İlaç bulma ve geliştirmede
metabolomik
Dr. H. Asuman Özkara
Hacettepe üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı
Bir ilacın yeni bir ürün olarak piyasaya çıkması
• 10-15 yıl ve
• 350 milyon dolar
Bu problem “inovasyon boşluğu” olarak tanımlanmıştır
ve ilaç keşfinde harcanan zamanı kısaltacak pahalı
olmayan teknolojilere yatırımı gerektirmiştir.
Genomik, transkriptomik ve metabolomik
teknolojileri bu teknolojilerdendir.
NIH’in metabolomiks teknoloji geliştirme
projeleri
• 70 milyon dolar- 5 yıldan uzun bir süre için
• Desteklenen projelerden bazıları:
“Fluorescent probes for hydrophobic
metabolites”
Hücreiçi ve hücredışı ortamda proteine bağlı
olmayan serbest yağ asitlerinin
konsantrasyonunu belirlemek için yeni metot
geliştirme
“Glycolipid metabolism in single cells”
İki farklı glikolipit metabolit yolunda farklı
flöresan işaretli substratlarla tek nörondaki
glikolipit metabolizmasını ortaya çıkararak
nöroaktif ajanların belirlenmesini ve ilaç
hedefi olarak kullanılmasını sağlayacak.
“Technologies for cellular Neurometabolomics”
tek örnekleme protokolü, mikro akışkanlı
örnek birimi elektroforez ayırımı ardından
flöresan ve MS ayırım ve uygun metabolitlerin
nanolitre hacimli kapillerler içine yakalanarak,
nanolitre hacimde NMR spektroskopik
karakterizasyonu
“Biological Oscilloscopes Spatio-Temporal
Metabolomics”
Metabolik akışkanlıkların real-time in vivo
spatiotemporal ölçülmesi
Real-time flöresan mikroskopi ve flöresan
nanosensör proteinlerle birlikte sinyal
iletimindeki değişiklikler ve yeni sinyal iletim
yolakları bulmayı hedefliyor.
İnsan Metabolom Projesi (HMP)
• 7.5 milyon $ Genome Canada İnovasyon Projesi
Ocak 2005-2007
• idrar, BOS, plazma ve lökositlerde bulunan tüm
metabolitleri tanımlamak ve normal-anormal değer
aralığını belirlemek
• Bu verilerin serbestçe elektronik ortamda elde
edilebilir olmasını sağlamak (HMDB)
• Tanımlanan bileşiklere halkın ulaşmasını sağlamak
(HML)
www.hmdb.ca
İnsan Metabolom Projesi (HMP)
• Amacı: Metabolomiki hızlandırmak
• Hedefi:
– Hastalıkların tanısını
– Hastalıkların seyri ve erken tanısını
– Hastalıkların izlemini
– İlaç metabolizması ve toksikolojiyi
– Metabolom ve genom arasındaki bağlantıyı
– Metabolomik için software geliştirmeyi daha
iyileştirmektir.
HMP sonuçları
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Yürütücü: Dr. David Wishart, Uni Alberta
Proje süresi: 2004-2007
Projede çalışan bilim adamı sayısı 53
Metabolit sayısı 2500
İlaç sayısı 1500
Besin bileşeni sayısı 3900
HML deki bileşik sayısı 778
Kitap basılsa sayfa sayısı 30.000
HMDB de her metabolit için en az 90 sayfa
HUSERMET projesi
human serum metabolome in health and
disease
• University of Manchester
• BBSRC : UK Biotechnology and Biological
Sciences and Research Council
• MRC : Medical research Council
• AstraZeneca
• GlaxoSmithKline
www.metabolomics.co.uk
HUSERMET projesi
• GC-MS, LC-MS
• İnsan serum metabolomunun normal
değerlerini belirlemek
• Hastalıkların tanı ve izleminde kullanılacak
biyobelirteçleri belirlemek
• İlaçların etkinliğini saptamak
• Yeni metabolitler tanımlamak
İlaç geliştirme basamakları
Hedef seçimi
Genomik, proteomik, metabolomik
Yapı analizi
Kimyasal madde taraması
Modelleme
8000 bileşikten 8’i klinik araştırmaya kadar
gidebiliyor, biri kullanıma giriyor
Küçük moleküllerin şansı daha büyük
Toplam harcama 1 milyar USD
ARGE harcamaları ↑
Yeni bulunan molekül sayısı↓
Zor hedefler → çok bileşenli sistemler
Nadir, ihmal edilmiş hastalıklar
Veri tabanları:
CREDO → protein-ligand etkileşimi
PICCOLO, TIMBAL → protein-protein
Orchestrar
FUGUE
Rapper
•
Hedef proteinin tanımlanması
•
Hedef proteinin hücrelerden klonlama,
protein ekspresyonu veya saflaştırma
yoluyla elde edilmesi ve kristalizasyonu
•
Hedef proteinin üç boyutlu yapısının
belirlenmesi
•
Olası inhibitörlerin bilgisayar taraması ile
bulunması ve hedef protein ile etkileşiminin
modelleme ile gösterilmesi
•
Hedef protein ve inhibitörün birlikte
kristalize edilerek yapısının belirlenmesi
•
Modelleme yoluyla daha iyi bir inhibitör
aranması ve sentezlenmesi
•
Optimum bileşiğin elde edilmesi ve hücre
kültüründe denenmesi
İlaç geliştirme basamakları
•
•
•
•
•
•
ilaç adayı moleküllerin tanımlanması,
sentezi,
karakterizasyonu,
taraması ve
tedavi etkinliğinin ölçümü aşamalarından oluşur.
Eğer bu aşamalarda ilaç adayı molekül, değerli
bulunursa klinik çalışmalara öncül ilaç geliştirme
işlemlerine başlanır.
• İlaç keşfi olayında ilk basamak hedef tanımlama
basamağıdır ve bu basamak en önemli, en karmaşık
basamaktır. Bunun için yıllar gerekir. Çünkü, tanımlanan
ilaç hedefi, bir sonraki basamağa geçebilmek için bazı
kriterleri yerine getirmek zorundadır.
Bunlar,
• hastalık durumunda hedefin aktivitesinin olması
• hedefin patojenin veya patolojinin büyüme ve
canlılığında esas molekül olmasıdır.
Bir kere potansiyel bir hedef belirlenirse ligandları
taramak gerekir.
İlaç keşfi ve geliştirmesinde metabolomik
çalışmalardan 2 şekilde faydalanılır.
1- Metabolit profili ve konsantrasyonlarının
belirlenmesi, metabolik havuzun incelenmesi
2- Metabolit akışının belirlenmesi
• Bu 2 yol ilaç hedefi molekülün
belirlenmesinde, aday ilaç molekülünün
etkisinin analizinde ve aday ilaç molekülünün
toksisitesinin değerlendirilmesinde
kullanılmaktadır.
• İlaç geliştirmede biyobelirteç tanımlamak için LC/MS ve GC/MS
• Metabolomiğin alt grubu olan lipidomik profili ilaç keşfi ve hedef
değerlendirmesinde güçlü bir yöntemdir.
• Çünkü, kardiyovasküler hastalıklar, şişmanlık, diyabet gibi pekçok sık
görülen hastalıkta lipit metabolizmasında değişiklikler olur.
• İlaç geliştirme sırasında lipomik profil
– metabolik yollarda ilaçların etkisini değerlendirmede kullanılabilir ve
faydalı ilaç adaylarını tanımlar.
– metabolik yolları hasara uğratarak yan etki oluşturan ilaçları da elimine
eder.
– aynı zamanda ilaç bileşiklerinin toksik etkilerini tanımlama potansiyeli
vardır. Toksinler serum ve dokularda lipit seviyelerini değiştirebildikleri
için, bu değişikliklerin ölçülmesi ilaç geliştirmenin erken aşamasında
potansiyel tehlikeleri açığa çıkarabilecektir
İlaç hedeflerinin bulunmasında
metabolomik
• İnflamatuar ve otoimmun kolitlerde, yeni ilaç hedefi molekül
belirlemek amacı ile,
dekstran sülfat sodium (DSS) ile indüklenen akut kolitin
oluşturulduğu bir fare modeli oluşturuldu.
• Bu farelerin serumlarında LC-MS ile yapılan metabolit profil
çalışmaları ile stearoilfosfatidilkolinin arttığı,
oleillizofosfatidilkolinin azaldığı gösterildi.
Bu karaciğerde ekspresse olan stearoil KoA desaturaz 1’in (scd1) DSS
la inhibisyonunun tanımlanmasına yolaçtı.
• Scd1 enzimi olmayan farenin oleik asitle beslenirken normal fareye
göre DSS uygulamasına daha duyarlı olduğu, scd1 enziminin
kurtarılması ile DSS ile indüklenen fenotipin hafiflediği gösterildi.
• Bu çalışmanın sonucu olarak, scd1’in inflamatuar hastalıkların
tedavisi için potansiyel bir hedef olabileceği sonucuna varıldı .
• Metabolik akış çalışmaları ile virusla enfekte olmuş hücrede ilaç
hedefi olabilecek moleküller tanımlanmıştır.
• Bir çalışmada insan sitomegalovirusu ile infekte edilmiş memeli
hücrelerinde işaretli glukoz ve glutamin ile metabolik akış çalışması
yapıldı.
• Araştırıcılar metabolit akış izlemi ile trikarboksilik asit döngüsüne
doğru akış olduğunu, yağ asiti sentezinden çıkış olduğunu
gösterdiler.
• Bunun üzerine yağ asiti biyosentez enzimi olan asetil KoA
karboksilazın 5-tetradesikloksi-2-furoik asit ile inhibisyonunun
viral replikasyonu inhibe ettiği aynı araştırıcılar tarafından gösterildi.
• Bu da viral replikasyonu inhibe etmek için tamamen yeni bir
potansiyel ilaç hedefine yönlenmeyi sağladı.
• Bazı çalışmalarda hücre kültüründe viral
infeksiyonundan sonra metabolom analizi yapıldı.
• HeLa hücrelerinin kızamık virusu ile, Drosophila
hücrelerinin flock ev virüsü ile infekte edilmesinin
ardından artan ve azalan 200 protein tanımlandı . Buna
ek olarak virusla indüklenen değişikliklerin görüldüğü
30 unda, 1000 özel metabolit belirlendi.
• Bir başka çalışmada RD insan hücre hatlarında
echovirus 11 infeksiyonunun etkisi NMR ile gösterildi.
Fosfokolin, üridin, şekerler, glutamin, glisin infekte
hücrelerde artmış bulundu.
• Özel bir tip maymun olan makagların BOS ları
Simian virusla enfeksiyondan önce ve sonra
metabolomik analizle izlendi ve
• enfeksiyonla indüklenen ensefalitte karnitin,
açilkarnitinler, yağ asitleri ve fosfolipit
moleküllerinin arttığı gösterildi .
• Bu metabolitler infeksiyonla beyinde
nöroAIDS’e neden olan bazı özel
fosfolipazların arttığını gösterdi.
Bu çalışmalar metabolomik ve metabolomik akış
çalışmalarının antiviral tedavi için yeni ilaç hedefi
belirlemede kullanılabileceğini göstermiştir.
Metabolik akış çalışmaları
• Meme kanseri modeli olan MCF10 hücre
sisteminde aynı genetik özelliğe sahip hücrelerde
transformasyon, tümör oluşumu ve metastaz
metabolomik ile çalışıldı. Bu hücrelere işaretli
glukoz verilerek metabolik akış çalışmaları yapıldı.
• Transformasyon sırasında ve meme tümor hücre
gelişiminin tüm önemli basamaklarında glisinin de
novo sentezinin arttığı görüldü.
Breast Cancer Res Treat (2008) 110:297–307
Breast Cancer Res Treat (2008) 110:297–307
Breast Cancer Res Treat (2008) 110:297–307
Breast Cancer Res Treat (2008) 110:297–307
Breast Cancer Res Treat (2008) 110:297–307
Metabolik akış çalışmaları
• Tümörigenezisle ilişkili çeşitli metabolitlerin
varlığı, normal ve kanser hücre hatlarını
karşılaştıran işaretli glukozun kullanıldığı bir
metabolik akış analizi çalışması ile belirlendi.
İlaç etkisinin metabolomik ile analizi
• Erken keşif çalışmalarında aday ilaç etkisi ya da hedef onaylanması
hakkında hücre sistemleri kullanılır. Hücre sistemleri metabolik akış
değerlendirmesine çok uygundurlar. Buna örnek olarak kanser
hücrelerinde de novo nükleik asit sentezi ile ilişkili değişik yolların SIDMAP
(stable isotope dynamic metabolic profiling) çalışması verilebilir.
• Kanser hücrelerinde glukoz metabolizması artmıştır. D-glukoz kullanılarak
yapılan metabolik profil izleme çalışması ile değişik kanser tiplerinde
glukoz karbonunu izleyerek farklı de novo nükleik asit sentezlerini
göstermek mümkün olmuştur.
• Apoptoza duyarlı hücre hatlarında ör; tiamin transport etmeyen insan
fibroblastları ya da pankreas adenokanser hücrelerinde pentoz fosfat
yolunun esas olarak oksidatif olmayan dalı kullanılır.
• Öte yandan apoptozise dirençli hücre hatları; ör; inflamatuar meme
kanseri hücre hatları esas olarak oksidatif dalı kullanır. Oksidatif yolu tercih
eden apoptoza dirençli hücreler yağ asiti sentezini ve desaturasyonu
NADPH varlığı nedeni ile fazla miktarda çalıştıracaklardır.
BCR-ABL+ lösemi hücrelerinde imatinib mesilatın
(Gleevec) etki mekanizmasının SIDMAP araştırması
• BCR-ABL gen ürünü bir tirozin kinazdır ve glukoz alımının artışına
neden olur. Glukoz alımı ile hekzokinaz aktivitesi ve oksidatif pentoz
fosfat yolu uyarılır. Gleevec de novo nükleik asit sentezini azaltarak
bu olayı belirgin şekilde inhibe eder.
• SIDMAP ile Gleevec direncinin mekanizması gösterildi. Gleevec
direnci gelişen hücreler, ilaç tarafından inhibe edilmeyen
nonoksidatif pentoz fosfat yolunun fonksiyonel kapasitesini artırarak
ilacı etkisiz kılar. Gleevec tedavisi sırasında perifer kan hücrelerinin
in vivo metabolit profilleri yapılır. Böylece Gleevec tedavisine erken
direnç SİDMAP tarafından nonoksidatif pentoz metabolizmasının
artışının gösterilmesi ile erken dönemde farkedilebilir (15, 16).
SİDMAP yaklaşımı karaciğer hücre kültüründe ve ilaç adaylarının
metabolik düzenlemeler üzerine etkilerini göstermede başarılıdır ve
daha sık kullanılmalıdır (17).
BCR-ABL tirozin kinazın inhibitörü
Apoptoza duyarlı hücreler PFY
nun oksidatif olmayan kısmını
Apoptoza dirençli hücreler PFY
nun oksidatif kısmını
de novo nükleik asit sentezi
Gleevec direnç mekanizması
Hayvan modeli sistemlerinde
metabolomik analiz
• Obezite, diyabet ve kardiyovasküler fonksiyon
bozukluğu gibi hastalıkların tedavisi amacıyla
ilaç geliştirmek için, hayvanlarda etkinlik ve
toksikoloji çalışmalarına ihtiyaç vardır.
• Hayvan modellerinde de metabolizmanın
düzenlenmesinin iyi anlaşılması etkinlik
değerlendirmesi için gereklidir. Bu
değerlendirmede kullanılan analizlerden biri
metabolomiğin lipidomik koludur.
• Geliştirilen bir lipidomik analiz ile kan ve doku
örneklerinde 500 den fazla lipit metabolitinin kantitatif
ölçümü sağlanabilmektedir. Bu çalışma aterosklerotik
gelişim için bir model oluşturan LDL reseptörü olmayan
farede metabolik düzenlemeyi araştırmak için
kullanılmıştır.
• Lipidomik platform hastalık ve ilaç etkilerinin
değerlendirmesinde yol göstericidir, önemli bilgiler
verir. Kolesterol hastalığın önemli bir öngörücüsü iken,
lipidomik profilleme ile elde edilen bilgi değişik ve farklı
yolların kolesterol sentezi, emilimi ve transportunu
düzenlemedeki katkılarını ayırtetmeyi kolaylaştırır.
• Farede lipidomik profilin elde edilmesi, serum kolesterol ester düzeylerine
katkı yapan iki yolun bağıl etkilerini tahmin etmemizi sağlamıştır.
• Birisi, lesitin kolesterol açil transferaz (LCAT) yoludur. Bu yol, tercihen çoklu
doymamış açil türlerini kullanır.
• İkincisi de, açil koenzim A kolesterol açil transferaz (ACAT) yoludur. Bu yol
doymuş ya da tekli doymamış açil türlerini kullanır.
• Batı tarzı bir beslenmenin uygulandığı fare tipinde, lipidomik profilleme ile
serum kolesterol ester artışı saptanmıştır. Ancak bu beslenme tarzı 12
haftadan fazla sürdürülürdüğünde ACAT ta artış ve LCAT ta azalma
görülmüştür. ACAT ve LCAT lipoprotein profilinin üzerinde birbirleri ile
çatışan etkiler gösterirler. ACAT ın daha aterojenik olduğu sonucuna
varılmıştır. Aynı çalışmada 2-fosfotidilkolin (PC) sentez yolu ile ilişkili olan
substratların özelliklerinin anlaşılması, bu farede PC düzeylerinin artması
CDP kolin yolundaki aktivenin artışı ile korelasyon gösterir.
İlaç geliştirmede Metabolomik
• İlaçla tetiklenen yan etkiler ilaçların klinik kullanımında
önemli dezavantajlardır. İlaç endüstrisi erken ilaç geliştirme
döneminde ilaçların potansiyel yan etkilerini önceden
saptayacak yöntemler aramaktadır. Bu nedenle
metabolomik, klinik öncesi ilaç geliştirme sırasında ilaç
toksisitelerini öngörme ve çalışma platformu olarak
geliştirilmiştir. Bir ilaç alınmaya başladıktan sonra idrar
metabolitleri organa özel toksisiteler için bir parmakizi
görevi görebilirler. İdrar kolay elde edilebilen, kolay analiz
edilebilen ve metabolizmaya özgü pekçok bilgi içeren bir
örnek olduğu için, invazif yöntemler kullanılarak elde
edilecek dokuların zahmet çekilerek yapılan patoloji
analizlerine ihtiyaç kalmaz (18, 19).
Sonuç
• FDA’in verilerine göre test edilen ilaç adaylarından %90’ı klinik
geliştirme sırasında doğru etkiyi oluşturmadığı için elenmektedir.
• Bunun en önemli nedeni hastalıkların mekanizmalarının tam olarak
bilinmemesi ve kişisel farklılıkların iyi analiz edilememesidir.
• Metabolomik henüz çok yeni bir analiz alanıdır. Ancak ilaç
adaylarının yeterli etki gösterememesi nedeni ile elenmesine neden
olan eksik bilgileri tamamlama yeteneğine sahiptir.
• Bu nedenle, ilaç bulma ve geliştirmede gelecek vaadeden, güçlü,
hızlı ve maliyeti düşüren bir teknolojidir.
• Aynı zamanda, metabolomik, bireysel farklılıkları analiz etme
yeteneği ile ilaç etkisinin değerlendirilmesi ve ilaç seçimi için kişisel
tıbbın gelişmesine en önemli katkıyı yapacak bilim alanıdır.
Download

İlaç geliştirme basamakları