Fluorospektrometr NANODROP ND-3300
Návod na obsluhu v 2.8
Obsah
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Přehled ............................................................................................................................. 2
Úvodní nastavení ............................................................................................................. 3
Provoz .............................................................................................................................. 4
Vytvoření/editace metod................................................................................................. 6
Profilování fluorescence ................................................................................................. 6
Obecné modulové funkce ............................................................................................... 7
Kvantifikace NK ............................................................................................................. 8
Kvantifikace proteinů ..................................................................................................... 9
Ostatní fluorofory ........................................................................................................... 9
Archivace a práce s daty ................................................................................................ 9
Kontrola zdroje ............................................................................................................. 10
Problémy ........................................................................................................................ 10
Údržba a záruka............................................................................................................ 11
1/11
1.
Přehled
Thermo Scientific Nanodrop ™ 3300 Fluorospektrometr využívá patentovanou technologii
retence vzorků (povrchové napětí) k měření fluorescence v malém objemu. Unikátně čistá
optika retenčního systému, v kombinaci s vhodným zpracováním signálu pro bílé LED
diodové aplikace, umožňuje měření vzorku v široké škále vlnových délek pouze v 1 – 2 µl
objemu bez použití kyvety a nákladné výměny filtrů.
Excitační zdroj vychází z jedné ze tří elektroluminiscenčních diod v pevném stavu, které jsou
orientovány kolmo k detektoru. 2048 - složka CCD pole detektoru (400 - 750 nm) je
propojena optickým vláknem k povrchu optického měření. Spektrometr je konfigurován
s filtrem, který slouží k eliminaci světelného šíření pod 395 nm. Na obrázku níže jsou
uvedeny některé společné fluorofory, které mohou být měřeny na přístroji Nanodrop 3300
spolu s nejvhodnější excitací LED diody.
UV LED max=365 nm; equipped with cut
filter that eliminates excitation above 400
nm.
Example Applications:
• GFP wt Em509
• Quinine Sulfate Em450
• Hoechst 33258 Em450
• 4-MU Em450
• Q Dots various
Blue LED max= 470 nm; equipped with cut
filter that eliminates excitation above 495
nm.
Example Applications:
• GFP wt Em509
• EGFP Em509
• FITC-FAM Em515
• Alexa 488 Em520
• PicoGreen Em525
• RiboGreen Em525
• Alexa 555 Em565
• B-Phycoerythrin
Em575
• Q Dots various
White LED range= 460-650 nm; uses virtual
filtering.
Example Applications:
• Cy3, Alexa 555 Em565
• Alexa 568 Em600
• Cy5, Alexa 647 Em667
• Sulforhodamine 101
Em 600
• 5-CMTREm570
• Q Dots various
• TET Em535
• HEX Em555
Virtuální filtrování - bílé LED diody
Abychom excitovali širší spektrum fluoroforů (rozsah od 460 do 650 nm), je vybrán zdroj bílé
LED diody. Bílá LED dioda je složena z modré LED diody a žluto-oranžového fosforu, který
je excitován modrou LED diodou, tak aby dal přibližně bílé spektrum (typicky namodralého
vzhledu). Virtuální filtrace: jako referenční spektrum je brána mapa intenzit vlnových délek
2/11
bílé LED diody žlutého píku, měření vzorku, a pak matematicky stanoven reprezentativní
vzorek signálu z celkového signálu.
Zbytkový signál (s odstraněným pozadím) je vypočítán a zobrazen přes příslušné vlnové
délky, které jsou určeny virtuálním emisním filtračním intervalem (∆λ). ∆λ je symetricky
aplikován okolo vybrané analýzy nm (emisní vlnová délka). Všechna fluorescenční čtení
mimo interval virtuálního filtru jsou nastavena na nulu.
2.
Úvodní nastavení
Software NANODROP funguje pouze na IBM PC kompatibilních počítačích s těmito
minimálními vlastnostmi:
• Windows 2000, XP, Visa (pouze 32 bit), Windows 7 Professional (32 a 64 bit)
• 233 MHz nebo vyšší procesor
• CD ROM
• 1GB RAM pro 32 bit a 2 GB pro 64 bit systém
• 40 MB volného místa na disku
• Dostupný USB port
Instalace
Software je nutné nainstalovat před připojením přístroje. Při jeho instalaci se řiďte pokyny na
obrazovce počítače, které Vás instalací vedou.
Potom připojte zdroj energie a propojte USB kabel. Opět proběhne instalace ovladačů, při
které se řiďte pokyny na obrazovce. Síťový zdroj zůstává zapojen trvale, spotřeba představuje
asi 5W.
Registrace
Prosím registrujte se na www.nanodrop.com. Rádi Vás budeme informovat o novinkách
v souvislosti s Vaším přístrojem.
3/11
3.
Provoz
Základní kroky jsou popsány níže:
1. S otevřeným horním ramenem
napipetujte na spodní část vzorek.
2.
Přiklopte
horní
rameno
a proveďte inicializační krok
pomocí
PC
softwaru.
Automaticky se vytvoří sloupec
vzorku mezi horním ramenem
a spodní částí. Měření je hotové.
3. Jakmile
otevřeme
a otřeme
buničinou,
vlákna
je měření hotové,
výkyvné
rameno
obě části suchou
která nezanechává
Po ukončení každého měření běžně postačuje otřít obě ramena buničinou. Po proměření
většího množství vzorků ovšem doporučujeme otřít i povrch přístroje kolem ramen. Po
posledním měření rovněž doporučujeme otřít povrchy neionizovanou vodou.
Pokud je nutná dekontaminace povrchů je možné ji provést například 0,5% roztokem
chlornanu sodného nebo jinými přípravky (viz dále).
U bílkovin a roztoků obsahujících surfaktanty může dojít k tomu, že u maloobjemových
vzorků 1ul se objeví problémy s vytvářením sloupce mezi rameny. Řešením je otřít povrch
obou ramen 30-40x pomocí buničiny. Vlastnosti povrchů se opět upraví a sloupec se bude
vytvářet bez problémů. Pokud ve výjimečných případech problém přetrvává i dále, řešením je
použití nekonstitučního přípravku PR-1.
Problematické může být měření u nehomogenních roztoků nukleových kyselin. Příkladem
jsou genomická DNA, fágová DNA a viskózní roztoky dalších nukleových kyselin. Řešením
je zahřátí vzorků na 55°C a intenzivní protřepání (vortexing).
Běžně nedochází v průběhu měření k takové míře odpařování, která by měření ovlivnila.
U vysoce těkavých rozpouštědel, jako je hexan, může v průběhu měření dojít k odpaření
vzorku. Úspěšně lze používat méně těkavá rozpouštědla, jako např. DMSO.
V případě potřeby lze vzorek opět odsát z povrchu ramen pomocí pipety.
4/11
Aplikační moduly
Software Nanodrop umožňuje řadu režimů, které byly připraveny pro potřeby laboratorních
pracovníků. Budou probrány postupně.
•
Kvantifikace NK - 33258 Hoechst dye, PicoGreen® dye, RiboGreen® dye, Quant-it™
DNA HS a Quant-It™ DNA BR metody.
•
Kvantifikace proteinů - Quant-iT™ Protein, Fluorescamine, Fluoraldehyde™ OPA, a
FluoroProfile™ assays.
•
Ostatní fluorofory - FITC (Fluorescein) (metody užívající buď Modrou nebo Bílou
LED), Cy3-Alexa Fluor® 555 a Cy5-Alexa Fluor® 647, 4-methyl umbelliferone,
quinine sulfate, DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 633, DyLight 649
a DyLight 680.
Create/Edit Method
Umožňuje vytvářet a editovat metody
Fluorescence Profiler
Je určen pro výběr excitace LED diody.
Data Viewer
Tento modul umožňuje uživateli pracovat s naměřenými daty.
User’s Manual
.pdf verze podrobného manuálu v AJ.
User Preferences
Umožňuje základní nastavení pro každého uživatele.
Source Check
Tento mudul se požívá k ověření, zda LED diody fungují správně.
Account Management
Tento modul umožňuje řízení přístupových práv k datům. Toto může provádět pouze
administrátor.
Existují 3 typy uživatelských účtů:
Hladina 10 – nejvyšší, může zavádět nové uživatele, upravovat jejich data, vymazat je a určit
přístupová hesla. V okamžiku instalace má úroveň 10 pouze Administrátor, jehož heslo je
NANODROP. Doporučujeme toto heslo změnit. Každý uživatel může obdržet tuto úroveň
bezpečnosti, ovšem nedoporučujeme to.
Hladina 5 – doporučeno pro běžného uživatele. Jeho účet je chráněn heslem a data jsou
ukládána v jeho podadresáři.
Hladina 0 – umožňuje provádět měření každému uživateli pod jménem DEFAULT. Účet není
chráněn heslem.
V rámci tohoto modulu je rovněž možné měnit heslo. Administrátor určí, zda a kdy budou
jednotlivá hesla exspirovat
5/11
4.
Vytvoření / editace metod
Každá metoda má svůj název jak pro inherentní fluorofory (např. FITC) a take pro aplikace
(např. PicoGreen).
Pět tlačítek ve spodní části seznamu metod v Editoru metod umožňují konfigurovat, měnit,
přesouvat a ukládat nové metody. Poznámka: Kosočtverce označují předdefinované metody,
které nemohou být modifikovány.
5.
Profilování fluorescence
Modul Profilování fluorescence byl navrhnut, aby umožnil uživateli zjistit excitační
zdroj/emisní profil specifických nebo neznámých fluoroforů.
Následující okna se objeví po vyběru tohoto modulu v hlavním menu:
Jako první se proměří blank. Po změření blanku se automaticky zobrazí další okno.
6/11
Dále se setře blank ubrouskem a nanese 1-2 ul požadovaného vzorku. Klikne se na tlačítko
MEASURE, aby se automaticky vyexcitoval vzorek postupně třemi LED diodami a poté se
zobrazí jejich příslušné emisní profily. Pozn.: Pro detekci je min. 30 RFU.
Software automaticky vybere LED diodu, která poskytuje největší RFU signál. Pokud se
vygeneruje fluorescenční signál více než jedna LED dioda, může si uživatel uložit více metod.
6.
Společné funkce
•
Blank (F3)
Před fluorescenčím měřením je nutné nahrát blank. Není nutné měřit blank před každým
měřením.
•
Measure (F1)
Tlačítko umožňuje měřit vzorky.
•
Re-blank (F2)
Tlačítko umožňuje nahrát nový blank a také zobrazí přepočítaná poslední měření s tímto
novým blank.
7/11
•
Print Screen (F4)
Tlačítko umožňuje vytisknout aktuální obrazovku.
•
Print Report (F5)
Tímto tlačítkem se vytiskne existující report vzorku.
•
Recording (F6)
Umožňuje nahrát formát reportu.
•
Show Report (F7)
Zobrazí požadovaný report měření.
•
View Standard Curve
Zobrazí standardní křivku.
•
Open Protocol
Otevře protokol metody.
•
Reset Window
Kliknutím smažete aktuální měření.
•
Method
Jaká metoda je vybrána.
•
Source
Zobrazuje, který zdor metoda využívá.
•
Measurement Type
Zobrazuje výběr typu měření.
•
Sample ID
Název vzorku.
7.
Kvantifikace Nukleových kyselin
Předdefinované metody
Je zde předdefinováno 6 aplikací, ve kterých se měří koncentrace nukleových kyselin:
•
•
•
•
•
•
dsDNA 33258 Hoechst dye
dsDNA PicoGreen® dye
Quant-It™ DNA BR
Quant-It™ DNA HS
RNA RiboGreen® dye
Sybr® Green I
8/11
8.
Kvantifikace proteinů
Předdefinované metody
Jsou zde předdefinovany 4 aplikace, ve kterých se měří koncentrace proteinů:
•
•
•
•
9.
Fluorescamine
FluoroProfile®
Fluoraldehyde™ OPA
Quant-iT™ Protein
Ostatní fluorofory
Zde je předdefinováno 11 metod:
Modré LED metody:
Fluorescein, FITC, FAM
•
DyLight 488
•
UV LED metody:
•
DyLight 405
•
Quinine Sulfate
•
4-methyl umbelliferone
Bílé LED metody:
Cy3,Alexa Fluor® 555
•
Cy5,Alexa Fluor® 647
•
DyLight 549
•
DyLight 633
•
DyLight 649
•
DyLight 680
•
10.
Archivace a práce s daty
Data vzorků ze všech aplikačních modulů se automaticky uloží do archivačních souborů a lze
je otevřít buď integrovaným softwarem v programu Data Viewer nebo tabulkovým
programem jako je MS Excel.
Data jsou ukládána na adrese:
C:\ND-3300 Data
RiboGreen, etc.)
User name
Application Module (Hoechst dsDNA, PicoGreen dsDNA, RNA
Data Viewer
Jedná se o užitečný program, který umožňuje uživateli upravovat formáty výstupů, importovat
uložená data a přepočítávat data získaná z přístroje Nanodrop. S daty se dá pracovat i bez
připojeného přístroje ND-3300.
9/11
11.
Problémy
V této části je popsáno řešení možných problémů. Jedná se o řešení poměrně triviálních
problémů v USB komunikaci, kde hlavní je zajistit mechanické spojení PC a přístroje, jinak je
třeba použít utilit podle v manuálu popsaného postupu. U ostatních potenciálních závad
doporučujeme obrátit se na Vašeho distributora nebo přímo na společnost Nanodrop.
12.
Kontrola zdroje
Tento modul zkontroluje, jestli zdroje LED diod správně fungují.
Následující spektra jsou typické příklady kontroly zdrojů modré a bílé LED diody. Pozn.:
Při měření musí být povrch čistý a suchý. V tomto modulu není vyžadováno proměření
blanku.
Pokud kontrola spektra nebude vypadat jako zobrazeno na příkladech, doporučujeme
opakovat měření s čistým a suchým povrchem. Pro další informace kontaktujte Vašeho
lokálního distributora.
Modrá LED dioda
Kontrola zdroje
Bílá LED dioda Kontrola zdroje
10/11
UV LED dioda Kontrola zdroje
Obrazy se automaticky ukládají a archivují zde: C:\ND-3300 Data\Operation & Performance
Images.
13.
Údržba a záruka
Čištění
Základním požadavkem je udržení čistoty ramen přístroje. Po dokončení každého měření
setřete vzorek z horního i dolního ramene. Rovněž doporučujeme, abyste po dokončení
každého bloku měření otřeli obě ramena neionizovanou vodou. Postupujte přitom následovně:
+ Aplikujte 5 ul vody na spodní rameno
+ Mechanicky vytvořte pomocí horního ramene sloupec, nechte ho cca 2-3 minuty působit
+ Otřete vodu z obou ramen čistou buničinou
Poznámka dH20 běžně stačí na čištění, v případech například zaschlých bílkovin
doporučujeme použít 0,5M HCl s následným použitím 5ul H20 na odstranění případné
reziduální HCl. Nepoužívejte pro aplikaci vody nebo roztoku Sava střičku.
Záruka
Společnost Nanodrop poskytuje záruku na díly i práci po dobu dvou roků od data zakoupení.
Kompatibilita s rozpouštědly
Spektrofotometr je kompatibilní s většinou rozpouštědel používaných v biomedicínské
laboratoři. Tyto zahrnují metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, acetone, eter, chloroform,
CCl4, DMSO, DMF, Acetonitril, THF, toluen, hexan, benzen, NaOH, chlornan sodný,
ředěnou HCl, ředěnou HNO3, ředěnou kyselina octová
Přístroj není kompatibilní s veškerými formami kyseliny fluorovodíkové (HF).
11/11
Download

Uživatelský manuál