EK-11Sonuç Raporu Formatı
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ
KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE
Proje Türü
: Sağlık
Proje No
: 10B3336001
Proje Yöneticisi
: Prof. Dr. Erdem BÜYÜKBİNGÖL
Proje Konusu
: Mdm2 Protein İnhibisyonu Yapan Yeni Heterosiklik Bileşiklerin Sentezi
ve Moleküler Modelleme Çalışmaları
Yukarıda bilgileri yazılı olan projemin sonuç raporunun e-kütüphanede yayınlanmasını;
İSTİYORUM
İSTEMİYORUM
21/01/2014
Proje Yöneticisi
İmza
EK-11Sonuç Raporu Formatı
EK-11Sonuç Raporu Formatı
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ
SONUÇ RAPORU
Proje Başlığı
MDM2 PROTEİN İNHİBİSYONU YAPAN YENİ HETEROSİKLİK BİLEŞİKLERİN
SENTEZİ
VE
MOLEKÜLER MODELLEME ÇALIŞMALARI
Proje Yürütücüsünün İsmi
Prof. Dr. Erdem BÜYÜKBİNGÖL
Yardımcı Araştırmacıların İsmi
Uzm. Ecz. Dilan KONYAR
Proje Kodu
10B3336001
Başlama Tarihi
15.03.2010
Bitiş Tarihi
15.03.2013
Rapor Tarihi
22.07.2013
Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri
Ankara - "2013"
EK-11Sonuç Raporu Formatı
RAPOR FORMATI
Bilgisayarda 12 punto büyüklüğünde karakterler ile, tercihan "Times New Roman" stili kullanılarak yazılacak ve
aşağıdaki kesimlerden (alt kesimler de dahildir) oluşacaktır.
Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri
I.
Amaç ve Kapsam
II.
III.
Materyal ve Yöntem
IV.
Analiz ve Bulgular
V.
Sonuç ve Öneriler
Geleceğe İlişkin Öngörülen Katkılar
VI.
Sağlanan Altyapı Olanakları ile Varsa Gerçekleştirilen Projeler
VII.
Sağlanan Altyapı Olanaklarının Varsa Bilim/Hizmet ve Eğitim Alanlarındaki Katkıları
VIII.
IX.
Kaynaklar
X.
Ekler
a.
Mali Bilanço ve Açıklamaları
b.
Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar
c.
Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III'de yer almayan analiz ayrıntıları)
d.
Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar) (Altyapı Projeleri için uygulanmaz)
e.
Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler (Altyapı Projeleri için uygulanmaz)
NOT: Verilensonuç raporu bir (1) nüsha olarak ciltsiz şekilde verilecek, sonuç raporu Komisyon onayından
sonra ciltlenerek bir kopyasının yer aldığı CD ile birlikte sunulacaktır. Sonuç raporundaproje
sonuçlarını içeren, ISI’ nın SCI veya SSCI veya AHCI dizinleri kapsamında ve diğer uluslar arası
dizinlerce taranan hakemli dergilerde yayınlanmış makaleler, III. Materyal ve Yöntem ve IV. Analiz
ve Bulgular bölümleri yerine kabul edilir.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
MDM2 PROTEİN İNHİBİSYONU YAPAN YENİ HETEROSİKLİK BİLEŞİKLERİN SENTEZİ VE
MOLEKÜLER MODELLEME ÇALIŞMALARI
ÖZET
Bu çalışmada ilk kez olmak üzere 3 adet sonuç spiro oksindol bileşiği sentezlenmiş ve in vitro protein
etkileşmeleri saptanmıştır.
Tasarlanan türevleri elde etmek üzere aşağıdaki sentez basamakları uygulandı. Ticari olmayan
başlangıç maddelerinin sentezi için 1,3-dihidro-indol-2-on ve benzaldehit/p-nitro benzaldehit/o-kloro
benzaldehitin piperidin ile metanollü ortamda kondensasyonu sonucunda 3-benziliden-1,3-dihidroindol-2-on türevi bileşikler (1-3) hazırlandı. Hedeflenen spiro oksindol türevlerinin sentezi için Argon
gazı altında (2S, 3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on üzerine 3-benziliden-1,3-dihidroindol-2-on/3-(p-nitro)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on/3-(o-kloro)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on
ve izovaleraldehit ilave edilerek toluen içerisinde çözüldü. Reaksiyon ortamına taze aktive edilmiş 4A o
moleküler elek de ilave edilerek (4-6) bileşikleri elde edildi.
Elde edilen sitotoksisite sonuçlarına göre 14 numaralı bileşik HuH7 ve MV karaciğer hücre
hattında en yüksek antikanser aktiviteyi göstermiştir. 11, 12, 13 numaralı bileşikler içinde de fenil
halkasında –Cl atomu yerine -NO2 grubu geldiği zaman MV karaciğer hücre hattında aktivitenin
kaybolduğu, Huh7 hücre hattında ise aktivenin çok düştüğü görülmüştür.
Bu yüksek lisans tezinde hazırlanan yeni spiro oksindol türevi bileşiklerin MDM2 proteinine
(1YCR) bağlanma özelliklerini araştırmak için, AutoDock Vina- 1.2.2 programı kullanılarak moleküler
modelleme (doking) çalışmaları yapılmıştır.
Bu bileşikler seçici olarak p53’ün Phe19, Trp23, Leu26, Leu 22 amino asit kalıntılarını taklit ederek
MDM2 proteininin hidrofobik cebine bağlanarak aktivitesini gösterdiği aydınlatılmıştır.
Anahtar Kelimeler: Oksindol, p53, MDM2, antikanser bileşikler, protein-protein etkileşimi,
moleküler modelleme.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
STUDIES ON SYNTHESIS AND MOLECULAR DOCKING OF SOME NOVEL HETEROCYCLIC
COMPOUNDS WHICH MAKE MDM2 INHIBITION
SUMMARY
In this study, three new spiro oxindol compounds were synthesized and their in vitro protein
interactions were determined.
Following synthesis steps were followed in order to obtain the designed derivatives. For the
synthesis of non-commercial starting materials, 3-benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one derivative
compounds (1-3) were prepared through the condensation of 1,3-dihydro-indol-2-one and
benzaldehyde/p-nitro benzaldehyde/o-chloro benzaldehyde with piperidine in a medium containing
methanol. For the synthesis of target spiro oxindol derivatives, 3-benzylidene-1,3-dihydro-indol-2one/3-(p-nitro)-benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one/3-(o-chloro)-benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one
and isovaleraldehyde were added on (2S, 3R)-2,3,5,6-tetrahydro-2,3-phenyl-1,4-oxazin-6-one under
Argon gas and it was dissolved in toluene. (4-6) compounds were obtained by adding freshly activated
4o molecular sieve into the reaction medium.
According to the obtained cytotoxicity results, compound number 14 was found to have the
highest anticancer activity in HuH7 and MV liver cell line. When –Cl atom of phenyl ring was replaced
with –NO2 group, it was found that the activity in MV liver cell line has disappeared and the activity in
Huh7 cell line has decreased drastically.
In this Master’s thesis, molecular modelling (docking) was done with AutoDock Vina-1.2.2
Program to investigate the binding property of newly synthesized spiro oxindole derivative compounds
to MDM2 protein (1YCR). It was illuminated that p53 acts through binding to hydrophobic pocket of
MDM2 protein selectively by imitating Phe19, Trp23, Leu26, Leu22 amino acid residues.
Key Words: Oxindole, p53, MDM2, anticancer compounds, protein-protein interactions, molecular
modelling.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
2. AMAÇ VE KAPSAM
p53, MDM2’nin p53 bağlama bölgesine bağlanarak MDM2’nin işlevini artırır. Buna karşılık, MDM2
proteini p53 proteinini 3 mekanizma aracılığıyla; 1) p53’ün transaktivasyon fonksiyonunu inhibe
ederek, 2) p53’ü çekirdekten dışarı çıkararak, 3) p53’ün E3 ubikuitinasyon ligaz aktivite ile proteazom
aracılı bozulmasını teşvik ederek inhibe eder (Shangary ve ark., 2009).
Yapılan araştırmalarda, MDM2 proteininin p53 proteininin tümör baskılayıcı fonksiyonunu bir
kaç farklı mekanizma ile engellediği belirlenmiştir. Birinci mekanizmada, MDM2, p53’ün
fonksiyonlarını p53’ün transaktivasyon bölgesi Leu-22 ve Trp-23 aminoasitlerinin bulunduğu
hidrofobik bölgeye bağlanarak engeller (Shangary ve ark., 2009; Lin ve ark., 1994; Lu ve ark., 1995).
MDM2 bu bölgeye bağlanabilmek için transkripsiyon faktörü kompleksi TFIID ile rekabet eder. Bu
şekilde p53’ün transkripsiyonu aktive etmek için kullandığı bölgeyi maskeler ve p53’ün fonksiyonunu
inhibe eder (Lu ve ark., 1995, Thut ve ark., 1997).
MDM2’nin p53 aktivitesini engellediği bir diğer
mekanizma, p53 proteininin seviyesini
MDM2-proteozom aracılı bozulma yardımıyla azaltır (Kubbubat ve ark., 1997). MDM2, p53’ü
hücrenin çekirdeğinde bağlar ve p53 ile birlikte sitoplazmaya göç ederek, p53’ün proteozomlar
tarafından parçalanmasını arttırır (Michael ve ark., 2003, Roth ve ark., 1998) ya da MDM2 proteini
karboksil ucundaki “yüzük parmak” bölgesini kullanarak “E3 ubikutin ligaz” aktivitesi yapar ve p53
proteininin inhibisyonuna direkt olarak etki etmektedir (Honda ve ark., 2000).
MDM2’nin p53’ün fonksiyonunu, p53 proteininin hücredeki konsantrasyonunu azaltarak
engellemesi, p53’ün transkripsiyonu aktive etmek için kullandığı bölgeyi bloke etmesinden daha etkili
bir mekanizmadır. MDM2’nin p53’ün fonksiyonlarını, transkripsiyon aktivasyonuna aracılık etme
yöntemi ile engellemesi, p53’ün apoptozu artırma ve DNA onarımını sağlama gibi fonksiyonlarını
yapmasına engel olmaz. Fakat p53 proteinini parçalaması, p53’ün transkripsiyonel aktivasyona ek
olarak gerçekleştirdiği diğer bütün fonksiyonları da engeller (Freedman ve ark., 1999).
MDM2’nin p53 fonksiyonunu engelledigi son mekanizma, p53’ün asetilasyonunu inhibe
etmektir. P300 gibi koaktivatörler p53’ün amino ucuna bağlanır ve karboksil ucundaki lizin amino
asitinden asetile olmasını sağlar (Rodriguez ve ark., 2000, Ito ve ark., 2001). Bu asetilasyon, p53’ün
DNA’ya
bağlanmasını hızlandırır. MDM2, p53’ün N-ucunda bulunan transaktivasyon alanına
EK-11Sonuç Raporu Formatı
bağlamak için p300 ile yarışır (Arva ve ark., 2005). MDM2, p53’ün p300 aracılı asetilasyonunu inhibe
ederek p53’ün transkripsiyonu aktive etme fonksiyonunu inhibe eder (Ito ve ark., 2001).
Spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin) ana yapısını taşıyan bileşikler MDM2-p53 etkileşimini inhibe
ederler (Ding ve ark., 2005a). Oksiindol yapısı triptofan yan zincirini çok iyi taklit eder ve triptofanın
MDM2 üzerinde bağlandığı bölgeyle etkileşir. Yapıda bulunan NH grubu MDM2 üzerinde bulunan
karbonil grubuyla
hidrojen bağı kurar ve spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin) türevi bileşikler, MDM2
bağlanma bölgesiyle hidrofobik etkileşme yapar (Sikora, 2011; Ding ve ark., 2005a). Buradan
çıkaracağımız sonuç spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin) türevi bileşiklerde stereoselektivitenin inhibisyonda
önemli bir rolü vardır (Ding ve ark., 2006).
MDM2 proteini, tümör baskılayıcı protein olarak bilinen ve p53 geni tarafından kodlanan TP53
proteinine bağlanarak bu proteinin DNA üzerindeki mutasyonları düzenleme çalışmalarını
engellemektedir.
MDM2
proteininin
inhibisyonu
ise
TP53
proteininin
re-aktive
olmasını
sağlamaktadır. Bu amaca yönelik olarak pek çok kimyasal bileşik sentezlenmiştir. Bunların içinde
spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin)halka yapısı içeren bileşikler yüksek antikanser aktivite göstermektedir.
Biz de daha önce yapılan Aldoz Redüktaz enzim inhibitörü olarak sentezlenen spirohidantoinil isatin
(Büyükbingöl ve Klopman., 1995) bileşiği 54 kanser hücresinde yapılan çalışmalarla elde edilen
indolaltiyohidantoin (PIT) (Süzen ve Büyükbingöl., 2000) bileşiklerinden hareketle çeşitli
spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin)bileşiklerinin sentezi, enzim inhibisyonuna dayalı çalışmalar ve
antikanser çalışmaların ışığı altında yeni spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin) türevi bileşiklerin sentezlenmesi
ve antikanser etkilerinin araştırılması amaçlandı. Bu amaca yönelik olarak pek çok kimyasal bileşik
sentezlenmiştir. Bunların içinde MI-219 olarak bilinen oksiindol yapısındaki bileşik en etkin antikanser
aktiviteyi göstermektedir. Daha önce yapılan çeşitli oksiindol yapısındaki bileşiklerin sentezi, enzim
inhibisyonuna dayalı çalışmalar ve antikanser çalışmaların ışığı altında MI-219 yapısını lider bileşik
olarak ele aldık. Shangary ve ark., p53’ün hedef gen ürünü olduğu bazı hücre hatlarında çalışmışlardır.
Bunlar SJSA-1 ve SaOS-2 (osteosarkoma), LNCaP,22Rv1, DU145ve PC3 (prostat kanseri) hücre
hatlarıdır (Shangary ve ark., 2008).
EK-11Sonuç Raporu Formatı
HO
Cl
O
OH
HN
NH
F
O
Cl
N
H
IC50
(μM)
SJSA-1
1.8
LNCaP
1.2
22RV1
2.2
SaOS-2
20
DU-145
20
PC-3
18
Şekil 2.1.MI-219
Moleküler Modelleme Çalışmaları
Yeni ilaç geliştirme çalışmalarında moleküler modelleme oldukça önemli bir yer tutmaktadır. Terapötik
bileşiklerin rasyonel tasarımı, moleküler modelleme çalışmalarının, araştırmacının bakış açısını
yansıtması bakımından da önemlidir. Son yıllardaki bilgisayar donanım ve yazılımındaki gelişmeler
moleküler modelleme çalışmalarını kolay uygulanabilir hale getirmiştir.
İlaç tasarımında, tasarlanan moleküllerin bilgisayar ortamında 3-boyutlu (3B) davranışlarını
incelemek rasyonel bir yaklaşımı zorunlu kılmaktadır (Cohen, 1996). Bu yaklaşımda, tasarlanan
kimyasal bileşiklerin 3B moleküler yapısı belli olan reseptör ile etkileşmeleri göz önüne alınmaktadır.
Reseptör yapısı belli olması nedeniyle tasarlanan moleküllerin reseptördeki kavitelere uyumu ve amino
asit kalıntılarıyla etkileşimleri, çeşitli açılardan irdelenebilmektedir. Bilgisayar ortamında 3B olarak
ligand-reseptör etkileşmesi olarak ele alınan ve bu nedenle “reseptör -ya da yapısal- tabanlı ilaç
tasarımı” olarak bilinen “doking” çalışmaları da bu sistem içinde yer almaktadır. Doking, kararlı bir
kompleks oluşturmak üzere birbirine bağlandıklarında, bir molekülün ikinci bir moleküle tercih edildiği
şekilde yönlendirilmesini tahmin eden bir yöntemdir (Lengauer and Rarey, 1996). Küçük moleküllü
ilaç adaylarının protein hedeflerine karşı afinitesini, bu proteinlere bağlanmasını ve dolayısıyla
biyolojik aktivitesini önceden tahmin edebilmek için kullanılmaktadır. Bu nedenle, ilaçların rasyonel
tasarımında önemli bir yeri bulunmaktadır (Kitchen ve ark., 2004; Chikhi ve Bensegueni, 2008).
Ancak, bu yüksek lisans tezinde başlangıçta çalışma kapsamı içinde yer almamasına rağmen,
sentezlenen bileşiklerin MDM2 ile uyumunu ve serbest bağlanma enerji düzeyi (G) ile tanımlanan
“sayısal değerlendirme” fonksiyonunu belirlemenin, gelecekte yapılacak benzeri çalışmalara ışık
tutacağı düşüncesiyle, sentezlenen bileşiklerin AutoDock Vina 1.1.2 programı kullanılarak ligandprotein etkileşmeleri incelenmiştir.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
AutoDock Vina, moleküler doking ve sanal tarama için yapılmış yeni bir programdır. AutoDock
Vina ve Auto Dock’ın hız ve doğruluğu 190 tane protein-ligand kompleksi ile deneme seti
oluşturularak karşılaştırıldığında AutoDock Vina’nın
daha hızlı ve güvenilir tahminleri olduğu
görülmüştür (Trott ve Olson, 2010).
Doking çalışmalarında reseptör olarak ele alınan yapı protein yapısındadır. Reseptörün
yapısının tanımlanmasında en çok X-ışınları kristallografisi ve nükleer manyetik rezonans (NMR)
teknikleri kullanılmaktadır. Kristal olarak elde edilebilen bir protein üzerine X-ışınları gönderilerek, bu
proteinin yapısı belirlenebilmektedir. Daha kompleks olan NMR yönteminde, su ortamında çözünen
proteinin konformasyonu saptanabilmektedir. Ancak, NMR yöntemi oldukça karışık ve kompleks
çözümlemelere gereksinim duymaktadır. Dolayısıyla, tercih edilen yöntem X-ışınları kristallografisidir.
Bu yöntemin en önemli dezavantajı, her protein bileşiğinin kristal olarak elde edilmesinin mümkün
olmamasıdır. En tercih edilen durum, ligand ile protein molekülünün yapmış olduğu kompleksin
kristalinin elde edilebilmesidir. Ancak, bu çok fazla rastlanan bir durum değildir. Reseptör proteininin
yapısının bilinmesi, ligand-reseptör kompleksinin kristal olarak elde edilememesine rağmen,
etkileşmenin belirlenmesi açısından, uygun bir yaklaşım olarak karşımıza çıktığı için önemlidir.
Moleküler doking teknikleri, bilgisayar destekli rasyonel ilaç tasarımında ilaç ya da ilaç adayları
ile enzim, nükleik asit, reseptör proteinlerinin birbirine nasıl uyum gösterdiklerini araştırmak için
sıklıkla kullanılmaktadır (Jain; 2007; Spitzer ve ark., 2007). Bu doking çalışmalarında, 3B yapısı belli
olan reseptöre bağlanma enerjileri belirlenebilmekte ve reseptörün bağlanma bölgesinde ligandın
konumlanması canlandırılabilmektedir. Bu durum, bağlanma tipinin anlaşılması ve proteinleri
hedefleyen küçük moleküllü, daha uyumlu ligandların tasarlanması için faydalı olabilmektedir (Holt ve
ark., 2008). Protein ve ligand arasındaki etkileşimleri incelemek ve etkileşme sürecinde hareket eden
esnek bölgelerin ve ligandın konumlanmasını hesaplamak için kullanılan AutoDock Tools (ADT),
küçük moleküllü ligandların makro molekül hedeflerine (genellikle protein, bazen DNA)
yanaştırılmasında en çok adı geçen program paketidir (Sousa ve ark., 2006; Yang ve ark. 2008; Morris,
2009). ADT, iki ana program içermektedir: Bunlardan birincisi, 3B “grid” yapısının ön
hesaplamalarının yapılması için kullanılan AutoGrid programı, diğeri ise ligandın hedef proteine
doking işlemlerini sağlayan AutoDock programıdır. AutoDock programının, kristalografik ligandprotein kompleksinin görüntülenmesinde DOCK, FlexX, GOLD ve Arguslab gibi diğer doking
programlarına göre üstünlüklerinin bulunduğu gösterilmiştir (Park ve ark., 2006; Chikhi ve
Bensegueni, 2008). AutoDock, Lamarckian genetik algoritma temeline dayanmaktadır (Morris ve ark.,
1998). Evrimde bireylerin genetik bilgi, kromozom eşleşmesi, gen mutasyonu ve çevresel etkenlere
EK-11Sonuç Raporu Formatı
bağlı olarak değişim gösterdiği gibi, genetik algoritmalar da ligand konformasyonlarını birey olarak
kullanarak, hayatta kalıp kalamayacağına karar verir. AutoDock, protein ile oluşturduğu komplekste
ligandın en uygun konformasyonunun belirlenmesini sağlar (Pospisil ve Folkers, 2004).
Sentezlenen Bileşiklerin MDM2 Proteinine Doking Çalışmaları
Sentezlenen yeni p53 agonisti bileşiklerin doking çalışmaları, http://vina.scripps.edu/ internet
sitesinden ücretsiz olarak temin edilen AutoDock Vina 1.2.2 program paketi kullanılarak
gerçekleştirildi.
Bileşiklerin 3-boyutlu yapılarının elde edilmesi ve minimizasyonunun sağlanması için
HyperChem 5.1 programı kullanıldı. Bileşiklerin doking işleminin gerçekleştirileceği hedef reseptör
olarak seçilen MDM2 ile Nutlin 2 (Şekil 2.3) kompleksinin kristal şekli (Vassilev ve ark., 2004) 1RV1
kodu ile Protein Veri Bankası (PDB) web sitesinden [http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do] pdb
formatında temin edildi. MDM2 proteini ile p53 agonisti ligand AutoDock 4.0 programı kullanılarak
birbirinden ayrıldı ve bu yüksek lisans tez çalışmasında sentezlenmiş olan yeni MDM2 antagonisti
bileşiklerin, proteinin ligand bağlanma yöresine doking işlemi gerçekleştirildi. Bileşiklerin reseptörle
farklı konformasyonlardaki etkileşiminin bağlanma enerjileri karşılaştırıldı ve p53 agonist ligand ile en
iyi uyum gösteren konformasyon belirlendi. Proteinin ligand bağlanma yöresinde, sentezlenen yeni
bileşikler ile p53 agonist ligandın üstüste çakıştırıldığı üç-boyutlu protein-ligand kompleksinin (Şekil
2.3) görüntülerini elde etmek için, [http://www.cgl.ucsf.edu/chimera] internet sitesinden ücretsiz olarak
temin edilen UCSF Chimera moleküler modelleme programı chimera-1.3-win32 kullanıldı.
Şekil 2.2. MDM2 ve Nutlin 2 kompleksinde MDM2’nin şerit şeklindeki gösterimidir (pdb kodu: 1RV1).
EK-11Sonuç Raporu Formatı
Sentezlenen Bileşiklerin Sitotoksisite Deneyleri
Sentezlenen spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin)türevlerinin (11-14) sitotoksisite deneyleri için, 96
kuyulu plakalara 150μl`de kuyu başına Huh7 için 4000, Mahlavu için 2000 hücre ekildikten 24 saat
sonrasında kuyulardaki besiyeri atılıp yeni besiyeri verildi ve ilaçlar istenen başlangıç dozlarında ilk
kuyulara uygulanarak seri dilusyon ile toplam 5 dozda tatbik edildi. 24, 48 ve 72 saatlik inkübasyon
süreci bitiminde fosfat tampon tuzu (PBS) ile yıkanarak yüzmekte olan ölü hücreler atıldı. Yapışık
sağlıklı hücreler 50μl 10% soğuk trikloroasetik asit (TCA) ile 1 saat +4°C`de karanlıkta bekletilerek
fikse edildi.
Kuruduktan sonra her kuyuya 50μl %0.4 Sülforfodamin B (SRB) çözeltisi kullanılarak 96
kuyulu plakalar boyandı ve 10 dakika karanlıkta bekletildi. 10 dakikanın sonunda fazla boyaları
uzaklaştırmak için % 1 asetik asit çözeltisi ile plaklar dört kez yıkanarak kurumaya bırakıldı. 10 mM
hazırlanan TRIS baz çözeltisi her kuyuya 200μl uygulanarak SRB çözüldü. Çözünen SRB
spektrofotometrede 515 nm dalga boyunda okutuldu. Inhibitörün etkisini incelemek için elde edilen
değerler (1-(inhibitör eklenen kuyucuktaki hücrelerin absorbansı x 100) / (DMSO eklenen kontrol
hücrelerinin absorbansı)) formülüne göre hücre ölümü yüzdesine çevrildi. Doz yanıt eğrileri yardımıyla
IC50 (%50 oranında ölüme neden olan doz) değerleri hesaplandı.
SRB boya solüsyonu : %1’lik 10ml asetik asit içinde çözünmüş 0.04 gr % 10 SRB.
TCA solüsyonu : % 100 TCA`den soğuk ddH2O ile seyreltildi.
10mM Tris : 0.6gr Tris 1000ml soğuk ddH2O ile çözündü.
Ayrıca sentezlenen spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin)türevlerinin (1-9, 15, 16) sitotoksisite
deneyleri için, hepatoselüler karsinoma (HCC) kökenli hücre hattı Huh7, meme kanseri hücre hattı
MCF7 ve kolon kanseri hücre hattı HCT116 Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) ile 96kuyucuklu kültür kaplarına her bir kuyucuğa 2000 (Huh7 ve MCF7) ve 3000 (HCT116) hücre düşecek
şekilde ekildi. 24 saat enkübe edilen hücrelere DK molekülleri 40μM, 20μM, 10μM, 5μM, 2.5μM
dozlarında uygulandı. Her inhibitörün her bir farklı dozu 2 kez tekrarlandı. National Cancer Institue
tarafından uygulanan ilaç tarama prosedürü doğrultusunda 3 günlük inkübasyon sonrasında hücre
EK-11Sonuç Raporu Formatı
canlılığının belirlenmesi için hücre içi protein seviyelerini ve dolayısı ile canlı hücre miktarını yansıtan
kolorimetrik bir yöntem olan Sülforodamin B (SRB) yöntemi izlendi. Boyama öncesi 10% TCA
(Trikloroasetik asit) ile 1 saat süre ile fiksasyonu gerçekleştirilen hücreler, SRB ile boyandı. SRB
analizi sonucunda elde edilen ve canlı hücre sayısı ile doğru orantılı olan boya yoğunluğu
spektrofotometrede her bir kuyucuk için okundu. Inhibitörün etkisini incelemek için elde edilen
değerler (1-(inhibitör eklenen kuyucuktaki hücrelerin absorbansı x 100) / (DMSO eklenen kontrol
hücrelerinin absorbansı)) formülüne göre hücre ölümü yüzdesine çevrildi. Doz yanıt eğrileri yardımıyla
IC50 (%50 oranında ölüme neden olan doz) değerleri hesaplandı.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Tasarlanan Türevlerin Sentezleri
3.1.1. Ticari Olmayan Başlangıç Maddelerinin Sentezleri
1,3-dihidro-indol-2-on, sübstitüe benzaldehit türevleri ve baz olarak ortama ilave edilen piperidinin 3
ml metanol içinde 80 °C’de 1.5 saat kaynatılması sonucu kondensasyon ürünleri elde edildi. (Şekil 2.1).
R1
CHO
CH3OH
Piperidin
+ R
1
O
N
H
O
N
H
R1: -H, -p-NO2, -o-Cl
Şekil 3.1. Sübstitüe 3-Benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on sentezi
3.1.2. Spiro oksindol Türevlerinin Sentezleri
Argon gazı altında (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on üzerine sübstitüe 3benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on ve izovaleraldehit ilave edilerek 5 ml toluen içerisinde çözüldü.
Reaksiyon ortamına taze aktive edilmiş 4A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat karıştırıldı
(Şekil 2.2).
R1
R1
O
N
H
N
CHO
O
O +
O
O
+
Toluen
O
4 A° moleküler elek
N
H
N
H
R1: -H, -p-NO2, -p-N(CH3)2, -o-Cl
Şekil 3.2. Spiro oksindol türevlerinin sentezi 1
EK-11Sonuç Raporu Formatı
5 ml THF içerisinde 1,3-dipolar ürünü, üzerine sübstitüe alifatik amin ilave edilerek oda sıcaklığında
bir gece döndürülmüştür. (Ding ve ark., 2005). Reaksiyon (Şekil 1.37)’de yer almaktadır.
R1
R1
O
O
N
+ R3
NH2
R3
HN
HO
O
N
THF
O R2
O R2
N
H
N
H
R1: -H, -p-NO2, -p-N(CH3)2, -o-Cl
R2: i-propil
R3: etil
Şekil 3.3. Spiro oksindol türevlerinin sentezi 2
3.1.3. Sentez Edilen Maddelerin Analitik İncelemelerinde Uygulanan Yöntemler
3.1.3.1. Kromatografik Analizler
Sentez çalışmaları esnasında reaksiyonların yürüyüşünü izlemek, elde edilen ürünlerin saflık
derecelerini saptamak amacı ile İnce Tabaka Kromatografisinden (İTK) yararlanılmıştır. Bu amaçla
Kieselgel-60 GF254 (Merck) kaplı aluminyum plaklar kullanılmıştır. Lekelerin belirlenmesinde 254 nm
dalga boyundaki UV ışığından yararlanılmıştır. Kolon kromatografisi için silikajel 60, 0.040-0.060 mm
(230-400 mesh) kullanılmıştır.
3.1.3.2. Erime Noktası Tayinleri
Erime noktası tayini, Elektrotermal 9100 kapiller erime noktası cihazı ile yapılmış ve sonuçlar
düzeltilmeden verilmiştir.
3.1.3.3. Spektral Analizler
NMR Spektrumları (1H)
NMR spektrumları, Varian Mercury-400 FT-NMR spektrometresinde gerçekleştirilmiştir.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
Kütle (MASS) Spektrumları
Kütle (Mass) analizleri, LC (Waters, Allience) ve Waters ZQ mikromass MS spektrometresinde,
Elektrosprey iyonizasyon (ESI) yöntemi ile gerçekleştirilmiştir.
3.2. Sentez İşlemlerinde Kullanılan Kimyasal Maddeler
Sentez ve saflaştırma işlemlerinde, 2-kloro benzaldehit (Fluka), 4-nitro benzaldehit (Aldrich),
benzaldehit (Aldrich), (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on (Nantong Baihua BioPharmaceutical Co., Ltd.), oksindol (Aldrich), piperidin (BDH Chemicals Ltd.), 3-metil bütiraldehit
(Aldrich), 4A0 moleküler sieve (Sigma-Aldrich), petrol eteri (Merck), aseton (Fluka), hekzan (SigmaAldrich), etil asetat (Sigma-Aldrich), metanol (Riedel de Haen), toluen (Merck), eter (Merck).
3.3. Sentezlenen Bileşiklerin MDM2 Proteinine Doking Çalışmaları
Sentezlenen yeni p53 agonisti bileşiklerin doking çalışmaları, http://vina.scripps.edu/ internet
sitesinden ücretsiz olarak temin edilen AutoDock Vina 1.2.2 program paketi kullanılarak
gerçekleştirildi.
Bileşiklerin 3-boyutlu yapılarının elde edilmesi ve minimizasyonunun sağlanması için HyperChem 5.1
programı kullanıldı. Bileşiklerin doking işleminin gerçekleştirileceği hedef reseptör olarak seçilen
MDM2 antagonistlerinden olan Nutlin 2 (Şekil 1.13) molekülü ile kristali oluşturulmuş halde
(Vassilev ve ark., 2004) 1RV1 kodu ile Protein Veri Bankası (PDB) web sitesinden
[http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do] pdb formatında temin edildi. MDM2 proteini ile p53 agonisti
ligand AutoDock 4.0 programı kullanılarak birbirinden ayrıldı ve bu yüksek lisans tez çalışmasında
sentezlenmiş olan yeni MDM2 antagonisti bileşiklerin, proteinin ligand bağlanma yöresine doking
işlemi gerçekleştirildi. Bileşiklerin reseptörle farklı konformasyonlardaki etkileşiminin bağlanma
enerjileri karşılaştırıldı ve p53 agonist ligand ile en iyi uyum gösteren konformasyon belirlendi.
Proteinin ligand bağlanma yöresinde, sentezlenen yeni bileşikler ile p53 agonist ligandın üstüste
çakıştırıldığı üç-boyutlu protein-ligand kompleksinin görüntülerini elde etmek için,
[http://www.cgl.ucsf.edu/chimera] internet sitesinden ücretsiz olarak temin edilen UCSF Chimera
moleküler modelleme programı chimera-1.3-win32 kullanıldı.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
4. ANALİZ VE BULGULAR
4.1. Başlangıç Maddelerinin Sentezi
O
R4
R1
Hidrazin Hidrat
O
Wolff-Kishner
redüksiyonu
N
H
R4
O
+
R1
MeOH
CHO
Piperidin
N
H
1
R4
O
N
H
3
2
+
O
O
R1
O
N
R3
O
R4
Toluen
R3
CHO
+
4 A° moleküler sieves
N
H
5
6
7
THF
R2
NH
R2
HO
NH
O
O
R1
N
Pb(OAc)4
R3
O
R4
N
H
8
CH2Cl2-MeOH (1:1)
N
H
4
NH2
+ R2
O
R1
NH
R3
O
R4
N
H
9
EK-11Sonuç Raporu Formatı
R4
O
N
H
R1 CHO
Bileşik
H
O
N
H
O2N
H
NO 2
O
N
H
Cl
Cl
H
O
N
H
Cl
Cl
Cl
H
Cl
O
N
H
CH3
H3 C N
H
H3 C
N
CH 3
O
N
H
OCH3
OCH3
H
O
N
H
EK-11Sonuç Raporu Formatı
H
O
OCH3
O
H3 CO
O
N
H
H3 C S
H
S
CH3
O
N
H
F
H
F
O
N
H
Cl
6-Cl
F
F
Cl
O
N
H
Cl
Cl
Cl
5,6-Cl
Cl
O
N
H
Cl
OCH 3
OCH 3
H
OCH3
O
OCH 3
N
H
Cl
Cl
O
H
N
H
NH
O
N
H
EK-11Sonuç Raporu Formatı
Cl
Cl
6-Cl
O
Cl
N
H
EK-11Sonuç Raporu Formatı
4.1.1. 3-Benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on Sentezi (1)
O
N
H
0,390 g (3 mmol) 1,3-dihidro-indol-2-on, 0,336 ml (3,3 mmol) benzaldehit ve 0,591 ml (6 mmol)
piperidin’den hareketle 3 ml metanol içinde 80°C’de 1,5 saat kaynatıldı. Reaksiyonun yürüyüşü İTK ile
n-hekzan:etil asetat (1:2) solvan sistemi kullanılarak takip edildi. Reaksiyonun sonunda solvan
evaporatörde uçuruldu. Ham madde n-hekzan:etil asetat (2:1) solvan sistemi kullanılarak kolon
kromotografisi ile saflaştırıldı. %40 verimle 0,263g sarı renkli ürün elde edildi. E.N: 164-166°C, lit.
E.N:175-176°C (Wahl ve ark., 1909).
Kütle Spektrumu m/e: 222,27 ( M+H)+(%100).
4.1.2. 3-(4'-Nitro-benziliden)-1,3-dihidro-indol-2-on Sentezi (2)
O 2N
O
N
H
0,390 g (3 mmol) 1,3-dihidro-indol-2-on, 0,498 g (3,3 mmol) 4'-nitrobenzaldehit ve 0,591 ml (6 mmol)
piperidin’den hareketle 3 ml metanol içinde 80 °C’de 1,5 saat kaynatıldı. Reaksiyonun yürüyüşü İTK
ile n-hekzan:etil (1:2) asetat solvan sistemi kullanılarak takip edildi. Reaksiyonun sonunda solvan
evaporatörde uçuruldu. Ham madde n-hekzan:etil asetat (2:1) solvan sistemi kullanılarak kolon
kromotografisi ile saflaştırıldı. %79 verimle 0,663 g kırmızı renkli ürün elde edildi. E.N: 239-242°C,
lit. E.N:245-250°C (Kniess ve ark., 2009).
Kütle Spektrumu m/e: 267,6 ( M+H)+(%100).
EK-11Sonuç Raporu Formatı
4.1.3. 3-(2'-Kloro-benziliden)-1,3-dihidro-indol-2-on Sentezi(3)
Cl
O
N
H
0,390 g (3 mmol) 1,3-dihidro-indol-2-on, 0,463 g (3,3 mmol) 2'-klorobenzaldehit ve 0,591 ml (6 mmol)
piperidin’den hareketle 3 ml metanol içinde 80 °C’de 1,5 saat kaynatıldı. Reaksiyonun yürüyüşü İTK
ile n-hekzan:etil asetat (1:2) solvan sistemi kullanılarak takip edildi. Reaksiyonun sonunda solvan
evaporatörde uçuruldu. Ham madde n-hekzan : etil asetat (2:1) solvan sistemi kullanılarak kolon
kromotografisi ile saflaştırıldı. %84 verimle 0,645 g sarı renkli ürün elde edildi. E.N: 225-232°C, lit.
E.N:142°C (Kniess ve ark., 2009).
Kütle Spektrumu m/e: 256,8 ( M+H)+(%100), 258,8 (M+H+2)+(%33).
4.1.4. 3-(4’-Floro)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on Sentezi (4)
F
O
N
H
0.39 g (3 mmol) oksiindol üzerine, 0.4 g (3.3 mmol) 4-floro benzaldehit ve 0.591 ml (6 mmol)
piperidin ilave edilip 2.6 ml metanol içerisinde çözüldü ve geri çeviren dik soğutucu altında 80 0C’de
1.5 saat refluks edildi. Metanol uçuruldu. Elde edilen ürün Hekzan:EtOAc (4:1) solvan sistemi
kullanılarak kolon kromotografisi ile saflaştırıldı. Sarı renkli bileşik elde edildi.
NMR: (CDCl3) ppm 9.317 (s, 1H, NH), 7.784(s, 1H, H-vin), 7.678, 7.655 (dd, 2H, j=5.6 Hz, j=5.2
Hz, H-2’, H-6’), , 7.595 (d, 1H, j=7.6 Hz, H-4), 7.226 (t, 1H, H-6), 7.167 (t, 2H, H-3’, H-5’), 6.950 (d,
1H, j=7.6 Hz, H-7), 6.880 (t, 1H, H-5).
m/z: 240.08 ( M+H, %100 )
E.N: 241.7-243 0C
EK-11Sonuç Raporu Formatı
4.1.5. 6-Kloro-3-(3’-floro, 4’-kloro)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on Sentezi (5)
Cl
F
O
N
H
Cl
0.50 g (3 mmol) 6-kloro oksiindol üzerine, 0.52 g (3.3 mmol) 3-floro, 4-kloro benzaldehit ve 0.591 ml
(6 mmol) piperidin ilave edilip 2.6 ml metanol içerisinde çözüldü ve geri çeviren dik soğutucu altında
80 0C’de 1.5 saat refluks edildi. Metanol uçuruldu. Elde edilen ürün Hekzan:EtOAc (4:1) solvan
sistemi kullanılarak kolon kromotografisi ile saflaştırıldı. Sarı renkli bileşik elde edildi.
NMR: (DMSO) ppm 10.8 (s, 1H, NH), 8.701 (dd, 1H, , jo=11.6 Hz, jm=2 Hz, jm=1.6 Hz, H-2’),
8.008 (dd, 1H, jo= 8.4 Hz, jm=2 Hz, jm=1.6 Hz, H-3’), 7.854 (s, 1H, H-7’), 7.602 (s, 1H, H-vin), 7.443
(d, 1H, j=8 Hz, H-4), 7.071 (dd, 1H, jo= 7.8 Hz, jm=2 Hz, H-5), 6.847 (d, 1H, j=2 Hz, H-6’).
m/z: 308.99 ( M+H, %100 )
E.N: 241.7-243 0C
4.1.6. 3-(2’,4’-dikloro)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on Sentezi (6)
Cl
Cl
O
N
H
0.39 g (3 mmol) oxindol üzerine, 0.708 g (4.05 mmol) 2,4-dikloro benzaldehit ve 0.591 ml (6 mmol)
piperidin ilave edilip 7.8 ml metanol içerisinde çözüldü ve geri çeviren dik soğutucu altında 80 0C’de
1.5 saat refluks edildi. Metanol uçuruldu. Elde edilen ürün Hekzan:EtOAc (4:1) solvan sistemi
kullanılarak kolon kromotografisi ile saflaştırıldı. Sarı renkli bileşik elde edildi.
NMR: : (CDCl3) ppm, 7.912 ( s, 1H, N-H ), 7.770 ( s, 1H, etilenik H), 7.676 ( d, 1H, jo= 8.4 Hz, H5’), 7.544 ( d, 1H, jm=2, H-3’), 7.348 (dd, 1H, j= 8,4 Hz, j= 1.6 Hz, H-4’), 7.316 (d, 1H, H-7), 7.230 (d,
1H, H-4 ), 6.889 ( d, 1H, H-6 ), 6.851 (d, 1H, H-5)
m/z: 290.8 ( M+, %85 )
E.N: 229-233 0C
EK-11Sonuç Raporu Formatı
4.1.7. 3-(2-metoksi)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on Sentezi (7)
OCH3
O
N
H
0.39 g (3 mmol) oxindol üzerine, 0.549 g (4.05 mmol) 2-metoksi benzaldehit ve 0.591 ml (6 mmol)
piperidin ilave edilip 7.8 ml metanol içerisinde çözüldü ve geri çeviren dik soğutucu altında 80 0C’de
1.5 saat refluks edildi. Metanol uçuruldu. Elde edilen ürün Hekzan:EtOAc (4:1) solvan sistemi
kullanılarak kolon kromotografisi ile saflaştırıldı. Sarı renkli bileşik elde edildi.
NMR: (CDCl3) ppm, 8.36 (br s, 1H, NH), 7.982 (s, 1H, H-vin), 7.738 (dd, 1H, jm= 1.2 Hz, jo=7.6
Hz, H-4), 7.575 (d, 1H, jo=7.2 Hz, H-6'), 7.196 (td, 1H, jm= 1.2 Hz, H-5'), 7.032 (t, 1H, H-5), 6.988
(d,1H, jo=8 Hz, H-3'), 6.893 (d,1H, jo= 8 Hz, H-7), 6.854 (td, 1H, jm= 1.2 Hz, H-4'), 3.884 (s, 3H,
OCH3).
m/z: 252.6 ( M+H, %100 )
E.N: 219-222 0C
4.1.8. 3-(3'-benziloksi-4'-metoksi)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on Sentezi (8)
H3CO
O
O
N
H
0.39 g (3 mmol) oxindol üzerine, 0.981 g (4.05 mmol) 3-benziloksi-4-metoksi benzaldehit ve 0.591 ml
(6 mmol) piperidin ilave edilip 7.8 ml metanol içerisinde çözüldü ve geri çeviren dik soğutucu altında
80 0C’de 1.5 saat refluks edildi. Metanol uçuruldu. Elde edilen ürün Hekzan:EtOAc (4:1) solvan
sistemi kullanılarak kolon kromotografisi ile saflaştırıldı. Sarı renkli bileşik elde edildi.
NMR: (CDCl3) ppm, 8.737 ( d, 1H, jm= 1.6 Hz, H-2'), 7.631 (dd, 1H, , jm= 2 Hz, jo= 8.8 Hz, H-4),
7.542-7.493 (m, 3H, H-2'', H-4'', H-6''), 7.464 (s, 1H, H-vin), 7.394-7.306 ( m, 3H, H-6', H-3'', H-5''),
7.185 (t, 1H, H-6), 7.035 (t, 1H, H-5), 6.946 (d,1H, jo= 8.4 Hz, H-5'), 6.83 (d, 1H, jo= 7.6 Hz, H-7),
5.293 (s, 2H,CH2- benzil), 3.953 (s, 3H, OCH3).
m/z: 358.8 ( M+H, %100 )
E.N: 215-218 0C
EK-11Sonuç Raporu Formatı
4.1.9. 3-(4-metiltiyo)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on Sentezi (9)
H 3C
S
O
N
H
0.39 g (3 mmol) oxindol üzerine, 0.615 g (4.05 mmol) 4-metiltiyo benzaldehit ve 0.591 ml (6 mmol) piperidin
ilave edilip 7.8 ml metanol içerisinde çözüldü ve geri çeviren dik soğutucu altında 80 0C’de 1.5 saat refluks
edildi. Metanol uçuruldu. Elde edilen ürün Hekzan:EtOAc (4:1) solvan sistemi kullanılarak kolon
kromotografisi ile saflaştırıldı. Sarı renkli bileşik elde edildi.
NMR: (CDCl3) ppm, 7.911 ( br , 1H, NH), 7.772 (s, 1H, H-vin) 7.720 (d, 1H, jo= 8 Hz, H-4), 7.624 (d, 2H,
jo= 8.4 Hz. H-3', H-5'), 7.322 (d, 2H, jo= 8.4 Hz. H-2', H-6'), 7.226 ( t, 1H, H-6), 6.922-6.883 (m, 2H, H-5, H-7),
2.560 (s, 3H, SCH3).
m/z: 268.7 ( M+H, %100 )
E.N: 181-184 0C
4.2. Spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin)Türevlerinin Sentezleri
4.2.1. 3',4',8'-Trifenil-6'-izobütil-3',4',8',8'a-tetrahidrospiro[3H-indol-3,7'[1H]pirolo[2,1-c]
[1,4]oksazin]-1',2-(1H)-dion Sentezi (10)
O
O
N
O
N
H
Argon gazı altında 0,1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on, 0,104 g
(4,75 mmol) 3-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on ve 0,0509 ml (4,75 mmol) 3-metil bütiraldehitten
hareketle 5 ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat karıştırıldı.
Reaksiyonun yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak takip edildi. Reaksiyonun
sonunda moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Ham madde n-hekzan:etil asetat
(5:1) solvan sistemi kullanılarak kolon kromotografisi ile saflaştırıldı. Daha sonra (eter: petrol eteri)
solvan sistemi ile kristalizasyon yapıldı. %16 Verimle 0,033 g beyaz renkli ürün elde edildi.
E.N: 127-129°C.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
1
H-NMR Spektrumu:(CDCl3) ppm
7,65 (s, 1H, NH), 7,35- 6,55 ve 6,23 (m, 19H, aromatik protonlar), 6,35 (d, 1H, J= 4,0 Hz, H-3'), 4,81
(d, 1H, J= 4,4 Hz, H-4'), 4,39 (d, 1H, J= 10,8 Hz, H-8'), 4,26 (d, 1H, J= 10,8 Hz, H-8'a), 3,21 (dd, 1H,
CH), 2,08-2,01 (m, 1H, CH2 ), 1,76-1,69 (m, 1H, CH2 ), 1,06-1,04 (m, 1H, CH), 0,81 (d, 3H, J= 6,8 Hz,
CH3), 0.48 (d, 3H, J= 6,0 Hz, CH3).
Kütle Spektrumu m/e: 543,70 ( M+H)+(%100).
4.2.2. 3',4'-Difenil-8'-(p-nitrofenil)-6'-izobütil-3',4',8',8'a-tetrahidrospiro[3H indol 3,7'[1H]
pirolo[2,1-c][1,4]oksazin]-1',2-(1H)-dion Sentezi (11)
O2N
O
O
N
O
N
H
0,1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetrahidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on üzerine 0,126 g (4,75 mmol)
3-(4'-nitro-benziliden)-1,3-dihidro-indol-2-on ve 0,0509 ml (4,75 mmol) izovaleraldehitten hareketle 5
ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat karıştırıldı. Reaksiyonun
yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak takip edildi. Reaksiyonun sonunda
moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Ham madde n-hekzan: etil asetat (5:1) solvan
sistemi kullanılarak kolon kromotografisi ile saflaştırıldı. Daha sonra (eter: petrol eteri) solvan sistemi
ile kristalizasyon yapıldı. % 9 Verimle 0.0207 g açık pembe renkli ürün elde edildi.
E.N: 104-106°C.
1
H-NMR Spektrumu:(CDCl3) ppm
7,60 (s, 1H, NH), 7,89 (d, 2H, J= 8,4 Hz, H-3''), 7,10 (d, 2H, J= 8,4 Hz, H-2''), 7,36- 6,55 ve 6,17 (m,
14H, aromatik protonlar), 6,32 (d, 1H, J= 4,0 Hz, H-3'), 4,80 (d, 1H, J= 4,4 Hz, H-4'), 4,33 (d, 1H, J=
10,8 Hz, H-8'), 4,28 (d, 1H, J= 10,8 Hz, H-8'a), 3,16 (dd, 1H, CH), 2,18-2,11 (m, 1H, CH2 ), 1,75-1,68
(m, 1H, CH2 ), 1,06-1,02 (m, 1H, CH), 0,83 (d, 3H, J= 6,4 Hz, CH3), 0.49 (d, 3H, J= 6,0 Hz, CH3).
Kütle Spektrumu m/e: 588,9 ( M+H)+(%100).
4.2.3. 3',4'-Difenil-8'-(o-kloro fenil)-6'-izobütil-3',4',8',8'a-tetrahidrospiro[3H indol-3,7'[1H]
pirolo[2,1-c][1,4]oksazin]-1',2-(1H)-dion Sentezi (12)
EK-11Sonuç Raporu Formatı
O
O
N
Cl
O
N
H
0,1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetrahidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on üzerine 0,121 g (4,75 mmol)
3-(2'-kloro-benziliden)-1,3-dihidro-indol-2-on ve 0,0509 ml (4,75 mmol) izovaleraldehitten hareketle
5 ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat karıştırıldı. Reaksiyonun
yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak takip edildi. Reaksiyonun sonunda
moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Ham madde n-hekzan : etil asetat (5:1)
solvan sistemi kullanılarak kolon kromotografisi ile saflaştırıldı. Daha sonra (eter : petrol eteri)
solvan sistemi ile kristalizasyon yapıldı. % 5 Verimle 0.0116 g beyaz renkli ürün elde edildi.
E.N: 128-130°C.
1
H-NMR Spektrumu:(CDCl3) ppm
8,43 (s, 1H, NH), 7,54-6,29 (m, 18H, aromatik protonlar), 6,74 (d, 1H, J= 3,6 Hz, H-3'), 4.90 (d, 1H, J=
4,0 Hz, H-4'), 4,78 (d, 1H, J= 10,4 Hz, H-8'), 4,74 (d, 1H, J= 10.4 Hz, H-8'a), 3,33 (dd, 1H, CH), 1,921,85 (m, 2H, CH2), 1,49-1,42 (m, 2H, CH2), 1,03-0,97 (m, 1H, CH), 0.64 (d, 3H, J= 6,4 Hz, CH3), 0.47
(d, 3H, J= 6,0 Hz, CH3).
Kütle Spektrumum/e: 577,9 (M+H)+(%100), 579,9 (M+H+2)+(%40).
4.2.4. N-etil-2'-(2-metilpropil)-1,2-dihidro-1'-[(1R,2S)-2-hidroksi-1,2-difeniletil]- 2-okso-4'-(pnitrofenil)-spiro[3H-indol-3,3'-pirolidin]-5'-karboksamid Sentezi (13)
O2N
HO
O
HN
N
O
N
H
Azot gazı altında, 0,587 g (1 mmol) 3',4'-difenil-8'-(p-nitro fenil)-6'-izobütil-3', 4', 8', 8'atetrahidrospiro[3H indol-3, 7'[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1', 2(1H)-dion üzerine 0,164 g (1,5
EK-11Sonuç Raporu Formatı
mmol) etil amin-HCl ve 0,415 g (2,5 mmol) NaEH ilave edilip 5 ml THF içerisinde çözüldü. Oda
sıcaklığında bir gece karıştırıldı. Elde edilen ürün üzerine doymuş NaCl sulu çözeltisi ilave edildi. Etil
asetatla ekstrakte edildi. Susuz Na2SO4 ile kurutuldu. Süzüldü. Kalan ürün petrol eteri : aseton (2:1)
solvan sistemi kullanılarak kolon kromotografisi ile saflaştırıldı . %45,5 Verimle 0,185 g pembe
renkli bileşik elde edildi.
E.N: 136-139°C.
1
H-NMR Spektrumu:(CDCl3) ppm
7,78 (d, 2H, J= 8,4 Hz, H-3''), 7,54 (s, 1H, NH), 7,52-6,05 (m, 14H, aromatik protonlar), 6,82 (d, 2H,
J= 7,6 Hz, H-2''), 6,65 (s, 1H, NH), 5,28 (s, 1H, pirolidin N-H2), 4,42 (d, 1H, pirolidin N-H1), 4,29 (d,
1H, H-4'), 3,87 (d, 1H, H-5'), 3,59 (d, 1H, CH), 3,37-3,28 (m, 1H, CH2), 3,07-3,00 (m, 1H, CH2), 2,57
(s, 1H, OH), 2,26 (m, 1H, CH2), 1,52 (m, 1H, CH2), 1,11-1,09 (m, 1H, CH), 0,99 (t, 3H, CH3), 0,82 (d,
3H, J= 6,4 Hz, CH3), 0,71 (d, 3H, J= 6,0 Hz, CH3).
Kütle Spektrumu m/e: 634,1 (M+H)+(%100).
4.2.5. 3', 4'-difenil-8'-m-floro, p-floro fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[6-kloro-3H
indol-3, 7' (6'H)-[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion Sentezi (14)
Cl
O
O
N
F
O
Cl
N
H
Argon gazı altında 1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on, 1,463 g
(4,75 mmol) 6-Kloro-3-(3’-floro, 4’-kloro)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on (1) ve 0,509 ml (4,75
mmol) 3-metil bütiraldehitten hareketle 50 ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70
°C’de 48 saat karıştırıldı. Reaksiyonun yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak
takip edildi. Reaksiyonun sonunda moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Ham
madde n-hekzan:etil asetat (5:1) solvan sistemi kullanılarak kolon kromotografisi ile saflaştırıldı.
Daha sonra (eter: petrol eteri) solvan sistemi ile kristalizasyon yapıldı. Beyaz renkli ürün elde edildi.
m/z: 628.18 ( M+, %100 )
E.N: 127-129°C.
NMR:(CDCl3) ppm, 8.694 (s, 1H, NH), 7.333- 6.658, 6.110-6.088 (m, 16H, aromatik saha), 6.302
EK-11Sonuç Raporu Formatı
(d, 1H, j= 4 Hz, CH), 4.787 (d, 1H, j= 4 Hz, CH), 4.216 (d, 1H, j= 10.8 Hz, CH), 4.167 (d, 1H, j= 10.4
Hz, CH), 3.113 (dd, 1H, j= 10.4 Hz, CH), 2.063 (td, 1H, CH2 ), 1.701 (td, 1H, CH2 ), 0.926-0.863 (m,
1H, CH), 0.787 (d, 3H, j= 6.4 Hz, CH3), 0.496 (d, 3H, j= 6.4 Hz, CH3).
4.2.6. 3', 4'-difenil-8'-p-floro fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[3H indol-3, 7' (6'H)[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion Sentezi (15)
F
O
O
N
O
N
H
Argon gazı altında 1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on, 1.135 g
(4,75 mmol) 3-(4’-Floro)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on (1) ve 0,509 ml (4,75 mmol) 3-metil
bütiraldehitten hareketle 50 ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat
karıştırıldı. Reaksiyonun yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak takip edildi.
Reaksiyonun sonunda moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Ham madde nhekzan:etil asetat (5:1) solvan sistemi kullanılarak kolon kromotografisi ile saflaştırıldı. Daha sonra
(eter: petrol eteri) solvan sistemi ile kristalizasyon yapıldı. Açık sarı renkli ürün elde edildi.
m/z: 561.3 ( M+H, %100 )
E.N: 127-129°C.
NMR:(CDCl3) ppm, 7.338- 6.655, 6.215-6.197 (m, 19H, aromatik saha), 6.323 (d, 1H, j= 3.6 Hz,
CH), 4.794 (d, 1H, j= 4.4 Hz, CH), 4.290 (d, 1H, j= 10.8 Hz, CH), 4.207 (d, 1H, j= 10.8 Hz, CH),
3.183 (dd, 1H, j= 10 Hz, CH), 2.082 (td, 1H, CH2 ), 1.706 (td, 1H, CH2 ), 0.899-0.856 (m, 1H, CH),
0.812 (d, 3H, j= 6.4 Hz, CH3), 0.479 (d, 3H, j= 6.4 Hz, CH3).
4.3. Sentezleri Denenmiş Olan Diğer Bileşikler
4.1.10. 3-(4-dimetil amino)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on Sentezi
EK-11Sonuç Raporu Formatı
CH3
H 3C N
O
N
H
0.39 g (3 mmol) oxindol üzerine, 0.603 g (4.05 mmol) 4-dimetil amino benzaldehit ve 0.591 ml (6
mmol) piperidin ilave edilip 7.8 ml metanol içerisinde çözüldü ve geri çeviren dik soğutucu altında 80
0
C’de 1.5 saat refluks edildi. Metanol uçuruldu. Elde edilen ürün Hekzan:EtOAc (4:1) solvan sistemi
kullanılarak kolon kromotografisi ile saflaştırıldı. Sarı renkli bileşik elde edildi.
m/z: 265.6 ( M+H, %100 )
E.N: 235-237 0C
4.3.1. 3-(5-kloro-1H-indol-3-il)-metiliden)indol-2-on Sentezi
Cl
NH
O
N
H
0.39 g (3 mmol) oxindol üzerine, 0.724 g (4.05 mmol) 5-kloro-1H-indol-3-karboksaldehit ve 0.591 ml (6 mmol)
piperidin ilave edilip 7.8 ml metanol içerisinde çözüldü ve geri çeviren dik soğutucu altında 80 0C’de 1.5 saat
refluks edildi. Metanol uçuruldu. Elde edilen ürün Hekzan:EtOAc (4:1) solvan sistemi kullanılarak kolon
kromotografisi ile saflaştırıldı. Sarı renkli bileşik elde edildi.
m/z: 295.1 ( M+H, %100 )
4.3.2. 3-(3,4-dimetoksi)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on Sentezi
OCH 3
OCH3
O
N
H
0.39 g (3 mmol) oksiindol üzerine, 0.672 g (4.05 mmol) 3,4-dimetoksi benzaldehit ve 0.591 ml (6 mmol)
piperidin ilave edilip 7.8 ml metanol içerisinde çözüldü ve geri çeviren dik soğutucu altında 80 0C’de 1.5 saat
refluks edildi. Metanol uçuruldu. Elde edilen ürün Hekzan:EtOAc (4:1) solvan sistemi kullanılarak kolon
EK-11Sonuç Raporu Formatı
kromotografisi ile saflaştırıldı. Sarı renkli bileşik elde edildi.
m\z: 282,1 (M+H, %100).
4.3.3. 3-(2-kloro)-benziliden-6-kloro-1,3-dihidro-indol-2-on Sentezi
Cl
O
N
H
Cl
0.501 g (3 mmol) 6-kloro oksiindol üzerine, 0.567 g (4.05 mmol) 2-kloro benzaldehit ve 0.591 ml (6 mmol)
piperidin ilave edilip 7.8 ml metanol içerisinde çözüldü ve geri çeviren dik soğutucu altında 80 0C’de 1.5 saat
refluks edildi. Metanol uçuruldu. Elde edilen ürün Hekzan:EtOAc (4:1) solvan sistemi kullanılarak kolon
kromotografisi ile saflaştırıldı. Sarı renkli bileşik elde edildi.
m\z: 289 (M+, %100), 291 (M+2H, %70).
4.3.4. 3-(2-kloro)-benziliden-5,6-dikloro-1,3-dihidro-indol-2-on Sentezi
Cl
Cl
O
N
H
Cl
0.606 g (3 mmol) 5,6-dikloro oksiindol üzerine, 0.567 g (4.05 mmol) 2-kloro benzaldehit ve 0.591 ml (6 mmol)
piperidin ilave edilip 7.8 ml metanol içerisinde çözüldü ve geri çeviren dik soğutucu altında 80 0C’de 1.5 saat
refluks edildi. Metanol uçuruldu. Elde edilen ürün Hekzan:EtOAc (4:1) solvan sistemi kullanılarak kolon
kromotografisi ile saflaştırıldı. Sarı renkli bileşik elde edildi.
m\z: 322,9 (M+, %100), 324,9 (M+2H, %95) 326,9 (M+4H, %30).
4.3.5. 3', 4'-difenil-8'-5-kloro-1H-indol-3-il-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[3H indol-3, 7'
(6'H)-[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion Sentezi
H
N
O
O
N
Cl
O
N
H
EK-11Sonuç Raporu Formatı
Argon gazı altında 1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on, (4,75
mmol) 3-(5-kloro-1H-indol-3-il)-metiliden)indol-2-on ve 0,509 ml (4,75 mmol) 3-metil bütiraldehitten
hareketle 50 ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat karıştırıldı.
Reaksiyonun yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak takip edildi. Reaksiyonun
sonunda moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Ancak reaksiyon yürümedi.
4.3.6. 3', 4'-difenil-8'-2,4-dikloro fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[3H indol-3, 7'
(6'H)-[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion Sentezi
O
O
Cl
N
Cl
O
N
H
Argon gazı altında 1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on, (4,75
mmol) 3-(2’,4’-dikloro)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on ve 0,509 ml (4,75 mmol)
3-metil
bütiraldehitten hareketle 50 ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat
karıştırıldı. Reaksiyonun yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak takip edildi.
Reaksiyonun sonunda moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Saflaştırma işlemi
yapılamadı.
4.3.7. 3', 4'-difenil-8'-p-dimetil amino fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[3H indol-3, 7'
(6'H)-[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion Sentezi
N
O
O
N
O
N
H
EK-11Sonuç Raporu Formatı
Argon gazı altında 1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on, (4,75
mmol) 3-(4-dimetil amino)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on ve 0,509 ml (4,75 mmol) 3-metil
bütiraldehitten hareketle 50 ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat
karıştırıldı. Reaksiyonun yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak takip edildi.
Reaksiyonun sonunda moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Saflaştırma işlemi
yapılamadı.
4.3.8. 3', 4'-difenil-8'-2-metoksi fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[3H indol-3, 7' (6'H)[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion Sentezi
O
O
N
H 3CO
O
N
H
Argon gazı altında 1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on, (4,75
mmol) 3-(2-metoksi)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on ve 0,509 ml (4,75 mmol)
3-metil
bütiraldehitten hareketle 50 ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat
karıştırıldı. Reaksiyonun yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak takip edildi.
Reaksiyonun sonunda moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Saflaştırma işlemi
yapılamadı.
4.3.9. 3', 4'-difenil-8'-3-benziloksi, 4-metoksi fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[3H
indol-3, 7' (6'H)-[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion Sentezi
O
O
H 3CO
N
O
O
N
H
Argon gazı altında 1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on,
(4,75
EK-11Sonuç Raporu Formatı
mmol) 3-(3'-benziloksi-4'-metoksi)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on ve 0,509 ml (4,75 mmol) 3-metil
bütiraldehitten hareketle 50 ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat
karıştırıldı. Reaksiyonun yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak takip edildi.
Reaksiyonun sonunda moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Ancak reaksiyon
yürümedi.
4.3.10. 3', 4'-difenil-8'-p-metiltiyo fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[3H indol-3, 7'
(6'H)-[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion Sentezi
H3 CS
O
O
N
O
N
H
Argon gazı altında 1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on, (4,75
mmol) 3-(4-metiltiyo)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on ve 0,509 ml (4,75 mmol)
3-metil
bütiraldehitten hareketle 50 ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat
karıştırıldı. Reaksiyonun yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak takip edildi.
Reaksiyonun sonunda moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Saflaştırma işlemi
yapılamadı.
4.3.11. 3', 4'-difenil-8'-3,4-dimetoksi fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[3H indol-3, 7'
(6'H)-[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion Sentezi
H 3CO
O
O
N
H 3CO
O
N
H
Argon gazı altında 1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on,
(4,75
EK-11Sonuç Raporu Formatı
mmol) 3-(3,4-dimetoksi)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on ve 0,509 ml (4,75 mmol)
3-metil
bütiraldehitten hareketle 50 ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat
karıştırıldı. Reaksiyonun yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak takip edildi.
Reaksiyonun sonunda moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Saflaştırma işlemi
yapılamadı.
4.3.12. 3', 4'-difenil-8'-2-kloro fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[6-kloro-3H indol-3, 7'
(6'H)-[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion Sentezi
O
O
N
Cl
O
N
H
Cl
Argon gazı altında 1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on, (4,75
mmol) 3-(2-kloro)-benziliden-6-kloro-1,3-dihidro-indol-2-on ve 0,509 ml (4,75 mmol) 3-metil
bütiraldehitten hareketle 50 ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat
karıştırıldı. Reaksiyonun yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak takip edildi.
Reaksiyonun sonunda moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Saflaştırma işlemi
yapılamadı.
4.3.13. 3', 4'-difenil-8'-2-kloro fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[5,6-dikloro-3H indol3, 7' (6'H)-[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion Sentezi
O
O
N
Cl Cl
O
Cl
N
H
EK-11Sonuç Raporu Formatı
Argon gazı altında 1 g (3,96 mmol) (2S,3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin-6-on, (4,75
mmol) 3-(2-kloro)-benziliden-5,6-dikloro-1,3-dihidro-indol-2-on ve 0,509 ml (4,75 mmol) 3-metil
bütiraldehitten hareketle 50 ml toluen içerisinde 4 A° moleküler elek ilave edilerek 70 °C’de 48 saat
karıştırıldı. Reaksiyonun yürüyüşü n-hekzan:etil asetat (1:1) solvan sistemi kullanılarak takip edildi.
Reaksiyonun sonunda moleküler elek süzüldü ve solvan evaporatörde uçuruldu. Saflaştırma işlemi
yapılamadı.
4.3.14. N-etil-2'-(2-metilpropil)-1,2-dihidro-1'-[(1R,2S)-2-hidroksi-1,2-difeniletil]-2-okso-4'-(2kloro fenil)-spiro[3H-indol-3,3'-pirolidin]-5'-karboksamid Sentezi
HO
HN
O
Cl
O
N
H
Azot gazı altında, (1 mmol) 3',4'-Difenil-8'-(o-kloro fenil)-6'-izobütil-3',4',8',8'a-tetrahidrospiro[3H
indol-3,7'[1H] pirolo[2,1-c][1,4]oksazin]-1',2-(1H)-dion üzerine 0,164 g (1,5 mmol) etil amin-HCl ve
0,415 g (2,5 mmol) NaEH ilave edilip 5 ml THF içerisinde çözüldü. Oda sıcaklığında bir gece
karıştırıldı. Elde edilen ürün üzerine doymuş NaCl sulu çözeltisi ilave edildi. Etil asetatla ekstrakte
edildi. Susuz Na2SO4 ile kurutuldu. Süzüldü. Kalan ürün de saflaştırma işlemi yapılamadı.
4.3.15. N-etil-2'-(2-metilpropil)-1,2-dihidro-1'-[(1R,2S)-2-hidroksi-1,2-difeniletil]- 2-okso-4'-fenilspiro[3H-indol-3,3'-pirolidin]-5'-karboksamid Sentezi
NH
HO
O
O
N
H
EK-11Sonuç Raporu Formatı
Azot gazı altında, (1 mmol) 3',4'-difenil-8'-fenil-6'-izobütil-3', 4', 8', 8'a-tetrahidrospiro[3H indol-3,
7'[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1', 2(1H)-dion üzerine 0,164 g (1,5 mmol) etil amin-HCl ve 0,415 g
(2,5 mmol) NaEH ilave edilip 5 ml THF içerisinde çözüldü. Oda sıcaklığında bir gece karıştırıldı.
Elde edilen ürün üzerine doymuş NaCl sulu çözeltisi ilave edildi. Etil asetatla ekstrakte edildi. Susuz
Na2SO4 ile kurutuldu. Süzüldü. Kalan ürün de saflaştırma işlemi yapılamadı.
4.3.16. N-etil-2'-(2-metilpropil)-1,2-dihidro-1'-[(1R,2S)-2-hidroksi-1,2-difeniletil]- 2-okso-4'-(3floro-4-kloro fenil)-spiro[6-kloro-3H-indol-3,3'-pirolidin]-5'-karboksamid Sentezi
HO
HN
O
Cl
F
O
Cl
N
H
Azot gazı altında, (1 mmol) 3', 4'-difenil-8'-m-floro, p-floro fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro
spiro[6-kloro-3H indol-3, 7' (6'H)-[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion üzerine 0,164 g (1,5
mmol) etil amin-HCl ve 0,415 g (2,5 mmol) NaEH ilave edilip 5 ml THF içerisinde çözüldü. Oda
sıcaklığında bir gece karıştırıldı. Elde edilen ürün üzerine doymuş NaCl sulu çözeltisi ilave edildi. Etil
asetatla ekstrakte edildi. Susuz Na2SO4 ile kurutuldu. Süzüldü. Kalan ürün de saflaştırma işlemi
yapılamadı.
4.3.17. N-etil-2'-(2-metilpropil)-1,2-dihidro-1'-[(1R,2S)-2-hidroksi-1,2-difeniletil]- 2-okso-4'-(4floro fenil)-spiro[3H-indol-3,3'-pirolidin]-5'-karboksamid Sentezi
EK-11Sonuç Raporu Formatı
HO
HN
O
F
O
N
H
Azot gazı altında, (1 mmol) 3', 4'-difenil-8'-p-floro fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[3H
indol-3, 7' (6'H)-[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion üzerine 0,164 g (1,5 mmol) etil aminHCl ve 0,415 g (2,5 mmol) NaEH ilave edilip 5 ml THF içerisinde çözüldü. Oda sıcaklığında bir gece
karıştırıldı. Elde edilen ürün üzerine doymuş NaCl sulu çözeltisi ilave edildi. Etil asetatla ekstrakte
edildi. Susuz Na2SO4 ile kurutuldu. Süzüldü. Kalan ürün de saflaştırma işlemi yapılamadı.
4.4.Moleküler Modelleme Çalışmaları
Bu yüksek lisans tezinde hazırlanan yeni spiro oksiindol türevi bileşiklerin MDM2 proteinine (1YCR)
bağlanma özelliklerini araştırmak için, AutoDock Vina- 1.2.2 programı kullanılarak moleküler
modelleme (doking) çalışmaları yapılmıştır.
Çizelge 4.1. (1-10) Numaralı bilesiklerin MDM2 proteinine ADT vina kullanılarak yapılan doking
calısmaları sonucunda elde edilen serbest bağlanma enerjileri (G).
Bileşik
No
R1 CHO
1
R4
O
N
H
G
(kcal\mol)
H
-7.3
H
-6.1
3
H
-7.1
4
H
-7.6
2
NO 2
Cl
F
EK-11Sonuç Raporu Formatı
5
F
6-Cl
-7.0
H
-7.3
H
-7.1
H
-6.4
H
-6.3
Cl
Cl
6
Cl
OCH3
7
8
O
OCH3
9
S
CH3
EK-11Sonuç Raporu Formatı
4.4.1. 3-Benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on (1)
O
N
H
Şekil 4.1. Bileşik 1’in MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
4.4.2. 3-(4'-Nitro-benziliden)-1,3-dihidro-indol-2-on (2)
O2 N
O
N
H
Şekil 4.2. Bileşik 2’nin MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
4.4.3. 3-(2'-Kloro-benziliden)-1,3-dihidro-indol-2-on (3)
Cl
O
N
H
Şekil 4.3. Bileşik 3’ün MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
EK-11Sonuç Raporu Formatı
4.4.4. 3-(4’-Floro)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on (4)
F
O
N
H
Şekil 4.4. Bileşik 4’ün MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
4.4.5. 6-Kloro-3-(3’-floro, 4’-kloro)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on (5)
Cl
F
O
N
H
Cl
Şekil 4.5. Bileşik 5’in MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
4.4.6. 3-(2’,4’-dikloro)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on (6)
Cl
Cl
O
N
H
Şekil 4.6. Bileşik 6’nın MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
EK-11Sonuç Raporu Formatı
4.4.7. 3-(2-metoksi)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on (7)
OCH3
O
N
H
Şekil 4.7. Bileşik 7’nin MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
4.4.8. 3-(3'-benziloksi-4'-metoksi)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on (8)
H3 CO
O
O
N
H
Şekil 4.8. Bileşik 8’in MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
4.4.9. 3-(4-metiltiyo)-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on (9)
H3 C S
O
N
H
Şekil 4.9. Bileşik 9’un MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
EK-11Sonuç Raporu Formatı
Çizelge 4.2. (11-16) Numaralı bilesiklerin MDM2 proteinine ADT vina kullanılarak yapılan doking
calısmaları sonucunda elde edilen serbest bağlanma enerjileri (G).
Bileşik
No
10
G
(kcal\mol)
-7.4
11
-7.6
12
-7.5
13
-7.9
14
-8.4
15
-7.4
MI-219
-7.0
4.4.10. 3',4',8'-Trifenil-6'-izobütil-3',4',8',8'a-tetrahidrospiro[3Hindol-3,7'[1H]pirolo[2,1-c]
[1,4]oksazin]-1',2-(1H)-dion (10)
O
O
N
O
N
H
Şekil 4.10. Bileşik 10’nun MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
4.4.11. 3',4'-Difenil-8'-(p-nitrofenil)-6'-izobütil-3',4',8',8'a-tetrahidrospiro[3H indol
3,7'[1H]pirolo[2,1-c][1,4]oksazin]-1',2-(1H)-dion (11)
EK-11Sonuç Raporu Formatı
O
O
O2N
N
O
N
H
Şekil 4.11. Bileşik 11’in MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
4.4.12. 3',4'-Difenil-8'-(o-kloro fenil)-6'-izobütil-3',4',8',8'a-tetrahidrospiro[3H indol3,7'[1H]pirolo[2,1-c][1,4]oksazin]-1',2-(1H)-dion (12)
O
O
N
Cl
O
N
H
Şekil 4.12. Bileşik 12’nin MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
4.4.13. N-etil-2'-(2-metilpropil)-1,2-dihidro-1'-[(1R,2S)-2-hidroksi-1,2-difeniletil]- 2-okso-4'-(p-
EK-11Sonuç Raporu Formatı
nitrofenil)-spiro[3H-indol-3,3'-pirolidin]-5'-karboksamid (13)
O 2N
HO
O
HN
N
O
N
H
Şekil 4.13. Bileşik 13’ün MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
4.4.14. 3', 4'-difenil-8'-m-floro, p-floro fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[6-kloro-3H
indol-3, 7' (6'H)-[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion (14)
Cl
O
O
N
F
O
Cl
N
H
Şekil 4.14. Bileşik 14’ün MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
4.4.15. 3', 4'-difenil-8'-p-floro fenil-6'-izobütil-3', 4', 8, 8'a-tetrahidro spiro[3H indol-3, 7' (6'H)-
EK-11Sonuç Raporu Formatı
[1H] pirolo [2,1-c][1,4] oksazin]-1',2 (1H)-dion (15)
F
O
O
N
O
N
H
Şekil 4.15. Bileşik 15’in MDM2 proteinine doking işlemi sonucunda elde edilen görüntüsü
Sentezlenen Bileşiklerin (11-14) Antikanser Etkilerinin Saptanması*
Sentezlenen spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin) türevlerinin (11-14) kanser hücre hatlarında yarattığı
sitotoksik etki, US National Cancer Institute (NCI) tarafından geliştirilen antikanser aktivite testi
(Sülforadamin B / SRB) ile incelenmiştir (Kerkvliet, 1990; Monks, 1991). NCI-SRB tarama yöntemi
hücresel proteinlerdeki bazik amino asitlere bağlanan Sülforodamin B (SRB) molekülünün gösterdiği
spektrofotometrik değişikliğin ölçülmesine dayanmaktadır. Ölçüm değerleri total protein miktarını
dolayısıyla da canlı hücre sayısını göstermektedir. 96 Kuyulu plaklara kuyu başına 10,000 hücre olacak
şekilde ekilen hücre hatlarına 24 saat sonrasında NCI’ın önerdiği uyarınca ilaç adayları tatbik edilmiş
ve 48 saatlik inkübasyon süreci başlatılmıştır. İnkübasyon sonunda SRB yöntemine göre mevcut
hücrelerin fiksasyonu, boyanması yapılmış ve uygulanan ilaç adaylarının yarattığı inkübasyon
yüzdeleri hesaplanmıştır.
4 Adet spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin) analoğu Huh7 ve MV karaciğer hücre hatlarında ve (S)(+)-Kamptotesin pozitif kontrolüne karşı incelenmiş, farklı konsantrasyonlarda yol açtıkları inhibisyon
yüzdeleri hesaplanmıştır (Şekil 3.17 ve Şekil 3.18). Elde edilen sonuçlara dayalı IC50 değerleri toplu
EK-11Sonuç Raporu Formatı
halde Çizelge 3.1.’de sunulmuştur.
Çizelge 4.3. Sentezlenen bileşiklerin iki farklı kanser hücresi için (Huh7 ve MV) hesaplanan IC50 değerleri.
IC50 Değerleri (μM)
Bileşik
MV
HUH7
Kamptotesin
˂1
˂1
10
48,6
32,1
11
IC50 yok
77,8
12
26,3
36,6
13
14,9
8,2
__________________________________
*
Antikanser etki çalışmaları Bilkent Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü Hücre Biyolojisi Grubu
tarafından yapılmıştır.
MV
1
Şekil 4.17. Kamptotesin (CPT) ve sentezlenen bileşiklerin MV hücre hattı üzerinde hücre büyümesini inhibe
etme yüzdesi bar grafiği.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
Huh7
Şekil 4.18. Kamptotesin (CPT) ve sentezlenen bileşiklerin Huh7 hücre hattı üzerinde hücre büyümesini inhibe
etme yüzdesi bar grafiği.
Sentezlenen Bileşiklerin (1-10, 15,16) Antikanser Etkilerinin Saptanması*
Hepatoselüler karsinoma (HCC) kökenli hücre hattı Huh7, meme kanseri hücre hattı MCF7 ve kolon
kanseri hücre hattı HCT116 Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) ile 96-kuyucuklu kültür
kaplarına her bir kuyucuğa 2000 (Huh7 ve MCF7) ve 3000 (HCT116) hücre düşecek şekilde ekildi. 24
saat enkübe edilen hücrelere sentezlenmiş olan moleküller 40μM, 20μM, 10μM, 5μM, 2.5μM
dozlarında uygulandı. Her inhibitörün her bir farklı dozu 2 kez tekrarlandı. National Cancer Institue
tarafından uygulanan ilaç tarama prosedürü doğrultusunda 3 günlük inkübasyon sonrasında hücre
canlılığının belirlenmesi için hücre içi protein seviyelerini ve dolayısı ile canlı hücre miktarını yansıtan
kolorimetrik bir yöntem olan Sülforodamin B (SRB) yöntemi izlendi. Boyama öncesi 10% TCA
(Trikloroasetik asit) ile 1 saat süre ile fiksasyonu gerçekleştirilen hücreler, SRB ile boyandı. SRB
analizi sonucunda elde edilen ve canlı hücre sayısı ile doğru orantılı olan boya yoğunluğu
spektrofotometrede her bir kuyucuk için okundu. Inhibitörün etkisini incelemek için elde edilen
değerler (1-(inhibitör eklenen kuyucuktaki hücrelerin absorbansı x 100) / (DMSO eklenen kontrol
hücrelerinin absorbansı)) formülüne göre hücre ölümü yüzdesine çevrildi. Doz yanıt eğrileri yardımıyla
IC50 (%50 oranında ölüme neden olan doz) değerleri hesaplandı.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
Çizelge 4.4. Sentezlenmiş olan (1-11) numaralı bileşiklerin üç farklı kanser hücresi için (Huh7, MCF7 ve
HCT116) hesaplanan IC50 değerleri.
IC 50 Değerleri (M)
Bileşik
HUH 7
R2
MCF7
R2
HCT116
R2
1
9.1
0.9
3.2
0.8
6.0
1.0
2
6.5
1.0
5.2
0.8
4.2
0.9
3
11.0
0.9
1.5
0.9
10.5
0.9
4
5.5
1.0
7.1
0.9
6.2
0.9
5
12.6
0.8
1.1
1.0
4.8
0.9
6
4.2
1.0
5.9
0.7
4.5
0.9
7
11.7
1.0
5.8
0.9
10.7
0.9
8
IC50 yok
9
0.4
0.9
6.2
0.9
0.6
0.9
14
1.1
0.9
6.1
0.9
4.7
0.9
15
1.0
0.7
13.0
0.9
7.7
1.0
IC50 yok
IC50 yok
Şekil 4.19. Kamptotesin (CPT) ve sentezlenen bileşiklerin Huh7 hücre hattı üzerinde hücre büyümesini inhibe
etme yüzdesi bar grafiği.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
1
2
3
4
5
6
7
9
10
11
CPT
Şekil 4.20. Kamptotesin (CPT) ve sentezlenen bileşiklerin MCF7 hücre hattı üzerinde hücre büyümesini inhibe
etme yüzdesi bar grafiği.
1
2
3
4
5
6
7
9
10
11
CPT
Şekil 4.21. Kamptotesin (CPT) ve sentezlenen bileşiklerin HCT116 hücre hattı üzerinde hücre büyümesini
inhibe etme yüzdesi bar grafiği.
5. SONUÇ VE ÖNERİLER
Bu çalışmada MDM2 proteini inhibitörü olarak etki göstermesi beklenen spiro(oksiindol-3,3'pirolidin)türevlerinin sentezlenmesi ve MDM2 proteininin inhibisyonunun in vitro incelenmesi
amaçlanmıştır.
Tasarlanan türevleri elde etmek üzere aşağıdaki sentez basamakları uygulanmıştır. Ticari olmayan
başlangıç maddelerinin sentezi literatürde önceden verilen yöntemler ile yapılmıştır. Bunun için 1,3dihidro-indol-2-on ve benzaldehit / p-nitro benzaldehit / o-kloro benzaldehitin piperidin ile metanollü
ortamda kondensasyonu sonucunda 3-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on türevi bileşikler (1-10)
hazırlandı. Başlangıç maddelerinin sentezinden sonra, hedeflenen spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin)
EK-11Sonuç Raporu Formatı
türevleri sentezlendi. Bunun için Argon gazı altında (2S, 3R)-2,3,5,6-tetra hidro-2,3-fenil-1,4-oksazin6-on üzerine 3-benziliden-1,3-dihidro-indol-2-on / 3-(p-nitro- benziliden)-1,3-dihidro-indol-2-on / 3-(okloro-benziliden)-1,3-dihidro-indol-2-on ve izovaleraldehit ilave edilerek toluen içerisinde çözüldü.
Ayrıca reaksiyon ortamına taze aktive edilmiş 4Ao moleküler elek ilave edilerek1,3-dipolar katım
ürünü olan (11-16) bileşikleri elde edildi. Sonraki basamakta, başlangıç maddesi olarak 1,3-dipolar
katım ürünü kullanılmıştır. Sodyum 2-etil hekzanoat katalizörlüğünde THF içerisinde etil amin HCl
ilave edilerek spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin) türevi (14) numaralı bileşik elde edildi.
Elde edilen bileşiklerin saflık ve yapı analizleri, ergime noktası, ince tabaka kromatografisi (İTK),
1
H-NMR, kütle ve elementel analizleri gibi aletsel analizlerle kanıtlandı.
Elde edilen bileşiklerin 1H-NMR spektrumları CDCl3 içerisinde alındı. 1H-NMR spektrumları
incelendiğinde şu noktalar dikkat çekici bulundu.
1- Oksiindol halkasının NH protonları 7,645-8,427 ppm aralığında singlet olarak gözlendi.
2- Spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin)yapısındaki türevlerin aromatik protonları 6,171-7,356 ppm
arasında multiplet olarak gözlendi.
3- Spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin)yapısındaki türevlerin 3', 4', 8', 8'a konumunda yer alan
protonlarda 6,735-4,256 ppm arasında dublet olarak gözlendi.
4- Spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin)yapısındaki türevlerin 6' protonu 3,163-3,332 ppm arasında dd
olarak gözlendi.
5- İzobütil yapısının CH2 protonları prokiral oldukları için hem kendisiyle hem de komşu
karbonların hidrojenleri ile etkileşme göstererek 1,020-2,186 ppm arasında multiplet olarak
gözlendiler.
6- İzobütil yapısının CH protonu 0,969-1,060 ppm arasında multiplet olarak gözlendi.
7- İzobütil yapısının CH3 protonları J= 6,0-6,8 Hz etkileşme değeri ile 0,831-0,473 ppm arasında
dublet olarak gözlendiler.
8- 14 Numaralı bileşikte 11-13, 15,16 numaralı bileşiklerde 8' ve 8a' konumlarında yer alan
protonlarda, halka parçalanması ile birlikte amid oluşumundan kaynaklı gözle görülür
kimyasal kayma olmuştur.
9- 14 Numaralı bileşikte diğer bileşiklerden farklı olarak OH protonu 2,567 ppm de yayvan
singlet olarak gözlendi.
10- Ayrıca 6,651 ppm civarında amid protonu gözlendi. Bununla birlikte amide bağlı CH2 grubu
protonları 3,020-3,367 ppm arasında multiplet olarak gözlendi. Metilene bağlı CH3 grubunun
protonları 0,993 ppm de triplet olarak gözlendi.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
Kütle ve yapı analizleri Elektrospray İyonizasyon (ESI) yöntemi kullanılarak yapıldı.Bütün
bileşiklerde (M+H)+iyonları şeklinde %100 bağıl bollukları ile gözlenmiştir. Cl atomu içeren türev
beklendiği izotop oranları ile gözlenmiştir. Sentezlenen türevlerin elementel analiz sonuçları teorik
olarak hesaplanan değerlerle karşılaştırıldığında, tespit edilen sapma (%0,4) kabul edilebilir sınırlar
içerisinde saptandı ve sentezlenen bileşiklerin kimyasal yapısını ve saflığını kanıtladı.
Sentezlenen bileşiklerin biyolojik etkinlikleri karaciğer kanser hücre hatları kullanılarak, apoptoz
ve hücre ekspresyonu üzerine olan etkileri Bilkent Üniversitesi Fen Fakültesi Moleküler Biyoloji ve
Genetik Bölümü’nde gerçekleştirilmiştir. Bu deneyler ile sentezlenen bileşiklerin IC 50 değerleri ve
tümör
hücrelerini
inhibe
etme
potansiyelleri
(S)-(+)-Kamptotesin
ile
karşılaştırılarak
değerlendirilmiştir.
Huh7 hücre hattında yapılan analizler sonucunda, 11, 12 ve 13 numaralı bileşiklerin IC50
değerlerinin düşük olması, ilaç olarak üzerinde çalışılabileceği konusunda bir fikir vermektedir. 5
numaralı bileşiğin bir sonraki basamağı olan 14 numaralı bileşiğin IC50 değerindeki 9 kat azalma ile bu
bileşiğin, yüksek antikanser
aktivite göstereceği belirlenmiştir. 11, 12 ve 13 numaralı bileşikler
içindeki en yüksek IC50 değeri 12 numaralı bileşiğindir. Bu bileşiğin sonraki basamağı olan 14
numaralı bileşiğin bu kadar düşük IC50 değerinin olması diğer bileşiklerin bir sonraki basamaklarda
daha yüksek antikanser aktivite gösterebilecekleri konusunda fikir vermektedir.
Hazırlanan bileşiklerin MV karaciğer hücre hattında, 12 numaralı bileşiğin inhibisyon yapmadığı
bulunmuştur. Buna karşılık 14 numaralı bileşiğin IC50 değeri 14,9 µM’dır. Bu sonuç da bu bileşiğin
üzerinde çalışılabileceği hususunda yol göstermektedir. 11 ve 13 numaralı bileşiklerin IC50 değerleri
sırasıyla 48,6 µM, 26,3 µM’dır. Bu bileşiklerin düşük IC50 değerinin olması diğer bileşiklerin bir
sonraki basamaklarda daha yüksek antikanser aktivite gösterebilecekleri beklenmektedir.
Bu projede hazırlanan yeni spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin)türevi bileşiklerin MDM2 proteinine
(1YCR) bağlanma özelliklerini araştırmak için, AutoDock Vina- 1.2.2. programı kullanılarak
moleküler modelleme (doking) çalışmaları da yapılmıştır.
Referans bileşik MI-219’un MDM2 proteinine bağlanma yöresi ile sentezlenen bileşiklerin
EK-11Sonuç Raporu Formatı
ligand-protein etkileşimi paralel bir uyum göstermektedir. MI-219 bileşiğinin MDM2 proteinine
bağlanma yöresinde (Shangary ve ark., 2008; Şekil 1.20) yer alan Phe19, Trp23, Leu26, Leu 22
aminoasit kalıntıları, sentezlenen bileşiklerin MDM2 proteinine doking çalışması ile elde edilen ve
reseptöre bağlanma cebinde bulunan aminoasitler ile aynıdır. Dolayısıyla, sentezlenen bileşiklerin
MDM2 proteinine bağlanmasının bu proteinin ligand bağlanma yöresi aracılığı ile olduğunu
düşündürmektedir. Bu durum, gelecekteki çalışmalarımızda serbest bağlanma enerjisi daha güçlü
olabilecek yeni spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin)bileşiklerin tasarlanması/sentezlenmesine yönlendirmesi
bakımından oldukça önemli bir altyapı oluşturmaktadır.
1 Numaralı bileşik Phe91, Ile99, Leu54, Tyr100, 2 Numaralı bileşik Leu54, Gly58, His96,
Ile99, 3 numaralı bileşik Gly58, Ile51, Leu54, Leu57, Ile99, His96, 4 numaralı bileşik Tyr100, His96,
Ile99, Leu54, Phe99, 5 numaralı bileşik Val93, Ile61, Leu57, Ile99, Tyr100, 6 numaralı bileşik His96,
Tyr100, Ile99, Val93, Leu54, Leu57, Ile61, Phe91, Phe86, 7 numaralı bileşik Phe91, Ile99, His96,
Leu57, Ile61, Leu54, 8 numaralı bileşik Ile103, Ile99, His96, Val93, Leu54, Gly58, 9 numaralı bileşik
Val93, Ile61, Met62, 10 numaralı bileşik Gly58, Ile61, Leu57, Leu54, Val93, His96, Tyr100, 11
numaralı bileşik Leu54, Leu57, Tyr100, His96, Val93, Ile61, 12 numaralı bileşik Leu54, Val93, Gln72,
Ile61, Gly58, Met62, 13 numaralı bileşik Leu54, Leu 57, Tyr100, Ile99, His96, Ile61, Val93, 14
numaralı bileşik Phe55, Leu54, Leu557, Tyr100, Ile99, His96, Val93, Gly58, 15 numaralı bileşik
Phe91, Val 93, Lys94, Leu54, Ile61, Gly58, Gln72, 16 numaralı bileşik Gln 72, Ile61, Phe86, Ley57,
Leu 54 His96
amino asit kalıntılarının bulunduğu hidrofobik cep ile etkileşime girmişlerdir. 10
numaralı bileşikte bulunan metiltiyo grubu, diğer bileşiklerden farklı olarak Met62 aminoasit kalıntısı
ile etkileşime girmesine neden olmuşur.
Genel itibarı ile Autodock Vina programının hesapladığı bağlanma enerjileri gaz fazında Van
der Waals ve elektrostatik enerjilerin toplamı olarak verilir ve dolayısı ile bu gaz fazı enerjileri
fizyolojik ortamda bağlanma afinitelerini yansıtmamaktadır. Çalışılan ligandların fizyolojik (37°C, 1
atm, 0.15 M NaCl) ortamda etkileşmelerini incelemek için sulu fazda moleküler dinamik ve MMPBSA (Molecular Mechanics Poisson Boltzmann/Surface Area) (Srinivasan ve ark., 1998) bağlanma
enerji hesaplamalarının yürütülmesi gerekir. Bu da daha sonraki çalışmalarda göz önüne alınacaktır.
Yapılan bu çalışmada, dayanak olarak aldığımız ve antikanser etkisi literatürlerce desteklenen
MI-219 ve orijinal olarak sentezlenen 16 adet spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin) bileşiğinin Autodock Vina
programı ile 1YCR proteini üzerindeki doking etkilerini gösterdik. Elde ettiğimiz bağlanma enerji
EK-11Sonuç Raporu Formatı
sonuçlarına göre sentezlediğimiz yeni bileşiklerin bağlanma enerjileri ile MI-219 bileşiğinin bağlanma
enerjisi arasında büyük farklılıklar olmadığı görülmektedir. Ancak biyolojik deneylerde elde edilen
sonuçların bağlanma enerjileri ile açıklanabilmesi tam olarak mümkün değildir. Çünkü bilindiği gibi
bir ilacın çeşitli kanser hücre tiplerinde (aynı organa bağlı farklı kanser çeşitleri de dahil) farklı
biyolojik aktivite göstermeleri söz konusu olabilmektedir. Örneğin akciğer kanserindeki bir hücre
tipine etkili olabilen bir bileşik pankreas kanserindeki bir kanser türünde etkili olamayabilmektedir.
Bunun nedenlerini araştırmak ve hangi tür protein ile etkileşerek aktivite gösterdiğini belirlemek için
ayrıntılı mekanizma çalışmalarının yapılması gerekmektedir. Daha öncede belirtildiği gibi doking
çalışmaları biyolojik etki konusunda yeterli düzeyde belirleyici olamamaktadır. Doking ile ilgili
kullanılan bir çok program bulunmaktadır. Bu programların hepsi farklı algoritma ve yöntemleri
temelde kullandıkları için doking sonuçları değişiklikler göstermektedir. Ancak, bizim bu tezde
kullandığımız Autodock Vina programı The Scripps Research Institute tarafından geliştirilen ve
sonuçları itibari ile bilim dünyasında çoğunlukla kullanılan ve bugüne kadar daha güvenilir ligandprotein etkileşmelerinin elde edildiği bir doking programıdır. Ancak bu güvenilirlik her zaman
tartışılabilir bir düzeydedir. Bu nedenle bir ön çalışma olarak ele aldığımız doking sonuçlarını yeterli
olarak görmememiz gerektiği için daha güvenilir sonuçlar elde edeceğimiz moleküler dinamik
sonuçlarını ele alacağız. Dolayısıyla MI-219 ile karşılaştırmalı olarak ele aldığımız ligandların
bağlanma enerjileri biyolojik aktivite için açıklayıcı bir veri oluşturmamaktadır. Ancak görülmüştür ki
sentezlediğimiz bileşikler literatürde yer alan MI-219 bileşiğine benzer bir bağlanma şablonu
göstermektedir. MI-219 bileşiği kemik ve prostat kanser hücrelerinde oldukça etkili olmaktadır; bizim
sentezlemiş olduğumuz bileşiklerden (1-9, 15,16) numaralı bileşiklerde biyolojik aktiviteleri üç farklı
kanser hücresinde denenmiştir. (11-14) Numaralı bileşiklerde biyolojik aktiviteleri iki farklı kanser
hücresinde denenmiştir.
Bu bulgular bize gelecekteki çalışma programımıza yönelik katkı sağlayan bilgiler sunmaktadır.
Moleküllerin kanserli hücreler üzerindeki etkilerinin belirlenmesi için en yaygın kullanılan tarama
yöntemi US National Cancer Institute (NCI) tarafından geliştirilen NCI-SRB biyoaktivite tarama
yöntemidir. (Kerkvliet, 1990; Monks, 1991). Bu yöntemin amacı kanserli hücre hatlarında antitümör
aktiviteye sahip olduğu düşünülen yeni maddeleri kısa sürede ve ekonomik bir test ile taramaktır. NCISRB tarama yöntemi hücresel proteinlerdeki bazik amino asitlere bağlanan Sülforodamin B (SRB)
molekülününgösterdiği spektrofotometrikdeğişikliğin ölçülmesine dayanmaktadır.
Bu çalışmada, sentezi yapılan 4 oksiindol analoğu Huh7 ve MV karaciğer hücre hattında (S)(+)-Kamptotesin pozitif kontrolüne karşı incelenmiş, farklı konsantrasyonlarda yol açtıkları inhibisyon
EK-11Sonuç Raporu Formatı
yüzdeleri hesaplanmıştır. Elde edilen sitotoksisite sonuçlarına göre 14 numaralı bileşik HuH7 ve MV
karaciğer hücre hattında en yüksek antikanser aktiviteyi göstermiştir. 11, 12, 13 Numaralı bileşikler
içinde her iki hücre hattında en yüksek antikanser aktiviteyi 8' konumunda bulunan fenil halkasında Cl
atomu içeren 13 numaralı bileşik göstermiştir. Fenil halkasında Cl atomu yerine NO2 grubu geldiği
zaman MV karaciğer hücre hattında aktivitenin kaybolduğu, Huh7 hücre hattında ise aktivenin çok
düştüğü görülmüştür.
Ayrıca bu çalışmada, sentezi yapılan 11 oksiindol analoğu Hepatoselüler karsinoma (HCC)
kökenli hücre hattı Huh7, meme kanseri hücre hattı MCF7 ve kolon kanseri hücre hattı HCT116’nın
farklı konsantrasyonlarda yol açtıkları inhibisyon yüzdeleri hesaplanmıştır. Elde edilen sitotoksisite
sonuçlarına göre, Huh7 hücre hattında 9,15 ve 16 numaralı bileşikler çok yüksek antikanser aktivite
göstermişlerdir. MCF7 hücre hattında ise 1, 3 ve 5 numaralı bileşikler yüksek aktivite göstermiştir.
HCT116 hücre hattında ise 9 numaralı bileşik en yüksek antikanser aktiviteyi göstermiştir. 9 numaralı
bileşik için bir sonraki basamağa geçilirse Huh7 karaciğer kanseri ve HCT116 kolon kanseri hücre
hattında daha yüksek antikanser aktivite gösterebilir. 8 numaralı bileşik ise hiçbir hücre hattında
antikanser aktivite göstermemiştir. 8 numaralı bileşiğin antikanser aktivite göstermemesi
3’
konumunda bulunan benziloksi grubundan kaynaklanmış olabilir.
Antikanser etkisi literatürlerce desteklenen MI-219 ve orjinal olarak sentezlenen 4 adet
spiro(oksiindol-3,3'-pirolidin) bileşiğinin Autodock Vina programı ile MDM2 proteini üzerindeki
doking etkilerini gösterdik. Elde ettiğimiz bağlanma enerji sonuçlarına göre sentezlediğimiz yeni
bileşiklerin bağlanma enerjileri ile MI-219 bileşiğinin bağlanma enerjisi arasında büyük farklılıklar
olmadığı görülmüştür.
Bu bulgular bize gelecekteki çalışma programımıza yönelik katkı sağlayan bilgiler sunmaktadır.
Ayrıca başka hücre hatlarında da aktivite çalışmalarının yapılması düşünülmektedir.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
9. KAYNAKLAR
ARVA, N.C., GOPEN, T.R., TALBOTT, K.E, CAMPBELL, L.E., CHICAS, A., WHITE, D.E.,
BOND, G.L., LEVINE, A.J., BARGONETTI, J. (2005). A Chromatin-associated and
Transcriptionally Inactive p53-Mdm2 Complex Occurs in mdm2 SNP309 Homozygous Cells. J
Biol Chem, 280(29): 26776–26787.
BUYUKBINGOL, E., KLOPMAN, G. (1995). A Novel Aldose Reductase Enzyme Inhibitor,
Spirohydantoinylisatin-1-acetic Acid Derivative. Farmaco, 50: 889-891.
CHIKHI, A., BENSEGUENI, A. (2008). Comparative Study of the Efficiency of
Three Protein-Ligand Docking Programs. J. Proteomics Bioinform., 1: 161 165.
COHEN, N. C. (1996). The Molecular Modeling Perspective in Drug Design, in
Guidebook on Molecular Modeling in Drug Design, Ed. COHEN, N. C., Academic Press, New
York, pp.: 5.
DING, K., LU, Y., NIKOLOVSKA-COLESKA, Z., QIU, S., DING, Y., GAO, W., STUCKEY, J.,
WANG, S. (2005a). Structure-Based Design of Potent Non-Peptide MDM2 Inhibitors. J. Am.
Chem. Soc., 127: 10130-10131.
DING, K., LU, Y., NIKOLOVSKA-COLESKA, Z., WANG, G., QIU, S., SHANGARY, S., GAO, W.,
QIN, D., STUCKEY, J., KRAJEWSKI, K., ROLLER, P. P., WANG S., (2006) Structure-Based
Design of Spiro-oxindoles as Potent, Specific Small-Molecule Inhibitors of the MDM2-p53
Interaction. J. Med. Chem., 49: 3432-3435.
FREEDMAN, D.A., WU, L., LEVINE, J. (1999). Functions of the MDM2 oncoprotein. CMLS, 55: 96107.
HOLT, P. A., CHAIRES, J. B., TRENT, J. O. (2008). Molecular Docking of
Intercalators and Groove-Binders to Nucleic Acids Using Autodock and Surflex. J. Chem. Inf.
Model., 48: 1602-1615.
HONDA, R., YASUDA, H.(2000). Activity of MDM2, a ubiquitin ligase, toward p53 or itself is
dependent on the RING finger domain of the ligase. Oncogene 19: 1473–1476.
ITO, A., LAI, C.,H., ZHAO, X. (2001). P300/CBP mediated p53 acetylation is commantly induced by
p53 activating agents and inhibited by MDM2. The EMBO J, 20(6): 1331-1340.
JAIN, A. N. (2007). Surflex-Dock 2.1: robust performance from ligand energetic
modeling, ring flexibility, and knowledge-based search. J. Comput.- Aided Mol. Des., 21: 281–
306.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
KITCHEN, D. B., DECORNEZ, H., FURR, J. R., BAJORATH, J. (2004). Docking
and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications. Nature reviews.
Drug discovery, 3: 935-949.
KUBBUTAT, M., H., G., JONES, S., N., VOUSDEN, K., H. (1997). Regulation of p53 stability by
MDM2. Nature, 387: 299-303.
LENGAUER, T., RAREY, M. (1996). Computational methods for biomolecular
docking. Curr. Opin. Struct. Biol., 6: 402-406.
LIN, J., CHEN, J., ELENBAAS, B., LEVINE, A.J. (1994). Several hydrofobic amino acids in the p53
amino-terminal domain are required for transcriptional activation, binding to mdm-2 and the
adenovirus 5 E1B 55-kD protein. Genes Dev. 8: 1235-1246.
LU, H., LEVINE, A., J. (1995). Human TAFII 31 protein is a transcriptional coactivator of the p53
protein. Proc Natl Acad. Sci., 92: 5154-5158.
MICHAEL, D., OREN, D.M. (2003). The p53–Mdm2 module and the ubiquitin system. Seminars in
Cancer Biology 13: 49–58.
MORRIS, G. M., GOODSELL, D. S., HALLIDAY, R. S., HUEY, R., HART, W. E.,
BELEW, R. K., OLSON, A. J. (1998). Automated docking using a Lamarckian genetic
algorithm and an empirical binding free energy function, J. Comput. Chem., 19: 1639-1662.
MORRIS, G. M. (2009). Molecular Docking Web. Homepage. Erişim:
http://mgl.scripps.edu/people/gmm/index.html
PARK, H., LEE, J., LEE, S. (2006). Critical assessment of the automated AutoDock
as a new docking tool for virtual screening. Proteins, 65: 549-554.
POSPISIL, P., FOLKERS, G. (2004). Making the Best Account of Molecular
Docking in Drug Design. FABAD J. Pharm. Sci., 29: 81-92.
RODRIGUEZ, M.S., DESTERRO, J.M.P., LAIN, S., LANE, D.P., HAY R.T. (2000). Multiple CTerminal Lysine Residues Target p53 for Ubiquitin-Proteasome-Mediated Degradation.
Molecular And Cellular Biology, 20(22): 8458–8467.
ROTH, J., DOBBELSTEIN, M., FREEDMAN, D., A., SHENK, T., LEVINE, A., J. (1998).
Nucleocytoplasmic shuttling of the HMD2 oncoprotein regulates the levels of the p53 protein
via a pathway used by the human immunodeficiency virus rev protein. EMBO J., 17: 554-564.
EK-11Sonuç Raporu Formatı
SHANGARY, S., WANG, S. (2009). Small-Molecule Inhibitors of the MDM2-p53 Protein-Protein
Interaction to Reactivate p53 Function: A Novel Approach for Cancer Therapy. Annu Rev Pharmacol
Toxicol, 49: 223–241.
SIKORA, A.E. (2011). Small molecule inhibitors of the p53-Mdm2 interaction. Doctor of Natural Sciences.
Max-Planck-Institute for Biochemistry.
SOUSA, S. F., FERNANDES, P. A., RAMOS, M. J. (2006). Protein-Ligand
Docking: Current Status and Future Challenges Proteins, 65: 15-26.
SPITZER, G. M., WELLENZOHN, B., LAGGNER, C., LANGER, T., LIEDL, K. R.
(2007). DNA minor groove pharmacophores describing sequence specific properties. J. Chem.
Inf. Model., 47: 1580-1589.
SUZEN, S., BUYUKBINGOL, E. (2000). Anti-cancer Activity Studies of Indolalthiohydantoin (PIT)
on Certain Cancer Cell Lines. Farmaco, 55: 246-248.
THUT, C., J., GOODRICH, J., A., TIJAN, R. (1997). Repression of p53 mediated transcription by
MDM2: A dual mechanism. Genes Dev., 11: 1974-1986.
TROTT, O., OLSON, A.J. (2010). AutoDock Vina: improving the speed and
accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J.
Comput Chem., 31(2):455-61.
VASSILEV, L.T., VU, B. T., GRAVES, B., CARVAJAL, D., PODLASKI, F., FILIPOVIC, Z.,
KONG, N., KAMMLOTT, U., LUKACS, C., KLEIN, C., FOTOUHI N., LIU, E. A. (2004). In
Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-Molecule Antagonists of MDM2. Science 303:
844.
YANG, S. - T., Wang, H., GUO, L., GAO, Y., LIU, Y., CAO, A. (2008). Interaction
of fullerenol with lysozyme investigated by experimental and computational approaches.
Nanotechnology, 19: 395101. Erişim: http://iopscience.iop.org/ 0957- 4484/19/39/395101.
Download

EK-11Sonuç Raporu Formatı ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL