Oddělení Molekulární embryologie
Ústavu experimentální medicíny, Brno
Biologický ústav Lékařské fakulty
Masarykovy Univerzity, Brno
Genomová nestabilita kmenových
buněk:
Od stárnoucích zárodečných
k embryonálním kmenovým buňkám
Vladimír Rotrekl & Petr Dvořák & Aleš Hampl
Izolace embryonálních kmenových buněk
Cowan
New England Journal of Medicine, 2004
• Léčba degenerativních onemocnění
• Regenerativní medicína
• Podpůrná léčba (chemoterapie atd.)
• Modelový systém ve farmakologii
ALE!...
Ohrožení genomové stability hESCs
při dlouhodobé kultivaci in vitro
Linie
Délka
pasáže
CCTL-14
6.2
5.1
3.8
4.7
3.7
5.0
4.1
3.8
3.6
Pasáž
Karyotyp
16
25
61
76
100
139
160
196
216
315
46, XX
46, XX
47, XX, +na
46, XX mix 47, XX, +der.(12)t(17;12)
47, XX, +der.12
47, XX, +der.12
47, XX, +der.12
47, XX, +der.12
47, XX, +der.12
47, XX, +der.12, der.21
46, XX, -?, +der.12, +der.21
Nestabilní genom
Nefunkční
oprava DNA
Zkracování
telomer
Neúčinná kontrola
v kontrolním bodě
(checkpoint)
Vysoká aktivita telomerázy je nezávislá
na délce kultivace
hESC
1000
900
800
600
500
400
Diferencované b.
300
200
100
M
EF
Au
to
lo
g
HF
F
EB
36
7
EB
93
EB
43
36
6
36
5
95
93
91
0
32
Telomerase Units
700
Nestabilní genom
Nefunkční
oprava DNA
Zkracování
telomer
Neúčinná kontrola
v kontrolním bodě
(checkpoint)
hESC akumulují p53 po ozáření UVC
Nízká pasáž hESC
Vysoká pasáž hESC
15D dif. hESC
0
0.5 1 1.5
J/m2 UVC
5
p53
Nízká pasáž
Vysoká pasáž
p53
Nízká pasáž
Vysoká pasáž
Lokalizace P53 indukovaná UVC
odpovádá somatickým buňkám
Akumulace p53 v jádře
Nuclei-DAPI
p53
Kontrola bez ozáření
Nuclei-DAPI
p53
3 hod po 5 J/m2 UVC
Funkce p53 není ovlivněna mutací v hESC
(2 hESC linie; nízká a vysoká pasáž)
Stanoveno funkční analýzou v kvasinkách (FASAY)
P53 v hESC aktivuje cílové
molekuly bez ohledu na pasáž
p53
MDM2
p53
degradation
Regulation
of p53
stability
Transcriptional activation
Growth arrest
DNA repair
p21
mRNA:
14-3-3
BAX
BCL2
caspases
GADD45
GADD45
MDM2
p21
400
400
331
800
300
246
100
74
713
400
200
100
98
0
0
P53
P322
347
314
300
632
600
Control
UV
200
100
Apoptosis
Control
UV
Control
200
100
100
95
0
P53
P322
P53
P322
UV
Nestabilní genom
Nefunkční
oprava DNA
Zkracování
telomer
Neúčinná kontrola
v kontrolním bodě
(checkpoint)
Odhadnuté dávky poškození DNA
D am age
A m ount/cell/day
SSB
20,000-40,000
apurinic sites
10,000-50.000 *
deam ination
100-300
oxidative base
dam age (total)
N 7 m eG
10,000
N 3 m eA
600
O 6 m eG
10-30
4,000
Recent findings** up to 50.000 500.000 AP sites per cell per day
* Lindahl et al. 1972** Nakamura et al. 1999
BER v zárodečných buňkách slábne
s rostoucím věkem
MGC G:U & OxoG
fmol/min/ug
1.2
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
MGC
1
0.8
G:U
0.6
OxoG:C
0.4
0.2
0
2 mont h
G:U
Apnat
2 month 12 month 24 month
OxoG:C
12 mont h
24 mont h
BER
proteiny v
jaderných
extraktech
zárodečných
buněk
Intano, MCB(2002) 22:2410
Aktivita BER u hESC při
dlouhodobé kultivaci
5’
3’
BER in hESC
0.001
5’
3’
časná
Střední Pozdní
DNA
glycosylase
APE1/Ref1
0.0009
5’
3’
BER [fmol.min-1.ug-1]
0.0008
dNTP
0.0007
0.0006
Polb/XRCC1
0.0005
0.0004
5’
3’
0.0003
0.0002
XRCC1/Lig3
0.0001
0
34
časná
73
Střední
Passage
149
Pozdní
5’
3’
Control
DAPI
APE1
Merged
p28
p60
p112
p261
Nestabilní genom
Nefunkční
oprava DNA
Zkracování
telomer
Neúčinná kontrola
v kontrolním bodě
(checkpoint)
Aktivita spojování konců je v hESC
vysoká bez ohledu na pasáž
1.1
1
0.8
0.7
0.6
0.5
p1
46
p1
49
p1
50
p2
90
no
pr
o
Li t
ga
sa
p7
1
p3
4
0.4
p3
3
Ligase U
0.9
Proposed Model
Selhání BER
Akumulace
oxidatívního
poškození
Akumulace jedno a
dvouřetězcových
zlomů
Bezchybná Náhodné
oprava
Spojování
konců
NHEJ
BER
1
Xsome
Clinic
2
Shrnutí
•
S rostoucí pasáží klesá stabilita genomu hESC
•
Vysoká telomerázová aktivita bez ohledu na pasáž
•
P53 kontrolní dráha pracuje korektně bez ohledu na pasáž
•
Vysoká aktivita NHEJ bez ohledu na pasáž
•
Aktivita BER klesá s rostoucí pasáží
•
APE1 je korektně lokalizována v jádře
pokles koncentrace APE1 stojí za poklesem BER
Many thanks to…
Petr Dvorak & Ales Hampl
Tomas Barta
Josef Jaros
Vitezslav Kriz
Zuzana Holubcova
Martina Vodinska
Klara Koudelkova
Iveta Peterkova
Jiri Fajkus
Zuzana Kunicka
Vendula Vernerova
Vladimir Vinarsky
Jan Verner
Sarka Pospisilova
Money thanks to:
• EU-6FP, Platforms for biomedical discovery with human
• ES cells – ESTOOLS, grant number 018739
• Centre for Chemical Genetics, Ministry of Education,
• Youth and Sports, grant number LC06077
Konec
… elixír mládí až příště...
P53 kontrolní bod funguje
Nedostatek APE1
Časná pasáž
Nízká aktivita BER
Telomerase is OK
Centrozomální defekty
(Aleš Hampl a Zuzana
Holubcova)
Vysoká pasáž
NEHJ is high
Kumulace
chromozomalnich
abnormalit /
kumulace SNIP
Short Patch BER assay (G:U lesion)
FL-5’
3’
U*
G
[α-33P]-dCTP
In vitro BER assay Using Purified Nuclear Extract
Uracil + Deoxyribose
0
FL-5’
3’
5
10
15 20
25 µg of nuclear extract
C*
G
Autoradiogram
* Oligonucleotides
carrying different
lesions were used in
this study.
Fluorogram
Non….NHEJ in hESC
• Nuclear extract from hESC
nuclear
extract
• End labeled linear DNA
start
• ATP dependent
trimer
dimer
monomer
+ + +
-
ATP
Chromosome Clinic
Chromosome Clinic
Download

Genomová nestabilita kmenových buněk