Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2
YERLİ SIĞIR IRKLARINDA MYOSTATİN GENİNE AİT III. EKZON BÖLGESİNİN
NT 821(DEL11) POLİMORFİZMİ BAKIMINDAN KARŞILAŞTIRILMASI
Comparison with Exon III Region of Myostatin Gene of Native Cattle Breeds for Nt
821(del11) Polymorphism
Atilla ÖZ
Biyoteknoloji Anabilim Dalı
Numan ÖZCAN
Zootekni Anabilim Dalı
ÖZET
Belçika Mavisi ve Piedmontese gibi ırkların da içinde yer aldığı bazı etçi
sığır ırklarında, II. kromozomda yer alan myostatin geninin III. ekzon (kodlama
yapan) bölgesindeki 821. nükleotidden itibaren oluşan 11 bazlık delesyon (del11
mutasyonu) (Belçika Mavisi’nde) bu gende mh dominant allelinin oluşmasına ve
çift kaslılık denilen %20 et artışı ile yağlanmada %50 azalmalara neden olmaktadır.
Bu çalışmada Türkiye’deki bütün yerli ırklara ait myostatin geninin ekzon III bölgesi
içinde nt821del11 mutasyonu bakımından karakterize edilmiştir. Bulgularda
myostatin genine ait ekzon III bölgesinde herhangi bir nt821del11 mutasyonuna
rastlanılmamıştır. Bu bulgu, yerli sığır ırklarımızın çift kaslı sığır ırkları ile
+
melezlenmelerine yönelik çalışmalarda melez mh ve mh alleli içeren melez
döllerin izlenmesini kolaylaştıracaktır.
Anahtar kelimeler: Çift kaslılık, Myostatin, Türkiye yerli sığır ırkları, Belçika Mavi
ABSTRACT
In some beef cattle breeds such as Belgium Blue and Piedmontese, exon
III region of myostatin gene of chromosome II is mutated (del11 mutation at 821
−
nucleotid position for Belgium Blue) to produce mh dominant allel thereby
increasing meat yield up to 20% and reducing carcass fat amount up to 50%.
Turkish native cattle breeds DNA samples obtained from peripheral bloods were
screened for exon III of myostatin gene for nt821del11 mutation. The results
revealed the non-existance of such mutations in Turkish native cattle breeds.
Key words: Double muscling, Myostatin, Turkish native cattle breeds, Belgium
Blue
___________________________
*Yüksek Lisans Tezi-MSc. Thesis
Giriş
130
Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2
GDF-8 (Growth Differentiation Factor-8) olarakta bilinen myostatin (mstn)
TGF-B (Transforming Growth Factor-B ) ailesinin bir üyesidir. İskelet kası
–
büyümesinde ve farklılaşmasında rol oynamakla birlikte kas hipertrofisine (mh :
musculus hypertrophy) neden olmaktadır. Myostatin geni sığırlarda II kromozomda
yer almakta 3 ekzon ile 2 intron’dan meydana gelmektedir (Bellinge ve ark., 2005).
Normal tip myostatin geni iskelet kası büyümesini, negatif yönde düzenleyici
etkisini ilk defa farelerde tespit etmişlerdir (McPherron ve ark., 1997). Belçika
Mavisi sığırlarında myostatin geni nükleotidlerinin 821. nükleotid’den başlayarak 11
baz çiftinin silinmesi sonucu bu sığırlarda çift kaslılık (double muscling) oluşmuştur
(Grobet ve ark., 1997). İtalya kökenli Piedmontese sığırlarında ise 3. ekzon içinde
938. pozisyondaki GA dönüşümü sonucu mutasyon tespit edilmiştir (Kambadur
ve ark.,1997). Ayrıca yine İtalya orijinli Marchigiana sığırlarında myostatin geninin 3.
ekzon bölgesinde, başlama kodonundan itibaren 871. pozisyonunda meydana
gelen GT dönüşümü sonucu, 291. amino asit olan glutamik asiti kodlayan
kodonun stop kodona dönüşmesi ile bu sığırlarda çift kaslılık ortaya çıkmıştır
(Marchitelli ve ark.,2003). Daha önce tarafımızdan yapılan bir araştırmada yerli
sığır ırklarımızın myostatin geni III.ekzon bölgesinde nt871(GT) bir mutasyon
olmadığı gösterilmiştir (Özcan ve ark., 2009).
Araştırmacıların sınırlı sayıdaki veriler ile yaptığı değerlendirmeler
sonucunda nt821(del11) mutasyonu ve nt938 (GA) dönüşümü gibi bazı
mutasyonlar bir çok sığır ırkı tarafından paylaşılmıştır (Grobet ve ark., 1998). Bu
mutasyonlardan nt821del11; Belgian Blue, Blonde d’Aquitaine, Limousine,
Parthenaise, Asturiana, ve Rubea Gallega sığır ırklarında görülmüştür. Ayrıca
nt938 (GA) mutasyonu ise Gasconne ve Piedmontese sığır türlerinde
görülmüştür (Karim ve ark., 2000). Araştırmamızda Bos taurus ve Bos inducus
myostatin gen dizileri refarans alınarak (Jeanplong ve ark., 2001; Tantia ve ark.,
2006), sığırlarda II. Kromozomda yer alan myostatin genine ait, ekzon-3
bölgesinde görülen nt821(del11) ve mutasyonu, Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı’na
bağlı bazı enstitülerde koruma altında tutulan yerli sığır ırklarımızdan( Yerli Kara,
Kilis, Doğu Anadolu Kırmızısı, Yerli Sarı, Boz Irk ) ve bir kültür ırkı olan Siyah Alaca
(kontrol) ırklarındaki varlığı araştırılmıştır.
Materyal ve Metot
Materyal
Araştırmada kullanılan DNA materyali, FAO'nun "Gen Kaynaklarının
Korunması" programı kapsamında Tarım ve Köyişleri Bakanlığı’na bağlı
enstitülerde koruma altında tutulan yerli sığır ırklarından sağlanmıştır. Çalışmada
kontrol ırkı olarak kullanılan kültür ırkı Siyah Alaca sığırları ise Ç.Ü. Ziraat
Fakültesi'nde bulunan Araştırma ve Uygulama Çiftliği'nden sağlanmıştır.
Çalışmada kullanılan kanların ırk bazında temin edildiği Tarım ve Köyişleri
Bakanlığı’na bağlı enstitüler çizelge.1’de ayrıntılı olarak belirtilmiştir.
131
Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2
Çizelge 1. Kanların ırk bazında temin edildiği Tarım ve Köyişleri Bakanlığı’na
bağlı enstitüler.
Örnek
Sayısı
NO
Irk
Kaynak
1
BI
Marmara Tarımsal Araş.
Enst./Balıkesir
24
2
YK
Lalahan Hayvan Araş. Enst./Anakara
19
3
Ki
Çukurova Tar. Araş. Enst./ Adana
25
4
DAK
Doğu Anadolu Tar. Araş.
Enst./Erzurum
25
5
YS
SA
6
Urfa/Siverek Köy Sürüleri
Ç.Ü. Büyükbaş Hayvan Yetiştirme
Ünitesi/Adana
18
25
TOPLAM
136
BI:Boz Irk, YK:Yerli Kara, Kİ:Kilis Irkı, DAK:Doğu Anadolu Kırmızısı, YS:Yerli
Sarı, SA:Siyah Alaca
Metot
Sığır kanlarından genomik DNA izolasyonu “Salting Out’’ yöntemine
(Miller ve ark. 1988) göre yapılmıştır. Myostatin gen dizisi AF320998 ulaşım
numarası ile NCBI gen bankasından sağlandı (Jeanplong ve ark., 2001). Ekzon III
bölgesi içinde yer alan 141 bç bölgenin amplifikasyonu için primer B kullanıldı
(Smith ve ark., 2000)(Çizelge. 2)
Çizelge 2. Çalışmada kullanılan primerler
Primer
Baz Dizisi
Sayısı
Bölge
ForwardB
5’-AGGAGAGATTTTGGGCTTGA-3’
20
nt 821del11
ReverseB
5’-TCCAGAGCAGTAATTGGCCT -3’
20
nt 821del11
PCR reaksiyonu; 10x Tris-HCI (pH:8.8) (NH4)2SO4 (5µl), Primer (forward)
20 pmol/µl (1µl), Primer (reverse) 20 pmol/µl (1µl), dNTPmix 10 mM (1µl), MgCl2
25 mM (5µl), Taq Polimeraz 5 IU/µl (1µl), Genomik DNA 40 ng/µl (2µl), distile su
(34µl) kullanılarak toplam 50 µl hacim olacak şekilde hazırlanmıştır. PCR
aşamaları ise Çizelge.3’de verilmiştir. PCR ürünleri %3’lük agaroz jel
elektroforezinde yürütüldü.
132
Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2
Çizelge 3. PCR reaksiyonuna ait aşamalar
Aşamalar
Sıcaklık (ºC)
Zaman (dk)
1
Döngü sayısı
95
5
94
1
60
1
72
1
3
72
10
1
4
4
<24 saat
1
2
1
48
Nt821(del11) polimorfik bölgenin genotipinin anlaşılması için iki farklı
+
analiz kullanıldı. İlk olarak amplifiye edilen mh :141bç’lik veya mh :130 bç’lik PCR
ürününün doğrudan %3’lük agaroz jelde görüntülenmesiyle polimorfik allellerin
gözlemlenmesine dayalı yöntem kullanıldı (Smith ve ark., 2000) (Şekil.1).
Şekil 1. Nt821(del11) polimorfik bölgeyi de kapsayan 141 bp’lik DNA fragmenti
133
Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2
Bulgular ve Tartışma
Bulgular
Nt821(del11) polimorfik bölgeye ait Bulgular
Beş yerli ve bir kültür sığır ırklarına ait 136 genomik DNA’nın myostatin
(GDF-8) geni ekzon III bölgesi içinde nt821(del11) polimorfik bölge için
+
mh :141bç’lik veya mh :130bç’lik DNA fragmenti PCR ile amplifiye edilerek %3’lük
agaroz jelde görüntülendi (Resim.1)
Resim 1. Bazı yerli ırklara ait myostatin geni ekzon-3 bölgesi
içindeki 141bç’lik
DNA parçasının %3’lük Agaroz jelde görüntüleri.
Beş yerli ve kültür ırkına (kontrol ırk) ait bütün örneklerde nt821(del11)
polimorfik bölge mevcut olmadığı için mh alleli bakımından mh+/+ olarak
genotiplendirildi. (Çizelge. 4).
Çizelge 4. Irklara göre nt821(del11) genotiplerinin ırklara göre dağılımı
Tartışma
Bu çalışmada, Dünya’da bazı sığır ırklarının myostatin geni ekzon-3 bölgesi
içinde meydana gelen nt821(del11) çerçeve kayması (frame shift) mutasyonun
varlığı Türkiye yerli sığır ırklarında tespit edilmemiştir.
Türkiye yerli ırklarında nt821(del11) çerçeve kayması (frame shift)
mutasyonu PCR amplifikasyonu ile doğrudan polimorfik allellerin gözlenmesine
dayalı olarak araştırılmıştır. Buna göre ırklarımız nt821(del11)( mh ) polimorfik allel
bakımından yabanil tip (wild-type) olduğu gözlenmiştir. Benzer bir çalışmada PCR
amplifikasyonu ile doğrudan mutant allelerin belirlenmesi yöntemi kullanılarak
134
Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2
South Devon sığır ırkına ait 107 örnek üzerinde nt821(del11) polimorfik bölge
araştırılmıştır. South Devon sığır ırkına ait bazı örneklerde nt821(del11)
polimorfizmi tespit edilmiştir (Smith ve ark., 2000).
Dünya’da nt821(del11) polimorfizmi; Belgian Blue, South Devon, Blonde
d’Aquitaine, Limousine, Parthenaise, Asturiana, Rubea Gallega, Red Angus, Polish
Red sığır ırklarında görülmüştür (Grobet ve ark.,1997; Kambadur ve ark.,1997;
Smith ve ark., 2000; Grobet ve ark., 1998; Karim ve ark., 2000; McPherron ve Lee.,
1997; Klauzińka ve ark.,2001).
Nadir gözlenen bir durum ise çift kaslılık genotipine sahip hayvanlar bazen
çift kaslılık fenotipini göstermemektedir. Polonya Kırmızı (Polish Red) sığırları ile
yapılan bir araştırmada nt821(del11) genotipi gözlenmesine rağmen çift kaslılık
fenotipine rastlanılmamıştır (Klauzińka ve ark, 2001). Bu
durumun yerli
ırklarımızda olabileceği ihtimali de göz önüne alınarak yapılan bu çalışmayla yerli
ırkların nt821(del11) genotipini taşımadıkları dolayısıyla çift kaslılığın fenotipe
yansımaması gibi bir durumun oluşmadığı sonucu ilk kez ortaya konmuştur.
McPherron ve Lee, (1997)’ de bu iki mutasyonun Avrupa’da mevcut etçi
sığırlar içinde varlığını tespit etmek amacıyla çift kaslı olarak sınıflandırılmayan 16
ayrı sığır türünden(11 Angus, 11 Charolais, 10 Holstein, 10 Brown Swiss, 10 Polled
Hereford, 10 Gelbvieh, 9 Simmental, 9 Jersey, 9 Guernsey, 9 Ayrshire, 7 Limousin,
4 Brahman, 4 Polled Shorthorn, 4 Red Angus, 2 Chianina, ve 1 Texas Longhorn )
oluşan 120 adet örnek üzerinden Southern Blot analizleri yardımıyla yaptıkları
çalışma sonucunda sadece bir Red Angus sığırının tek ipliğinde nt821del11
mutasyonu bulunduğunu geri kalan çift kaslı olmayan bütün ırklarda her iki
(nt821del11 ve nt 938 GA ) mutasyona rastlanmadığı gözlenmiştir
Çift kaslılık fenotipini en az 6 farklı mutasyon etkilemektedir. Bu
mutasyonlardan nt419 (del7-ins10), nt610 (C→T), nt676 (G→T) polimorfizmleri
II.ekzon bölgesi içinde ve nt821 (del11), nt874 (G→T), ve nt938 (G→A)
polimorfizmleri ise III.ekzon bölgesi içinde yer almaktadır. (Karim ve ark., 2000).
Çift kaslılık fenotipi üzerine en az 6 farklı allelin etkilediği bilinmektedir. Yerli
ırklar için et verimi en yüksek ırk Doğu Anadolu Kırmızı ırkıdır. Başta Doğu Anadolo
Kırmızı ırkı olmak üzere yerli ırkların et veriminin nt821(del11), bölgesinde olmadığı
doğrudan PCR dayalı yöntem ile tespit edilmiştir. Bu bölgenin PCR-RFLP ve DNA
baz dizilerinin okunması ile teyid edilmesi gereklidir. Ancak yerli ırklarımızın et
veriminin çift kaslılığı etkileyen Ekzon-3 bölgesindeki diğer polimorfik allelerden
kaynaklanabilir. Bu nedenle myostatin geni Ekzon-3 bölgesinin DNA dizi analiziyle
daha kapsamlı araştırılması düşünülmektedir.
KAYNAKLAR
BELLINGE, R.H.S., LIBERLES, D. A., LASCHI, S.P.A., BRIEN,O.,TAY,
G.K. 2005. Myostatin and its implications on animal breeding:a
review. Anim. Genet. 36:1-6
135
Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2
GROBET, L., PONCELET, D., ROYO, L. J., BROUWERS, B., PIROTTIN,
D., BROUWERS, B., RIQUET, J., SCHOEBERLEIN, A.,
DUNNER, S.,
GROBET, L., PONCELET, D., ROYO, L. J., BROUWERS, B., PIROTTIN,
D., MICHAUX, C., MÉNISSIER, F., ZANOTTI, M., DUNNER, S.,
GEORGES, M. 1998. Molecular definition of an allelic series of
mutations disrupting the myostatin function and causing doublemuscling in cattle Mamm. Genome ,9:210-213
JEANPLONG, F., SHARMA, M.,SOMERS, W.G. ,BASS, J.J.
ANDKAMBADUR, R. 2001.Genomic organization and neonatal
expression of the bovine myostatin gene Mol.Cell.Biochem.220:1-2,
31-37
KAMBADUR, R., SHARMA, M., SMITH, T. P. L., BASS, J. J. 1997.
Mutations in myostatin (GDF-8) in double muscled Belgian Blue
and Piedmontese cattle. Genome Research, 7: 910-915
KARIM, L., COPPIETERS, W., GROBET, L., VALENTINI, A.,
GEORGES, M. 2000. Convenient genotyping of six myostatin
mutations causing double-muscling in cattle using a multiplex
oligonucleotide ligation assay. Animal Genetics, 31: 396-399
KLAUZIŃSKA, M., ZURKOWSKI, M., SIADKOWSKA, E.,
SZYMANOWSKA, M., GROCHOWSKA, R., ZWIERZCHOWSKI,
L., KLEWIEC, J. 2004. Analysis of genetic structure in Polish Red
and Polish Black-and-White cattle using twelve marker loci
potentially related to mil kor meat production traits. Anim. Sci. 2:
153-171
MARCHITELLI, C., SAVARESE, M.C., CRISÀ, A., NARDONE, A.,
MARSAN, P.A., VALENTINI, A. 2003. Double muscling in
Marchigiana beef breed is caused by a stop codon in the third exon
of myostatin gene. Mamm. Genome 14:392-395
McPHERRON, A.C., LAWLER, A.M., LEE, S.J. 1997. Regulation of
skeletal muscle mass in mice by a new TGF-B superfamily member.
Nature 387 : 83-90
MÉNISSIER, F., MASSABANDA, J., FRIES, R., HANSET, R.,
GOERGES, M. 1997. A deletion in the myostatin gene causes
double-muscling in cattle. Natural Genetics, 17: 71-74.
136
Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2
MILLER, S.A.,DYKES, D.D., AND POLESKY,H.F. 1988. Asimple Salting
Out procedure for extracting DNA from Human nucleated
cells.Nucleic Acids Research,16(3):1215.
ÖZCAN, N., ÖZ, A., ÖZCAN, B.D. 2009. Yerli Sığır Irklarında Myostatin
Genine Ait III.Ekzon Bölgesinin GT Polimorfizmi Bakımından
Karşılaştırılması, 6.Ulusal Zootekni Bilim Kongresi, 79- 84,
ERZURUM.
SMITH, J.A.,LEWIS, A.M., WIENER, P.,WILLIAMS, J.L. 2000. Genetic
variation in the bovine myostatin gene in UK beef cattle: Allele
frequencies and haplotype analysis in the South Devon. Anim.Genet,
31:306-3
TANTIA,M.S., VIJH,R.K., KUMAR,S.T., MISHRA,B. AND REECY, J.M.
2006. Comparative analysis of GDF 8 (myostatin) in Bos indicus
and Bos taurus DNA Seq. 17 (4), 311-313
137
Download

Yerli Sığır Irklarında Myostatin Genine Ait III