), and acetic acid (99%, Lach-Ner, Czech
Republic). Detector was filled by the mixture of 10 mg of spherical carbon particles (particles
110
size 10 – 20 µm, Alfa Aesar, Germany) and 2 mL of nitromethane (POCH, Gliwice, Poland).
This mixture was filled into the detector by methanol. Millipore Q-plus System (Millipore,
USA) was used for the preparation of distilled water for all aqueous solutions.
Fig. 1. Chemical structure of hydroquione (A) and thymol (B).
Apparatus
FIA system used for the determination of both analytes was composed of HPP 5001 high
pressure pump with ADLC2 detector (both Laboratorni pristroje, Prague, Czech Republic)
and it worked in three-electrode arrangement, consisting of working coulometric detector with
renewable working material, platinum auxiliary electrode with large surface and Ag/AgCl (3
M KCl) reference electrode (both Monokrystaly Turnov, Czech Republic). Coulometric
detector was filled by HPP 4001 high pressure pump (Laboratorni pristroje Prague, Czech
Republic). All the measurements were made in triplicate, unless stated otherwise. The
detection limit was calculated as the concentration corresponding to three times the standard
deviation (α = 0.05) of the lowest measured concentration.
Result and discussion
Basic electrochemical properties of the newly developed coulometric detector were tested,
using FIA determination of hydroquinone at pH 2 (Ref. 10). Optimal determination conditions
were found: detection potential + 1.1 V, flow rate 0.7 mL min–1 and injected volume 100 µL.
At these conditions detector worked in coulometric mode with conversion degree of 112 %
and the signal of detector was stable for 30 injection of hydroquinone with RSD 1.39 %.
Repeatability of signal obtained from 5 different fillings of detector was high (RSD 1.86 %);
thanks to this, there is possibility to use this detector for strongly passivating analytes such as
thymol. Concentration dependences of FIA measurements were linear in the range from 4 to
100 µmol L–1 and detection limit was 0.44 µmol L–1; other parameters of the dependence are
summarized in Table 1, while the concentration dependence is shown in Fig. 3B.
After the successful determination of hydroquinone as the model compound, new
electrochemical method for determination of thymol using new coulometric detector was
developed. First step was the optimization of pH of the carrier solution in the range from pH 2
to 12. Area and height of the peak were similar in the observed range, but slightly better
parameters were obtained at pH 10, which was therefore selected as optimal value. At this pH,
optimal conditions were determined: detection potential +1.1 V, flow rate 0.6 mL min–1 and
injected volume 50 µL. Some of the dependences obtained during the optimization
measurements are shown in Fig. 2.
Conversion degree and repeatability were determined under the optimal conditions. As well as
in the preliminary measurements, the conversion degree slightly exceeded the theoretical full
conversion and reached 114 %. Passivating properties of thymol were much stronger than
those of hydroquinone and the signal of the repetitive injections was stable for just
6 injections of thymol (100 µmol L–1), after that the signal reduced rapidly (Fig 3A); RSD of
111
signal during five refillings of the detector was 4.23%. Parameters of the concentration
dependence measured under the optimal conditions are summarized in Table 1 and the
dependence is shown in Fig. 3B; the dependences are linear from 4 to 100 µmol L–1 and limit
of detection was 0.29 µmol L–1.
Fig. 2. Hydrodynamic voltammograms of thymol (100 µmol L–1) (A) in B-R buffer of pH 4
(×), 6 (Δ), 8 (○) and 10 () and background current of pH 10 (); flow rate 0.5 mL min–1
and injected volume 20 µL and FIA recordings of thymol (B) of injected volume 10 (1), 20
(2), 50 (3) and 100 (4) µL; concentration of thymol 100 µmol L–1 in B-R buffer of pH 10,
detection potential +1,1 V and flow rate 0.6 mL min–1.
Fig. 3. FIA recording of 10 injections of thymol (100 µmol L–1) (A) in B-R buffer of pH 10;
flow rate 0.5 mL min–1, injected volume 20 µL, and detection potential 1.1 V and
concentration dependences (B) of hydroquinone () and of thymol (); measured at the
optimal conditions.
112
Table I.
Parameters of calibration dependences of the respective analytes.
dynamic linear
slope
intercept
correlation
analyte
range
–1
(μA
s
mol
L)
(μA
s)
coefficient
(μmol L–1)
hydroquione
4 – 100
22.18
–82.2
0.9997
thymol
4 – 100
7.65
–18.3
0.9991
limit of
detection
(µmol L–1)
0.44
0.29
Conclusion
New method for the determination of thymol by FIA with coulometric detection was
developed. In spite of the strong passivating properties of thymol, the renewable electrode
material enabled to obtain stable and repeatable signal and provided fast and easy work with
coulometric detection.
Coulometric detector works with similar detection limits as other common methods such as
HPLC with UV 11 detection or DPV 12, although it cannot compete with highly sensitive
methods such as GC/MS 13. Other detection techniques (HPLC-ED 14) obtained better limit of
detection thanks to extraction step, so it can be assumed, that the same procedure could also
improve results of this newly developed method.
Acknowledgements
This work was performed in the framework of Specific university research (SVV 267215).
Financial support from the Grant Agency of Charles University (project no. 84213) is
gratefully acknowledged.
References
1. Bond A. M.: Anal. Chim. Acta 400, 333 (1999).
2. Toth K., Stulik K., Kutner W., Feher Z., Lindner E.: Pure Appl. Chem. 76, 1119 (2004).
3. Stulik, K., Pacakova, V.: Electroanalytical measurements in flowing liquids. E. Horwood.
1987.
4. Beinrohr E., Nemeth M., Tschopel P., Tolg G.: Fresenius. J. Anal. Chem. 343, 566
(1992).
5. Schieffer G. W.: Anal. Chem. 52, 1994 (1980).
6. Mayer M., Ruzicka, J.: Anal. Chem. 68, 3808 (1996).
7. Pollema C. H., Ruzicka, J.: Anal. Chem. 66, 1825 (1994).
8. Ruzicka J.: Anal. Chim. Acta 308, 14 (1995).
9. Český lékopis 2007, 3.díl: léčivé a pomocné látky, léčivé přípravky. Grada publisher.
Prague 2007.
10. de Oliveira A. C., dos Santos S. X., Cavalheiro E. T. G.: Talanta 74, 1043 (2008).
11. Newbery J. E., Dehaddad M. P. L., Charlwood K. A.: Anal. Chim. Acta 147, 387 (1983).
12. Michelitsch A., Rittmannsberger A., Hufner A., Ruckert U., Likussar, W.: Phytochem.
Anal. 15, 320 (2004).
13. Hudaib M., Speroni E., Di Pietra A., Cavrini, V.: J. Pharm. Biomed. Anal. 29, 691
(2002).
14. Newbery J. E., Dehaddad M. P. L.: J. Chromatogr. 260, 173 (1983).
113
Electrochemical Generation of Drug Metabolites
(Elektrochemické generování metabolitů léčiv)
Tomáš Mikysek, Robert Jirásko, Michal Holčapek and Karel Vytřas
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical
Chemistry, Studentská 573, 53210 Pardubice,Czech Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
Within this study, an electrochemical characterization of atorvastatin by cyclic voltammetry,
coulometry and preparative electrolysis accompanied by UHPLC/MS/MS analysis has been
presented. Atorvastatin undergoes the oxidation showing one irreversible process at about
+1.0 V involving two electrons. The influence of pH showed drop of current at pH>6 which is
connected to atorvastatin-lactone formation driving the electrochemical reaction. The
products of preparative electrolysis were compared to those obtained by biotransformation.
Key-words: Electrode, Metabolites, Preparative electrolysis, Cyclic voltammetry.
Úvod
Léčivo atorvastatin (obr. 1) patří do skupiny statinů a slouží jako inhibitor 3-hydroxy-3methylglutaryl reduktázy při léčbě hyperlipidémie 1. Jedná se stále o nejprodávanější léčivo
svého druhu. Již dříve mu byla věnována celá řada studií zabývajících se nejen jeho
stanovením v biologických vzorcích 2,3, ale i charakterizací jeho metabolismu 4-6 včetně
popsání oxidativních produktů degradace 7,8. Ke studiu metabolismu léčiv se využívá
převážně in vitro a in vivo experimentů založených na enzymaticky katalyzovaných reakcích,
které poskytují informaci o přítomných metabolitech v daném organismu 9,10. Simulaci
metabolismu lze rovněž provést elektrochemicky buď v on-line nebo off-line uspořádání 11,12.
Navíc preparativní elektrolýza může být využita pro elektrosyntézu drahých a nebo těžce
dostupných standardů metabolitů léčiv.
Obr. 1. Struktura léčiva atorvastatin.
V tomto příspěvku je prezentována základní elektrochemická charakterizace léčiva
atorvastatin pomocí cyklické voltametrie a coulometrie. Výsledky nabízejí nejen srovnání
navrhovaného mechanismu oxidace atorvastatinu s dříve publikovanými pracemi, ale i
srovnání s metabolity získanými biotransformací.
Experimentální část
Chemikálie. Atorvastatin – trihydrát vápenaté soli 3R,5R-7-[2-(4-fluorophenyl)-3-phenyl-4phenylcarbamoyl-5-propan-2-ylpyrrol-1-yl]-3,5-dihydroxyheptanové kyseliny (European
Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare Council of Europe, Strasbourg,
Francie). Pro přípravu základních elektrolytů v podobě 0,1 mol/l roztoků HCl, H2SO4, NaCl a
k přípravě série Britton-Robinsonových pufrů bylo použito běžných laboratorních chemikálií.
114
Všechny potřebné roztoky byly připraveny z deionizované vody pomocí systému Milli-Q od
firmy Millipore.
Instrumentace. Všechna elektrochemická měření byla prováděna na přístroji AUTOLAB
(model "PGSTAT-128"; Metrohm - Autolab B.V., Utrecht, Nizozemí), ke kterému byla
připojena měřicí cela s tří-elektrodovým systémem obsahujícím pracovní elektrodu ze
skelného uhlíku/pyrolitického grafitu referentní elektrodu Ag | AgCl | 3 M KCl a pomocnou
elektrodu (Pt). Pro účely preparativní elektrolýzy byly výše uvedené elektrody umístěny do
cely tvaru H, která nabízí oddělení anodického a katodického prostoru.
Postupy
Cyclická Voltametrie (CV). Tyto experimenty byly prováděny v roztoku výše uvedených
elektrolytů obsahujících 0,1 mg/ml atorvastatinu, připraveného z jeho metanolického
zásobního roztoku o koncentraci 1mg/ml. U většiny experimentů počáteční potenciál byl
0,0 V vs. Ag/AgCl a změna potenciálu probíhala v anodickém směru a následně pak
v katodickém při rychlosti polarizačního napětí 50 mV/s; vše při trojím opakování. Před
každým měřením byl roztok důkladně probublán argonem.
Preparativní elektrolýza a coulometrie. Na potenciostattu byl nastaven potenciál 1,2 V a
doba elektrolýz se pohybovala mezi 1-2 hodinami, následně ze závislosti proudu na čase byl
integrací získán počet spotřebovaných elektronů.
Výsledky a diskuse
V této práci bylo studováno elektrochemické chování atorvastatinu v různých elektrolytech
s cílem popsat mechanismus a následně i produkty elektrochemických a chemických reakcí.
K tomuto účelu byly nejprve vybrány roztoky 0.1 mol/l H2SO4, 0.1 mol/l HCl or 0.1 mol/l
NaCl, které byly testovány jako základní elektrolyty. Ve všech třech byl pozorována jedna
ireverzibilní oxidace při potenciálu +1.0 V vs. Ag/AgCl, která přísluší oxidaci atorvastatinu a
jeho laktonu (obr.2). Z opakovaných cyklů, při rychlosti změny polarizačního napětí 50 mV/s,
docházelo k poklesu proudu píku atorvastatinu vlivem pomalého transportu látky k elektrodě,
což se potvrdilo při nižší rychlosti skenu.
Další část byla zaměřena na studium vlivu pH. Pomocí série Britton-Robinsonových pufrů
bylo zjištěno, že se vzrůstajícím pH dochází k posunu potenciálu píku atorvastatinu k nižším
hodnotám. Co se týče proudu, i zde byla pozorována závislost na pH, přibližně u pH5
docházelo k poklesu proudu se vzrůstajícím pH a u pH 9 byl proud na úrovni pozadí. Toto
chování lze vysvětlit tím, že při nižším pH dochází k tvorbě laktonu atorvastatinu, který
podléhá elektrochemické oxidaci, jehož přítomnost byla zjištěna pomocí UHPLC/MS/MS.
Naopak při vyšším pH dochází k hydrolýze zmíněného laktonu, což bylo již dříve popsáno
v literatuře 13.
Coulometrické experimenty ukázaly, že studované léčivo je oxidováno dvěma elektrony.
K určení produktů oxidace byla poté použita preparativní elektrolýza v kyselém a neutrálním
prostředí s následnou UHPLC/MS/MS analýzou, kde se ukázala složitost oxidace
atorvastatinu v podobě již dříve zmíněné tvorby atorvastatin-laktonu, ale bylo evidováno
celkem asi 20 různých produktů. K oxidaci dochází nejen na isopropylu ale také na
konjugovaném skeletu molekuly atorvastatinu. Při porovnání produktů preparativní
elektrolýzy s experimenty biologické transformace dojdeme k závěru, že se liší nejen v počtu
(u biologické transformace cca 10 produktů) ale i ve struktuře, např. hydroxylaci
fenylkarbamoylové skupiny, beta-oxidaci aj. Výčtu jednotlivých produktů elektrolýz jako
i biotransformace se přehledně věnuje publikace 14. Bohužel, vzhledem k jejich počtu
115
a množství nebylo možné provést jejich izolaci a identifikaci pomocí NMR jako v případě
jiné studie 15.
Obr. 1. Cyklická voltametrie atorvastatinu v Britton – Robinsonově pufru pH 1,71,
koncentrace atorvastatinu 0,05 mg/ml, rychlost skenu 50 mV/s.
Závěr
Tato práce se zabývá elektrochemickou charakterizací atorvastatinu pomocí cyklické
voltametrie, coulometrie a preparativní elektrolýzy. Atorvastatin je oxidován dvěma
elektrony, a poskytuje ireverzibilní elektrodovou reakci při potenciálu cca 1 V. Zásadní roli
v jeho elektrochemickém chování hraje vliv pH ze kterého vyplývá i tvorba atorvastatin –
laktonu zajišťujícího elektrochemickou aktivitu tohoto systému. Pomocí analýzy
UHPLC/MS/MS se podařilo určit produkty elektrolýz, kde bylo zjištěno asi 20 různých
produktů. Oxidace se odehrává jak na isopropylovém substituentu atorvastatinu tak na
kojugovaném skeletu. Naproti tomu biotransformace atorvastatinu v krysích hepatocytech
poskytovala 10 metabolitů např. hydroxylaci fenylkarbamoylové skupiny nebo beta-oxidaci
na alkylovém řetězci. Tato metoda by mohla být v budoucnu uplatněna i u jiných léčiv nejen
k objasnění reakčního mechanismu, ale i při generování standardů metabolitů.
Poděkování
Tato práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České
Republiky projektu CZ.1.07/2.3.00/30.0021 "Posílení excelentních týmů výzkumu a vývoje
na Univerzitě Pardubice" a Grantové agentury ČR projekt č.: P206/12/P065.
Literatura
1. Curran M.P.: Drugs 70,191 (2010).
2. Bahrami G., Mohammadi B., Mirzaeei S., Kiani A.: J. Chromatogr. B 826, 41 (2005).
3. Nováková L., Satinský D., Solich P.: Anal. Chem. 27, 352 (2008).
4. Vlčková H., Solichová D., Bláha M., Solich P., Nováková L.: J. Pharmaceut. Biomed. 55,
301 (2011).
116
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Bořek-Dohalský V., Huclová J., Barrett B., Němec B., Ulc I., Jelínek I.:Anal. Bioanal.
Chem. 386, 275 (2006).
Hermann M., Christensen H., Reubsaet J.L.E.: Anal. Bioanal. Chem. 382, 1242 (2005).
Shah R.P., Kumar V., Singh S.: Rapid Commun. Mass Sp. 22, 613 (2008).
Kracun M., Kocijan A., Bastarda A., Grahek R., Plavec J., Kocjan D.: J. Pharmaceut.
Biomed. 50, 729 (2009).
Jirásko R., Holčapek M., Nobilis M.: Rapid Commun. Mass Sp. 25, 2153 (2011).
Jirásko R., Holčapek M., Vrublová E., Ulrichová J., Šimánek V. J. Chromatogr. A 1217,
4100 (2010).
Faber H., Jahn S., Kunnemeyer J., Simon H., Melles D., Vogel M., Karst U.: Angew.
Chem. Int. Edit. 50, A52 (2011).
Baumann A., Lohmann W., Schubert B., Oberacher H., Karst U.: J. Chromatogr. A 1216,
3192 (2009).
Jemal M., Zheng O., Chen B.C., Teitz D.: Rapid Commun. Mass Sp. 13, 1003 (1999).
Jirásko R., Mikysek T., Chagovets V., Vokřál I., Holčapek M.: Anal. Bioanal. Chem.
(submitted february 2013).
Mikysek T., Švancara I., Bartoš M., Vytřas K., Drabina P., Sedlák M., Klíma J., Urban J.,
Ludvík J.: Electroanalysis 19, 2529 (2007).
117
Pencil Graphite Electrodes as a Tool for Analysis of Xanthine and 8-Methylxanthine
(Grafitová elektroda jako nástroj pro analýzu xanthinu a 8-methylxanthinu)
Rudolf Navrátil a, František Jelen b, and Libuše Trnková a,c
a
Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5,
625 00 Brno, Czech Republic
b
Institute of Biophysics, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic, Kralovopolska
135, CZ-612 65 Brno, Czech Republic
c
Central European Institute of Technology – CEITEC, Brno, University of Technology,
Technicka 3058/10, 616 00 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Electrochemical behavior of xanthine (Xan) and 8-methylxanthine (8-mXan) on a pencil
graphite electrode (PeGE) in the presence of copper ions is reported. For this purpose we used
linear sweep voltammetry (LSV) in combination with adsorptive stripping (AdS) technique
and the elimination (EVLS) procedure. The sensitive detection of purine oxidation signals
was performed depending on scan rate, pH, concentration of Cu(II), and modification of
PeGE surface. To achieve the best electroanalytical determination of Xan and 8-mXan the
optimal experimental conditions were chosen, and to understand the electrode processes of
both xanthines on Cu(I)-modified PeGE spectral and microscopic methods were used.
Key words: Xanthine (Xan), 8-methylxanthine (8-mXan), Pencil graphite electrode (PeGE),
linear sweep voltammetry (LSV), Elimination voltammetry with linear scan (EVLS), SEM,
EDX.
Úvod
Xanthin a jeho methyl deriváty jsou důležité látky, které mohou být nalezeny v krvi, moči a
dalších fyziologických tekutinách jako produkty katabolismu purinů 1. Moderní techniky
používané pro stanovení methyl-xanthinů zahrnují spektrofotometrické, chromatografické a
elektroanalytické metody 2. Elektrochemická oxidace xanthinů byla studována mnoha autory
a předpokládá se, že výměna elektronů na povrchu elektrody probíhá na uhlíku C8 a dusíku
N7 3-5. Byl též popsán detailní oxidační mechanismus a vliv methyl skupin na oxidační proces
xanthinu 6-9.
Některé další publikace jsou věnovány analýze těchto látek v přítomnosti mědi 10-11.
Přídavkem iontů mědi Cu(II) do roztoku s purinem dochází při vhodném potenciálu
k akumulaci mědi na elektrodě podložené redukcí na Cu(I). Díky Cu(I) je získávána další
voltametrická odezva v oblasti 0,4 V, která odpovídá oxidaci málo rozpustného komplexu
Cu(I)-purin a zároveň je zaznamenáno zvýšení intenzity původního oxidačního signálu
odpovídajícího purinu 12-13. S využitím adsorpční stripping techniky za přítomnosti Cu(II)
iontů pomocí a cyklické voltametrie (CV) na grafitových elektrodách (PeGE) byla provedena
detekce xanthinů. Ke zvýšení citlivosti byla využita eliminační voltametrie (EVLS),
konkrétně eliminační funkce E4 zachovávající difúzní proudovou složku a eliminující
kinetický a kapacitní proudovou složku. Tyto metody se ukázaly jako vhodné pro zlepšení
zkoumání rozdílů mezi puriny, vzniku komplexu na elektrodě a objasnění reakčního
mechanismus na PeGE 13-17.
Cílem práce byl vývoj biosenzoru pro kvalitativní a kvantitavní analýzu z hlediska analytické
chemie a především pro citlivou a selektivní detekci methyl-xanthinů využitelnou v medicíně
a farmaceutickém průmyslu ke stanovení těchto látek. Za tímto účelem byla provedena
analýza redoxního chování xanthinu a 8-methyl-xanthinu probíhající na povrchu PeGE
elektrody v přítomnosti iontů Cu (II).
118
Experimentální část
Všechna měření byla provedena na analyzátoru AUTOLAB (Elektrochemický Analyzér
společnosti EcoChemie, Metrohm, Švýcarsko) doplněný VA-Standem 663 (Metrohm, ZurichSchwitzerland) s tří-elektrodovým uspořádáním (pracovní elektroda - PeGE - 0,5 HB
Tombow, Japonsko, argento-chloridová referenční elektroda (Ag/AgCl/3M KCl a platinový
drát - pomocná elektroda), ovládaným programem GPES 4.9. Zaznamenané a vyhlazené
křivky (Savitzky-Golay filtr - úroveň 2) byly vyexportovány a zpracovány programem MS
Excel.
K aktivaci elektrody (pretreatment) bylo využito metody diferenční pulzní voltametrie (DPV)
s nastavením: aktivační potenciál: 1,4 V, doba trvání: 30 s, depoziční potenciál: 0 V, doba
trvání: 0 s, vyrovnávací čas: 2 s, modulační čas: 0,05 s, doba intervalu: 0,5 s, iniciační
potenciál: 0 V, konečný potenciál: 0 V, step potenciál: 0,00495 V, modulační amplituda:
0,04995. Následné stanovení bylo provedeno lineární sweep voltametrii (LSV) s nastavením:
Akumulační potenciál: 0 V, doba trvání: 120 s, vyrovnávací čas: 5 s, počet skenů: 2, počáteční
potenciál: -0,1 V, potenciál prvního vrcholu: 1,4 V, potenciál druhého vrcholu: -0,1 V, step
potenciál: 0,002 V, rychlost scanu: 25 mV/s, 50mV/s, 100mV/s, 200mV/s, 400 mV/s,
800 mV/s.
Výsledky a diskuse
Naše laboratoř se dlouhodobě zaměřuje na voltametrickou analýzu purinových derivátů na
pentelkové grafitové elektrodě (PeGE) v přítomnosti mědi. Pro výběr optimální pracovní
elektrody z hlediska citlivé analýzy byla využita celá řada různých grafitových tuh a s
nejlepším výsledkem (nejvyšší oxidační píky) obstála pentelková tuha Tombow japonské
výroby. Na této elektrodě byla provedena voltametrická měření xanthinu (Xan) a 8methylxanthinu (8-mXan) v přítomnosti mědi, a to za účelem získat informace: (a) o
oxidačním chování těchto dvou sloučenin, kdy u jedné je methyl navázán ne na dusíku, ale na
uhlíku imidazolového kruhu a (b) o interakci obou látek s povrchem elektrody, který může být
modifikován jednomocnou mědí. Bylo zjištěno, že povrch elektrody Tombow je potažen
polymerem, který může být pro modifikaci elektrody pomocí mědi velmi důležitý. Zatím je
známo, že se na povrchu elektrody vložením vhodného potenciálu Cu(II) redukuje na Cu (I) a
tato jednomocná měď je schopna tvořit s příslušným purinovým derivátem (xanthinem) slabě
rozpustný komplex Cu(I)-purin. Tento komplex se při polarizaci elektrody do pozitivních
potenciálů (kolem 0,4 V vs. Ag/AgCl/3M KCl) rozpouští a jednomocná měď se v něm
oxiduje na měď dvojmocnou. Zároveň dochází ke zvýšení odpovídajícího oxidačního píku
purinu (v našem případu Xan nebo 8-mXan) - Obrázek 1.
Vliv změny methyl substituentu na Xan v poloze C8 je uveden na Obrázku 1., na kterém jsou
zobrazeny jednotlivé LSV křivky v závislosti na rychlosti polarizace elektrody v 0,1 M
acetátovém pufru (pH 5,1) o koncentracích xanthinů 20 µM a stejně tak velkých
koncentracích iontů Cu(II) v roztoku.
119
Obr.1. LSV křivky Xan a 8-mXan bez přítomnosti iontů mědi Cu(II) (A, B) a v přítomnosti
iontů mědi Cu(II) (C, D) pro různé rychlosti polarizace (spodní červená čára - 200 mV/s,
střední modrá čára – 400 mV/s, horní černá čára – 800 mV/s) v acetátovém pufru (pH 5.1);
cmXan=20 µM, cCu=20 µM.
Obrázek 1. ukazuje závislost intenzity píku na rychlosti polarizace pro mXan, kde v souladu s
teorií ireverzibilní oxidace s rostoucí rychlostí polarizace dochází ke zvýšení intenzit píků a k
jejich posun k pozitivnějším potenciálům. Lze také pozorovat, že navázání methylu na C8
způsobuje u xanthinu mírný posun v poloze píku, ale hlavně, velkou změnu v intenzitě
signálu, a to jak v případě oxidačního signálu komplexu, tak i v případě oxidačního signálu
odpovídajícího derivátu.
V případě 8-mXan se jedná o posun píku směrem do méně pozitivních potenciálů (785 mV),
což naznačuje snazší oxidaci, ovšem vzhledem k intenzitě píku dochází k tvorbě komplexu
s mědí mnohem méně ochotně než je tomu v případě xanthinu (820 mV), kdy jsou intenzity
píků Xanthinu asi 6x vyšší než je tomu v případě 8-methyl xanthinu a přibližně 3x vyšší
v roztoku obsahujícím ionty mědi Cu(II).
Navíc, na rozdíl od 8-mXan, xanthin poskytuje v přítomnosti mědi druhý oxidační pík
v oblasti 960 mV. Tento jev jsme popsali v naší předchozí práci. Pík je velmi silně závislý na
čase a byl detekován jen při velmi detekčních metodách s rychlou změnou potenciálu (vysoká
rychlost polarizace u LSV nebo CPSA). Domníváme se, že se jedná o přeměnu oxidačních
intermediátů xanthinu 13.
EVLS analýza
Eliminační voltametrie s lineární polarizací (EVLS) je netradiční elektrochemická metoda,
která je schopna eliminovat nebo zachovat vybrané dílčí proudy (např. difúzní, nabíjecí nebo
kinetické proudy) z celkového voltametrického proudu, čímž se zvýší citlivost a zlepší
rozlišení naměřených voltametrických signálů 17. EVLS procedura vyžaduje tři voltametrické
120
křivky měřené při různých rychlostech polarizace. Jedna rychlost polarizace je vybrána jako
referenční (Iref, 400 mV/s) a zbylé dvě jsou polovinou respektive dvojnásobkem referenční
rychlosti (I1/2ref a I2ref, 200 a 800 mV/s). Tyto tři proudy byly použity pro výpočet EVLS
funkce E4 s odstraněním nabíjecí a kinetické proudové složky a zachováním difúzního
proudu. Z analytického hlediska tato EVLS funkce výrazně zvyšuje LSV signály, separuje
překrývající se signály a rychle potvrzuje adsorpční stav elektroaktivní látky (peakcounterpeak signály) 17-19. Výsledky aplikace EVLS funkce E4 na voltametrické signály Xan
a 8-mXan jsou zobrazeny na obrázku 2. Byla použita rovnice:
f ( I )  11.657 I1 2  17.485 I  5.8284 I 2
I d  0; I k  0; I c  0
Obr.2. EVLS křivky Xan (A) a 8-mXan (B) bez přítomnosti iontů mědi Cu(II) (modrá plná
čára – E4 funkce, modrá přerušovaná čára – referenční scan rate 400 mV/s) a v přítomnosti
iontů mědi Cu(II) (C, D) (černá plná čára – E4 funkce, černá přerušovaná čára – referenční
scan rate 400 mV/s) v acetátovém pufru (pH 5.1); cmXan=20 µM, cCu=20 µM.
EVLS křivky potvrzují adsorbovaný stav obou purinových derivátů (pík-protipík) a podstatně
zvyšují proudovou odezvu. V případě oxidace Xan eliminace přispívá k separaci signálů.
Závěr
Tato práce studuje redoxní chování xanthinu a jeho 8-methyl derivátu na pencil grafitové
elektrodě v přítomnosti Cu(II) iontů s využitím adsorpčních technik v kombinaci s eliminační
voltametrií jako citlivou metodou pro sledování elektrodových procesů na povrchu elektrody.
Cílem práce bylo optimalizovat experimentální podmínky pro jejich stanovení a
charakterizovat vliv substituentu na C8 imidazolového kruhu na jeho oxidaci a tvorbu Cu(I)purin komplexu. Z důvodu velmi blízkých oxidačních signalů obou látek (Xan 840mV a 8mXan 790mV) bylo z hlediska jejich možné separace využito možností dalších změn
v experimentálních podmínkách (pH a poměr koncentrací Cu:ligand). Tyto výsledky mohou
být využity při vývoji senzoru (Cu-modifikované PeGE), který by mohl nalézt uplatnění
v medicíně, ve farmacii a v potravinářské chemii.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektů OPVK (NanoBioMetalNet) CZ.1.07/2.4.00/31.0023,
MUNI/A/0992/2009 a LH 13053 KONTAKT II od MŠMT ČR.
Literatura
1. Ashihara H., Sano H., Crozier A.: Phytochem. 69, 841 (2008).
2. Talik P., Krzek J., Ekiert R. J.: Sep. and Purific. Rev. 41, 1 (2012).
3. Yao T., Wasa T., Musha S.: Bull. Chem. Soc. Japan 50, 2917 (1977).
121
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Yao T., Musha S.: Bull. Chem. Soc. Japan 52, 2307 (1979).
Palanti S., Marrazza G., Mascini M.: Anal. Lett. 29, 2309 (1996).
Goyal R. N., Rastogi A.: Croatica Chemica Acta 73, 495 (2000).
Goyal R. N., Singhal N. K.: Bull. Chem. Soc. Japan 71, 199 (1998).
Goyal R. N., Srivastava A. K.: Indian J. Chem. 33, 212 (1994).
Goyal R. N., Thankachan P. P., Kumar N., Sangal A.: Indian J. Chem. 39, 953 (2000).
Shiraishi H., Takahashi R.: Bioelectrochem. Bioenerg. 31, 203 (1993).
Shengshui H., Dafu C., Mascini M.: Wuhan Univ. J. Natur. Sci. 4, 99 (1999).
Aladag N., Trnkova L., Kourilova A., Ozsoz M., Jelen F.: Electroanalysis 22, 1675
(2010).
Navratil R., Pilarova I., Jelen F., Trnkova L.: Int. J. Electrochem. Sci. 8, 4397 (2013).
Trnkova L. in: Adam V. and Kizek R. (Eds.): Utilizing of Bio-electrochemical and
Mathematical Methods in Biological Research. Research Signpost, Kerala, India 2007.
Jelen F., Hason S., Trnkova L. in: Adam V. and Kizek R. (Eds.): Utilizing of Bioelectrochemical and Mathematical Methods in Biological Research. Research Signpost,
Kerala, India 2007.
Trnkova, L., Jelen, F., and Ozsoz, M. in: Ozsoz M. (Ed.): Electrochemical DNA
Biosensors, Pan Stanford Publishing, Singapore 2012.
Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996).
Trnkova L., Kizek R., Dracka O.: Electroanalysis 12, 905 (2000).
Trnkova L.: J. Electroanal. Chem. 582, 258 (2005).
122
Short Information on Methanol Outbreak in the Czech Republic in the year 2012
Tomáš Navrátil a, Sergey Zakharov b, Daniela Pelclová b, and Karolina Mrazová b
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23
Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Charles University in Prague, First Faculty of Medicine, Department of Occupational
Medicine, Czech Toxicological Information Centre and General University Hospital in
Prague, Na Bojišti 1, 128 00 Prague 2, Czech Republic
Abstract
This contribution reports briefly on the large methanol outbreak in the Czech Republic (CR)
in autumn 2012. The first case was registered in September 2012 in Havířov. The source was
unknown at that time, but it was connected with the illegal production and sale of adulterated
spirits. More than 130 cases of methanol intoxication have been reported during September
2012 – April 2013. 44 people died, about 1/5 of intoxicated patients have suffered by sequels
of intoxication and their number have been increasing. Moreover, the samples of methanol
can be found in some illegal stores and in some households up to now.
Key words: Methanol, Formate, Outbreak, Intoxication, 2012, Czech Republic.
Introduction
Methanol belongs to very dangerous substances. Methanol poisonings are characterized by
high morbidity and mortality, even when small doses are ingested (minimum lethal dose is
estimated about 1 g/kg-1) 1. This organic substance is not produced in the Czech Republic
(CR) at present (its annual world production amounts to 54 million tons in 245 factories, 54%
of them in China). Its utilization had been strongly limited in CR by national standards till
2010. In 2010, EU legislative 2 approved that the windscreen washer system shall be filled
and fully primed with a low-temperature windscreen washer fluid consisting of a 50 %
solution of methanol, or alternatively isopropyl alcohol, in water with hardness not exceeding
205 mg/l (Ca). Until then, ethanol had been used for these purposes.
Methanol outbreaks occur rather frequently worldwide with large numbers of victims, e.g.,
(Cambodia 1998 – affected >400, dead 60; Estonia 2001 – affected 154, dead 68; India 2009
– affected >600, dead 50; Haiti 2011 – affected 40, dead 20; Norway 2002-2004 – affected
>50, dead 18; Libya 2013 – affected >138, dead 51). The last mass methanol poisoning
occurred in CR in 1945. During the last 60 years, methanol intoxications were episodic in our
country. Yearly the Czech Toxicological Information Centre (TIC) received only about 3-4
inquiries regarding methanol ingestions. These cases were mostly related to occasional
ingestions of methanol in laboratories where it was used, e.g., in spectrometry3, 4,
chromatography 5, voltammetry 4, 6-12. It is necessary to note that home distilled spirits were
not considered as significant toxicological problem (TIC consulted it on average once a year).
The first phone inquiry about the case of acute methanol poisoning to the TIC was recorded
by the toxicologist on duty on September 6th, 2012, and it was the case from the hospital in
Havířov. It was the second similar poisoning in the same city within a week. Media began to
air warnings about the toxic spirits that caused the first fatal poisoning from September 7th.
The number of intoxicated persons increased very fast. Because it could be supposed that a
relatively high amount of contaminated alcohol was distributed among consumers, Czech
hygienic stations and some universities repeatedly tested the alcoholic beverages brought by
people. Partial prohibition (sale of beverages with declared alcohol concentration above 20%)
was declared on September 27th, 2012 in CR. Similarly, some neighboring countries limited
import of alcoholic beverages from CR.
123
Methanol, ethanol as well as ethylene glycol are oxidized in human body under catalysis of
alcohol dehydrogenases (EC 1.1.1.1) in liver. They are members of dehydrogenase enzymes,
and facilitate the interconversion between alcohols and aldehydes or ketones with the
reduction of NAD+ to NADH (Fig. 1). The final oxidation product is an acid which can be
further oxidized to CO2 and H2O. While acetic acid in usual doses does not represent a serious
problem, formic acid, originating by methanol oxidation, is considered as very toxic. This
toxicity results from a combination of the metabolic acidosis (H+-production) and an intrinsic
toxicity of the anion formate. Metabolism and hence elimination of formate is folate
dependent 13. Three principal ways can solve ingestion of toxic methanol or ethylene glycol:
1) removing from stomach (e.g., vomiting) – this solution is realizable in very short time after
ingestion; 2) enhanced elimination of the toxic compounds from blood (by hemodialysis (HD)
or oxidation) and 3) inhibition of alcohol dehydrogenase by an antidote. The second and third
steps are used in their combinations in the most serious cases.
Methanol
Ethanol
4-methy lpy raz ol
Ethanol
-
NAD +
Alco h o l d eh yd ro g en ase
NADH+H +
EC 1.1.1.1
F ormaldehyde
For m ate
dehydr ogenase
1.2.1.2
NAD+
Aldehyde
dehydr ogenase
1.2.1.3
NADH+H +
Formate
Leucovorin
+
Acetaldehyde
NAD+
NADH+H+
Acetate
10-formyl
tetrahydrofolate
synthetase
CO2 + H2 O
Fig. 1. Metabolic pathways of methanol and ethanol in human body
Experimental part
Determined species and parameters
There are many laboratory parameters and clinical features which can confirm the diagnosis
and characterize the severity of acute methanol intoxication: levels of serum methanol, serum
ethanol, serum formate, serum creatinine, serum glucose, urine methanol, urine ethanol, pH,
pCO2, HCO3-, base deficit, level of lactic acid, anion gap, osmolality, and osmolal gap, applied
treatment (first aid), history of chronic alcohol abuse (alcoholism), time interval from
ingestion, etc. Venous blood for methanol and formate analysis is commonly sampled on
admission, at the start of HD, each 2-4 hours during and at the end of HD. Blood samples
must be spun, serum separated and frozen until analyses.
Analytical Methods
Due to the rare incidence of methanol intoxication the situation was a bit complicated in CR.
The laboratories in some small hospitals were not able to analyze the serum methanol and
formate; some hospitals did not have in stock a sterile solution of ethyl alcohol for
intravenous application. Methanol (and similarly ethanol) in the serum can be measured by
headspace gas chromatographic method with flame ionization detection and a headspace
injector 14. However, formate must be derivatized in hot sulfuric acid by ethanol to ethyl
formate. Therefore, for formate determination a new, but already published, method 15, 16,
based on enzymatic decomposition of formate in presence of formate dehydrogenase and
NAD+, was introduced. Formate is decomposed to CO2 and the simultaneously formed
NADH+ can be spectrophotometrically detected at 340 nm. New electrochemical method for
124
serum formate determination was developed in Brno in 2013
electrophoresis and should be fast, simple and reliable.
17
. This method is based on
The specialists have had to correct some disinformation and myths which were wide-spread
among people, e.g., that it is possible to differentiate methanol from ethanol according to their
taste or flame color. Similarly, the initial symptoms of intoxication are often similar to those
caused by ethanol (mainly when the beverage contains both alcohols). Therefore, some
laboratories tried to develop cheap, routine, but above all fast method for methanol
determination in hard drink samples, if it would be possible, directly in closed bottles. One of
them is based, e.g. 18, on application of infrared spectroscopy. However, the situation is
complicated in case of some colored drinks and some colored bottles.
Results and Discussion
Two antidotes have been used in case of methanol or ethylene glycol intoxication: traditional
ethanol and fomepizole (active compound 4-methylpyrazol). Ethanol does not block the liver
enzyme activity directly, its activity is based on competitive inhibition (ethanol is processed
contemporarily with methanol). Fomepizole application was not approved for the use in CR.
Nevertheless, its application was legal within many countries in the European Union, and
therefore it was not necessary to start the complete approving process from the beginning. The
first packages were donated by the Oslo PCC and delivered by Dr. E. Hovda, Ph.D., to the CR
on September 13th, 2012. Ethanol is available, cheap, and easily applicable by laymen.
Nevertheless, it is often difficult to maintain its serum concentration on the therapeutic level
19
, it is frequently underdosed, especially during HD 20, its level should be monitored 19, it
causes the CNS depression, and the patients get drunk during its application 21. It is applied in
the form of 10% solution in 5% glucose solution intravenously. It can be applied as first aid
by laymen: in the form of high quality alcohol per os (1-2 dL of 40% or more, it is possible to
dilute it by water or juice). The level of ethanol should be maintained on about 1-1.5 ‰ (e.g.,
15-30 ml of 40% alcohol per hour for a person weighing 70 kg). Indication of ethanol therapy
is the methanol level above 200 mg/l, or osmolar gap above 15 mmol/l, or the history of
ingestion of significant amount of methanol, or metabolic acidosis 14. Availability of
fomepizole is relatively limited, because it is rather expensive. On the other hand, fomepizole
is considered to be more effecient (it has 80 000x stronger affinity to alcohol dehydrogenase
than methanol, a plasma concentration of 10 μmol/L seems to inhibit the production of formic
acid) 22, easily administered, more “predictable”, also during HD 22. It is not necessary to
monitor its level, it does not cause the CNS depression, the patients remain sober, in some
cases the HD is not necessary 22, and its application can reduce the “burden” on intensive care
units 23. It is primarily transformed and eliminated in the liver, and partly eliminated by HD.
Altogether, 192 fomepizole packages were imported in CR (112 fomepizole packages were
donated to CR from Norway (some of them brought Dr. Hovda already by his first visit in
September 2012) and 80 were purchased) 24. They were partly distributed into hospitals with
intoxicated patients (42 Olomouc, 53 Ostrava, 30 Zlín, etc.) and certain reserve has been
available in TIC in Prague as central deposit of antidotes 24. The total expenditures on the
treatment of intoxicated persons have amounted to about 50 million CZK (about 2 million €)
(including 806 820 CZK for fomepizole and 7.5 million CZK for drink samples testing) till
the March 2013. One fomepizole package costs about 10 000 CZK and the treatment of one
poisoned patient with antidote only can costs from 20 000 to 160 000 CZK.
TIC has been focusing on evaluation of health consequences of acute methanol poisonings
during the present mass methanol outbreak in CR. Information about the diagnostics and
treatment in 101 intoxicated patients was collected and analyzed thoroughly. The protocols
for the collection of information on diagnosis and treatment established during the Norwegian
125
methanol outbreak 25 were used, and the hospital discharge reports of all these patients with
the detailed information on clinical features, laboratory data, treatment and outcomes were
collected and analyzed. Later the actual health condition of the patients within 4-6 months
after dismission was examined and compared with the information from the hospital
discharge reports. The results were analyzed, medically and statistically evaluated 26. The
hospitalized patients were retrospectively separated into three groups according to the
outcomes: group I, the patients who survived without sequel; group II, the patients who
survived with sequel(s); group III, the patients who died. In group I 40 % of patients were
asymptomatic on admission, at least 16 of them with measurable ethanol in blood; 11
appeared inebriated. Among symptomatic patients, the clinical symptoms were:
gastrointestinal (43%); visual disturbances (27%), dyspnoea (20%), coma (8.3%) and chest
pain (3%). Other symptoms involved fatigue, headache, dizziness, hangover, somnolence,
anxiety, tremor, seizures. In group II only one patient (5%) was asymptomatic on admission,
the most frequent symptoms were visual disturbances (70%), gastrointestinal (60%); dyspnoe
(45%), coma (45%) and chest pain (15%). Other symptoms involved fatigue, headache,
dizziness, somnolence, seizures, alcoholic delirium, respiratory and cardiac arrest. In group III
all the patients were symptomatic on admission and no one had measurable ethanol in blood.
The most frequent symptom in this group was coma (81%), visual disturbances (57%), and
dyspnea (52%), gastrointestinal symptoms (48%); chest pain (33%), cardiac (29%) and
respiratory arrest (19%). The patients in all groups were treated by alkalization, by antidotes
ethanol, fomepizole, or their combination, by folates (folic acid, folinic acid). HD was
performed in 65% subjects in group I (continuous veno-venous HD/hemodiafiltration
CVVHD/HDF in 30% of subjects; conventional intermittent HD (IHD) in 35%), in group II in
90% of subjects (CVVHD/HDF in 65% of subjects, IHD in 25% subjects), and in group III in
86 % (CVVHD/HDF in 62% subjects; IHD in 24% subjects. Time of start and duration of HD
differed. Generally, the attention has been paid to some special aspects of treatment and
sequels, e.g., differences in formate and methanol kinetics in the treatment: CVVHD/HDF vs.
IHD 27, epidemiology, clinical features and outcomes 26.
Conclusion
44 people (25 of them in North Moravian region) died due to methanol poisonings between
September 2012 and April 2013 in the CR (41 in 2012). The last victim was a woman died on
April 6th, 2013. More than 130 people (121 in 2012) were intoxicated and in about 20 % of
them the visual and CNS sequels were diagnosed according to the discharge reports and the
percentage of the cases with sequels can increase in course of time. The patients were treated
in 30 medical hospitals in 11 regions of the Czech Republic. Fortunately, none person abroad
died on the acute poisoning with the “Czech methanol” (some Slovaks were intoxicated, but
due to the adequate “layman prevention” they recovered without sequel. Huge amount of
alcoholic beverages has been analyzed since the start of mass methanol outbreak in CR 2012.
Due to this measure about 300 contaminated samples were identified at the end of 2012. It is
supposed that more than one half of all methanol containing liquids (15 000 L) was seized
from illegal stores. Nevertheless, substantial quantity of contaminated alcohol was distributed
among consumers, so certain amounts can be stored in household stocks of “private drinkers”,
other can be stored by the distributors or producers. So it cannot be excluded that methanol
poisonings will continue.
Acknowledgements
This work was financially supported by Grant Agency of the Czech Republic – GA CR
(Project P206/11/1638 and Project P208/12/1645).
126
References
1. Roe O.: CRC Crit. Rev. Toxicol. 10, 275 (1982).
2. European_Commission: No. 1008/2010 concerning type-approval requirements for
windscreen wiper and washer systems of certain motor vehicles and implementing
Regulation (EC) No 661/2009 of the European Parliament and of the Council concerning
type-approval requirements for the general safety of motor vehicles, their trailers and
systems, components and separate technical units intended therefor (2010).
3. Ramesova S., Sokolova R., Degano I., Bulickova J., Zabka J., Gal M.: Anal. Bioanal.
Chem. 402, 975 (2012).
4. Sokolova R., Degano I., Hromadova M., Bulickova J., Gal M., Valasek M.: Collect.
Czech. Chem. Commun. 75, 1097 (2010).
5. Bulickova J., Sokolova R., Giannarelli S., Muscatello B.: Electroanalysis 25, 303 (2013).
6. Bandzuchova L., Selesovska R., Navratil T., Chylkova J.: Electrochim. Acta 56, 2411
(2011).
7. Cabalkova D., Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Chem. Listy
103, 236 (2009).
8. Peckova K., Barek J., Navratil T., Yosypchuk B., Zima J.: Anal. Lett. 42, 2339 (2009).
9. Vyskocil V., Navratil T., Danhel A., Dedik J., Krejcova Z., Skvorova L., Tvrdikova J.,
Barek J.: Electroanalysis 23, 129 (2011).
10. Vyskocil V., Navratil T., Polaskova P., Barek J.: Electroanalysis 22, 2034 (2010).
11. Selesovska-Fadrna R., Navratil T., Vlcek M.: Chem. Anal.-Warsaw 52, 911 (2007).
12. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19,
2003 (2007).
13. Hovda K. E., Andersson K. S., Urdal P., Jacobsen D.: Clin. Toxicol. 43, 221 (2005).
14. TIC: Methanol. http://www.tis-cz.cz/index.php/informace-pro-odborniky/methylalkohol,
Downloaded: 4.4.2013.
15. Hovda K. E., Urdal P., Jacobsen D., v knize: Methanol poisoning: Clinical features,
diagnosis, treatment and prognosis.; (Hovda K. E., ed. Faculty of Medicine, University
of Oslo, Oslo, 2005.
16. Schaller K. H., Triebig G. T., v knize: Methods of enzymatic analysis; (Bergmeyer H. U.,
ed. Verlag Chemie, Weinheim, 1984.
17. http://www.novinky.cz/domaci/294663-vedci-objevili-novou-metodu-pro-rychloudiagnozu-otravy-metanolem.html, Downloaded: 6.4.2013.
18. http://www.spectro.cz/aktualne-mereni-methanolu-primo-na-miste/, Downloaded:
6.4.2013.
19. McCoy H. G., Cipolle R. J., Ehlers S. M., Sawchuk R. J., Zaske D. E.: Am. J. Med. 67,
804 (1979).
20. Paasma R., Hovda K. E., Tikkerberi A., Jacobsen D.: Clin. Toxicol. 45, 152 (2007).
21. Paasma R., Hovda K. E., Hassanian-Moghaddam H., Brahmi N., Afshari R., Sandvik L.,
Jacobsen D.: Clin. Toxicol. 50, 823 (2012).
22. Brent J., McMartin K., Phillips S., Aaron C., Kulig K., Methylpyrazole for Toxic
Alcohols Study G.: N. Engl. J. Med. 344, 424 (2001).
23. Hovda K. E., Jacobsen D.: Hum. Exp. Toxicol. 27, 539 (2008).
24. TIC; Toxicological Information Centre: Prague, 2013.
25. Hovda K. E., Hunderi O. H., Tafjord A. B., Dunlop O., Rudberg N., Jacobsen D.: J.
Intern. Med. 258, 181 (2005).
26. Zakharov S., Pelclova D., Navratil T., Hovda K. E., Hubacek J., Ruzicka E., Klempir J.,
Diblik P., Pilin A., Miovsky M., Popov P.: In preparation (2013).
27. Zakharov S., Pelclova D., Navratil T., Kurcova I., Hovda K. E., Bocek R., Salek T.,
Hubacek J., Fenclova Z., Petrik V.: In preparation (2013).
127
Characterization of Electrochemical Behavior of Lecithin-Cholesterol Mixture in
Formation of Model Phospholipid Membranes
Kateřina Nováková a,b, Tomáš Navrátil a, Ivana Šestáková, Vladimír Mareček,
and Jaromíra Chýlková b
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3,
182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and
Chemical Engineering. Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic
Abstract
Electrochemical behavior of lecithin-cholesterol mixture in the form of phospholipid
membranes (PLMs) was studied in this contribution. Lecithin (phosphatidylcholine) and
cholesterol were chosen for this research, because they are essential for living cells.
Electrochemical behavior of this system was studied using an electrochemical cell developed
in our laboratory and with applying electrochemical impedance spectroscopy (EIS). Different
ratios between lecithin and cholesterol placed on different polycarbonate substrates were
tested. The influence of time and of temperature on formation of PLMs in presence of
cholesterol was investigated.
Key words: Phosphatidylcholine, Cholesterol, Model phospholipid membrane,
Electrochemical impedance spectroscopy.
Introduction
Biological membranes play one of the most important roles in the normal functioning of
living cells. The cell membrane separates the interior of all cells from the outside milieu. The
cell membrane is selectively permeable for ions and organic molecules and has substantial
influence on movement of substances into and out of cells.
Investigation of cell membrane structure began in 17th century, when the microscope was
invented. One of the basic studies about structure of membrane was created by Overton. He
formed fundamental concept of the structure and function of the cell membrane. It was the
lipid theory of cell permeability 1. He did the conclusion that the cell membrane might be
made of lecithin (phosphatidylcholine) and cholesterol 2. In the present time, it is used “fluidic
mosaic” model described by Singer and Nicolson 3 for presenting real phospholipid (PL)
bilayers. According to this model biological membranes are consisting mainly of PL bilayers
with proteins penetrating either half way or all the way through the membrane. The bilayer is
completely liquid and the proteins float freely. This model was first which correctly
incorporated fluidity, membrane channels and multiple modes of protein/bilayer into one
theory.
The cell membrane is created of a thin layer of amphiphatic PLs. They are spontaneously
organized so that the hydrophobic “tail” regions are isolated from the surrounding polar fluid.
The hydrophilic “head” regions are kept in touch with the intracellular and extracellular faces
of the resulting bilayer. Forces as Van der Walls, electrostatic, hydrogen bonds, and
noncovalent interactions help to form the PL membrane (PLM).
For better understanding of properties and functionality of real membranes, the different
model PLMs are used (i.e., planar lipid bilayers, supported lipid bilayers, tethered lipid
bilayers, liposomes, micelles…). For formation of planar lipid bilayer, there are two main
methods (Mueller 4 and Langmuir-Blodget technique 5). On planar lipid bilayers, the
mechanism of transporting processes and the properties of membranes can be studied. The
advantage is that both sides of the membrane can be easily altered. The measurement of
128
electrical parameters of the model membrane is enabled by electrodes placed in the aqueous
compartment on each side of the PLMs.
Cholesterol is a very important component of real cell membranes. It has structural and
regulatory role in biomembranes. It does not form bilayers by itself, but it is dissolved readily
in phospholipid membranes 6. Cholesterol is not homogeneously distributed in cell
membranes. Its high concentration can be found in plasma membrane and its low
concentration in the membranes of intracellular organelles 7. The reason for engaging
cholesterol in the model membranes is its positive effect on stability of biomembranes.
Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) is an important tool in research of planar lipid
membranes and in characterization of the electrical properties of these membranes. Planar
lipid membrane can be easily presented as a parallel-plate capacitor. The typical resistance is
very high. The electrical properties of model membranes are dependent on the physical
properties and o composition of the lipids that form the bilayer 8.
Experimental
The 0.1 M KCl was used as base electrolyte solution. It was prepared from KCl Suprapur,
acquired from Merck, Prague, Czech Republic. The p.a. solvents (ethanol – 99.88%,
n-heptane – 99%) were obtained from Penta-Švec, Prague, Czech Republic. All the other
chemicals used were of analytical grade. For all the measurements, deionized water from
Milli-Q-Gradient, Millipore, Prague, Czech Republic (conductivity < 0.05 μS.cm-1) was
utilized.
For the preparation of lipid membrane 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (lecithin,
DPPC, GPCho (16:0/16:0)) (Avanti Polar lipids, alabaster, USA) and cholesterol (Sigma
Grade, ≥ 99%, from Sigma-Aldrich, Prague, Czech Republic) were used.
The lipid membranes were created by self-assembling in the holes of the Isopore™
Membrane Filters (Millipore, USA), polycarbonate, hydrophilic 8.0 μm and 2.0 μm.
Nuclepore Track-Etch Membrane (Whatman, USA), polycarbonate, hydrophilic 0.2 μm and
0.05 μm were used.
For our experiments “glass” cell was used. The cell was composed of two glass columns
(these two compartments can represent inner and outer medium of the cell). The
compartments were separated by two Teflon parts with holes (0.07 cm2), where the
polycarbonate porous membrane was deposited. The electrodes were placed into the holes on
the top of glass compartments. The same supporting electrolyte (0.1 M KCl) was inserted into
both compartments.
The membranes were formed in the way described in, e.g., 9-18. Lecithin-cholesterol mixture
was prepared by dissolving lecithin and cholesterol in ethanol (10 μl) and n-heptane (100 μl).
The ratios of lecithin and cholesterol were changed according to scheme suggested by us. 25
μl of the phospholipid-cholesterol mixture was applied to one side of the polycarbonate
membrane, the solvent was let to evaporate and then another volume of 25 μl was applied to
the other side of the membrane. Both sides were simultaneously exposed to aqueous
electrolyte at a certain time before the start of measurement.
The EIS measurements were performed with the use of CHI 650C Electrochemical
Analyzer/Workstation, Software: CHI version 8.1 (IJ Cambria Scientific, UK) and with
potentiostat PGSTAT302N + FRA2 module (Metrohm, Czech Republic), software Nova 1.8.
129
The measurements were realized using two silver/silver chloride electrodes (silver wire,
diameter 1 mm, electroplated by silver chloride) (working and reference electrode). Platinum
wire, diameter 1 mm, was used as the auxiliary electrode. In our EIS measurements, recorded
in 0.1 M KCl the system provided reliable results in the frequency range from 0.1 Hz to
1 MHz, amplitude 0.005 V. The voltage of -0.1 V has been used in all EIS-measurements
(this value is relatively close to the plant membrane potential). The measurements were
performed at laboratory temperature (25 ± 2 °C).
Results and discussion
The behavior of lecithin mixture with cholesterol was elucidated by EIS. Lecithin-cholesterol
mixtures were prepared in weight ratios 3:1, 2:1, 1:1, and 1:2. The weight ratio 2:1 (molar
ratio 1:1) was found as the most suitable. Another tested parameter was the size of holes in
polycarbonate substrate. The diameters 8.0 μm, 2.0 μm, 0.2 μm and 0.05 μm were tested.
Time and temperature during membrane formation of bilayer are very important parameters
for membrane stabilization. The effect of cholesterol presence on the PL membrane
capacitance and resistance was examined in the above given range of concentrations with the
use of EIS. The spectra confirmed that cholesterol has been successfully incorporated into the
model phospholipid membrane and it had significant effect on the electrical properties of the
membrane. The positive influence of cholesterol on the stability of biological membranes was
proved.
Conclusions
In our research, planar PLM was utilized as a model of a real biological membrane. Geometry
of this planar PLM provided chemical and electrical access to both aspects of this membrane,
so that the physical attributes of this bimolecular film can be easily measured. PLM was
created from two lipid monolayers at an air-water interface in holes of polycarbonate
membrane. Lipid monolayers were formed by mixture of phosphatidylcholine and cholesterol
in different ratios. Formation of the membrane was proved by an increase of the electrical
capacitance and its values were much higher in presence of cholesterol than in its absence.
We will use our results to obtain more information about PLM and about transport across it
and to study the properties of real cell membrane gained, e.g., from protoplasts of various
plants and from their different parts (roots, leaves).
Acknowledgments
The research was supported by GACR (project No. P208/12/1645) and by University of
Pardubice (project No. SGFChT05/2012).
References
1. Kleinzeller A.: News in Physiological Sciences 12, 49 (1997).
2. Hintzensterna U. V., Schwarzb W., Goerigc M., Petermann H.: The history of anesthesia
1242, 609 (2002).
3. Singer S. J., Nicolson G. L.: Science 175, 720 (1972).
4. Mueller P., Rudin D. O., Tien H. T., Wescott W. C.: The Journal of Physical Chemistry
67, 534 (1963).
5. Langmuir I., Blodgett K. B.: Kolloid-Zeitschrift 73, 257 (1935).
6. Melzak K. A., Melzak S. A., Gizeli E., Toca-Herrera J. L.: Materials 5, 2306 (2012).
7. Bach D., Wachtel E.: BBA-Biomembranes 1610, 187 (2003).
8. Kramar P., Miklavčič D., Kotulska M., Lebar A. M., v knize: Advances in Planar Lipid
Bilayers and Liposomes; (11 Elsevier Inc., 2010.
9. Navratil T., Sestakova I., Stulik K., Marecek V.: Electroanalysis 22, 2043 (2010).
130
10. Navratil T., Sestakova I., Marecek V., Stulik K.: Modern Electrochemical Methods XXX:
Transport of cadmium ions across model supported phospholipid membranes,
Jetrichovice,
(Barek
J.,
Navratil
T.,
Eds.),
http://www.bestservis.eu/upload/file/Sbornik_metody10.pdf, Best servis, Jetrichovice
2010, p. 119.
11. Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Marecek V.: 7th WSEAS
International Conference on Environment, Ecosystems and Development: Study of
charged particles transport across model and real phospholipid bilayers, Puerto de la
Cruz, SPAIN, (Otesteanu M., Celikyay S., Mastorakis N., Lache S., Benra F. K., Eds.),
World Scientific and Engineering Acad. and Soc., Puerto de la Cruz, SPAIN 2009, p.
212.
12. Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Marecek V.: WSEAS Trans.
Environ. Dev. 6, 208 (2010).
13. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Development, Energy, Environment, Economics
(DEEE '10): Supported phospholipid bilayers and transport of heavy metals across them,
Puerto de la Cruz, (Mladenov V., Psarris K., Mastorakis N., Caballero A., Vachtsevanos
G., Eds.), Puerto de la Cruz 2010, p. 192.
14. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Int. J. Energy Env. 5, 337 (2011).
15. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods XXXI:
Transport of divalent cations across the gel supported phospholipid membranes,
Jetrichovice,
(Navratil
T.,
Barek
J.,
Eds.),
http://www.bestservis.eu/upload/file/Sbornik_metody11.pdf, Best servis, Jetrichovice
2011, p. 91.
16. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Int. J. Electrochem. Sci. 6, 6032 (2011).
17. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods
XXXII: Transport of copper ions in the presence and absence of ionophore calcimycin
and the influence of LMWOAs on this transport, Jetrichovice, (Navratil T., Fojta M.,
Eds.), www.bestservis.eu/upload/file/Sbornik_metody12.pdf, Best servis, Jetrichovice
2012, p. 102.
18. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Navratil T., Schroder D.: Collect. Czech. Chem. Commun.
76 (2011).
131
Impact of the Silver Nanoparticles on Carpio Embryos, evaluation of their gradual
agglomeration
(Působení nanočástic stříbra na plůdek kapra, hodnocení jejich postupné agregace)
Jakub Opršal, Renáta Petráňková, Ladislav Novotný, and Miloslav Pouzar
University Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Environmental and
Chemical Engineering, Studentská 573, CZ-532 10 Pardubice, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
Impact of the silver nanoparticles on carpio embryos was observed. Gradual agglomeration
(aggregation) process of solver particles was described and evaluated. A possible utilization
of the proposed approach for the toxicity test of Ag nanoparticles was recommended.
Key words: Ecotoxicity, Carp, Embryo, Silver, Nanoparticles, Agglomeration.
Úvod
Aplikace nanomateriálů využívaných v různých oblastech průmyslu, zdravotnictví a jinde
vede ke zvýšenému riziku jejich úniku do životního prostředí. Možnosti zjišťování jejich
skutečného vlivu na prostředí jsou však velmi omezené 1. Jde přitom o heterogenní skupinu
materiálů a to jak z pohledu jejich chemického složení (byly připraveny již z více než
44 prvků 2), tak i průměrné velikosti částic a jejich distribuce, náboje atd. Ty ovlivňují
chování nanomateriálů a jejich toxicitu. Voda patří mezi potencionálně nejvíce ohrožená
prostředí. O negativním vlivu nanočástic však nejsou ucelené informace 3-6. Příkladem může
být toxicita nanostříbra (nAg). Zájem o něho roste zejména v souvislosti s jeho
antibakteriálními účinky 7,8. Testy toxicity nAg byly provedeny na množství organismů.
Nicméně výsledky studií i laboratorních testů jsou zatím velmi nejednoznačné 11, jelikož
toxicita/ekotoxicita nanostříbra je ovlivněna širokou škálou vnitřních (velikost částic, měrný
povrch apod.) i vnějších (pH, iontová síla, přítomnost chelatujících látek aj.) faktorů 12.
Běžnou praxí je stabilizace připraveného koloidního systému pomocí stabilizačních činidel,
jako je arabská guma 9, sacharidy 13 nebo biomolekuly 10. Mezi nejčastěji používané techniky
analýzy velikosti a tvaru částic patří transmisní/rastrovací elektronová mikroskopie (TEM,
SEM), dynamický rozptyl světla (DLS) případně i ultrafialovo-viditelná (UV-VIS)
spektroskopie. K analýze prvkového složení bývá užito metod AAS (atomová absorpční
spektrometrie), ICP-OES (optická emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem) a
ICP-MS (hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem). K charakterizaci
stability slouží měření ζ-potenciálu 14. Z dřívějších publikací 15 plyne, že různé formy typu
nanočástice, mikročástice nebo volný iont téhož prvku vykazují rozdílnou toxicitu. Je proto
nutné odlišit toxicitu nanočástic od toxicity aglomerátů či volných iontů. Cílem práce je
předběžné studium vlivu koloidních částic nAg na plůdek kapra, při zohlednění jejich časově
závislé velikosti.
Experimentální část
Pro přípravu nanostříbra byl použit modifikovaný Tollensův proces 13 založený na smíchání
redestilované vody, roztoků dusičnanu stříbrného, amoniaku, hydroxidu sodného a glukózy.
Takto vzniklý roztok byl míchán při laboratorní teplotě po dobu 15 minut a poté byl slit do
tmavé zásobní láhve. Koncentrace Ag v takto připraveném roztoku byla 1 mmol/L. Roztoky o
nižší nominální koncentraci byly připraveny ředěním tohoto zásobního roztoku Médiem 203 a
jejich koncentrace byla ověřena pomocí ICP-OES.
Médium 203 bylo připraveno podle směrnice OECD 203 16 ze solí CaCl2, MgSO4, NaHCO3
a KCl. Hydrodynamický průměr byl měřen na přístroji ZetaPALS Potential Analyzer
(Brookhaven Instruments Corp., USA) na základě dynamického rozptylu světla (DLS).
132
Mikroskopie atomárních sil (AFM) byla uskutečněna na přístroji Solver Pro M (NT-MDT;
Rusko), v semikontaktním modu nastaveným na 40 % volné oscilace. Vzorky byly připraveny
metodou „spin-coating“ na vysoce orientovaném pyrolytickém grafitu a vysušeny za vakua 17.
Koncentrace stříbrných iontů byla měřena pomocí metody ICP-OES na přístroji INTEGRA
XL 2 (GBC, Dandenong Australia).
Výsledky a diskuse
V rámci studia byla sledována relativní rychlost růstu aglomerátů Ag na základě změn časové
závislosti růstu jejich poloměru r pro koncentrace okolo 10 µmol/L a cca desetkrát vyšší. Pro
obě zkoumané koncentrace Ag v koloidních roztocích nAg dochází díky aglomeračnímu
procesu k růstu střední hodnoty r v čase. Velikosti aglomerátů v různých časových úsecích
byly vztaženy vůči hodnotám naměřeným při t = 5 min. Tyto relativní změny r přitom
ukazovaly na rychlejší nárůst r při vyšších koncentracích Ag, přičemž se poměr těchto
veličin s rostoucím časem stával na čase nezávislým.
Na základě takto získaných dat je možné určit dobu, za kterou dojde ke stavu, kdy se velikost
aglomerátů u Ag mění s časem již poměrně málo. Vodní organismus bývá v reálných
podmínkách dlouhodobě vystaven působení právě takových aglomerátů.
Jak Tabulka I. ukazuje, klesal procentickýk rozdíl mezi okamžitým poloměrem nAg (r) v čase
t a jeho limitním poloměrem (rm) v čase t blížícím se nekonečnu. Kinetika (resp. rychlost)
přibližování se limitní velikosti rm se přitom s časem zpomalovala, přičemž se po cca 80
minutách měnil r již relativně málo. Tato pozorování kvalitativně odpovídala i vztahu (1)
převzatému z práce 35
(1)
Dt  Dinf  ( D0  Dinf )  e k t
t
inf
0
kde D , D a D značí průměr v čase t, t blížícímu se nekonečnu a výchozí průměr a k je
konstanta charakterizující kinetiku změn.
V našem případě byly změny r s časem t vyhodnocovány pomocí modifikované rovnice (1)
po jejím zlogaritmování – s využitím postupů a i některých vztahů uplatněných dříve 18,19 při
specifickém popisu a vyhodnocování adsorpčního chování látek za vzájemné interakce částic.
Konstanta k nabývala v závislosti na koncentraci nAg hodnot mezi 1 až 3 [hodin-1].
Tabulka I.
Procentický rozdíl mezi okamžitým poloměrem nAg (r) v čase t a jeho limitním poloměrem
(rm) v čase t blížícím se nekonečnu.
Čas [min]
10
20
30
40
50
60
70
Rozdíl [%]
90
71
60
50
44
34
20
Testovaným organismem byly zárodky kapra. Byly použity pouze zdravé jikry bez
nežádoucích abnormalit. Pro každý experiment bylo použito třicet jiker. Experiment byl
proveden pro výše zmíněné dvě úrovně koncentrace Ag.
Kontrolní skupina embryií vykazovala po celou dobu testu normální růst bez abnormalit
v jejich chování. Mortalita u kontrolních skupin nepřesahovala po dobu experimentu hodnotu
3 %. Kultivace embryí v koloidním roztoku nAg vedla naopak při cca 10 µmol/L k výsledné
mortalitě 30 %. Docházelo-li k výměně kultivačního média během experimentu, bylo možné
pozorovat abnormality ve fenotypu zárodků. Šlo zejména o deformace páteře nebo ocasu. Při
testu prováděném (jak bylo zmíněno) i při výrazně vyšších hodnotách nAg, byla zjištěna
133
přibližně stejná mortalita, vývoj embryí byl však pomalejší a jejich deformace výraznější.
Jikry byly na povrchu chorionu obaleny vrstvou aglomerátů stříbra a některé byly i uvnitř
chorionu. Někdy došlo i k neschopnosti plůdků vykulit se z chorionu. V několika případech
došlo pouze k částečnému vykulení.
Závěr
Za všech použitých koncentrací nAg byla pozorována vyšší mortalita a pomalejší vývoj
embryí s rostoucí frekvencí výměny média. Vyšší toxicita byla zjištěna pro koloid s vyšší
koncentrací Ag, přičemž se ukázalo, že by bylo možné do určité míry vliv rychlosti a míry
aglomerace nanočástic eliminovat řízením maximální velikosti aglomerátů cestou výměny
kapalného média s různou koncentrací aktivních částic. Tímto způsobem by patrně bylo
možné získat monotónní závislost toxicity daného nanomateriálu (při normalizovaném
obsahu) na jeho koncentraci v koloidním roztoku. Námi prezentované zjištění je však nutné
chápat zatím pouze jako předběžné výsledky, které představují nezbytný první krok při
ověřování aplikovatelnosti navrhovaného postupu.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektu č. TACR TA01020730, MSM č. 0021627502 a MPO
TIP č. FR-TI3/288.
Literatura
1. Navarro E., Baun A., Behra R., Hartmann N. B., Filser J., Miao A. J., Quigg A., Santschi
P. H., Sigg L.: Ecotoxicology 17, 372 (2008).
2. Kahru A., Dubourguier H. C., Blinova I., Ivask A., Kasemets K.: Sensors 8, 5153 (2008).
3. Franklin N. M., Rogers N. J., Apte S. C., Batley G. E., Gadd G. E., Casey P. S.: Environ.
Sci. Technol. 41, 8484 (2007).
4. Griffitt R. J., Luo J., Gao J., Bonzongo J. C., Barber D. S.: Environ. Toxicol. Chem. 27,
1972 (2008).
5. Blaise C., Gagne F., Ferard J. F., Eullaffroy P.: Environ. Toxicol. 23, 591 (2008).
6. Crane M., Handy R. D., Garrod J., Owen R.: Ecotoxicology 17, 421 (2008).
7. Lara H. H., Ayala-Nunez N. V., Turrent L. D. I., Padilla C. R.: World J. Microbiol.
Biotechnol. 26, 615 (2010).
8. Lee S. M., Song K. C., Lee B. S.: Korean J. Chem. Eng. 27, 688 (2010).
9. Yin L. Y., Cheng Y. W., Espinasse B., Colman B. P., Auffan M., Wiesner M., Rose J., Liu
J., Bernhardt E. S.: Environ. Sci. Technol. 45, 2360 (2011).
10. Asharani P. V., Wu Y. L., Gong Z. Y., Valiyaveettil S.: Nanotechnology 19 (2008).
11. Oberdorster E.: Environ. Health Perspect. 112, 1058 (2004).
12. Romer I., White T. A., Baalousha M., Chipman K., Viant M. R., Lead J. R.: J.
Chromatogr. A 1218, 4226 (2011).
13. Tolaymat T. M., El Badawy A. M., Genaidy A., Scheckel K. G., Luxton T. P., Suidan M.:
Sci. Total Environ. 408, 999 (2010).
14. Fabrega J., Luoma S. N., Tyler C. R., Galloway T. S., Lead J. R.: Environ. Int. 37, 517
(2011).
15. Zhang Q. W., Kusaka Y., Zhu X. Q., Sato K., Mo Y. Q., Kluz T., Donaldson K.: J. Occup.
Health 45, 23 (2003).
16. OECD guideline for testing chemicals No. 203—Fish acute toxicity test.
17. Bilkova E., Sedlak M., Imramovsky A., Charova P., Knotek P., Benes L.: International
Journal of Pharmaceutics 414, 42 (2011).
18. Novotný L.: DrSc.-disertační práce. AV ČR, Praha 1998.
19. Novotný L., Krista J.: Electroanalysis 10, 965 (1998).
134
Monitoring of Activities of DNA-Processing Enzymes by Electrochemical Methods
(Monitorování aktivity enzymů působících na DNA pomocí elektrochemických metod)
Petr Orság a, Hana Pivoňková a, Luděk Havran a, Petra Horáková a, Eva Šimková a,
Miloslava Fojtová a, Hana Macíčková-Cahová b, Michal Hocek b, and Miroslav Fojta a
a
Institute of Biophysics, ASCR,v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
b
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, ASCR v. v. i., Flemingovo nam. 2,
166 10 Prague 6, Czech Republic
Abstract
Electrochemical methods have been applied in a number of studies of DNA structure and
interactions. DNA-processing enzymes include a variety of proteins catalysing synthesis,
degradation and/or various modifications of the nucleic acid. These enzymes, on one hand,
can be utilized as tools for preparation of DNA molecules for studying DNA structure
interactions, as well as for DNA pretreatment prior to analysis by means of different
techniques. On the other hand, activities of the enzymes and effects of different factors on
them can naturally be assayed using the same principles.
Key words: DNA-processing enzymes, Electrochemistry, Label-free, DNA modification.
Úvod
Elektrochemické metody se osvědčily jako citlivé nástroje analýzy struktury a interakcí DNA.
Přírodní DNA je elektrochemicky aktivní látka díky přítomnosti redukovatelných (na
rtuťových a amalgámových elektrodách) nebo oxidovatelných (obvykle na uhlíkových
elektrodách) zbytků bází 1. Elektrochemické a adsorpčně-desorpční vlastnosti DNA jsou
ovlivněny její strukturou. Především chování DNA na rtuťových a amalgámových
elektrodách je silně závislé na přístupnosti zbytků bází a jejich interakci s povrchem
elektrody, což umožňuje rozlišit nejen jednořetězcovou DNA od dvouřetězcové a přítomnost
jednořetězcových úseků v dvouřetězcových molekulách DNA, ale také konformační změny
dvoušroubovice DNA na základě specifických voltametrických signálů. Díky povrchové
denaturaci DNA na negativně nebitém povrchu rtuťové elektrody je možno od sebe odlišit
DNA obsahující volné konce (která této povrchové denaturaci podléhá) od kovalentně
uzavřené kružnicové DNA (která je vůči tomuto procesu rezistentní). Vznik a zánik zlomů,
případně jednořetězcových úseků v DNA působením enzymů je tedy možno monitorovat
elektrochemicky bez jakéhokoli značení. Další možnosti pro využití elektrochemické analýzy
v oblasti sledování enzymových přeměn na DNA otevírá aplikace různých způsobů značení
DNA, ať již elektrochemicky aktivními skupinami nebo analogy nukleobazí lišícími se od
přirozených stavebních kamenů DNA svými elektrochemickými vlastnostmi, nebo
enzymovými značkami obvykle připojenými k DNA prostřednictvím bioafinitního adaptoru
(antigen-protilátka, biotin-streptavidin). Tyto přístupy lze využít k řadě aplikací zaměřených
na monitorování aktivity enzymů odbourávajících, syntetizujících nebo modifikujících DNA.
Následující odstavce přinášejí stručný popis enzymových aktivit na DNA, které lze sledovat
elektrochemickými nástroji vyvíjenými v naší laboratoři, a přehled našich výsledků.
Nukleázy
Nukleázy jsou obecně enzymy hydrolyticky štěpící fosfodiesterovou vazbu v DNA. Působí
buďto uvnitř molekuly DNA (endonukleázy), nebo odštěpují jednotlivé nukleotidy z konce
polynukleotidového řetězce (exonukleázy). Produktem působení endonukleáz je obecně zlom
– tedy volný konec DNA, což umožňuje pro detekci jejich aktivity využít kovalentně
uzavřenou kružnicovou DNA a voltametrii na rtuťových nebo amalgámových elektrodách. Po
vzniku zlomu se DNA stává citlivou k povrchové denaturaci a objeví se signál odpovídající
odvinutým úsekům. Touto metodou bylo studováno 2 např. štěpení DNA pankreatickou
135
deoxyribonukleázou I (DNázou I) v roztoku a na povrchu elektrody a bylo ukázáno, že
interakce DNA s DNázou a štěpení DNA je ovlivněno potenciálem elektrody. Specifickým
případem endonukleáz jsou enzymy účastnící se oprav DNA, které rozpoznávají poškozené
báze nebo místa, kde tyto báze chybí, a zavedením zlomů do těchto míst zahajují opravný
proces. S využitím těchto enzymů byla navržena metoda citlivé a specifické detekce
modifikovaných (poškozených) bází 3. Restrikční endonukleázy (restriktázy) jsou enzymy,
které v DNA vyhledávají specifické nukleotidové sekvence a v nich DNA štěpí přesně
definovaným způsobem. Štěpení DNA restriktázami je obecně citlivé k modifikaci bází
v rozpoznávané sekvenci, ať již přirozené (metylací bází, např. cytosinů) nebo syntetické za
účelem např. dočasné ochrany DNA před štěpením 4. Restrikčních endonukleáz lze využít pro
nepřímé sledování aktivity jiných enzymů, např. metyltransferáz (viz dále). Jako příklad
exonukleázy lze uvést exonukleázu III z E. coli, která odbourává v dvouřetězcové DNA jeden
řetězec od jeho 3‘-OH konce a vzniklý jednořetězcový úsek lze stanovit buďto přímo na
rtuťových elektrodách 3, nebo nepřímo po jeho modifikaci elektroaktivní chemickou
strukturní sondou na bázi komplexu oxoosmia 5.
Topoizomerázy
Topoizomerázy jsou enzymy, jejichž biologickou funkcí je odstraňovat nebo vytvářet v DNA
nadšroubovicové závity. Kovalentně uzavřená kružnicová DNA může existovat v různých
topologických formách, které se liší globální konformací a tendencí k vytváření alternativních
struktur. Negativní superhelicita je spojena s tvorbou struktur, ve kterých je snížen zkrut
(twist) dvoušroubovice a jsou tak zpřístupněny zbytky bází ve srovnání s relaxovanou
dvoušroubovicí DNA. Tyto přechody lze monitorovat pomocí voltametrie na rtuťových
elektrodách 6. Na stejném principu je pak v principu možno monitorovat aktivitu
topoizomeráz.
DNA ligázy
Jde o enzymy zacelující zlomy v DNA za účasti makroergického kofaktoru, NAD nebo ATP
(podle typu ligázy). Pro sledování jejich aktivity jsme využili metodu založenou na rozdílu ve
voltametrickém chování DNA obsahující a neobsahující volné konce, tedy stejný princip, jaký
je využíván k detekci štěpení DNA endonukleázami, avšak v opačném uspořádání (v případě
ligační reakce je zlom zacelen a signál odpovídající DNA odvinuté na negativně nabitém
povrchu elektrody vymizí) 7. Druhou možností je využití varianty metody založené na
imobilizaci DNA sondy na magnetických mikročásticích, jejíž princip je ukázán na obr. 1 pro
případ detekce metylace DNA s využitím štěpení DNA restriktázou (ligázou jsou dvě části
řetězce DNA k sobě spojeny, takže vznik elektrochemického signálu indikuje ligázovou
aktivitu).
DNA metyltransferázy
Enzymatická metylace specifických nukleobází je u prokaryot využívána jako nástroj obrany
proti cizorodé DNA (např. při infekci bakteriofágy), u eukaryot jako tzv. epigenetická
modifikace sloužící spolu s dalšími mechanismy k regulaci genové exprese a modulaci
struktury chromatinu. Metylace bází uvnitř restrikčního místa vede v některých případech
k zablokování jeho štěpení příslušnou restriktázou. Metylaci DNA a aktivitu DNA
metyltransferázy tak lze detekovat nepřímo analýzou restrikčního štěpení DNA sondy
metylačně citlivými restrikčními endonukleázami. Jedna z možností, jak pro detekci této
enzymové aktivity využít elektrochemické metody, je znázorněna na obr. 1.
136
magnetická mikročástice
restriktáza
neštěpená
(metylovaná)
DNA
120
nemethylované
restrikční místo
90
alkalická fosfatáza
oxidační
signál
1-naftolu
I/A
odstraněno
60
restriktáza
štěpená
(nemetylovaná)
DNA
30
methylované
restrikční
místo
0
0.0
E/V
0.4
0.8
Obr. 1. Příklad elektrochemické detekce DNA pomocí methylačně citlivé restrikční
endonukleázy, s využitím magnetického nosiče a koncové enzymové značky. Pokud není
vazebné místo pro restriktázu methylováno, dojde ke štěpení DNA, koncová značka je
odstraněna a v souladu s tím není pozorován signál produktu enzymové reakce (zde 1-naftolu
uvolněného alkalickou fosfatázou z 1-naftylfosfátu). Pokud je restrikční místo methylováno,
ke štěpení DNA nedojde, čemuž odpovídá intenzívní signál produktu enzymatické reakce –
ten tak nepřímo indikuje aktivitu DNA metyltransferázy, jíž byla sonda DNA vystavena před
působením restriktázy.
DNA polymerázy
DNA polymerázy jsou enzymy syntetizující řetězec DNA podle sekvence komplementárního
řetězce, sloužícího jako předloha (templát) s využitím deoxynukleosid trifosfátů (dNTP) jako
monomerních stavebních kamenů. V buňkách mají zásadní význam v procesech replikace
a oprav DNA. Moderní metody analýzy nukleotidových sekvencí a DNA diagnostiky jsou
z velké části založeny na využití DNA polymeráz. Komerčně je dostupná celá řada těchto
enzymů, z nich značná část patří mezi termostabilní polymerázy využitelné v technikách
PCR. Liší se mezi sebou přesností čtení předlohy na jedné straně, rychlostí polymerace
a tolerancí k chemicky modifikovaným (značeným) dNTP na straně druhé 8. Aktivitu DNA
polymeráz a jejich schopnost inkorporovat modifikované dNTP lze v principu monitorovat na
základě stanovení značených nukleotidů inkorporovaných do DNA pomocí metod
prodlužování primeru nebo PCR.
Terminální deoxynukleotidyl transferáza
Reakce katalyzovaná tímto enzymem spočívá v připojování nukleotidů, dodaných do reakční
směsi ve formě dNTP, na 3’-OH konec primeru bez komplementární předlohy. Vznikají tak
jednořetězcové úseky, jejichž nukleotidová sekvence je určena statisticky složením směsi
dNTP v dané reakci. Stejně jako v případě DNA polymeráz, i u terminálních transferáz je
možno enzymovou aktivitu monitorovat pomocí elektrochemické analýzy na základě
sledování inkorporace určitého typu báze, jeho analogu nebo konjugátu s elektrochemicky
aktivní skupinou do molekuly DNA 9.
137
Závěr
Enzymové reakce na DNA jsou obecně rozšířeným nástrojem konstrukce molekul DNA pro
účely genového a proteinového inženýrství a pro diagnostické aplikace. Na základě
kombinace enzymových a elektrochemických přístupů byla navržena řada metod vhodných
k analýze nukleotidových sekvencí, detekce sekvenčních polymorfismů a poškození DNA.
Podobné přístupy mohou být naopak využity k detekci aktivity a studiu vlastností enzymů
samotných.
Poděkování
Tato práce vznikla za podpory grantů GAČR (P206/11/P739, P301/11/2076) a OPVK
CZ.1.07/2.3.00/30.0019.
Literatura
1. Palecek E., Bartosik M.: Chem Rev 112, 3427 (2012).
2. Fojta M., Kubicarova T., Palecek E.: Electroanalysis 11, 1005 (1999).
3. Cahova-Kucharikova K., Fojta M., Mozga T., Palecek E.: Anal. Chem. 77, 2920 (2005).
4. Macickova-Cahova H., Pohl R., Hocek M.: Chembiochem 12, 431 (2011).
5. Havran L., Vacek J., Cahova K., Fojta M.: Anal Bioanal Chem 391, 1751 (2008).
6. Fojta M., Bowater R.P., Stankova V., Havran L., Lilley D.M.J., Palecek E.: Biochemistry
37, 4853 (1998).
7. Vacek J., Cahova K., Palecek E., Bullard D.R., Lavesa-Curto M., Bowater R.P., Fojta M.:
Anal Chem 80, 7609 (2008).
8. Hocek M., Fojta M.: Chem Soc Rev 40, 5802 (2011).
9. Horakova P., Macickova-Cahova H., Pivonkova H., Spacek J., Havran L., Hocek M.,
Fojta M.: Org Biomol Chem 9, 1366 (2011).
138
Characterization of Liposomes Used as Model System of Biological Membranes by
Glassy Carbon Electrode
a,b
Martina Parisová , Tomáš Navrátil a, Ivana Šestáková a, and Jiří Barek b
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3,
182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre UNCE
“Supramolecular electrochemistry”, Department of Analytical Chemistry, UNESCO
Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 128 43 Prague 2, Czech Republic
Abstract
This contribution deals with study and characterization of liposomes. These vesicles may
serve as model membranes used for study of transporting processes of heavy metal ions
across the real phospholipid membranes (PLMs). 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
was used for the formation of large unilamellar vesicles (LUV). These vesicles were prepared
by hydration method. Interactions of cadmium ions with LUV in solution have been
characterized using voltammetry, where glassy carbon electrode was used as the working
electrode. Size and presence of liposomes in sample was proved by dynamic light scattering
and free cadmium ions in samples were determined by differential pulse voltammetry.
Key words: Liposomes, Transport, Biological membranes, Model system, Glassy carbon
electrode.
Introduction
Consumption of metals and metalloid, organic and inorganic compounds has been constantly
increasing with development of society, industry and other human progress. Heavy metals get
into soils by erosion of rocks and minerals and also in consequence of various natural
processes (e.g., volcanic activity, atmospheric precipitations). However, the most important
source of heavy metals in the environment are various human activities like application of
various fertilizers, pesticides, sludge, irrigation water etc. 1, 2. Rapid and intensive
industrialization have caused contamination of soils, waters and air by substances that are not
biodegradable. In some cases these elements and substances are carcinogenic or toxic at
higher concentrations and their presence can be considered as risk for the environment and
human health 1, 2. Cadmium, copper, lead, zinc (generally heavy or risk metals) and their
compounds belong to them 3-5. They are used for surface plating of other metals, in metallurgy
6-8
, in agriculture or chemical industry 9-13. Those substances may pass into living organisms,
specifically into cells, where they can be partially accumulated and at higher concentrations
they can form specific complex compounds 3, 9, 14, 15. Elucidation of transport mechanisms of
these compounds across the biological membranes can help to affect the selectivity and
amount of transported substances into plants and human organisms 4, 5, 16-19. Therefore, this
work is aimed at studying of interactions of cadmium with suitable model membranes.
Biological membranes are essential for life on Earth. They separate inner, organized space of
the cell from outer, entropic space and provide many important processes that are necessary
for living cells. Biological membranes are mechanically resistant, can be deformed in a
certain range without damage and they have a certain degree of fluidity. These unique
properties are ensured by mobile building elements – phospholipids (PLs), which form the
plasmatic membrane. Phospholipids are amphipathic molecules containing hydrophobic and
hydrophilic parts. The hydrophobic part is created from saturated and unsaturated fatty acid
tails and the hydrophilic part contains phosphatidic acid, glycerol and a polar group as
inositol, choline, ethanolamine etc. PL molecules are oriented by their hydrophobic chains
towards nonpolar part of the membrane and by their hydrophilic parts towards aqueous
environment. So, PL bilayer structure is formed. This arrangement is the best in terms of
139
thermodynamics and optimal for all processes, which are ensured by plasmatic membrane.
Biological membranes are investigated in many types of laboratories and the aim is to
elucidate the biological processes connected with phospholipid membranes (PLMs). One of
these processes is transport of various compounds across PLMs. Biological membrane
represents a semipermeable barrier which enable transport of some compounds across it only.
Small molecules and gases (CO2, O2, N2) easily diffuse across PLM, as well as compounds
with hydrophobic character (steroidal hormones) are capable to be transported across
nonpolar core of membrane. On the contrary, compounds with polar character as ions,
nutrients (amino acids, water…) and other hydrophilic compounds, which are not able to pass
across the PLM, require presence of specific proteins, specific transporters incorporated in
membrane. These trans-membrane proteins can bound compounds with hydrophilic character
and transport them across hydrophobic part of membrane 20. Ionophore calcimycin, highly
selective for bivalent metal cations, has been used for this purpose.
Because work with real biological membranes is very complicated, for the study of biological
processes it is necessary to create a model system which properties would be close to real
membrane. In this work liposomes were used as model membranes. Liposomes or PL vesicles
are spherical and self-closed vesicles which represent a type of microencapsulation. Thus,
fluid or gas parts are closed with help of multilamellar structures of liposomes formed from
lipid bilayers 21, 22. Composition of liposomes is very similar to biological membranes,
because their basic structure is formed from PLs too. This is one of the reasons why
liposomes are used as models of artificial PLMs. Liposomes can be imagined as extremely
twisted plasmatic membranes forming the vesicles 23. Liposomes have number of
characteristics which can be useful in various applications. They are nontoxic, biodegradable,
and can encapsulate a wide range of dissolved compounds. Due to physicochemical properties
of liposomes, they have many specific biological characteristics and they can interact with
biological membranes of various cells. Therefore, the liposomes can be used as model
membranes to study properties, structures, transport mechanisms and other associated
processes.. Moreover, they can be used in several industries, especially, in medicine and
pharmacy as drug delivery vesicles, solubilizers for various ingredients and penetration
compounds in cosmetics 24, 25. These microscopic vesicles can be formed from one or more
lipid bilayers (in dependence on method of preparation) surrounding water phase. There are
three basic types of liposomes – multilamellar vesicles (MLVs), which contain several
bilayers, small unilamellar vesicles (SUVs) and large unilamellar vesicles (LUVs). LUVs,
which were prepared by hydration method, were used in our measurements. In this method, a
solution of PLs in an organic solvent is evaporated and dried in vacuum to form thin film on
side of a flask 26. Then the film is hydrated by addition of aqueous buffer and the dispersion is
vortexed for 5 minutes. This hydration step must be done at a temperature above the gelliquid crystalline transition temperature Tc of the PL, because otherwise a precipitate in
solution is formed and liposomes are not created. Size (100 nm) and presence of ĹUVs in
solution was confirmed by dynamic light scattering. Voltammetric technique was used for
determination of free cadmium ions in solutions and for characterization of interaction of ions
with liposomes.
Experimental
Apparatus
The voltammetric determinations of cadmium ions were carried out using a PC-controlled
voltammetric analyzer ECO-TRIBO polarograph (Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic),
equipped with MultiElchem v 3.0 software (J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of
the AS CR, v.v.i., Prague, Czech Republic). Glassy carbon electrode SESV 12
(Elektrochemické Detektory, Turnov, Czech Republic) was used as the working electrode,
140
Ag/AgCl/KCl (3 mol L-1) 10-20 (Elektrochemické Detektory, Turnov, Czech Republic) as
reference electrode and platinum wire (1 mm diameter) served as the counter electrode. The
free cadmium ions were determined in 0,1 M phosphate buffer, pH 7.0 and analyzed using
anodic stripping differential pulse voltammetry under following conditions: Accumulation
potential (Eacc) = -1500 mV, accumulation time (tacc) = 30 - 120 s, initial potential
(Ein) = - 1500 mV, final potential (Efin) = 1200 mV, scan rate 20 mV s-1, pulse amplitude
50 mV, pulse duration 80 ms, sampling interval 20 ms, sample volume 10 mL.
Surface of the glassy carbon electrode was cleaned on soft emery paper and then polished on
polishing polyurethane pad using a polishing kit, (Electrochemical Detectors, Turnov, Czech
Republic), consisting of Al2O3 suspension (particle size 1.1 mm) and soft polishing Al2O3
powder (particle size 0.3 mm). After finishing this step, the electrode was ready for
measurement. Usually, the electrode surface should be polished once a week. Before starting
of the work, the glassy carbon electrode surfaces was activated in a 0.1 M phosphate buffer
using cyclic voltammetry under following conditions: initial potential (Ein) = - 1500 mV, final
potential (Efin) =+1000 mV, scan rate 150 mV s-1. Electrode surface was cleaned before each
measurement of sample: cleaning potential was -1500 mV and cleaning time was 60 s. The
cleaning step ensures that the adsorbed species are removed from the surface.
pH-value was measured by a digital pH meter 3505, Jenway (Bibbi Scientific Limited, UK).
To obtain a homogenous dispersion of liposomes, Mini-Extruder Set was used and
polycarbonate membranes with 100 nm pores (Both Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)
were applied. Size of LUVs was determined by dynamic light scattering Zetasizer Nano S
(Malvern, United Kingdom), scattering angle 173, He-Ne laser with 4mW output power at 633
nm wavelength).
Reagents and Materials
The base electrolyte solutions 0.1 M phosphate buffer was prepared from Na2HPO4.12 H2O
p.a. and NaH2PO4.2H2O p.a. (Sigma Aldrich, Prague, Czech Republic). All the other
chemicals were used of the analytical reagent purity grade. 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3phosphocholine (Sigma Aldrich, Prague, Czech republic) was used for preparation of
liposome solutions.
Characterization of liposomes
Large unilamellar liposomes were prepared by hydration method and passed through a
polycarbonate filter. Thus prepared liposomes were characterization by dynamic light
scattering. By using this method, it has been determined that their size is about 100 nm.
Different amounts of liposome stock solution (50, 100, 150, 200, 250 µl) were pipetted into
the voltammetric cell containing 10 mL of basic electrolyte and different times of
accumulation were applied. Interactions of cadmium ions with liposomal membrane were
studied by additions of adequate amounts of cadmium solution (1 mg/ml) to liposomal
solution, which was stirred for 2 h. After then, free cadmium ions were determined by
standard addition method.
Results and Discussion
The main attention of this work was aimed toward preparation and characterization of LUVs.
Hydration method, which proved to be suitable and easily reproducible, was used to obtain
the required mixture of liposomes. An interaction of cadmium ions with liposomes was
monitored using glassy carbon electrode. If only liposomes were present in the polarographic
cell, none peak corresponded to their presence in the investigated potential interval. After
addition of cadmium ions, two peaks at potentials -800 mV and +750 mV were detected (Fig.
141
I [nA]
1.). Peak at -800 mV corresponded to free cadmium ions in solution and peak at +750 mV
represent complex of liposomes with cadmium ions. Because these measurements were
performed in absence of an ionophore, it is possible to suppose that cadmium ions were not
transported into liposomes.
10000
8000
250ulLIP_60s
6000
250ulLIP_120s
4000
250ulLIP_60s_10ulCd
2000
250ulLIP_120s_10ulCd
0
-1700
-2000
-1200
-700
-200
300
800
1300
E [mV]
-4000
-6000
Fig. 1. Direct current (DC) striping voltammetry of cadmium in presence liposomes.
0.1 M phosphate buffer (pH = 7.0); Accumulation potential (Eacc) = -1500 mV, accumulation
time (tacc) = 60, 120 s, initial potential (Ein) = - 1500 mV, final potential (Efin) = 1200 mV,
scan rate 20 mV s-1, cleaning procedure: -1500 mV for 60 s with stirring. Liposomes
concentration: 0.5 mg/ml; Cd2+ concentration: 0.05 mg/l.
Conclusion
For preparation of liposomes the suitable hydration method was used. Liposomes were
characterized by dynamic light scattering. Voltammetry with glassy carbon electrode was
proved as useful for investigation of interactions of cadmium ions with liposomes. Thus
prepared liposomes will be used further as model system for study of transporting processes
of cadmium ions in the absence and in the presence of ionophore calcimycin and the
transporting conditions will be characterized and optimized.
Acknowledgement
The authors gratefully acknowledge the financial support by the GA AV CR (Project No.
P208/12/1645).
References
1. Klusackova P., Lebedova J., Kacer P., Kuzma M., Brabec M., Pelclova D., Fenclova Z.,
Navratil T.: Prostag. Leukotr. Ess. 78, 281 (2008).
2. Navratil T., Petr M., Senholdova Z., Pristoupilova K., Pristoupil T. I., Heyrovsky M.,
Pelclova D., Kohlikova E.: Physiol. Res. 56, 113 (2007).
3. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D., Navratil T.: Curr. Org. Chem. 15, 2970 (2011).
4. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Marecek V.: Int. J.
Electrochem. Sci. 8, 27 (2012).
5. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods
XXXII: Transport of copper ions in the presence and absence of ionophore calcimycin
and the influence of LMWOAs on this transport, Jetrichovice, (Navratil T., Fojta M.,
Eds.), www.bestservis.eu/upload/file/Sbornik_metody12.pdf, Best servis, Jetrichovice
2012, p. 102.
142
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
Novotny L., Navratil T., Sander S., Basova P.: Electroanalysis 15, 1687 (2003).
Sander S., Navratil T., Basova P., Novotny L.: Electroanalysis 14, 1133 (2002).
Sander S., Navratil T., Novotny L.: Electroanalysis 15, 1513 (2003).
Cizkova P., Navratil T., Sestakova I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007).
Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Sestakova I., Zins E. L., Schroder D., Navratil T.: Anal.
Chim. Acta 693, 100 (2011).
Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Int. J. Energy Env. 5, 337 (2011).
Navratil T., Kopanica M.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 153 (2002).
Navratil T., Sebkova S., Kopanica M.: Anal. Bioanal. Chem. 379, 294 (2004).
Jaklova Dytrtova J., Sestakova I., Jakl M., Navratil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009).
Sestakova I., Navratil T.: Bioinorg. Chem. Appl. 3, 43 (2005).
Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Marecek V.: 7th WSEAS
International Conference on Environment, Ecosystems and Development: Study of
charged particles transport across model and real phospholipid bilayers, Puerto de la
Cruz, SPAIN, (Otesteanu M., Celikyay S., Mastorakis N., Lache S., Benra F. K., Eds.),
World Scientific and Engineering Acad. and Soc., Puerto de la Cruz, SPAIN 2009, p.
212.
Jaklova Dytrtova J., Navratil T., Marecek V.: Collect. Czech. Chem. Commun. 76, 1917
(2011).
Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods XXXI:
Transport of divalent cations across the gel supported phospholipid membranes,
Jetrichovice, (Navratil T., Barek J., Eds.),
http://www.bestservis.eu/upload/file/Sbornik_metody11.pdf, Best servis, Jetrichovice
2011, p. 91.
Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Navratil T., Schroder D.: International Journal of
Electrochemical Sciences 8, 1623 (2013).
Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Development, Energy, Environment, Economics
(DEEE '10): Supported phospholipid bilayers and transport of heavy metals across them,
Puerto de la Cruz, (Mladenov V., Psarris K., Mastorakis N., Caballero A., Vachtsevanos
G., Eds.), Puerto de la Cruz 2010, p. 192.
Hsieh Y. F., Chen T. L., Wang Y. T., Chang J. H., Chang H. M.: J. Food Sci. 67, 2808
(2002).
Gregoriadis G.: Boca Raton, Florida, USA, CRC Press 3, 1 (1984).
Dua J. S., Rana, A. C., Bhandari, A. K.,: Interantional Journal of Pharmaceutical Studies
and Research 3, 14 (2012).
Lasic D.: Am. Sci. 80, 20 (1992).
Lipowsky R.: Nature 349, 475 (1991).
Bangham A. D.: Prog. Biophys. Mol. Biol. 18, 29 (1968).
143
Very Fast Electrophoretic Determination of Creatinine and Uric Acid in Human Urine
using a Combination of Two Capillaries with Different Inner Diameters
(Velmi rychlé elektroforetické stanovení kreatininu a kyseliny močové v lidské moči
pomocí spojení dvou kapilár o různých vnitřních průměrech)
Václav Pavlíček a and Petr Tůma a
a
Institute of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Third Faculty of Medicine, Charles
University in Prague, Ruská 87, 100 00 Prague 10, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
Very fast electrophoretic methods have been developed for determination of creatinine and
uric acid in human urine with diode-array detection. The separations were performed
in a laboratory-made combination of two capillaries with different inner diameters.
Determination of creatinine was successfully performed in 20 mM citric acid/NaOH (pH 3.0)
and the determination of uric acid in 30 mM MES/NaOH (pH 6.0) as background electrolytes.
The developed methods are characterized by a separation time around 10 s and limits
of detection 1.4 µM for both analytes. A dilution of the urine sample with water was the only
step necessary before the electrophoresis analysis.
Key words: Capillary electrophoresis, Creatinine, Diode-array detector, Uric acid.
Úvod
Mezi hojně stanovované analyty v lidské moči patří kreatinin a kyselina močová. Kreatinin je
cyklickým imidem kreatinu (Obr. 1). Kreatin je syntetizován v játrech a ledvinách z glycinu,
guanidinové skupiny argininu a methylové skupiny poskytované S-adenosylmethioninem 1.
Krví je dopraven do svalu, kde se vyskytuje ve fosforylované formě jako kreatinfosfát.
Zhruba 2 % kreatinfosfátu je denně cyklizováno na kreatinin, který je z těla vyloučen jako
odpadní látka. Kreatinin vzniká ve svalech jako konečný produkt degradace kreatinfosfátu.
Produkce a vylučování kreatininu jsou za normálních okolností rovnocenné. Veškerý
kreatinin přefiltrovaný ledvinami je z těla vyloučen močí. V tubulech není zpětně resorbován.
Vylučování kreatininu závisí na množství svalové hmoty, funkci ledvin a jeho příjmu
v potravě, především na příjmu masa a masných výrobků. Přítomnost kreatininu lze dokázat
v moči, mozku, krvi a svalové tkáni 2. Patologické hodnoty kreatininu mají různé druhy
původu 3,4. Stanovení koncentrace kreatininu má význam při sledování poruch funkce ledvin
a je nejčastěji prováděno Jaffého kolorimetrickou metodou 5,6. V současné době lze kreatinin
stanovit enzymatickou metodou 7, ale i řadou různých chromatografických systémů, jako
je kapalinová chromatografie s UV 8 a MS 9 detekcí (HPLC-UV/MS), vysokotlaká papírová
chromatografie (HPTLC) 10, plynová chromatografie s hmotnostní detekcí (GC-MS) 11
a kapilární elektroforéza (CE) 12-14.
.
Obr. 1. Neenzymatická přeměna kreatinu na kreatinin.
144
Kyselina močová (obr. 2) je u člověka a primátů konečným metabolitem purinů, které jsou
součástí nukleových kyselin a řady koenzymů (ATP, NAD+ aj.). Kyselina močová
je považována za významnou antioxidační látku 4. Některé studie však naznačují,
že kyselina močová vstupuje do buněk prostřednictvím specifických transportérů a vyvolává
zde prozánětlivé a prooxidační reakce. Porucha metabolismu kyseliny močové souvisí
se vznikem řady onemocnění, jako je dna, Lesch-Nyhanův syndrom aj. Její zvýšená
koncentrace v organismu (hyperurikémie) indikuje hypertenzi, kardiovaskulární a renální
onemocnění. V klinické praxi se stanovení kyseliny močové provádí enzymatickými
metodami. Nejběžnější z nich využívá oxidace kyseliny močové kyslíkem za katalýzy
enzymem urikázou na allantoin a peroxid vodíku. Využít lze však i řadu dalších metod, jako
je vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) 15, plynová chromatografie (GC) 16,
hmotnostní spektrometrie (MS)17 a kapilární elektroforéza (CE) 18.
Obr. 2. Strukturní vzorec kyseliny močové.
Experimentální část
Separace byly prováděny v laboratorně sestavené kapiláře vytvořené spojením dvou
standardních křemenných kapilár o vnějším průměru 363 µm (Composite Metal Services,
UK). Separační kapilára, vnitřní průměr 25 μm, délka 9,7 cm, a pomocná kapilára, vnitřní
průměr 100 μm, délka 22,9 cm, byly spojeny pomocí polyethylenové trubičky, jejíž vnitřní
průměr je o něco menší než vnější průměr spojovaných kapilár. Polyethylenová trubička
o délce cca 1 cm byla nahřáta pomocí horkovzdušné pistole na 450 °C a poté převlečena přes
rovně zaříznuté konce obou kapilár. Tím bylo vytvořeno hydrodynamicky těsné spojení dvou
elektroforetických kapilár, které je elektricky izolované 19. Kapilára byla vložena do kazety
elektroforetického přístroje (HP3D CE, Agilent Technologies) a separace byly prováděny při
dávkování z krátkého konce kapiláry. Vzdálenost injekčního konce kapiláry k diode-array
detektoru byla 8,2 cm.
Před použitím byla nová kapilára aktivována promytím 0,1 M roztokem NaOH po dobu
15 min, poté 10 min deionizovanou vodou a na závěr 10 min separačním elektrolytem. Mezi
jednotlivými analýzami modelových vzorků i upravené moče byla kapilára promývána pouze
separačním elektrolytem po 2 min. Pro stanovení kreatininu byl elektroosmotický tok
v kapiláře potlačen pokrytím kapiláry komerčním roztokem (INST coating solution, Biotaq,
USA) po dobu 2 min. Vzorek byl dávkován hydrodynamicky tlakem 50 mbar po dobu 5 s.
Separace probíhaly při napětí +25 kV a konstantní teplotě 25 °C. Pro statistické zpracování
dat byl použit program Origin 8.0 (OriginLab Corporation, USA).
Veškeré použité chemikálie vykazovaly analytický stupeň čistoty: kyselina citronová (Penta,
ČR), kyselina močová (Fluka), hydroxid sodný (Fluka), kyselina p-aminosalicylová (PAS,
Sigma - Aldrich), 2-(N-morpholin)ethansulfonová kyselina (MES, Sigma – Aldrich),
kreatinin (Fluka). K přípravě separačních elektrolytů a zásobních roztoků standardů byla
použita deionizovaná voda (18,2 MΩ.cm, Millipore, Bedford, USA). Standardní roztoky
kreatininu, kyseliny močové a PAS o koncentraci 1 mg.ml-1 byly získány rozpuštěním
pevných látek v deionizované vodě; přídavek 1 M NaOH byl použit k úplnému rozpuštění
kyseliny močové a PAS. Separační pufry (BGE) o složení 30 mM MES + 15 mM NaOH (pH
145
6,0) a 20 mM kyselina citronová + 9 mM NaOH (pH 3,0) byly připravovány každý den
čerstvé. pH bylo měřeno laboratorním pH metrem pMX 3000 WTW (Německo).
Vzorky moči byly filtrovány přes centrifugační filtry (Amicon, Millipore, USA) při 14 100 ot.
min-1 po 3 minuty a uchovávány v plastových uzavíratelných zkumavkách při teplotě 2 °C.
Před elektroforetickou separací byly vzorky temperovány na laboratorní teplotu, poté
zpracovány dle následující metodiky: Pro stanovení kreatininu v moči bylo 20 l vzorku
smícháno s 980 l deionizované vody. Pro stanovení kyseliny močové v moči bylo 20 l
vzorku smícháno s 20 l 1 mg.ml-1 roztoku kyseliny p-aminosalicylové (PAS) a 960 l
deionizované vody. Tímto postupem je získán 50krát zředěný vzorek. Výsledná koncentrace
PAS je 20 mg.l-1, jež je použita jako vnitřní standard pro zvýšení přesnosti elektroforetického
stanovení.
16
kreatinin
Signal (mAU), 191 nm
Výsledky a diskuze
Moč jako komplexní vzorek obsahuje značné množství ionizovatelných látek, které mohou
potenciálně ovlivnit elektroforetické stanovení. Z tohoto důvodu je důležitá správná volba
separačního pufru (BGE), ve kterém dochází k úplnému oddělení analytu od ostatních složek
moče. Kreatinin je dusíkatý heterocyklus s hodnotou pKa 4,8. V kyselém BGE o složení
20 mM kyselina citronová
9 mM NaOH (pH 3,0) migruje jako kationt. Pro omezení
adsorpce kreatininu na stěnu kapiláry byla separace provedena v pokryté kapiláře
se zastaveným elektroosmotickým tokem v kationtovém módu při napětí 25 kV.
Na elektroferogramu, 50krát ředěné lidské moče je patrný výrazný, dobře kvantifikovatelný
pík kreatininu, viz obr. 3.
14
12
10
8
6
4
2
0
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
čas [s]
Obr. 3. Záznam elektroforetického stanovení kreatininu v lidské moči, po 50násobném
zředění (36,9 mg.l-1). Experimentální podmínky: separační elektrolyt; 20 mM kyselina
citronová 9 mM NaOH (pH 3,0), hydrodynamické dávkování 250 mbar.s, napětí 25 kV,
UV detekce při 191 nm.
Kyselina močová je slabá dvojsytná kyselina s hodnotou pKa 5,4. Pro CE stanovení kyseliny
močové byl testován separační elektrolyt o složení: 30 mM MES + 15 mM NaOH (pH 6,0)
a separace byla provedena v kationtovém módu při napětí 25 kV. Za těchto podmínek
migruje kyselina močová jako aniont proti elektroosmotickému toku, který je při pH 6,0
146
PAS
8
kyselina močová
Signal (mAU), 292 nm
rychlý a strhne kyselinu močovou do detektoru. Elektroferogram 50krát ředěné lidské moči
s přídavkem interního standardu PAS je znázorněn na obr. 4.
7
6
5
4
3
2
1
0
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
čas [s]
Obr. 4. Záznam elektroforetického stanovení kyseliny močové v lidské moči, po 50násobném
zředění (8,8 mg.l-1). Koncentrace PAS 20 mg.l-1. Experimentální podmínky: separační
elektrolyt; 30 mM MES 15 mM NaOH (pH 6,0), hydrodynamické dávkování 250 mbar.s,
napětí 25 kV, UV detekce při 292 nm.
Kvalitativní i kvantitativní parametry stanovení kreatininu a kyseliny močové jsou shrnuty
v tabulce I.
Tabulka I.
Migrační čas (tM), počet teoretických pater (N), limity detekce (LOD), citlivost a korelační
koeficient (R) v 50krát ředěné moči s přídavkem kreatininu a kyseliny močové
v koncentračním rozmezí 0 až 70 mg.l-1. Hodnoty RSD byly určeny pro 3 analýzy jednoho
vzorku moče. Vzorek moče obsahoval 37 mg.l-1 kreatininu a 9 mg.l-1 kyseliny močové.
Parametr
Analyt
kreatinin
kyselina močová
tM, s
10,6
10,1
-1
N, m
401000
253000
N, s-1
3300
2180
-1
LOD, mg.l
0,16
0,23
LOD, µM
1,41
1,37
-1
Citlivost, mAU.mg.l
0,112
0,149
R
0,998
0,998
RSD pro tM, %
0,8
4,3
RSD pro plochu píku, %
4,4
3,7
Fyziologické hodnoty v moči, mM
5,7 – 14,7
1,5 – 4,5
Hodnoty LOD byly určeny jako výška píku odpovídající trojnásobku průměrné hodnoty
šumu.
147
Vyvinuté metodiky poskytují pro oba sledované analyty velmi krátké migrační časy kolem
10 s. Počet teoretických pater (N) se pohybuje kolem 400 tisíc na metr kapiláry pro kreatinin
a 250 tisíc pater/m pro kyselinu močovou. Pro velmi rychlé separace je vhodnější vyjádřit
separační účinnost jako N za jednotku času (N/tM), která lépe vystihuje rychlost separačního
procesu 20; 3300 s-1 pro kreatinin a 2180 s-1 pro kyselinu močovou. Dosažené LOD v moči
se pro oba analyty pohybují kolem 1 µM. Tyto LOD jsou dostatečně nízké pro kvantifikaci
kreatininu i kyseliny močové v 50krát ředěných vzorcích moče. Získané relativní směrodatné
odchylky (RSD) pro migrační čas i plochu píku byly určeny ze 3 následných analýz jednoho
vzorku moče a odpovídají běžným hodnotám pro CE analýzu.
Závěr
Spojením dvou kapilár o různých vnitřních průměrech se podařilo zvýšit hodnotu intenzity
elektrického pole v kapiláře na cca 3 kV/cm. Za těchto podmínek jsou dosažené migrační časy
pro kreatinin a kyselinu močovou cca 10 s. Vyvinutá metodika velmi rychlého stanovení obou
analytů je dostatečně citlivá pro jejich monitorování v lidské moči. Je zřejmé, že spojená
kapilára je účinným nástrojem pro velmi rychlé elektroforetické separace, které se v budoucnu
mohou stát silným partnerem nejen pro klinickou analýzu.
Poděkování
Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury Univerzity Karlovy, grant č. 389111
a UNCE 204015.
Literatura
1. Čermáková M., Štěpánová I.: Klinická biochemie 1.díl, NCO NZO. Brno 2003.
2. Murray R. K., et al.: Harperova biochemie, 4. vyd.. H&H 1998.
3. Masopust J.: Požadování a hodnocení biochemických vyšetření, Karolinum. Praha1998.
4. Racek J., et al.: Klinická biochemie, Galén. Praha 2006.
5. https://www.erbalachema.com/attachments/CREAT%20L%20500-CZ+SK+EN+RU.pdf,
Downloaded 20. 2. 2013.
6. Jaffé M. Z.: Physiol. Chem. 10, 391 (1886).
7. Dastych M., et al.: Klinická biochemie, LF MU. Brno 2008.
8. Werner G., Schneider V., Emmert J.: J. Chromatogr. 525, 265 (1990).
9. Takatsu A., Nishi S.: Biol. Mass Spectrom. 22, 643 (1993).
10. Klaus R., Fischer W., Hauk H. E.: Chromatographia 32, 307 (1991).
11. Welch M. J., Cohen A., Hertz H. S., Ng K. J., Schaffer R., Van Der Lijn, P., White, E.:
Anal. Chem. 58, 1681 (1986).
12. Rodríguez J., Berzas J. J., Castaneda, G., Mora, N., Rodrígez J., M.: Anal. Chim. Acta.
521, 53 (2004).
13. Costa O. A. C., Da Costa L. J., Tonin G. F., Tavares M. F. M., Micke, A. G., J.:
Chromatogr. A. 1171, 140 (2007).
14. Tůma P., Samcová E., Duška F.: J. Sep. Sci. 31, 2260 (2008).
15. Kanďár R., Žáková P., Mocová P., Skalický J., Kovařík J.: Klin. Biochem. Metab. 18, 167
(2010).
16. Lakshmi D., Whitcombe M. J., Davis F., Skarun P. S., Prasad B. B.: Electroanalysis. 23,
305 (2011).
17. Chen X. B., Calder A. G., Prasitkusol P., Kyle D. J., Jayasuriya M. C.: J. Mass Spectrom.
33, 130 (1998).
18. Pormsila W., Krähenbühl S., Hauser P. C.: Anal. Chim. Acta. 636, 224 (2009).
19. Tůma P., Opekar F., Samcová E.: Electrophoresis. 34, 522 (2013).
20. Monnig C. A., Jorgensen J. W.: Anal. Chem. 63, 802 (1991).
148
Adsorptive Transfer Stripping Voltammetry in DNA and RNA Oligomer Research
Iveta Pilařová a, Zdeňka Balcarová a, and Libuše Trnková a, b
a
Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5,
625 00 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected], [email protected]
b
Central European Institute of Technology – CEITEC, Brno, University of Technology,
Technická 3058/10, CZ–616 00 Brno, Czech Republic
Abstract
Adsorptive transfer stripping (AdTS) technique in combination with electrochemical methods,
such as cyclic voltammetry (CV), linear sweep voltammetry (LSV) and elimination
voltammetry with linear scan (EVLS), was applied for the electrochemical investigation of
DNA and RNA oligomers with sequences d(GCGAAGC), r(GCGAAGC) and d(GCGAGC),
forming hairpins. On the mercury electrode in buffered aqueous solutions, all the oligomers
studied provide reduction signals of adenine and cytosine and an oxidation signal of guanine.
The AdTS voltammetry at pH 1.8, 5.8 and 12.8 showed differences between DNA and RNA
fragments and confirmed that the shortest and most stable hairpin is formed by the DNA
heptamer d(GCGAAGC).
Key words: Adsorptive transfer stripping, hairpins, DNA heptamer d(GCGAAGC),
neurodegenerative diseases, voltammetric methods, mercury electrode.
Introduction
Adsorptive transfer stripping voltammetry (AdTSV) presents a new analytical method, based
on the adsorptive preconcentration of biomacromolecules on the electrode, the transfer of the
adsorbed layer into a new medium containing supporting electrolyte and subsequent
voltammetric analysis. It is known, that the combination of cyclic voltammetry with
adsorptive transfer stripping is a suitable tool for the anaylsis of nucleic acids. In addition,
AdTS enables us not only to perform voltammetric analysis of biomacromolecules adsorbed
from media not suitable for voltammetric analysis of the conventional type, but also to utilize
the differences in the adsorbability of substances to separate them on the electrode 1.
Nowadays, great attention has been devoted to the electrochemical study of DNA and RNA
oligomers, forming hairpin or hairpins–like structures in dependence on the number of bases
in the chain.
Hairpins, consisting of single-stranded loop and base–paired stem regions and naturally
occurring not only in single-stranded DNAs and RNAs but also in double–stranded DNAs 2-4,
are very important in many biological processes. They play a crucial role in expansion events
of triplet repeat expansion associated with neurodegenerative diseases, such as fragile
chromosome X syndrome, Huntington’ disease, Friedreich’ ataxia, or myoclonic epilepsy.
The shortest and most stable hairpin is formed by the DNA heptamer d(GCGAAGC). This
sequence is found in replication origins of phage ФX 174 4, 5 and herpes simplex virus 4, 6, in
the promoter region of an Escherichia coli heat-shock gene 4, 7, and in rRNA genes 4, 8. Our
contribution deals with the application of adsorptive transfer stripping in combination with
cyclic voltammetry (CV), linear sweep voltammetry (LSV), and elimination voltammetry
with linear scan (EVLS) for the investigation of DNA and RNA heptamers – d(GCGAAGC)
and r(GCGAAGC) respectively, and DNA hexamer – d(GCGAGC) on the mercury electrode.
Experimental
Chemicals
The lyophilized samples of DNA and RNA oligomers – d(GCGAAGC), r(GCGAAGC) and
d(GCGAGC) were purchased from Integrated DNA Technologies, Inc., USA. The exact
concentration of all the oligomers studied was determined by UV/VIS spectroscopy.
149
Phosphate–acetate buffer as the supporting electrolyte was prepared as a mixture of acetic
acid (glacial, Sigma Aldrich; ACS reagent), phosphoric acid (84%; p.a.; Penta Chrudim) and
sodium hydroxide (Sigma Aldrich; 97%; p.a.). All solutions were prepared in distilled MILI
Q water.
Methods
The voltammetric experiment was carried out using the electrochemical analyzer AUTOLAB
PGSTAT 20 (EcoChemie, Utrecht, The Netherlands). A solution of DNA or RNA oligomer
sample with a concentration of 5·10-5 mol·L-1 was injected into the polarographic vessel
equipped with three electrodes: a hanging mercury drop electrode (HMDE) as the working
electrode, and Ag/AgCl/3M KCl and Pt wire as a reference and an auxiliary electrode,
respectively. The phosphate-acetate buffer (pH 1.8, 5.8 and 12.8) was used as the supporting
electrolyte. In the first step, adsorptive transfer stripping followed by voltammetric analysis
was performed.
Adsorptive transfer stripping voltammetry (AdTSV)
Fifty μl of phosphate-acetate buffer (pH 1.8, 5.8 and 12.8) with the addition of the sample
measured (DNA, RNA oligomer; c = 5·10-5 mol·L-1) is put on the parafilm and afterwards it
is adsorbed on HMDE for 120 s. In the next step, this adsorbed layer is transferred into water
and then into the new medium containing only the supporting electrolyte (phosphate–acetate
buffer; pH 5.8), and the voltammetric analysis is carried out. The LSV curves were measured
in a potential range from 0 to -1.7 V at scan rates from 100 to 800 mV/s. From the smoothed
voltammetric curves (Savitzky-Golay filter, level 2), the elimination function E4 with
simultaneous elimination of kinetic and charging currents and diffusion current conservation,
according to EVLS E4 equation 9-12: f(I) = 17.485I-11.657I1/2-5.8584I2, was calculated.
Results and discussion
In cyclic voltammetry (CV) the DNA and RNA oligomers studied provide typical reduction
signals of adenine (A) and cytosine (C) and an oxidation signal of guanine (G) on the mercury
electrode (HMDE) in buffered aqueous solution (phosphate–acetate buffer). The oxidation
peak of guanine (G peak) corresponds to the oxidation of reduced product of G (7,8dihydrogenguanine) formed at very negative potentials with hydrogen discharge 13.
-0.1
Cathodic part
-0.3
AdTS from pH 12.8 to pH 5.8
-0.7
AdTS from pH 5.8 to 5.8
AdTS from pH 1.8 to pH 5.8
-0.9
-1.1
A+C peaks
-1.3
-1.5
-1500
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
-0.02
-0.04
-0.06
-0.08
-0.1
-1400
-1300
E [mV]
-1200
-1100
-1000
EVLS E4 AdTS from pH 12.8 to
pH 5.8
EVLS E4 AdTS from pH 5.8 to pH
5.8
EVLS E4 AdTS from pH 1.8 to pH
5.8
-1450
-1400
-1350
-1300
-1250
-1200
Cathodic part
E [mV]
0.8
GII
Anodic part
0.6
AdTS from pH 12.8 to pH 5.8
AdTS from pH 5.8 to pH 5.8
GI
AdTS from pH 1.8 to pH 5.8
0.2
0
-0.2 -350
-0.4
G peaks
-0.6
-0.8
-500
-400
Anodic part
0.4
f (I)
I [μA]
f (I)
I [μA]
-0.5
4
3
2
1
0
-1-1500
-2
-3
-4
-5
-6
-300 E [mV] -200
-100
0
-1
-300
-250
-200
EVLS E4 AdTS from pH 12.8 to
pH 5.8
EVLS E4 AdTS from pH 5.8 to pH
5.8
EVLS E4 AdTS from pH 1.8 to pH
5.8
E [mV]
Fig. 1. Adsorptive transfer stripping of DNA heptamer d(GCGAAGC).
150
-150
-100
-50
Both signals are studied by CV, LSV and EVLS in combination with adsorptive transfer
stripping technique which enabled us to utilize differences in the adsorbability of substances
to separate them on the electrode (accumulation time ta 120 s). The voltammetric curves
obtained are divided into two parts: (a) a cathodic part, involving the reduction signals of A
and C residua and (b) an anodic part, involving the oxidation signals of the G residua of the
DNA and RNA oligomer studied.
Cathodic part: It follows from Fig.1 that the LSV experiment provides two, quite huge
reduction signals of A and C residua in the more negative potential region. The best resolution
of these signals is observed in the case of AdTS of DNA heptamer from a buffer with pH 12.8
to pH 5.8. The highest signals are monitored for DNA heptamer from a buffer with pH 5.8 to
buffer with pH 5.8. In contrast, the lowest signal without well readable current maxima in the
case of AdTS from a solution with pH 1.8 to pH 5.8 is monitored. Elimination voltammetry
with linear scan (EVLS E4) in combination with adsorptive transfer stripping yields a twofold increase of reduction signals.
Anodic part: The LSV experiment yields two oxidation signals of guanine residua, GI (~ -300
mV) and GII (~ -200 mV) of the DNA heptamer studied. In addition, the GI signal is
significantly higher than the GII signal in the case of AdTS of DNA heptamer studied from
buffer with pH 5.8 to pH 5.8 and AdTS from pH 12.8 to pH 5.8. Compared to AdTS from a
buffer with pH 1.8 to pH 5.8, both oxidation signals are sharp and narrow. It can be seen that
decreasing the pH value of the buffer in which the DNA heptamer studied is adsorbed causes
a shift of GI and GII peaks into the more positive potential region. EVLS in combination with
AdTS verified the adsorption of guanine residua of the DNA heptamer studied on the
electrode (readable peak – counterpeak signals).
3
-0.1
Cathodic part
-0.3
-0.5
EVLS E4 AdTS from pH 5.8 to pH
5.8
1
-0.7
EVLS E4 AdTS from pH 1.8 to pH
5.8
AdTS from pH 12.8 to pH 5.8
f (I)
I [μA]
EVLS E4 AdTS from pH 12.8 to
pH 5.8
2
0
-1500
-1
AdTS from pH 5.8 to pH 5.8
-0.9
AdTS from pH 1.8 to pH 5.8
-1.1
A+C peaks
-1.3
-1.5
-1500
-1400
-1300
E [mV]
-1200
-1100
-1000
-1350
-1300
-1250
-1200
Cathodic part
-3
E [mV]
1.5
G peaks
0.15
EVLS E4 AdTS from pH 12.8 to
pH 5.8
1
AdTS from pH 12.8 to pH 5.8
EVLS E4 AdTS from pH 5.8 to pH
5.8
AdTS from pH 5.8 to pH 5.8
AdTS from pH 1.8 to pH 5.8
0.5
0.05
EVLS E4 AdTS from pH 1.8 to pH
5.8
f (I)
I [μA]
-1400
-2
0.2
0.1
-1450
0
0
-0.05
-350
Anodic part
-0.5
-0.1
-500
-400
-300
E [mV]
-200
-100
0
-300
-250
-200
-150
-100
-50
Anodic part
-1
E [mV]
Fig. 2. Adsorptive transfer stripping of RNA heptamer r(GCGAAGC).
Cathodic part: Compared to DNA heptamer, RNA heptamer yields only one reduction signal
of A and C residua on the HMDE. The highest reduction signal is observed in the case of
AdTS of the RNA heptamer studied from a buffer with pH 1.8 to pH 5.8. EVLS verified the
151
adsorption of adenine and cytosine residua on the electrode (readable peak – counterpeak
signal).
Anodic part: RNA heptamer yields only one sharp oxidation signal of guanine residua
(~ -200 mV). The decreasing pH value of the buffer in which the RNA heptamer is adsorbed
causes a shift of the G signals into the more positive potential region. In addition, it follows
from Fig. 2 that the intensity of G signals of RNA heptamer (Ip = 0.13 μA) is significantly
higher than in the case of DNA heptamer (Ip = 0.04 μA). EVLS in combination with
adsorptive stripping verified the adsorption of guanine residua on the HMDE (readable peak–
counterpeak signals).
Apart from the DNA and RNA heptamer also the DNA hexamer was studied.
1
-0.1
Cathodic part
EVLS E4 AdTS from pH 12.8 to pH 5.8
0.5
I [μA]
-0.5
f (I)
-0.3
AdTS from pH 12.8 to pH 5.8
-0.7
AdTS from pH 5.8 to pH 5.8
AdTS from pH 1.8 to pH 5.8
-0.9
-1.1
-1450
-1400
-1350
-1.5
-1.5
-1500
-1400
-1300
E [mV]
-1200
-1100
-1300
-1250
-1200
Cathodic part
-2
-1000
E [mV]
0.06
0.5
0.04
AdTS from pH 12.8 to pH 5.8
AdTS from pH 5.8 to pH 5.8
0.02
EVLS E4 AdTS from pH 12.8 to pH
5.8
G II
GI
0.3
G peaks
AdTS from pH 1.8 to pH 5.8
EVLS E4 AdTS from pH 5.8 to pH
5.8
EVLS E4 AdTS from pH 1.8 to pH
5.8
0.1
0
f (I)
I [μA]
EVLS E4 AdTS from pH 1.8 to pH 5.8
-1
A+C peaks
-1.3
0
-1500
-0.5
EVLS E4 AdTS from pH 5.8 to pH 5.8
-0.02
-0.04
-0.1 -350
-300
-250
-200
-150
-100
-50
-0.3
-0.06
Anodic part
-0.5
-0.08
-500
-400
-300 E[mV] -200
-100
0
Anodic part
-0.7
E [mV]
Fig 3. Adsorptive transfer stripping of DNA hexamer d(GCGAGC).
Cathodic part: The DNA hexamer studied provides two, quite identical reduction signals of
adenine and cytosine residua. It can be stated that the character of these signals is not changed
with the increasing pH value of the buffer in which the DNA hexamer studied is adsorbed,
compared to the heptamers studied. EVLS in combination with AdTS yields significantly
resolved reduction signals of A and C residua.
Anodic part: Analogous to the DNA heptamer, also the DNA hexamer provides two oxidation
guanine signals GI (~ -300 mV) and GII (~ -200 mV) and the character of these signals is not
changed with the increasing pH value of the buffer in which the hexamer studied is adsorbed.
EVLS in combination with adsorptive stripping verified the adsorption of guanine residua of
the hexamer studied on the electrode (readable peak–counterpeak signal).
Conclusion
The DNA and RNA oligomers studied provided the typical reduction signals of adenine and
guanine residua and oxidation signals of guanine, on the mercury electrode in aqueous
buffered solutions (phosphate–acetate buffer; pH 1.8, 5.8 and 12.8). It was found that DNA
oligomers provided two reduction signals of adenine and cytosine residua which in the case of
DNA heptamer d(GCGAAGC), are quite huge and with worse readable current maxima Ip.
The intensity of reduction signals is changed with increasing pH. It can be stated that the
152
highest effectivity of adsorption is noted in the case of AdTS in the more alkaline buffered
media. In the case of DNA hexamer d(GCGACG) we obtain two identical reduction signals
without any effect of pH on the intensity of the reduction signals obtained. And, for this
reason, we can conclude, that the effectivity of the hexamer studied is similar in all media
buffered. Concerning the oxidation signals of G it was found that DNA oligomers yielded two
G oxidation signals, GI (~ -300 mV) and GII (~ -200 mV) on the HMDE. These oxidation
signals are in the case of DNA heptamer shifted into the more positive potential region with
the decreasing pH value of the buffer in which the heptamer studied is adsorbed. AdST EVLS
verified the adsorption of G residua on the electrode (readable peak– counterpeak signals).
The RNA heptamer r(GCGAAGC) yielded only one reduction signal of A and C residua of
the heptamer studied. Analogous to DNA heptamer, the intensity of the reduction signals is
changed with increasing pH and the highest effectivity of adsorption is noted in the case of
AdTS in the more acidic buffered media. Compared to the DNA oligomers studied, the RNA
heptamer provided only one oxidation signal of guanine residua. This oxidation signal is
shifted into the more positive potential region as the effect of the decreasing pH value of the
buffer in which the RNA heptamer studied is adsorbed. AdTS EVLS verified the adsorption
of A, C and G residua on the mercury electrode (readable peak – counterpeak signals).
Acknowledgement
This research was supported by (a) the CEITEC – Central European Institute of Technology
Project CZ.1.05/1.1.00/02.0068, (b) MUNI/A/0992/2009 project of the Ministry of Education,
Youth and Sports of the Czech Republic and (c) the OPVK project (NanoBioMetalNet)
CZ.1.07/2.4.00/31.0023. The authors wish to thank Metrohm Company for the possibility of
presenting these results.
References
1. Palecek E., Postbieglova I.: J. Electroanal. Chem. 214, 359 (1986).
2. Hirao I., Nishimura Y., Naraoka T., Watanabe K., Arata Y., Miura K.: Nucleic Acids
Research. 17, 2223 (1989).
3. Yoshizawa S., Kawai G., Watanabe K., Miura K., Hirao I.: Biochemistry. 36, 4761
(1997).4. Trnkova L., Postbieglova I., Holik M.: Bioelectrochemistry. 63, 25 (2004).
5. Arai K., Low R., Kobori J., Shlomai J., Kornberg A.: Journal of Biological Chemistry,256,
5273 (1981).
6. Elias P., Lehman I.R.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America. 85, 2959 (1988).
7. Cowing D.W., Bardwell J.C.A., Craig E.A., Woolford C., Hendrix R.W., Gross C.A.:
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82,
2679 (1985).
8. Hirao I., Kawai G., Yoshizawa S., Nishimura Y., Ishido Y., Watanabe K., Miura K.,
Nucleic Acids Research, 22, 576 (1994).
9. Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996).
10. Dracka O., Trnkova L.: J. Electroanal. Chem. 413, 123 (1996).
11. Trnkova L.: Application of elimination voltammetry with linear scan in bioelectrochemistry. In: Utilizing of bio-electrochemical and mathematical methods in
biological research. Ed.: Adam V. and Kizek R., Signpost, Kerala, Chapter 4, p. 51
(2007).
12. Trnkova L., Friml J., Dracka O.: Bioelectrochemistry. 54, 131 (2001).
13. Studničková M., Trnková L., Zetěk J., Glatz Z.: Bioelectrochem. Bioenerg. 21, 83 (1989).
153
Preparation of DNA Probes for Electrochemical Bioassays by Sequence-Specific
Incorporation of a Single or More Redox Labels into a DNA-Strand
(Příprava DNA sond pro elektrochemické bioanalytické aplikace pomocí sekvenčně
specifické inkorporace jedné nebo více redoxních značek do řetězce DNA)
Medard Plucnara a, Petra Ménová b, Jana Balintová b, Hana Macíčková-Cahová b,
Luděk Havran a, Michal Hocek b, and Miroslav Fojta a
a
Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic
b
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, AS CR, v.v.i., Flemingovo nam. 2,
166 10 Prague 6, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Incorporation of different types of labels into DNA strand by single step primer extension
reaction is for a long time commonly used method for preparing products bearing labels in
whole synthesized strand. Drawback of single-step primer extension procedure is global
modification of the whole synthesized DNA stretch which may affect structure and
interactions of the DNA (protein-binding ability, stability of double helix and others) in an
undesirable way. For these reasons development of two- or multistep techniques enabling
introduction of a single label or combination of labels only into specific positions in DNA
sequence is subject of our research.
Key words: Electrochemical labeling of DNA, Enzymatic incorporation, Ligation,
Multipotential DNA coding.
Úvod
Podstatnou předností elektrochemického značení je zejména nižší cena a konstrukční
jednoduchost měřících zařízení. To by mohlo být jejich hlavním přínosem ve srovnání
s optickými metodami využívajícími fluorescenčního značení. V naší práci vyvíjíme nové
způsoby značení nukleových kyselin různými elektrochemicky aktivními skupinami, které by
umožnily jejich efektivnější aplikaci pro nejpoužívanější typy analýz, jako je detekce
hybridizace DNA, identifikace jednonukleotidových polymorfismů, detekce interakcí proteinů
s DNA apod. 1, 2 Kromě samotných bioanalytických aplikací je součástí tohoto výzkumu
rovněž problematika vlivu chemické modifikace DNA na její interakce s dalšími molekulami,
včetně komplementárních vláken DNA a specifických bílkovin. Příprava značených DNA
sond je obvykle založena na enzymatické inkorporaci jedné nebo více různých
elektrochemických značek do jediného řetězce prodloužením primeru („primer extension“
dále „PEx“) v jednom kroku. U takto připravených řetězců nesoucích různé kombinace
značek se sleduje korelace intenzity signálů se zastoupením příslušně značených nukleotidů
v sekvenci (tzv. vícepotenciálové kódování), čehož lze v principu využít pro detekci změn
zastoupení jednotlivých bazí v dané sekvenci. V případě jednokrokové PEx metody dochází
k inkorporaci značených (tj. chemicky modifikovaných) nukleotidů do celého
syntetizovaného úseku, což je pro některé aplikace nežádoucí (modifikace DNA podél jejího
delšího úseku může např. ovlivnit interakce této DNA s proteiny nebo ovlivnit stabilitu
dvoušroubovice DNA). V jiných případech je pak výhodné vkládat modifikovanou
nukleobázi do přesně definovaného místa v DNA (studium vlivu modifikace DNA na
interakce s proteiny na úrovni jednonukoetidového rozlišení). Pro tyto účely jsme vyvinuli
dvoukrokové techniky konstrukce sekvenčně-specificky modifikovaných DNA sond.
Experimentální část
Jedním ze způsobů zavádění značky na jedno konkrétní místo uvnitř sekvence je enzymatická
inkorporace PEx reakcí o dvou krocích s využitím primeru, přiléhajícího 3´ - koncem
k modifikovanému místu 3. V tomto případě dojde v prvním kroku při ideálním molárním
poměru primeru (1 : 1,3) a značeného trifosfátu k prodloužení primeru o jednu modifikovanou
154
bázi. Následným přídavkem přebytku nemodifikovaných nukleosid trifosfátů je poté řetězec
dosyntetizován (Obr. 1A). Vzniká zpravidla směs produktů, ve které proporce
modifikovaných řetězců závisí na úspěšnosti prvního kroku PEx reakce. Pro inkorporace
značených nukleotidů do řetězce byla použita polymeráza KOD XL. Templáty jsou značené
biotinem na 5´-konci. Duplex je izolován ze směsi s využitím magnetických částic se
streptavidinem. Modifikované ssDNA řetězce jsou izolovány následnou tepelnou denaturací
při 75 °C.
Jinou možností je připojení zbytku řetězce ke 3´ - koncovému modifikovanému nukleotidu
primeru DNA ligázou (Obr. 1B). U této metody je zajištěna přítomnost značeného nukleotidu
v řetězci o plné délce, neboť v případě absence značeného nukleotidu na 3´-konci primeru
nemůže dojít k ligaci. V prvním kroku se provede připojení značené báze podobně jako
v předchozí variantě. Poté, ještě před samotnou ligací, je provedena purifikace řetězců pomocí
soupravy „Nucleotide removal kit“ (Quiagen). Následuje přídavek ligázy spolu s ligovaným
řetězcem do směsi a inkubace 30 min. při 16 °C. Tento experiment je zatím ve fázi
optimalizace.
Obr. 1. Schéma provedení monoinkorporace s využitím dvoustupňové PEx reakce (A), resp.
s využitím ligace T4 DNA ligázou.
Výsledky a diskuze
Na Obr. 2 je vidět výsledek monoinkorporace tří různých elektrochemických značek
s využitím obou výše uvedených postupů. V případě syntézy řetězce KOD XL polymerázou
byly úspěšně inkorporovány všechny typy modifikací a dvoukrokovou PEx reakcí (starty
9-12) se podařilo získat velmi dobrý výtěžek řetězců s monoinkorporovanou modifikovanou
bází uvnitř sekvence (50 nukleotidů dlouhý produkt). V případě ligace řetězce T4 ligázou
probíhá reakce méně účinně a za daných podmínek se podařilo získat cca 50 % úspěšně
dosyntetizovaných produktů (50 nt.) (starty 13-16). Je ale vidět, že ligáza toleruje přítomnost
modifikovaných nukleotidů na 3´-konci řetězce v místě ligace, jelikož se výrazněji neliší
zastoupení produktů v případě použití modikovaných konců značek od nemodifikované
kontroly. To je pro další aplikaci této metody klíčové zjištění.
155
Obr. 2. Monoinkorporace modifikovaného adeninu (vyznačen šipkou) do pozice 15 ve
vazebné sekvenci pPGM1: 1, 3, 5, 7 - kontrola – primer 15 +.14; 2, 4, 6, 8 – primer 15 + 14
prodloužený „PEx“ reakcí o 1 (modifikovaný) adenin, 9-12 řetězce dosyntetizované
polymerázou se směsí nemodifikovaných dNTP, 13-16 řetězce dosyntetizované připojením
zbytku řetězce ligázou; 2, 9, 13 A – nemodifikovaná kontrola; 4, 10, 14 A-NO2 (nitroskupina
vázaná přes fenyl); 6, 11, 15 A-EBF (benzofurazan vázaný přes ethinyl); 8, 12, 16 A-PAQ
(antrachinon vázaný přes propargyl). Sekvence primeru je podtržena, vazebná sekvence
pPGM1 je vyznačena žlutým obdelníkem.
Obr. 3. Porovnání intenzit signálů řetězců různým způsobem značených nitroskupinou.
Měřeno adsorpční přenosovou volumetrií na rtuti (HMDE).
Pro účely elektrochemických analýz byly do řetězce monoinkorporovány konjugáty různých
nukleotidů s nitroskupinou, která se pro enzymatickou inkorporaci a následnou
elektrochemickou detekci dosud dobře osvědčila 3. Tato značka poskytuje při cyklické
voltametrii ve zvoleném potenciálovém rozsahu (-0,2V
-0,65 V
0,1 V
-0,2V) tři
výrazné signály – ireverzibilní redukce nitroskupiny a reverzibilní oxidace vzniklého
hydroxylaminu na nitrososkupinu. Obrázek 3 ukazuje porovnání signálů plně modifikovaných
řetězců, primerů s jednou nitroskupinou na 3´-konci, resp. řetězce s jednou nitroskupinou
uvnitř sekvence, při měření cyklickou voltametrií na rtuťové elektrodě (HMDE). Je vidět, že
přítomnost jediné nitroskupiny uvnitř řetězce lze poměrně spolehlivě elektrochemicky
detekovat.
156
Obr. 4. Ukázka měření signálů řetězce modifikovaného bázemi nesoucími nitroskupinu,
a benzofurazan (BF) (vlevo), porovnání intenzit signálů obou skupin normalizovaných
velikostí píku G při jejich různém zastoupení v řetězci (vpravo).
V dalších experimentech jsme kombinovali značení DNA nitroskupinami se značením další
reducibilní organickou skupinou, benzofurazanem. Signály nitroskupiny a benzofurazanu na
HMDE bylo možno díky dostatečnému rozdílu potenciálu jejich ireverzibilní redukce (obr. 4
vlevo) pozorovat v jednom měření. Jak je patrno, za daných podmínek (bod obratu CV
při potenciálu -1.3 V) již detekovat signály oxidace hydroxylaminu a redukce nitrososkupiny
(viz obr. 3). Pokud je bod obratu posunut až do potenciálu -1,85 V, lze získat pík G
poskytovaný guaninovými zbytky v DNA (v obr 4 vlevo byl CV s bodem obratu při -1.8
V změřen jako druhý sken po změření CV s bodem obratu při -1.3 V, proto na této křivce již
nejsou píky redukce nitroskupiny a benzofurazanu). Pomocí píku G lze kvantifikovat
množství DNA ve vzorku a tudíž provést normalizaci signálů (výšky píků) inkorporovaných
značek na jednotkové množství DNA. Ve sloupcovém grafu (Obr. 4, vpravo) vidíme
porovnání intenzit signálů nitroskupiny (NO2 red.) a benzofurazanu (BF red.) normalizované
výškou G-píku v oligonukleotidech, kde jsou tyto značky zastoupeny v různém poměru. Je
patrný vztah mezi velikostí signálu a zastoupení značek v daném oligonukleotidu.
Závěr
U výše popsaných způsobů enzymatického značení řetězců DNA se podařilo získat výsledky
naznačující univerzálnost těchto postupů pro konstrukci DNA sond nesoucích různé značky
(modifikace). Některé postupy, například metoda využívající ligaci DNA v sousedství
značených nukleotidů, však ještě vyžadují optimalizaci postupu. Zvládnutí těchto metod
značení by přineslo mnoho relativně nenákladných možností přípravy sond prakticky
využitelných pro detekci polymorfizmů, vazebné experimenty, analýzy sekvence nukleových
kyselin a dalších typů analýz.
Poděkování
Tato práce vznikla díky podpoře grantů GA ČR (P206/12/G151) a GA AV ČR
(IAA400040901).
Literatura
1. Hocek M., Fojta M.: Chem. Soc. Rev. 40, 5802 (2011).
2. Cahova H., Havran L., Brazdilova P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.:
Angew. Chem. Int. Edit. 47, 2059 (2008).
3. Menova P., Cahová H., Plucnara M., Havran L., Fojta M., Hocek M. Chem. Commun in
press (2013).
157
Evaluation of Measured Data – Validation of a New Analytical Method
(Vyhodnocení naměřených dat - Validace nové analytické metody)
Petr Pořický
The Dukovany Nuclear Power Station, ČEZ, a. s., 675 50 Dukovany, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
The present contribution deals with validation of a new analytical method. The article
describes one of possible ways, how to realize this validation.
Key words: Analytical chemistry, Validation, Evaluation.
Úvod
Jeden z problémů je jak validovat novou analytickou metodu. V tomto článku je popsán jeden
z možných postupů jak validaci provést.
Experimentální část
1. Změří se sada vzorků původní metodou a novou metodou
2. Získaná data původní metodou se vynesou na osu x a na osu y data získaná novou metodou
3. Závislost se vyhodnotí metodou nejmenších čtverců pomocí regresního tripletu
4. Výsledný model se vyhodnotí
Příklad
Byla testována a porovnávána nová metoda stanovení koncentrace rozpuštěného kyslíku na
optickém principu s původní elektrochemickou metodou. Naměřená data (Tabulka I)
porovnejte a rozhodněte, zda nová optická metoda je vhodná pro stanovení koncentrace
rozpuštěného kyslíku.
Tabulka I
Porovnávaná naměřená data.
O2 [%] opt
2,686
2,943
O2 [%] pův 2,860
2,940
3,555
3,560
4,135
4,130
4,558
4,560
4,835
4,840
4,964
4,960
5,036
5,010
Výsledky a diskuse
Návrh modelu
Navrhneme regresní model (přímky) y = β0 + β1x, u které budeme testovat nulovou hypotézu
H0: β0 = 0, β1 = 1
Předběžná analýza dat
Poloha a proměnlivost proměnných y, x se posuzuje na základě průměru a směrodatné
odchylky hodnot každé proměnné. Pearsonův párový korelační koeficient ukazuje vysokou
korelaci proměnných y a x (Tabulka II).
Tabulka II
Předběžná analýza dat.
Proměnná Průměr
Y
X
4.1118E+00
4.1075E+00
Směrodatná odchylka Párový korelační
koeficient
8.8851E-01
1.0000
8.8658E-01
0.9999
158
Spočtená
hladina výz.
----0.000
Odhadování parametrů
Klasickou metodou nejmenších čtverců (MNČ) byly nalezeny odhady parametrů (Tabulka
III), úseku β0 a směrnice β1. Studentův t-test ukázal, že úsek (absolutní člen) β0 je statisticky
nevýznamný, zatímco směrnice β1 je statisticky významná, když t0,95(8-2) = 2,447.
Tabulka III.
Odhady parametrů získané MNČ.
Parametr Odhad
Směrodatná
odchylka
b0
-4.4653E-03
1.8944E-02
b1
1.0021E+00
4.5208E-03
H0: bj = 0 vs.
t-kriterium
-2.3571E-01
2.2167E+02
HA: bj <> 0
hypoteza H0 je
Akceptována
Zamítnuta
Spočtená
hlad. význam
0.821
0.000
Párový korelační koeficient r (Tabulka IV) ukazuje, že navržený lineární regresní model je
statisticky významný. Vysoká hodnota koeficientu determinace D (= 99,988%), představující
procento bodů vyhovujících regresnímu modelu, ukazuje, že všechny body výtečně
korespondují s modelem přímky. Střední kvadratická chyba predikce MEP a Akaikovo
informační kritérium AIC se užívají k rozlišení mezi několika navrženými modely. Za
optimální se považuje model, pro který dosahuje MEP a AIC minimálních hodnotu.
Tabulka IV
Základní statistické charakteristiky.
Vícenásobný korelační koeficient, r:
Koeficient determinace, D [%]:
Predikovaný korelační koeficient, R2p:
Střední kvadratická chyba predikce, MEP:
Akaikeho informační kritérium, AIC:
0.99994
99,988
0,99989
1.5470E-04
-7.1045E+01
Regresní diagnostika
Obsahuje pomůcky a postupy pro interaktivní analýzu (a) dat, (b) modelu, (c) metody, což
jsou složky regresního tripletu.
Kritika dat
Na základě grafu regresního modelu (Obr. 1) lze posoudit významnost nalezených odhadů
parametrů 0, 1.
Obr. 1. Graf regresního modelu
Rezidualní součet čtverců, RSC: 6.7471E-04
Průměr absolutních hodnot reziduí, Me: 7.0403E-03
Průměr relativních reziduí, Me,rel: 1.6578E-01
159
Odhad reziduálního rozptylu, s2(e): 1.1245E-04
Odhad směrodatné odchylky reziduí, s(e): 1.0604E-02
Odhad šikmosti reziduí, g1(e): 9.5110E-01
Odhad špičatosti reziduí, g2(e): 3.1118E+00
Odhad směrodatné odchylky s(e) se blíží svou velikostí experimentální chybě, kterou je
zatížena závisle proměnná. Odhad šikmosti a špičatosti prokazují normální rozdělení reziduí,
normalitu.
Grafy vlivných bodů
Grafy vlivných bodů (Obr. 2) jsou schopny indikovat přítomnost odlehlých hodnot a extrémů.
A
B
C
D
Obr. 2. A. Graf predikovaných reziduí; B. Pregibonův graf; C. Williamsův graf; D. L-R graf
Graf predikovaných reziduí ukazuje na odlehlý bod č. 8. Pregibonův graf ukazuje na silně
vlivný bod č. 8. Williamsův graf indikuje č. 8 jako odlehlý bod. L-R graf dokazuje extrém č.
8. Lze uzavřít, že bod č. 8 je většinou diagnostik indikován jako odlehlý.
Model
Vhodnost modelu se posuzuje přímo v grafu obsahujícím data a průběh modelové funkce. Je
patrné, že je přímka akceptovatelná a data nevykazují nelineární průběh.
Metoda
Vyšetření splnění základních předpokladů metody nejmenších čtverců (MNČ), za kterých by
měla metoda vést k nejlepším lineárním nestranným odhadům regresních parametrů:
Testování regresního tripletu (data + model + metoda) shrnuje Tabulka V.
Tabulka V
Testování regresního tripletu (data
model
metoda).
160
Fisher-Snedocorův test významnosti regrese,Fexp : 4.9137E+04
: 5.9874E+00
Tabulkový kvantil, F1-(m-1, n-m)
Závěr
: Navržený model je přijat jako
významný.
Spočtená hladina významnosti
: 0.000
:-2.0101E-13
Scottovo kriterium multikolinearity, M
Závěr
: Navržený model je korektní.
Cook-Weisbergův test heteroskedasticity, Sf
: 9.5520E+00
2
: 3.8415E+00
Tabulkový kvantil,  1- (1)
Závěr
: Rezidua vykazují heteroskedasticitu.
Spočtená hladina významnosti
: 0.002
Jarque-Berraův test normality reziduí, L(e)
: 1.2103E+00
2
: 5.9915E+00
Tabulkový kvantil,  1- (2)
Závěr
: Normalita je přijata.
Spočtená hladina významnosti
: 0.546
Waldův test autokorelace, Wa
: 2.2464E-01
2
: 3.8415E+00
Tabulkový kvantil,  1- (1)
Závěr
: Rezidua nejsou autokorelována.
Spočtená hladina významnosti
: 0.636
Znaménkový test, Dt
: 3.8188E-01
: 1.6449E+00
Tabulkový kvantil, N1-/2
Závěr
: Rezidua nevykazují trend.
Spočtená hladina významnosti
: 0.351
 Fisherův- Snedecorův test významnosti regrese potvrdil, že navržený model je přijat jako
významný.
 Scottovo kriterium multikolinearity nemá smysl u jednorozměrného regresního modelu.
 Cookův-Weisbergův test heteroskedasticity dokazuje, že rezidua vykazují heeskedasticitu
(nekonstantnost rozptylu).
 Jarqueův – Berraův test reziduí ukazuje, že klasická rezidua vykazují Gaussovo
rozdělení.
 Waldův test autokorelace ukazuje, že klasická rezidua nejsou autokorelována.
 Znaménkový test prokazuje, že znaménko klasických reziduí se dostatečně střídá, a proto
rezidua nevykazují žádný trend.
Konstrukce zpřesněného modelu
a) po odstranění bodu č. 8 byly nalezeny nové odhady parametrů zpřesněného modelu
(Tabulka VI).
Tabulka VI.
Nové odhady parametrů zpřesněného modelu.
Parametr
Odhad
Směrodatná
H0: bj = 0 vs. HA: bj <> 0
odchylka
t-kriterium
hypoteza H0 je
b0
1.0507E-02 9.8131E-03
1.0707E+00
Akceptována
b1
9.9765E-01 2.4171E-03
4.1274E+02
Zamítnuta
Zpřesněný model (v závorce je uveden odhad směrodatné odchylky parametru):
y = 0,010507 (0,0098131) + 0,99765 (0,0024171) x
je doložen statistickými chrakteristikami:
Vícenásobný korelační koeficient, r: 0,99999
Koeficient determinace, D [%]: 99,997
Predikovaný korelační koeficient, R2p: 0,99997
161
Spočtená hlad.
význam
0.333
0.000
Střední kvadratická chyba predikce, MEP: 3.6809E-05
Akaikeho informační kritérium, AIC: -72,069
Střední kvadratická chyba predikce MEP a Akaikovo informační kritérium AIC dosáhly
nižších hodnot, čímž dokazují kvalitnější model než předešlý.
Rezidua vykazují normální rozdělení a nevykazují trend, stále však vykazují
heteroskedasticitu, a proto lze doporučit užití metody vážených nejmenších čtverců.
b) Užitím statistické váhy (wi = 1/y2i)se kompenzuje heteroskedasticitu v datech. Získáme
nové správnější odhady parametrů (Tabulka VII).
Tabulka VII.
Správnější odhady parametrů.
Parametr Odhad
Směrodatná
odchylka
b0
1.2938E-02
8.8872E-03
b1
9.9702E-01
2.3907E-03
H0: bj = 0 vs.
t-kriterium
1.4558E+00
4.1703E+02
HA: bj <> 0
hypoteza H0 je
Akceptována
Zamítnuta
Spočtená hlad.
význam
0.205
0.000
Opravený model má tvar (v závorce je uveden odhad směrodatné odchylky parametru):
y = 0,012938 (0,0088872) + 0,99702 (0,0023907) x
je doložen statistickými charakteristikami:
Vícenásobný korelační koeficient, r: 0,99999
Koeficient determinace, D [%]: 99,997
Predikovaný korelační koeficient, R2p: 0,99997
Střední kvadratická chyba predikce, MEP: 3.4746E-05
Akaikeho informační kritérium, AIC: -72,491
Jelikož došlo ke snížení rozhodujících kriterií, střední kvadratické chyby predikce MEP a
Akaikova informačního kritéria AIC, lze považovat tyto odhady za lepší než předešlé.
Pearsonův korelační koeficient r a koeficient determinace zůstávají stejné.
Závěr
Nalezený model má tvar (závorce je vždy uveden odhad směrodatné odchylky parametru):
y = 0,012938 (0,0088872) + 0,99702 (0,0023907) x
a intervalový odhad parametrů úseku 0 a směrnice 1 bude
b0  t1 / 2 5 D(b0 )   0  b0  t1 / 2 5 D(b0 )
a po dosazení
0,012938 - 2,5706 x 0,11374 ≤ 0 ≤ 0,012938 2,5706 x 0,11374
vyjde
-0,279 ≤ 0 ≤ 0,305
Tento interval spolehlivosti úseku regresní přímky zahrnuje nulu, takže lze úsek 0 považovat
za nulový.
Dosazením do intervalu spolehlivosti směrnice obdržíme nerovnost
0,99702 - 2,5706 x 0,9985 ≤ 1 ≤ 0,99702 2,5706 x 0,9985
a po vyčíslení
-1,570 ≤ 1 ≤ 3,564
Protože tento interval obsahuje jedničku, lze považovat směrnici 1 za jednotkovou. Lze
uzavřít, že úsek regresní přímky lze považovat za nulový 0 = 0 a směrnice 1 není odlišná od
jedničky. Výsledky nové metody se proto statisticky významně neliší od původní metody.
162
Electrochemical Study of Rhamnazin
(Elektrochemická studie rhamnazinu)
Šárka Ramešová a, Romana Sokolová a, and Ilaria Degano b
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182
23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Department of Chemistry and Industrial Chemistry, University of Pisa,
Via Risorgimento 35, 56100 Pisa, Italy
Abstract
The natural flavonoid compound rhamanzin (3,5,4’-trihydroxy-7,3’-dimethoxyflavone) is
important bioactive compound with antioxidative, anti-allergic, and anti-inflammatory
properties. The cyclic voltammetry is used for the electrochemistry behavior of rhamnazin.
The determination of oxidation pathways is supported by the identification of degradation
products using separation technique.
Key words: Flavonoids, Antioxidants, Oxidation mechanism.
Úvod
Rhamnazin (3,5,4’-trihydroxy-7,3’-dimethoxyflavone) patří do skupiny přirozeně se
vyskytujících bioflavonoidů. Flavonoidy jsou zpravidla syntetizovány rostlinami a jsou
hlavními chromofory ve většině používaných žlutých barviv 1. Flavonoidy byly využívány k
barvení tapiserií a dalších historických předmětů již v 16. století 2. Rhamnazin je široce
rozšířený v přírodě, především v ovoci, zelenině a čajích 3,4. Tato sloučenina je známá pro své
terapeutické účinky, užívá se jako preventivní léčivo při kardiovaskulárních onemocněních,
rakovině a hepatitidě 5,6.
Molekula rhamanzinu obsahuje ve své chemické struktuře několik hydroxylových skupin
vázaných na aromatický kruh (Obr. 1.). Rhamnazin je v přítomnosti vzdušného kyslíku
nestabilní, což způsobuje degradaci a komplikaci při měření 7. Během oxidačního měření se
uplatňuje následná chemická reakce, hydroxylace nebo dimerizace 8.
Obr. 1. Strukturní vzorec rhamnazinu.
Experimentální část
Zásobní roztoky nebyly připravovány a uchovávány, protože studovaná látka je nestabilní.
Pro přípravu základních elektrolytů byly použity chemikálie: chlorid draselný (Lachema,
Brno, Česká republika), hydroxid draselný (Lachema, Brno, Česká republika), ethanol
(AppliChem, Darmstadt, Německo) – vše čistoty p.a. Kyslík byl z používaných roztoků
odstraněn proudem
argonu (Messer Technogas, Praha, Česká republika).
K chromotagrafickému měření byl použit dusík (Messer Technogas, Praha, Česká republika).
Brittonovy – Robinsonovy (BR) tlumivé roztoky o příslušném pH byly připraveny smísením
0,2 mol·dm-3 hydroxidu sodného (Lachema, Brno, Česká republika) s roztokem obsahujícím
163
kyselinu boritou (min 99,5%, Sigma-Aldrich, Praha, Česká republika), fosforečnou (Lachema,
Brno, Česká republika) a octovou (Lachema, Brno, Česká republika), každou o koncentraci
0,04 mol·dm-3. Chemikálie pro přípravu pufru byly v kvalitě p.a.
Hodnota pH byla měřena digitálním pH-metrem pH 340 s kombinovanou skleněnou
elektrodou (Radiometer, Bronshoj, Dánsko). Kalibrace pH-metru byla prováděna
standardními vodnými pufry za laboratorní teploty.
Pro přípravu všech roztoků byla používána deionizovaná voda ze systému Milli Q (Millipore,
Praha, Česká republika). Použité roztoky byly uchovány ve skleněných nádobách.
Pro elektrochemická měření byl použit rychlý potenciostat s elektrochemickou celou
v tříelektrodovém zapojení. Jako pracovní elektroda byla použita elektroda ze skelného uhlíku
(o průměru 0,7 mm). Referentní argentchloridová elektroda Ag|AgCl|1M LiCl byla oddělena
od roztoku elektrolytu solným můstkem. Jako pomocná elektroda byla použita platinová
síťka. Elektrolýza a coulometrie při konstantním potenciálu byla prováděna na potenciostatu
Autolab PGSTAT30 (Ecochemie, Utrecht, Holandsko) s elektrochemickou celou
v tříelektrodovém zapojení. Jako pracovní elektroda byla použita uhlíková pastová elektroda
(PIGE – parafilmem impregnovaná grafitová elektroda). Roztok byl míchán pomocí
elektromagnetického míchadla.
Produkty elektrolýzy byly identifikovány pomocí chromatografické metody HPLC s DAD
detekcí za pomocí stroje Waters® Quattro PremierXE s pumpou Waters 1525µ Binary HPLC
Pump a detektorem Waters 2487 Dual λ Absorbance Detektor (Waters, Massachusetts, USA)
s kolonou HyPurity C8, 150 x 3 mm, 5 µm (Thermo Scientific, Dubuque, USA).
Pro separaci byla použita rozpouštědla (A): vodný roztok s 0,1% kyselinou fosforečnou
(Sigma-Aldrich, Praha, Česká republika) a (B): acetonitril (Merck, Praha, Česká republika).
Použitý gradient: 0-2 min 95 % A a 5 % B, 2-30 min lineární gradient do 40 % A a 60 % B,
30-35 min lineární gradient do 0 % A a 100 % B, 35-60 min 0 % A a 100 % B, 60-70 min
95% A a 5% B. Průtok byl nastaven na 0,2 ml·min-1 a nástřikový objem byl 40 µl. Optický
detektor byl nastaven na vlnové délky 250 nm a 280 nm.
Výsledky a diskuze
Cyklická voltametrie rhamnazinu byla měřena při různých hodnotách pH v rozmezí pH 4,3 až
11,4. Rhamnazin v roztoku o pH 6,7 vykazuje tři oxidační vlny, které souvisejí s oxidací
hydroxylových skupin obsažených v chemické struktuře (Obr. 2) 9. S rostoucí hodnotou pH
dochází k posunu potenciálu oxidačních vln rhamnazinu směrem k nižším hodnotám
potenciálu. Z tohoto je patrné, že na celkovém mechanismu oxidace se účastní vodíkové
ionty.
164
Obr. 2. Cyklický voltamogram 3·10-4 M rhamnazinu ve 40% ethanolu s BR pufrem (v/v).
Výsledné pH=6,7. Rychlost polarizace 0,25V/s.
Pro zjišťování oxidačních produktů po elektrolýze byla zvolena chromatografická metoda
HPLC s DAD detektorem (Obr. 3). Konečné produkty oxidace byly identifikovány analýzou
složek roztoku po částečné nebo úplné elektrolýze při konstantním potenciálu.
Hlavní oxidační produkt rhamnazinu je 2,4-dihydroxy-2-(4’-hydroxy-3’-methoxybenzoyl)-6methoxy- benzofuran-3(2H)-on (R1), který se dále rozkládá na nízkomolekulární látky a to 2(2,6-dihydroxy-4-methoxyfenyl)-2-oxooctovou kyselinu (R2) a 2,6-dihydroxy-4-methoxybenzoovou kyselinu (R3) 10,11.
Obr. 3. HPLC chromatogram během elektrolýzy rhamnazinu, detekce při 280 nm.
Závěr
Za pomoci elektrochemických a chromatografických metod byly zjištěny oxidační produkty
studované látky.
165
Acknowledgement
This work was supported by the Academy of Sciences of the Czech Republic (M200401201).
Literatura
1. Sokolová R., Degano I., Ramešová Š., Bulíčková J., Hromadová M., Gál M., Fiedler J.,
Valášek M.: Electrochimica Acta 56, 7421 (2011).
2. Hofenk de Graaff J. H.: The Colourful Past, Origins Chemistry and Identification of
Natural Dyestuffs, Abegg-Stiftung/Archetype Publications Ltd., London/Riggisberg,
2004.
3. Biesaga M., Pyrzynska K.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 95 (2009).
4. Hollman P., Arts I.: J. Sci. Food Agric. 80, 1081 (2000).
5. Chokchaisiri R., Innok P., Suksamrarn A.: Phytochemitry Letters 5, 361 (2012).
6. Zhao Y., Yu Z., Fan R., Gao X., Yu M., Li H., Wei H., Bi K.: Chem. Prahrm. Bull. 59,
1322 (2011).
7. Ramešová Š., Sokolová R., Degano I., Žabka J., Bulíčková J., Gál M.: Anal. Bioanal.
Chem. 402, 975 (2012).
8. Hendrickson H. P., Kaufman A. D., Lunte C. E.: J. Pharm. Biomed. Anal. 12, 325 (1994).
9. Ramešová Š., Sokolová R., Pecková K.: Chemické Listy 105, S62 (2011).
10. Sokolová R., Ramešová Š., Degano I., Hromadová M., Gál M., Žabka J.: Chem.
Commun. 48, 3433 (2012).
11. Ramešová Š., Sokolová R., Degano I., Hromaodvá M., Gál M., Kolivoška V., Colombini
M. P.: Collect. Czech. Chem. Commun 76, 1651 (2011).
166
Effect of tetraalkylammonium cations on amperometric detection of heparin at a
polarized water/ionic liquid membrane interface
Zdeněk Samec a, Jan Langmaier a, Eva Samcová b, and Petr Tůma b
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23
Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague,
Ruská 87, 100 00 Prague 10, Czech Republic
Abstract
Amperometric detection of heparin, which combines the spontaneous extraction of heparin
into the ionic liquid (IL) membrane with its potential-driven stripping, is studied using IL
composed of the tetradodecylammonium (TDDA+) cation and tetrakis[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]borate (TFPB-). In contrast to the IL membrane composed of
tridodecylmethylammonium cation (TDMA+) and TFPB-, no promotion effect of the
tetrapentylammonium cation (TPeA+) is observed. The absence of the effect is ascribed to a
much weaker ion association between heparin and TDDA+, which does not support the
accumulation of heparin into the IL phase.
Key words: Heparin, Ionic liquid membrane, Amperometric detection, Tetraalkylammonim
cation.
Introduction
Heparin is a highly sulfated linear glucosaminoglycan which has been used for many years as
a unique agent preventing blood coagulation in medical procedures. The unfractionated
heparin is a mixture of glucosaminoglycans with a molar mass Mh in the range 12 kDa to15
kDa, and an average charge number of -75 1. Medically relevant activities a0 of heparin are in
the range 0.1-1.0 U mL-1 (therapy) and 1-10 U mL-1 (surgery) 2. Conversion of the activity of
heparin to its molar concentration c0 is accomplished as a0 = c0 u Mh, where u is the heparin
activity expressed in U mg-1. Activity of 1 U mL-1 corresponds to c0 = 0.4 - 0.6 mol L-1,
assuming that Mh = 12 kDa and u = 150-200 U mg-1. Clinical assays of heparin have been
based on monitoring of the activated clotting time (ACT), or the activated partial
thromboplastin time 2. Analytical methods for the heparin detection have been developed
using the colorimetric 3, fluorescent 4, potentiometric 5,6 or amperometric 7,8 techniques, which
have not been ingraded in medical practice, in spite of their plausible LOD. Amperometric
and potentiometric detection of heparin at polymeric membranes is facilitated by asymmetric
tetraalkylammonium cations (R(CH)3N+ and R3(CH3)N+, R = long-chain alkyl functional
group) via the counter-ion association mechanism 9,
MkHepx-(w) + r S+(m)  s M+(w) + MnSrHepy-()  s M+(w) + MnSrHepy-(m) (1)
where (w) and (m) denote the membrane (or organic solvent) and the aqueous phase of the
electrochemical detector, respectively, () stands for the interphase, and M+ represents the
cation of the aqueous phase, and S+ denotes the membrane cation (R(CH)3N+, R3(CH3)N+).
Tridodecylmethylammonium (TDMA+) cation has been found to be most convenient counterion for the potentiometric detection of heparin using the PVC plasticized membrane 10.
These effects have motivated us to investigate the amperometric detection of heparin using
the polarized ionic liquid (IL) membrane composed of TDMA+ and tetrakis[3,5bis(trifluoromethyl)phenyl]borate (TFPB-) 11. TDMATFPB belongs to the family of highly
hydrophobic ILs, which provide a wide polarized potential window, and which have been
previously exploited in voltammetric studies of both the simple and facilitated transfer of
univalent ions across the water-IL interface 12. Study revealed a tunable effect of the
167
semihydrophobic tetraalkylammonium cations (TAA+) present at trace concentrations in the
aqueous solution containing heparin. Theoretical considerations based on the mixed-potential
concept and experimental evidence suggested that the TAA+ cations promote the extraction of
heparin into the IL phase, from which heparin can be stripped off by applied potential
providing a well-separated current signal. The promoting effect of tetrapentylammonium
cation (TPeA+) is demonstrated in Figure 1 (panel A). The enhancement Ip+ of the TPeA+
peak current at ca. 0 V was found to increase linearly with the heparin concentration in the
test aqueous phase, cf. Figure 1 (panel B) 11.
Main aim of this work has been to examine the promotion effect of the tetrapentylammonium
+
0.4
+
TPeA
0.0
BGR
-0.4
-0.4 0.0 0.4 0.8
+
Hep+TPeA
Ip / A
I / A
A
B
0.6
0.4
0.2
0.0
0
10
0
20
-1
a / U mL
E/V
Fig. 1. (A) CVs (5 mV s-1) of ion transfer processes at the TDMATFPB membrane in the
absence (dotted line) and presence of 5x10-5 M TPeACl (dashed line), or 5x10-5 M TPeACl +
5 U mL-1 (full line) in the aqueous phase (w) containing 0.1 M NaCl; ohmic potential drop
compensation 100 k. (B) Plot of the positive peak current increment Ip+ vs. the heparin
activity a0. Adapted from ref. 11.
cation on the extraction of heparin into the IL membrane composed of the TFPB - anion and a
hydrophobic symmetric tetradodecylammonium (TDDA+) cation.
Experimental
The supported IL membrane was prepared by using a PVDF microporous filter (Millipore,
type GVHP 1300, pore size of 0.22 μm, thickness of ~112 μm), which was impregnated by
soaking with TDDATFPB. The membrane disk was cut and mounted in a four-electrode cell,
so that the membrane area exposed to the aqueous electrolyte solution was 0.07 cm 2 13,14. The
scheme of the membrane cell can be described as
Ag’|AgCl | 0.1 M LiCl (w’) | TDDATFPB (m)| 0.1 M LiCl, 0.2 mM TPeACl, x Hep (w)| AgCl|Ag
(2)
where x = 1-20 U mL . Voltammetric measurements were carried out at the ambient
temperature of 25 ± 2 oC using Solartron ModuLab System (Solartron Analytical, Ametek).
-1
The capillary electrophoresis (CE) measurements were carried out using Agilent CE
Instrument G1600A equipped with a diode-array detector, a contactless conductivity detector
and a fluorescence detector.
168
I / A
Results and Discussion
Figure 2 shows the voltammetric behavior of TPeA+ at the TDDATFPB membrane in the
absence (squares) and the presence (circles or crosses) of heparin at two different
concentrations (5 and 20 U mL-1) in the aqueous phase (w) containing 0.1 M LiCl. In contrast
to the TDMATFPB membrane, cf. Figure 1, the voltammetric peak of the TPeA+ ion transfer
from the aqueous to the membrane phase at E  0 V is obviously unaffected by the presence
of heparin.
0.5
0.0
-0.5
-0.8 -0.4 0.0 0.4 0.8
E/V
Fig. 2. CVs (10 mV s-1) of ion transfer processes at the TDDATFPB membrane in the
absence (dashed line) and presence of 0.2 mM TPeACl (squares), 0.2 mM TPeACl + 5 U
mL-1 (circles), or 0.2 mM TPeACl + 20 U mL-1 (crosses) in the aqueous phase (w)
containing 0.1 M LiCl; ohmic potential drop compensation 130 k.
In general, the positive peak current enhancement at E  0 V could be associated with the
amplification of either the cation transfer from the aqueous to the membrane phase, or the
anion transfer in the opposite direction. We have speculated that binding of TPeA+ on heparin
could lead to an overcompensation of the negative heparin charge and to the formation of the
new transferable hydrophobic cation 11. However, the CE measurements do not support this
idea. Figure 2 demonstrates the CE separation of heparin in the absence (peak A) and the
presence (peak B) of an excess of TPeA+. The migration times which are presumably related
to the charge carried by heparin are practically identical (96.4 s vs. 95.9 s), though the
presence of TPeA+ leads to a better CE resolution, as indicated by a larger peak height (14.3
vs. 9.7 mV) and a smaller peak half-width (5.4 s vs. 8.3 s).
On the other hand, the current enhancement could be associated with the back transfer of
heparin after its extraction into the membrane phase 11. The spontaneous accumulation of
heparin under the zero-current conditions must be balanced by the transfer of an anion in the
opposite direction (e.g. TFPB-), or by the coextraction of a cation (e.g. TPeA+). According to
the mixed-potential theory of extraction 15, the extraction rate depends on the degree of
matching of the standard ion transfer potential differences of the coextracted ions. The
detailed analysis indicates, that the heparin polyanion and TPeA+ meet this requirement, while
the coextraction of Cl- may interfere 11.
169
B
A
5 mV
80
100
80
time / s
100
Fig. 3. CE separation of heparin (15 U mL-1, 75% acetonitrile) in two different background
electrolytes: (A) 1 M acetic acid (migration time 96.4 s) and (B), 1 M acetic acid + 0.2 mM
TPeACl (migration time 95.9 s). Experimental conditions: capillary 50 µm id, 32 cm total
length, 18 cm to CCD; voltage -20 kV; hydrodynamic injection 1000 mbar.s.
electric current
Figure 4 shows schematically the partial electric currents of heparin, TPeA+ and Cl-, which
determine the position of the mixed-potential difference (mpd) at the water-TDMATFPB
interface 11. The absence of the promotion effect of TPeA+ for the polarized TDDATFPB
membrane, cf. Figure 2, could be then ascribed to a much weaker ion association between
heparin and TDDA+, i.e., the facilitated transfer of heparin into the membrane phase
according to Eq. 1 is not supported. As a result, the partial electric current of heparin is
largely suppressed, and the accumulation of heparin in the membrane phase by coextraction
with TPeA+ is negligible.
TPeA
+
sum
-
Cl
x-
MkHep
potential difference
Fig. 4. Partial currents associated with the coextraction of TPeA+ (■), heparin (●) and Cl- (○)
from the aqueous to the membrane phase, and their sum (dashed line) indicating the position of
the mixed potential difference. Adapted from ref. 11.
Conclusions
In contrast to the IL membrane composed of TDMA+ and TFPB-, no promotion effect TPeA+
on the amperometric detection of heparin is observed for the TDDATFPB membrane. The
absence of the effect is ascribed to a much weaker ion association between heparin and
TDDA+. As a result the facilitated transfer of heparin proceeds slowly, and the accumulation
of heparin in the membrane phase by coextraction with TPeA+ is negligible.
170
Acknowledgements
This work was supported by the grant No. P206/11/0707 from the Grant Agency of the Czech
Republic.
References
1. Linhardt R. J.: J. Med. Chem. 46, 2551 (2003).
2. Abildgaard U. in Lane D. A. and Lindahl U. (Eds.): Heparin: Chemical and Biological
Properties, Clinical Applications, CRC Press, pp. 495-515, Boca Raton, FL, 1989.
3. Zhan R., Fang Z., Liu B.: Anal. Chem. 82, 1326 (2010).
4. Pu K.-Y., Liu B.: Adv. Funct. Mater. 19, 277 (2009).
5. Ma S., Yang V.C., Meyerhoff M.E.: Anal. Chem. 64, 694 (1992).
6. Langmaier J., Samcová E., Samec Z.: Anal. Chem. 79, 2892 (2007).
7. Samec Z., Trojánek A., Langmaier J., Samcová E.: Electrochem. Commun. 5, 867 (2003).
8. Guo J., Yuan Y., Amemiya S.: Anal. Chem. 77, 5711 (2005).
9. Amemiya S., Kim Y., Ishimatsu R., Kabagambe B.: Anal. Bioanal. Chem. 399, 571
(2011).
10. Fu B., Bakker E., Yang V.C., Meyerhoff M.E.: Macromolecules 28, 5834 (1995).
11. Langmaier J., Samec Z., Samcová E., Tůma P.: Electrochem. Commun. 24, 25 (2012).
12. Samec Z., Langmaier J., Kakiuchi T.: Pure Appl. Chem. 81, 1473 (2009).
13. Langmaier J., Olšák J., Samcová E., Samec Z., Trojánek A.: Electroanalysis 18, 115
(2006).
14. Samec Z., Trojánek A., Samcová E.: J. Electroanal. Chem. 389, 1 (1995).
15. Koryta J., Skalicky M.: J. Colloid Interface Sci. 124, 44 (1988).
171
Blister Formation on Polymer Coated Galvanised Steel
during Immersion in Oxidizing Alkaline Solutions
Ernst Dietmar Schachinger a,b, Roland Braidt a, and Achim Walter Hassel b
a
voestalpine Stahl GmbH, voestalpine Straße 3, A-4020 Linz, Austria,
E-mail: [email protected]
b
Institute for Chemical Technology of Inorganic Materials, Johannes Kepler University Linz,
Altenberger Straße 69, A-4040 Linz, Austria
Abstract
The performance of polymer coated galvanized steel sheet in alkaline solutions with and
without saline components containing sodium percarbonate as an oxidising agent was
investigated by visual inspection, light microscopy and electrochemical impedance
spectroscopy (EIS) measurements. It was found that ionic species are necessary to initiate
blistering, but also contribute to blister growth. The nascent oxygen evolving from
percarbonate accelerates blister growth enormously. Detailed investigations concerning the
effect of temperature and salt concentration were made. Blister growth kinetics was followed
by EIS and is in good agreement with visual inspection.
Key words: Galvanised steel, Organic coating, Blistering, EIS, Alkaline solution, Sodium
percarbonate.
Introduction
Wet adhesion is a very important parameter for protecting metallic substrates against
corrosion. The formation of blisters is usually the first visually noticeable sign for insufficient
protection of the substrate. The reduction of paint adhesion by water accumulation at the
coating-substrate-interface is a requirement for blistering 1-3.
Osmotic blistering is considered to be the most important mechanism of blister formation.
Soluble salts at the polymer-substrate-interface can form a concentrated salt solution. Due to
the concentration gradient formed, water can be drawn through the coating, which acts as a
semipermeable membrane 3-4. Soluble salt contamination at the interface may originate from
insufficient cleaning of the substrate 5 or diffusion of ions from the environment to the
interface, but may also arise from substrate corrosion 6.
Cathodic blistering is an important mechanism in the presence of corrosion of the substrate. It
is caused by the highly alkaline environment at local cathodes under the coating. In neutral to
alkaline environments the cathodic reaction is the reduction of oxygen, which can easily
diffuse through the coating. The high pH-values at the local cathodes cause a delamination of
the coating 3,7-8.
Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) is a very powerful tool to characterise the
barrier properties and to monitor the degradation kinetics of organic coatings and is widely
used nowadays. Important parameters like the coating capacitance (Cc) and the pore resistance
(Rap) of the coating can be determined by fitting of equivalent circuit models 9-11. The
impedance modulus |Z| at low frequencies, which can be derived directly from the Bode-plot
was also suggested to be a significant parameter to estimate the barrier properties of organic
coatings 12-13.
Whereas the majority of coated panel testing is conducted in solutions of sodium chloride or
deionised water, there is only one study dealing with the immersion of coated steel sheets in
alkaline solution 14. The aim of this work is to investigate the performance of organic coated
hot dip galvanised steel sheet in alkaline solution containing various amounts of sodium
172
carbonate, sodium sulfate and sodium percarbonate the latter being an oxidising agent. The
findings are discussed in terms of a comprehensive model for blister initiation and growth.
Experimental
Coil Coated hot dip galvanised steel sheets with 150 x 100 mm in size and a total coating
thickness of 25 µm were immersed in alkaline solutions at 95 °C containing different amounts
of salts and percarbonate under stirring for 5 h, followed by a drying stage for 15 h at room
temperature and another immersion stage as described above. The solution was replaced
before a new immersion period was started. EIS spectra were taken after each immersion
period with the “Colt Laminate Tester” by Zahner (working electrode area: 20 cm2).
Detailed investigations were made concerning the effect of increasing salt concentration with
an immersion time of 5 h at 95 °C. The immersion time was extended to 16 h to investigate
the effect of temperature variation. EIS spectra were taken with an in house developed double
wall electrochemical cell with 3-electrode arrangement suitable for thermostatic
measurements (reference electrode: Ag/AgCl, counter electrode: graphite).
All EIS spectra were taken with a Zahner IM6 potentiostat in borate buffer solution (pH 8.5).
The perturbation voltage amplitude was 20 mV. Spectra were recorded from 1 Hz to 100 kHz
and from 0.01 Hz to 100 kHz for the cyclic test and the detailed investigations, respectively.
Results and Discussion
Fig. 1 shows the optical micrographs and impedance spectra after immersion in 1.5 g/l sodium
percarbonate solution. Although there was a difference in the impedance spectrum already
after 5 hours, no blistering was observed visually. After 10 hours of immersion blistering was
evident and the phase angle approaches 0° at low frequencies also indicating delamination.
The value of |Z| at 1 Hz which is related to the barrier properties of the coating decreased to
approx. 2 MΩ after 10 hours of immersion.
9
10
0h
5h
10h
8
10
0
-10
-20
7
-30
|Z| / Ohm
6
10
-40
-50
5
10
-60
4
10
phase angle / °
10
-70
3
-80
10
-90
2
10
1
10
100
1000
10000
100000
frequency / Hz
Fig. 1. Bode plots and optical micrographs after immersion in 1.5 g/l sodium percarbonate.
Although there is sometimes blistering after immersion in 1.5 g/l percarbonate without
additional saline components for 10 hours as shown in Fig. 1, it is the general case that no
blistering is observable over a long period of time when additional saline components are
absent. Instead of blistering, a superficial degradation of the coating takes place as shown in
Fig. 2.
173
Fig. 2. Optical micrographs after immersion in 1.5 g/l sodium percarbonate for 10, 20 and 30
hours.
When the panels were immersed in 1.5 g/l sodium percarbonate and 1.6 g/l Na2SO4, the first
blisters appeared after 5 hours and |Z| at 1 Hz dropped below 10 MΩ. After 10 hours large
blisters were observed and |Z| at 1 Hz decreased tremendously to a value of approx. 10 kΩ
indicating that nearly the whole coating is detached from the substrate surface.
9
10
0h
5h
10h
8
10
0
-10
-20
7
-30
Z / Ohm
6
10
-40
-50
5
10
-60
4
10
phase angle / °
10
-70
3
-80
10
-90
2
10
1
10
100
1000
10000
100000
frequency / Hz
Fig. 3. Bode plots and optical micrographs after immersion in 1.5 g/l percarbonate and
1.6 g/l sodium sulfate solution.
An immersion of the panels in a solution of 1.5 g/l sodium percarbonate, 1.6 g/l Na2SO4 and
1.5 g/l Na2CO3, as shown in Fig.3, resulted in severe blistering already after 5 hours of
immersion. A second time constant associated with corrosion processes seemed to develop in
the Bode plot and |Z| at 1 Hz decreased to a few kΩ. After 10 h of immersion the coating is
fully detached from the substrate surface and can be easily removed by hand. A replacement
of the sulfate anion with the same amount of carbonate lead to fewer blistering indicating that
also the anion plays a role in blister initiation and growth.
When sodium percarbonate was replaced by the same molar amount of sodium carbonate,
there was an enormous reduction in blistering, which led to the conclusion that nascent
oxygen evolved by percarbonate accelerates the blister growth.
Fig. 4 shows the influence of sodium sulfate concentration on the amount of blistering and |Z|
values at 0.1 Hz. At first the amount of blistering is increasing with increasing salt
concentration, leading to a drop of impedance values. When the concentration exceeds a
174
certain limit, blister growth is retarded. Also sodium carbonate concentration was increased
stepwise (not shown here), leading to similar results. These findings might be attributed to
reduced osmosis when a certain concentration is reached.
Variation of the temperature has a large effect on coating deterioration kinetics as shown in
the Bode plots in Fig. 5. Also the permeability of the unaffected coating increases with
increasing temperature, as measured with EIS in borate buffer solution (not shown here).
Fig. 4. Influence of Na2SO4 concentration on blistering and |Z| at 0.1 Hz after immersion for
5 h.
9
0
10
pristine coating
60°C
70°C
80°C
90°C
8
10
7
-20
10
-30
phase angle / °
6
10
|Z| / Ohm
pristine coating
60°C
70°C
80°C
90°C
-10
5
10
4
10
-40
-50
-60
3
10
-70
2
10
-80
1
10
-90
0.01
0.1
1
10
100
1000
10000
0.01
100000
0.1
1
10
100
1000
10000
100000
frequency / Hz
frequency / Hz
Fig. 5. Bode plots in borate buffer solution (22°C) after immersion for 16 h in 1.5 g/l
percarbonate + 1.5 g/l Na2CO3 + 1.6 g/l Na2SO4 solution at different temperatures.
Conclusion
The formation of blisters in alkaline solutions with and without saline components containing
percarbonate as an oxidising agent was investigated. The contributions of the single
components to blistering are as follows:
• Ionic species Na+, SO42- and CO32- are necessary to initiate blistering and also
contribute to blister growth.
• SO42- has a larger effect on blister growth than the same amount of CO 32- Nascent
oxygen evolved from sodium percarbonate accelerates blister growth enormously.
175
•
•
Sodium percarbonate without additional saline components result in a degradation of
the organic coating without onset of blistering in most of the cases.
Blister growth kinetics was followed by EIS and is in good agreement with visual
observations: Below a threshold value of approx. 1 MΩ (impedance modulus at 1 Hz)
blister formation can be detected after an induction period of ≥ 1 hour.
If the concentration of ions exceeds a certain limit, blister growth is retarded. This might be
attributed to a lower amount of water penetrating the blister due to reduced osmosis.
Temperature has an enormous effect on the permeability of the unaffected coating and the
blister growth kinetics.
References
1. Funke W.: Prog. Org. Coat. 28, 3 (1996).
2. Funke W.: J. Oil Colour Chem. Assoc. 68, 229 (1985).
3. Funke W.: Prog. Org. Coat. 9, 29 (1981).
4. Leidheiser H. Jr.: Corrosion 38, 374 (1982).
5. Appleman B. R.: J. Prot. Coat. Lin. 4, 38 (1987).
6. Hare C. H.: J. Prot. Coat. Lin. 15, 45 (1998).
7. Hare C. H.: J. Prot. Coat. Lin. 15, 17 (1998).
8. Schwenk W.: Corrosion Control by Organic Coatings. Houston 1981, p. 103.
9. Geenen F. M., de Wit J. H. W.: Prog. Org. Coat. 18, 299 (1990).
10. Murray J. N.: Prog. Org. Coat. 30, 225 (1997).
11. Murray J. N.: Prog. Org. Coat. 31, 375 (1997).
12. Bierwagen G., Tallman D., Li J., He L., Jeffcoate C.: Prog. Org. Coat. 46, 148 (2003).
13. Hinderliter B. R., Croll S. G., Tallman D. E., Su Q., Bierwagen G. P.: Electrochim. Acta
51, 4505 (2006).
14. Deflorian F., Rossi S., Kamarchic P., Fedrizzi L., Bonora P.L.: Prog. Org. Coat. 47, 103
(2003).
176
Ion Current Enhancement at Glass Microcapillaries
Barry R. Silver, Karel Holub, and Vladimir Mareček
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8,
Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Ion conductivity has been investigated at a reusable borosilicate glass microcapillary using
DC and AC electrochemical techniques. The ion current enhancement at low frequencies is
modeled using a simple serial resistance – inductor circuit. The enhancement effect is
ascribed to an electrokinetic mass transport process at the capillary wall.
Key words: Ion conductivity, Current enhancement, Microcapillary.
Introduction
Our recent paper 1 reported the existence of an interesting low-frequency pseudo-inductive
behavior 2 at novel micron-sized glass capillaries under an AC perturbation. Our previous
work proposed the existence of an electrokinetic ‘wall-effect’ as a possible cause for the
observed enhancement in current and potential-dependent resistance effects under DC
polarization. In this contribution, we further investigate this novel low-frequency pseudoinductive behavior in more detail, using a single, re-useable glass capillary (and using
different chloride-based electrolytes) under both an AC and a DC perturbation. Our results
provide more compelling evidence for our postulated cation-specific, potential-dependent
‘wall-effect’. The results are significant, as within certain electrochemical contexts, such as
those involving kinetic measurements made at the interface of two immiscible electrolyte
solutions supported at the tips of glass microcapillaries for example, considerable error could
arise from the presence of such electrokinetic ‘wall-effects’ if not properly described and
accounted for.
Experimental
Microcapillary and electrolyte solutions (10 mM LiCl, 10 mM TEACl and 10 mM CsCl) were
prepared as previously described1. The three-electrode cell with two Ag/AgCl reference
electrodes, one placed inside the capillary was used throughout. Conventional AC impedance
measurements were conducted with a CHI 600C potentiostat (CHI Instruments). Another
experimental set-up was used which involved interfacing of an EG&G 263A potentiostat
(Princeton Applied Research), a LeCroy Waverunner LT322 oscilloscope and a DS340
function generator (Stanford Research Systems). AC impedance data were analyzed using EIS
Spectrum Analyzer software 3.
Results and discussion
Figure 1 (A) is a micrograph of the tip region of the microcapillary which was used for
electrochemical measurements made throughout this study. The orifice diameter was difficult
to measure accurately with an optical microscope and is approximately ≤1 μm.
An experimental I-V curve (2 mV/s, 10 mM LiCl) is shown in Figure 1 (B). Also shown, for
comparative purposes, is a derived ‘ohmic I-V curve’. The derived ‘ohmic I-V’ curve is
plotted using a single resistance value (see Figure 5) obtained from fitting impedance data
conducted at 0 V DC bias (40 mV peak-to-peak (pk-pk) perturbation 10 kHz - 1 Hz frequency
range). The extent of the current enhancement at negative potentials at -0.7 V, above that of
the derived ‘ohmic I-V curve’ is 1.8 nA. A similar enhancement in current was found when
using CsCl as an electrolyte. However, no significant current enhancement was found when
using TEACl as the electrolyte in conjunction with this particular capillary.
177
2.0x10-8
1.5x10-8
A
B
b
1.0x10-8
a
I/A
5.0x10-9
0.0
-5.0x10-9
-1.0x10-8
1.8 nA
-1.5x10-8
a
-2.0x10-8
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
E/V
Fig. 1. (A): An optical micrograph indicating a pulled glass capillary. Diameter of the orifice
is ≤1 µm; (B): a - experimental I-V curve (2 mV/s, 10 mM LiCl), b - ‘ohmic I-V’ curve
plotted using a single resistance value R = 5.8x107 Ω.
To further explore the origin of this current enhancement, AC impedance was conducted at 0.7 V DC (200 mV pk-pk perturbation, 10 kHz to 0.1 Hz). The experimental impedance data
is shown in Figure 2 (A) in the form of a Nyquist plot. An equivalent circuit (Figure 3 (A))
was used to model the experimental data (solid line overlaying the experimental data in
Figure 2 (A)). AC impedance data collected using the same capillary, but filled on each
separate occasion with different electrolyte solution, enables comparison between Li+, Cs+
and TEA+ cations. Figure 2 (B), indicates that the TEA+ cation is less conductive, although a
small ‘pseudo-inductive loop’ indicating current enhancement is still evident on the Nyquist
plot. In the case of TEA+, under DC polarization, one observes constant resistance
commensurate with Ohm’s Law. The resistance does not appear potential-dependent, as it is
in the case of Li+ (Figure 1 (A)) and Cs+ (data not shown).
9x107
4x107
8x107
A
3x107
B
7x107
TEACl
2x107
- Z'' / Ohm
- Z'' / Ohm
6x107
1x107
0
5x107
4x107
3x107
CsCl
2x107
LiCl
1x107
0
-1x107
0
1x107
2x107
3x107
4x107
5x107
6x107
7x107
-1x107
0.0
Z' / Ohm
2.0x107 4.0x107 6.0x107 8.0x107 1.0x108 1.2x108 1.4x108 1.6x108
Z' / Ohm
Fig. 2. Nyquist plots representation of the impedance data. Capillary filled with (A): 10 mM
CsCl; (B): 10 mM solution of LiCl or CsCl or TEACl.
The extent of the current enhancement is shown more clearly in Figure 3 (B), where
resistance values from various AC and DC experiments are plotted at various potentials (10
mM LiCl as an electrolyte). For the ‘non-enhanced’ or ohmic case (upper dotted line, Figure 3
(B)) one observes constant resistance as expected from a purely ohmic response (as in the
case of TEA+). The resistance value (point at 0 V, Fig. 5) was obtained from modeling
impedance data conducted at 0 V DC bias. Current enhancement above that predicted via
Ohm’s Law is indicated by ‘line a’. The capillary resistance derived from AC impedance data
(-0.7 V DC bias, 200 mV pk-pk amplitude perturbation, 10 kHz – 0.1 Hz frequency range) is
178
given by a point at the end of ‘line b’. It is interesting to note that the overall resistance under
DC bias is larger than that of the capillary resistance (R) as derived from modeling AC
impedance data.
A
B
5.8x107
5.6x107
a
C
RL
5.4x107
L
R
R / Ohm
RE
5.2x107
5.0x107
b
4.8x107
4.6x107
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
E/V
Fig. 3. (A): Scheme of the equivalent circuit; (B): Resistance values R vs. applied potential
for the experimental data shown in Fig. 1 (B), points () represent the value of R derived from
AC impedance measurements at 0 and -0.7 V DC potential.
To further explore this interesting difference, we used an experimental set-up which allowed a
constant DC bias (typically -0.7 V, applied via an EG&G 263A potentiostat) to be added to a
separate AC perturbation (typical pk-pk amplitude in this case of 200 mV, at varied
frequency, produced via the DS340 function generator). The supposition of the two signals
produces a voltage perturbation similar to that of a conventional impedance experiment which
is usually conducted on the CHI instrumentation.
An important difference between this experimental set-up and that of a conventional AC
impedance experiment is that we are able to collect the value of the current via a DC-coupled
oscilloscope which is generated in response to an AC+DC voltage perturbation signal. The
collection of current values from the CHI instrumentation is not possible. In all cases, we
made sure that, the frequency of output current matched that of the perturbation signal.
Another important difference between this experimental set-up and that of a conventional AC
impedance experiment conducted on the CHI instrumentation is that we do not monitor phase
angle. In this experimental arrangement we pay attention to, and monitor solely, the average
maximum, the average minimum and the average mean output currents achieved over the
course of an experiment lasting 3 minutes in duration (at bias with a particular frequency). We
term this experiment the ‘EG&G experiment’ for brevity herein.
The results for the EG&G experiment are featured in Figure 4. At higher frequency (approx.
20 Hz) we observe little difference between the maximum and minimum currents (Fig. 4 (A)),
however, at low frequency there is a large difference (Fig. 4 (A, B)). The average mean
current increases with decreasing frequency.
The reason why the mean current increases at lower frequency can be explained by an
incorrect evaluation of a linear mean response current value from the data which are
inherently non-linear. In other words, either the maximum and/or the minimum currents
appear to be changing in a non-linear fashion in response to the applied voltage perturbation.
One notes, however, that the conventional AC impedance experiment (conducted on the CHI
instrumentation, using a 200 mV pk-pk perturbation at -0.7 V DC bias) was conducted on a
179
linear portion of the I-V curve which gives one the impression that the linearity condition has
been fulfilled.
Figure 4 (B) shows the dependence of the maximum, minimum and mean currents on the
reciprocal of frequency.
-12.0
A
-12.5
-13.0
a
-12.5
a
-13.5
-13.0
-14.0
-13.5
c
-14.5
-14.0
-15.0
I/A
I / nA
B
-12.0
-15.5
-16.0
c
-14.5
-15.0
-15.5
b
-16.5
-16.0
-17.0
-16.5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
b
-17.0
f / Hz
0
2
4
6
8
1/f / Hz-1
Fig. 4. Dependence of the maximum (a),
minimum (b) and average mean current (c) on frequency (A) and on the reciprocal of
frequency (B) derived from the EG&G experiment (see the text).
The difference in pk-pk currents (curve a, b. Fig 4) versus the reciprocal of frequency is
shown in Figure 5. At high frequency (approx. 20 Hz) this difference goes to zero. At low
frequency (0.1 – 7 Hz), the dependence of the pk-pk vs. 1/f can be simulated by a simple
serial RLL circuit neglecting other components of the equivalent circuit shown in Fig. 3 (A). It
should be noted that the values of RL and L strongly depend on the applied DC potential. At
zero DC potential their values are very high as compared with the other components of the
equivalent circuit and therefore the inductive behavior is not observed.
The RL = 4x107 Ω and L = 4.2x106 H values used in this modeling (in Figure 5) differ from
the RL = 4.6x108 Ω and the single L = 1.8x108 H value of the inductive branch derived from
modeling conventional AC impedance data, obtained from the CHI instrument. The reason for
this discrepancy could be explained by a non-linear response of a microcapillary system to the
applied perturbation resulting in an error in the determination of the amplitude and phase
angle (in the case of the impedance experiment conducted on the CHI instrumentation). In
contrast, the EG&G experiment uses only pk-pk values , and hence there will be no phase
angle error in this measurement.
The inductive behavior could be explained by another type of ion transport, which occurs
parallel to ‘bulk’ ion transport. The only aspect of the capillary tip region which could cause
this type of behavior is the negatively charged glass wall. Clearly no migrational effects occur
in bulk as evidenced from the TEACl data (which displays ohmic behavior). Potentialdependent surface conductivity effects seem a likely candidate for our previously proposed
‘wall-effect’. Such phenomena could be caused by longitudinal polarization of the electric
double-layer (formed by the fixed negatively charged glass surface and adjacent electrolyte
cations). It also seems likely that cation-specific interactions with the glass surface could be
present 4,5, which in turn helps to explain cation-specific enhancement effects which we have
observed herein. The presence of these proposed cation-specific effects could also explain for
instance, why current enhancement was very obvious with Li+ as the cation but not so obvious
180
10
in the case of the TEA+ cation. Importantly though, it is very clear that the effect is not due to
the electrolyte anion.
5.0x10-9
4.0x10-9
3.0x10-9
I/A
calculated
experiment
2.0x10-9
1.0x10-9
0.0
0
2
4
6
8
10
1/f / Hz-1
Fig. 5. The difference in pk-pk currents (curve a, b. Fig 4) versus the reciprocal of frequency.
Conclusions
We have presented further, more compelling evidence which suggests that the previously
observed low frequency ‘pseudo-inductive’ behavior is linked to an electrokinetic ‘wall’ or
potential-dependent surface conductivity effect.
Values of the inductance obtained in modeling procedures (in units of Henry) are abnormally
large. In future work, these large inductance values need to be reconciled with physically
meaningful physico-chemical processes and properties such as surface conductivity, glass
zeta-potential, the magnitude and direction of the applied electric field, cation-glass effects as
well as cation-specific thermodynamic measures.
Future efforts will also be aimed at quantifying the error which may be produced by the ‘wall
effect’ within the context of electrochemical kinetic measurements at the interface between
two immiscible electrolyte solutions supported at the tips of glass microcapillaries.
Acknowledgements
This research has been supported by the Czech Science Foundation (project No. 13-04630S).
References
1. Silver B. R., Holub K., Mareček V.: Electrochim. Acta in print (2013).
2. Feng J., Liu J., Wu B., Wang G.: Anal. Chem. 82, 4520 (2010).
3. EIS Spectrum Analyser, Version 0.1b, http://www.abc.chemistry.bsu.by, Downloaded
April 6th, 2013.
4. Tadros T. F., Lyklema J.: J. Electroanal. Chem. 17, 267 (1968).
5. Dishon M., Zohar O., Sivan U.: Langmuir 27, 12977 (2011).
181
Electrochemical Determination of Adrenaline in Human Urine by Boron-doped
Diamond Film Electrode
(Elektrochemické stanovenie adrenalínu v ľudskom moči na bórom dopovanej
diamantovej filmovej elektróde)
Jozef Sochr, Ľubomír Švorc, Miroslav Rievaj, Dušan Bustin, and Ján Labuda
Slovak University of Technology in Bratislava, Faculty of Chemical and Food Technology,
Institute of Analytical Chemistry, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovak Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
In the present work we are dealing with the development of new electrochemical method
using a relatively new electrode material - boron-doped diamond as sensitive electrochemical
sensor for determination of trace amounts of adrenaline. The main aim was to study and
optimize the experimental and instrumental conditions using pulse voltammetric techniques.
The influence of some urine components as possible interfering agents on the current response
of oxidation of adrenaline was also investigated. The proposed method was successfully
applied in the determination of adrenaline in spiked human urine samples with good recovery
values.
Key words: Adrenaline, Boron-doped diamond film electrode, Differential pulse
voltammetry, Square-wave voltammetry, Human urine.
Úvod
Adrenalín (ADR) je hormón tvoriaci sa v dreni nadobličiek a patriaci do skupiny tzv.
katecholamínov. Je vhodnou voľbou pri liečbe anafylaktického šoku, pri resuscitácii po
infarkte a pôsobí aj ako kardiostimulant pri operačných zákrokoch. Nízke koncentrácie ADR
v telesných tekutinách sú najčastejšie prejavom Parkinsonovej a Alzheimerovej choroby,
schizofrénie a anorexie. Vyššie koncentrácie spôsobujú stres, náhle zlyhanie srdca alebo jeho
arytmiu, prípadne indikujú prítomnosť nádorov. Z týchto dôvodov patrí analytické stanovenie
ADR a ostatných katecholamínov v telesných tekutinách k dôležitým aspektom klinickej
chémie. Navyše súčasný trend v analytickej chémii vyžaduje požadovaný analyt v danej
matrici stanoviť maximálne jednoducho a rýchlo, ale zároveň citlivo a selektívne 1,2,3.
Pre účely stanovenia ADR boli vo výskumných a klinických laboratóriách vypracované
viaceré analytické postupy využívajúce HPLC a kapilárnu elektroforézu 2, obvykle v spojení
s fluorescenčným 4 alebo elektrochemickým detektorom5. Pri spektrálnych metódach sa na
stanovenie ADR vo veľkej miere využíva jeho oxidačná schopnosť 6,7. Na stanovenie ADR
možno využiť diazotačné a kopulačné reakcie 8, enzymatické reakcie s pôsobením
polyfenoloxidáz1 alebo aj elektrochemiluminiscenciu 9.
Na základe dostupných informácií z vedeckej literatúry možno konštatovať, že problematika
elektroanalýzy ADR je výlučne spojená s využitím modifikovaných elektródových povrchov,
obvykle za účelom zvýšenia citlivosti a selektivity stanovenia. Pomerne rozsiahle spektrum
elektrochemických metód využíva elektródy s polymérnymi filmami 3,10,11, uhlíkovými
nanočasticami 12-14, ale aj biosenzory 15,16. Využitie holých (nemodifikovaných) elektród je
skôr rarita, čo súvisí s faktom, že pri elektrochemickom stanovení ADR dochádza
k ireverzibilnej adsorpcii reakčných produktov elektródovej reakcie 17,18. Tu sa otvárajú
možnosti pre využitie perspektívneho elektródového materiálu - bórom dopovaného
diamantového filmu (BDDF). V porovnaní s tradičnými uhlíkovými elektródami má široký
pracovný rozsah potenciálov, nízku kapacitu elektrickej dvojvrstvy, nízku adsorpčnú
schopnosť vďaka parafinickému charakteru povrchu elektródy a výbornú mechanickú
robustnosť 19.
182
V tejto práci je pozornosť venovaná vývoju novej elektrochemickej metódy na stanovenie
ADR využitím citlivých pulzových techník na holej (nemodifikovanej) BDDF elektróde. Je
potrebné zdôrazniť, že stanovenie ADR na tomto perspektívnom elektródovom materiály
doposiaľ nebolo publikované v žiadnom referáte na základe dostupných informácii z vedeckej
literatúry. V porovnaní s inými elektrochemickými metódami stanovenia ADR je významný
aj fakt, že sa jedná o elektródový materiál nevyžadujúci chemickú modifikáciu povrchu.
Praktická aplikovateľnosť metódy je demonštrovaná na modelových vzorkách ľudského
moču.
Experimentálna časť
Zásobný roztok ADR (Sigma-Aldrich, Česká republika) o koncentrácii 1.10-3 mol.dm-3 bol
pripravený v HClO4 (c = 0,5 mol.dm-3) a skladovaný v chladničke pri 4°C a v tme po dobu 7
dní. Roztoky elektrolytov anorganických kyselín, octanových tlmivých roztokov (ABS) a
potenciálnych interferujúcich látok ako glukóza, sacharóza, močovina, kreatinín, kyselina
citrónová, barbiturová, močová (všetky Lachema, Brno) o koncentrácii 0,1 mol.dm-3 boli
pripravené v prevarenej redestilovanej vode. Všetky chemikálie boli požadovanej analytickej
čistoty. Elektrochemické merania boli realizované pomocou elektrochemického analyzátora
AUTOLAB PGSTAT 302N (EcoChemie, Utrecht, Holandsko) s 3-elektródovým systémom:
pracovná bórom dopovaná diamantová filmová elektróda (BDDFE, film s priemerom 3 mm,
odporom 0,075 Ω·cm a koncentráciou bóru 1000 ppm; Windsor Scientific Ltd., United
Kingdom), platinový drôtik ako pomocná elektróda a Ag/AgCl/3M KCl ako referenčná
elektróda. Obsluha analyzátora a získavanie základných údajov z nameraných
voltampérogramov bolo vykonávané pomocou elektrochemického softvéru NOVA 1.8,
získané dáta boli ďalej spracovávané v softvéri Origin 8.0. Kalibračné závislosti sa určili
pomocou metódy najmenších štvorcov s 95% pravdepodobnosťou, z parametrov ich
regresných priamok sa vypočítali hodnoty detekčných limitov (LOD) ako 3-násobok chyby
úseku podelenej smernicou. Modelová vzorka bola pripravená 20-násobným riedením
ľudského moču so základným elektrolytom a obohatená o ADR tak, aby výsledná
koncentrácia ADR bola 5.10-5 mol.dm-3. Na kvantitatívne vyhodnotenie bola použitá metóda
prídavku štandardu.
Výsledky a diskusia
V prvom kroku bolo pomocou cyklickej voltampérometrie (CV) študované elektrochemické
správanie ADR na povrchu BDDF elektródy. Pre tento účel bol pripravený roztok ADR
s koncentráciou 1.10-4 mol.dm-3 v rôznych prostrediach. Namerané CV voltampérogramy
vo vybraných prostrediach sú zobrazené na Obr. 1. V prípade ABS (pH 6) boli v anodickej
oblasti pri potenciáloch 0,8 (oxidácia adrenalínu na adrenalínchinón) a 1,2 V (oxidácia
adrenalínchinónu na adrenochróm) pozorované dva oxidačné píky, pričom každý prislúcha
dvojelektrónovému procesu na povrchu elektródy. Tento jav bol charakteristický pre pH
hodnoty elektrolytu v rozmedzí 2-7. V zásaditom prostredí sa tvar oboch oxidačných píkov
výrazne deformoval a súčasne narastal šum (výsledky neuvádzame). S klesajúcou hodnotou
pH elektrolytu však klesal oxidačný pík pri 1,2 V a súčasne rástol oxidačný pík pri 0,8 V.
V silne kyslom prostredí (pH < 1) sa oxidačný pík pri 1,2 V už neobjavil vo
voltampérometrickom zázname. Pre kvantifikačné účely bolo preto vhodné vybrať silno kyslé
prostredie, kde sa v CV zázname nachádza len jeden oxidačný pík. Z Obr. 1 je zrejmé, že
ADR v prostredí kyseliny chloristej (HClO4) podlieha elektrochemickej premene, čo sa
prejavilo výrazným oxidačným píkom pri potenciály 0,8 V, pričom redukčný pík dosahoval
maximum pri -0,1 V. Môžeme konštatovať, že sa jedná o ireverzibilný elektródový proces.
Z CV voltampérogramov bez prítomnosti ADR (Obr. 1, krivka 1) je zrejmé, že zvyškové
prúdy (hlavnou zložkou je kapacitný prúd) boli relatívne nízke, čo potvrdzuje spomínané
183
výhody a aj opodstatnenosť použitia BDDFE. Navyše prostredie HClO4 vykazovalo spomedzi
ostatných študovaných kyselín (HNO3, H2SO4, HCl) najmenší šum a najvyšší oxidačný prúd
adrenalínu. Za optimálnu hodnotu koncentrácie roztoku HClO4 bola zo sledovaného rozsahu
0,01 – 2 mol.dm-3 vybraná koncentrácia 0,5 mol.dm-3 (pH 0,3).
Obr. 1. CV voltampérogramy: 1.) 0,5 M HClO4, 2.) ADR (c = 1.10-4 mol.dm-3) v ABS (pH
6), 3.) ADR (c = 1.10-4 mol.dm-3) v 0,5 M HClO4 (pH 0,3) na BDDFE pri polarizačnej
rýchlosti 100 mV.s-1.
Polarizačná rýchlosť (v) má veľký význam pre pochopenie mechanizmu redoxného deja
prebiehajúceho v difúznej vrstve pracovnej elektródy. Jednotlivé CV voltampérogramy boli
namerané pri rôznych polarizačných rýchlostiach (5 až 500 mV.s-1). S rastúcou polarizačnou
rýchlosťou narastala aj veľkosť oxidačného (Iox) a redukčného (Ired) prúdu ADR na základe
Randles-Ševčíkovej rovnice, ktorá má platnosť pre difúziou kontrolované deje:
Iox = 6,395.10-7 + 1,553.10-6 v1/2
(R = 0,9985)
Ired = 1,721.10-6 + 1,083.10-6 v1/2
(R = 0,9965)
Z týchto rovníc je zrejmé, že elektródový dej je kontrolovaný výlučne difúziou. Bol tiež
pozorovaný aj mierny posun oboch potenciálových maxím smerom k pozitívnejším (oxidačný
pík) a negatívnejším (redukčný pík) potenciálom.
Na stanovenie ADR boli použité diferenčná pulzová (DPV) a square-wave (SWV)
voltampérometria, pričom bolo potrebné najskôr optimalizovať inštrumentálne parametre
oboch techník. Pre DPV bola optimalizovaným parametrom modulačná amplitúda. Z rozsahu
hodnôt modulačných amplitúd 5-500 mV pre roztok ADR s koncentráciou 1.10-5 mol.dm-3
bola vybraná hodnota 200 mV z nasledovných dôvodov. S rastúcou hodnotou modulačnej
amplitúdy narastala prúdová odozva, pričom tento efekt bol súčasne sprevádzaný s
rozširovaním a posunom oxidačného píku smerom k negatívnejším hodnotám a zároveň
narastal aj šum. Nad hodnotou 200 mV boli píky veľmi deformované (šírky na základni
presahovali cez 0,5 V). Analogickým spôsobom boli vybrané optimálne parametre pre SWV
metódu: amplitúda 100 mV a frekvencia 50 Hz.
S optimalizovanými parametrami sa pre sériu kalibračných roztokov ADR v rozsahu
koncentrácii 1.10-7 až 1.10-3 mol.dm-3 získali kalibračnej krivky spolu s hodnotami
parametrov regresných rovníc. Získané kalibračné krivky pre SWV sú zobrazené na Obr. 2.
Príslušné regresné rovnice, z ktorých boli určené hodnoty LOD, sú:
DPV: Iox = -3,015.10-8 + 0,032c (R = 0,9994)
LOD = 4,8.10-7 mol.dm-3
184
SWV: Iox = -1,579.10-8 + 0,018c (R = 0,9996)
LOD = 4,2.10-7 mol.dm-3
Obr. 2. SWV voltampérogramy pre koncentrácie ADR: 1.) 1.10-6, 2.) 2.10-6, 3.) 3.10-6, 4.)
4.10-6, 5.) 5.10-6, 6.) 6.10-6, 7.) 7.10-6, 8.) 8.10-6, 9.) 9.10-6, 10.) 1.10-5, 11.) 2.10-5, 12.) 3.10-5,
13.) 4.10-5, 14.) 5.10-5 mol.dm-3 a kalibračné závislosti pre a.) DPV, b.) SWV.
Opakovateľnosť merania vyjadrená vo forme relatívnej smerodajnej odchýlky pre 50 za sebou
idúcich (paralelných) meraní roztoku ADR o koncentrácii 1.10-5 mol.dm-3 bola 3,5%, čo
potvrdzuje nízku adsorpciu produktu oxidácie ADR na povrchu BDDFE.
Vypracovaný postup bol aplikovaný na vzorku ľudského moču so známym obsahom ADR
využitím metódy prídavku štandardu z dôvodu potlačeniu vplyvu matrice. Získané výsledky
sú uvedené v Tab. I. Vypočítané hodnoty koncentrácie adrenalínu v modelovej vzorke sú
v dobrej zhode s očakávanými hodnotami, pričom výťažnosti sa pohybujú v rozmedzí 100 až
103%. Interferenčné štúdium bolo vykonané za účelom overenia dostatočnej selektivity
navrhovanej metódy. Z pomedzi širokej škály potenciálnych interferentov bežne sa
nachádzajúcich v moči (glukóza, sacharóza, močovina, kreatinín, kyselina citrónová, kyselina
barbiturová, kyselina močová) nemal ani jeden v značnom nadbytku významný vplyv na
signál adrenalínu.
Tabuľka I.
Analýza vzorky ľudského moču, * interval spoľahlivosti bol počítaný podľa vzťahu
x  tn 1,  SD  n1 / 2 pre n = 5, tn 1,  2,7764 .
Pridané
množstvo
(μl)
Očakávaná
koncentrácia
(mol.dm-3)
Stanovená
koncentrácia
(mol.dm-3)
SD
(mol.dm-3)
Interval
spoľahlivosti*
(mol.dm-3)
Výťažnosť
(%)
0
50
100
150
200
5,00·10-5
5,19·10-5
5,38·10-5
5,57·10-5
5,75·10-5
5,14·10-5
5,23·10-5
5,51·10-5
5,64·10-5
5,87·10-5
2,71·10-7
1,84·10-7
1,24·10-7
7,85·10-8
9,02·10-8
(5,14 ± 0,03)·10-5
(5,23 ± 0,02)·10-5
(5,51 ± 0,02)·10-5
(5,64 ± 0,01)·10-5
(5,87 ± 0,01)·10-5
102,8
100,8
102,4
101,3
102,1
Záver
V tejto práci sme sa zaoberali vývojom novej metódy na stanovenie adrenalínu využitím
BDDF elektródy ako citlivého elektrochemického senzora bez chemickej modifikácie
185
povrchu. Navrhovaná analytická metóda je jednoduchá, rýchla a dostatočne citlivá v
porovnaní s inými elektrochemickými metódami stanovenia adrenalínu využívajúcimi rôzne
modifikátory pre účely zvýšenia citlivosti a selektivity. Relatívne nízke detekčné limity boli
dosiahnuté v prostredí 0,5 mol.dm-3 HClO4 využitím pulzových techník. Praktická
aplikovateľnosť metódy bola overená na modelových vzorkách ľudského moču, pričom
vysoké hodnoty výťažnosti (100-103%) poukazujú aj na správnosť metódy. Navrhovaný
postup zapadá do koncepcie zelenej analytickej chémie a ponúka citlivú možnosť pre
monitorovanie obsahu adrenalínu v ľudskom moči. Práca nadväzuje aj na aktuálny trend v
oblasti využitia nových elektródových materiálov na riešenie úloh potravinárskej, klinickej
a environmentálnej stopovej analýzy v našom laboratóriu.
Poďakovanie
Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe zmluvy č.
APVV-0797-11. Autori ďakujú za podporu Vedeckej grantovej agentúre VEGA MŠ SR
a SAV (projekt č. 1/0182/11 a 1/0051/13).
Literatúra
1. Poliakov A. E., Dumshakova A. V., Muginova S. V., Shekhovtsova T. N.: Talanta 84, 710
(2011).
2. Chen D., Zhan D., Cheng Ch., Liu A., Chen Ch.: J. Chromatogr. B 750, 33 (2001).
3. Tavana T., Khalilzadeh M. A., Karimi-Maleh H., Ensafi A. A., Beitollahi H., Zareyee D.:
J. Mol. Liq. 168, 69 (2012).
4. Kehr J.: J. Chromatogr. A 661, 137 (1994).
5. He H., Stein C. M., Christman B., Wood A. J. J.: J. Chromatogr. 701, 115 (1997).
6. Palop S. G., Romero A. M.: J. Pharm. Biomed. Anal. 27, 1017 (2002).
7. Nevado J. J. B., Gallego J. M. L., Laguna P. B.: J. Pharm. Biomed. Anal. 14, 571 (1996).
8. Nagaraja P., Vasantha R. A., Sunitha K. R.: Talanta 55, 1039 (2001).
9. Zheng X., Guo Z., Zhang Z.: Anal. Chim. Acta 441, 81 (2001).
10. Kalimuthu P., John S. A.: Anal. Chim. Acta 647, 97 (2009).
11. Li J., Lin X.-Q.: Anal. Chim. Acta 596, 222 (2007).
12. Zare H. R., Nasirizadeh N.: Sens. Actuators, B 143, 666 (2010).
13. Goyal R. N., Rana A. R. S., Aziz M. A., Oyama M.: Anal. Chim. Acta 693, 35 (2011).
14. Yaghoubian H., Beitollah H., Soltani-Nejad V., Mohadesi A., Afzali D., Zamani H.,
Roodsaz S.: Int. J. Electrochem. Sci. 6, 1307 (2011).
15. Brondani D., Scheeren C. W., Dupont J., Vieira I. C.: Sens. Actuators, B 140, 252 (2009).
16. Akyilmaz E., Turemis M., Yasa İ.: Biosens. Bioelectron. 26, 2590 (2011).
17. Hasanzadeh M., Karim-Nezhad G., Shadjou N., Khalilzadeh B., Saghatforoush L.,
Hajizadeh M., Abnosi M. H.: Anal. Bioanal. Electrochem. 2, 98 (2010).
18. Sochr J., Švorc Ľ., Rievaj M., Bustin D.: Bioelectrochemistry, submitted
19. Kraft A.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 355 (2007).
186
The Adsorption of Phospholipids at the Interface
(Adsorpce fosfolipidů na mezifází)
a
Romana Sokolová , Jana Bulíčková a, Martina Parisová a, Tomáš Navrátil a, and Miroslav Gál b
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23
Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Department of Inorganic Technology, Faculty of Chemical and Food Technology, Slovak
University of Technology in Bratislava, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovakia.
Abstract
The adsorption of phospholipids on different types of substrate was studied. The adsorbatesurface interactions play an important role in the formation of supported phospholipid bilayer.
The deposition of phospholipids on atomically flat surfaces as mica, gold(111), highly
oriented graphite and rough surface of polycarbonate membrane is compared. The supported
phospholipids bilayer covers some small defects (5 – 30 nm deep) present in rough
polycarbonate membrane.
Key words: Supported phospholipid bilayer, Phospholipid membranes, Polycarbonate
membrane, Atomic force microscopy, Surface topography.
Úvod
Na každém fázovém rozhranní se uplatňují interakce mezi povrchem a adsorbovanou látkou a
mezi molekulami adsorbátu vzájemně. Změna interakcí mezi povrchem a adsorbovanou
látkou může vést k reorientaci adsorbované vrstvy. Silné interakce mezi adsorbovanými
molekulami často vedou k přeměně adsorbované vrstvy na kompaktní dvourozměrný film 1-5.
K charakterizaci povrchu vrstvy nanesené na elektrodě lze použít buď elektrochemické
metody jako je elektrochemická impedanční spektroskopie 1,6, chronopotenciometrie 7,8 nebo
mikroskopii rastrovací sondou 9-11.
Fosfolipidy jsou široce zkoumány v mnoha vědních oborech, elektroanalytice 12,13, farmacii,
lékařství nebo kosmetice. V závislosti na jejich koncentraci v roztoku vytvářejí dvojvrstvy,
micely nebo liposomy (vesikuly) 14. Jejich adsorpci na povrchu substrátu nebo elektrody
výrazně ovlivňuje materiál substrátu, jeho hydrofilnost nebo hydrofobicita, hrubost materiálu
a teplota při depozici. Studované materiály zahrnují sklo, slídu, křemen, SiO2, TiO2, zlato,
vysoce orientovaný pyrolytický uhlík (HOPG) 15-20. Významný vliv má samoorganizace
molekul při měření pod vodou, zde se uplatňuje vliv pH, iontové síly a složení roztoku
(přítomnost alkalických kovů a kovů alkalických zemin).
V předkládaném příspěvku je diskutován vliv typu substrátu na tvorbu fosfolipidové vrstvy,
ať už fosfolipidové dvojvrstvy nanesené na povrchu (supported phospholipids bilayer, SPB)
nebo vrstvy vesikul fosfolipidu nanesené na povrchu (supported vesicular layer, SVL).
Studium je zaměřeno hlavně na vlastnosti fosfolipidové vrstvy nanesené na polykarbonátovou
membránu.
Experimentální část
Chemikálie
1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DPPC) byl zakoupen od firmy Avanti Polar Lipids
(Alabaster, USA). Jako rozpouštědlo byl použit roztok absolutního ethanolu (AppliChem,
Germany 99,8 %, GC, Chemos, Cítov, ČR) a n-heptanu (p.a., Penta – Švec, Pentachemicals,
Praha, ČR), v poměru 1:10 (v/v). Destilovaná voda byla získána z Milli-Q RG systému
(18MΩ.cm, Millipore Co., USA).
187
Substráty
Vyžíhané monokrystalické zlato Au(111) na slídě dodávané od firmy Agilent Technologies
(USA), vysoce orientovaný pyrolytický grafit (HOPG, Structure Probe Inc., USA),
polykarbonátová membrána s velikostí pórů 8 μm (IsoporeTM Membrane Filters, Millipore,
USA).
Příprava fosfolipidové dvojvrstvy nanesené na povrchu
Depozice DPPC na polykarbonátovou membránu uchycenou na podložce byla provedena
nadávkováním 10 mM roztoku DPPC předem temperovaného na 60 ºC ve vodní lázni. Po 4
min byl povrch omyt rozpouštědlem ethanol/n-heptan 1:10 (v/v) o stejné teplotě. Postup
uvedený v literatuře byl přizpůsoben potřebám měření AFM 21.
Depozice DPPC na substráty Au(111) na slídě a HOPG probíhala ponořením substrátu do
roztoku ethanol/n-heptan 1:10 (v/v) při 60 ºC. Poté byl substrát omyt teplým roztokem
samotných rozpouštědel a vysušen pod proudem argonu.
Přístroje
Měření AFM byla prováděna na přístroji Agilent Technologies 5500 SPM za použití sondy a
nosiče vhodného pro zobrazování povrchu pomocí tzv. „tapping“ režimu (TM AFM). Byl
použit hrot typu 2 (MACLeversTM, Agilent Technologies, USA) s nominální rezonanční
frekvencí fN = 75 kHz a hodnotou nominální silové konstanty kN = 2,8 N/m. Vzorky byly
měřeny na vzduchu (ex-situ) a také in-situ pod vodou.
Výsledky z topografie (výška vrstev apod.) byly odečteny v programu PicoView (Agilent
Technologies, USA) a zpracovány v programu Origin 8 (OriginLab Corporation, USA).
Obrázky topografie, amplitudy a fáze byly zpracovány v programu Gwyddion 2.7 (Český
metrologický ústav, ČR).
Výsledky a diskuze
Charakterizace polykarbonátové membrány byla prováděna pomocí metody AFM. Obrázek
topografie povrchu membrány v oblasti mezi póry zobrazen v magneticky řízeném
přerušovaně kontaktním AFM režimu ukazuje Obr. 1. Je vidět, že membrána není rovná.
Obsahuje řadu defektů, které lze rozdělit na prohlubně a špičky. Velikost defektů byla
vyhodnocena pomocí histogramu distribuce výšky (nebo hloubky) defektu z 220 měření (80
měření). Hloubka prohlubní se pohybuje v rozmezí 5 – 30 nm, jejich šířka je od 100 po 700
nm, nejčastěji byla zjištěna šířka 245 nm. Šířka špiček je nejčastěji 105 nm, jejich výška 16,8
nm, získaný histogram je zobrazen na Obr. 2.
188
Obr. 1. Topografie povrchu polykarbonátové membrány zobrazená ex-situ v magneticky
řízeném přerušovaně kontaktním AFM režimu. Velikost zobrazované oblasti 5 μm, osa Z: 75
nm.
Obr. 2. Histogram výšky špiček, defektů nalezených na povrchu polykarbonátové membrány.
V závislosti na koncentraci a době depozice fosfolipidu bylo zjištěno, že fosfolipid buď
vytváří fosfolipidovou dvojvrstvu, která pokrývá některé prohlubně membrány, špičky
vystupují nad povrch vrstvy, nebo dochází k utvoření vrstvy vesikul a tzv. panelů.
Metodou „nanoshaving AFM“ (NS AFM) 11,22,23 byla odstraněna povrchová vrstva ve vybrané
oblasti a zjištěna pomocí histogramu výška vrstvy 5,7 nm. Tato výška odpovídá výšce
dvojvrstvy DPPC.
Závěr
Byl diskutován vliv typu substrátu na tvorbu fosfolipidové vrstvy. Tvorba fosfolipidové
dvojvrstvy nanesené na povrchu nebo vrstvy vesikul fosfolipidu nanesené na povrchu závisí
na podmínkách depozice, tj. koncentraci roztoku fosfolipidu, teplotě, typu použitého
substrátu.
189
Acknowledgement
This work was supported by the the Academy of Sciences of the Czech Republic
(M200401201).
Literatura
1. Pospíšil L., Záliš S., Sokolová R., Fanelli N.: Acta. Chim. Models in Chem. 137, 383
(2000).
2. Sokolová R., Hromadová M., Pospíšil L.: J. Electroanal. Chem. 552, 53 (2003).
3. Hromadová M., Sokolová R., Pospíšil L., Fanelli N.: J. Phys. Chem. B, 110, 4869 (2006).
4. Hromadová M., Kolivoška V., Sokolová R., Gál M., Pospíšil L., Valášek M.: Langmuir
26, 17232 (2010).
5. Sokolová R., Kolivoška V., Gál M.: J. Electroanal. Chem., DOI:
10.1016/j.jelechem.2013.01.032, in press (2013).
6. Navrátil T., Šestáková I., Mareček V.: Int. J. Electrochem. Sci. 6, 6032 (2011).
7. Naumowicz M., Petelska A. D., Figaszewski Z. A.: Steroids 76, 967 (2011).
8. Naumowicz M., Figaszewski Z. A.: J. Electrochem. Soc. 160, H166 (2013).
9. ZhiHua W. U., XueHua Z., XiaoDong Z., JieLin S., YaMing D., Jun H. U.: Chin. Sci.
Bull. 52, 1913 (2007).
10. Kada G., Kienberger F. – Hinterdorfer P.: Nano today 3, 12 (2008).
11. Kolivoška V., Gál M., Lachmanová Š., Janda P., Sokolová R., Hromadová M.: Collect.
Czech. Chem. Commun. 76, 1075 (2011).
12. Navratil T., Sestakova, I., Marecek V., Stulik, K.: Electroanalysis 22, 2043 (2010).
13. Jaklova Dytrtova J., Navratil T., Marecek V.: Collect. Czech. Chem. Commun. 76, 1917
(2011).
14. Švecová H., Součková J., Skopalová J., Novotný R., Barták P.: Chem. Listy 106, 200
(2012).
15. Giocondi M. C., Yamamoto D., Lesniewska E., Milhiet P.-E., Ando T., Le Grimellec C.:
Biochim. Biophys. Acta 1798, 703 (2010).
16. Hui S. W., Viswanathan R., Zasadzinski J. A., Israelachvili J. N.: Biophys. J. 68, 171
(1995).
17. Richter R. P., Brisson A.: Langmuir 19, 1632 (2003).
18. Richter R. P., Berat R., Brisson A. R.: Langmuir 22, 3497 (2006).
19. Bayerl, T. M., Bloom, M.: Biophys. J. 58, 357 (1990).
20. Koenig B. W., Kruger S., Orts W. J., Majkrzak C. F., Berk N. F., Silverton J. V.,
Gawrisch K.: Langmuir 12, 1343 (1996).
21. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Marecek V.: Int. J.
Electrochem. Sci. 8, 27 (2013).
22. Liu G. Y., Xu S., Qian Y.: Acc. Chem. Res. 33, 457 (2000).
23. Wendel M., Kuhn S., Lorenz H., Kotthaus J. P., Holland M.: Appl. Phys. Lett. 65, 1775
(1994).
190
Applicability of Novel Antimony- and Bismuth-Based Electrodes in Advanced
Electroanalysis
a,b
Hanna Sopha , Samo B. Hočevar b, and Ivan Švancara a
a
Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of
Pardubice, CZ-532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Analytical Chemistry Laboratory, National Institute of Chemistry
Hajdrihova 19, SI-1000 Ljubljana, Slovenia
Abstract
Different kind of bismuth and antimony based electrodes were investigated towards their
application in modern electroanalytical chemistry for measuring trace heavy metal ions and
some selected organic compounds. For instance, for the first time an antimony film electrode
was prepared in-situ in alkaline media, i.e. ammonia buffer solution of pH 9.0. Furthermore, a
new type of bismuth based electrodes, the ammonium tetrafluorobismuthate bulk modified
carbon paste electrode, was introduced and ordinary bismuth and antimony based electrodes
were employed for measuring new electrolytes. All applied electrode modifications showed
excellent electroanalytical performances.
Key words: Bismuth electrode, Antimony electrode, Heavy metals, Organic compounds,
Electroanalytical measurements.
Introduction
Electrochemical (stripping) analysis in combination with different working electrode
materials still belong to the most powerful and convenient analytical techniques for measuring
trace metal ions and some organic compounds 1. In the last six to seven decades mercury was
most commonly used as electrode material due to its auspicious electroanalytical
performance. Due to its well-known toxicity there is still increasing interest for new non-toxic
or less toxic materials with performances similar to those of mercury. This trend is
particularly important in a view of growing demands for on-site environmental analysis and
decentralized clinical testing. However, a great variety of different mercury-free electrode
materials has been reported, such as gold, platinum, silver, iridium or carbon 2-4. Although
offering useful stripping signals, none of these materials approaches the performance of their
mercury analogues exhibiting unfavorable cathodic potential limits for hydrogen evolution,
broad or doubled stripping signals, high background contribution and/or poor precision and
resolution.
In the year 2000 bismuth was introduced as an alternative electrode material to mercury 5.
Bismuth based electrodes show a similar applicable potential window as mercury electrodes
due to a favorable high hydrogen overvoltage 6. In comparison with mercury, bismuth, as an
electrode material, also revealed good performance in the presence of dissolved oxygen and is
known as a non-toxic “green” element 7. Till today, bismuth electrodes have been accepted in
numerous laboratories worldwide in different modifications, e.g. in-situ and ex-situ bismuth
film electrode prepared on a glassy carbon (BiFE) or carbon paste (BiF-CPE) substrate 8-10,
bismuth bulk electrode (BiBE), bismuth screen printed electrode, bismuth powder modified
carbon paste electrode (Bi-CPE) and Bi2O3- (Bi2O3-CPE) 11 and ammonium
tetrafluorobismuthate (BiF4-CPE) 12 bulk-modified carbon paste electrodes. Bismuth
electrodes have been used for measuring many trace metals as well as for some selected
organic compounds 13.
Despite bismuth approximately 5 years ago also antimony was found as a convenient
electrode material for advanced electrochemical stripping analysis 14. Antimony reveals a
similar potential window to bismuth and mercury, an attractive performance for
191
measurements in more acidic media and in the presence of oxygen and an interestingly low
stripping signal for antimony itself. By now several applications of the antimony electrodes
are published, e.g. antimony film carbon paste electrodes (SbF-CPE) 15, antimony screenprinted electrode and antimony nanoparticle modified boron doped electrodes etc 16,17.
Experimental
Voltammetric and potentiometric (stripping) measurements were performed using a modular
electrochemical system (Autolab, Eco Chemie, The Netherlands), equipped with a
potentiostat PGSTAT12 and driven by GPES 4.9 software (Eco Chemie, The Netherlands).
For all experiments a three electrode system was employed using different kinds of bismuth
and antimony based electrodes as working electrodes, an Ag/AgCl(satd. KCl) as reference
electrode and a platinum rod as counter electrode. Bismuth and antimony film electrodes were
usually plated on a glassy carbon disk (d = 2 mm) or carbon paste (d = 2 mm or 3 mm)
substrate. All measurements were carried out in a 20 ml voltammetric cell equipped with a
computer controlled magnetic stirrer at room temperature (23 ± 2 °C). If not stated otherwise
measurements were carried out in non-deaereted solutions.
All chemicals were of analytical purity grade and used as received. Ammonium
tetraflurobismuthate was synthesized in Pardubice, Czech Republic. Water used for solution
preparation was first deionized and further purified via an Elix/Milli-Q unit (Millipore,
Bedford, USA).
In- and ex-situ prepared bismuth film electrodes were prepared from 0.1 M acetate buffer
solution (pH 4.5) containing Bi(III) by applying a sufficient negative potential. Antimony film
electrodes were prepared from 0.01 M hydrochloric acid containing Sb(III). The BiF4-CPE
was prepared by mixing 0.5 g of the bare carbon paste material with 3 % (w/w) of ammonium
tetrafluorobismuthate.
Results and discussion
The in-situ prepared SbF-CPE revealed excellent possibilities for the measurements of In(III)
and Tl(I) in the presence of Zn(II) in 0.01 M hydrochloric acid in combination with the
chronopotentiometric stripping mode. The performance of the SbF-CPE was compared to its
bismuth (BiF-CPE) and mercury (MF-CPE) counterparts. Due to the low pH the measurement
of Zn(II) was precluded at the BiF-CPE, whereas at the MF-CPE the signal of Tl(I) was
suppressed and not well separated from the signal of In(III) (Fig. 1). Interestingly, at the SbFCPE two signals of In(III) were obtained. This phenomenon might be explained with the
intermetallic film formation between antimony and indium and the successive stripping of
deposited indium and indium-antimony intermetallic compound from the electrode surface.
Another possible explanation is the oxidation of In(0) to In(III) in two steps via In(I).
Moreover it is interesting that at deposition potentials less negative than -1.2 V no signal of
In(III) was observed suggesting the possibility of a selective determination of Tl(I). The
electrode exhibited excellent reproducibilities for all three examined analytes, i.e. for Zn(II),
In(III) and Tl(I) of 2.1 %, 1.6 % and 4.0 %, respectively. Detection limits (3σ) of 2.4 μg L-1
for In(III) and 1.4 μg L-1 for Tl(I) were calculated in combination with deposition times of
120 s.
192
In
50 s/V
A
(dt/dE) / s V-1
Zn
Zn
Tl
Tl
In
Tl
-1.4
-1.2
-1
B
In
-0.8
-0.6
C
-0.4
-0.2
Potential / V vs. Ag/AgCl(sat.)
Fig. 1. Comparison chronopotentiometric measurements of 50 μg L-1 In(III), Tl(I) and Zn(II)
at MFE (A), SbFE (B) and BiFE (C) using a CPE substrate in 0.01 M HCl containing
1 mg L-1 Hg(II) (A), 1 mg L-1 Sb(III) (B) and 1 mg L-1 Bi(III). Deposition potential: -1.3 V,
deposition time: 120 s.
An in-situ prepared antimony film electrode on a glassy carbon substrate (SbFE) was
employed for the determination of Ni(II) in the presence of DMG in ammonia buffer solution
(pH 9.0) using adsorptive cathodic stripping voltammetry. In the alkaline ammonia buffer
solution the antimony ions were stabilized from hydrolysis by means of complexation with
tartrate. The measurement protocol was optimized and it was found that employing an unique
four step procedure assured an excellent performance of the SbFE, including (i) the predeposition of the antimony film on the substrate electrode, (ii) the accumulation of the Ni(II)
complex together with further deposition of the antimony film, (iii) the cathodic stripping
voltammetric step, and (iv) the cleaning step at +0.5 V. A RSD of 1.2 % was found and the
LoD (3σ) was calculated to 110 ng L-1 in combination with a deposition time of just 60 s. The
signals obtained at the in-situ prepared SbFE were considerably higher than at the ex-situ
prepared SbFE. In comparison to its bismuth counterpart the in-situ prepared SbFE revealed
slightly lower peak currents; however, the reproducibility was significantly improved.
With the BiF4- CPE, for the first time, an ionic liquid was introduced as a reservoir of bismuth
ions for the metal film formation. Interestingly, the BiF4-CPE revealed its highest
electroanalytical performance in solutions of pH 1 for the determination of Cd(II) and Pb(II)
as test metal ions, whereas most other bismuth based electrodes exhibited more favorable
results in higher pH, i.e. in pH 4.5. This phenomenon can be beneficially exploited for
measurements in solutions of low pH when an increase of the pH is not desirable. In pH 1 the
BiF4-CPE exhibited significantly higher stripping signals of Cd(II) and Pb(II) than at the
Bi2O3-CPE, the BiF-CPE and the BiFE. The BiF4-CPE revealed a RSDs of 8.7 % and 4.6 %
and LoDs (3σ) of 9.8 μg L-1 and 1.2 μg L-1 for Cd(II) and Pb(II), respectively.
The applicability of the BiFE was expanded for measuring pharmaceutics, i.e. sildenafil
citrate using the cathodic stripping voltammetric mode. The measurements were carried out in
acetate buffer solution of pH 4.5. The performance of the BiFE was compared to the
performances of its lead (PbFE) and mercury (MFE) analogues, as well as to the bare glassy
193
carbon electrode (GCE). The BiFE revealed a considerably higher reproducibility than the
bare GCE. Furthermore, higher signals were obtained at the BiFE than at the PbFE and MFE.
As an optimal measurement solution acetate buffer solution with pH 4.5 was selected. The
comparison of the in-situ and ex-situ preparation protocol revealed that the ex-situ prepared
BiFE exhibited a lower background contribution than the in-situ prepared analogue (Fig. 2)
and a relative standard deviation of 1.5 %. The LoD (3σ) was calculated to 1.8 x 10-8 mol L-1
in combination with a deposition time of 120 s.
Current /  A
0
-5
-10
A
-15
B
-20
-0.9
-1
-1.1
-1.2
-1.3
-1.4
-1.5
Potential / V vs. Ag/AgCl(sat.)
Fig. 2. Cathodic square-wave stripping voltammograms of 8 x 10-7 M sildenafil citrate at the
ex-situ (A) and the in-situ (B) prepared BiFE in 0.1 M acetate buffer solution with pH 4.5.
Accumulation of sildenafil citrate at -0.6 V for 90 s.
As another organic compound the neonicotinoid thiamethoxam was measured at the ex-situ
prepared SbFE in 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.0) combined with direct differential
pulse voltammetry. For this purpose the preparation procedure of the antimony film was
studied in detail and as the most suitable procedure a deposition of antimony at -0.5 V for 60 s
from a solution of 10 mg L-1 Sb(III) was chosen. Employing lower deposition times than 60 s
caused lower reproducibility of the TMO signal probably due to too thin antimony films,
since the signal resembled that obtained at the bare GCE. On the contrary, if longer deposition
times were applied a higher background was observed. The comparison between the ex-situ
prepared SbFE, the ex-situ BiFE and the bare GCE revealed similar signals and peak shapes
at all three electrodes. However, the signal obtained at the SbFE was slightly higher than the
ones obtained at the other electrodes. Additionally, the bare GCE revealed a poor
reproducibility. A RSD of 1.6 % was found for TMO whereas the LoD (3σ) was calculated to
560 μg L-1.
Conclusions
Excellent results were obtained at all examined bismuth and antimony electrodes with
favorable reproducibility and detection limits. In this work, for the first time an antimony film
electrode was prepared in-situ in mildly alkaline media, i.e. in ammonia buffer solution of pH
9.0, for the determination of nickel. An advantage of using in-situ prepared electrodes is that
just one solution is required for the deposition of film and analyte since the film preparation
step for ex-situ prepared film electrodes is often time-consuming. Additionally, with the BiF4CPE, for the first time, an ionic liquid had been used as a reservoir of bismuth ions for the
film formation and the favorable properties of the bismuth film electrodes have been
combined with the properties of ionic liquid modified carbon paste electrodes. Two different
194
organic compounds had been measured, namely sildenafil citrate and the neonicotinoid
thiamethoxam. With the application of the BiFE the voltammetric determination of sildenafil
citrate was carried out for the first time at a non-toxic metal film electrode.
Acknowledgements
Financial support from the Slovenian Research Agency (P1-0034 and BI-CZ/07-08-008) is
gratefully acknowledged.
Literature
1. Wang J.: Analytical Electrochemistry, 3rd ed., Wiley-VCH, Hoboken, New York 2006.
2. Wang J., Tian B.: Anal. Chem. 65, 1529 (1993).
3. Nolan M. A., Kounaves S. P.: Anal. Chem. 71, 3567 (1999).
4. Mikkelsen Ø., Schrøder K. H.: Electroanalysis 13, 687 (2001).
5. Wang J., Lu J., Hocevar S.B., Farias P.A.M., Ogorevc B.: Anal. Chem. 72, 3218 (2000).
6. Hutton E., Ogorevc B., Hocevar S.B., Weldon F., Smyth M., Wang J.: Electrochem.
Commun. 3, 707 (2001).
7. Wang J.: Electroanalysis 17, 1341 (2005).
8. Wang J., Lu J., Kirgöz Ü. A., Hocevar S. B., Ogorevc B.: Anal. Chim. Acta 434, 29
(2001).
9. Sopha H., Hocevar S. B., Pihlar B., Ogorevc B.: Electrochim. Acta 60, 274 (2012).
10. Baldrianova L., Svancara I., Vlcek M., Economou A., Sotiropoulos S.: Electrochim. Acta
52, 481 (2006).
11. Krolicka A., Pauliukaite R., Svancara I., Metelka R., Bobrowski A., Norkus E., Kalcher
K., Vytras K., Electrochem. Commun. 4, 193 (2002).
12. Sopha H., Baldrianova L., Tesarova E., Grinciene G., Weidlich T., Svancara I.,
Hocevar S. B.: Electroanalysis 22, 1489 (2010).
13. Buckova M., Gründler P., Flechsig G. U.: Electroanalysis 17, 440 (2005).
14. Hocevar S. B., Svancara I., Ogorevc B., Vytras K., Anal. Chem. 79, 8639 (2007).
15. Sopha H., Baldrianova L., Tesarova E., Hocevar S. B., Svancara I., Ogorevc B.,
Vytras K., Electrochim. Acta 55, 7929 (2010).
16. Kokkinos C., Economou A., Raptis I., Speliotis T.: Electrochem. Commun. 11, 250
(2009).
17. Toghill K. E., Xiao L., Wildgoose G. G., Compton R. G.: Electroanalysis 21, 1113
(2009).
195
Determination of Nicotine at a Carbon Paste Electrode Using Square-Wave
Voltammetry
(Stanovení nikotinu na uhlíkové pastové elektrodě technikou square-wave voltametrie)
Matěj Stočes, Iveta Ksandrová, and Ivan Švancara
Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice,
CZ-532 10, Pardubice, Czech Republic. Email: [email protected]
Abstract
Unmodified carbon paste electrode was employed for determination of nicotine in samples of
nicotine mouth spray by using square-wave voltammetry with method of multiple standard
additions. The samples did not require any prior pre-treatment process and were directly
analysed in phosphate buffer (pH ≈ 7.5). In order to avoid decreasing of nicotine signal with
subsequent measurement it was necessary add condition step before each measurement,
finding that the best conditioning step consist of 30 second potentiostatic hold at -0.2 V . The
found amount of nicotine in each sample correlated with the amount declared by
manufacturer.
Key words: Carbon paste electrode, Square-wave voltammetry, Unmodified, Nicotine
determination.
Úvod
Nikotin, 3-[(2S)-1-methylpyrrolidin-2-yl]pyridin, je jedním z hlavních alkaloidů obsažených
v listech tabákovníku (Nicotiana tabacum, česky Tabák virginský), které jsou zpracovávány
do podoby cigaret, řezaného tabáku, nebo doutníků. Nikotin se dostává do lidského těla
nejčastěji ve formě cigaretové kouře a následnou inhalací v plicích. Do našeho těla se ale
dostává i skrz kůži (například pomocí tzv. nikotinových náplastí) nebo přes dutinu ústní nebo
nosní sliznici. Kouření má na lidské zdraví celou řadu negativních vlivů 1,2 (nemocnění plic,
kardiovaskulárního systému, nádorové bujení a mnoha dalších). Na druhou stranu a navzdory
jeho vysoké toxicitě je dle některých posledních studií doporučován při terapeutické léčbě
neurogenerativních onemocněních jako je Alzheimerova nebo Parkinsonova choroba 3.
Stanovení nikotinu je důležité jak pro samotný tabákový průmysl (kdy obsah nikotinu je
jednou ze sledovaných složek při dodržování a kontroly kvality tabákových výrobků), tak
z pohlednu toxikologického a medicínského.
K zjištění obsahu nikotinu ve vzorcích cigaret, tabákových listů, přípravků určených
k odvykání kouření, ve vzorcích vlasů, krvi a moči je využíváno moderních analytických
a separačních metod a technik jako je kapalinová 4-8 a plynová chromatografie 9-12, kapilární
elektroforéza 13, spektrofotometrie 14,15 nebo spektrofluorometrie 16. Elektroanalytických
metod pro stanovení nikotinu není mnoho, a to zejména z toho důvodu, že ke sledovaným
oxidačním procesům nikotinu dochází při značně pozitivních hodnotách potenciálu, což může
být limitující pro některé typy běžně používaných elektrod. S úspěchem bylo využito bórem
dopované diamantové elektrody pro stanovení nikotinu v alkalickém prostředí 17, sledování
redukce nikotinu byla prováděna na kapající rtuťové elektrodě 18 s následným stanovením
v nikotinových náplastích, tabletách a žvýkačkách. Amperometrické stanovení bylo
provedeno na elektrodě TiO2/poly(3,4-ethylenedioxythiophene) připravené technikou
molekulárního imprintu 19 a byla rovněž popsána metoda injekční průtokové analýzy spolu
s elektrochemicko-luminiscenční technikou pro stanovení obsahu nikotinu 20. Snížení
potenciálu nutného k detekci nikotinu bylo dosaženo na elektrodě založené na uhlíkových
nanotrubičkám pokrytých vrstvou nanočástic hlinitomřemičitanů 21.
V současnost narůstá obliba alternativního přijímání nikotinu do lidského organismu –
například populární elektronické cigarety nebo například tzv. nikotinové ústní spreje. Tato
196
práce se soustředí na elektroanalytické využití uhlíkové pastové elektrody pro stanovení
nikotinu ve vybraných reálných vzorcích.
Experimentální část
Chemikálie
Všechny použité chemikálie byly čistoty p.a. od firmy Aldrich nebo Merck. Standardní
zásobní roztok nikotinu byl připraven o koncentraci 63,16 mM (102,46 mg / 10 ml) a zásobní
roztok fosfátové pufru o koncentraci 0,1M a pH ≈ 7,5.
Příprava pracovní elektrody
Uhlíková pastová elektroda (CPE) byla připravena důkladným smícháním 0.3 g uhlíkového
prášku (CR-5, Lučební závody Kolín) s vysoce viskózním silikonovým olejem (SO, typ
LUKOIL MV 8000; Lučební závody Kolín), aby výsledná pasta obsahoval 20% hm.
silikonového oleje. Zhotovená pasta byla vpravena do pouzdra vlastní konstrukce.
Příprava reálných vzorků
Vzorky nikotinových sprejů NicoStar byly před vlastní analýzou pouze odplyněny
v ultrazvukové lázni. Další úpravy se vzorkem nebyly prováděny. K vlastní analýze bylo
pipetováno 1 ml vzorku do 19 ml základní elektrolytu (fosfátový pufr). Stanovení bylo
prováděno metodou vícenásobného standardního přídavku.
Instrumentace
Pro všechna měření v režimu square-wave voltametrie bylo použito elektrochemické pracovní
stanice Autolab PGSTAT12 (Metrohm) ovládané pomocí softwaru NOVA 1.9 (tentýž
výrobce). Pracovní elektrodou byla uhlíková pastová elektroda; referenční elektrodou pak
Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou platinová elektroda. Všechna měření byla prováděna ve
voltametrické nádobce v objemu 20 ml při konstantní laboratorní teplotě (22 ± 2 ºC).
Postup a měření
Všechna měření probíhala v režimu square-wave voltametrie (frekvence 50 Hz, amplituda
50 mV) v potenciálovém rozsahu 0,3 až 1,3 V. Před každým měření byla rovněž prováděna
kondicionace elektrody po dobu 30 s při potenciálu -0,2 V.
Výsledky a diskuse
Uváděné výsledky dokumentují uplatnění uhlíkových elektrod a obecněji elektroanalytických
metod při praktických analýzách reálných vzorků. Odráží i velmi důležitý fakt, že při
vhodném výběru analytické metody lze minimalizovat náklady potřebné na analýzu jednoho
vzorku, což v soukromém sektoru hraje jednu z klíčových rolí. Uhlíková pasta elektroda
(CPE), která si na poli elektrochemie vydobyla své pevné postavení, ve spojení s technikou
přímé square-wave voltametrie je toho konkrétním příkladem. Při stanovení nikotinu
v nikotinových ústních sprejích NicoStar byly sledovány oxidační procesy nikotinu, ke
kterým dochází na povrchu CPE dochází při cca při 0,9 V. Nezbytným krokem před každým
voltametrickým záznamem bylo zařazení kondicionace elektrodového povrchu při vloženém
potenciálu -0,2V po 30s. Pokud tento krok nebyl zařazen, docházelo při opakovaném měření
k rapidnímu poklesu proudového signálu nikotinu (Obr. 1). Delší doby kondicionace než
30s neměly na měřený signál žádný vliv (pozitivní ani negativní). Vliv vloženého potenciálu
při kondicionačním kroku byl studován v rozsahu od -1,6 v do + 0,6 V a byly zaznamenány
jen nepatrné změny v proudové odezvě signálu nikotinu s maximem pro potenciál -0,2 V.
197
Obr. 1: Vliv kondicionace elektrody na proudovou odezvu nikotinu. (A) bez kondicionace; (B)
s kondicionací. Experimentální podmínky: CPE; c(Nik)= 0,5 mmolL-1; 0,05 M fosfátový pufr
pH ≈ 7,5. Podmínky kondicionace: Econd = -0,2 V; tcond = 30 s. Podmínky square wave
voltametrie viz experimentální část.
198
Stanovení vzorků bylo prováděno metodou vícenásobného standardního přídavku
a vyhodnocováno příslušnou extrapolací získaných lineárních regresí. Stanovení každého
vzorku bylo provedeno desetkrát. Ukázkový voltamogram analýzy vzorku spolu s třemi
standardními přídavky demonstruje obrázek č. 2 a získané výsledky jsou shrnuty v tabulce I.
Výsledky jsou udávány jako hmotnost nikotinu v mg na 1 ml.
Tabulka I:
Obsah nikotinu ve vzorcích nikotinového spreje NicoStar.
Obsah nikotinu (mg / ml)
Vzorek č. 2
Vzorek č. 3
měření č.: Vzorek č. 1
0,687
0,853
0,789
1
0,621
0,735
0,691
2
0,641
0,779
0,712
3
0,641
0,798
0,737
4
0,659
0,826
0,752
5
0,717
0,724
0,696
6
0,725
0,746
0,695
7
0,682
0,707
0,715
8
0,697
0,740
0,745
9
0,714
0,741
0,733
10
Ø 0,678 ± 0,034 0, 765 ± 0,045 0,729 ± 0,029
Obr. 2. Ukázkový voltamogram získaný při stanovení nikotinu ve vzorku nikotinového
ústního spreje metodou vícenásobného standardního přídavku. Plná čára (—) vzorek;
přerušovaná čára (---) jednotlivé standardní přídavky. Experimentální podmínky: CPE;
standardní přídavky 3 × 0,150 mmolL-1; 0,05 M fosfátový pufr pH ≈ 7,5. Podmínky
kondicionace: Econd = - 0,2 V; tcond = 30 s. Podmínky square wave voltametrie viz
experimentální část.
199
Závěr
Stanovení nikotinu ve vzorcích nikotinových ústních sprejů bylo provedeno pomocí uhlíkové
pastové elektrody a techniky přímé square-wave voltametrie v prostředí fosfátového pufru bez
nutnosti předchozí úpravy vzorku nebo modifikace povrchu pracovní elektrody. Získané
výsledky jsou v současné době konzultovány s výrobcem, ale jejich hodnoty jsou v rámci
deklarovaného množství uváděného na etiketě výrobku.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou MŠMT (No. CZ.1.07/2.3.00/30.002) a AIP ČR v rámci
bilaterálního programu KONTAKT, ev. č. MEB091139.
Literatura
1. Alberg A. J.: Drugs Today 44, 895 (2008).
2. Yildiz D.: Toxicon 43, 619 (2004).
3. Picciotto M. R., Zoli M.: Front. Biosci. 13, 492 (2008).
4. Domino E.F., Hariharan M., VanNoord T., Demana T.: Med. Sci. Res. 20, 859 (1992).
5. Dash A. K., Wong S. T.: J. Chromatogr. A 749, 81 (1996).
6. Tambwekar K. R., Kakariya R. B., Garg S.: J. Pharm. Biomed. Anal. 32, 441(2003).
7. Page-Sharp M., Hale T.W., Hackett L.P., Kristensen J.H., Ilett K. F.: J. Chromatogr. B
796, 173 (2003).
8. Mahoney G. N., Al-Delaimy W.: J. Chromatogr. B 753, 179 (2001).
9. Beckett A. H., Triggs E. J.: Nature 211, 1415 (1996).
10. Shin H. S., Kim J. G., Shin Y. J., Jee S. H.: J. Chromatogr. B 769, 177 (2002).
11. Cai J., Liu B., Lin P., Su Q.: J. Chromatogr. A 1017, 187 (2003).
12. Man C. N., Ismail S., Harn G. L., Lajis R., Awang R.: J. Chromatogr. B 877, 339 (2009).
13. Marsh A., Clark B. J., Altria K. D.: Electrophoresis 25, 1270 (2004).
14. Liu J.-F., Feng Y.-D.: Talanta 47, 833 (1998).
15. Al-Tamrah S. A.: Anal. Chim. Acta 379, 75 (1999).
16. Zhou Y., Yu H., Zhang L., Xu H., Wu L., Sun J., Wang L.: Microchim. Acta 164,. 63
(2009).
17. Suffredini H. B., Santos M. C., De Souza D., Codognoto L., Homem-de-Mello
P.,Honorio K. M., Da Silva A. B. F., Machado S. A. S., Avaca L. A.: Anal. Lett. 38, 1587
(2005).
18 . Hannisdal A., Mikkelsen Q., Schrøder K.H.: Collect. Czech. Chem. Commun. 72, 1207
(2007).
19. Wu C.-T., Chen P.-Y., Chen J.-G., Suryanarayanan V., Ho K.-C.: Anal. Chim. Acta 633,
119 (2009).
20. Lin M. S., Wang J. S., Lai C. H.: Electrochim. Acta 53, 7775 (2008).
21. Wang S.-J., Liaw H.-W., Tsai Y.-C.: Electrochem. Commun. 11, 733 (2009).
200
Use of New Electrode Materials for Tasks of Food, Clinical and Environmental Analyzes
(Využitie nových elektródových materiálov pre úlohy potravinárskych, klinických
a environmentálnych analýz)
Jana Svítková, Ľubomír Švorc, Miroslav Rievaj, Dušan Bustin, and Ján Labuda
Slovak University of Technology, Faculty of Chemical and Food Technology, Institute of
Analytical Chemistry, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovak Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
The aim of this contribution is to compare the electrochemical behavior of the commercially
available electrodes such as graphite, glassy carbon, screen-printed carbon electrode (SPCE)
with a new electrode material which belongs to the area of “green” analytical chemistry. The
main emphasis is on characterization and analytical applications of the most perspective
electrode material at present - boron-doped diamond (BDD). The comparative study was
carried out by cyclic voltammetry.
Key words: Carbon electrodes, Boron-doped diamond, Screen printing carbon electrode,
Voltammetry.
Úvod
V posledných dvoch desaťročiach sa pozornosť elektrochemikov venuje novému
elektródovému materiálu - bórom dopovaného diamantu (BDD). Samotný diamant sa
vyznačuje mimoriadnou mechanickou aj chemickou stabilitou. Je jedným z najlepších
prírodných izolátorov a na jeho elektroanalytické využitie je nutné ho dopovať atómami iných
prvkov, najčastejšie atómami bóru 1,2. Publikovali sa početné štúdie zamerané na naviazania
DNA pomocou uhlíkových elektród a sieťotlačených elektród. Typicky používané
elektródové materiály majú niektoré nevýhody ako napr. slabú mechanickú stabilitu,
obmedzený potenciálový rozsah (Hg), zložitejšiu obnoviteľnosť povrchu (Pt, C) alebo
nemožnosť ďalšieho použitia po modifikácii elektródy (SPCE) 3-5. Preto sa v súčasnosti
systematicky hľadajú nové elektródové materiály vykazujúce širší potenciálový rozsah, nižší
šum a zvyškový prúd, použiteľné v rôznych rozpúšťadlách, odolné voči pasivácii, s dobrou
chemickou stabilitou, nízkou citlivosť a dobrá odolnosť proti povrchovému znečisteniu v
dôsledku slabej adsorpcie Dôležitou požiadavkou je aj ich minimálna toxicita, nízke
prevádzkové náklady a ľahko obnoviteľný povrch elektródy aj po chemickej modifikácii
povrchu 6,7.
Výber materiálu pre DNA modifikované elektródy je úzko spätý s technikou imobilizácie
DNA na povrchu elektródy, ktorý hrá veľmi dôležitú úlohu v celkovom použití elektródy ako
senzora. Nie sú nám známe publikácie o štúdiu a optimalizácii podmienok pre
elektrochemické sledovanie DNA na BDDE a pre jej modifikáciu s DNA. V štúdiu sa
zameriavame na uplatnenie BDD elektródy ako citlivého elektrochemického senzora pre
voltampérometrické stanovenie a v konkrétnej prezentovanej práci pre naviazanie DNA na
povrch elektródy. Porovnáva sa a charakterizuje 4 komerčne dostupných elektród (CE, GCE,
SPCE a BDDE) z hľadiska možnosti modifikácie ich povrchu karboxylovanými
jednostennými uhlíkovými nanorúrkami (SWCNT-COOH) a imobilizácie DNA. Použitý
chitozán je biokompatibilný biopolymér s voľnými aminoskupinami, ktoré v slabo kyslom
prostredí protonizujú a zabezpečujú tak kladný náboj a iónovýmenné vlastnosti. Preto sa
používa v biosenzoroch ako matrica na imobilizáciu biozložky aj ako externá ochranná vrstva
biozložky pred interferentami. Uhlíkové nanorúrky patria k známym materiálom významne
zlepšujúcim elektrickú vodivosť a chitozán k prostriedkom zabezpečujúcim stabilitu
imobilizácie DNA 8,9.
201
Experiment
Všetky voltampérometrické merania sa uskutočnili pomocou elektrochemického analyzátora
AUTOLAB PGSTAT 302N (EcoChemie, Utrecht, Holandsko) v spojení s externým
elektródovým stojanom PA-4 SMDE (Laboratorní přístroje, Praha), ktorý bol prispôsobený
pre prácu s BDD elektródou. V trojelektródovom zapojení bola pracovná elektróda (4
komerčne dostupných elektród) BDD s priemerom filmu 3 mm (Windsor Scientific, Veľká
Británia), CE, GCE, alebo SPCE, platinový drôtik ako pomocná elektróda,
a argentochloridová Ag/AgCl/3 mol l-1 KCl ako referenčná elektróda. Všetky experimenty sa
uskutočnili pri laboratórnej teplote. Jednotlivé voltampérogramy sa spracovali a vyhodnotili v
softvéri NOVA 1.7. Cyklická voltampérometria (CV) a diferenciálna pulzová
voltampérometria (DPV) sa realizovali bez predbežného prebublávania roztoku, pretože
rozpustený kyslík nezasahoval do anodického potenciálového okna elektród. Po optimalizácii
inštrumentálnych parametrov sa zaznamenávali DPV voltampérogramy.
Zásobný roztok K3[Fe(CN)6] a K4[Fe(CN)6] v látkovom pomere 1:1 s výslednou
koncentráciou 1.10-3 mol l-1 sa doplnil na 100 ml tlmivým roztokom 0.1 mol l-1 PBS
(pH=6.9). Zásobný roztok dsDNA sa pripravil v koncentrácii 2 mg ml-1 v prevarenej
deionizovanej vode a skladoval pri teplote 4°C. Na povrch pracovnej elektródy sa naniesli 4
μl zásobného roztoku DNA, ktorý sa nechal zaschnúť minimálne 8 hod. Pred samotným
meraním sa elektróda ponorila na 2 min do PBS, aby sa uvoľnila adsorpciou neviazaná DNA.
Chitozán z krevetových pancierov, nízkoviskózny (CHIT) bol od Fluka, Nemecko. Jeho 0,5%
roztok bol pripravený v 1% (v/v) kyseline octovej (99.8%, Lachema, Česká republika) a
preliftrovaný cez filtračný papier. Konečný roztok chitozánu mal pH=5,0. Karboxylované
SWCNT (priemer 4–5 nm, dĺžka 500–1500 nm) boli od Sigma–Aldrich, Nemecko. Roztok
SWCNT s obsahom 1 mg ml−1 sa pripravil v deionizovanej vode. Zmes SWCNT-COOH a
CHIT sa pripravila v pomere 1:1 (v/v).
Výsledky a diskusia
V prvom kroku bolo potrebné optimalizovať podmienky merania. Pre voľbu vhodného
meracieho potenciálu sa robili merania v rozsahoch -0.8 V – 0.8 V, -1 V – 1 V, -1.5 V – 1.5
V, -2 V – 2 V, pomocou cyklickej voltampérometrie. Na základe experimentu pri rôznych
potenciáloch sa pre ďalšie experimenty použil potenciálový rozsah -0.8 V - 0.8 V pre
všetkých 4 komerčne zakúpených elektród (obr. 1).
Obr. 1. CV záznamy 1.10-3 mol l-1 [Fe(CN)6]3–/4– v 0.1 mol l-1 PBS (pH= 6.9) získané na
nemodifikovaných elektródach, rýchlosť polarizácie 50 mV s-1.
202
V ďalšom kroku sa modifikovali povrchy elektród nanesením malého objemu roztoku
SWCNT-COOH a zaschnutím alebo nanesením malého objemu roztoku DNA, pričom sa
vrstva DNA nechala schnúť počas noci a na tmavom mieste. Nakoniec sa rovnako pripravili
elektródy modifikované vrstvou SWCNT-COOH a po zaschnutí aj vrstvou DNA. Získané CV
záznamy sú na obr. 2.
Obr. 2. CV záznamy 1.10-3 mol l-1 [Fe(CN)6]3–/4– v 0.1 mol l-1 PBS (pH= 6.9) získané na
elektródach modifikovaných s SWCNT-COOH a DNA, rýchlosť polarizácie 50 mV s-1.
Na obr. 3 a obr. 4 vidieť porovnanie CV záznamov získaných na nemodifikovaných ako aj
modifikovaných elektródach BDD a SPCE.
Obr. 3. CV záznamy 1.10-3 mol l-1 [Fe(CN)6]3–/4– v 0.1 mol l-1 PBS (pH= 6.9) získané na
nemodifikovanej BDD a modifikovanej BDD elektróde: DNA/BDD, SWCNT-COOH/BDD,
DNA/SWCNT-COOH/BDD. Kontrola: CV záznam na BDD v 0.1 mol l-1 PBS. Rýchlosť
polarizácie 50 mV s-1
203
Obr. 4. CV záznamy 1.10-3 mol l-1 [Fe(CN)6]3–/4– v 0.1 mol l-1 PBS (pH= 6.9) získané na
nemodifikovanej SPCE a modifikovanej SPCE elektróde: DNA/SPCE, SWNT-COOH/SPCE,
DNA/SWCNT-COOH/BDDE. Kontrola: CV záznam na SPCE v 0.1 mol l-1 PBS. rýchlosť
polarizácie 50 mV s-1.
Z CV záznamov indikátora 1.10-3 mol l-1 [Fe(CN)6]3–/4– v 0.1 mol l-1 PBS (pH= 6.9) získaných
pomocou komerčných elektród BDDE (obr. 3) a SPCE (obr. 4) vidieť, že uhlíkové nanorúrky
významne zlepšujú ich elektrické vlastnosti, čo sa prejaví lepšie vyvinutým tvarom CV
a hodnotou prúdu píku. Potvrdilo sa tiež, že ako holé tak aj nanorúrkami modifikované BDD
a SPCE elektródy možno úspešne modifikovať aj vrstvou dsDNA, čo vedie k horšiemu tvaru
CV s väčšou separáciou Ep ako aj s nižším prúdom píku indikátora. Tieto pozorovania
potvrdili aj číselné hodnoty parametrov CV záznamov.
Z CV záznamov získaných použitím všetkých študovaných komerčných elektród (CE, GCE,
SPCE a BDDE) nemodifikovaných ako aj rôzne modifikovaných vrstvami SWCNT-COOH,
DNA a DNA/SWCNT-COOH sa zistili hodnoty Ipa (maximálny prúd anodického píku) a ΔEp
(rozdiel potenciálov katodického a anodického píku), ktoré sú zhrnuté v Tabuľke 1. Z daných
hodnôt vyplýva, že po modifikácií povrchu elektród s DNA sa dôsledkom jej negatívneho
náboja znížil prúd negatívne nabitého indikátora a zvýšil sa rozdiel potenciálov píkov.
Modifikáciou SWCNT-COOH sa redoxný systém indikátora stal reverzibilnejší oproti
nemodifikovaným elektródam. Na elektródach modifikovaných kombináciou DNA/SWCNTCOOH sa vyššie opísaným spôsobom prejavili oba modifikátory, pričom CV záznamy
predstavujú dobrú možnosť analytickej detekcie DNA.
Tabuľka I.
Znázorňuje hodnoty Ipa a ΔEp pre nemodifikované a modifikované elektródy CE, GCE, SPCE,
a BDDE.
Modifikátor nemodifikovaná
DNA
SWCNT-COOH DNA/SWCNT-COOH
/Elektróda
Ipa, μA ΔEp, V Ipa, μA ΔEp, V Ipa, μA ΔEp, V
Ipa, μA
ΔEp, V
CE
24,8
0,4053
21,8 0,4981 59,5
0,2344
68,5
0,3565
GCE
13,1
0,1514
2,2
0,9424 29,8
0,2295
5,7
0,6641
SPCE
23,1
0,5615
16,9 0,6201 48,5
0,4492
86,9
0,3076
BDDE
9,4
0,2344
5,2
0,6738 43,8
0,1855
29,9
0,2734
204
Štúdium zároveň potvrdilo vhodnosť konštrukcie biosenzora s využitím chitozánu, keď
polymérna vrstva na elektróde stabilizovala imobilizáciou vo vode inak dobre rozpustných
SWCNT-COOH. Druhou úlohou pozitívne nabitého filmu chitozánu bolo elektrostaticky
stabilizovať tiež imobilizáciu negatívne nabitej DNA.
Záver
Daný príspevok štúdia zapadá do koncepcie „zelenej“ analytickej chémie, najmä pre šetrenie
prostredia z hľadiska záťaže odpadom v prípade BDD elektród. Práca smeruje k využitiu
nových elektródových materiálov na analýzu v potravinárskych, klinických a
environmentálnych laboratóriách. Zaoberá sa štúdiom BDD elektródy ako citlivého
a selektívneho elektrochemického senzora a možnosťou modifikácie jej povrchu pomocou
SWCNT-COOH a DNA. BDD elektróda bola porovnávaná s inými uhlíkovými elektródami a
sieťotlačenej uhlíkovej pastovej elektródy. Z výsledkov sa zistilo, že komerčná BDDE je
nielen elektródou, ktorá samotná poskytuje reverzibilný obraz depolarizátora, ale je aj vhodná
na modifikáciu s SWCNT-COOH a imobilizáciu DNA. Dáva porovnateľné výsledky ako
SPCE, no modifikovaná BDDE má dlhšiu životnosť a je možné ju používať aj po nanesení
DNA (stačí ju len elektrochemicky očistiť), čo v prípade SPCE nie je možné.
Poďakovanie
Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe zmluvy č.
APVV-0797-11. Autori ďakujú za podporu Vedeckej grantovej agentúre VEGA MŠ SR
a SAV (projekt č. 1/0182/11 a 1/0051/13) a Programu na podporu mladých výskumníkov.
Literatúra
1. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009).
2. Granger M. C., Xu J. S., Strojek J. W., Swain G. M.: Anal. Chim. Acta 397, 145 (1999).
3. Manivannan A., Ramakrishnan L., Seehra M. S., Granite E., Buttler J. E., Tryk D. A.,
Fujishima A.: J. Electroanal. Chem. 577, 287 (2005).
4. Sonthalia P., Mcgaw E., Show Y., Swain G. M.: Anal. Chim. Acta 522, 35 (2004).
5. Zhang Y., Yoshibara J.: Electroanal. Chem. 573, 327 (2004)
6. Pecková K., Musilová J., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 148 (2009).
7. Pleskov Y. V.: J. Appl. Electrochem. 38, 1275 (2002).
8. Galandová J., Ziyatdinova G., Labuda J.: Anal. Sci. 24, 711 (2008).
9. Ambrózy A., Hlavatá L., Labuda J.: Acta Chimica Slovaca, In Press.
205
The Influence of Labile Complexes on Cadmium Transport across Artificial
Phospholipid Membrane
a
Ivana Šestáková , Martina Parisová a,b, Kateřina, Nováková a,c, and Tomáš Navrátil a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3,
182 23 Prague, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 128 43 Prague 2,
Czech Republic
c
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and
Chemical Engineering. Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic
Abstract
The influence of labile cadmium complexes on transport across phospholipid membrane with
A23817 ionophore – the increase of the amount of transported cadmium ions - has been found
when only diffusion controlled transport was applied. Lability of Cd-MA complex was
demonstrated with stripping chronopotentiometry. Used experimental setup can be utilized for
specifying conditions for transport of metal complexes with different stability.
Key
words:
Cadmium,
Malic
acid,
Phospholipid
membranes,
Voltammetry,
Chronopotentiometry, Labile complexes, Electrochemical impedance spectroscopy.
Introduction
Citric and malic acids belongs to the group of low molecular organic acids, which can be
found as root exudateds in rhizosphere, where they form complexes with metal ions and
influence solubility and uptake by plants 1. Several studies have shown that this uptake is well
correlated with the concentration of the free, uncomplexed metal ions as is described in FIAM
model from aquatic toxicology. Nevertheless, some exceptions have been reported, namely
for labile Cd complexes 2,3. The possibility that dissociation of labile metal complexes in the
diffusive boundary layer enhances diffusion limited uptake of metals has been examined
theoretically and further confirmed using technique of diffusive gradient in thin films. The
observed effect of Cd complexes was assumed to be governed by the diffusional flux 4.
In connection with our studies of the influence of LMWOAs on cadmium and copper
transport across model phospholipid membranes 5 with ionophore A23187 some differences
were observed between malic or citric acid. As potentiometric determination of stability
constant suggest labile behavior of cadmium malate complex 6, additional experiments were
performed, where for transport of cadmium malate complex only diffusion was important.
Again, electrochemical impedance spectroscopy, voltammetry and also chronopotentiometry
were involved in this study.
Experimental part
Apparatus
The electrochemical impedance spectroscopy measurements were realized using CHI 650C
Electrochemical Analyzer/Workstation, Software: CHI v 8.1 (IJ Cambria Scientific, UK) and
Potentiostat No. 283 and FRA No. 1025, No. 5210 (Princeton Applied Research, USA). The
electrochemical impedances were determined using silver/silver chloride electrodes (silver
wire, diameter 1 mm, electroplated by silver chloride). Platinum wire, diameter 1 mm, served
as the auxiliary electrode. In our EIS measurement (the dependence of the imaginary part
(Z’’) on the real part (Z’) of impedance recorded in 0.1 M KCl) the system provided
satisfactory results in the frequency range of 0.1 – 1000 Hz, amplitude 0.005 V. But for this
study, in order to maintain conditions for only diffusion in the transport, no potential has been
applied after addition of cadmium ions.
206
The voltammetric determinations of cadmium and copper ions or its complexes were carried
out by the PC-controlled voltammetric analyzer ECO-TRIBO polarograph (Polaro-Sensors,
Prague, Czech Republic), equipped with POLAR.PRO software v. 5.1 and with MultiElchem
v. 2.1 software (J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Czech
Republic). Pen-type electrode – hanging mercury drop electrode (HMDE) was used as the
working electrode, Ag/AgCl/KCl(3 mol L-1) electrode to which all potentials are referred to
and platinum wire served as a counter electrode (both Elektrochemické Detektory, Turnov,
Czech Republic). The measurements were performed at laboratory temperature.
The values of pH were measured using pH-meter Jenway 3505 (Bibby Scientific Limited,
UK).
Electrochemical cell for measurement of metal ions transport
“Insert” cell, was used, which was described earlier 5,7. In this arrangement, the polycarbonate
membrane was glued (epoxy resin CAS 25068-38-6 (UHU, Bühl, Germany)) onto the plastic
cup with a small hole in the center (0.12 cm2), prior to the application of the PL solution. This
cup subsequently formed the bottom of the upper part of the polypropylene electrochemical
cell. Such arrangement ensures the same areas provided for the bilayer formation. To prevent
contamination in the experiments with calcimycin and cadmium ions, all the parts (cup, upper
and lower part) were exchanged for the new ones prior to each experiment. The volume of the
upper part of the cell with “Electrolyte 1” amounted to 3 mL, the compartment with “Electrolyte
2” contained 17 mL of the solutions.
Reagents and Materials
The 0.1 M KCl base electrolyte solutions were prepared from KCl Suprapur, purchased from
Merck, Prague, Czech Republic. The p.a. solvents were obtained from Penta-Švec, Prague, Czech
Republic. All the other chemicals used were of analytical grade. For all the measurements,
deionized water from Milli-Q-Gradient, Millipore, Prague, Czech Republic (conductivity < 0.05
μS.cm-1) was used. The AAS standard solution of Cd2+, Cu2+, and Pb2+ (1000 mg.L-1 in 2 %
HNO3) were purchased from Analytica, Prague, Czech Republic and they were diluted as
necessary.
pH of the solutions was adjusted to desired value with NaOH (Suprapur, Merck, Czech Republic).
For the preparation of SPL membranes 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (lecithin,
DPPC, GPCho (16:0/16:0)) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA) was used. Soya beans (SigmaLMWOAs (CA, MA) were purchased from Sigma Aldrich, Prague, Czech Republic, and their
0.01 M standard solutions were prepared by dissolving appropriate amounts in deionized
water.
The used calcimycin was > 98 % (TLC) (Calcium Ionophore, Antibiotic A23187). The
SPLBs were formed by self-assembling in the holes of the Isopore™ Membrane Filters
(Millipore, USA) polycarbonate, hydrophilic 8.0 μm, and the supporting membrane thickness
amounted to 7-22 µm. The area of one pore amounted to 50 µm2, the experimentally found
porosity of the membranes was about 25-45 %.
Voltammetric determination of cadmium ions
For the determination of cadmium ions, the sample was diluted with 0.1 M KCl and acidified by
addition of HNO3, Suprapur (Merck, Czech Republic), to pH 1. Differential pulse anodic stripping
voltammetry (DPASV) was performed at conditions: accumulation potential (E acc) -800 mV,
accumulation time (tacc) was chosen according to the determined concentration level (from 30 to
240 s), initial potential (Ein) -700 mV, final potential (Efin) +150 mV, scan rate 20 mV.s-1, pulse
amplitude 50 mV. A new drop was used for each record; measurement has been realized in
207
nitrogen atmosphere. Oxygen was removed from the measured solutions by bubbling nitrogen
(purity class 4.6; Messer Technogas, Prague, Czech Republic) for 10 minutes.
Results and discussion
As it was found by us earlier, the SPL membrane is completely formed and stabilized
approximately one hour after insertion of PL solution on the porous material 5,7. Similarly as in
earlier measurement, cadmium ions or Cd2+ with MA at pH 6.5 were added to the upper part (part
1) of electrochemical cell and diffusion transport was allowed for one hour. Then the electrolyte
in compartment 2 was analyzed.
I [nA]
As there are no reducible groups in the molecule of malic or citric acid, cathodic stripping
voltammetry after accumulation of their complexes is suitable method. Similarly as in case of
Cd or Cu phytochelatins 8, potential of -100 mV at solution of 0.1 KCl at pH 5.8 – 6.5 has
been applied for the accumulation of complexes on HMDE.
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
scan
120 s
240 s
240 s
360 s
-100
-200
-300
-400
-500
-600
-700
-800
E [mV]
Fig. 1. DPV of CuMA on HMDE, accumulation at -100 mV: 0, 120, 240 and 360 s. 1·10-6 M
Cu2+, 1·10-4 M malic acid, pH 6.4
Cu complex of MA or CA was employed for detection of transport of LMWOAs across
phospholipid membrane with ionophore A23187. In both cases, only metal ions were
transported across phospholipid membrane 5.
Severe interferences can arise from the presence of lead ions, which form complex with
LMWOAs, which also accumulates and is reduced at above -400 mV. Moreover, above pH
6.5 the highly adsorbable ion PbOH+ is formed 8,9. This is demonstrated on voltammogram of
Cd CA complex,
208
I [nA]
-30
0 s-100
-25
60 s-100
-20
120 s-100
-15
-10
-5
0
-100
-200
-300
-400
-500
-600
-700
E [mV]
Fig. 2. 3·10-6 M Cd2+ and 2·10-4 M citric acid in 0.1 M KCl, pH 7.1 DP CSV, Eacc -100 mV:
tacc 0, 60, 120 s, scan 20 mV/s.
dt/dE [ms/mV]
Contrary to the behavior of Cd CA , For Cd MA there is no substantial peak increase with
accumulation time using DC or DP voltammetry. Using chronopotentiometry with adsorptive
accumulation at – 100 mV and different values of reducing current, the peak of released
cadmium ions could be observed.
70
120s-25nA
60
240s-25nA
50
240s-10nA
40
120-10nA
30
20
10
0
-100
-200
-300
-400
-500
-600
-700
-800
E [mV]
Fig. 3. CdMA - Stripping chronopotentiometry after accumulation at -100 mV (120 or 240s).
Stripping current: -25 and -10 nA, 3·10-6 M Cd2+, 2·10-4 M malic acid, pH 6.5.
209
Enhancement of transport of cadmium ions under diffusion controlled conditions
The average value for transported Cd2+ in 0.1 KCl was 3.9 %, for CdMA complex 12.3.% of
Cd2+ was found. (The same amount of Cd2+ = 20 µg was always applied into compartment 1 at
the beginning of transport). Both values are higher than those in earlier measurement 5: (1.6%
for Cd2+ in 0. 1 KCl and 3.1 % of Cd2+ in case of CdMA.) This is in agreement with lability of
both- cadmium chloro complexes as was described in study of plant uptake 2 and lability of
CdMA complex 3, as was demonstrated also here by chronopotentiometric measurement.
Conclusion
The influence of labile complexes on transport across phospholipid membrane was found,
using artificially prepared membrane with A23817 ionophore. Lability of Cd-MA complex
was demonstrated with stripping chronopotentiometry. Used experimental setup can be
utilized for distiquishing conditions for transport of metal complexes with different stability.
Acknowlegements
The research was supported by GA ČR (project No. P208/12/1645).
References
1. Clemens S.: Biochimie 88, 1707 (2006).
2. Smolders E., McLauglin M. J.: Soil Sci. Soc. Am. J.60, 1443 (1996).
3. Degryse F., Smolders E., Merckx R.: Environ. Sci. Technol. 40, 830 (2006).
4. Van Leeuven H. P.: Electroanalysis 13, 826 (2001).
5. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Marecek V.: Int. J.
Electrochem. Sci.8, 27 (2013).
6. Filella M., Town R. M., Bugari M. G.: J. Chem. Eng. Data 44, 1009 (1999).
7. Navratil T., Sestakova I., Stulik K., Marecek V.: Electroanalysis 22, 2043 (2010).
8. Sestakova I., Vodickova H., Mader P.: Electroanalysis 10, 764 (1998).
9. Jaklova Dytrtová J., Sestakova I., Jakl M., Navratil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009).
10. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Sestakova I., Zins E.L., Schroder D., Navratil T.: Anal.
Chim. Acta 693, 100 (2011).
210
Enzyme-linked Electrochemical Detection of DNA Hybridization at the Surface of Pencil
Graphite Electrode
(Elektrochemická detekce hybridizace DNA na povrchu elektrod z tužkového grafitu
využívající enzymové značky)
a
Jan Špaček , Ece Eksin b, Gulsah Congur b, Luděk Havran a, Petra Horáková a,
Arzum Erdem b, and Miroslav Fojta a
a
Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
b
Analytical Chemistry Dept., Faculty of Pharmacy, Ege University, 35100 Izmir, Turkey
Abstract
Enzyme-linked electrochemical detection systems proved to be potent tools for various
bioassay, including DNA hybridization assays and immunoassays. Previously we presented a
simple technique using target DNA adsorbed on pyrolytic graphite electrode surface and
biotinylated oligonucleotide probe to which alkaline phosphatase was attached via
streptavidine linker. Here we used analogous system in combination with disposable pencil
graphite electrodes. We demonstrate a facile and reproducible detection of DNA hybridization
in a wide range of target concentrations using natural PCR-amplified DNA targets.
Key words: DNA hybridization, Electrochemical DNA sensors, Biotin label, Streptavidin
alkaline phosphatase, p53.
Úvod
Detekce hybridizace DNA je důležitou částí molekulárně biologických metod. Umožňuje
zjištění přítomnosti cílové DNA ve vzorku, čehož lze využít v širokém spektru oborů
od lékařské diagnostiky po potravinářský průmysl. Hledání nových způsobů detekce
hybridizace DNA může vést k vytvoření nových druhů hybridizačních senzorů.
Elektrochemickým metodám je věnována značná pozornost vzhledem k jejich výhodným
vlastnostem, ať již jde o jejich relativní nenákladnost nebo o analytické parametry. Pro účely
analýzy nukleotidových sekvencí se osvědčila kombinace elektrochemické detekce s aplikací
vhodných značek pro hybridizační sondy, jimiž mohou být různé kovalentně připojené
elektrochemicky aktivní skupiny 1 nebo enzymy uvolňující z elektrochemicky neaktivních
substrátů elektrochemicky aktivní produkty.
Typickým příkladem takového enzymu je alkalická fosfatáza (ALP) v kombinaci s 1-naftyl
fosfátem, jehož enzymatickou přeměnou vzniká 1-naftol. ALP je komerčně dostupná ve
formě konjugátu se streptavidinem, který lze snadno navázat na hybridizační sondy koncově
modifikované biotinem. Elektrochemický signál odpovídající hybridizaci DNA
s biotinylovanou sondou a následnému navázání ALP konjugované se streptavidinem pak má
původ v oxidaci 1-naftolu. Tento systém byl využit různých modifikacích, včetně technik
využívajících pro hybridizaci, navázání enzymu a provedení enzymové reakce magnetické
mikročástice 2 i technik založených na provedení celé této procedury na povrchu uhlíkové
elektrody 3,4. Díky „biokatalytické amplifikaci signálu“, tedy produkci mnoha molekul
elektroaktivního indikátoru jednou molekulou enzymu (odpovídající jedné hybridizační
události), má tato metoda přirozeně vyšší citlivost (nižší detekční limit) než metody
využívající koncového značení DNA elektrochemicky aktivní skupinou.
Experimentální část
Prvotní optimalizaci metody jsme prováděli s využitím modelových oligonukleotidů
odvozených z genu p53 2. V další fázi jsme prováděli experimenty na produktech PCR
amplifikovaných z plazmidové DNA obsahující p53 cDNA a v poslední fázi jsme využili
DNA získanou amplifikací genu p53 přímo z buněčných linií. Jako kontroly jsme použili
211
nekomplementární stejně dlouhé oligonukleotidy, PCR produkty s absencí cílové sekvence
a kmeny mutantních lidských buněk s příslušnou delecí v genu p53. Ve všech třech případech
jsme jako sondy použili oligonukleotidy o délce 20 nukleotidů, značené na 5‘ biotinem, plně
komplementární k cílové sekvenci.
Vlastní procedura probíhala v následujících krocích:
1) Adsorpce cílové DNA na elektrodách z tužkového grafitu (bez jejich předchozí úpravy)
2) Blokování zbylého povrchu mléčnými proteiny (v roztoku sušeného mléka)
3) Hybridizace adsorbované cílové DNA s biotinylovanou sondou
4) Zachycení konjungovaného streptavidinu alkalické fosfatázy na biotinových značkách
5) Ponoření elektrody do základního elektrolytu (0,5 M Na2CO3 and 0,5 M NaHCO3, pH 9.5)
obsahujícího 5 mM 1-naftyl fosfát, enzymatická reakce a následné měření.
Obr. 1. Ukázka 4 voltamogramů z hybridizačních experimentů: Pík č. 1 je signál oxidace
1-naftolu, pík č. 2 odpovídá oxidaci mléčných bílkovin použitých pro blokování povrchu
elektrody. Křivky s vyvinutým píkem 1 odpovídají hybridizaci s PCR produktem obsahujícím
cílovou sekvenci, křivky, na nichž tento pík chybí, odpovídají PCR produktům, které danou
cílovou sekvenci neobsahovaly. Voltametrie s lineárním skenem, rychlost polarizace 1 V/s.
Konkrétní podmínky byly odvozeny z předchozí práce 4 a optimalizovány k dosažení
minimálního času celé procedury potřebného pro získání dobře vyvinutého pozitivního
signálu.
Měření jsme prováděli metodou voltametrie s lineárním skenem pomocí potenciostatu
Autolab (Metrohm-Autolab, Holandsko) na soustavě tří elektrod (pracovní elektroda
z tužkového grafitu, referenční elektroda: Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda: platinový
drát) v prostředí.
212
Výsledky a diskuze
Výše popsanou metodou jsme dokázali detekovat hybridizaci se všemi typy cílových DNA,
přičemž limit detekce pro produkty PCR amplifikace fragmentů přirozené DNA o délce 347
bp obsahující 1 cílovou sekvenci byl 8,7 nM. Zjistili jsme, že adsorpce, blokování
a hybridizace dosahuje rovnovážného stavu (dosahuje maximální úrovně) během půl hodiny,
přičemž 1 minuta u každého kroku je dostatečná doba pro citlivé stanovení proběhnutí
hybridizace a odlišení komplementární (cílové) od nekomplementární (nespecifické) DNA
(viz obr. 1). Celou proceduru tak bylo možno provést během cca šesti minut, což je výrazně
méně, než je doba analýzy u většiny běžně využívaných hybridizačních systémů.
Závěr
Předloženou metodou je možné detekovat hybridizaci DNA rychle, s vysokou citlivostí
a dobrou reprodukovatelností a z malého objemu vzorku (5 μl). Zjistili jsme, že komerčně
dostupné pentelkové tuhy mají velice dobrou reprodukovatelnost a jejich jednorázové užití
značně usnadňuje práci s nimi. Tato metoda by v mnoha parametrech mohla konkurovat
současně používaným molekulárně biologickým metodám a v některých parametrech (zejm.
rychlost analýzy) je i předčít.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektů GAČR
a mezinárodního projektu Tübitak-AV ČR č. 111T050.
(P206/12/2378,
P206/11/P739)
Literatura
1. Hocek M., Fojta M.: Chem Soc Rev 40, 5802 (2011).
2. Horakova P., Simkova E., Vychodilova Z., Brazdova M., Fojta M.: Electroanalysis 21,
1723 (2009).
3. Fojta M., Brazdilova P., Cahova K., Pecinka P.: Electroanalysis 18, 141 (2006).
4. Horakova-Brazdilova P., Fojtova M., Vytras K., Fojta M.: Sensors 8, 193 (2008).
213
Sensitive Electrochemical Determination of Selected Opiates Using a Boron-doped
Diamond Film Electrode
Ľubomír Švorc, Miroslav Rievaj, and Dušan Bustin
Slovak University of Technology in Bratislava, Faculty of Chemical and Food Technology,
Institute of Analytical Chemistry, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovak Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
An unmodified boron-doped diamond film electrode was used for the first time as a sensitive
and selective electrochemical sensor for the determination of codeine by the use of differential
pulse voltammetry. Codeine provided a single well-defined oxidation peak at +1.0 V vs.
Ag/AgCl in Britton-Robinson buffer solution at pH 7.0. Using the optimal differential pulse
voltammetric conditions (modulation amplitude of 50 mV, modulation time of 40 ms and scan
rate of 50 mV.s-1), the detection limit of 0.08 µM and the linear response of peak current on
codeine concentration in the range from 0.1 to 60 µM (R2 = 0.998, n = 6) were achieved. The
method was successfully applied in the determination of codeine in real samples including
pharmaceutical tablets and human urine with results similar to those declared by manufacturer
and obtained by reference high-performance liquid chromatography method, respectively.
Key words: Codeine, Boron-doped diamond film electrode, Differential pulse voltammetry,
Pharmaceutical tablet, Human urine.
Introduction
Codeine (3-methylmorphine, COD) is an analgesic and antitussive agent which belongs to the
family of opiates naturally found in the poppy plant. It has similar applications to morphine,
but with much less effect. COD is widely available as a single agent or in combinations with
other analgesics such as acetylsalicylic acid, ibuprofen and caffeine in some pharmaceutical
tablets to reduce pain and pyrexia. Moreover, COD is extensively used in cough-cold syrup,
but it would cause drug addiction, and make mental damage to patient if abused, then even
give rise to many issues of social problem 1. In respect of these objectives, there is a growing
need for continual development of sensitive and selective analytical methods for drug analysis
in many research laboratories as well as forensic and clinical toxicology.
A survey of the literature shows many studies in recent years describing various analytical
methods for determination of COD and other morphine derivatives. High-performance liquid
chromatography 2, gas chromatography 3, capillary electrophoresis 4 and spectrophotometry 5
have also been widely employed in the analysis of COD. However, most of these methods are
prone to many drawbacks, such as expensiveness and lengthy as well as complicated sample
pretreatment usually involving pre-concentration step prior to the analysis.
On the other hand, electrochemical methods offer the practical advantages involving
operation simplicity, low expense of instrument, suitability for real-time detection and less
sensitivity to matrix effects. Recently, few papers have been devoted to the electrochemical
determination of COD using modified electrodes 6,7. Boron-doped diamond film (BDDF) is a
one of the novel carbon-based material, which has received much attention in last twenties
years. It possesses the various desirable properties, such as high thermal conductivity, high
hardness and chemical inertness, extreme electrochemical stability in both alkaline and acidic
media, very low and stable background current as well as absolutely the widest working
potential window 8-10.
In this contribution, the voltammetric determination of COD by differential pulse
voltammetry using the unmodified BDDF electrode is described11. The practical applicability
214
of proposed method is demonstrated in determination of COD in pharmaceutical tablets and
human urine. This procedure could also find an application in routine analytical practice for
quantification of COD thanks to rapidity, simplicity and sensitivity.
Experimental
COD standard and other compounds were obtained from Zentiva (Hlohovec, Slovak
Republic) and used as received without any further purification. 1 mM stock COD standard
solution was prepared by dissolving of its calculated amount in deionised water with
resistivity greater than 18 MΩ cm. The voltammetric measurements were performed with an
AUTOLAB PGSTAT 302N (Metrohm Autolab B.V., The Netherlands) potentiostat
controlled by NOVA 1.8 electrochemical software. The three electrode system consisted of
Ag/AgCl/3 M KCl and platinum wire as reference and counter electrode, respectively. BDDF
electrode inserted in polyether ether ketone body with inner diameter of 3 mm and boron
doping level of 1000 ppm (Windsor Scientific Ltd, UK) was used as working electrode.
Cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV) were employed for
purposes of voltammetric studies and quantification of COD, respectively. The detection limit
was calculated as three times the standard deviation for the blank solution divided by the
slope of the calibration curve.
Six tablets of commercial pharmaceutical tablets of Codeine® (each with 30 mg COD) were
weighted, ground into powder in achate plate and an equivalent portion of 150 mg of
powdered tablet was dissolved in deionised water. The mixture was filtered through a filter
paper to obtain a clear filtrate and then quantitatively transferred into 100 mL volumetric
flask. To obtain final concentrations in the range of calibration curve, the sample solutions
were suitably diluted with supporting electrolyte (dilution factor 1:100 v/v). Human urine
samples of patients who underwent the treatment with Codeine® (30 mg) were received from
research laboratory of Faculty of Pharmacy of Comenius University in Bratislava. The urine
samples were always collected one hour after intake of tablet and subsequently diluted with
supporting electrolyte (dilution factor 1:20 v/v).
Results and discussion
Fig. 1 shows the CV voltammograms in the absence (curve a) and presence (curve b) of COD
in BRBS at pH 7.0 on BDDF electrode. As can be seen, during the scan the single welldefined anodic peak has appeared at potential around +1.0 V vs. Ag/AgCl using without any
electrochemical modification of BDDF electrode surface. On the reverse scan, no
corresponding reduction peak was observed indicating that the electrode process of COD is
the totally irreversible one. It is also apparent that residual current appeared to be sufficiently
low at higher potentials on unmodified BDDF electrode.
The applicability of DPV (with previously optimized instrumental parameters) in the
determination of COD was tested by calibration curve constructed by plotting peak current
against COD concentration in the linear range from 0.1 to 60 µM as depicted in Fig 2. The
parameters of calibration curve are: ICOD = (0.125±0.004) (0.155±0.009)cCOD with R2 =
0.998. The low detection limit of 0.08 µM was obtained as a consequence of high S/N ratio
and without any BDDF electrode surface modification. The repeatability of the procedure was
examined with ten replicate DPV measurements at 10 µM COD concentration under the same
operating conditions over the short time interval with relative standard deviation (RSD) of 0.9
%. The very low RSD value revealed the excellent repeatability of method and confirmed the
minimal adsorption propensity of BDDF electrode surface to the oxidation product of COD.
The method has appeared to be a suitable platform for precise detection and quantification of
COD.
215
Fig. 1. CV voltammograms of (a) 0 μM COD, (b) 10 μM COD in BRBS at pH 7.0 on BDDF
electrode with scan rate of 100 mV.s-1.
Fig. 2. DP voltammograms of various COD concentrations in BRBS at pH 7.0 on BDDF
electrode: (a) 0, (b) 0.1, (c) 0.25, (d) 0.5, (e) 1, (f) 2.5, (g) 5, (h) 10, (i) 20, (j) 40 and (k) 60
μM. The optimized DPV parameters: modulation amplitude of 50 mV, modulation time of 40
ms and scan rate of 50 mV.s-1. The dependences between peak current (μA) and COD
concentrations (μM) appear in the inset.
The standard additions method was employed for the analysis of pharmaceutical tablets of
Codeine® when the aliquots amount of COD standard solution was added in order to estimate
the accuracy of proposed analytical method. The satisfactory recovery values (calculated as
found concentration values after spiking of COD standard solution divided by expected COD
concentration values multiply by hundred) between 96.2 and 102.6% were obtained (Table I).
From these values it could be concluded that there are no significant matrix interferences.
Thus the proposed method is accurate and suitable for quantification of COD in
pharmaceutical tablets. Subsequently, in order to evaluate the validity and practical
applicability of the proposed method, the human urine samples of patients treated by
Codeine® were directly analyzed using standard additions method. Under the optimum
216
experimental conditions, the representative DP voltammograms for the urine sample of
patient 1 are illustrated in Fig. 3.
Table I.
Analysis of pharmaceutical tablets of Codeine® (30 mg) spiked with COD standard solutions
using proposed method.
Added
(mg)
Expected
(mg)
Found*
(mg)
SD
(mg)
CI for P=95 %**
(mg)
Recovery
(%)
0
25
50
100
200
54.2
79.2
129.2
229.2
29.2
55.6
77.8
123.3
220.5
1.1
2.3
5.6
8.4
12.1
(29.2 ± 0.9)
(55.6 ± 1.9)
(77.8 ± 4.6)
(123.3 ± 6.9)
(220.5 ± 9.9)
102.6
98.2
95.4
96.2
* Average for six replicate measurements (n = 6): x
** Confidence interval calculated according ( x ± tn-1,α SD/n1/2); from tables t5; 0.05 = 2.0150
Fig. 3. DP voltammograms of urine sample of patient 1 (a) undergoing treatment with
Codein® (30 mg) and after spiking with (b) 4, (c) 8 and (d) 12 μM of COD standard solution
in BRBS at pH 7.0 on BDDF electrode. The optimized DPV parameters: modulation
amplitude of 50 mV, modulation time of 40 ms and scan rate of 50 mV.s-1.
It is clearly shown that the observed peak at about 0.97 V is assigned to the COD oxidation
since this peak increases while adding COD standard solution; however it occurs at slightly
more positive potential. Table II presents the COD concentrations determined for six replicate
measurements (expressed as confidence interval for 95% probability) in the analyzed human
urine samples employing the proposed DPV method and reference HPLC method. By
evaluation of these results, one can conclude that the values obtained by the proposed method
agree well with those acquired by reference HPLC method. Applying the paired t-test12 to the
results obtained by both methods, the resulting t-value of 1.07 is smaller than the critical one
(4.30 for α = 0.05), indicating that there is no significant difference between these results at
the confidence interval for 95% probability.
217
Table II.
Analysis of COD in patients´ urine samples using proposed method (n = 6).
COD content* (µM)
Patient
Proposed method
HPLC-PDA
1.52 ± 0.09
1.47 ± 0.11
1
1.31 ± 0.07
1.33 ± 0.06
2
0.98 ± 0.05
0.94 ± 0.03
3
* Confidence interval calculated according [ x ± tn-1,  SD/sqrt(n)]; t5; 0.05 = 2.0150
Conclusions
An unmodified BDDF electrode was used in combination with DPV technique to elaborate
the novel, simple and cheap alternative analytical method for determination of COD in the
pharmaceutical tablets and human urine. The low detection limit of 0.08 µM was obtained;
this value belongs to the lowest ones when compared with previously reported analytical
methods in the literature. The determination of COD in the pharmaceutical tablets and human
urine was successfully applied without complex sample pretreatment (only filtration and/or
simple dilution) with the results in good agreement with those declared by manufacturer and
obtained by reference HPLC method, respectively. The method is also sufficiently selective
because most of species usually present in the pharmaceutical tablets and human urine do not
interfere in high excess.
Acknowledgments
The authors thank the Scientific Grant Agency VEGA of the Slovak Republic (Project No.
1/0051/13).
References
1. Fischer W., Bernhagen J., Neubert R.H.H.: Eur. J. Pharm. Sci. 41, 31 (2010).
2. Hu Z., Zou Q., Tian J., Sun L., Zhang Z.: J. Chromatogr. B 879, 3937 (2011).
3. Chen B.G., Wang S.M., Liu R.H.: J. Mass Spectrom. 42, 1012 (2007).
4. Zhang L., Wang R., Yu Y.Q., Zhang Y.R.: J. Chromatogr. B 857, 130 (2007).
5. Vidal A.D., Reyes J.F.G., Barrales P.O., Diaz A.M.: Anal. Lett. 35, 2433 (2002).
6. Pournaghi-Azar M. H., Saadatirad A.: Electroanalysis 22, 1592 (2010).
7. Pournaghi-Azar M. H., Saadatirad A.: J. Electroanal. Chem. 624, 293 (2008).
8. Švorc Ľ., Sochr J., Tomčík P., Rievaj M., Bustin D: Electrochim. Acta 68, 227 (2012).
9. Švorc Ľ., Sochr J., Rievaj M., Tomčík P., Bustin D: Bioelectrochemistry 88, 36 (2012).
10. Švorc Ľ., Tomčík P., Svítková J., Rievaj M., Bustin D: Food Chem. 135, 1198 (2012).
11. Švorc Ľ., Sochr J., Svítková J., Rievaj M., Bustin D: Electrochim. Acta 87, 503 (2013).
12. Miller J.N., Miller J.C.: Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 5th ed.,
Pearson Education, Edinburgh, 2005.
218
Direct Voltammetric Determination of Antioxidant Butylated Hydroxyanisol in Biodiesel
(Přímé voltametrické stanovení antioxidantu 3-tert-butyl-4-hydroxyanisolu ve směsné
motorové naftě)
Markéta Tomášková a, Jaromíra Chýlková a, Vladimír Jehlička b, Tomáš Navrátil c, and
Renáta Šelešovská a
a
University of Pardubice, Faculty Chemical Technology, Institute of Environmental and
Chemical Engineering, Studentská 573, 530 10 Pardubice, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
b
University of Hradec Králové, Faculty of Science, Department of Informatics,
Rakitanského 62, 500 03 Hradec Králové III, Czech Republic
c
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3,
182 23 Prague 8, Czech Republic
Abstract
Direct voltammetric determination of antioxidant butylated hydroxyanisol (BHA) in
isopropanol containing 0.1 mol L-1 H2SO4 using linear sweep voltammetry with gold working
electrode was tested. The developed method was purposed for determination of BHA in
biodiesel. There were compared the results achieved by nonlinear and linear regression of
registered data. This method was applied by analysis of biodiesel samples. These analyses can
be performed directly, without necessity of sample treatment or extraction.
Keywords: Butylated hydroxyanisol, Voltammetry, Antioxidant, Biodiesel.
Úvod
Působení dopravy na životní prostředí úzce souvisí s technickým stavem dopravních
prostředků. Z ekonomických důvodů jsou kladeny stále vyšší nároky na prodloužení jejich
dobrého technického stavu, na zabezpečení vysoké provozní spolehlivosti, na snižování
spotřeby paliv, maziv i dalších provozních hmot. Růst kvality a efektivnosti údržby pozitivně
ovlivňuje využívání metod kontroly jejich jakosti, které mohou při důsledném uplatňování
přinést snižování nákladů, a zároveň přispívá ke snižování škodlivých vlivů dopravy na
složky životního prostředí. V současné době se velmi rychle rozvíjejí fyzikální a fyzikálněchemické instrumentální zkušební metody pro posuzování stupně opotřebení provozních
kapalin. Získané analytické údaje poskytují zejména u olejů kromě diagnostické informace
i informaci prognostickou, tj. dovolují předvídat případné havarijní situace a předcházet jim.
Optimalizace výměny olejových náplní je velmi závažným problémem z hlediska
ekonomického, provozně-bezpečnostního i environmentálního. Právě v oblasti životního
prostředí nachází stále širší uplatnění tribotechnická diagnostika. Uplatňují se jak expresní
diagnostiky, tak i standardní laboratorní zkoušky a náročné instrumentální metody.
Oleje pro dnešní motory představují řadu problémů: Na prvním místě je to zabezpečení
bezporuchového chodu motorů za provozních podmínek, ale i hospodárnost 1. Základním
procesem stárnutí oleje v motoru je termooxidace. Ta je vždy doprovázena polymerací,
kondenzací, termickým štěpením, odpařováním složek oleje atd. Oxidační zplodiny
motorových olejů vedou k tvorbě usazenin na místech, kde je olej v klidu nebo jen v pomalém
pohybu, k tvorbě lepkavých kalů a laků na stěnách válce a pístu. Oxidace tedy způsobuje
podstatné zhoršení použitelnosti oleje 2-3. Pro zlepšení kvality olejů a zejména pro zvýšení
jejich oxidační stability se přidávají různé antioxidanty. Antioxidanty tedy prodlužují
životnost olejů. Nejčastěji používanými jsou 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT), 3-tertbutyl-4-hydroxyanisol (BHA), tertbutylhydrochinon (TBHQ), propyl galát (PG) and
pyrogallol (PA) 4-5. Ke stanovení antioxidantů v mazacích olejích se v praxi nejvíce užívá
infračervená spektroskopie, která sleduje průběh oxidačních dějů v olejové matrici na základě
určení přítomnosti oxidačních produktů, obsahujících karbonylovou skupinu. Nevýhodou této
219
metody jsou problémy nastávající při vyhodnocování spekter. Mnoho motorových olejů
obsahuje esterový základový olej, který má velmi intenzivní signál ve stejné oblasti jako
oxidační produkty 3. Další možností je aplikace kapalinové chromatografie 6-9. Obě tyto
metody jsou však experimentálně náročné nebo drahé a vyžadují často komplikovanou
přípravu vzorku před vlastní analýzou. Elektrochemické metody představují vhodnou
relativně levnou alternativu s nenáročnou instrumentací a s možností miniaturizace 10-13.
Vhodná metoda stanovení antioxidantů je nezbytná pro určení a kontrolu jejich obsahu
v různých typech produktů, jejich vlivu na oxidační stabilitu jednotlivých výrobků a rovněž
při sledování jejich úbytku v závislosti na čase, což souvisí například s určením doby
životnosti mazacích olejů. Vlastní analýza je rychlá a velice citlivá. Navíc antioxidanty jsou
látky, které se velmi snadno elektrochemicky oxidují 14. Tato práce je zaměřena na nalezení
vhodných podmínek pro přímé stanovení BHA ve směsné motorové naftě (SMN) s využitím
zlaté indikační elektrody.
Experimentální část
Voltametrické analýzy antioxidantu byly realizovány pomocí elektrochemického analyzátoru
EP 100VA (HSC servis, Bratislava) v tříelektrodovém uspořádání. Indikační elektroda byla ve
tvaru zlatého disku (AuDE, HSC servis, Bratislava). Jako referentní sloužila argentchloridová
elektroda, pomocná elektroda byla z platiny. Elektrodový systém byl uchováván mezi
jednotlivými analýzami v destilované vodě. Vlastní stanovení probíhalo v kyselém prostředí
0,1mol.l-1 H2SO4 za přítomnosti organického rozpouštědla isoppropanolu. Elektrochemické
oxidace antioxidantu byly realizovány metodou DC s lineární změnou potenciálu (Linear
sweep voltametry - LSV). Indikační elektroda byla polarizována v rozmezí potenciálů
400 mV až 1200 mV při rychlosti scanu 40 mV/s. Proudový rozsah byl 4 µA.
Výsledky a diskuse
Voltametrické stanovení BHA bylo nejprve testováno ve třech prostředích (0,1 mol.l-1
kyselina sírová, 0,007 mol.l-1 acetátový pufr a 0,007 mol.l-1 hydroxid sodný). Jako
rozpouštědlo byl zvolen isopropanol na základě předešlých informací v publikaci 12.
Analýzou modelových roztoků v rozsahu koncentrací 14,9 µg.ml-1 - 119,5 µg BHA/ml bylo
zjištěno, že v alkalickém prostředí anodická oxidace analytu neprobíhá. Stanovení v prostředí
acetátového pufru o pH 5 již poskytuje křivky anodické oxidace BHA, ale ve srovnání
s kyselým prostředím se posouvají směrem k pozitivnějším potenciálům. Kyselé prostředí
vyhovuje nejlépe, neboť poskytuje citlivější odezvu a dobře vyhodnotitelné píky.
Navržená metoda stanovení a následného vyhodnocení BHA byla aplikována na vzorky
SMN, a sice pro tři modelové roztoky obsahující BHA o koncentraci 1%; 0,5% a 0,1%. Toto
složení odpovídá reálnému stavu, neboť počáteční koncentrace antioxidantů v produktech se
blíží 1 % a s časem klesá. Pro zdárný průběh analýz bylo třeba nalézt vhodné množství vzorku
a zjistit, zda má matrice SMN vliv na průběh a tvar křivek anodické oxidace studovaného
antioxidantu BHA. Na základě celé řady stanovení (příklad je uveden na obr. 1) bylo zjištěno,
že pro každou testovanou koncentraci zvyšující se dávkovaný objem SMN (bylo měněno
v rozmezí 0,5 ml až 1,5 ml) vede ke snížení citlivosti stanovení a zároveň se poloha píků
posunuje směrem k pozitivnějším potenciálům. Tyto změny však nejsou nijak výrazné
a objem vzorku se proto může volit libovolně ve studovaném rozsahu podle očekávané
koncentrace analytu.
220
Obr. 1. Záznam křivek anodické oxidace při voltametrickém stanovení BHA v prostředí
isopropanolu obsahujícím 0,1 mol.l-1 H2SO4. Exp. podmínky: LSV, EINIT: +0,4 V, EFIN =
+1,2 V, rychlost nárůstu potenciálu 40 mV.s-1, koncentrační rozmezí BHA: od 14,9 µg.ml-1 do
119,5 µg.ml-1, dávka SMN: 0,5 ml.
Další pozornost byla zaměřena na metodu vyhodnocení naměřených křivek. Ty byly jednak
kvantitativně stanovovány za předpokladu lineární odezvy proudu na koncentraci a dále podle
nelineární regrese. Dosažené výsledky jsou shrnuty v tabulce I. Z uvedených hodnot,
jednoznačně vyplynulo, že navržená metoda analýzy BHA za doporučených podmínek v dané
matrici vyžaduje vyhodnocení výsledků podle nelineárního modelu.
Tabulka I.
Výsledky analýz modelových vzorků o koncentraci: model 0,1% - 1,099 g/kg; model 0,5% 5,281 g/kg; model 1% - 9,817 g/kg.
Obsah
BHA ve
vzorku
1%
0,5%
0,1%
Objem vzorku
[ml]
0,1
0,5
1,0
0,1
0,5
1,0
0,5
1,0
1,5
Lineární regrese
Stanoveno
Chyba
-1
[µg.ml ]
[%]
11,45
+16,6
13,56
+38,1
12,75
+29,8
5,96
+12,9
6,66
+26,2
7,50
+42,1
1,22
+11,3
1,24
+13,2
1,36
+24,1
221
Nelineární regrese
Stanoveno
Chyba
-1
[µg.ml ]
[%]
10,01
-1,9
9,84
+0,2
9,00
-8,4
4,90
-7,2
5,23
-0,9
5,35
+1,4
1,14
+3,4
1,08
-1,5
1,13
+2,5
Nelineární regrese byla aplikována následovně: v následujícím grafu na obrázku 2 jsou
vyneseny výšky jednotlivých píků v závislosti na přídavku BHA. Prvnímu píku odpovídá
nulová hodnota přídavku standardu, tedy se jedná o koncentraci neznámého vzorku.
Naměřená data byla aproximována polynomy 1. až 4. stupně.
Obr. 2. Závislost výšky píku anodické oxidace BHA na koncentraci tohoto antioxidantu
v roztoku. Křivka 1 – polynom 1.stupně; Křivka 2 – polynom 2.stupně; Křivka 3 – polynom
3.stupně; Křivka 4 – polynom 4.stupně.
Pro výpočet koncentrace vzorku je třeba správně zvolit vhodný stupeň aproximačního
polynomu a příslušnou křivku posunout v argumentu tak, aby procházela počátkem
souřadného systému. Z této křivky pak bude možné na základě změřené hodnoty proudu,
příslušící vzorku, určit jeho koncentraci, pro niž je podstatná právě oblast, ve které dochází
k extrapolaci a ke hledání průsečíku křivky s vodorovnou osou souřadného systému.
Vzhledem k tomu, že oblast s extrapolovaným průběhem závislosti výšky píku na koncentraci
BHA neobsahuje žádná naměřená data, nelze o správnosti zvoleného stupně aproximačního
polynomu rozhodnout jinak, než na základě experimentálního proměření a vyhodnocení
dostatečného množství vzorků. Celkem bylo analyzováno 25 modelových vzorků se známými
koncentracemi. Průměrná chyba stanovení podle 1. stupně polynomu je 22,09%, dle 2.
stupně -1,54% a 3. stupně -8,74%. Je zřejmé, že nelineární závislost velikosti píků na
koncentraci je optimálně aproximována polynomem 2. stupně.
Pro výpočet koncentrace analyzovaného neznámého vzorku byl tedy navržen
a experimentálně odzkoušen následující algoritmus, který je součástí programu OK-nelin 15.
Naměřená data jsou metodou nejmenších čtverců aproximována polynomem 2. stupně,
přičemž prvnímu píku je přiřazena nulová hodnota přídavku standardu a dalším píkům jsou
přiřazeny odpovídající přírůstky koncentrace. Numerickou iterační metodou pro výpočet
kořenů nelineárních funkcí je vypočtena hodnota kořenu nalezeného polynomu. Jako první
aproximace je brána velikost prvního píku. Hledaná koncentrace analyzovaného vzorku je
číselně rovna záporné hodnotě kořenu aproximačního polynomu.
Metoda stanovení BHA ve směsné motorové naftě byla ověřena při analýzách 5 vzorků
reálných modelových směsí, připravených homogenizací známého množství antioxidantu
a čisté matrice SMN. Dosažené výsledky představují průměr ze tří stanovení a jsou shrnuty
v tabulce II.
222
Tabulka II.
Výsledky voltametrického stanovení BHA v modelových reálných vzorcích.
Stanovováno
Stanoveno
Chyba
Vzorek č.
[g/kg]
[g/kg]
[%]
1
4,82
4,98±0,13
+3,4
2
5,09
5,13±0,18
+0,8
3
3,08
3,09±0,18
0,0
4
2,50
2,55±0,12
+2,0
5
1,06
1,140±0,025
-4,3
Na základě uvedených hodnot, lze konstatovat, že vypracovaná voltametrická metoda
stanovení BHA , včetně navrženého postupu vyhodnocení, poskytuje spolehlivé výsledky
i v tak složité matrici, jako je směsná motorová nafta.
Závěr
Z předložené práce vyplynulo, že voltmetrické stanovení syntetického antioxidantu 3-tertbutyl-4-hydroxyanisolu (BHA) lze provádět v prostředí organického rozpouštědla
- isopropanolu za přítomnosti 0,1 mol.l-1 H2SO4 s využitím zlaté indikační elektrody a metody
linear sweep voltammetry (LSV) za doporučených podmínek přímo ve vzorcích směsné
motorové nafty, za předpokladu, že následné vyhodnocení bude provedeno programem
OK-nelin, z důvodu nelinearity závislosti výšky voltametrických křivek na stanovované
koncentraci v přítomnosti matrice vzorku.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektu č. SGFChT05/2012.
Literatura
1. Straka B.: Motorové oleje a tribotechnická diagnostika naftových motorů. NADAS. Praha
1986.
2. Matějovský V.: Automobilová paliva. Grada. Praha 2005.
3. http://www.oleje.cz/clanek/Vlastnosti-motorovych-oleju, Downloaded 5th March 2013.
4. Dunn O.: Fuel Process. Technol. 86, 1071 (2005)
5. Karavalakis G., Hilari D., Givalou L., Karonis D., Stournas S.: Energy 36, 369 (2011).
6. Nekvasil F.: Příručka pro nakládání s odpady. Expertízy a poradentství v oblasti odpadů a
NS. Nakladatelství Kutná Hora, 1996.
7. Saad B., Sing Y. Y., Nawi M. A., Hashim N., Ali A. S. M., Saleh M. I., Sulaiman S. F.,
Talib K. M., Ahmad K.: Food Chem. 105, 389 (2007).
8. Biparva P., Ehsani M., Hadjmohammadi M. R.: J. Food Comp. Anal 27, 87 (2012).
9. Wang J. Y., Wu H. L., Chen Y., Sun Y. M., Yu Y. J., Zhang X. H., Yu R. Q.:
J. Chromatography A 2012, 1264, 63.
10. Cheek G. T., Mowery R.: Anal. Chem. 61, 1467 (1989).
11. Chýlková J., Šelešovská R., Machalíková J., Dušek L.: Cent. Eur. J. Chem. 8, 607 (2010).
12. Chýlková J., Tomášková M., Šelešovská R., Mikysek T., Jehlička J.: Electroanalysis 24,
1374 (2012).
13. Tomášková M., Chýlková J., Machalický O., Šelešovská R., Navrátil T.: J. Electrochem.
Sci. 8, 1664 (2013).
14. Korotkova E. I., Korbainov Y. A., Sheychuk A. V.: J. Electroanal. Chem. 518, 56 (2002).
15. Jehlička V.: Soukromé sdělení.
223
A New Method of Apparent Protonation Constant Evaluation from Voltammetric Data
Libuše Trnková a, b, Nuria Serrano c, and Iveta Pilařová a
a
Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5,
625 00 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected]; [email protected]
b
Central European Institute of Technology – CEITEC, Brno, University of Technology,
Technická 3058/10, CZ – 616 00 Brno, Czech Republic
c
Departament de Química Analítica, Facultat de Química, Universitat de Barcelona, Martí i
Franquès 1-11, E – 08028 Barcelona, Spain
Abstract
In general, the determination of apparent protonation constants of organic electroactive
substances from polarographic and voltammetric data is based on the dependence of peak
potential (Ep) on pH. Then the pKa´ value is given as an intersection of two lines
characterizing a different shift Ep of protonated and unprotonated particles on pH. Due to the
fact that both slopes of these lines usually are not very different, the exact assessment of the
intersection is problematic. Our new proposed method, which is able to determine pKa' values
from the Rp (peak resistance) depending on pH, eliminates this drawback.
Key words: Electrochemical determination of pKa, Linear sweep voltammetry, Elimination
voltammetry, Adenine.
Introduction
For the electrochemical study of protonation-deprotonation equilibria of organic compounds
potentiometric and conductometric methods have been widely employed 1. A polarographic
and voltammetric acidic scale for some weak acids was developed but the evaluation of a
protonation-deprotonation equilibrium is complicated by all processes in the vicinity of the
electrode 2. The acid-base balance is influenced by the loss of molecules that are reduced on
the electrode. On the other hand, the decrease of protonated molecules is again complemented
by the subsequent protonation of neutral molecules. It is very important how quickly the
balance is established 3. Most of the protonation-deprotonation constants determined by
electrochemical methods other than potentiometry and conductometry suffer from the use of
irreversible redox potentials (sluggishness of the heterogeneous electron transfer or fast
chemical reaction following the reversible or quasireversible electron transfer) and/or
approximate evaluation of the solution bond dissociation energies 4. On the other hand, the
potentiometric approach cannot be confidently extended to the determination of the acidity in
the high pKa region 5.
Experimental
Chemicals
Phosphate–acetate buffer as the supporting electrolyte was prepared as a mixture of acetic
acid (glacial, Sigma Aldrich; ACS reagent), phosphoric acid (84%; p.a.; Penta Chrudim) and
sodium hydroxide (Sigma Aldrich; 97%; p.a.). Methanol CH3OH (p.a.) was purchased from
Penta Chrudim, Czech Republic; ethanol, NaClO4 and adenine were purchased from Sigma
Aldrich. All the solutions were prepared in distilled MILI Q water.
Methods
The voltammetric experiment was carried out using the electrochemical analyzer AUTOLAB
PGSTAT 302N (EcoChemie-Utrecht, Metrohm, Switzerland) in connection with VA Stand
663 controlled by GPES software manager. The solution of adenine (5·10-5 mol·L-1) was
measured in the electrochemical vessel equipped with three electrodes: a hanging mercury
drop electrode (HMDE) as the working electrode, and Ag/AgCl/3M KCl and Pt wire as a
reference and an auxiliary electrode, respectively. The phosphate-acetate buffer solutions with
224
different pH were used as supporting electrolytes. The ionic strength (0.1M) was adjusted by
NaClO4. The sample of adenine in water or methanol, or in ethanol (10 % v/v) was analyzed
after 300 s of bubbling by argon in order to eliminate oxygen. All voltammetric experiments
were carried out at room temperature (23 °C). The LSV curves were measured in a potential
range from -1.0 V to -1.7 V at scan rates from 100 to 800 mV/s. The conditioning time for
HMDE electrode was 2s and the potential step was 2 mV. From the smoothed voltammetric
curves (Savitzky-Golay filter, level 2) exported into Excel the elimination function EVLS E4
with simultaneous elimination of kinetic and charging currents and diffusion current
conservation, according to the equation EVLS E4 6-11: f(I) = 17.485I - 11.657I1/2 - 5.8584I2
was calculated.
Results and discussion
On a hanging mercury drop electrode (HMDE) in aqueous and aqueous-alcohol buffer
solutions (10% v/v methanol or ethanol) adenine provides voltammetric peaks corresponding
to the reduction of double bond in the pyrimidine ring. The reduction process is irreversible
requiring the protonated form of adenine. With increasing scan rate (100, 200, 400, and 800
mV/s) and pH (from 1.63 to 6.69) the peaks are shifted to more negative potentials. Fig.1
shows not only LSV curves measured at a scan rate of 400 mV/s and at different pH in
aqueous-methanol buffer solutions (Fig. 1A), but also shows the pH dependences of peak
potential Ep (mV) - Fig. 1B and peak resistance Rp (MΩ) - Fig.1C for adenine in buffer
solutions with I = 0.66 M.
The Rp values were calculated as the values of the peak potential divided by the peak current
at the peak maximum. Both Ep and Rp dependences on pH are represented by two lines with
different slopes. The voltammetric determination of apparent pKa´ is based on the intersection
of these lines 12-13; the first branch corresponds to pH < pKa´ and the second to pH > pKa´.
Compared to Figs. B and C it can be seen that the evaluation of pKa´ is more suitable in the
case of pH dependence of Rp. Moreover, the pKa´ value (3.97) is close to the value
determined by potentiometric titration (4.10). The pKa´ values of adenine determined not only
from LSV but also from EVLS results for aqueous buffer, aqueous-methanol and aqueousethanol buffer solutions were compared. The accuracy and correctness of pKa´ using both
voltammetric methods (LSV and EVLS) and both evaluation approaches were discussed. The
equations of lines in the range of pH < pKa´ and pH > pKa´ with the corresponding
coefficients of determination are shown in Figs. 1B and 1C. These equations provide the
possibility of numerically determining pKa´.
Conclusion
The example of adenine in different media served to demonstrate our new method of
evaluation of apparent dissociation constants pKa's. Instead of the dependence of the reduction
peak potential (Ep) on pH, the dependence of the peak resistance (Rp) on pH was used. It was
found that the crossing, from which the pKa´ value is determined, in Rp-pH dependence of
protonated and unprotonated molecules is much more interpretable and not burdened with a
subjective error.
Acknowledgement
This research was supported by (a) the CEITEC – Central European Institute of Technology
Project CZ.1.05/1.1.00/02.0068, (b) MUNI/A/0992/2009 project of the Ministry of Education,
Youth and Sports of the Czech Republic and (c) CTQ2012-32863 project of the Spanish
Ministerio de Economia y Competitividad. The authors also wish to thank Metrohm Company
for the possibility of presenting these results.
225
A
400mV-pH1.63
400mV-pH2.64
400mV-pH4.13
400mV-pH5.31
400mV-pH6.69
400mV-pH1.76
400mV-pH2.91
400mV-pH4.33
400mV-pH5.49
400mV-pH1.90
400mV-pH3.18
400mV-pH4.55
400mV-pH5.87
400mV-pH2.23
400mV-pH3.31
400mV-pH4.70
400mV-pH6.07
400mV-pH2.36
400mV-pH3.66
400mV-pH4.92
400mV-pH6.33
0.00
-0.05
-0.10
I/μA
-0.15
-0.20
-0.25
-0.30
-0.35
-0.40
-1650
-1550
-1450
-1350
-1.1
-1.2
7
B
Ep/V
y = -0.0864x - 0.9751
R² = 0.9979
-1.3
-1.4
C
pKa´
5
y = 0.5624x + 2.0543
R² = 0.9935
4
3
-1.5
-1050
y = 2.0959x - 3.8808
R² = 0.9831
6
Rp/MΩ
y = -0.0732x - 1.0225
R² = 0.9985
-1250
-1150
E/mV
pKa´
2
1.5
2.5
3.5
pH 4.5
5.5
1.5
2.5
3.5
pH
4.5
5.5
Fig. 1. LSV curves of adenine recorded on mercury electrode in aqueous-methanol buffer
solutions at different pH and their evaluation in the scale of Ep and Rp.
References
1. Kolthoff I. M., Elving P. J.: Treatise on Analytical Chemistry. Wiley, New York, 1979.
2. Heyrovsky J., Kůta J.: Principles of Polarography, Czechoslovak Academy of Science,
Prague 1965.
3. Kim H.-s., Chung T.D., Kim H.: J. Electroanal. Chem. 498, 209 (2001).
4. Ritchie C. D.: Solute-Solvent Interaction, Marcel Dekker, New York 1976.
5. Matthews W. S., Bares J. E.: J. Am. Chem. Soc., 97, 7006 (1975).
6. Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996).
7. Dracka O., Trnkova L.: J. Electroanal. Chem. 413, 123 (1996).
8. Trnkova L., Kizek R., Dracka O.: Electroanalysis, 12, 905 (2000).
9. Trnkova L.: J. Electroanal. Chem. 582, 258 (2005).
10. Trnkova L.: Application of elimination voltammetry with linear scan in bioelectrochemistry. In: Utilizing of bio-electrochemical and mathematical methods in
biological research. Signpost, Kerala, Chapter 4, p. 51 (2007).
11. Serrano N., Klosova K., Trnkova L.: Electroanalysis 22, 2071 (2010).
12. Serrano N., Holubova S., Trnkova L.: Electroanalysis 23, 2217 (2011).
13. Pilarova I., Lubal P., Trnkova L.: Electroanalysis 24, 349 (2012).
226
The Use of Large Volume Sample Stacking with Acetonitrile for Determination of
Neurotransmitters by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity Detection
(Použití vysokého dávkování vzorku do kapiláry pro stanovení neurotrasmiterů
kapilární elektroforézou s bezkontaktní vodivostní detekcí)
Petr Tůma, Václav Pavlíček, Klára Málková, and Eva Samcová
Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Institute of Biochemistry, Cell and
Molecular Biology, Ruská 87, CZ-100 00 Prague 10, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
A new method of large volume sample stacking with acetonitrile was used for determination
of γ-aminobutyric acid (GABA), glycine (Gly) a glutamate (Glu) in the microdialyzate of
central nervous system by capillary electrophoresis with contactless conductivity detection. A
pressure is applied to remove the interfering acetonitrile zone out of the capillary during
separation. This technique enables to increase the injected sample amount up to 98% of total
capillary length. Under optimized conditions LODs achieve 9, 10 and 15 nM for GABA, Gly
and Glu in model sample and 29, 29 a 37 nM in microdialyzate samples.
Key words: Capillary electrophoresis, Contactless conductivity detection, Large volume
sample stacking, Neurotransmitters.
Úvod
Pro stanovení neurotransmiterů v mikrodialyzátech 1 se vysokoúčinná elektroforetická
separace obvykle kombinuje s laserem indukovanou fluorescencí (LIF) 2. Toto spojení
umožňuje provádět stanovení neurotransmiterů vyskytujících se mikrodialyzátech s LODs na
úrovni 10-8 M. Neurogenní aminokyseliny ovšem nevykazují přirozenou fluorescenci a
použití LIF je nutně spojeno s jejich derivatizací 3. Navíc spojení CE/LIF je velmi náročné po
technické i finanční stránce a z těchto důvodů není široce rozšířené.
Z hlediska technického provedení, nároků na přípravu vzorku a v neposlední řadě i finančních
nákladů se jednodušším řešením pro stanovení aminokyselin v biologických materiálech
postupně stává spojení CE s bezkontaktní vodivostní detekcí (C4D) 4. Univerzální C4D
nevyžaduje provádět derivatizaci vzorku a pro nízkomolekulární organické látky běžně
dosahuje LOD kolem 10-6 M. Citlivost stanovení v CE lze ovšem zvýšit až o několik řádů
prováděním prekoncentrace vzorku přímo on-line v separační kapiláře 5. V této studii je
ukázáno, že použitím techniky large volume sample stacking, při kterém nadávkované
množství vzorku může dosáhnout až celého objemu separační kapiláry, lze i v kombinaci
s C4D docílit LOD pro γ-aminobutyrát (GABA), glycin (Gly) a glutamát (Glu) na úrovni 10-8
M. Tato citlivost je plně srovnatelná s použitím LIF a umožňuje provádět monitorování
neurotransmiterů v mikrodialyzátech CNS.
Experimentální část
Elektroforetická měření byla provedena na elektroforetickém přístroji HP3DCE system
(Agilent Technologies, Waldbronn Germany) vybaveným C4D, který je zabudován do
elektroforetické kazety a termostatován na 25C. CE separace byly provedeny v křemenné
kapiláře (Composite Metal Services, UK), vnitřní průměr 60 m, vnější průměr 363 m,
celková délka 43 cm, délka k C4D 28 cm. Elektroosmotický tok byl v kapiláře zastaven
pokrytím vnitřní stěny kapiláry komerčním roztokem (INST pokrývací roztok, Biotaq,
U.S.A.). Nová kapilára byla postupně promývána 0.1 M NaOH (5 min), voda (5 min), INST
roztok (2 min), voda (5 min) a základní elektrolyt (BGE, 5 min). Mezi jednotlivými
analýzami byla kapilára promývána BGE 1 min.
Separace byly prováděny v BGE o složení 4.0 M kyselina octová (pH 1.9) při separačním
napětí 25 kV. Za těchto podmínek migrují aminokyseliny jako kationty a v C4D poskytují
227
negativní píky. Zaostření aminokyselin bylo ukázáno na modelovém vzorku o složení: 10-5 M
směs GABA, Gly a Glu s přídavkem 20 mM NaCl (korekce zasolení mikrodialyzátu)
rozpuštěná ve směsném rozpouštědle voda/acetonitril (ACN) s 75% zastoupením ACN. Pro
dávkování vzorku do kapiláry i vytlačování balastní zóny ACN z kapiláry byl použit tlak 50
mbar. Veškeré použité chemikálie dosahovaly analytického stupně čistoty a pro přípravu
roztoků byla použita deionizovaná voda (Milli-Q water System, 18.2 MΩ cm, Millipore).
Výsledky a diskuse
Přímé dávkování neupraveného mikrodialyzátu podobně jako jiné tělesné tekutiny do
separační kapiláry je nevýhodné pro prekoncentraci vzorku. Mikrodialyzát má z důvodu
vysokého zastoupení NaCl vysokou elektrickou vodivost, což má za následek rozmytí zóny
vzorku pod vlivem separačního pole. Vodivost mikrodialyzátu lze ovšem snadno snížit
přídavkem organického rozpouštědla mísitelného s vodou (acetonitril, ACN; aceton,
methanol, isopropanol) ke vzorku 6. Na zóně vzorku ošetřeného ACN je v důsledku jeho
nízké vodivosti vyšší hodnota intenzity elektrického pole (E) než na okolním separačním
elektrolytu o vysoké vodivosti. Pod vlivem elektrického pole ionty analytu rychle opouští
zónu ACN a po vstupu do BGE se jejich rychlost zpomalí. Tímto procesem lze dlouhou
nadávkovanou zónu zředěného analytu zakoncentrovat do krátkého úseku, large volume
sample stacking.
Po vycestování iontů z ACN se stane tato zóna málo vodivá a představuje odpor pro průchod
elektrického proudu kapilárou. Je-li délka nadávkované zóny ACN krátká poklesne proud jen
po dobu nutnou k promíchání zóny ACN s okolním BGE a poté se opět stoupne. V případě
dlouhé zóny ACN je promíchání s BGE pomalé a vede k přerušení průchodu proudu
kapilárou a zničení separace. Předchozí studie odhalila, že délka zóny vzorku mikrodialyzátu
s 75% obsahem ACN nemůže překročit cca 24% z celkové délky kapiláry (pro 43 cm kapiláru
to je cca 10 cm), aby nedocházelo k přerušení separace 7. I při dávkování kratší zóny ACN,
kdy nedochází k přerušení proudu, způsobuje přítomnost ACN v kapiláře nežádoucí
prodloužení migračního času (migrační čas glycinu kontinuálně vzrůstá z 8 min. při
dávkování 3% z délky kapiláry na 14 min. při dávkování 24%, viz 7). Zóna ACN v kapiláře
odebírá významnou část separačního napětí a v důsledku toho je na okolním BGE nízká E.
Pro odstranění negativních vlivů ACN na separaci byl zaveden nový dávkovací program
(Obr. 1). Po nadávkování vzorku s ACN je současně se zapnutím separačního napětí
aplikován hydrodynamický tlak, kterým je zóna ACN vypuzována z kapiláry do vstupní
nádobky s BGE. Za zvolených experimentálních podmínek (separační napětí 25 kV,
vypuzovací tlak 50 mbar) je rychlost migrace aminokyselin v zóně ACN vyšší než rychlost,
kterou je tato zóna vytlačována ven z kapiláry. Tím dojde k zakoncentrování aminokyselin do
úzké zóny na rozhraní mezi BGE a ACN. Po vytlačení veškerého ACN ven z kapiláry je tlak
vypnut a zakoncentrovaná zóna analytu nacházející se na počátku kapiláry se začne
elektroforeticky separovat na základě rozdílné mobility.
Stacking experimenty byly provedeny s modelovým vzorkem, 10-5 M směs GABA, Gly, Glu
v 75% ACN s přídavkem 20 mM NaCl (vysoké zastoupení NaCl ve vzorku simuluje zředěný
mikrodialyzát, současně Na+ ionty mají význam vedoucího elektrolytu pro izotachoforetické
zaostření aminokyselin do úzké zóny 6). Jako optimalizovaný BGE byla použita 4 M kyselina
octová (pH 1.9), ve které nastává úplné oddělení Gly a Glu od ostatních aminokyselin
v biologických materiálech 8. Z výsledků shrnutých do Tabulky I vyplývá, že výška píku
analytu prakticky lineárně vzrůstá s délkou nadávkované zóny vzorku od 1.4% až do 98%
z celkové délky kapiláry (experiment ukázal, že po naplnění 100% kapiláry vzorkem je
vhodné na konec kapiláry nasát krátkou zónu BGE). Šířka píku analytu se s nadávkovanou
délkou zóny prakticky nemění. Dále se ukázalo, že korigovaný migrační čas (skutečný
migrační čas minus doba vytlačování) je vhodným parametrem pro popis elektromigrace,
228
protože je téměř nezávislý na dávkovaném množství. Korigovaný migrační čas dokládá, že
aminokyseliny se od sebe začnou separovat až poté, co je vypuzen veškerý ACN a zaostřená
zóna vzorku se nachází na počátku kapiláry (Obr. 1C). Výsledkem je zaostření zóny analytu
(focusing) měřené jako podíl délky nadávkované zóny a šířky píku v detektoru dosahující při
maximálním dávkování hodnot 96, 149 a 147 pro GABA, Gly a Glu. Ještě výrazněji je
výhoda zavedeného prekoncentračního postupu patrna přímo při srovnání elektroferogramu
směsi aminokyselin o koncentraci 10-5 M při běžném dávkování (1.4% délky kapiláry) a při
vysokém dávkování rovném 98% délky kapiláry (Obr. 2). Pro dokumentaci vysoké citlivosti
vyvinuté metodiky je na obrázku ukázána analýza této směsi při koncentraci 10-7 M. Dobu
vytlačování ACN z kapiláry lze přesně monitorovat z časového průběhu elektrického proudu.
Obr. 1 Proces zaostření vzorku: hydrodynamické dávkování (A), zaostřování vzorku
elektrickým polem se současným vytlačováním ACN z kapiláry (B), finální zaostření
zaostření vzorku po vytlačení ACN (C), CE separace (D). Barevné rozlišení: analyt (žlutě),
ACN (červeně), BGE (modře).
Tabulka I.
Závislost separačních parametrů pro Gly na délce nadávkované zóny do kapiláry.
Dávkování, Korigovaný
Výška
Plocha
Šířka píku,
N× 10-3,
Zaostření
-1
%
čas, s
píku, mV píku, mV.s
mm
m
zóny
1.4
239
0.10
0.20
2.2
328
2.8
22
238
1.3
2.8
2.4
280
39
43
219
2.4
4.9
2.6
233
72
65
220
3.7
8.1
2.7
210
102
86
210
4.9
10.6
2.9
187
128
98
208
6.0
12.7
2.9
188
149
229
Obr. 2. CE/C4D elektroferogram 10-5M směsi GABA, Gly a Glu v 75% ACN s přídavkem
20 mM NaCl při dávkování 1.4% (A), 98% z délky kapiláry (B) a téže směsi o koncentraci
10-7 M při dávkování 98% (C).
Závěr
Přídavek ACN do klinických vzorků snižuje jejich vodivost a tím umožňuje provádět
techniku large volume sample stacking. Na druhou stranu přítomnost ACN v kapiláře
způsobuje přerušení elektrického proudu, prodlužování migračních časů a nestabilitu základní
linie detektoru. V tomto příspěvku byl navržen nový postup pro ACN-stacking: po
nadávkování dlouhé zóny vzorku s ACN je současně se separačním napětím aplikován
hydrodynamický tlak. Výsledkem je zaostření zředěného analytu do úzké zóny a současné
vytlačení balastního ACN ven z kapiláry. Navrženým postupem lze zvýšit citlivost stanovení
asi o dva řády bez nežádoucího ovlivnění migrační času. Dosažené LODs pro CE/C4D
stanovení aminokyselin se pohybují kolem 10-8 M a jsou plně srovnatelné s použitím vysoce
citlivé CE/LIF, která ovšem vyžaduje derivatizaci vzorku a je pro mnohé laboratoře finančně
nedostupná. Nová metodika byla úspěšně použita pro monitorování hladin neurotransmiterů
v mikrodialyzátech centrálního nervového systému.
Poděkování
Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury Univerzity Karlovy (grant č. 389111),
Grantové agentury České republiky (projekt P206/10/1231) a UNCE 204015.
Literatura
1. Guihen E., O'Connor W.T.: Electrophoresis 31, 55 (2010).
2. Bowser M.T., Kennedy R.T.: Electrophoresis 22, 3668 (2001).
3. Tuma P., Samcova E.: Chem. Listy 101, 200 (2007).
4. Kuban P., Hauser P.C.: Electrophoresis 34, 55 (2013).
5. Breadmore M.C., Shallan A.I., Rabanes H.R., Gstoettenmayr D., Keyon A.S.A., Gaspar
A., Dawod M., Quirino J.P.: Electrophoresis 34, 29 (2013).
6. Shihabi Z.K.: Electrophoresis 23, 1612 (2002).
7. Tuma P., Soukupova M., Samcova E., Stulik K.: 30, 3436 (2009).
8. Tuma P., Malkova K., Samcova E., Stulik K.: J. Sep. Sci. 33, 2394 (2010).
230
Electrocatalysis in Proteins and Polyamino Acids
Veronika Vargová a, Marko Zivanović a, Vlastimil Dorčák a, Veronika Ostatná a,
and Emil Paleček a,b
a
Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
b
Masaryk Memorial Cancer Institute, Zluty kopec 7, 656 53 Brno, Czech Republic
Abstract
Electrochemical methods are shown to be suitable for protein studies. To better understand
the electrode processes, it is useful to follow protein electrochemical responses related to
changes in amino acid composition, glycosylation, 3D conformation of proteins and
environment. Polyamino acids (polylysine, polyarginine, and polyhistidine) as an intermediate
model system between peptides and macromolecular proteins have been investigated to find
how different amino acid residues contribute to the catalytic hydrogen evolution reaction at
hanging mercury drop electrode.
Key words: Constant current stripping, Catalytic hydrogen evolution, Proteins, Polyamino
acids, Hanging mercury drop electrode.
Introduction
The opportunity to discover novel methods for protein study in biomedicine and proteomics is
extremely challenging for existing protein analysis techniques. In electrochemical (EC)
methods using small polarizable electrodes, interactions of surface-confined
biomacromolecules, such as nucleic acids, proteins and carbohydrates (including mutual
biomacromolecule interactions, electric field effects, etc.) can be studied. The advantages of
EC applications in bioanalysis comprise simplicity, rapidity, easy miniaturization, low cost
and the small amounts of protein required. In the last decades most electrochemists focused
their attention to small group of redox-active center containing proteins offering fast
reversible EC processes at solid electrode. Electrochemistry of the majority of proteins was
thus neglected in the rapidly growing fields of biomedicine and proteomics. Already in 1930
polarographic presodium wave was discovered in J. Heyrovsky’s laboratory, but this d.c.
polarographic wave appeared too close to the background discharge and its shape was poorly
developed and difficult to measure. Almost 15 years ago using constant-current
chronopotentiometric stripping (CPS) analysis and Hg electrodes, well-developed peak of
peptides and proteins was obtained in our laboratory 1. This peak, termed peak H, was due to
the catalytic hydrogen evolution displaying sensitivity to local and global changes in protein
structure 2-9. This peak was useful in the analysis of proteins at nanomolar and subnanomolar
concentrations, including determination of metalloproteins in tissues 10, monitoring protein
aggregation 5, 9 and denaturation 2, 4-7, DNA-protein interaction 1, including determination of
DNA point mutations based on DNA interaction with DNA repair proteins. Excellent
correlation between the structure of tumor suppressor p53 core domain, stability of oncogenic
mutants and the CPS responses was observed 8.
For better understanding of CPS peak H nature, including the role of individual types of
amino acid (aa) residues and advantages and disadvantages of this peak in protein analysis,
working with model systems is necessary. In the last years, some such studies were done 11-14
but still more work with poly(aa), peptides and model proteins is required.
Experimental
All chemicals were purchase from Sigma-Aldrich in analytical grade. A three electrode cell
was connected to a μAutolab III potentiostat. The working electrode was a mercury drop
(area: 0.4 mm2) controlled by a VA-stand 663 (Metrohm), the counter electrode was a
231
platinum wire and a Ag|AgCl|3 M KCl was used as the reference electrode. All experiments
were carried out at room temperature open to air.
In our experiments analyte was adsorbed at HMDE electrode from stirred solutions of
poly(aa) at accumulation potentials, EA of -1.4 V for accumulation time, tA of 120 s in the
background electrolyte (50 mM phosphate buffer, pH 6) followed by chronopotentiogram
recording from initial potential, Ei of -1.4 V to final potential, Ef of -2.0 V at stripping current,
Istr of -30 µA.
Results and discussion
40 μM poly(aa) (concentration related to monomer content) namely polylysine (polyLys),
polyarginine (polyArg) and polyhistidine (polyHis) were accumulated for accumulation time,
tA 120 s at accumulation potential, EA -1.4 V 14 from 50 mM phosphate buffer, pH 6 at
HMDE. Under these experimental conditions, well-defined CPS peaks H of given poly(aa)
were observed. CPS polyLys peak H is the most negative (peak potential, Ep -1.93 V) as
compared to polyArg and polyHis. Ep of polyArg is at -1.89 V, whereby polyHis peak is by
100 mV less negative as polyLys (Fig. 1). CPS peak H heights of different poly(aa) were not
the same; peak H of polyLys was the highest and polyArg the smallest one. A more detailed
study of poly(aa)s is under way.
A
Fig. 1. A. CPS peak H of polyArg (dashed line), polyLys (solid line) and polyHis (dotted line)
in 50 mM phosphate, pH 6. B Scheme of dissociation of lysine, arginine and histidine.
232
Conclusion
Earlier we found that, in agreement with the Brdicka’s opinion 15, peptides not containing
cysteine did not show any peak H at alkaline pH. Influence of cysteine in catalyses was
verified in early works dealing with the peak H 11, 16, 17. Our experiments with poly(aa)
showed that at pH 6.0 polyLys and polyArg,Trp produced peak H but polyglutamic acid did
not 14. Recently, important role of Arg in catalysis of angiotensin peptides was reported; the
effect of His residues appeared marginal under the given conditions 12. Our results (Fig. 1)
point out that also His residues in poly(aa) behave as catalysts similar as Arg and Lys in
weakly acidic or neutral environment. Further work with homo-peptides with well-defined
length, without structure should be done for better understanding of the contribution of
individual amino acids in the catalytic process.
Acknowledgements
This work was supported by the GACR 13-00956S.
References
1. Palecek E., Ostatna V.: Electroanalysis 19, 2383 (2007).
2. Ostatna V., Cernocka H., Palecek E.: J. Am. Chem. Soc. 132, 9408 (2010).
3. Ostatna V., Dogan B., Uslu B., Ozkan S., Palecek E.: J. Electroanal. Chem. 593, 172
(2006).
4. Ostatna V., Kuralay F., Trnkova L., Palecek E.: Electroanalysis 20, 1406 (2008).
5. Ostatna V., Palecek E.: Electrochim. Acta 53, 4014 (2008).
6. Palecek E., Ostatna V.: Chem. Commun., 1685 (2009).
7. Palecek E., Ostatna V.: Analyst 134, 2076 (2009).
8. Palecek E., Ostatna V., Cernocka H., Joerger A. C., Fersht A. R.: J. Am. Chem. Soc. 133,
7190 (2011).
9. Palecek E., Ostatna V., Masarik M., Bertoncini C. W., Jovin T. M.: Analyst 133, 76
(2008).
10. Kizek R., Trnkova L., Palecek E.: Anal. Chem. 73, 4801 (2001).
11. Doneux T., Dorcak V., Palecek E.: Langmuir 26, 1347 (2010).
12. Dorcak V., Ostatna V., Palecek E.: Electrochem. Commun. in press (2013).
13. Dorcak V., Palecek E.: Electroanalysis 19, 2405 (2007).
14. Zivanovic M., Aleksic M., Ostatna V., Doneux T., Palecek E.: Electroanalysis 22, 2064
(2010).
15. Brdicka R.: Bull. Int. Acad. Sci. Boheme 46 (1936).
16. Tomschik M., Havran L., Fojta M., Palecek E.: Electroanalysis 10, 403 (1998).
17. Dorcak V., Palecek E.: Anal. Chem. 81, 1543 (2009).
233
Novel Analytical Subject Matter: Cluster Compounds of Boron
Radim Vespalec
Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 35 Brno, Czech Republic
E-mail: [email protected]
Abstract
Electron deficiency of boron allows the existence of chemical bond in which one electron pair
binds three boron atoms. Such a three-center bond is electron deficient and planar in contrast
to two-center bonds that are linear and electron exact or even electron rich. Due to these
dissimilarities, and significance of chemical bonds for properties, capabilities and behavior of
compounds, boron cluster compounds frequently differ unexpectedly and unpredictably from
organic compounds. Just unique properties of boron cluster compounds underlie their
practical prospects including the medical ones.
Key words: Boron cluster compounds, Electron deficiency, Chirality, Analysis
Introduction
Fully synthetic cluster compounds of boron, cluster boranes, have been synthesized first in
1912. Their aimed use as rocked fuels made them scientifically attractive in 1946. However,
cluster compounds of boron became the subject of standard scientific research only after
declasification their research if their military attractivity extincted. Till now, subsequent
research enriched theoretical chemistry and inorganic chemistry much more than everyday
practice life of people. It may change the finding that boron cluster compounds have potential
for curing HIV strains resistant to organic compounds 1.
The existence preconditions
There are two preconditions for existence of boron clusters, and compounds with such
clusters: (i) electron deficiency of boron atoms, and (ii) tendency of boron atoms to mutual
bonding. Their direct consequence is existence of the three-center two-electron bond between
mutually bonded boron atoms, e.g., 2 and consequences of its differences from two-center
two-electron bonds.
Introduction to origins of analytically relevant properties
The three-center two-electron bond (Fig. 1) is electron deficient, planar and rigid 2. Due to its
planarity and rigidity, clusters with more than three boron atoms are three-dimensional.
Structure of a cluster depends both on the numbers of its boron atoms and valence electrons
that entered the cluster during synthesis. Various structural types of clusters exist from this
reason. The lower is the number of electrons that entered a cluster during its synthesis; the
more is the cluster closed and stabil. Cluster boranes are the simplest boron cluster
compounds from the viewpoint of chemical composition. Their derivatives may be formally
obtained either by substitution of boron atoms (endo-skeletal substitution) or by substitution
of hydrogen atoms (exo-skeletal substitution). Almost any substitution deteriorates symmetry
of cluster boranes 3. Absolute majority their derivatives is therefore structurally chiral.
Chirality dominates among boron cluster compounds in contrast to organic compounds. In
clusters, one three-center bond belongs to each boron atom. Total deficiency of valence
electrons therefore increases with the number of boron atoms in general. Each cluster
stabilizes by delocalization of bonding electrons present in individual bonds. Thus, these
bonds extinct and clusters exist as ansambles of boron cations held together by a threedimensional cloud of electrons delocalized over the whole cluster volume. Such a
delocalization cannot decrease the overall electron deficiency. For its decreasing, a boron
cluster compound splits off one or two hydrogen atoms, which are bonded to its boron atoms
by standard two-center bonds, as protons, and their valence electrons includes among
234
delocalized electrons. In this way, the compound turns to a cluster anion with sterical anionic
charge. Electronegativity of hydrogen is higher than that of boron 4. Exo-skeletal hydrogen
atoms therefore acquire partially hydridic nature. However, such a nature deteriorates their
hydrogen bonding capability. Therefore, not only cluster boranes and their anions but their
derivatives are frequently hydrophobic, too.
Fig. 1. Scheme of the electron deficient three-center two-electron bond. Grey color indicates
area in which bonding electrons occur in single three-center bond.
Analytical research: state of the art
Despite the fact that number of synthesized boron cluster compounds was estimated to 50,000
at the end of the past century, the number of purely analytical articles dealing with these
compounds was below 50 at that time 3. It evidences that analytical chemistry of boron cluster
compounds does not exist yet in fact. Fortunately, the number of articles containing
analytically usable data is higher. For example, numerous electrochemical articles and articles
containing electrochemical data published till 1984 was summarized into review 5. Majority
of them presents half-wave potentials as supplementary characteristics measured for
identification of newly synthesized compounds. Other electrochemically important aspects of
electrode processes, e.g., reversibility and the exchanged electrons numbers, have not been
investigated systematically. Due to frequent hydrophobicity of boron cluster species, polar
organic solvents dominated above water in studies utilizing inert gold or platinum electrodes.
The same holds for majority of electrochemical articles published later. Only low number of
recent articles focuses to purely analytical tasks how the utilization of boron cluster
compounds as electrochemical markers in DNA research is, e.g., 6.
Conclusion
The principal dissimilarity of boron cluster compounds and compounds containing only twocenter two electron bonds is caused by two causes: first, by dissimilarity of electron deficient
three-center bonds, and electron exact or electron rich two-centre bonds, and, second, by the
root importance of chemical bonds for all properties and behaviors of compounds. Analytical
research of boron cluster compounds can be classified untouched field at present. It is opened
for anyone who enjoyes dealing with novel topics attractive both scientifically and practically.
235
Acknowledgements
This work was supported by Czech Science Foundation, grant No. P206/12/G151 and by
institutional research plan AV0Z50040702.
References
1. Cigler P., Kozisek M., Rezacova P., Brynda J., Otwinowski Z., Pokorna J., Plesek J.,
Gruner B., Doleckova-Maresova L., Masa M., Sedlacek J., Bodem J., Krausslich H. G.,
Kral V., Konvalinka J.: P Natl Acad Sci USA 102, 15394 (2005).
2. Williams R. E.: Chem. Rev. 92, 177, (1992).
3. Horáková H., Grüner, B. Vespalec, R.: Chirality 23, 307 (2011).
4. Linde D. R.(Ed.), Handbook of Chemistry and Physics, 77-th edition, CRC Press, Bocca
Raton 1997.
5. Morris, J.H., Gysling H. J., Reed D.: Chem. Rev. 85, 51, (1995).
6. Jelen F., Olejniczak A. B.,. Kouřilová A., Lesnikowski Z .J., Paleček E.: Anal. Chem. 81,
840 (2009).
236
Voltammetric Analysis of DNA Multiply Labeled with Anthraquinone and Nitro Tags
(Voltametrické stanovení DNA značené antrachinonem a nitroskupinou současně)
Pavlína Vidláková a, Jana Balintová b, Petra Ménová b, Luděk Havran a, Michal Hocek b,
and Miroslav Fojta a
a
Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
b
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry AS CR, v. v. i., Flemingovo nám. 2, 166 10
Prague 6, Czech Republic
Abstract
Electrochemically labelled DNA can be prepared using primer extension with DNA
polymerase and dNTPs bearing different electroactive groups. For primer extension and DNA
labelling only one type of labelled dNTPs or a suitable combination of several types of
labelled dNTPs simultaneously introduced in a DNA (oligonucleotide) molecule can be used.
We tested the possibility of simultaneous detection of DNAs modified with the two types of
electroactive tags – anthraquinone and nitro group.
Key words: DNA modification, Voltammetry, Anthraquinone, Nitro group.
Úvod
Přestože je přirozená DNA sama o sobě elektrochemicky aktivní a je možné ji stanovit na
různých typech elektrod 1, je pro řadu analytických aplikací praktické použít DNA značenou
elektroaktivními molekulami (například komplexy přechodných kovů 2,3, amino- nebo
nitroskupinami 4,5, antrachinonem 6 apod.). Tyto látky podléhají redoxním reakcím a dávají
takto modifikované DNA nové elektrochemické vlastnosti, které je možné využít pro studium
struktury a interakcí nukleových kyselin a v oblasti DNA diagnostiky.
Značenou DNA je možné připravit například inkorporací nukleotidů s kovalentně navázanými
elektroaktivními skupinami s využitím DNA polymeráz nebo je možné využít koncové
značení modifikovanými nukleotidy navázanými pomocí terminální transferázy.
Experimentální část
Nukleosidtrifosfáty modifikované antrachinonem a nitrofenylskupinou byly připraveny
Sonogashira cross-coupling reakcí halogenovaných nukleosidtrifosfátů s N-(-2-propynyl)antrachinoncarboamidem nebo 3-nitrofenylboronovou kyselinou.
Inkorporace značených nukleosidtrifosfátů byla prováděna metodou prodlužování primeru
(PEX). Pro separaci připravených oligonukleotidů byly používány magnetické mikročástice
Dynabead MyOne streptavidin T1 (Invitrogen).
Voltametrická měření byla prováděna metodou adsorptivní přenosové rozpouštěcí cyklické
voltametrie (AdTS CV) na analyzátoru Autolab (Eco Chemie, Utrecht, The Netherlands)
spojeném s VA-Stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland) ve tříelektrodovém zapojení
(Ag/AgCl/3 M KCl jako referentní elektroda, platinový drátek jako pomocná elektroda). Jako
pracovní elektroda byla používána visící rtuťová kapková elektroda (HMDE). Měření bylo
prováděno v inertní atmosféře argonu. Doba akumulace byla 60 s. Cyklická voltametrie (CV)
na HMDE - základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M fosforečnan sodný, pH 6,9.
Výsledky a diskuse
Metodou PEX byly připraveny neznačené oligonukleotidy a oligonukleotidy značené
antrachinonem a nitroskupinou buď samostatně, nebo jejich kombinací. Elektrochemické
chování těchto oligonukleotidů bylo studováno pomocí CV na HMDE. V případě
neznačených ODN jsou na voltamogramu měřeném při počátečním potenciálu 0.1 V
237
a potenciálu bodu obratu -1,85 V patrné dva signály odpovídající elektrochemickým reakcím
bází. Jedná se o katodický pík CA při potenciálu okolo -1,5 V (příslušející ireverzibilní
redukci cytosinu a adeninu) a anodický pík G při potenciálu -0,25 V (příslušející oxidaci
7,8-dihydrogenguaninu generovaného redukcí guaninu při potenciálech negativnějších než
-1,6 V) 1. Na cyklickém voltamogramu měřeném s potenciálem bodu obratu -1,85 V ODN
značeného antrachinonem je kromě signálů bází navíc katodický pík AQred při potenciálu
okolo -0,4 V (redukce antrachinonu na antrahydrochinon). V CV téhož ODN měřeném při
potenciálu bodu obratu -1V je kromě píku AQred i anodický pík AQH2ox (zpětná oxidace
antrahydrochinonu) (Obr. 1). Intenzita píku AQH2ox závisí na potenciálu bodu obratu. Pík
s nejvyšší intenzitou pozorujeme při potenciálech bodu obratu -0,6 - -1,2 V, při potenciálech
zápornějších než -1,4 V výška píku prudce klesá a při potenciálech zápornějších než
-1,6 V pík AQH2ox nepozorujeme.
0.32
G
ox
0.16
AQH2
0.00
red
I/A
-0.16
AQ
-0.32
-0.48
CA
PEX s AQ ( Esw = -1.85 V)
-0.64
PEX s AQ ( Esw = -1 V)
neznačený PEX
-0.80
-0.96
-1.68
-1.44
-1.20
-0.96
-0.72
-0.48
-0.24
0.00
E/V
Obr. 1. AdTS CV oligonukleotidu značeného antrachinonem (plná čára) a neznačeného
oligonukleotidu (přerušovaná čára) na HMDE, základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný,
0,05 M fosforečnan sodný, pH 6,9, počáteční potenciál 0,1 V, potenciál obratu -1,85 V nebo
-1,0 V.
Na voltamogramu ODN značeného nitroskupinou jsou kromě píků CA a G katodický pík
NO2red (čtyřelektronová redukce nitroskupiny na hydroxylamin) okolo -0,45 V. Na CV téhož
oligonukleotidu měřeném při potenciálu bodu obratu -1 V je kromě píku NO2red i anodický
pík NHOHox (reverzibilní oxidace hydroxylaminu vzniklého předchozí redukcí nitroskupiny)
okolo 0,0 V (Obr. 2). Stejně jako u píku AQH2ox je intenzita píku NHOHox závislá na
potenciálu bodu obratu a s negativnějším potenciálem klesá. Při potenciálu zápornějším než 1,4 V pík AQH2ox na voltamogramu nepozorujeme.
238
0.28
PEX s NO2 ( Esw = -1 V)
0.14
neznačený PEX
PEX s NO2 ( Esw = -1.85 V)
0.00
I/A
-0.14
-0.28
-0.42
-0.56
-0.70
-1.6
-1.4
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
E/V
Obr. 2. AdTS CV oligonukleotidu značeného nitroskupinou (plná čára) a neznačeného
oligonukleotidu (přerušovaná čára) na HMDE, základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný,
0,05 M fosforečnan sodný, pH 6,9, počáteční potenciál 0,1 V, potenciál obratu -1,85 V nebo
-1,0 V.
Metodou PEX byly připraveny i oligonukleotidy, které byly modifikovány antrachinonem
i nitroskupinou současně v různém poměru. Na voltamogramech těchto oligonukleotidů je
vidět, že vzhledem k velmi blízkým hodnotám redukčních potenciálů obou skupin jsou jejich
katodické signály velmi obtížně rozlišitelné. Obě značky je však možno velmi snadno rozlišit
díky příslušným anodickým signálům. Redukce nitroskupiny je ireverzibilní a neposkytuje tak
žádný pík, který by interferoval s píkem AQH2ox. Produkt ireverzibilní redukce nitroskupiny
navíc poskytuje oxidační signál NHOHox, jehož potenciál se od potenciálu píku AQH2ox liší
o cca 400 mV a tudíž se oba signály neovlivňují (Obr. 3). Intenzita píků AQH2ox a NHOHox
koresponduje s poměrným zastoupením antrachinonem a nitroskupinou modifikovaných bází
v oligonukleotidu.
Závěr
V naší práci jsme studovali možnost současného stanovení nitroskupiny a antrachinonu
pomocí CV na HMDE. Pro elektrochemické chování antrachinonu je charakteristická
dvouelektronová redoxní přeměna chinon/hydrochinon, zatímco nitroskupina podléhá
ireverzibilní čtyřelektronové redukci na hydroxylamin, který je možné následně reverzibilně
oxidovat. Z našich výsledků vyplývá, že tyto značky je možné od sebe velmi dobře rozlišit.
Pro současné sledování signálů obou značek i signálů odpovídajících redukci/oxidaci bází
nukleových kyselin je možné použít dva následné potenciálové cykly, kdy první má potenciál
bodu obratu mezi -0,7 a -1 V a druhý -1,85 V. Kombinaci obou značek je možné využít pro
studium interakcí i struktury nukleových kyselin.
239
Obr. 3. AdTS CV oligonukleotidů značených antrachinonem a nitroskupinou v různém
poměru na HMDE, základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M fosforečnan sodný,
pH 6,9, počáteční potenciál 0,1 V, potenciál obratu -1,0 V.
Poděkování
Tato práce vznikla díky podpoře grantů GA ČR (P206/12/2378, P206/12/G151) a GA AV ČR
(IAA400040901).
Literatura
1. Palecek, E., Jelen, F.: In Electrochemistry of nucleic acids and proteins Towards
electrochemical sensors for genomics and proteomics (Palecek, E., Scheller, F., Wang, J.,
ed.), pp 74-174, Elsevier, Amsterdam 2005.
2. Fojta, M., Havran, L., Kizek, R., Billova, S., Palecek, E.: Biosens. Bioelectron. 20, 985
(2004).
3. Vrabel, M., Horakova, P., Pivonkova, H., Kalachova, L., Cernocka, H., Cahova, H., Pohl,
R., Sebest, P., Havran, L., Hocek, M., Fojta, M.: Chem-Eur. J. 15, 1144 (2009).
4. Cahova H., Havran L., Brazdilová P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.:
Angew. Chem. Int. Ed. 47, 2059 (2008).
5. Horakova P., Cahova H., Pivonkova H., Spacek J., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Org.
Biomol. Chem. 9, 1366 (2011).
6. Balintova J., Pohl R., Horakova P., Vidlakova P., Havran L., Hocek M., Fojta M.: ChemEur. J. 17, 14063 (2011).
240
Electrophoretic Separation of Short Oligonucleotides from their Complexed Osmates
(Elektroforetická separace krátkých oligonukleotidů od jejich komplexovaných osmátů)
Lada Vítová and Radim Vespalec
Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 35 Brno, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
Capillary electrophoresis in free solution is a promising technique for separations of very
short oligonucleotides. Separation potential of chosen separation system was checked by
analyses of reaction mixtures in which bathophenanthrolinedisulfonic acid, neocuproine and
N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine have been present as stabilizing ligands of AAAAT
oligonucleotide osmate adduct. Various numbers of separated zones, and unexpected
mobilities of some zones evidence that at least one supposed reaction step depends on
chemical nature of the stabilizing ligand. Under the given conditions, N,N,N′,N′tetramethylethylenediamine hardly acts as the osmate stabilizing ligand.
Key words: Capillary electrophoresis; DNA; electroactive marker; oligonucleotide; osmate;
osmium tetroxide.
Úvod
Elektroaktivní značky jsou účinným nástrojem studia struktury, strukturních změn, poruch
i chemických modifikací nukleových kyselin i jejich fragmentů, viz např. 1. Velmi populární
jsou značky získané derivatizací krátkých oligonukleotidů nebo oligodeoxynukleotidů
kysličníkem osmičelým a stabilizované pro vodné prostředí aromatickými dusíkatými bázemi
viz např. 2. Jejich elektroaktivním atomem je vždy osmium, někdy to však mohou být i další
atomy. Vyšší stabilizační účinnost mají báze se dvěma stericky vhodně umístěnými atomy
dusíku 3. Počet sloučenin zkoušených nebo navrhovaných ke stabilizaci vznikajících osmátů
stále roste. Znalosti nutné pro optimalizaci přípravy značek s elektroaktivním atomem osmia
i pro jejich využívání však přesto dosud nejsou vždy dostatečné. K nezbytným krokům při
získávání chybějících znalostí vždy patří izolace reakčních produktů a často následovaná
jejich identifikací. Očekávané reakční produkty jsou nabité. Vhodnou technikou potřebných
analýz reakčních směsí je proto elektroforéza.
Výběr separační techniky a separačního systému.
Pro analýzy DNA a fragmentů DNA s hmotnostmi řádu desítek tisíc Daltonů a více jsou
nezbytné trojrozměrné gely 4, které však nejsou schopny dělit fragmenty tvořené pouze
několika málo nukleotidy. Tím méně jsou schopné oddělit takové fragmenty od jejich
derivátů, které byly získány navázáním funkčních skupin a malých molekul. Pro
elektroforetická dělení takových směsí je třeba použít separace ve volném roztoku. Jejich
optimální variantou jsou separace v kapilárách 4.
Separačním systémem kapilární elektroforézy ve volném roztoku je vždy křemenná kapilára
naplněná základním elektrolytem. Pro vyloučení experimentálních obtíží a omezení, které
působí kationtový elektroosmotický tok při separacích aniontů, byla zvolena kapilára, jejíž
vnitřní povrch byl pokryt chemicky vázaným polyakrylamidem 5. Chemický charakter vzorků
vyžaduje jako rozpouštědlo základního elektrolytu vodu. Pufrující složka základního
elektrolytu, kyselina morfolinpropansulfonová (MOPS), byla nastavena na pracovní pH 7
morfolinem. Kationty morfolinu konkurují coulombické interakci kladně nabitých nukleových
bází v oligonukleotidech s negativními náboji disociovaných silanolových skupin, které
zůstávají na vnitřním povrchu křemenné kapiláry i po jejím pokrytí polyakrylamidem. Při pH
7 takovou interakci prakticky eliminují již při analytické koncentraci kyseliny 40 mM.
241
Experimentální část
Hlavní součástí použité laboratorní sestavy byl spektrofotometrický detektor pro kapalinovou
chromatografii Jasco 875 UV–VIS (Jasco, Tokio, Japonsko) upravený pro práci s radiálně
prosvěcovanými kapilárami, které jsou termostatovány kapalinou. Separované zóny byly
detekovány při vlnové délce 260 nm. Odezvu detektoru monitorovala chromatografická
stanice CSW 1,7 (Data Apex, Praha, Česká Republika). Vysokonapěťový zdroj Spellman
CZE 1000R (Plainview, New York, USA) poskytoval napětí vkládané na separační kapiláru.
MOPS a morfolin použité pro přípravu základního elektrolytu byly od firmy Sigma-Aldrich
(Praha, Česká Republika). Dodané vzorky AAAAT i reakční směsi tohoto oligonukleotidu
byly analyzovány bez předběžných úprav.
Výsledky a diskuze
Ve zvoleném separačním systému (křemenná kapilára světlosti 75 µm a separační délky 26
cm s vnitřním povrchem pokrytým chemicky vázaným lineárním polyakrylamidem 5, základní
elektrolyt 40 mM MOPS nastavený morfolinem na pH 7) a při zvolených experimentálních
podmínkách (kapilára termostatovaná kapalinou na 25°C, vkládané napětí
–20 kV) rozlišení zóny oligodeoxynukleotidu AAAAT od zóny jeho pomaleji migrujícího
osmátu, který je komplexován 2,2´ bipyridinem, výrazně překračuje rozlišení nutné pro
dokonalé oddělení dvou zón (záznam analýzy neuveden). Toto rozlišení, dosažené s kapilárou
jejíž separační délka je pouhých pouhých 26 cm, je důsledkem vysoké selektivity separace
způsobené především větším objemem komplexovaného derivátu ve srovnání s objemem
výchozího oligonukleotidu. Obdobnou změnu velikosti reakčních produktů je možno
očekávat při komplexaci osmátu AAAAT s jinými nízkomolekulárními sloučeninami.
K ověření tohoto předpokladu sloužily tři sloučeniny považované za perspektivní ligandy:
kyselina bathofenantrolindisulfonová, neokuproin and N,N,N′,N′-tetrametyletylendiamin.
V reakčních směsích byly přítomny v koncentracích 0,2 mM, 0,5 mM nebo 1 mM. V těchže
koncentracích byl do nich přidáván také kysličník osmičelý. Výsledky elektroforetických
analýz reakčních směsí (obr. 1) tento předpoklad potvrzují. Výsledky analýz blízké očekávání
byly získány při všech počátečních koncentracích kyseliny bathofenantrolindisulfonové (obr.
1a, záznamy č. 2, 3, a 4) a při nejvyšší koncentraci neokuproinu (obr. 1b, záznam 4). Záznam
1 je předběžnou analýzou výchozího oligonukleotidu AAAAT, který byl v reakční směsi vždy
přítomen v koncentraci 0,08 mM. Mobility a tvary oddělených zón zobrazených při
zmenšeném měřítku časové osy v analýzách 2, 3 a 4 v obr. 1a i 1b ukázaly, že počet reakčních
produktů byl vždy vyšší než počet úplně oddělených zón. Tento počet závisel nejen na
identitě ligandu, ale i na jeho počáteční koncentraci v reakční směsi, která rostla od záznamu
2 k záznamu 4. Současně zvyšovaná koncentrace kysličníku osmičelého nedovoluje připsat
nalezené skutečnosti pouze vlivu ligandu. Výsledky analýz reakčních směsí
s tetrametyletylendiaminem (obr. 1c) ukazují, že v těchto případech AAAAT není
derivatizován očekávaným způsobem 3,4. Tuto sloučeninu nelze proto považovat za
perspektivní ligand.
242
Obr. 1. Analýzy reakčních směsí. Detaily jsou uvedeny v textu.
Závěr
Separační systém navržený pro vzájemné separace oligodeoxynukleotidu AAAAT a jeho
derivátu s kyselinou osmičelou, který je stabilizován komplexací s 2,2´ bipyridinem, je vysoce
selektivní. Je proto perspektivní pro separace zkoušeného typu a typů obdobných i pro dělení
krátkých a velmi krátkých oligonukleotidů i deoxynukleotidů.
Poděkování
Práce vznikla s podporou centra excelence č. GAP 206/12/G151.
Literatura
1. Fojta M.: V Electrochemistry of Nucleic Acids and Proteins. Towards Electrochemical
Sensors for Genomics and Proteomics (Paleček E., Scheller F., Wang J., Eds.); Elsevier,.
Amsterdam, 2005, p. 386.
2. Fojta M., Kostečka P., Pivoňková H., Horáková P., Havran L.: Current Anal. Chem. 7, 35
(2011).
3. Criege R., Marchand B., Wannowius H.: Ann. der Chemie, 550, 8 (1941).
4. Khaledi M.G., High Performance Capillary Electrophoresis, Wiley, 1998.
5. M. Vespalcová, D. Gregorová, J. Sep. Sci. 26, 729 (2003).
243
Deterministic and Stochastic Analysis of Organic Semiconductor Doping
(Deterministická a fluktuační studie dopování organických polovodičů)
Ryan M. West, Mira Josowicz, and Jiří Janata
School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology,
Atlanta, GA 30332-0400, USA, E-mail: [email protected]
Abstract
Deterministic and stochastic evaluation of signal from insulated gate field-effect transistor
with polyaniline gate is reported. It is shown that combination of these two modes of
measurement offers deep insight into the mechanism of doping. The space-charge region of
an organic semiconductor - insulator interface is probed and a model is proposed for local
work function variations and spontaneous charge-carrier fluctuations within polyaniline films,
with consequences for organic electronics using organic semiconductors, including solid state
gas sensors.
Key Words: Fluctuation analysis, Organic semiconductor, Field-effect transistors, Work
function, Doping.
Introduction
Any variable describing a system at equilibrium contains two parts: its mean value and the
fluctuating component. The former provides deterministic information while the dynamic
information, i.e. kinetics can be obtained from the latter. Work function of an electronic
material is its fundamental property. It is a key parameter in devices belonging to the category
of organic electronics, including solid-state chemical sensors for gases. An absolute mean
value of WF of a material cannot be measured, similar to the mean value of a single electrode
potential. Only the difference of the two WFs is experimentally accessible. It corresponds to
the energy required to remove a test charge, typically an electron, from the bulk of the
electronic phase and place it outside the electrostatic field of the solid phase, in vacuum
reference level. Unlike its electrochemical counterpart, the value of WF depends on the path
through which the test charge has been removed, i.e. on the surface dipole as well as on the
bulk affinity of the material. In this paper we focus on WF of the organic semiconductor
polyaniline (PANI) and show that its mean value WF can be directly linked to the analytical
concentration of the doping gas while the fluctuating part F(t) can provide insight into the
actual mechanism of doping.

WF(t) = WF + F(t)
(1)
Information from Deterministic Value of Work Function
Vibrating capacitor, the Kelvin probe, is the most common instrument for measuring the
experimental mean value of WF . Besides the material under study, it requires a reference
plate against which the work function difference WF is measured 1. Thus the final value
contains the contribution from the bulk affinity of the sample and of the reference plate as
well as from the dipoles at both surfaces. An assumption needs to be made about the

constancy of the reference
plate contribution. Although it has been demonstrated for
measurement of partial pressure of gases it is somewhat awkward to use Kelvin probe as a
chemical sensor. On the other hand an insulated gate field-effect transistor (IGFET) is almost
an ideal sensor 2. Bulk semiconductor from which the transistor is made, typically silicon,
represents the reference plate. Its WF contribution is constant and the value of WF thus
obtained relates only to the gate material. The functional relationship between the partial
pressure of the doping gas PG and the transistor gate response VG is
244
kT
ln( PG   K i Pi )
(2)
2 G
i
The WF of the sensing material is included in the VG term. The product KiPi represents the
contribution of interfering doping gases (Ki is selectivity coefficient and Pi is the partial
pressure) and  is the partial charge shared between the gate material and the dopant gas 3.
VG  VG* 
Fig. 1. (A) Analytical (deterministic) response of the work function PANI-IGFET to ammonia
in air. Different curves correspond to different content of ionic liquid forming the PANI gel4.
(B) Fluctuation analysis of the PANI IGFET showing power spectral density (right) and
“smeared” Lorentzian spectrum (left) of the fluctuating portion of the work function F(t). The
corner frequency "f" and the broadness exponent “c” define the position and shape of the
peak, respectively 7.
Stochastic Evaluation of Fluctuating Value of Work Function
The fluctuation-dissipation theorem states that a fluctuating variable D(t) equals the product
of dissipative force M, absolute temperature T and the Boltzmann constant k
D(t)  MkT
(3)
Thus, a dynamic (fluctuating) variable at equilibrium can yield kinetic information about the
system without external stimulation. This fundamental relationship of statistical mechanics
has been used to study phenomena as diverse as critical opalescence, light scattering, the
etc. In this work the equilibrium fluctuating value of drain current
Nyquist noise in resistors,
of silicon-based transistor with Polyaniline (PANI) gate has been studied. The transistor itself
is a mere low noise, moderate gain amplifier that makes such measurement possible.
Experimental
Transistors with dual PANI gate and a chip housing eight PANI gate IGFETs were used for
deterministic as well as for stochastic analysis. Experimental set-up for equilibrium
deterministic 4 and fluctuation 5 analysis is described here only in the outline. The details can
be found in the full papers. In order to minimize the extraneous noise, all stochastic
experiments were done in a welded Faraday cage consisting of 3 mm thick walls with battery
powered instruments. Such precautions were not necessary for the deterministic
measurements. The gas doping was done by exposing the transistor with PANI gate to
donor/acceptor gases of interest, in an enclosed compartment. The proton doping was done by
controlled photolysis of phosphonium triflate salt.
245
Fig. 2. Effect of the threshold voltage V on (A) the corner frequency "f" and (B) on the
broadness exponent "c" in the Lorentzian spectrum7. The shift of the threshold voltage is
caused by the different concentration of the selected dopant: ammonia (NH3), dimethylamine
(DMA) and proton generated photochemically from phosphonium triflate (PhT) 6.
Results and Discussion
An example of analytical (deterministic) response of PANI gate to ammonia gas (electron
donor) according to Eq. 2 is shown in Fig. 1a. It is a typical reversible up-down response
obtained from the mean value of the gate voltage4. From such measurement a value of  can
be evaluated.
No external perturbation is needed to record the stationary fluctuating variable F(t). Because
the "noise" is additive, it is possible to dissect the source of fluctuations, layer by layer, into
individual contributions, until the fluctuations from the sample are isolated. Therefore, the
external radiofrequency noise and the background noise from auxiliary instrumentation and
from the operation of the transistor of identical geometry are all factored out. The fluctuations
of interest, the "excess noise F(t)", is then analyzed for its frequency content.
An example of acquired fluctuation data is shown in Fig. 1b. There a 100 ms sample of
fluctuating drain current is shown. Five thousand such segments are collected, examined for
ergodicity and, through Fourier algorithm, the set is transformed to power spectrum and
averaged (left curve)7. By multiplication with frequency, the shape of the Lorentzian is
obvious (right curve).
c
 A  f / f 
 B
L( f )  f  S ( f )  
2 
 1  ( f / f ) 
(4)
The Lorentzian L(f) is product of frequency f and power spectral density S(f). It conveniently
shows the corner frequency f, Lorentzian amplitude A, the 1/f noise amplitude B and the
"broadness exponent" c. The latter is a fitting parameter allowing description of processes
involving larger number of distributed frequencies. For a pure Lorentzian the c = 1. The peak
frequency corresponds to the time constant of the slowest process causing the fluctuation,
while the exponent c of the peak is related to the dispersion of dynamic processes involved in
the fluctuation of F(t).
Obviously, in order to gain further insight other experimental variables must be systematically
changed. These were: (1). applied gate voltage that determines the depth of the space charge
246
at the interface, (2). temperature, which confirms that the fluctuations are caused by the
activated process, with an activating energy approximately 0.35 eV. The chemical doping
with protons (primary doping) and doping with selected donor/acceptor gases (secondary
doping) show the effect of chemical modulation of WF according to Eq. 2. The polarity of the
dopant is clearly demonstrated (Fig. 2). Because the doping level relates to the probing depth,
it is possible to conclude from these results that higher frequency sites involved in the ndoping (i.e. NH3 and DMA) are localized farther away from the interface while the opposite is
true for the p-doping (i.e. PhT). Such interactions are the underlying principle of WF-based
chemical sensors for gases.
Conclusions
From these experiments it is possible to propose a model of dynamics modulation of WF in
field-effect transistors with PANI gate (Fig. 3). It is very likely that such model applies to
other organic semiconductors and their interaction with dopants as well7. The concentration
dependence of the mean value of WF extends over several decades of partial pressure,
according to Eq. 2. It is therefore assumed that the majority of the deterministic signal
originates in the bulk of the material. On the other hand the fluctuations of work function
F(t) seem to have their origin in the space charge region of the insulator/PANI interface and
are dependent on the donacity of the dopant. They seem to be related to the stochastic filling
charge traps near the interface as shown in Fig. 3
Fig. 3. The proposed model of random charge trapping in PANI IGFET, leading to
fluctuations of work function. The silicon part of the transistor is shown on the left of the
insulator while the PANI gate is shown on the right. In this diagram the transistor is shown on
the left of the insulator while the PANI gate is shown on the right. In this diagram the
transistor is shown in arbitrarily chosen state of zero electric field in the insulator (flat-band
condition).
Acknowledgment
Support of this project from Georgia Research Alliance is greatly appreciated.
References
1. Janata J. Josowicz M.: Anal.Chem. 69, 293A (1997).
2. Janata J.: Principles of Chemical Sensors, Springer, New York 2009
3. Janata J., Josowicz M.: J. Solid State Electrochem. 13, 41 (2009).
4. Saheb A., Josowicz M., Janata J.: Anal.Chem. 80, 4214 (2008).
5. West R.M., Watts C., Josowicz M., Janata J.: Coll.Czech.Chem.Commun. 76, 843 (2011).
6. Potje-Kamloth K., Polk B.J, Josowicz M., Janata J.: Chem. Materials 14, 2782 (2002).
7. West R.M, Josowicz M. Janata J., Phys. Chem. Chem. Phys. (2013), submitted.
247
The Use of the Conductometric Method for Indication of Damage Plant Tissues by
Cadmium
(Využití konduktometrické metody pro indikaci poškození rostlinných pletiv kadmiem)
Brigita Zámečníková, Hana Vodičková, Daniela Miholová, Zorka Kotíková,
and Jaromír Lachman
Czech University of Life Science Prague, Department of Chemistry, Kamýcká 129, Prague 6,
165 21, Czech Republic, [email protected]
Abstract
Conductometric determination of electrolyte leakage from plant parts was used in the
experiment with young barley plants subjected to increasing doses of cadmium. Plants were
grown hydroponically for three weeks, and then cadmium solution (CdCl2), at concentrations
of 10-5, 10-3, 10-2 mol/l, was added into root medium. After three days the effect of cadmium
was observed as tissue damage by measuring of the electrical conductivity of the leakage
electrolyte. It was found that at the concentration of 10-5 mol/l there was no significant
damage of the membrane. At higher concentrations, however, the most damaged were roots,
then the oldest leaves. The lowest damage was found for youngest leafs with not yet
completed growth. Damaged parts of plants were affected by cadmium accumulation in
different organs.
Key words: Electrolyte leakage, Heavy metal, Barley.
Úvod
Rostliny jsou úzce vázány na okolní prostředí. Negativní působení toxických kovů na rostliny
způsobuje stres. Stresové vlivy obecně působící na nízké úrovni způsobují vratné změny nebo
na vyšší úrovni nevratné změny ve fyziologických pochodech 1, například nedostatek vody
způsobí uzavírání průduchů, nízká teplota zpomaluje biochemické pochody. Nízká hladina
toxických kovů, například kadmia, rovněž zpomaluje růst a ovlivňuje biochemické pochody.
Síla stresu a doba působení může také vyvolat změny trvalého charakteru 1,2. Změny na
membránách rostlinných buněk kromě působení toxických kovů nejvíce ovlivňuje vodní stres,
změny teplot a mráz. Toxické působení kovů, například kadmia, může působit jeho kumulaci
v pletivech, což ovlivní metabolismus rostliny, zejména fotosyntetický aparát 3. S vysokou
hladinou stresu dochází až k poškození membrány. Porušení membrány při sledované
koncentraci kadmia pak lze detekovat prostým výtokem obsahu buněk 4. Měření výtoku iontů
je základem pro konduktometrickou metodu, kterou lze používat pro detekci poškození
toxickými ionty, ale i při suchu a mrazu 5,6,7.
Metodika
Rostliny ječmene jarního byly naklíčeny na klíčidlech po dobu 5 dnů při 19 °C a pak
přesazeny a kultivovány v hydroponické kultuře s použitím modifikovaného Knopova
živného roztoku. Třetí den po přesazení byly aplikovány dávky CdCl2. 2,5 H2O v koncentraci
10-5 mol/l, devátý den po přesazení byly aplikovány dávky CdCl2. 2,5 H2O v koncentraci
10-4 a 10-3 mol/l. Dvanáctý den bylo provedení měření výtoku elektrolytu z pletiv pomocí
vodivostní elektrody a měřicího přístroje Conductometer Skála (Skála, Česká republika).
U rostlin, které byly ve stádiu růstu třetího listu byly odebrány 100 mm dlouhé části kořenů ze
střední části kořenového systému, u nejstaršího listu (1. list) a nejmladšího listu (3. list) byly
odebrány vždy dva segmenty 100 mm dlouhé ve více opakováních. Tyto segmenty byly
vloženy do zkumavek se 3 ml destilované vody, třepány horizontálně 150 cyklů za minutu při
laboratorní teplotě 24 °C po 30, 60 a po 90 minutách, kdy došlo k ustálení hodnot měřené
vodivosti a následně po varu byla změřena opět vodivost roztoků. Vzhledem k tomu, že na
řezných plochách listů i kořenů dochází k výtoku elektrolytu i u kontrolní varianty, je nutné
248
konečný výpočet pro index poškození (It) upravit dle Flinta 8, Prášila a Zámečníka
relativní vodivost a relativní poškození.
7
jako
It = (Rt - R0) /(Rm-R0),
(1)
kde It = index poškození po působení kadmia;
R0= relativní výtok elektrolytu kontrolní varianty bez působení kadmia vztažený k hodnotám
po varu;
Rt = relativní výtok elektrolytu po působení kadmia vztažený k hodnotám po varu;
Rm= relativní výtok elektrolytu po působení maximální koncentrace kadmia vztažený
k hodnotám po varu.
V případě, že se hodnoty výtoku elektrolytu po působení vyšší koncentrace kadmia blíží
hodnotám po varu, lze předpokládat, že Rm = 1.
It(%)=(Rt−R0)/(1−R0)
(2)
Výsledky a diskuse
Již z našich předchozích pokusů (Obr. 1) lze vysledovat, že kumulace kadmia probíhá při
nižší koncentraci méně intenzivně než při vyšší koncentraci. Zároveň je vidět, že více kadmia
se kumuluje v kořenové části než v listové části. Hodnoty obsahu kadmia v listové části se
zvyšují se zvyšováním kadmia přidaného do živného roztoku.
Obr. 1. Stanovené obsahy kadmia v pletivech po kultivaci v kontrolním roztoku a v roztoku
s CdCl2 . 2,5 H2O 10-5 a 10-4 mol/l.
249
Obr. 2. Relativní vodivost u jednotlivých variant po kultivaci v roztoku kontrolní a v roztoku
s CdCl2 . 2,5 H2O, kontrola, 10-5, 10-3a 10-2 mol/l.
Obr. 3. Relativní index poškození u jednotlivých variant po kultivaci v roztoku kontrolní
a v roztoku s CdCl2. 2,5H2O, kontrola, 10-5, 10-3 a 10-2 mol/l.
Sledujeme-li míru poškození při výtoku elektrolytu (obr. 2) a použijeme relativních hodnot
pro konečné vyhodnocení (obr. 3), je vidět, že u nízké koncentrace 10-5 mol/l je tendence
k poškození kořene, avšak neprůkazná statisticky, u vyšších koncentrací je pak průkazné
poškození nejvyšší nejdříve u kořenů, pak u prvního listu a nejnižší poškození u třetího nebo
druhého listu.
V původní práci 8 je popsáno použití metody měření výtoku iontů z rostlinných pletiv, kde
byla metoda vyzkoušena na více rostlinných druzích, a bylo zjištěno, že detekuje poškození
membránového systému. Často je touto metodou hodnoceno působení mrazu 7 u obilovin,
250
autoři vyzkoušeli různou velikost, tvar a počet terčíků aby metodu optimalizovali pro pšenici.
Dále pak řešili interpretaci výsledků jako vyjádření intenzity poškození vycházející z výpočtu
relativních vodivostí. Jiná autorka5 se pak zabývá poškozením membrán v podmínkách
vodního stresu vyvolaném pomocí PEG (polyethylenglycol), podrobnější studií přechodu
iontů ze symplastu do apoplastu a poté do vnějšího roztoku u ječmene, kde prokazuje
vhodnost využití této metody. V další práci3 je popsán účinek sníženého RWC na poškození
membrány. Z hodnot indexu poškození pro kontrolní variantu (Obr. 2) vyplývá, že ionty
mohou procházet i přes nepoškozenou membránu. Bylo zjištěno, že propustnost membrán
souvisí také s antioxidační aktivitou daného pletiva. Pokud dojde k poškození membrán, jedná
se o poškození především bílkovinných složek enzymů 9, může však docházet i k poškození
a změnám strukturylipidů 10.
Závěr
Ověřili jsme vhodnost metody výtoku elektrolytu a konduktometrického měření z buněk pro
hodnocení indexu poškození membrán u kořenů a listů mladých rostlin ječmene jarního
kultivovaného v podmínkách stupňující se koncentrace kadmia. Se zvyšováním obsahu
kadmia v rostlinách, roste také míra poškození membrán. Nejvíce jsou poškozeny kořeny, pak
nejstarší listy a nejméně nejmladší listy. Z této práce je patrné, že metoda výtoku iontů je
vhodná pro sledování poškození membrán.
V návaznosti na získané výsledky, hodnoty indexu poškození po působení toxických kovů
bude možné dát do korelace s parametry metabolických změn důležitých látek v rostlinném
organismu, zejména dusíkatých sloučenin.
Acknowledgment
This research was supported by the Grant Agency of the Czech Republic GAČR (Project
No.P208/12/1645).
Přehled literatury
1. Selye H.:The stress of life. New York, McGraw-Hill. 1956.
2. Levit J.: Responses of plants to environmental stresses. AcademicPress, New York. 1980.
3. Kocheva K., Lambrev P., Georgiev G., Goltsev V., Karabaliev M.: Bioelectrochemistry
63,121(2004).
4. Dexter S. T., Tottingham W. E.,Graber. L.F.: Plant Physiol. 5, 215 (1930).
5. Kocheva K. V., Georgieva G. V., Kocheva V. K.:Physiol. Plant. 125, 1 (2005).
6. Bajji M., Kinet J. M., Lutts S.:Plant Growth Regul. 36, 61 (2001).
7. Prášil I., Zámečník J.:Environ. Exp. Bot. 40, 1 (1998).
8. Flint H. L., Boyce B. R., Beattie D. J.:Can. J. Plant Sci. 47, 229 (1967).
9. Azevedo H., Pinto C. G., Santos C.: J. Plant Nutr. 28, 2233 (2005).
10. Belkhadi A., Hediji H., Abbes Z., Nouairi I., Barhounmi Z., Zarrouk M., Chaibi W.,
Djebali W.: Environ. Safe. 73, 1004 (2010).
251
E-mail: [email protected]
tel.: 266 053 877
tel./fax: 286 890 502
DETEKČNÍ SYSTÉM ÚNIKU ROPNÝCH LÁTEK
AS-DETECTOIL
Detekční zařízení určené ke zjišťování a monitorování přítomnosti ropných látek, olejů, apod.
na hladině vody. Zařízení je certifikováno. Zařízení je využitelné zejm. v průmyslu (energetika,
čističky odpadních vod, ap.), v odlučovačích ropných látek, v životním prostředí aj. – jako
kontrolní a bezpečnostní systém.
POPIS ZAŘÍZENÍ
Systém sestává ze sondy o rozměrech 70 x 70 x 30 mm, z vyhodnocovacího přístroje o
rozměrech 220 x 50 x 150 mm (napájeného napětím 12 V – akumulátor, trafo) a z výstupu pro
instalaci signalizačního zařízení (zvonek, světlo) či pro napojení regulačního, záznamového a
jiného systému.
Zařízení umožňuje dlouhodobý, spolehlivý a bezúdržbový provoz, i v prostředí s nebezpečím
výbuchu. Díky rozměrům sondy lze detektor instalovat např. i do vrtů nebo na odbočky z potrubí.
TECHNICKÉ ÚDAJE
připojením na síť 220/50 Hz; 3,5 mA; akumulátor nebo trafo; váha 1,9 kg
252
Potřebujete výkonnou a certifikovanou
pracovní stanici?
Potřebujete kompletní vybavení učeben?
Potřebujete vybavit serverovnu?
Nabízíme:








desktopové jedno a dvouprocesorové certifikované pracovní stanice
kvalitní LCD monitory s technologií IPS
mobilní certifikované pracovní stanice
servery a kompletní vybavení serveroven
návrh a realizace poslucháren včetně veškerého vybavení
kvalitní počítačové sítě od návrhu po realizaci
projekční a interaktivní technologie
velkoformátová tisková řešení
Kontaktujte nás:
CSF s.r.o.,
Střelecká 672, 500 02 Hradec Králové,
Tel
606 630 421, 495 533 495
E-mail
[email protected]
www.csf.cz
2013 Preferred GOLD Partner HP Workstation Specialist
Nejlepší TOSHIBA servis ve Střední Evropě
253
E-mail: [email protected]
tel.: 266 053 877
tel./fax: 286 890 502
Osvědčený analyzátor do každé laboratoře, provozu i terénu, výzkumu i škol
moderní, citlivý a široce využitelný s vlastními originálními US patenty, certifikovaný přístroj
PC ECO - TRIBO voltametrický/POLAROGRAFický analyzátor
● vysoká citlivost ● snadná automatizace ● ideální pro speciaci
● stolní nebo přenosná verze (připojení na stolní PC, laptop či notebook)
● verze pro DOS, Win 3.x, 9x, Me, 2000, XP
Metody



DC a diferenční pulzní voltametrie (DCV a DPV), Cyklická voltametrie,
DP a Tast polarografie
Chronopotenciometrie s konstantním proudem
Možnost návrhu vlastních metod podle potřeby uživatele
Elektrody



Miniaturní tužková rtuťová
Zlatá, uhlíková (pastová i filmová), stříbrná, měděná
Pevné amalgamové
stříbrná, zlatá, měděná (menisková, leštěná, filmová)
Použití
Pro ekoanalýzu (polarografii a voltametrii)
ve vodách, v roztocích a v různých materiálech (podle ČSN, DIN apod.),
v běžných podmínkách pro vysoké obsahy i pro stopové koncentrace
10-10 až 10-11 mol/l



stanovení kovů (Pb, Cd, Zn, Cu, Fe, Ni, Al, Cr, Hg, As, Mn, Mo, Be), resp.
většiny prvků Mendělejevovy tabulky
stanovení aniontů (dusičnanů, dusitanů, Cl-, CN-, Br-, J-, SO42-, PO43-, S2-)
sledování velkého množství org. látek a škodlivin (saponátů, herbicidů,
pesticidů, insekticidů, nitrolátek, barviv, biologicky aktivních látek, surfaktantů
atd.).
Hodnocení stavu a stupně opotřebení motorů, ropných olejů a maziv
v běžných podmínkách, bez demontáže
Oblasti aplikací - dosud nejširší laboratorní, provozní, dílenská i terénní praxe
vodohospodářství, ekologie, hygiena, zemědělství a potravinářství, medicína, farmacie,
geologie, hutnictví, chemické a jiné průmyslové závody, výzkum, školství atd.
Analýza všech druhů vod a vodných roztoků; odpadních vod, vod z galvanizoven,
průsaků, skládek odpadů, výluhů půd; geologických vzorků; rud; popílků a prachu;
zemědělských, chemických a farmaceutických vzorků; pokrytí ČSN a vyhl. na vody z asi
80 % atd.
Samozřejmostí je bezplatná konzultace a předvedení systému. Poskytujeme
komplexní, odborný i pogaranční servis, odbornou pomoc a vývoj
analytických metodik. Celý systém je, pro svou jednoduchou obsluhu,
vhodný pro výukové účely.
254
255
ISE sponsored Meeting
256
257
© Best servis Ústí nad Labem
258
Download

SBORNÍK PŘEDNÁŠEK květen 2013