Molekularna biologija
prokariota
II
Molekularne osnove procesa:
Mehanizama reparacije oštećenja na molekulu
DNK kod prokariota
Reparacija DNK





Od vitalnog je značaja očuvati integritet nasledne informacije
→ kod svih organizama oštećenja na molekulu DNK se
moraju ukloniti (ostali molekuli se mogu zameniti, ponovo
sintetisati)
Raznovrsni reparacioni sistemi razvijeni tokom evolucije su
rezultat raznovsnosti oštećenja koja nastaju na DNK
Većina reparacionih mehanizama se oslanja na
komplementarnost baza i ne greši– error free
Mali broj mehanizama greši – error-prone
Održavanje života – strogi balans procesa reparacije DNK i
mutageneze – dinamička ravnoteža koja učestalost mutacija
održava na niskom nivou → balans očuvanja genetičke
informacije i evolutivnih procesa
Mehanizmi DNK reparacije kod prokariota
1. Direktna reverzija oštećenja
Dealkilacija - demetiluje O6-metilguanin
Fotoreaktivacija – monomerizuje pirimidinske dimere
2. Eksciziona reparacija
- Ekscizija (isecanje) baza (BER) ispravlja oštećene ili
neodgovarajuće baze u DNK (uracil, hipoksantin, alkilirane ili oksidovane
baze)
- Ekscizija (isecanje) nukleotida (NER) ispravlja velike strukturne
promene baza, pirimidinske dimere, prepoznaje distorziju heliksa
- „Mismatch repair“ (MMR) ispravlja greške u toku replikacije,
pogrešno sparene baze
3. Mehanizmi tolerancije oštećenja
- rekombinacija (rekombinaciona reparacija, ispravlja prekide u DNK)
- DNK Pol II zavisan „bypass“ (premošćivanje) oštećenja, inducibilan proces
- DNK Pol IV i Pol V zavisna replikacija oštećenja, translezijska sinteza,
inducibilna “error-prone” reparacija
Oštećenja DNK i reparacioni sistemi
Postoji delimično
preklapanje mehanizama:
 Isti reparacioni
mehanizam ispravlja
različite tipove oštećenja
 Veći broj reparacionih
sistema ispravlja jedan tip
(česta) oštećenja
Dealkilacija


Alkilirajući agensi (MMS, EMS, MNNG)
Enzim O6-metilguanin DNK metiltransferaza (produkt ada
gena) preuzima metil grupu sa O6-metilguanina, što ga
inaktivira (nije enzim po strogoj definiciji)
Neispravljen: G:C → A:T
Fotoreaktivacija




UV (254 nm) dovodi do dimerizacije
pirimidina (ciklobutanski pirimidinski
dimeri i 6-4 fotoprodukti)
Enzim fotoliaza sa kofaktorom FADH2
prepoznaje pirimidinski dimer i vezuje se
Kompleks apsorbuje kvant svetlosti (300500 nm) i koristi energiju za razdvajanje
dimera
Fotoliaza se oslobađa
Postoji kod mnogih bakterija, biljaka i
nekih životinja (ne postoji kod
placentalnih sisara)
Ekscizija baza - BER




Oksidativna deaminacija baza (C u
U), hidroksimetiluracil, 5metilcitozin, hipoksantin, 8-oxoG
Specifične DNK glikozilaze –
uklanjaju bazu, hidrolizuju Nglikozidnu vezu (nastaje AP mesto)
AP endonukleaze - raskidaju
fosfodiestarsku vezu koja se nalazi 5'
(najčešće) ili 3' od AP mesta
Nukleotidi uklonjeni egzonukleazom
se zamenjuju reparativnom sintezom
(DNK Pol I) i ligacijom
Ekscizija nukleotida NER






UvrABC endonukleaza + UvrD
helikaza
Prepoznavanje oštećenja (dimera) i
vezivanje proteinskog kompleksa
Dve incizije na oštećenom lancu (5' i
3' od mesta oštećenja)
Uklanjanje oligonukleotida (12 nt) sa
oštećenjem
Popunjavanje nastalog prekida DNK
polimerazom I i ligacija
„Transcription-coupled TC-NER”
(ispravka na transkripciono aktivnom
lancu) i globalna NER reparacija
(ispravka oštećenja na oba lanca)
Reparacija pogrešno sparenih baza - MMR










Editorska funkcija DNK polimeraze zakaže:
postojanje pogrešno sparenih baza (npr. A:C)
Najčešći razlog nastanka: tautomerija baza
Obe baze su ispravne, ali pogrešno sparene
→ mora postojati signal koji lanac treba
ispravljati: Metilacija GATC sekvenci Dam
metilazom (razlikovanje roditeljskog i
novosintetisanog lanca)
MutS protein prepoznaje pogrešno sparen
bazni par
MutH endonukleaza prepoznaje
hemimetilovanu GATC sekvencu
Formira se MutS/MutL/MutH kompleks
MutH endonukleaza iseca nemetilovanu
GATC sekvencu
Lanac se degraduje egzonukleazama (dužina
fragmenta i do 2000 nt)
DNK Pol III popunjava prekid
DNK ligaza povezuje lanac
Postreplikativna rekombinaciona reparacija
Mehanizam za toleranciju oštećenja:
 popunjavanje jednolančanih prekida u
novosintetisanom lancu (daughterstrand gaps - DSG)
RecA zavisan mehanizam za ispravku:
 jednolančanih prekida (single-strand
breaks – SSB i DSG)
 dvolančanih prekida (double-strand
breaks - DSB)
Translezijska sinteza - TLS





Inducibilni mehanizam uključen u
toleranciju oštećenja
Replicira lanac koji sadrži
oštećenje
Jedan je od niza odgovora ćelije
na oštećenje DNK (SOS odgovor)
Biološki smisao SOS odgovora je
povećanje kapaciteta reparacije i
preživljavanja
TSL povećava preživljavanje, ali i
genetičku varijabilnost
Model SOS indukcije kod E. coli






LexA represor sprečava
ekspresiju gena SOS regulona
Zaustavljanjem replikacije na
oštećenju formira se signal za
SOS indukciju (ssDNK).
RecA protein se vezuje za ssDNK
i aktivira se (RecA*)
RecA* ima koproteaznu ulogu,
pomaže autokatalitičku razgradnju
LexA represora
Povećava se ekspresija inhibitora
ćelijskih deoba i nekih proteina
koji učestvuju u NER i
rekombinacionoj reparaciji
Eksprimiraju se polB (Pol II),
dinB (Pol IV), i umuDC operon
(Pol V)







RecA* omogućava post-translacionu
obradu UmuD proteina u aktivnu
formu UmuD’
Kompleks UmuD’2C je DNK Pol V
koja vrši translezijsku sintezu
Pol V nema editorsku funkciju
(egzonukleaznu funkciju), ne može
da ukloni pogrešan nukleotid
Replizom (Pol III) se zaustavlja na
oštećenju
Zamena replizoma mutazomom (Pol
V)
Translezijska sinteza, ugrađivanje
nekomplementarnih nukleotida
naspram oštećenja
Ponovno uspostavljanje replikacije
Pol V TLS
Pol II i Pol IV reparativni mehanizmi
Pol II:
 ima editorsku funkciju
 omogućava nastavak
replikacije nekoliko minuta
posle njenog zaustavljanja
na oštećenju
 „replication restart“
mehanizmom “chickenfoot”
Pol IV
 nema editorsku funkciju –
reparacija error-prone
 replicira AP mesta i velike
adukte, npr. indukovane sa
derivatima B(a)P
 ne može da ugrađuje nukleotide
naspram pirimidinskih dimera
Pol II replication restart




Regresija replikativne viljuške
pomoću RecA + RecFOR
kompleksa
Pol II kopira neoštećeni
novosintetisani lanac –
struktura “chickenfoot”
RecG vraća replikativnu
viljušku na početnu poziciju
PriA omogućava nastavak
replikacije pomoću Pol III
Mutageneza
Nastanak i vrste mutanata
Izolovanje mutanata
Fenotipska i genotipska promenljivost
Fenotipska promenljivost – adaptacija na
uslove u kojima se jedinke nalaze, zahvata sve
jedinke u populaciji, ne nasleđuje se
 Genotipska promenljivost – promena u
genotipu, zahvata retke jedinke u populaciji i
nasleđuje se

Genetička varijabilnost
Postojanje genetičke varijabilnosti u populaciji je neophodno
za adaptaciju na izmenjene uslove sredine, opstanak i
evoluciju živih organizama.
Mehanizmi genotipske promenljivosti



Mutacije – promene u broju i redosledu nukleotida u
molekulu DNK
Rekombinacije – stvaranje nove kombinacije gena
prenosom dela genetičke informacije iz jedne ćelije u drugu
(horizontalni transfer gena)
Transpozicije – premeštanje jednog ili više gena sa jednog
mesta na drugo ili sa jednog replikona na drugi (sa
plazmida na hromozom ili obrnuto, sa jednog palzmida na
drugi isl.)
Mutacije



Promene u broju ili redosledu nukleotida u
molekulu DNK
Mutacije su redak i slučajan događaj i uglavnom
imaju negativan efekat
Mali broj mutacija omogućava evolutivne
promene
Tipovi mutacija






Tačkaste mutacije - zamene baznog para (tranzicije
ili transverzije) i promene okvira čitanja
Delecije - gubitak baznih parova
Adicije - dodavanje baznih parova
Insercije - umetanje većeg broja baznih parova
Inverzije - isecanje dela DNK i umetanje u obrnutom
smeru
Duplikacije - oblik adicija kod kojih su dodati
nizovi baza identični
Zamene baznog para - efekat na strukturu proteina
Vanfazne - frameshift mutacije
Upravne mutacije i reverzije
Upravne (forward) mutacije – u divljem soju, gubitak funkcije
Reverzije (povratne mutacije) – nove mutacije koje uspostavljaju
fenotip divljeg soja


Prave reverzije – nova mutacija je na istom mestu gde i prethodna, wt stanje
se uspostavlja i na genotipskom nivou
Supresije – nova mutacija je na drugom mestu ali poništava efekat prethodne,
na fenotipskom nivou se uspostavlja wt stanje
 Intragenske supresije – nova mutacija u istom genu, npr. frameshift
 Intergenske supresije – nova mutacija u drugom genu, npr. supresija
nonsense mutacije pomoću supresorskih tRNK
Spontane mutacije



Greške u replikaciji izazvane tautomerijom baza
“Proklizavanje” DNK Pol III na monotonim nizovima nukleotida
Replikacija ili „error prone“ reparacija endogenih oštećenja DNK
(oksidativna oštećenja, depurinacija, itd)

Glavni mehanizmi u ćeliji koji kontrolišu nivo spontanih mutacija:
Selekcija baza i editorska funkcija DNK Pol III
Reparacija pogrešno sparenih baza – MMR

Redak događaj, u proseku 10-10 nukleotida

Indukovane mutacije





Izazvane brojnim hemijskim, fizičkim i biološkim agensima,
mutagenima, koji mogu izazvati različita oštećenja u
molekulu DNK i povećati stopu mutacija
Glavni mehanizmi nastanka indukovanih mutacija:
Zamena purinske ili pirimidinske baze (bazni analozi)
Hemijska promena baze koja izaziva pogrešno sparivanje
(alkilacija, oksidativna deaminacija)
Interkalacija (EtBr, akridin oranž)
Hemijska promena baze koja izaziva potpuni gubitak
sposobnosti sparivanja (pirimidinski dimeri, adukti)
Mutagen
Dejstvo
Tip mutacija
Bazni analozi
5-Bromouracil
2-aminopurin
Analog T, sparuje se sa G
Analog A, sparuje se sa C
AT→GC, GC →AT
AT→GC, GC →AT
Modifikacija baza
Azotasta kiselina HNO2
Hidroksilamin NH20H
Deaminacija A u H i C u U
Reaguje sa C
AT→GC i GC →AT
GC →AT
Alkilirajući i cross
linking agensi
Metiluje G (G me-T)
Metil metan sulfonat MMS Povezuju lance u dsDNK
Mitomicin C
Interkalirajući agensi
Akridini
Etidijum bromid EtBr
Zračenja
Ultravioletno UV-254 nm
Jonizujuća (X-)
GC →AT
Tačakste, delecije
Ubacuju se između 2 bp
Male insercije i delecije
Formiranje dimera
pirimidina
Slobodni radikali, prekidi
lanaca
U toku ispravke može doći
do tačkastih mutacija ili
delecija
Fiksacija mutacija




Proces od nastanka oštećenja do
nastanka mutacije
Potrebne dve replikacije za
fiksaciju mutacija
U prvoj replikaciji naspram
oštećenja dolazi do ugrađivanja
nekomplementarnog nukleotida
u novi lanac DNK
U drugoj replikaciji dolazi do
kopiranja templeta sa pogrešnim
nukleotidom i stvara se mutirana
DNK
Posledice delovanja mutagena

Ispravka oštećenja reparacionim mehanizmima koji ne greše
Replikacija oštećenja ili ispravka oštećenja reparacionim
mehanizmima koji greše - indukcija mutacija
Smrt ćelije

Manje od 1/1000 oštećenja će biti fiksirano u mutaciju


Mutanti
Jedinke kod kojih je došlo do mutacija i
koje se fenotipski razlikuju od roditelja





Mutanti u morfologiji
Mutanti u ishrani (auksotrofi)
Mutanti rezistentni na antibiotike
Mutanti u reparaciji DNK
Uslovni mutanti
Izolovanje mutanata

U morfologiji
Zasejavanjem na bogate podloge i posmatranjem morfologije kolonija
pr. Serratia marcescens (crvene kolonije nemutirane, mali br. belih
kolonija – mutanti)

Rezistentnih na antibiotike
Zasejavanjem na podloge sa antibioticima (selektivne podloge –
selektivno rastu samo bakterije otporne na dati antibiotik)
Izolovanje auksotrofnih mutanata tehnikom kopiranja
bogata podloga
mimimalna podloga
Izolovanje mutanata

U reparaciji DNK (primer: mutanti sa nefunkcionalnim NER mehanizmom)
„Replica plating“ tehniku koristimo da zasejemo bakterije na dve bogate
podloge, prvu tretiramo mutagenom (npr. ozračimo UV zracima), druga je
netretirana kontrola. One kolonije koje rastu samo na netretiranoj podlozi su
mutanti u reparaciji.

Uslovnih mutanata (primer: mutanti osetljivi na temperaturu)
U permisivnim uslovima mutacija se ne ispoljava na fenotipskom nivou, u
nepermisivnim se ispoljava. Replica plating tehniku koristimo da zasejemo
bakterije na dve bogate podloge, prvu gajimo u nepermisivnim uslovima,
drugu u permisivnim. One kolonije koje rastu samo u permisivnim uslovima su
uslovni mutanti.
Fenotip
Vrsta promene
Detekcija mutanata
Auksotrofi
Odsustvo biosintetičkih puteva
Ne rastu na MM
Osetljivi na
temperaturu
Promene u proteinima koji se
inaktiviraju na određenoj temp.
Ne rastu na temperaturama na
kojima roditelji rastu
Rezistentni na
antibiotike
Izmenjena propustljivost, izmenjeno
mesto vezivanja ili razgradnja
antibiotika
Rastu na antibiotskim
podlogama
Bez kapsule ili LPS
Odsustvo enzima za sintezu kapsule ili
LPS
Male, grube (rough) i
nepravilne kolonije
Gubitak flagela,
nepokretni
Odsustvo enzima za sintezu flagelina
Kompaktne kolonije
Gubitak pigmenta
Odsustvo enzima za sintezu pigmenata
Kolonije su drukčije boje ili
bezbojne
Ne fermentišu šećere
Odsustvo enzima za razgradnju šećera
Ne menaju pH podloge i boju
indikatora
Osetljivi na
mutagene
Odsustvo enzima za reparaciju DNK
Ne rastu na podlogama koje
sadrže mutagen
Rezistentni na viruse
Gubitak receptora za viruse
Rastu u prisustvu virusa
Testovi za detekciju mutagena




Ames test, test na bakteriji S. typhimurium
Najpoznatiji, rutinski se koristi za ispitivanje mutagenog efekta
različitih supstanci
Osnovni princip: Bakterije gajimo u prisustvu i odsustvu test
supstance u uslovima koji dozvoljavaju uočavanje i brojanje
mutanata. Upoređivanjem broja mutanata zaključujemo da li je
test supstanca mutagena (i koliko je mutagena) ili nije.
Realizacija osnovnog principa:
Sojevi su mutanti u histidinskom operonu i ne mogu da rastu na podlozi bez
histidina
 Pratimo reverzije, reverznim mutacijama nastaju ćelije koje mogu da
sintetišu histidin
 Gajenjem bakterija na podlogama bez histidina (minimalna podloga)
selektujemo mutante
 Upoređujemo broj mutanata koji se formira bez tretmana i nakon tretmana
test supstancom

Mutagen
His–
bakterije
Medijum
sa
histidinom
Reverzne mutacije
Ne rastu
na MM
His+
bakterije
MM
Ekstrahromozomalni
genetički elementi
Plazmidi i epizomi
Insercione sekvence i transpozoni
Invertibilni genetički elementi
Plazmidi







Mali DNK molekuli van hromozoma, najčešće cirkularni (izuzetak su linearni
plazmidi Streptomyces i Borrelia)
Ako imaju sposobnost integracije u hromozom – epizomi
Imaju sopstveni ori, autonomno se repliciraju i regulišu broj kopija u ćeliji (F
faktor – br kopija 1-2, ColE1 – br kopija oko 50, postoje plazmidi sa ~100
kopija po ćeliji)
Mehanizam replikacije: cirkularni molekuli (θ replikacija, mehanizam
kotrljajućeg obruča); linearni molekuli (za 5’ kraj svakog lanca se vezuje
proteinski prajmer, jednolančani krajevi vezani kovalentno u strukturu
ukosnice – zaštita od ćelijskih nukleaza i obezbeđivanje prajmera)
Enzimi uključeni u relikaciju su kodirani sa hromozoma, ali plazmid
obezbeđuje informaciju za inicijaciju replikacije i pravilnu distribuciju kopija
u kćerke ćelije)
Nose genetičke informacije neesencijalne za domaćina (domaćin može da
preživi i bez plazmida, ne kodiraju esencijalne životne funkcije)
Povećavaju kompetitivnost, u specifičnim uslovima daju domaćinu selektivnu
prednost nad bakterijama koje ih ne poseduju (bolje preživljavanje)
Osobine bakterija kodirane plazmidima






Proizvodnja antibiotika (Streptomyces)
Proizvodnja bakteriocina (E.coli, Bacillus)
Konjugacija (E.coli, Staphylococcus, Streptococcus)
Rezistencija na antibiotike i teške metale (enterične
bakterije, Neisseria, Staphylococcus, Pseudomonas)
Specifični katabolički putevi (Clostridium, Rhizobium,
Pseudomonas – degradacija oktana, naftalena ili kamfora)
Faktori patogenosti (Salmonella, Staphylococcus,
Streptococcus, Agrobacterium, enteropatogene E.coli,)
Podela plazmida





Prema veličini, broju kopija, sposobnosti za samostalni
transfer konjugacijom i mehanizmima replikacije
Konjugativni (veliki, mali broj kopija, repliciraju se sinhrono
sa hromozomom domaćina, imaju mehanizme za distribuciju u
ćerke ćelije)
Nekonjugativni plazmidi (mali, veliki broj kopija, repliciraju
se nezavisno od replikacije hromoza)
Horizontalan transfer plazmida (prenos kroz populaciju sa
ćelije na ćeliju: konjugacijom, nekonjugativni – transdukcijom
ili transformacijom, ili ih konjugativni mobilišu
Svrstavaju se u inkompatibilne grupe u zavisnosti od gena
uključenih u kontrolu replikacije (inc geni). Dva plazmida iste
inkompatibilne grupe su u kompeticiji kada se nađu u istoj
ćeliji domaćinu – ne mogu opstati zajedno, nakon određenog
broja deoba jedan od njih se gubi.
F plazmid
Konjugacija kod E. coli
R plazmidi



R100 plazmid - 89,3 kbp
Rezistencija na streptomicin,
spektinomicin, fusidinsku
kiselinu, tetraciklin,
hloramfenikol, sulfonamide i
soli žive
Konjugativni plazmid
enterobakterija
Ti plazmid iz Agrobacteruim tumefaciens




Nosi T-DNK koja se unosi u
biljnu ćeliju, odlazi u nukleus i
stabilno se ugrađuje u
hromozome
T-DNK nosi funkcionalne
biljne promotore odgovorne za
pojačanu sintezu biljnih
hormona, uzrokuje tumore
stabla
Transformisano tkivo sintetiše
opine, derivate arginina koji
bakteriji služe u ishrani
Na Ti plazmidu su geni za
katabolizam opina
Transpozoni
Genetički elementi koji se
premeštaju sa jednog
mesta na hromozomu na
drugo procesom
transpozicije - mesto
specifičnom
rekombinacijom (sitespecific recombination)
IS sekvence

Najjednostavnije građeni transpozoni, dužine 7002500 bp, kodiraju samo enzime transpozaze koji
katalizuju transpoziciju, na krajevima su invertovani
ponovci
Pravi transpozoni



Prosti: slične građe kao IS sekvence, ali pored gena
za transpozazu nose i gene za faktore virulencije ili
rezistenciju na antibiotike (Tn3, Tn7, itd)
Složeni: ograničeni IS sekvencama, a u centralnom
delu su geni za faktore virulencije ili rezistenciju na
antibiotike (Tn5, Tn10)
Najsloženiji transpozon je Mu (mju) bakteriofag.
Mehanizmi transpozicije

Konzervativna transpozicija
Isecanje transpozona sa
prvobitne pozicije i ugradnja
na novom mestu
(transpozon uklonjen sa
prvobitne pozicije)
Mehanizmi transpozicije

Replikativna transpozicija
Pojava nove kopije
transpozona na drugom
mestu
(transpozon postoji i na
prvobitnoj poziciji)
Privremenu strukturu –
kointegrat razdvaja enzim
resolvaza
Efekti transpozicije

Insercione mutacije

Veliki genetički rearanžmani (delecije, inverzije)
Promene u ekspresiji gena

Invertibilni genetički elementi; fenomen fazne varijacije
kod S. typhimurium
Invertovani ponovci oko hin gena (kodira Hn protein – enzim invertazu)
Fazna varijacija – reverzibilne promene u strukturi flagela
Biološki smisao – zaštita od odbrambenih mehanizama domaćina (S.
typhimurium je patogena)
Download

reparacija DNK i mutageneza 2015