Toxoplasma, Pneumocystis, Trichomonas, Leptospira –
co mají společné?
Seminář ku příležitosti 105. výročí narození a 40. výročí úmrtí prof. Otto Jírovce
Společnost pro epidemiologii a mikrobiologii ČLS JEP
a
Česká parazitologická společnost
www.parazitologie.cz
Lékařský dům
Koordinátor: RNDr. Libor Mikeš, PhD.
3. dubna 2012
Společnost pro epidemiologii a mikrobiologii ČLS JEP
a
Česká parazitologická společnost
pořádají odborný seminář na téma
Toxoplasma, Pneumocystis, Trichomonas, Leptospira – co mají společné?
Seminář ku příležitosti 105. výročí narození a 40. výročí úmrtí prof. Otto
Jírovce
dne 3. dubna 2012 ve 13:30 hodin
ve velké posluchárně Lékařského domu ČLS JEP, Sokolská 31, Praha 2
Program:
Doc. RNDr. Josef Chalupský, CSc. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze):
Osobnost profesora Jírovce
Toxoplasma v dobách Jírovcových
RNDr. Petr Kodym, CSc. (SZÚ Praha):
Toxoplasma od profesora Jírovce po současnost
Prof. RNDr. Jiří Vávra, DrSc. (PaÚ AVČR a Katedra parazitologie PřF JU České Budějovice):
Od intersticální plasmocytární pneumonie a Pneumocystis carinii k Pneumocystis jirovecii
pneumonii
RNDr. Eva Nohýnková, PhD. (Klinika infekčních a tropických nemocí 1. LF UK v Praze a FN
Na Bulovce):
Pneumocystis – možnosti a úskalí diagnostiky
Přestávka s občerstvením (cca 15:00-15:30)
MVDr. Zuzana Čermáková, PhD. (Ústav klinické mikrobiologie FN a LF UK v Praze Hradec
Králové):
Leptospiry, leptospirózy – pokroky v diagnostice
Prof. RNDr. Jaroslav Kulda, CSc. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze):
Trichomonas vaginalis: přínos profesora Jírovce a jeho následovníků
RNDr. Ivan Čepička, PhD. (Katedra zoologie PřF UK v Praze):
Trichomonády v respiračním traktu člověka
Předpokládané zakončení semináře v cca 16:45.
Koordinátor semináře a editor sborníku:
RNDr. Libor Mikeš, PhD. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze a ČPS)
© Česká parazitologická společnost
Seminář má charakter postgraduálního vzdělávání a je garantován ČLK jako akce
kontinuálního vzdělávání. Seminář bude ohodnocen kredity ČLS, KVVOPZ ČR a
Společností SML - obor mikrobiologický laborant – účastníci obdrží potvrzení o účasti.
1
2
OSOBNOST PROFESORA JÍROVCE, TOXOPLASMA V DOBÁCH
JÍROVCOVÝCH
Doc. RNDr. Josef Chalupský, CSc. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze)
e-mail: [email protected]
Přednáška byla pojata jako bezprostřední, osobní zavzpomínání na profesora Otto
Jírovce. Jak to umožnilo dlouholeté pobývání v jeho blízkosti. Nelze z ní tedy zde pořídit nějaký
souhrn.
Nicméně alespoň něco. Vyzdvižena byla Jírovcova jedinečná zásluha na poválečném
vybudování zcela nového, samostatného oboru - parazitologie. De novo, a to nejen po stránce
odborné a vědecké, ale též vlastního a promyšleného vybudování podoby pracoviště. Protože
parazitologie byla tehdy zaměřena především směrem k humánní medicině, zřízena byla
vyšetřovací a diagnostická laboratoř hojně navštěvovaná pacienty a parazitologie si získala záhy
zasloužené renomé v lékařské veřejnosti. Vzniklo tak zárodečné líhniště budoucích parazitologů.
Což přetrvává. Vždyť na lékařské fakultě se parazitologie dodnes nepřednáší.
Připomenuto bylo Jírovcovo zaujetí a zápal pro obor a poznání vůbec. Bylo mu to
vrozené. Nikdy jsme jej neviděli lelkovat. Mohl tím být pro nás vzorem. Ale také i v něčem
jiném. Byl nefalšovaným ctitelem lidské rovnosti. Za všech okolností vždy světlým bodem,
kolem kterého se vše otáčelo.
Protože je o něm dnes zejména pro mladší známo málo, uvádíme jeho hlavní životopisná
data. Otto Jírovec se narodil 31. ledna 1907 v Praze. Maturoval v roce 1924 na vinohradském
gymnáziu. V r. 1929 skončil doktorátem studium na Přírodovědecké fakultě UK prací o
trypanosomách bez kinetoplastu. V letech 1925-29 byl již demonstrátorem na zoologickém
ústavu PřFUK a 1930-32 tam působil jako nehonorovaný asistent. Rok potom učil na
břeclavském gymnáziu, ale v r. 1933 se po smrti doc. Hahna vrátil na uvolněné místo do Prahy.
V r. 1938 se stal docentem s habilitační prací o mikrosporidiích a r. 1948 profesorem. V roce
1952 se stal členem korespondentem ČSAV a r. 1955 akademikem. V roce 1953 dostal společně
s plzeňským patologem doc. Vaňkem státní cenu za odhalení původce intersticiální pneumonie
kojenců Pneumocystis carinii. Zveřejnil 278 vědeckých prací a 250 populárních článků. Dále 11
knih. Asi první je jeho populární spolu s manželkou vydaná „Parasiti člověka“. Nejznámější jsou
„Zoologická technika“ (vyšla ve třech vydáních), „Parasitologie pro lékaře“ (dvě vydání česká a
jedno německé), „Parasitologie pro zvěrolékaře“ a ve spoluautorství „Protozoologie“ a obrazový
atlas „Život pod drobnohledem“ (vydaný též ve čtyřech světových jazycích - úplný soupis jeho
prací lze nalézt ve Věstníku Čs. zoologické společnosti 36, 300, 1972). Otto Jírovec zemřel 7.
března 1972.
3
Portrét p. prof. Otto Jírovce
Někdy na přelomu čtyřicátých a padesátých let se narodilo na Karlově dítko, které bylo
postiženo tím věhlasným hydrocefalem. Ascitickou tekutinu v neurocraniu mělo plnou
tachyzoitů Toxoplasma gondii. Podařilo se je přeočkovat na myšky a vznikl tak domácí kmen,
který byl na nich po desítky let na parazitologii udržován. Umožnilo to podle Frenkelova vzoru
(1948) vyrábět u nás z vlastních zdrojů testovací látku „Toxoplasmin“. Tzv. intradermálním
testem (IDT) tu byli vyšetřováni pacienti, přicházející s podezřením, že by příčinou jejich potíží
mohla být toxoplamosa . Ale nejen v Praze. Zásluhou Jírovcovou a Jindřicha Jíry vzniklo opět
vyhlášené pracoviště, které později dovolilo přejít na diagnostiku imunofluorescenční. Výsledky
IDT v jeden čas naznačovaly možnou souvislost mezi toxoplasmosou a mongoloidismem.
4
TOXOPLASMA OD PROFESORA JÍROVCE PO SOUČASNOST
RNDr. Petr Kodym, CSc.
(Národní referenční laboratoř pro toxoplasmózu, CEM, Státní zdravotní ústav, Praha)
email: [email protected]
Profesor Otto Jírovec (1907-1972), český světově významný průkopník parazitologie, se
toxoplasmózou zabýval od roku 1954. S četnými spolupracovníky vydal o této infekci na 50
publikací.
V Jírovcově čase byla Toxoplasma gondii tajuplným parazitem. Velice dobře bylo známo
stadium tachyzoitů, které se dařilo kultivovat na myších, jakož i tkáňové cysty s bradyzoity.
Nebylo pochyb o tom, že Toxoplasma gondii může být nebezpečným lidským patogenem. První
známý případ kongenitální a současně i oční toxoplasmózy popsal Janků (1923), od 50. let se
vědělo, že toxoplasma způsobuje lymfadenopatie. Byla zaznamenána široká plejáda hostitelů,
stále však nebyl znám kompletní životní cyklus a nebylo jasné, jak se infikují lidé. Bylo zjevné,
že tkáňové cysty objevené například ve vepřovém mase nejsou všechno. Jírovec (1960) píše:
„Jakou cestou se tento velký počet lidí infikuje toxoplasmami, není dosud exaktně známo;
připouští se většinou perorální, intranasální, vzácněji intrakonjunktivální a perkutánní infekce“.
Vše se vyjasnilo až na sklonku života profesora Jírovce: roli kočky jakožto definitivního
hostitele odhalil Hutchinson (1965) a teprve Dubey, Miller a Frenkel (1970) popsali stadium
oocysty.
Navzdory těmto poměrně vážným mezerám ve znalostech o biologii Toxoplasma gondii
fungovala poměrně dobře diagnostika a terapie humánní toxoplasmózy. Například v plodové
vodě bylo možné prokázat toxoplasmy isolačním pokusem na laboratorním zvířeti. Základem
laboratorní diagnostiky však byly titrační sérologické metody – především Sabinův-Feldmanův
„dye test“ (SFT), který, ačkoliv jej provádí už jen pár vybraných laboratoří, dodnes platí za zlatý
standard stanovení antitoxoplasmických protilátek a z titru SFT se odvozují mezinárodní
jednotky IgG. Vyjádřením titrů SFT, NIFR a KFR se dá obsah protilátek v séru kvantifikovat
mnohem lépe než v moderních jednobodových testech, což umožňuje sledovat dynamiku
protilátek a i poměrně dobře určovat fázi infekce bez znalosti obsahu antitoxoplasmických IgM
či IgA nebo bez stanovení avidity IgG. Sérologické testy jsou základem diagnostiky
toxoplasmózy i v současnosti. Nejoblíbenější metoda profesora Jírovce – intradermální test – se
vzhledem k obtížné kvantifikovatelnosti hodí k diagnostice akutní toxoplasmózy méně; jelikož je
však založen na buněčné imunitě, má vynikající předpoklady stát se ideální metodou pro
vyšetřování populace v rámci epidemiologických studií. Vzhledem k tomu, že Ústav sér a
očkovacích látek byl z důvodu údajné potenciální rizikovosti nucen zastavit výrobu antigenu toxoplasminu - na přelomu 80. a 90. let minulého století, intradermální test pro své studie již
5
nikdo nepoužije. Porovnání diagnostických testů v časech profesora Jírovce a v současnosti
přináší tabulka 1.
Tab. 1: Základní testy používané k diagnostice toxoplasmózy v minulosti a současnosti
Používán
od
1966
V časech prof. Jírovce
V 21. století
Používána
Používána v NRL
PCR – stanovení DNA
Toxoplasma gondii
Kožní (intradermální)
test (IDT)
1990
nebyla
1948
Hlavní test specifické
buněčné imunity
Metoda přímého průkazu
T. gondii v plodové vodě
Není povolen
Sabinův-Feldmanův
„dye test“ (SFT)
Komplementfixační
reakce (KFR)
1948
Základní sérologický
test
Základní sérologický
test
„Zlatý standard“, v ČR se
momentálně neprovádí
Základní sérologický test
Nepřímá imunofluorescenční reakce (NIFR)
1961
Používána
Používána
ELISA IgG
cca. 1980
Nebyla
Základní sérologický test
ELISA IgM
cca. 1988
Nebyla
Základní sérologický test
1991
Nebyl
Významný u těhotných
žen
Diagnostický test
Isolace toxoplasem na
laboratorní myši
Test avidity IgG
1942
V oblasti terapie toxoplasmózy nenastala od časů profesora Jírovce žádná významná
změna. Dosud nebyl do klinické praxe zaveden žádný lék, který by byl proti tachyzoitům
účinnější než kombinace pyrimethaminu a sulphadiazinu, preparát účinný proti bradyzoitům se
dosud marně hledá.
Vedle problémů diagnostiky považoval profesor Jírovec za důležitou otázku „jaké jsou
účinky chronické respektive klinicky bezpříznakové toxoplasmové infekce na zdravotní stav
člověka?“ Zaujala jej především i dnes aktuální problematika možné souvislosti toxoplasmózy
se vznikem psychiatrických nemocí, která se koneckonců vzhledem k lokalizaci cyst
Toxoplasma gondii v mozku sama nabízí. Jeho studie provedená na celkem 1 683 pacientech
psychiatrických léčeben v Dobřanech, Pezinku, Havlíčkově Brodě a Praze-Bohnicích má dodnes
zásadní výpovědní hodnotu, v současnosti se ztěží může někomu podařit takto rozsáhlý soubor
vyšetřit. Do studie byly zařazeny osoby se schizofrenními (954) a maniodepresivními (48)
6
psychózami, involučně depresivními stavy (103), různými psychózami a narkomaniemi (53),
oligofrenií (235), psychopatiemi (93), epilepsií (152) a lues CNS (56). Prevalence toxoplasmózy,
s výjimkou maniodepresivních psychóz (pouhých 27%) a involučně depresivních stavů (53%)
kolísala mezi 42,7 % (epilepsie) a 47,1 % (psychózy a narkomanie). Autoři odstranili vliv
možného bias jako je věk či délka pobytu v léčebně. Závěr je jednoznačný: „Jsme proto toho
názoru, že toxoplasmóza při etiologii různých psychických onemocnění nehraje prakticky
žádnou roli. U jednotlivých onemocnění jsme našli přibližně stejná nebo velmi podobná čísla
pozitivity jako Kozar, ta však odpovídají normě promořenosti našeho obyvatelstva“ (Jírovec,
1971 A).
Zajímavá otázka zní: bylo v časech profesora Jírovce u nás více toxoplasmózy? Studie
provedená IDT v průběhu 8 let na úctyhodných 15 972 občanech Československa vykázala
prevalenci 37,7% (Jírovec, 1971 B). To je více, než nám vyšlo z posledních sérologických
přehledů (90. léta 20. století), ale méně, než se v soudobých pramenech uvádělo pro Vídeň nebo
Francii. Autor však uvádí, že čísla mohou být zvýšena výběrem testovaných osob, z nichž
většina pochází z venkovských oblastí. Prevalence výrazně stoupá s věkem: zatímco v kategorii
do 5 let je jen 4,6%, do 10 let 14,4% a do 15 let 20,7%, je ve věku 16-20 let 30,5%, 21-30 let
36,5% a 31-40 let 51,2 % positivních. S ještě vyšším věkem již prevalence příliš nenarůstá: 4150 let 54,5%, 51-60 let 56 % a přes 60 let 51,6%. Na odlišnostech v prevalenci může mít vliv i
odlišná citlivost diagnostických testů - tehdejšího IDT a dnešního KFR. Jedině nové vyšetření
větších souborů běžné populace by mohlo ukázat, zda toxoplasmózy skutečně ubývá; to je však
v současnosti velice těžko proveditelné.
A co se změnilo od dob prof. Jírovce v parazitologii jakožto oboru? Vedle metod výzkumu i
mnoho dalších věcí, snad ještě zásadnějších. Například špičkového vědce formátu profesora
Jírovce zajímala v první řadě diagnostika (mnoho jeho prací je věnováno metodice IDT a dalších
testů), klinika a terapie sledované infekce, byl v neustálém kontaktu s praxí. Dnes je to bohužel
jinak. „Vědečtí“ a „praktičtí“ parazitologové se od sebe neustále vzdalují a čím dál tím méně
nacházejí společnou řeč.
Dnešního čtenáře Jírovcových prací asi překvapí, že jsou většinou v němčině. Obzvláště
v německé a rakouské literatuře jsou také hojně citovány.
A jakožto pracovník Státního zdravotního ústavu (SZÚ) si na závěr neodpustím drobnou
poznámku: je známo, že v době Protektorátu, kdy byly zavřeny české vysoké školy, se profesor
Otto Jírovec uchýlil do SZÚ, kde pracoval až do osvobození Prahy. Jeho pozdějším
pokračovatelem v SZÚ byl parazitolog Dr. O. Havlík a přes něj již vede přímá linie ke vzniku
Národní referenční laboratoře pro toxoplasmózu.
7
LITERATURA
Dubey, J.P.: Miller, N.L: Frenkel, J.K.(1970): Characterization of the new fecal form of
Toxoplasma gondii. J. Parasitol. 56:447
Hutchinson, W.M (1965): Experimental transmission of Toxoplasma gondii. Nature 206 :961
Janků J. (1923) Pathogenesa a pathologická anatomie tak nazvaného vrozeného kolobomu žluté
skvrny v oku normálně velkém a mikrophthalmickém s nálezem parasitů v sítnici. Časopis
lékařův českých 62 (39):1021-1027; 62 (40):1054-1059; 62 (41):1081-1085; 62 (42):1111-1115;
62 (43) 1138-1144.
Jírovec, O (1960): Parasitologie für Ärzte. VEB Gustav Fischer Verlag, Jena, 684 pp.
Jírovec, O (1971 A): Toxoplasminteste bei Patienten in vier psychiatrischen Heilanstalten. In:
Kirchoff, H., Langer, H.: Toxoplasmose. Praktische Fragen und Ergebnisse. Stuttgart, Georg
Thieme Verlag, : 14-16
Jírovec, O (1971 B): Resultate des Toxoplasmintestes bei sog. Normaler Bevölkerung der
Tschechoslowakei. In: Kirchoff, H., Langer, H.: Toxoplasmose. Praktische Fragen und
Ergebnisse. Stuttgart, Georg Thieme Verlag, : 10-11
OD INTERSTICÁLNÍ PLASMOCYTÁRNÍ PNEUMONIE A
PNEUMOCYSTIS CARINII K PNEUMOCYSTIS JIROVECII PNEUMONII
Prof. RNDr. Jiří Vávra, DrSc.
(Parazitologický ústav, Biologické centrum AVČR, České Budějovice a Katedra parazitologie
Přírodovědecké fakulty Jihočeské Univerzity, České Budějovice)
e-mail: [email protected]
Souhrn
Pneumocystis spp. (PNC) (s velkou řadou hostitelsky specifických druhů) je kvasinka
(Fungi: Ascomycota), kolonizující povrch pneumocytů typu I, které vystýlají plicní alveoly
savců. Výskyt těchto kvasinek v plicích savců je zcela běžný a mimo dosud 5 řádně taxonomicky
popsaných druhů jich zřejmě existují v jednotlivých savčích hostitelích stovky či tisíce. Lidské
infekce jsou působeny druhem Pneumocystis jirovecii Frenkel, 1976 (PJ), jehož je člověk
jediným hostitelem. Druhové jméno parazita připomíná zásadní úlohu profesora Otto Jírovce
((1907-1972) a jeho spolupracovníků v rozpoznání, že pneumocystis je častým a závažným
parazitem člověka (1951/1952) vyvolávající specifický typ pneumonie (intersticiální
plasmocytární pneumonie), dnes známý jako “pneumocystis jirovecii peumonie” nebo
8
pneumocystová pneumonie – PNP. Záludnost infekce tímto patogenem spočívá v tom, že
pneumocysty žijící v alveolu se chovají jako neškodní komenzálové, pokud jsou kontrolovány
imunitním systéme hostitele, ale v případě selhání hostitelské imunity dojde k masivnímu
namnožení organizmu v plicních alveolech hostitele, jejich zaplnění s až fatálními následky.
Závislost výskytu Pneumocystis jirovecii pneumonie na imunodeficitu hostitele definuje PNP
jako “immunodeficiency-dependent disease” – IDD.
Historie objevu
Organizmus byl objeven náhodou v r. 1909 brazilským parazitologem Carlos Chagasem
v plicích morčat uměle nakažených Trypanosoma cruzi, původcem jihoamerické Chagasovy
choroby. Carlos Chagas nalezl v plicích morčat drobná kulovitá cystická stadia (5 µm) s osmi
jádry, která mylně zařadil do vývojového cyklu trypanosomy. Tato stadia, o nichž dnes víme, že
to jsou askospory Pneumocystis, pak sehrála klíčovou roli při další identifikaci organizmu.
Chagasovo přesvědčení, že tato cystická stadia patří k americké trypanosomatóze posílilo to, že
je v r. 1911 nalezl v plicích člověka zemřelého na Chagasovu chorobu. Později bylo to, co
Chagas popsal, nalezeno v plicích krys, ale bez nákazy T. cruzi (Carini 1910). A další nález
téhož v plicích divokých potkanů v Paříži vedl konečně k uznání samostatnosti organizmu a jeho
popisu jako Pneumocystis carini Delanoe et Delanoe, 1912. V roce 1942 byl organizmus nalezen
v patologickém materiálu plic několika lidí a zvířat v Holandsku (van der Meer a Brugg).
Holandští patologové nalezený organizmus správně určili jako Pneumocystis, nerozeznali ale
jeho patologický potenciál a bohužel, díky probíhající světové válce, jejich nález nevzbudil
patřičnou odezvu.
Je to teprve publikace přednosty Šiklova Ústavu patologie Lékařské fakulty UK v Plzni,
prof. Josefa Vaňka z roku 1951, oznamující nález Pneumocystis v alveolárním exudátu
zemřelých dětí, která zahajuje dodnes trvající periodu celosvětového zájmu o tohoto kolonizátora
savčích plic a příležitostného patogena. Otto Jírovec, profesor parazitologie Přírodovědecké
fakulty UK v Praze, vstupuje do historie pneumocystis tím, že identifikuje organizmus na
patologickém materiálu prof. Vaňka jako Pneumocystis carinii a v další spolupráci s ním a s
pediatrem Lukešem tito autoři identifikují v r. 1952 Pneumocystis jako původce epidemicky se
vyskytujícího onemocnění kojenců (“nedonošenců a oslabených dětí”) známého klinikům a
patologům jako intersticiální plasmocytární pneumonie. Toto onemocnění se vyskytovalo v
Evropě ve stovkách až tisícovkách případů přibližně mezi léty 1920 a 1960, vrcholilo v létech
1955-59. Dnes přetrvává v izolovaných případech a drobných nosokomálních epidemiích,
nikoliv však jen u kojenců, ale v populaci obecně. Jeho původce a patologické agens nebyl až do
objevu Vaňka a Jírovce identifikován.
9
Onemocnění má relativně vyhraněný klinický projev (horečka, suchý kašel, rychlý nástup
dyspnoe a hypoxie) a charakeristický patologický nález (infiltrace plicních alveol “pěnovitou
hmotou” = masa pneumocyst, mezi kterými se vyskytují cystovitá eliptická či kulatá stadia s 8mi
jádry). Je další zásluhou Vaňka a Jírovce, že identifikovali přítomnost Pneumocystis ve
fotografiích doprovázejících původní popis intersticiální plasmocytární pneumonie jako
patologické jednotky (Ammich 1938, Benecke 1938) a tak definitivně potvrdili, že se jedná o
pneumocystózu. Impakt publikací Vaňka, Jírovce a Lukeše identifikující Pneumocystis jako
etiologické agens kojenecké plasmocytární pneumonie byl obrovský: jen v prvé dekádě
následující objev Pneumocystis jako lidského patogena bylo publikováno ve střední Evropě 111
prací věnovaných Pneumocystis. Zvýšil se zájem lékařské veřejnosti o toto onemocnění (během
4 let se na území Československa bylo zaznamenáno kolem 2000 případů kojenecké
intersticiální pneumonie). V databázi prof. Jírovce představují publikace věnované
Pneumocystis celou pětinu, v současnosti vychází ročně kolem 500-700 prací věnovaných
nejrůznějším aspektům PNC a PNP (databáze SCOPUS). Pneumocystis je dnes nejběžnějším
oportunistickým patogenem lidí s imunodeficitem (HIV, hematologické malignity, stav po
orgánových transplantacích, nádorová onemocnění, immunosupresivní terapie, terapie
antimetabolity a j.) a je organizmem citlivě signalizující stav imunitní nedostatečnosti.
Co ve stručnosti víme o PNC dnes, po 60ti letech co se ukázalo, že to je to potencíálně závažný
patogen, nejen lidí ale savců obecně?
Systematická příslušnost
Původně byla Pneumocystis považována za protozoon a byla řazena do blízkosti kokcidií
(Aragao 1913, Chagas 1913). O příslušnosti k prvokům nepochyboval ani Otto Jírovec a tento
názor se naposled objevuje v jeho Lékařské parazitologii vydané v r. 1977. Ovšem, ihned po
identifikaci Pneumocystis jako lidského patogena, řada mykologů (Csillag, Giese) vyslovila
názor, že PNC je příslušník říše hub, Fungi. Zprvu, byl tento názor podporován málo závažnými
argumenty (barvicí vlastnosti PNC v histologickém materiálu, skutečnost, že v plicích se běžně
vyskytují vdechnuté kvasinky). Později byl názor, že PNC je houbový organizmus podpořen
zjištěním, že cystická stadia PNC jsou ultrastrukturálně identická s asky (vřecky) kvasinek
(Vávra a Kučera 1970). Molekulární biologie přinesla definitivní rozsudek. Fylogeneze rRNA
genů, sekvenční analýza mitochondriálních genů, disjunkce genů thymidylát syntázy a
dihydrofolát reduktázy, přítomnost houbám specifického elongačního faktoru EF-3 a j. (Edman a
spol. 1989, Stringer et al. 1989 a řada dalších autorů) jasně potvrzuje, že PNC je kvasinka. Její
dnešní taxonomické zařazení je následující: rod Pneumocystis, čeleď Pneumocystidaceae, řád
Pneumocystidales, třída Pneumocystidomycetes, podkmen Taphrinomycotina (to jsou primitivní
ascomycety, pravděpodobně jejich bazální skupina), kmen Ascomycota, říše Fungi.
10
Pneumocystis tak patří mezi vřeckovýtrusné houby a její nejbližší příbuzná je běžná,
volně žijící kvasinka Schizosaccharomyces pombe. Přesto, jak je uvedeno dále, PNC nemá stadia
mimo savčí organizmus. Baterie molekulárně biologických a biochemických důkazů, že PNC je
kvasinka vybavená životním cyklem zahrnujícím meiosu a tvorbu askospor, je dnes
nezpochybnitelná. Na druhé straně, detailní výzkum tohoto organizmu přináší důkazy i o
některých specifických vlastnostech PNC, zřejmě reflektujících parazitární způsob života. Tou
nejdůležitější je přítomnost cholesterolu jako lipidické složky buněčných membrán na rozdíl od
ergosterolu, typické buněčné komponentě hub. Tato vlastnost zakládá rezistenci PNC na
antimykotika inhibující biosyntézu ergosterolu. Vegetativní buňky pnumocyst v elektronovém
mikroskopu se příliš nepodobají kvasinkám, mají nepravidelný tvar, tenkou stěnu, která vybíhá v
množství výběžků splétajících se navzájem a s výběžky membrán pneumocytů. Tato schopnost
tvořit kompaktní kolonie, dovoluje pneumocystám zaplnit vzdušný prostor alveolu.
Jedna či více PNC, kolik druhů?
Mimo krysy (potkany) a člověka je PNC nalézána běžně v plicích prakticky všech savců
včetně některých jejich primitivních forem (např. klokani). Až do r. 1976 byly všechny nálezy
označovány jako Pneumocystis carinii z prostého důvodu, že morfologický obraz organizmu ve
světelném a elektronovém mikroskopu neposkytuje možnost spolehlivě rozlišit PNC z
jednotlivých hostitelů. V roce 1976 americký patolog J.K. Frenkel snesl řadu argumentů pro
odlišnost krysí a lidské PNC (antigenní odlišnost, klinický průběh onemocnění, morfologické
odlišnosti) a lidskou formu PNC označil jako Pneumocystis jiroveci a to v uznání zásluh Otto
Jírovce. Popis z roku 1976 byl proveden podle Mezinárodních pravidel zoologické nomenklatury
(ICZN) (jiroveci s jedním i), popis byl v r. 1999 inovován dle pravidel botanické nomenklatury
(ICBN). Dle tohoto kódu je správný název organizmu Pneumocystis jirovecii Frenkel, 1976
(jiroveci, dvě ii). V literatuře se ovšem stále ještě objevuje i P. jiroveci, což je chybné.
Sekvenční analýza řady genů dovoluje srovnání PNC z různých hostitelů. Ukazuje se, že
PNC z jednotlivých hostitelů jsou hostitelsky přísně specifické druhy s řadou vnitřních genotypů.
To znamená, že potenciálně existují stovky druhů PNC, protože jeden hostitel může být
nositelem i několika, pro hostitelský druh specifických pneumocyst. Plicní alveoly jednoho
druhu hostitele mohou být tedy kolonizovány několika molekulárně biologicky dobře
podpořenými druhy PNC a to dokonce současně. Při této kohabitaci však nedochází k výměně
genetického materiálu. V souladu s pravidly taxonomie bylo zatím popsáno 5 druhů PNC: P.
carinii a P. wakefialdiae v potkanech, P. jirovecii v člověku, P. murina v laboratorních
hlodavcích, P. oryctolagi v králících. Řada dalších PNC figuruje v literatuře jako druhy bez
řádného popisu (např. P. soricina z rejsků, P. equina z koňů, nebo jsou zmiňovány v literatuře
jako tzv. speciální formy, např. P. carinii f. sp. mustelae z fretky, P.carinii f.sp. suis z prasete.
11
Jsou to rozhodně dobré druhy, jen čekající na řádný popis. PNC je evidentně soubor
fylogeneticky starých organizmů, které se vyvíjely společně se svými hostiteli a jsou k ním
extrémně úzce adaptovány. To je také zřejmě důvodem, proč se zatím nepodařila dlouhodobá
kultivace PNC v umělém mediu a proč imunosuprimovaný potkan či mladý králík těsně po
odstavu (který spontánně prodělává krátkou episodu pneumocystózy) jsou vlastně jedinými
laboratorními modely pneumocystózy.
Specifický savčí oportunista – existují volně žijící stadia?
Molekulárně biologické metody umožňují nalézat PNC volně v přírodě, kde její DNA je
nalézána na vzduchových filtrech nebo ve vodě. To a systematická příslušnost PNC k volně
žijícím kvasinkám zavdalo podnět ke spekulacím, že PNC má někde v přírodě další část
životního cyklu. Recentní analýzy proteomu však ukazují, že PNC má nápadně chudou výbavu
enzymů pro syntézu aminokyselin (pouze 2! ve srovnání s minimálně 54 enzymy volně žijící S.
pombe) a že tedy musí získávat aminokyseliny z prostředí plicního alveolu. S největší
pravděpodobností tedy PNC může existovat pouze jako intraalveolární oportunista (Hauser a
spol. 2010). PNC je rovněž závislá na získávání hostitelského cholesterolu a velkých množství Sadenosyl methioninu (AdoMet).
Životní cyklus
Zahrnuje binární dělení, sexuální cyklus zahrnující kopulaci dvou haploidních buněk
(PNC exprimují sexuální feromon) s následující meiózou (navozující opět haploidní stav) během
tvorby spory (asku) s 8mi haploidními askosporami uvnitř. Askospory jsou pak vykašlávány a
zprostředkují vzdušnou cestou infekci nového hostitele. V plicích se PNC zřejmě šíří z alveolu
do alveolu prostřednictvím tvorby biofilmu z agregovaných buněk a vyloučené extracelulární
matrix. Stěna asků, kterými životní cyklus kulminuje, obsahuje beta-1,3-D-glukan jako základní
strukturální polysacharid. Ten hraje důležitou úlohu v zánětlivé reakci organizmu vyvolané PNC
a hladina sérových protilátek proti tomuto glukanu se dá využít jako perspektivní diagnostická
metoda reflektující množství PNC v plicích.
Ačkoliv přítomnost sérových protilátek v populaci je vysoká (sérologická pozitivita dětí
vůči P. jirovecii dosahuje ve věku 2-3 roky 70-90%), vše nasvědčuje tomu, že PNC je v plicích
imunokompetentních hostitelů (včetně člověka) přítomna jen přechodně, v podobě občasných,
krátkodobých infekcí. Trvalejší kolonizace je pak vždy známkou hostitelského imunodeficitu.
Extrapulmonární pneumocystóza
Ačkoliv je PNC v podstatě parazit lokalizovaný v dutině plicního alveolu, ojediněle jsou
nalézána drobná a izolovaná ložiska PNC v mimoplicní lokalizaci. Histologická zjištění pak
12
podporuje molekulárně biologická detekce PNC ve tkáních imunosuprimovaných potkanů: v
případě silných nákaz v plicích může PNC diseminovat do různých dalších orgánů (játra,
ledviny, slezina, mezenteriální mízní uzliny) (Golab 2009). Z klinického hlediska jsou ale tyto
lokalizace pravděpodobně bezvýznamné.
Antigenní variabilita
K významným zjištěním patří to, že PNC je schopna měnit povrchové antigeny svých
buněk. Buňky PNC jsou pokryty glykoproteinem A (=MSG – „major surface glycoprotein“),
který hraje roli v přichycení PNC k buňkám hostitele. U krysí P. carinii zahrnuje genová rodina
MSG asi kolem 70-80 genů exprimovaných jednotlivě z expresního místa blízko
chromozomových telomer. Tyto geny kódují izoformy povrchového proteinu MSG
(exprimována je vždy jen jedna izofoma MSG); tím se zvyšuje fenotypová variabilita, což
pravděpodobně pomáhá úniku před imunitní reakcí hostitele. Podobné geny jsou i u dalších
druhů PNC, včetně P. jirovecii. Tento systém antigenního převleku se podobá tomu, co používají
africké trypanosomy pro dlouhodobé přežívání v hostiteli - s tím rozdílem, že repertoár
genových variant je u PNC nepoměrně nižší ( u P. carini asi 73 variantních genů oproti až
tisícům u T. brucei). Díky genetické rekombinaci však množství povrchových antigenních
variant PNC podstatně vzrůstá. Antigenní variabilita umožnující částečný únik před reakcí
imunitního systému hostitele může mít zásadní význam pro krátkodobé přežívání organizmu
v hostiteli, dokončení životního cyklu a vytvoření stadií pro přenos na nového hostitele.
Závěr
Co je tedy PNC? Je to komenzál savčích plic, oportunista využívající poklesu
hostitelských obranných reakcí (specificky poklesu CD4+ lymfocytů pod 200/mm3), je to
patogen? PNC má za různých okolností daných specifickými podmínkami v hostiteli všechny
tyto vlastnosti. Americký patolog Frenkel, který popsal P. jirovecii, navrhl, aby tímto
organizmem působená pneumonie, v literatuře dnes bežně označovaná jako P. jirovecii
pneumonie, byla specificky označena jako tzv. IDD choroba („immunodeficiency dependent
disease“). Tedy choroba postihující jedince s buď nedozrálým imunitním systémem, nebo
se sekundárním imunodeficitem. To nejlépe vystihuje podstatu PNP . Vrátíme-li se pod tímto
aspektem k epidemii dětské pneumocystózy, která probíhala v Evropě od r. 1920 do přibližně
1960, a jejíž zkoumání Otto Jírovcem a jeho spolupracovníky otevřelo cestu k tomu, co známe o
PNC dnes, naskýtá se otázka: co bylo podstatou imunodeficitu či nevyzrálosti imunitního
systému tisíců onemocnělých dětí v oné době? Není úplně jisté, že to byl důsledek podvýživy
během války, PNC probíhala i v zemích kde tomu jistě tak nebylo (Švýcarsko). Byly to speciální
podmínky v pediatrických zařízeních té doby a způsoby zacházení s kojenci (proteinová
13
podvýživa, nahromadění jedinců vnímavých k nákaze, špatné hygienické podmínky mohou vést
k endemii dětské pneumocystózy – Shiraz, Iran- in Frenkel 1999)? Jako zajímavost uveďme, že
američtí pediatři se domnívají, že v Evropě tehdy proběhla epidemie neznámého retrovirového
onemocnění, která predisponovala děti pro rozvoj PNP. Epidemiologická data tomu nasvědčují,
chybí jedině důkaz, že takový virus skutečně existoval (Goldman A.S. et al. 2005. What Caused
the Epidemics of Pneumocystis Pneumonia in European Premature Infants in the Mid-20th
Century? Pediatrics 115, 725-736).
Doplňkové informace
Pneumocystis Genome Project at http://pgp.cchmc.org/
Cushion, M.T., Stringer, J.R. Stealth and Opportunism: Alternative lifestyles of species in the
fungal genus Pneumocystis. (2010) Annual Review of Microbiology, 64, pp. 431-452.
Cushion, M.T., Collins, M.S, Linke, M.J. Biofilm formation by Pneumocystis spp. (2009)
Eukaryotic Cell, 8 (2), pp. 197-206.
Finkelman, M.A. Pneumocystis jirovecii infection: Cell wall (1→3)-β-D-glucan biology and
diagnostic utility. (2010) Critical Reviews in Microbiology, 36 (4), pp. 271-281.
Frenkel J.J. Pneumocystis pneumonia, an Immunodeficiency-Dependent Disease (IDD): A
Critical Historical Overview. (1999). J.Eukaryot. Microbiol. 46(5), 89S-92S
Vaněk, J. (1951). Atypická intersticiální pneumonie dětí, vyvolaná Pneumocystis carinii. Čas.
Lék. Čes. 90, 1121-1124.
Vaněk, J., Jírovec, O. (1952). Parasitaere Pneumonie, „Interstitielle“ Plasmazellenpneumonie
der Fruehgeborenen verursacht durch Pneumocystis carinii. Zbl. Bakt. Abt. I. Orig. 158, 120127.
Vaněk, J., Jírovec, O., Lukeš, J. (1953). Interstitial Plasma Cell Pneumonia in Infants.
Annales Pediatrici 188, 120-127.
van der Meer MG, Brug SL. 1942. Infection a Pneumocystis chez l’homme et chez les
animaux. Ann. Soc. Belge Med. Trop. 22:301–9
14
PNEUMOCYSTIS – MOŽNOSTI A ÚSKALÍ DIAGNOSTIKY
RNDr. Eva Nohýnková, PhD., Mgr. Ivana Zicklerová
(Oddělení tropické medicíny Nemocnice Na Bulovce a 1. LF UK v Praze)
e-mail: [email protected]
Odhalení Pneumocystis jirovecii (původně carinii) jako původce atypické plazmocytární
intersticiální pneumonie kojenců, která mezi roky 1920 – 1960 byla v Evropě zodpovědná za 2030% úmrtnost dětí v kojeneckém věku, patří mezi nejvýznamnější objevy prof. Otto Jírovce.
V současné době tvoří kojenci pouze velmi malý segment pacientů s pneumocystovou
pneumonií. Klinicky manifestní nákaza P. jirovecii však zůstává celosvětově závažným
onemocněním imunokompromitovaných osob.
Klasifikace pneumocystové pneumonie
Pneumocystová pneumonie (Pjp) je oportunní nákaza epidemiologicky řazená do
specifické skupiny pneumonií u imunokompromitovaných osob (pneumonia in
immunocompromised hosts - PIIH). Obecně je pneumonie akutní zánětlivé onemocnění, které
postihuje respirační bronchioly, alveoly a plicní intersticium (viz slovníček). Podle rozložení
zánětlivé reakce v plicní tkáni patří Pjp mezi intersticiální pneumonie: zánětlivý exudát se
nachází v plicním intersticiu. Hustý, nehnisavý zánětlivý infiltrát lokalizovaný
v interalveolárních septech je tvořen lymfocyty a plasmocyty: odtud zařazení mezi
lymfoplasmocytární pneumonie. Pro Pjp je charakteristické zaplnění alveolů surfaktantem
navázaným na pneumocysty adherující k výstelce alveolů. Tím je snížena kapacita alveolu pro
výměnu plynů.
Historie pneumocystové pneumonie a skladba pacientů
Epidemie atypické intersticiální pneumonie kojenců, později popsané díky průkazu
původce jako pneumocystová (Vaněk a Jírovec, 1952), začala plíživě sporadickými případy
v Německu v letech 1920-1940, postupně postihla několik tisíc dětí v řadě evropských zemí
včetně Československa a kulminovala mezi roky 1955-1959. Rizikovým faktorem byla nízká
porodní váha. Na začátku 60. let došlo k náhlému a rychlému ústupu počtu případů u dětí a
v následujících letech byla Pjp považovaná za velmi vzácnou infekci, která souvisí s imunitní
nedostatečností: ojedinělé případy se vyskytovaly sporadicky většinou u dospělých pacientů
s nádorovým onemocněním krve.
Na počátku 80. let - v souvislosti s nástupem pandemie nákazy virem lidské imunitní
nedostatečnosti (HIV) - se situace zásadně mění. Dochází ke strmému nárůstu počtu případů Pjp,
která se stává hlavní infekční komplikací osob nakažených virem HIV. V té době a v letech
následujících je pneumocystová pneumonie v popředí příčin úmrtí pacientů s AIDS. Ke změně
15
dochází koncem 80. let, kdy se jako součást péče o HIV+ pacienty zavádí v rozvinutých zemích
profylaktické podávání léků proti nákaze P. jirovecii. To vede o 10 let později k prvnímu
výraznějšímu snížení počtu případů Pjp v této skupině nemocných. Další snížení nastává ke
konci 90. let po zavedení vysoce účinné antiretrovirové léčby (highly active anti-retroviral
treatment - HAART), která brání poklesu pomocných CD4+ T lymfocytů pod kritickou hladinu,
při níž se manifestují oportunní infekce (200 buněk/µl krve). Avšak i přes významnou redukci
počtu případů během poslední dekády zůstává pneumocystová pneumonie závažnou oportunní
infekcí HIV+ osob. Na její aktuálnosti se ale stále častěji podílejí pacienti, kteří nejsou nakaženi
virem HIV, ale kterým jsou dlouhodobě podávány léky tlumící imunitu (imunosupresiva) buď
jako součást léčby základního onemocnění nebo jako součást předtransplantační přípravy a
posttransplantační péče (Reid et al. 2011; Striuk et al. 2011). Spektrum imunosupresivních léků a
jejich aplikace neustále roste. K pacientům se zvýšeným rizikem pneumocystové pneumonie
jsou tak v současnosti řazeni příjemci solidních orgánů, zejména ledvin a srdce, příjemci kostní
dřeně, pacienti s nádorovými onemocněními krve, především lymfoproliferativními, a
s některými typy solidních tumorů. Do této rizikové skupiny patří rovněž pacienti se
systémovými autoimunitními onemocněními. Důkazem je skladba nemocných s Pjp potvrzenou
průkazem P. jirovecii v naší laboratoři (Tab. 1). Ze 147 pacientů téměř 84% byli
imunokompromitovaní nemocní s neinfekčním základním onemocněním. Zatímco u HIV+ osob
koreluje riziko rozvoje Pjp s poklesem počtu CD4+ T lymfocytů, u jiných typů imunodeficitu
jakýkoliv laboratorní korelát chybí.
Tab. 1. Pacienti s pneumocystovou pneumonií podle skupinových diagnóz základní nemoci a)
Název skupiny
Infekční a parazitární nemoci
Novotvary
Nemoci krve a imunity
Nemoci endokrinní a metabolické
Nemoci oběhové soustavy
Nemoci dýchací soustavy
Nemoci trávicí soustavy
Nemoci svalové a kosterní soustavy
Nemoci močové a pohlavní soustavy
Kód b) Počet pacientů
A-B
24
C-D
55
D
9
E
2
I
7
J
28 e)
K
2
M
6
N
14
Převažující základní onemocnění
HIV c)
lymfom, leukémie, myelom
aplastická anémie, SCID d)
ischemická choroba, (transplantace srdce)
jaterní selhání
systémový lupus erythematosus,
Wegenerova granulomatóza
selhání ledvin, (transplantace ledvin)
tabulka zahrnuje údaje Oddělení tropické medicíny Fakultní nemocnice Na Bulovce a 1. LF UK z období XII. 2002 – III. 2012
skupinový kód podle Mezinárodní klasifikace nemocí
c)
23 pacientů HIV+ (16 s nově zjištěnou HIV nákazou)
d)
vrozený těžký kombinovaný imunodeficit T a B lymfocytů (severe combined immunodeficiency)
e)
uveden je počet pacientů, u kterých není známa základní diagnóza
a)
b)
Historie laboratorní diagnostiky pneumocystové pneumonie
Laboratorní diagnostika pneumocystové pneumonie je založena na přímém průkazu
původce v plicních sekretech nebo tkáních. Během epidemie dětské intersticiální pneumonie, do
začátku 60. let minulého století, bylo hlavní diagnostickou metodou histologické vyšetření plicní
16
tkáně odebrané post mortem. K mikroskopickému průkazu Pneumocystis v sekčním materiálu
sloužila řada barvících technik (např. impregnace dle Grocotta prokazující cysty, Gomoriho
trichrom aj. Obr. 1), které se používají doposud. Od poloviny šedesátých let, kdy došlo
k výraznému poklesu incidence Pjp, byly sporadické případy diagnostikovány již intra vitam
díky pokroku v bronchoskopii, který umožnil omezený odběr materiálu z dolních cest dýchacích
za života pacienta. Základní diagnostickou metodou pro průkaz původce zůstala mikroskopie.
Od 80. let se stala rutinní bronchoskopickou technikou bronchoalveolární laváž (BAL)
(Hunninghake et al. 1979). Frakcionovaný výplach periferní oblasti dýchacích cest 100-200 ml
teplého fyziologického roztoku umožňuje postupnou aspirací získat 50-100 ml bronchoalveolární
tekutiny (BAT), která obsahuje materiál přímo z míst patologického působení pneumocyst
(Střičková, Kolaříková 2004). BAT byla zprvu, a je stále, používána k mikroskopickému
průkazu P. jirovecii. Od 90. let, kdy doktorka Wakefieldová zavedla PCR do diagnostiky Pjp
(Wakefield et al. 1990), i jako materiál pro izolaci DNA. Přes vysokou citlivost vyšetření BAT
pro průkaz P. jirovecii (uvádí se až 100%) její odběr není možný u všech pacientů s podezřením
na Pjp, neboť se jedná o invazivní zákrok. Jako alternativa k BAL byl zaveden odběr
indukovaného sputa (Turner et al. 2003).
Současné možnosti laboratorní diagnostiky pneumocystové pneumonie
Základem diagnostiky Pjp je odběr materiálu na základě podezření vysloveného na
podkladě klinického obrazu a zobrazovacího vyšetření. Laboratorní diagnostika Pjp je založena
na přímém průkazu původce. Nepřímý průkaz sérových protilátek se neprovádí. Pro přímý
záchyt P. jirovecii jsou používány obě výše zmiňované metody (1) mikroskopie a/nebo (2) PCR.
Všeobecně akceptovaný diagnostický algoritmus ale neexistuje.
Mikroskopický průkaz a jeho úskalí
Tradiční mikroskopické metody, které jsou založeny na morfologické identifikaci
vývojových stádií pneumocyst po obarvení (pro identifikaci cyst lze použít stříbření dle
Grocotta, Gram-Weigertovo barvení či barvení toluidinovou modří, pro identifikaci trofických
stádií se používá barvení dle Giemsa-Romanowski) jsou vysoce specifické, avšak jejich citlivost
jednoznačně závisí na druhu vyšetřovaného materiálu a kvalitě jeho odběru. Pro mikroskopický
průkaz lze použít sputum, indukované sputum (obojí po solubilizaci), tracheální aspirát a BAT.
Záchytností se ale liší: od nejvyšší v bronchoalveolární tekutině (80 – 95%; stav pacienta nemusí
umožnit odběr) po nejnižší v neindukovaném sputu (~ 25%) (neplatí absolutně). Toto omezení
neřeší ani metody založené na nepřímé imunofluorescenci s použitím specifické protilátky (např.
komerční kit Monofluo fy Bio-Rad), jejichž výhoda spočívá ve snadnějším nalezení pneumocyst
na preparátě. Nevýhodou je, že prokazují pouze cysty P. jirovecii a neumožňují případný nález
17
jiných patogenů. Výsledek mikroskopického vyšetření může být rovněž negativně ovlivněn
profylaktickým podáváním kotrimoxazolu nebo zahájením terapie před odběrem materiálu na
vyšetření. Negativní výsledek mikroskopického vyšetření proto nevylučuje pneumocystovou
pneumonii.
Průkaz pomocí PCR a jeho úskalí
Od roku 1990 se PCR jako diagnostická metoda pro průkaz Pjp rychle rozšířila. Jako
výchozí materiál lze použít sputum, indukované sputum, výplach dutiny ústní kloktáním
fyziologického roztoku (oral wash), tracheální aspirát, hrudní punktát, hrudní výpotek, výplach
bronchů, BAT, případně materiál získaný z kanyly. Přestože chybí konsensus, pro izolaci DNA
je obvykle používán komerční kit fy QIAGEN (QIAmp DNA Kit). Amplifikován je obvykle, ale
ne vždy, gen pro mtLSU rRNA. Značná variabilita je ve vlastním uspořádání reakce.
V současnosti je diagnostickými laboratořemi ve světě i u nás používána řada modifikací, často
typu in-house, počínajíc jednokrokovou kvalitativní PCR až po kvantitativní real-time PCR. Při
srovnání PCR a mikroskopie vychází PCR v jakémkoliv uspořádání jako citlivější metoda.
Na našem pracovišti jsme v letech 2002 až 2012 vyšetřili materiál na průkaz
pneumocystové pneumonie celkem od 1727 pacientů. Ve všech případech šlo o
imunokompromitované nemocné s důvodným podezřením na Pjp na základě klinického obrazu a
rentgenového nálezu. U 147 pacientů byla metodou jednokrokové PCR prokázána nákaza P.
jirovecii, ale pouze u 61 (41.5%) byla nákaza současně prokázána i mikroskopicky. Tato často
uváděná diskrepance může mít řadu příčin od falešné pozitivity PCR po nízkou citlivost
vyšetřovaného materiálu. Minimálně se ukazuje, na základě srovnání, že profylaktické podávání
kotrimoxazolu mikroskopický záchyt negativně ovlivňuje. Rovněž je zřejmé, že mikroskopické a
PCR vyšetření je třeba provádět souběžně u každého pacienta.
Kdo laboratorní diagnostiku pneumocystové pneumonie v ČR provádí
Současná situace je poměrně nepřehledná. Mikroskopická vyšetření provádějí některá
mikrobiologická pracoviště, zejména velkých a fakultních nemocnic (po zařazení Pneumocystis
mezi houby častěji mykologické než parazitologické laboratoře), některá z nich včetně PCR.
Vyšetření pouze pomocí PCR provádějí některé molekulárně biologické laboratoře. Žádný
ucelený přehled ale není k dispozici.
Literatura
-Carmona E, Limper AH (2011). Update on the diagnosis and treatment of Pneumocystis
pneumonia. Ther Adv Respir Dis 5:41-59
18
-Hunninghake GW, Gadek JE, Kawanami O, Ferrans VJ, Cyst RG (1979). Inflammatory and
immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar
lavage. Am J Pathol 97:149-206
-Khot PD, Fredricks DN (2009). PCR-based diagnosis of human fungal infections. Expert Rev
Anti Infect Ther 7:1201-1221
-Reid AB, Chen SCA, Worth LJ (2011). Pneumocystis jirovecii pneumonia in non-HIV-infected
patiens: new risks and diagnostic tools. Curr Opin Infect Dis 24:534-544
-Struijk GH, Gijsen AF, Yong SL, Zwinderman AH, Geerlings SE, Lettinga KD, van Donselaarvan der Pant KA, ten Berge IJ, Bemelman FJ (2011). Risk of Pneumocystis jiroveci pneumonia
in patiens long after renal transplantation. Nephrol Dial Transplant 26:3391-Střičková J, Kolaříková R (2004). Standardní postup při provádění bronchoalveolární laváže
(BAL) a vyšetřování bronchoalveolární tekutiny (BAT). Stud Pneumol Phtiseol 64:235-239
T-urner D, Schwarz Y, Yust I (2003). Induced sputum for diagnosing Pneumocystis carinii
pneumonia in HIV patiens: new data, new issues. Eur Respir J 21:204-208
-Wakefield AE, Pixley FJ, Banerji S, Sinclair K, Miller RF, Moxon ER et al. (1990). Detection
of Pneumocystis carinii with DNA amplification. The Lancet 336:451-453
Slovníček
Respirační bronchioly – terminální větve bronchiálního stromu, z nichž odstupují alveoly
Alveoly (plicní sklípky) - tenkostěnné váčky velikosti 200 µm. Alveolární výstelka (respirační
epitel) se skládá ze 2 typů buněk: (1) ploché, velmi tenké (25 nm) membranózní pneumocyty I.
typu tvoří 97% výstelky, (2) ovoidní pneumocyty II. typu přítomné solitérně ve výstelce
produkují surfaktant; proliferují a diferencují se na pneumocyty I. typu (obnova výstelky)
Plicní intersticium – vazivo zevně od alveolů mezi bazální membránou alveolární výstelky a
bazální membránou plicních endotelií
Surfaktant – vazký komplexní sekret složený z lipidů a proteinů, syntetizovaný pneumocyty II.
typu a sekretovaný do lumen alveolů
19
LEPTOSPIRY, LEPTOSPIRÓZY – POKROKY V DIAGNOSTICE
MVDr. Zuzana Čermáková, Ph.D., Mgr. Petra Kučerová, Mgr. Ota Pavliš
(Ústav klinické mikrobiologie, UK v Praze, LF a FN v Hradci Králové,
Centrum biologické ochrany Těchonín, ÚVZÚ Praha)
e-mail: [email protected]
Leptospiróza je celosvětově rozšířená zoonóza s prevalencí 0,1-100/100 000 obyvatel.
Výskyt je výrazně vyšší v oblastech s teplým a vlhkým klimatem, ale i v Evropě se onemocnění
vyskytuje. V České republice je uváděna prevalence 0,4/100 000; předpokládá se, že je ve
skutečnosti o něco vyšší. Na vyšší výskyt leptospirózy mají vliv především dva fenomény –
povodně a přemnožení hlodavců, ojedinělé případy zaznamenáváme po rizikovém chování. Po
povodních bývají i v Evropě a občas také v České republice vyšší lokální výskyty leptospirózy.
Počet vyšetřených pacientů a incidence leptospirózy v jednotlivých letech (2002-2009) v krajích:
Královéhradecký (HK), Pardubický (PA) a část kraje Vysočina (počet obyvatel cca 1 115 000):
Počet vyšetřených
pacientů
Počet pozitivních
pacientů
Incidence (počet případů na 100 000
obyvatel)
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
1 012
773
681
763
523
408
21
1,83 (povodně v ČR)
11
0,96
9
0,78
25
2,17 (lokální povodně – HK, PA)
6
0,52
9
0,78
285
2
0,17
368
6
0,52
celkem
4813
89
-
Rok
K přenosu onemocnění dochází obvykle kontaktem s močí rezervoárových zvířat
(hlodavci, hmyzožravci, drobní savci, domácí zvířata) a k rizikovým aktivitám patří např.vodní
sporty, práce v povodněmi postiženém území, práce, při kterých dochází ke kontaktu
s rezervoárovými zvířaty nebo jejich exkrementy (úklid sklepů, práce v zemědělství) atd.
Inkubační doba onemocnění je obvykle 1- 4 týdny a klinické příznaky se pohybují od
mírných „chřipkovitých“, jako jsou bolesti hlavy, únava a zvýšená teplota, až po těžkou
hepatorenální insuficienci, která může být spojena s pneumonií až respiračním selháváním.
20
Soubor pacientů s prokázanou leptospirózou – klinické příznaky dle ošetřujících lékařů:
Klinické příznaky
Horečka
Bolesti hlavy
Jaterní léze
Déletrvající zvýšená teplota
Bolesti svalů
Bolesti kloubů
Nausea, zvracení, průjem
Alterace mentálního stavu
Renální příznaky
Respirační symptomy
Meningeální symptomy
Hepatorenálním selhávání
Krvácivost
Hepatosplenomegálie
Icterus
Kardiální příznaky
Oligurie
Urtikárie
Konjuncitivitida, světloplachost
Uveitis
%
91,6
69,4
58,3
38,8
44,4
47,2
47,2
33,3
41,6
30,5
30,5
22,2
13,9
13,9
16,7
13,9
16,7
5,6
13,9
8,3
Možnosti laboratorní diagnostiky
1. nepřímá diagnostika
1.1. nepřímá diagnostika – průkaz protilátek metodou (MAL, MAT)
Za „zlatý standard“ je v laboratorní diagnostice leptospir nepřímými metodami
považován mikroaglutinační test (MAL, MAT) s živými laboratorními kmeny leptospir.
Vzhledem ke skutečnosti, že detekovatelné množství protilátek je infikovaným hostitelem
tvořeno asi po 7 -10 dnech, je tento test velmi vhodný k následnému konfirmačnímu vyšetření a
určení sérovaru, ovšem v diagnostice akutního onemocnění hraje zanedbatelnou úlohu.
Principem je hodinová až dvouhodinová inkubace živých laboratorních kmenů s naředěným
sérem susp.pacienta. Odečet je prováděn mikroskopicky v temném poli – zpravidla hodnocen +
až +++, za viditelnou reakci je považována aglutinace více než 30% bakteriálních buněk
v zorném poli. Za pozitivní titr je považováno ředění 1:400 a více.
Z výše uvedených informací vidíme, že úloha MAT v diagnostice akutní formy
onemocnění byla vždy problematická, neboť nejenže protilátková odpověď nemocného hostitele
nastupuje po typickém „diagnostickém okně“, ale také hranice titru 1:400 je pro účel diagnostiky
21
akutní fáze diskutabilní, protože onemocnění i reakce se vyvíjejí a čím časnější přesnou
diagnostiku provedeme, tím nižší je sice titr, ale podstatně je větší benefit pro pacienta.
1.2. nepřímá diagnostika – EIA test (Serion)
K dispozici je v různých zemích několik EIA testů (Německo – Serion, Indie – Panbio…)
Díky podpoře grantového oddělení Armády České Republiky (AČR) jsme v rámci projektu
POV 907 980 – „Leptospiróza“ – vyhodnocení rizika a nové možnosti detekce, testovali EIA
soupravu firmy Serion na 1598 vzorcích krevních sér příslušníků AČR a pacientů. EIA souprava
detekuje IgM a IgG protilátky, ale je založena na detekci rodově specifických protilátek (antigen
L.biflexa), protože existuje velké množství patogenních sérovarů a je obtížné EIA test připravit.
Zřejmě vzhledem k této skutečnosti má nízkou specificitu a pro diagnostiku akutní formy
leptospirózy i konfirmační vyšetření je dle našeho názoru prakticky nepoužitelná.
V následující tabulce je uveden soubor testovaných sér od 45 pacientů FN Hradec Králové, na
kterém jsme rovněž soupravu vyzkoušeli a v tabulce č. 2 senzitivita, specificita, pozitivní
prediktivní hodnota a negativní prediktivní hodnota v naší studii a srovnání s dalšími autory.
Pro testování uvedených parametrů jsme použili soubor sér s MAT a klinicky konfirmovanou
leptospirózou, negativní séra, 5 krevních sér od pacientů s infekcí Treponema pallidum, séra
pacientů se sérologicky a klinicky konfirmovanou boreliózou a deset sér s protilátkami proti
některým infekčním agens (a pacientů se sclerosis multiplex), u nichž bývají zkřížené reakce
v EIA testech na průkaz protilátek proti boréliím:
22
Číslo
pacienta
v souboru
Výsledky klinické a
sérologické
konfirmace
Pohlaví
Věk
1.
2.
3
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♂
40
28
62
66
48
50
60
25
53
32
Leptospira +
Leptospira +
Leptospira +
Leptospira +
Leptospira +
Leptospira +
Leptospira +
Leptospira +
Leptospira +
Leptospira +
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
♂
♂
♂
♂
♂
♀
♀
♂
♀
♀
56
22
21
37
43
35
19
75
50
54
Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira Leptospira -
21
22.
23
24.
25.
♂
♂
♂
♂
♂
25
28
45
32
36
26.
♂
82
Další sérologicky
prokázané
infekce
Výsledek MAT
patogenní
leptospiry
Výsledek MAT
L. biflexa Patoc
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Hraniční
Pozitivní
1 : 800
1 : 200
1 : 200
1 : 400
1 : 800
1 : 400
1 : 400
1 : 200
1 : 200
1 : 400
-
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Tr. Pallium +
Tr. Pallium +
Tr. Pallium +
Tr. Pallium +
Tr. Pallium +
-
Borellia +
-
CMV +
HBS AB +
CMV +
Výsledek ELISA
IgG
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Negativní
Nd
Nd
Nd
Nd
Negativní
Negativní
Negativní
Nd
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Pozitivní
Pozitivní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
1 : 200 hraniční
Nd
Negativní
Nd
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Pozitivní
Pozitivní
Negativní
Pozitivní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Pozitivní
23
pozitivní
hraniční
hraniční
pozitivní
pozitivní
pozitivní
pozitivní
hraniční
hraniční
pozitivní
Výsledek ELISA
IgM
Výsledky klinické a
sérologické
konfirmace
Číslo
pacienta
Pohlaví
Věk
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
♀
♀
♂
♂
♀
♀
♂
♀
♀
45
40
66
48
41
50
44
50
66
Borrelia +
Borellia +
Borellia +
Borellia +
Borellia +
Borellia +
Borellia +
Borellia +
Borellia +
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
♂
♀
♂
♀
♀
♂
♂
♀
♀
♀
61
59
44
42
35
21
28
18
59
50
CMV +, HSV +
RS +
CMV +
RS +
CMV +
HSV+,
Chlamydia +
CMV +
Chlamydia +
Chlamydia +
souboru
Vysvětlivky:
BBG - IgG protilátky proti borréliím
CMV - cytomegalovirus
HAVG - IgG protilátky proti viru hepatitidy A
HBS AB- protilátky proti australskému antigenu
HSVG - IgG protilátky proti herpes simplex viru
KEG - IgG protilátky proti viru klíšťové encefalitidy
RS - roztroušená skleróza
Další sérologicky
prokázané
Infekce
KEG +
HAVG
VCAG, VZVG
Chlamydia +
HSVG
VZV+
VCAG
VCAG
BBG
BBG
Výsledek MAT
patogenní
leptospiry
Výsledek MAT
L. biflexa Patoc
Výsledek ELISA
IgM
Výsledek ELISA
IgG
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Nd
Nd
Nd
1 : 200
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Negativní
Negativní
Negativní
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Nd
Nd
Nd
1 : 100
Nd
Nd
Nd
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Pozitivní
Pozitivní
Negativní
Negativní
Pozitivní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Negativní
Pozitivní
Pozitivní
VCAG- IgG protilátky proti viru varicelly
VZVG- IgG protilátky proti varicella zoster viru
Nd - nevyšetřeno
24
Porovnání výsledků diagnostické senzitivity, specificity, PPV, NPV soupravy SERION ELISA
classic IgM/IgG s dalšími studiemi:
Naše studie (2011)
Honarmand a kol. (2010) Panwala a kol. (2011) Effler a kol. (2002)
IgM (%)
IgG (%)
IgM (%)
IgG (%)
IgM (%)
IgM (%)
100,0
100,0
100
84,0
96,2
43
Specificita
88,6
54,3
43,0
77,0
88,1
98
PPV
71,4
38,5
37,0
55,0
88,4
86
NPV
100,0
100,0
100,0
94,0
96,7
85
Senzitivita
2. přímý průkaz původce
2.1. kultivační průkaz – tekutá média, polotuhá média, kultivace je zdlouhavá (generační čas
v hodinách), nesterilní biologický materiál (moč) přerůstají rychle se množící bakterie… metoda je
zastaralá tam, kde je možné využít PCR.
2.2. – mikroskopie v temném poli – rovněž se již nepoužívá, pokud je k dispozici průkaz DNA.
2.3. průkaz DNA patogenních leptospir metodou PCR
Na našem pracovišti (pracovištích) jsou k dispozici prakticky 2 typy průkazu DNA patogenních
leptospir:
A) Průkaz DNA patogenních leptospir ve dvou standardních PCR reakcích. První PCR (In-house) je
pro průkaz 7 genetických druhů patogenních leptospir, primery G1/G2 (z oblasti genu SecY) a pro
průkaz DNA L.kirschneri (L. grippotyphosa) je nutné použít druhou PCR s odlišnými primery B641/ B64-2 (oblast genu pro chromosom 9).
Využíváme již osm let, mez detekce cca 2,5 – 10 leptospir, konfirmační vyšetření metodou MAT –
dourčení infikujícího sérovaru z epidemiologických důvodů.
B) Průkaz DNA patogenních leptospir PCR metodou – detekce genu lipL32, kódujícího povrchový
lipoprotein LipL32, který je přítomen pouze u patogenních leptospir.
Real time PCR (In-house), používáme od roku 2010, mez detekce 2,5 – 10 bakterií.
V rámci projektu AČR POV 907 980 jsme měli možnost vyšetřit 267 laboratorních kmenů
(odpovídá 260 sérotypů) patogenních a nepatogenních leptospir ze sbírky Royal Tropical Institute,
WHO/FAO/OIE and National Collaborating Centre for Reference and Resaerch on Leptospirosis,
Meibergdreef 39, 1105 AZ Amsterdam, The Netherlands.
25
Testování potvrdilo možnost využití nově zavedené PCR diagnostiky (Real time PCR
pro LipL32 gen) patogenních leptospir v laboratorní praxi – kmeny certifikované Institutem jako
patogenní byly PCR pozitivní a kmeny certifikované jako nepatogenní byly uvedenou metodou
negativní.
Metodu jsme zavedli do rutinního laboratorního provozu v dubnu 2010 a do prosince
roku 2011 bylo vyšetřeno 216 pacientů s podezřením na akutní leptospirózu, z toho bylo 8 osob
vyhodnoceno jako pozitivní (3,70%).
Praktické využití PCR metod pro diagnostiku leptospirózy je velmi citlivé na preanalytickou fázi
vyšetření:
2.4. Doporučení k odběru biologických materiálů
Leptospira je bakterie dobře citlivá na většinu antibiotik a proto po zahájení
účinné antibiotické terapie relativně rychle mizí pozitivita v PCR, neboť bakterie se
rozpadají a imunitní systém likviduje jejich zbytky, včetně DNA. Je nutné odebírat
vzorky biologických materiálů co nejdříve po vyslovení podezření na leptospirózu,
nejlépe před započetím antibiotické terapie, popř. do 24 – maximálně do 48 hodin
po jejím zahájení (po 48 hodinách však signál v PCR může být negativní, ačkoliv
v organismu leptospiróza probíhá, nejdéle bývá pozitivní reakce z moči).
2.6. Časová posloupnost odběrů biologických vzorků:
I)
V prvních dnech odebíráme především nesrážlivou krev (EDTA, citrát).
NIKDY NE heparin (inhibuje PCR reakci)!!!.
II)
Ve druhém týdnu (cca 5-7 dní od počátku klinických příznaků) odebíráme
pokud možno moč i nesrážlivou krev (EDTA, citrát).
Při meningeálních příznacích lze vyšetřit DNA patogenních leptospir
z likvoru.
III)
Po více než 7-10 dnech od počátku klinických příznaků (bez účinné ATB
terapie) pak lze prokázat DNA patogenních leptospir především v moči.
IV)
Dle našich zkušeností při ATB terapii přetrvává pozitivní nález
nejdéle v moči – cca 48 hodin.
2.7.
Uchování biologického materiálu:
3) Materiál (nesrážlivá krev, plazma, moč, likvor) je nutno uchovávat v chladničce, při 4
°C, a pokud možno do 24 hodin dopravit na pracoviště, kde je prováděno vyšetřování
vzorků metodou PCR nebo provést izolaci DNA.
26
4) Uhynulá zvířata – orgány ze zvířat (především ledviny) lze vyšetřovat, ovšem je
zapotřebí, aby materiál byl odebrán čerstvý – do několika hodin po úhynu, neboť
bakterie rodu leptospira jsou velmi citlivé na změny pH ( především ke kyselému
pH), a rychle v kadáverech hynou a rozkládají se.
Literatura
1. Gravekamp C., Van de Kemp H., Franzen M., Carrington D., Schoone G.J., Van Eys G.J.,
et al., Detection of Seven of Pathogenic Leptospires by PCR Using Two Sets of Primers, J.
Gen. Microbiol., 1993, 139, 1691-1700
2. Levett P.N., Morey R.E., Galloway R.L., Turner D.E., Steigerwalt A.G., Mayer L.W.,
Detection of pathogenic leptospires by real-time quantitative PCR, J. Med. Microbiol., 2005, 54,
45-49
Práce byly podporovány projektem obranného výzkumu AČR:
POV 907 980 – „Leptospiróza“ – vyhodnocení rizika a nové možnosti detekce.
TRICHOMONAS VAGINALIS: PŘÍNOS PROFESORA JÍROVCE A JEHO
NÁSLEDOVNÍKŮ
Prof. RNDr. Jaroslav Kulda, CSc. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze)
e-mail: [email protected]
Jednou z oblastí, kde poznatky profesora Jírovce dosáhly mezinárodního významu, je i
výzkum původce urogenitální trichomonózy, prvoka Trichomonas vaginalis. Touto
problematikou se zabýval v období 1939-1956. Jeho výzkum byl zaměřen na druhovou identitu
původce poševní trichomonózy, jeho patogenitu, způsob přenosu a dynamiku infekce, klasifikaci
mikrobních obrazů poševních a lokální chemoterapii trichomonózy. Výsledky, kterých na tomto
poli spolu se svými spolupracovníky dosáhl, byly pak shrnuty v konfrontaci s poznatky z jiných
laboratoří v kritickém review, které publikoval společně s dr. M. Petrů v Advances of
Parasitology v roce 1968 (Vol. 9:117-188).
Přestože pařížský anatom A.F. Donné roku 1836 nalezl a popsal druh Trichomonas
vaginalis v poševním výtoku ženy trpící zánětem pochvy a Höhne roku 1916 formálně stanovil
27
trichomonádovou kolpitis jako klinickou jednotku, přetrvávaly kontraverze o patogenitě a zvláště
o přenosu této infekce až do padesátých let minulého století. Pověry o možnosti získat tuto
infekci při koupání, o možnosti přenosu infekce pomocí rezistentních stádií (cyst) nebo o
zanesení střevních trichomonád do vagíny dlouhodobě přežívaly v podvědomí lékařů i v odborné
literatuře.
V letech 1939-42, kdy po zavření českých vysokých škol pracoval prof. Jírovec ve
Státním zdravotním ústavu, publikoval ve spolupráci s gynekology a mikrobiology několik prací,
které podaly přesvědčivé důkazy o identitě druhu Trichomonas vaginalis a jeho odlišnosti od
dalších trichonád nalézaných ve střevě (Pentatrichomonas hominis) nebo ústní dutině člověka
(Trichomonas tenax). Ukázal také, že trichomonády nevytvářejí rezistentní cysty umožňující
dlouhodobé přežívání v nepříznivých podmínkách a že sexuální styk je přirozenou a za
normálních podmínek jedinou cestou infekce. Společně s profesorem Peterem a dalšími
gynekology pak sledovali výskyt trichomonád u různých věkových skupin žen a ve vztahu
k estrogenizaci poševní sliznice. Sledovali dále dynamiku trichomonádové infekce a ukázali, že
po akutní fázi zpravidla přechází do fáze chronické až latentní, nedochází však k její spontánní
eliminaci a může pod vlivem různých podmětů exacerbovat. Společně s Peterem a Málkem pak
navrhli klasifikaci mikrobních poševních obrazů (I-VI), která umožňuje orientační morfologické
posouzení stavu poševní sliznice a biocenózy ve vztahu k infekčním agens (1947-1950). Toto
hodnocení bere v úvahu množství a typ epitelových buněk, množství leukocytů, přítomnost nebo
nepřítomnost Döderleinova laktobacila nebo jiných bakterií a morfologicky identifikovatelných
patogénů (Trichomonas, Candida). Tato klasifikace v kombinaci s kultivačním vyšetřením a
specifickými diagnostickými testy se používá dodnes.
Peter a Jírovec také navrhli kombinované lokální léčivo proti poševní trichomonóze
(1946,1947) obsahující složky bakteriostatické (sulfathiazol), trichomonocidní (carbazon nebo
jodchinoliny), mykocidní (kyselina boritá) a laktózu pro stimulaci Döderleinova lactobacila. Na
tomto základě vyrábělo účinné léky několik firem pod názvy Triflocid, Fluocid (Spofa), Viozol
(Ciba), Tricolpon (Organon) aj., které byly v klinickém použití až do zavedení metronidazolu a
dalších 5-nitroimidazolů vhodných k perorální léčbě po roce 1960.
V roce 1952 založil profesor Jírovec laboratoř klinické parazitologie Fakultní nemocnice
I, která byla po dlouhou dobu v areálu parazitologického pracoviště PřF UK. Diagnostika
trichomonózy byla nedílnou součástí této laboratoře a prováděla se v ní i ambulantní vyšetření a
odběry materiálu od pacientek s podezřením na trichomonózu nebo vaginální mykózy.
Přítomnost této laboratoře tak stimulovala parazitology dalších generací k výzkumu
trichomonád.
V letech 1962-1965 jsem pracoval jako postgraduální student („vědecký aspirant“)
v Protozoologické laboratoři ČSAV založené profesorem Jírovcem. Tato laboratoř byla posléze
28
začleněna pod jiným vedením do Parazitologického ústavu ČSAV, profesor Jírovec však zůstal
mým školitelem. Tématem mé disertační práce byla srovnávací studie o trichomonádách se
zvláštním zřetelem na druhy patogenní pro lidi a zvířata, včetně Trichomonas vaginalis. Zabýval
jsem se kultivačními technikami, axenizací a klonováním kultur a jejich kryoprezervací, což byla
v té době novinka. Podstatnou částí disertace bylo i testování virulence izolátů trichomonád na
myších a tkáňových kulturách. V roce 1966 mi nabídl profesor B. M. Honigberg, známý
americký protozoolog a znalec trichomonád, postdoktorské stipendium v jeho laboratoři na
Universitě státu Massachusetts. Vzhledem k příznivému období v předjaří „Pražského jara“ bylo
mi povoleno nabídku přijmout a v roce 1967 do USA vycestovat. Hlavní náplní mé práce v USA
bylo studium virulence trichomonád a jejich interakce s buněčnými kulturami.
Po návratu v roce 1969 mi nabídl profesor Jírovec místo v Zoologickém ústavu
Přírodovědecké fakulty, jehož byl tehdy ředitelem. Tuto nabídku jsem bez váhání přijal a stal
jsem se tak jeho posledním asistentem, bohužel jen na krátkou dobu, protože v roce 1972 zemřel.
Krátce po návratu z USA jsem zamýšlel pokračovat ve studiu patogenity Trichomonas vaginalis
a jako základ tohoto výzkumu jsme společně s mými tehdejšími studentkami (H. Nedvědová a
M. Dohnalová) a ve spolupráci s Laboratoří klinické parazitologie (dr. M. Vojtěchovská, dr. E.
Kunzová) a 1. gynekologickou klinikou (dr. M. Zavadil, dr. I. Karásková) Fakultní nemocnice I
testovali soubor čerstvých izolátů T. vaginalis různými virulenčními testy na myších a
porovnávali tyto výsledky s klinickým nálezem a histopatologickým vyšetřením biopsie
z děložního hrdla pacientek. Tyto výsledky byly později doplněny pokusy na tkáňových
kulturách a elektronovou mikroskopií trichomonád z experimentálních infekcí, které potvrdili
ameboidní transformaci trichomonád po kontaktu s hostitelskou tkání. Soubor 25
charakterizovaných kmenů trichomonád z této studie je uložen v kryobance katedry parazitologie
PřF UK a předpokládám, že ještě poslouží k dalšímu výzkumu patogenity trichomonád.
Hlavní směr výzkumu trichomonád na PřF UK se však obrátil jiným směrem. Na začátku
sedmdesátých let minulého století jsme se sblížili s biochemiky Jiřím a Apolenou
Čerkasovovými a společně s našimi studenty jsme se vydali na vzrušující cestu objevování a
biochemické charakterizace nových buněčných organel trichomonád, hydrogenosomů. Při této
práci postupně vznikala neformální skupina, sdružující studenty dvou různých kateder,
fyziologie a parazitologie a stipendisty z Parazitologického ústavu ČSAV, která se stala
základem dnešní Laboratoře biochemické a molekulární parazitologie. Prioritním výsledkem této
éry bylo zjištění, že hlavní metabolická dráha hydrogenosomů produkuje ATP a přispívá tak k
energetické bilanci buňky. Jako model pro tyto biochemické experimenty jsme používali
především druh Tritrichomonas foetus, původce bovinní trichomonózy. K T. vaginalis jsme se
však vrátili v souvislosti se studiem rezistence k metronidazolu. Ukázalo se totiž, že účinek
metronidazolu na trichomonády je aktivován v hydrogenosomech, kde působí jako preferenční
29
akceptor elektronů generovaných při metabolismu pyruvátu nebo malátu, jejichž přenos na nitroskupinu léčiva vede k uvolňování cytotoxických radikálů. Potlačení nebo odpojení
hydrogenosomálního metabolismu tak vede k navození rezistence k 5-nitroimidazolovým
léčivům. V letech 1988 až 2002 jsme uveřejnili řadu publikací zaměřených na biochemické
vlastnosti rezistentních kmenů, rozdíly mezi aerobním a anaerobním typem rezistence, navození
rezistence in vitro a monitorování změn, které vývoj rezistence provázejí i na standardizaci testů
pro detekci rezistence klinických izolátů T. vaginalis.
Studium trichomonád na PřF UK pokračuje i v současnosti. Členové týmu Laboratoře
molekulární a biochemické parazitologie, kterou dnes vede prof. Jan Tachezy, se podíleli na
genomovém projektu Trichomonas vaginalis a využívají poznatků tohoto projektu k hlubšímu
pochopení molekulárních zákonitostí funkce buňky trichomonád. Tradice výzkumu iniciovaného
profesorem Jírovcem tedy žije i v postgenomické éře.
TRICHOMONÁDY V RESPIRAČNÍM TRAKTU ČLOVĚKA
RNDr. Ivan Čepička, PhD. (Katedra zoologie PřF UK v Praze)
e-mail: [email protected]
Co jsou trichomonády
Trichomonády (kmen Parabasalia) jsou významná skupina bičíkatých prvoků. Většina
z přibližně 450 dosud popsaných druhů trichomonád jsou kooperativní symbionti termitů,
několik desítek druhů žije jako střevní komenzálové obratlovců. Je známo i několik volně
žijících druhů. Pouze několik zástupců trichomonád je patogenních pro člověka a domácí zvířata,
obvykle jsou to druhy, které unikly ze střeva do jiných orgánů. Většina druhů trichomonád
včetně všech druhů nalezených v člověku netvoří cysty ani jiná odolná stádia a trofozoiti ve
volném prostředí poměrně rychle umírají. Pro přenos mezi hostiteli je proto obvykle důležitý
blízký kontakt.
Lidské trichomonády
Nepočítáme-li nálezy v plicích a pleurální dutině (viz dále), bylo u člověka nalezeno pět
druhů trichomonád. Nejznámějším a nejvýznamnějším druhem je parazit urogenitálního traktu
Trichomonas vaginalis způsobující lidskou urogenitální trichomonózu. Mezi lidmi se přenáší
téměř výhradně pohlavním stykem. Příbuzný druh T. tenax žije v ústní dutině. Jeho význam pro
30
člověka je nejasný, pravděpodobně půjde o komenzála. Častěji se vyskytuje u osob se sníženou
zubní hygienou a u pacientů s chronickou periodontitidou. Mezi lidmi se přenáší slinami.
Z lidského tlustého střeva byly popsány tři druhy trichomonád. Trichomitus fecalis nemá žádný
význam, protože byl nalezen pouze jednou a není o něm téměř nic známo. Pentatrichomonas
hominis je pravděpodobně komenzál a kromě člověka se vyskytuje v tlustém střevu celé řady
dalších savců. Konečně Dientamoeba fragilis je zvláštní měňavkovitá trichomonáda, která
ztratila bičíky. Pro lidi je patogenní a způsobuje průjmovitá onemocnění. Přenos střevních
trichomonád se děje fekálně-orální cestou, u D. fragilis se spekuluje i o roli roupa dětského.
Nálezy trichomonád v lidském respiračním traktu
Ačkoli dolní cesty dýchací nejsou typickým místem výskytu trichomonád, během
posledních zhruba padesáti let byla publikována pestrá sbírka několika desítek nálezů
trichomonád v plicích a hrudním empyému. Dříve byly tyto nálezy celkem logicky přisuzovány
druhu Trichomonas tenax žijícímu normálně v ústní dutině. S rozvojem diagnostiky se však
ukázalo, že trichomonády izolované z lidských dolních cest dýchacích náleží nejméně do sedmi
druhů. Kromě Trichomonas tenax se jedná o Trichomonas vaginalis, Pentatrichomonas hominis,
Tetratrichomonas gallinarum, Tetratrichomonas sp. „LP“, Tritrichomonas foetus a Lophomonas
blattarum. Nálezy těchto druhů byly poměrně nečekané, protože se o většině z nich dříve
soudilo, že se jimi člověk nemůže vůbec nakazit. Smejkalová et al. (2012) však zjistili, že
primáti, mezi které člověk patří, ve svém tlustém střevu hostí široké spektrum střevních
trichomonád jiných živočichů.
O druhu Trichomonas vaginalis se dlouho soudilo, že nemůže dlouhodobě přežívat mimo
urogenitální trakt. Dnes je však známo více jak deset případů nákazy dýchacího traktu člověka
(viz Carter a Whithaus 2008). Jak již bylo zmíněno, Pentatrichomonas hominis je střevní
komenzál člověka a dalších savců včetně hospodářských zvířat, člověk se tedy s infekcí může
běžně setkat. Nákaza respiračního traktu druhem P. hominis je však velmi vzácná, např.
Jongwutiwes et al. (2000) našli tento druh v pleurální efuzi. Tetratrichomonas gallinarum je
běžný střevní komenzál ptáků včetně drůbeže. Všechny známé případy lidské nákazy tímto
druhem pocházejí z Estonska a byly izolovány z ústní dutiny nebo průdušek (Kutisova et al.
2005). Dosud nepopsaný druh Tetratrichomonas sp. „LP“ byl nalezen v hrudním empyému
jediné pacientky (Mantini et al. 2009). O tomto druhu není známo téměř nic, ani to, od kterých
hostitelů se člověk může nakazit. Tritrichomonas foetus je veterinárně významný původce
bovinní urogenitální trichomonózy. Kromě urogenitálního traktu skotu se vyskytuje v trávicím
traktu a nosní dutině (!) prasat a v posledních letech se ukazuje, že je to běžný střevní parazit
koček způsobující průjmovité onemocnění. Tento druh byl jednou nalezen v plicích pacientky
s pneumocystovou pneumonií (Duboucher et al. 2006a). Druh Lophomonas blattarum je
31
specializovaný symbiont zadního střeva švábů. I přesto byl opakovaně nalezen ve sputu
astmatických a imunosuprimovaných pacientů (viz Martínez-Girón a Doganci 2010).
Způsob infekce
Ačkoli o vstupu trichomonád do dolních cest dýchacích můžeme pouze spekulovat, je
velmi pravděpodobné, že obvykle je nejprve infikována ústní dutina. Do dolních cest dýchacích
se trichomonády nejsnáze dostanou vdechnutím orofaryngeálního sekretu. Hematogenní
diseminace z jiných orgánů je u druhů nalezených v člověku nepravděpodobná, zdokumentován
byl příklad pravděpodobného rozsevu Pentatrichomonas hominis ze subfrenického a jaterního
abscesu do hrudní dutiny (Hersh 1985).
Protože Trichomonas tenax se přirozeně vyskytuje v ústní dutině, nákaza je dlouhodobá a
je to celosvětově rozšířený a poměrně běžný organismus, je to logicky i nejčastější trichomonáda
nalézaná v lidských plicích. Trichomonády druhu T. vaginalis se do ústní dutiny dostane
prostřednictvím orálně-genitálního styku, novorozenci se nakazí od matky při porodu, obzvláště
v případech předčasné ruptury amnia (viz Carter a Whithaus 2008). Způsob nákazy ostatními
druhy trichomonád nalezených v lidských plicích je nejistý. Všechno to jsou komenzálové
zadního střeva různých živočichů, lze tedy očekávat fekálně-orální přenos s následnou
kolonizací ústní dutiny. Dolní cesty dýchací mohou být zřejmě infikovány i přímo, vdechnutím
částeček fekálií obsahujících trofozoity. U druhu Pentatrichomonas hominis, který jediný
z těchto druhů je znám i z lidského tlustého střeva, lze uvažovat i o orálně-análním přenosu,
podobně jako např. u Giardia intestinalis nebo Cryptosporidium parvum. U lidských nákaz
druhem Tetratrichomonas gallinarum byl hledán zdroj infekce u různých druhů drůbeže, bylo
však zjištěno, že lidské izoláty představují samostatné genotypy a zdroj infekce nebyl
identifikován (Cepicka et al. 2005).
Patologie
Role trichomonád v respiračních onemocněních je dosud zcela neznámá. Přitom mohou
být trichomonády poměrně běžné v plicích nebo pleurální dutině pacientů s různě závažnými
respiračními chorobami. Duboucher et al. (2007a, b) našli trichomonády u 60 % pacientů
trpících pneumocystovou pneumonií (u těžkých infekcí byla prevalence trichomonád dokonce
100 %) a u 30 % pacientů s ARDS (syndrom akutní dechové tísně dospělých). Protože jsou
trichomonády mikroaerofilní, je vznik mikrooxického prostředí v postižených plicích kritickou
podmínkou pro možnost infekce. Stejně důležitá pro přežívání a množení trichomonád v plicích
a pleurální dutině je přítomnost bakterií, kterými se trichomonády živí. Zdá se tedy, že ve většině
případů jsou trichomonády spíše oportunisti kolonizující již oslabené plíce. Podobně, většina
nálezů trichomonád v pleurální efuzi (od roku 1966 zdokumentováno na 17 pacientech) byla
32
z pacientů oslabených nádorovými onemocněními, imunosupresivní terapií nebo alkoholismem
(viz Leterrier et al 2012). Není jisté, zda jsou trichomonády schopné zhoršovat stav pacienta
popř. zpomalovat zotavení, např. mechanismem tvorby lézí.
Diagnostika
Základní diagnostickou metodou pro výskyt trichomonád v respiračním traktu člověka je
mikroskopické vyšetření tekutin (bronchoalveolární tekutina, sputum, pleurální výpotek).
Trofozoiti trichomonád jsou pohybliví a dobře patrní již v nativním preparátu. Přitom je potřeba
dávat pozor na záměnu s uvolněnými buňkami obrveného epitelu (viz Martínez-Girón et al.
2011; Qiang et al. 2011). Buňky druhu Trichomonas tenax však v plicích procházejí améboidní
transformací, kdy ztratí bičíky a další struktury typické pro trichomonády a adherují k epitelu
(Duboucher et al. 2006b). Protože buňky druhu Trichomonas vaginalis procházejí obdobnou
transformací v prostředí urogenitálního traktu, lze očekávat, že se podobně chovají i v prostředí
plic. V nativních preparátech proto nemusí být pohyb trofozoitů patrný. Vhodná jsou různá
barvení, nejčastěji se používá barvení dle May-Grünwald-Giemsa, kdy lze oválná jádra
trichomonád poměrně dobře odlišit od jader buněk hostitele. Pomocí této metody však prakticky
není možná spolehlivá determinace přítomných trichomonád. I když jednotlivé druhy
trichomonád (včetně blízce příbuzných Trichomonas vaginalis a Trichomonas tenax) lze od sebe
při vhodném barvení morfologicky dobře odlišit, v současné době to zvládne pouze několik
specialistů. Byly vyvinuty i imunohistochemické a FISH metody (Duboucher et al. 2007) pro
detekci trichomonád, ty však dosud nejsou příliš rozšířené a vzhledem k obrovskému spektru
nepříbuzných trichomonád infikujících lidský respirační trakt je jejich použití problematické.
V úvahu přicházejí i kultivační metody, ale jejich použití je opět limitováno faktem, že se
jednotlivé druhy trichomonád liší kultivačními nároky. Nejlepší diagnostická metoda je založena
na PCR a sekvenční analýze ITS regionu nebo SSU rDNA, pomocí které lze nejenom potvrdit
přítomnost i malého počtu buněk trichomonád ve vzorku, ale lze také přesně určit zjištěné
trichomonády (např. Jongwutiwes et al. 2000; Cepicka et al. 2006). Je navíc natolik univerzální,
že do budoucna zaručuje i identifikaci druhů, které dosud nebyly v člověku nalezeny. Problém
je, že tato metoda dosud nebyla plošně zavedena.
I když se nálezy trichomonád v lidském respiračním traktu rychle množí, je zjevné, že
většina infekcí projde nepovšimnuta. Přestože je patogenní potenciál plicních trichomonád dosud
nejasný, měla by být jejich diferenciální diagnostika zvažována u pacientů trpících závažnými
respiračními onemocněními a pacienti pozitivní na trichomonády by měli být přeléčeni.
33
Terapie
Lékem první volby při léčení plicních infekcí trichomonádami je metronidazol nebo
tinidazol (viz Martínez-Gíron et al. 2008). Z terapeutického hlediska nezáleží na konkrétním
druhu trichomonády, všechny druhy jsou citlivé na obě látky. I když dosud nebyly hlášeny
případy rezistence plicních trichomonád na metronidazol, jsou známy rezistentní kmeny druhu
Trichomonas vaginalis izolované z urogenitálního traktu. Pacientky nakažené rezistentními
kmeny se podařilo vyléčit buď zvýšenou dávkou metronidazolu, anebo změnou terapie na
ornidazol nebo tinidazol (viz Kulda 2002; Bachmann et al. 2011). Jiné léčebné postupy
nepřinesly jednoznačné výsledky.
Literatura
Bachmann LH, Hobbs MM, Seña AC, Sobel DJ, Schwebke JR, krieger JN, McClelland RS,
Workowski KA (2011) Trichomonas vaginalis genital infections: progress and
challenges. Clin Infect Dis 53: S160-S172
Carter JE, Whithaus KC (2008) Neonatal respiratory tract involvement by Trichomonas
vaginalis: a case report and review of the literature. Am J Trop Med Hyg 78: 17-19
Cepicka I, Kutišová K, Tachezy J, Kulda J, Flegr J (2005) Cryptic species within the
Tetratrichomonas gallinarum species complex revealed by molecular polymorphism.
Veter Parasitol 128: 11-21
Cepicka I, Hampl V, Kulda J, Flegr J (2006) New evolutionary lineages, unexpected diversity,
and host specificity in the parabasalid genus Tetratrichomonas. Mol Phylogenet Evol 39:
542-551
Duboucher C, Caby S, Dufernez F, Chabé M, Gantois N, Delgado-Viscogliosi P, Billy C, Barré
E, Torabi E, Capron M, Pierce RJ, Dei-Cas E, Viscogliosi E (2006a) Molecular
identification of Tritrichomonas foetus-like organisms as coinfecting agents of human
Pneumocystis pneumonia. J Clin Microbiol 44: 1165-1168.
Duboucher C, Caby S, Pierce RJ, Capron M, Dei-Cas E, Viscogliosi E (2006b) Trichomonads as
superinfecting agents in Pneumocystis pneumonia and acute respiratory distress
syndrome. J Eukaryot Microbiol 53: S95-S97
Duboucher C, Boggia R, Morel G, Capron M, Pierce RJ, Dei-Cas E, Viscogliosi E (2007a)
Pneumocystis pneumonia: immunosuppression, Pneumocystis jirovecii…and the thir
man. Nat Rev Microbiol 5: 966
Duboucher C, Barbier C, Beltramini A, Rona M, Ricome JL, Morel G, Capron M, Pierce RJ,
Dei-Cas E, Viscogliosi E (2007b) Pulmonary superinfection by trichomonads in the
course of acute respiratory distress syndrome. Lung 185: 295-301
Hersh SM (1985) Pulmonary trichomoniasis and Trichomonas tenax. J. Med Microbiol 20: 1-10
34
Kulda J (2002) Rezistence Trichomonas vaginalis k metronidazolu a její význam. In: Kulda J,
Pazdiora E (Eds.) Trichomonóza. Sborník pro Seminář v Lékařském domě České
lékařské společnosti Jana Evangelisty Purkyně. Pp. 16-17
Kutisova K, Kulda J, Cepicka I, Flegr J, Koudela B, Teras J, Tachezy J (2005)
Tetratrichomonads from the oral cavity and respiratory tract of humans. Parasitology
131: 309-319
Jongwutiwes S, Silachamroon U, Putaporntip C (2000) Pentatrichomonas hominis in empyema
thoracis. Trans R Soc Trop Med Hyg 94: 185-186
Leterrier M, Morio F, Renard B, Poirier AS, Miegeville M, Chambreuil G (2012) Trichomonads
in pleural effusion: case report, literature review and utility of PCR for species
identification. New Microbiol 35: 83-87
Mantini C, Souppart L, Noël C, Duong TH, Mornet M, Carroger G, Dupont P, Masseret E,
Goustille J, Capron M, Duboucher C, Dei-Cas E, Viscogliosi E (2009) Molecular
characterization of a new Tetratrichomonas species in a patient with empyema. J Clin
Microbiol 47: 2336-2339
Martínez-Gíron R, Esteban JG, Ribas A, Doganci L (2008) Protozoa in respiratory pathology: a
review. Eur Respir J 32: 1354-1370
Martínez-Girón R, Doganci L (2010) Lophomonas blattarum: a bronchopulmonary pathogen.
Acta Cytol 54: 1050-1051
Martínez-Girón R, van Woerden HC, Doganci L (2011) Lophomonas misidentification in
bronchoalveolar lavages. Intern Med 50: 2721
Qiang H, Xiuju C, Jianghua C (2011) Authors reply to Lophomonas misidentification in
bronchoalveolar lavages. Intern Med 50: 2723
Smejkalová P, Petrželková KJ, Pomajbíková K, Modrý D, Čepička I (2012) Extensive diversity
of intestinal trichomonads of non-human primates. Parasitology 139: 92-102
35
Download

Toxoplasma, Pneumocystis, Trichomonas, Leptospira – co mají