Laboratorní úloha č. 6
Stabilní transformace suspenzních buněčných kultur Arabidopsis thaliana Ler ekotyp
pomocí Agrobacterium tumefaciens
Cíl laboratorní úlohy
Naučit se pracovat s buněčnou kulturou Arabidopsis thaliana, transformovat ji pomocí
Agrobacterium tumefaciens a v neposlední řadě práci s epifluorescenčním mikroskopem
k vyhodnocení výsledků.
Očekávaný výsledek
Subcelulární lokalizace daných enzymů fúzovaných s GFP v rostlinné buňce.
Teoretický úvod
Agrobacterium tumefaciens je široce rozšířený druh půdní bakterie, infikující
dvouděložné rostliny a tvořící v rostlinných pletivech nádory. Má jedinečnou schopnost
přenosu do jádra a stabilní inkorporace nového genetického materiálu do rostlinných buněk.
Přenášený úsek se nazývá T-DNA (transfer DNA), která je umístěna na Ti plasmidu (tumor
inducing), což je cirkulární plasmidová DNA nacházející se v bakterii. Tato přirozená
schopnost A. tumefaciens měnit rostlinný genom se stala základem transformace rostlin. Dnes
patří mezi nejvíce využívané metody genového inženýrství, zejména pro vysokou účinnost
transformace. Původně se myslelo, že je možné transformovat pouze dvouděložné rostliny,
nicméně metoda byla aplikována i na některé jednoděložné rostliny jako např. rýži či
kukuřici.
T-DNA obsahuje dva typy genů: onkogenní, zahrnující geny pro enzymy syntézy auxinů a
cytokininů, které jsou zodpovědné za tvorbu nádorů a geny pro za syntézu opinů. Tyto
sloučeniny jsou syntetizovány a sekretovány nádory a slouží k výživě bakterie. Mimo T-DNA
region se nachází geny účastnící se přenosu T-DNA (důležité vir geny), opinového
katabolismu aj.
V přírodě je proces infikace A. tumefaciens zahájen malými fenolickými sloučeninami, které
produkuje rostlina při poranění. Ty jsou rozpoznány receptory na bakteriální membráně, čímž
se aktivuje exprese vir genů a spouští se kaskáda reakcí vedoucí až k uvolnění jednovláknové
T-DNA a její přenos do jádra rostlinné buňky. Právě úsek T-DNA bývá nahrazen jakýmikoli
geny, které chceme studovat, spolu s geny pro selekci v rostlinách atd. Nedochází tedy
k vytvoření nádorů a tedy ani k syntéze opinů. Při transformaci se k aktivaci bakterie se
využívá acetosyringon, který se přidá k bakteriální suspenzi před samotným kontaktem
s rostlinou.
1
Zelený fluorescenční protein (GFP, z angl. green fluorescent protein) byl poprvé
izolován před osmi lety z medúzy Aequiria victoriae. Je složen z 238 aminokyselin, má
molekulovou hmotnost 28 kDa a jeho charakteristickou vlastností je emise zelené
fluorescence při vystavení modrému světlu. Divoký typ má excitační maximum při 396 nm a
emisní maximum pak při 504 nm. Chromofor vzniká cyklizací třech a následnou oxidací
postranních řetězců třech aminokyselin (Ser65, Tyr66 a Gly67). Mutacemi na pozici
některých aminokyselin, byla vytvořena nová forma EGFP (enhanced), která má lepší
fluorescenční vlastnosti a je méně škodlivá pro buňky. Excitační maximum tak bylo posunuto
na 488 nm a emisní maximum na 510. Dalšími mutacemi byly odvozeny formy proteinu
emitující světlo ve žluté (YFP) či modré (CFP) části spektra. Příbuzným proteinem je DsRed
izolovaný z mořského korálu (Discosoma), který emituje červenou fluorescenci (558/583).
Jednotlivé proteiny mohou být použity společně ke kolokalizačním experimentům.
V buněčné a molekulární biologii se v současnosti běžně využívá GFP proteinu (a jeho
modifikovaných forem YFP, CFP aj.) jako reportéru genové exprese. Studované proteiny jsou
fúzovány s GFP buď na N- nebo C-konci aminokyselinového řetězce a mohou být pak snadno
v buňkách lokalizovány za použití metod fluorescenční mikroskopie. GFP se také často
využívá k vizualizaci tkání či určitých organel, připojením na specifické promotory či tzv.
protein vazebné domény, díky kterým jsou pak vizualizovány strukturní proteiny nebo
proteinové komplexy. Metoda značení pomocí GFP je velmi jednoduchá, rychlá a ve většině
případů účinná. Nevýhodou může být silné pozadí GFP fluorescence, nízká specifita signálu
či naopak postupné slábnutí signálu např. v případě transientní exprese proteinů. Dále se
využívá ke studiu proteinové dynamiky (FRAP), protein-protein interakce (FRET) či
enzymatické reakce (fosforylace).
Materiál a chemikálie





Ler médium; na 1 litr: 4,4 g Murashige&Skoog medium+vitamins, 3% sacharóza,
hormony: 5 µl kinetin (zás. roztok 10 mg/ml), 100 µl NAA (zás. roztok 10 mg/ml),
pH=5,7 upravit pomocí KOH, poté autoklávovat
LB médium; 1% trypton, 0,5% kvasnicový extrakt, 1% NaCl, pH upraveno na 7,2
pomocí NaOH, autoklávováno, po ochlazení přidat příslušná antibiotika – hygromycin
50 µg/ml, kanamycin 50 µg/ml, rifampicin 25 µg/ml, gentamycin 25 µg/ml, jedná se o
finální koncentrace
100 mM acetosynringon v DMSO (19,62 mg/ml)
Elektrokompetentní kultury Agrobacterium tumefaciens nesoucí dané plasmidové
konstrukty (pSEG33::CAMV35S-GFP, pGWB5::CAMV35S-ZmCKX8-GFP)
7-denní WT (wild type) buněčná kultura Arabidopsis thaliana Landsberg erecta (Ler)
Vybavení a pomůcky
Flow-box, sterilní Erlenmayerovy baňky 50, 250 ml, sterilní falkony 50 ml, sterilní
serologické pipety 25 ml + pipetman, sterilní Pasteurovy pipety 3 ml, UV spektrofotometr,
kyvety, automatické pipety, inkubátor 28°C, třepačka, centrifuga, podložní a krycí skla,
fluorescenční mikroskop.
2
Experimentální postupy
1. Den (pondělí)
a) Pasážování buněčné kultury k transformaci
10 ml 7-denní kultury pipetujeme (pomocí serologických pipet) do 40 ml čistého Ler
média, celkem v osmi opakováních (2 slouží jako rezerva). Umístíme do tmavé místnosti na
třepačku a necháme kultivovat po dobu 2 dnů.
b) Napěstování Agrobacterium tumefaciens nesoucí příslušné plasmidy
Do 20 ml LB média (viz materiál a chemikálie) očkujeme ze zmražené glycerolové
kultury Agrobacterium tumefaciens (pSEG36-GFP – rezistence na kanamycin, pGWB5ZmCKX-GFP – rezistence na hygromycin a kanamycin) a necháme kultivovat při 28°C do
OD600 = 0,5 – 0,8 (dodržet!), většinou je potřeba nechat kultivovat cca 24 h.
2. Den (úterý)
c) Sklizení bakteriální kultury a příprava k transformaci
Kulturu přelejeme do 50 ml falkony, stočíme na centrifuze 4000 g, 10 min. Odstraníme
supernatant a pelet opatrně resuspendujeme pomocí Pasteurovy pipety v 1-2 ml čistého Ler
média. Přidáme acetosyringon na finální koncentraci 100 µM a necháme přes noc třepat při
cca 90 rpm a laboratorní teplotě. Veškerou práci provádíme ve sterilním boxu.
3. Den (středa)
d) Transformace buněčných kultur Arabidopsis thaliana
Do 2-denních buněčných kultur přidáme tří různá množství Agrobacterium tumefaciens
(např. 100, 500 a 1000 µl), budeme tedy mít vždy 3 replikáty od jednoho plasmidového
konstruktu. Necháme kultivovat na třepačce v tmavé místnosti po dobu dvou dnů.
5. Den (pátek)
e) Mikroskopické pozorování transformované kultury
Zkontrolujeme nárůst A. tumefaciens a expresi pod epifluoresncenčním mikroskopem.
Měly by být pozorovatelné shluky tyčinek kolem buněk (tvořící „auru“), v médiu ovšem
minimálně. Po dvou dnech by neměl být GFP signál ještě pozorovatelný, nicméně začínající
exprese se může objevit. V případě, že je kultura již přerostlá a obsahuje tedy hodně buněk, A.
tumefaciens nemá prostor k růstu, je proto zapotřebí začít transformované kultury promývat
čistým médiem a naředit: buněčnou kulturu slejeme do 50 ml sterilní falkony, stočíme na
centrifuze při 700 g, 1 min, při laboratorní teplotě. Supernatant slejeme a odebereme buňky
pomocí Pasteurovy pipety cca po rysku 7, 5 ml, přidáme čisté Ler médium a opatrně
suspendujeme pelet buněk převracením falkony. Pokud je potřeba, provedeme ještě jednou či
3
dvakrát. Pozor! Není ovšem žádoucí vymýt všechno A. tumefaciens, protože transformace je
teprve na počátku.
Totéž provedeme v opačném případě, pokud došlo k přemnožení A. tumefaciens, ale
neodebereme buňky.
Může se stát, že buněk bude hodně, ale nebudeme pozorovat téměř žádné A. tumefaciens.
V takovém případě postupujeme stejně, s tím rozdílem, že po odebrání buněk, vrátíme tentýž
supernatant zpět, abychom zvýšily koncentraci bakterií v médiu.
8. – 12. den (pondělí-pátek)
f)
Mikroskopické pozorování transformované kultury
Transformované kultury opět promyjeme, zkontrolujeme stav buněk, expresi GFP-fúzních
proteinů. Pokud sledujeme již velké množství exprimujících buněk, začneme se postupně
zbavovat A. tumefaciens, promýváním kultury a v dalších dnech již i přídavkem antibiotika
timentinu (250 µg/ml). Poté začneme přidávat selekční antibiotikum na dané plasmidové
konstrukty – kanamycin (15 µg/ml), nebo hygromycin (50 µg/ml).
Vyhodnocení výsledků
Pomocí fluorescenční mikroskopie určit a diskutovat lokalizaci daných enzymů
značených GFP v rostlinné buňce.
pSEG-GFP – samotný GFP protein se nachází v jádře a cytosolu
pGWB5-ZmCKX8 – kukuřičná cytokinin dehydrogenasa je lokalizována ve vakuolách
Správná manipulace s buněčnou kulturou




Pracujeme vždy ve sterilním boxu, používáme rukavice a sterilní gel
Před každým otevřením/uzavřením Erlenmayerovy baňky ožíháme hrdlo nad kahanem
Kulturu nenecháváme stát déle než 30 min, buňky by začaly odumírat, musí být
zachováno kontinuální třepání
Pokud dojde k vylití či potřísnění nádobí v boxu, ihned utřeme a vydezinfikujeme,
zejména pokud již kultury obsahují A. tumefaciens
4
Laboratorní úloha č. 7
Detekce polymorfismu geneticky podmíněného onemocnění metodou alelické
diskriminace pomocí kvantitativního PCR.
Cíl laboratorní úlohy
Pochopit možnost využití metody real-time PCR pro potřeby alelické diskriminace,
tzn. rozlišení jednobodové mutace v neznámém vzorku.
Očekávaný výsledek
Určení typu mutace ve vlastním genomu pro gen kódující chemokinový receptor
leukocytů CCR5, hemokoagulačního faktoru 5 a cystathion-β-synthase.
Teoretický úvod
Zavedení metod kvantitativní PCR do molekulárně-biologických laboratoří přineslo
nejrychlejší způsob jak s vysokou spolehlivostí odhalit jednonukleotidový polymorfismus
v rámci DNA celého genomu. Tato metoda se rychle rozvinula pro detekci geneticky
podmíněných onemocnění v diagnostických laboratořích a v současné době patří mezi
nejpoužívanější. Polymorfismus na úrovní jednoho nukleotidu se dá pomoci kvantitativní
PCR rozlišit dvěma způsoby. Buď se využije velmi citlivé interkalační barvivo, které má
saturační vaznost k DNA např. LC Green a real-time termocyklér s velmi přesnou změnou
teplotního gradientu např. australské firmy Corbett a polymorfismus se pak rozliší pomocí
rozdílného tvaru denaturačních křivek PCR produktu (Liew et al., 2010), nebo se využívá
krátkých nukleotidových fluorescenčně značených prób např. na bázi TaqMan MGB „minor
groove binding“, kdy změna již v jednom nukleotidu v jejich sekvenci výrazně ovlivní třeba
až o 20°C denaturační teplotu (Obrázek č. 1) při jejich vazbě na DNA templát (Kennedy et
al., 2006). Vhodným navržením amplikonu, primeru či próby lze dosáhnou rozlišení
jednobodové mutace a určit zda je daný vzorek na polymorfismus homozygot či heterozygot.
Obrázek č. 1: Návrh diskriminační MGB próby pro rozlišení mutace G1691A v genu pro
lidský hemokoagulační faktor V pomocí softwaru PRIMER EXPRESS 3.0.1 firmy Applied
Biosystems.
5
V současné době kdy lze získávat relativně levně a rychle informace o celém genomu
konkrétního jedince, se plní veřejně dostupné databáze mapami polymorfismů, u kterých je
vysoká penetrace v populaci. Zaměřeným výzkumem se pak zjišťuje, které polymorfismy
(mutace) mohou souviset s geneticky podmíněným onemocněním.
V této úloze budeme detekovat přítomnost wild-type (WT) alel a alel mutovaných (MT) pro
polymorfismy následujících onemocnění:
CCR5 - mutace v genu pro chemokinový receptor leukocytů CCR5, která se vyskytuje u
kavkazoidní rasy s 16% penetrací v heterozygotní formě a s 2% penetrací ve formě
homozygotní. Nedávným výzkumem bylo zjištěno, že nositelé této mutace v homozygotní
formě jsou imunní vůči viru HIV a tato mutace se zřejmě ustálila v populaci pravděpodobně i
díky tomu, že zaručovala v dřívějších dobách rezistenci vůči bakterii moru (Galvani a Slatkin,
2003). Pomocí standardních Taqman prób rozlišíme 32bp deleci v genu CCR5.
Faktor V – detekce Leidenské mutace hemokoagulačního faktoru 5, při kterém je zvýšená
krevní srážlivost projevující se trombózami žil dolních končetin s rizikem následné plicní
embolie. Prevalence této mutace v populaci je až 5%, nejčastěji G1691A, přičemž u
heterozygotních jedinců je riziko žilní trombózy 5-10x zvýšené oproti zdravým jedincům,
kdežto u homozygotů na tuto mutaci je riziko 80-100 násobné. Pomocí Taqman MGB próby
rozlišíme záměnu G/A bází na pozici 1691 s nejvyšší penetrací v kavkazoidní rase (cca 8%).
CBS – mutace v cystathion-β-synthase, enzymu podílejícím se na trans-sulfurylaci
homocysteinu na cystathionin v metabolismu cysteinu. Mutace genu tohoto enzymu vede
k narušení metabolismu vitaminů B6, B12 a kyseliny listové vedoucí k hromadění
homocysteinu. Homozygotní jedinci trpí závažným recesivním onemocněním
hyperhomocysteinemii projevující se mentální retardací a silnou aterosklerózou.
Heterozygotní jedinci s mutací v tomto genu způsobující hyperhomocysteinemii mají vyšší
riziko vzniku kardiovaskulárních chorob, onemocnění kostí a vzniku neuropsychických
onemocnění jako je Alzheimer nebo schizofrenie (Shih et al., 1995). Frekvence nejčastější
mutace v evropské populaci I278T (T833C) se pohybuje kolem 1.5%.
Izolaci lidské genomové DNA lze provést z jakéhokoli materiálu obsahujícího buňky
s jádrem. Nejčastěji je DNA izolována z nesrážlivé periferní krve, kde se nachází
v leukocytech. Kvalitní DNA dostatečnou pro účely PCR amplifikace lze získat i izolací ze
stěru bukální sliznice, který je neinvazivní a odběr lze udělat bez jakéhokoli rizika přímo
v laboratoři.
Vybavení
Real-time termocykler StepOnePlus firmy Applied Biosystems, který je vhodný pro metodu
založenou na amplifikaci s diskriminační próbou rozpoznávají daný polymorfismus,
mikrocentrifuga na ependorfky.
6
Materiál a chemikálie
TaqMan genotyping master mix (Life Technologies), Chelex (BioRad), TaqMan MGB či
standardní próby a primery (Life Technologies) viz tabulka č. 1, FTA kartičky s reagenciemi
(Whatman), TE pufr, sterilní deionizovaná destilovaná voda,
Tabulka č. 1: TaqMan próby a primery pro detekci jednotlivých polymorfismů
CCR5 – chemokinový receptor leukocytů
Próba/primer označení Sequence
Alela
CCR5WT
CCR5MT
CCR5fw
CCR5rev
WT
MT
WT/MT
WT/MT
VIC-ACAGTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTTCCAGCCAG-NFQ
FAM-CTCATTTTCCATACATTAAAGATAGTCATCTTGGCTTG-NFQ
5´-TTCATTACACCTGCAGCCTGCAG-3´
5´-CGGCAGGACCAGACCA-3´
Faktor V – hemokoagulační faktor
Próba/primer označení Reportér
VIC-CCTGGACAGGCGAG-NFQ-MGB
FRVWT
FAM-CCTGGACAGGCAAG-NFQ-MGB
FRVMT
5´-GCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTC-3´
FRVfw
5´-CCAGCTTTTGTTCTCATCAAACA-3´
FRVrev
CBS – cystathion-β-synthasa
Próba/primer označení Reportér
VIC-ATGCAGGATCATTG- NFQ-MGB
CBSWT
FAM-ATGCAGGATCACTG- NFQ-MGB
CBSMT
5´-CCAGGAAGCTGAAGGAGAAGTG-3´
CBSfw
5´-TCCGGCTCTGCGAGGAT-3´
CBSrev
Alela
WT
MT
WT/MT
WT/MT
Alela
WT
MT
WT/MT
WT/MT
běžný laboratorní plast, stěrové tampóny, mikrozkumavky pro real-time PCR s optickými
víčky, centrifuga na ependorfky, stripy a destičky, plast pro real-time PCR termocyklér
StepOnePlus, pipety, vortex.
Experimentální postupy
Izolace genomové DNA
a) z buněk bukální sliznice:
Stěrový tampón se vloží do dutiny ústní kde se jím důkladně otřou vnitřní strany tváří a
záhyby mezi dásněmi a to pohybem dopředu a dozadu (jako při čištění zubů) za přiměřeného
tlaku. Tamponem se zároveň otáčí, aby byla plně využita celá jeho plocha. Pro úspěšný odběr
je vhodné otírat sliznici minimálně 1 minutu a zároveň se vyvarovat slin, které jsou
nežádoucí! Stěr provedeme tak, abychom se vyhnuli případné kontaminace! Tampón ihned
ponoříme do ependorfky s 1 ml sterilní vody a inkubujeme při pokojové teplotě po dobu 20
min za občasného promíchávání. Poté tampón vyjmeme a roztok s uvolněnými buňkami
centrifugujeme při 14 000 rpm po dobu 3 min. Supernatant odstraníme a peletu buněk
rozpustíme vortexováním v 5% roztoku chelexu. Následnou inkubací při 56 °C se zbavíme
zbytků buněk, proteinů a pevných částic, které se navážou na kuličky chelexu. Poté vzorek
7
zahřejeme na 99 °C pro degradaci zbylých proteinů. Následně vzorek centrifugujeme při 14
000 rpm po dobu 3 min, čímž dojde k rozdělení vzorku do dvou fází – horní vodné, obsahující
genomovou DNA, a spodní, obsahující suspenzi chelexu. Horní fázi s DNA přeneseme do
čisté ependorfky.
b) z kapilární krve:
Jako alternativní zdroj pro izolaci genomové DNA může sloužit kapilární krev odebraná
z bříška prstu. Kapka krve se nanese na FTA kartičku (Whatman) a nechá se zaschnout.
Následně se z kartičky pomocí perforovacího pera o průměru 1,2 mm připraví disky
obsahující genomovou DNA. Z disků se genomová DNA purifikuje jednoduchým promytím
20 μL činidla FTA Purification Reagent (Whatman) a následnou elucí 20 μL 1×TE pufru.
Kvantitativní real-time PCR
1. Primery a próby
Jako reportér WT alely použijeme na 5’ konci fluorescenční značku VIC a 6-FAM pro
mutovanou (MT) alelu. Jako zhášeč použijeme v obou případech nefluorescenční zhášeč
(NFQ, non fluorescent quencher) s krátkou sekvencí MGB (minor groove binder) na 3’ konci.
Princip použití fluorescenčních prób ilustruje obrázek č. 3. Próby i primery použijeme
komerčně syntetizované (Life Technologies).
Obrázek č. 3: Mechanismus průběhu PCR při použití dvou fluorescenčních prób pro
alelickou diskriminaci v kvantitativní PCR.
8
2. Nastavení reakcí
Pro přípravu reakcí o objemu 10 μL použijeme mikrozkumavky s optickými víčky.
Pipetujeme 5 μL 2x TaqMan Genotyping Master Mix, primery do finální koncentrace 900
nm, TaqMan MGB próby do finální koncentrace 250 nm a 0,5 μL připravené genomové DNA
(platí pro oba izolační postupy). Zkumavky dobře uzavřeme, centrifugujeme a vložíme do
StepOnePlus termocykléru. Cyklování reakcí nastavíme dle následujícího postupu: počáteční
denaturace 10 min při 95°C a následně 40 cyklů denaturace 15 s při 95°C a annealing/extenze
1 min při 60°C.
Vyhodnocení
Provedeme analýzu získaných dat pomocí softwaru StepOnePlus genotyping, který je
dostupný na počítači sbírající data z termocykléru. Výsledkem je histogram clusteringu
fluorescenčních signálů napříč vzorky viz obrázek č. 2.
Obrázek č. 2: Clustering jednotlivých vzorků se může lišit podél osy horizontální (Alela 1),
horizontální (Alela 2) nebo diagonální (obě alely). Černé body jsou negativní kontroly.
Ostatní body diagramu jsou vzorky se zásadním nárůstem fluorescence viz tabulka č. 2.
Odlišnost ve fluorescenci jednotlivých vzorků je výsledkem míry intenzity fluorescence
reportérové barvy po PCR amplifikaci. Korelaci mezi fluorescenčními signály z obrázku č. 2
popisuje tabulka č. 2.
Tabulka č. 2: Fluorescence v závislosti na amplifikované sekvenci ve vzorcích
Zásadní nárůst fluorescence u následující
proby…
Výhradně VIC- fluorescenčně značená próba
(červená)
Výhradně FAM-fluorescenčně značená próba
(modrá)
VIC i FAM fluorescenčně značená próba (zelená)
9
…znamená, že vzorek
je:
Homozygot na Alelu 1
Homozygot na Alelu 2
Heterozygot pro Alelu 1 i
2
Výsledkem pro každý vzorek tedy je zjištění přítomnosti jedné nebo obou alel pro daný
polymorfismus.
Závěr
V této úloze jsme za pomocí real-time kvantitativní PCR s fluorescenčně značenými próbami
detekovali polymorfismy geneticky podmíněných onemocnění (metodou alelické
diskriminace). Díky této metodě v kombinaci s jednoduchým odběrem biologického materiálu
stěrem z bukální sliznice nebo odběrem kapilární krve bylo možné tyto onemocnění detekovat
rychle, efektivně a neinvazivně. Obdobný postup se rutinně používá v rozličných
diagnostických laboratořích, kde princip zůstává stejný, liší se pouze fluorescenční značení
jednotlivých používaných prób a samozřejmě jejich sekvence dle detekovaného
polymorfismu.
Literatura:
Andrews LB, Curtis WR (2005) Biotechnol Prog 21, 946-952.
Bechtold N, Ellis J, Pelletier G (1993) C R Acad Sci Paris 316,1194-1199.
Galvani AP, Slatkin M (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100, 15276-15279.
Horsch R, Fry J, Hoffmann N, Wallroth M, Eichholtz D, Rogers S, Fraley R (1985) Science
227, 1229-1231.
Hruz T, Laule O, Szabo G, Wessendorp F, Bleuler S, Oertle L, et al. (2008) Adv Bioinform
420747.
Hunter CS, Neill SJ (1990) Methods Mol Biol 6, 279-288.
Forreiter C, Kirschner M, Nover L (1997) Plant Cell 9, 2171-2181.
Kennedy B, Arar K, Reja V, Henry RJ (2006) Anal Biochem 348, 294-299.
Liew M, Wittwer C, Voelkerding KV (2010) J Mol Diagn 12, 731-738.
McGall GH, Christians FC (2002) Adv Biochem Eng Biotechnol 77, 21-42.
Shih VE, Fringer JM, Mandel R (1995) Am J Hum Genet 57, 34-39.
Simon SA, Zhai J, Nandety RS, McCormick KP, Zeng J, et al. (2009) Annu Rev Plant Biol
60, 305-333.
Yansong M, Liwen J (2007) Nature Prot 2, 2348-2353.
10
Download

nové úlohy