Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A,
Efinska-Mladenovska O, Hristomanova S, Spiroska E,
Sibinovska O, Petrov J
IMUNOLO[KI
PRAKTIKUM
- laboratoriska imunodijagnostika -
Institut za imunobiologija i humana genetika,
Medicinski fakultet, Univerzitet "Sv. Kiril i Metodij"
Skopje, 2006
Institut za imunobiologija i humana genetika
1
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
AVTORI
Prof. d-r Mirko Spiroski, asist. d-r Dejan Trajkov, asist. d-r Aleksandar Petli~kovski,
asist. d-r Todor Arsov, asist. d-r Ana Strezova, biotehnolog Olivija Efinska-Mladenovska,
d-r Slavica Hristomanova, d-r Eli Spiroska, molekularen biolog Olgica Sibinovska, d-r
Jordan Petrov, Institut za imunobiologija i humana genetika, Medicinski fakultet,
Univerzitet "Sv. Kiril i Metodij", Skopje.
CIP - Katalogizacija vo publikacija
Narodna i univerzitetska biblioteka "Sv. Kliment Ohridski", Skopje
612.017(076.5)(075.8)
IMUNOLO[KI praktikum : laboratoriska imunodijagnostika / Spiroski M, Trajkov
D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A, Efinska-Mladenovska O, Hristomanova S, Spiroska
E, Sibinovska O, Petrov J. - Skopje :Medicinski fakultet, Institut za imunobiologija i humana
genetika, 2006. - 240 str. : ilustr. ; 28 sm
Bibliografija: str. 240
ISBN 978-9989-9674-9-8
1. Spiroski, Mirko
a) Imunologija - Visoko{kolski u~ebnici - Ve`bi, laboratoriski
COBISS.MK-ID 68067338
© 2006 Institut za imunobiologija i humana genetika, Medicinski fakultet, Univerzitet
"Sv. Kiril i Metodij", Skopje
Site prava se za{titeni. Ovoj trud ne smee da bide preveden ili kopiran vo celina ili negov del
bez potpi{ana dozvola od izdava~ot (Institut za imunobiologija i humana genetika, Medicinski
fakultet, Univerzitet "Sv. Kiril i Metodij", Skopje). Zabraneto e bilo kakvo skladirawe i
arhivirawe, elektronsko prilagoduvawe, kompjutersko programirawe ili koristewe so nekoja sli~na
ili razli~na tehnologija poznata do denes ili koja }e se razvie podocna.
Pe~ati: pe~atnica PROpoint grafi~ki centar, Skopje
Tira`: 600 primeroci
Spored misleweto na Ministerstvoto za kultura na Republika Makedonija za knigata
Imunolo{ki praktikum se pla}a povlastena dano~na stapka.
2
Institut za imunobiologija i humana genetika
PREDGOVOR
PREDGOVOR
Predmetot imunologija za prv pat e voveden vo {estogodi{niot sistem na studii na Medicinskiot fakulet
vo Skopje vo u~ebnata 1993/94 godina. Predmetot se
slu{a{e vo zimskiot semestar od treta godina (5.
semestar) so vkupen fond od 30 ~asovi (15 ~asa teoretska
nastava + 15 ~asa prakti~na nastava). Vo po~etokot
celokupnata teoretska i prakti~na nastavata ja
izveduvaa nastavnici i asistenti po fiziologija od
Institutot za fiziologija i nastavnici i asistenti
po transfuziologija od Republi~kiot zavod za transfuziologija.
Institut za imunobiologija i humana genetika
3
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Vo tekot na 1994 godina bea raspi{ani izbori i bea
izbrani prviot nastavnik i prvite asistenti po
predmetot imunologija. Na 02.03. 1995 godina e konstituirana prvata Katedra za imunologija na Medicinskiot fakultet vo Skopje. Od 2001? predmetot Imunologija se slu{a{e vo ~etvrtiot semestar (vtora godina)
so fond na ~asovi 15+15 i so dopolnitelni 15 ~asovi
seminari. Od u~ebnata 2005/06 zapo~na Evropskiot
kreditniot transfer sistem (EKTS) na Medicinskiot
fakultet vo Skopje, spored koj predmetot Imunologija
se slu{a so fond na ~asovi 24+21 (45) vo tretiot semestar
(vtora godina).
Vo juni mesec 1995 godina izleze od pe~at prviot u~ebnik
po imunologija, odnosno knigata Osnovni imunolo{ki
metodi nameneta za prakti~nata nastava od ovoj
predmet. Vo 2005 izleze od pe~at knigata Imunolo{ki
praktikum za prakti~nata nastava od predmetot
imunologija vo izdanie na Institutot za imunobiologija
i humana genetika. Vrabotenite od Institutot se
zafatija so zada~a da napi{at Imunolo{ki praktikum
- imuno-dijagnostika spored programata za EKTS i da
im go stavat na raspolagawe na studentite.
Vo ovoj praktikum se vneseni sedum blokovi od ve`bi od
imunodijagnostikata vo imunologijata. Sekoj blok e
sotaven od tri ve`bi, od koi prvite dve se laboratoriski
metodi za imunodijagnostika, a tretata ve`ba e
tolkuvawe na rezultatite od soodvetanata oblast na
imunologijata. Kon ovie sedum blokovi, odnosno 21 ve`ba
se ponudeni dopolnitelni materijali vo oblik na video
ise~oci (na kompakt disk) za polesno sovladuvawe na
materijalot. Kon sekoja ve`ba za tolkuvawe na imunolo{kite rezultati dodadeni se analizi na slu~ai so cel
studentite da gi povrzat imunolo{kite rezultati so
idnite klini~ki disciplini vo koi }e go primenat
steknatoto znaewe od imunologijata.
Studentite treba da gi sovladaat predvidenite materijali pred da prisustvuvaat na ve`bi za da osvojat
najgolem broj poeni i so toa povisoka ocenka.
Se nadevam deka praktikumot }e im bide od korist na
studentite i deka }e pretstavuva dobra osnova za
donesuvawe na novata nastavna programa od ovoj predmet.
Prof. d-r Mirko Spiroski
Skopje, noemvri 2006 godina
4
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected]
[email protected]
PREDGOVOR .....................................................................................................................................................................................3
[email protected] .................................................................................................................................................................................... 5
BLOK 1- VRODEN IMUN SISTEM ...........................................................................................................................................9
[email protected] 1: ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM ............................................................................. 11
1.1. Ispituvawe imunolo{kata funkcija na fagocitite ...........................................................................................................11
1.2. Kvalitativen NBT test ...................................................................................................................................................... 12
1.3. Kvantitativen NBT test ..................................................................................................................................................... 12
1.4. Zada~a ...................................................................................................................................................................................... 15
[email protected] 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM ..................................................................... 17
2.1. Proteini na akutna faza (PAF) ...................................................................................................................................... 17
2.1.1. Akutno fazen odgovor ................................................................................................................................................. 17
2.1.2. Regulacija na akutno faznite promeni .................................................................................................................... 18
2.1.2.1. Indukcija na proteinite od akutna faza so citokini i drugi signalni molekuli ............................ 20
2.1.2.2. Regulacija na drugite akutno fazni promeni so vospalitelno asociranite citokini ......................... 21
2.1.3. Funkcii na akutno fazniot odgovor ........................................................................................................................ 22
2.2. Opredeluvawe koncentracija na akutno fazni proteini so imunoturbidimetrija............................................... 23
2.2.1. Principi na imunoturbidimetrija........................................................................................................................... 23
2.2.2. Kalibracija ................................................................................................................................................................... 24
2.2.3. Sistem za temperaturna kompenzacija ..................................................................................................................... 25
2.2.4. Procedura ...................................................................................................................................................................... 25
2.3. Zada~a .................................................................................................................................................................................... 26
[email protected] 3: ANALIZA NA VRODEN IMUN SISTEM .................................................................................................... 27
3.1. Tolkuvawe rezultati od vroden imun sistem ................................................................................................................ 27
3.1.1. Normalni vrednosti od ispituvawe kleto~en vroden imun sistem ................................................................... 27
3.1.2. Klini~ka primena na akutno faznite proteini ................................................................................................... 29
BLOK 2 - IMUNI KLETKI .................................................................................................................................................... 31
[email protected] 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM .................................................................................................................. 33
4.1. Dvoewe limfociti i monociti od periferna krv ..................................................................................................... 33
4.1.1. Op{ti napomeni ........................................................................................................................................................... 33
4.1.2. Postapka za dvoewe limfociti od periferna krv ............................................................................................... 34
4.1.3. Broewe kletki so hemocitometar ............................................................................................................................. 35
4.1.4. Ispituvawe `ivi i mrtvi kletki ............................................................................................................................. 37
4.2. Imunofluorescencija ....................................................................................................................................................... 38
4.2. 1. Fluorescentna mikroskopija ................................................................................................................................... 39
4.2.1.1. Fluorescentna mikroskopija so propusno svetlo ........................................................................................ 39
4.2.1.2. Fluorescentna mikroskopija so pa|a~ko svetlo .......................................................................................... 40
4.2.2. Dobivawe kowugirani protivtela ........................................................................................................................... 41
4.2.3. Podgotovka na tkiva i kletki ................................................................................................................................... 42
4.2.3.1. Tkivni preparati .................................................................................................................................................. 42
4.2.3.2. Parafinski preparati ......................................................................................................................................... 43
4.2.3.3. Kleto~ni preparati ............................................................................................................................................ 43
4.2.4. Boewe, ot~ituvawe i dokumentirawe ...................................................................................................................... 44
4.2.4.1. Direktna imunofluorescencija (DIF) ............................................................................................................ 44
4.2.4.2. Indirektna imunofluorescencija (IIF) ...................................................................................................... 45
4.2.4.3. Sistemot biotin-avidin ................................................................................................................................... 45
4.2.4.4. Kvantitativna imunofluorescencija ............................................................................................................ 46
4.2.4.5. Gre{ki i la`no pozitivni rezultati............................................................................................................. 47
4.2.4.6. Dokumentirawe na rezultatite (fotografirawe) .................................................................................... 47
4.3. Zada~a .................................................................................................................................................................................... 48
[email protected] 5: PROTO^NA CITOMETRIJA ........................................................................................................................... 49
5.1. Sistem za proto~na citometrija........................................................................................................................................ 49
5.1.1. Proto~na citometrija ................................................................................................................................................. 50
5.1.2. Te~ni sistemi ................................................................................................................................................................ 50
5.1.3. Opti~ki sistem ............................................................................................................................................................... 51
5.1.4. Analiza na podatocite .................................................................................................................................................. 53
5.1.4.1. Analiza ........................................................................................................................................................................ 53
5.1.4.2. Nadomest (kompenzacija) ....................................................................................................................................... 56
5.1.4.3. Skladirawe podatoci ............................................................................................................................................. 56
5.1.5. Proto~no sortirawe kletki ........................................................................................................................................ 57
5.2. Funkcionalen test za kletki prirodni ubijci (KPU) ................................................................................................ 57
5.2.1. Osnovi na testot ............................................................................................................................................................. 57
5.2.2. Protokol za rabota ...................................................................................................................................................... 58
Institut za imunobiologija i humana genetika
5
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
5.2.2.1. Op{ti podgotovki ................................................................................................................................................ 58
5.2.2.2. Izolacija na efektornite kletki .................................................................................................................... 58
5.2.2.3. Odmrznuvawe na K562 kleto~nata linija ......................................................................................................... 59
5.2.2.4. Priprema na primerokot za merewe ................................................................................................................... 59
5.2.2.5. Merewe i analiza na podatocite dobieni so proto~niot citometar .................................................... 60
5.3. Zada~a .................................................................................................................................................................................... 60
[email protected] 6: TOLKUVAWE REZULTATI OD KLETO^EN IMUNITET ..................................................................... 61
6.1. Normalni vrednosti na beli kletki ............................................................................................................................... 61
6.2. Imunofenotipizirawe ...................................................................................................................................................... 62
6.2.1. Voved ................................................................................................................................................................................. 62
6.2.2. Dijagnoza na hematolo{ki maligniteti ..................................................................................................................... 63
6.2.3. Ostanati klonalni/genetski hematolo{ki i imunolo{ki zaboluvawa.............................................................. 65
6.2.4. Transplantacija ............................................................................................................................................................. 65
6.2.5. Dijagnoza i sledewe na infektivnite zaboluvawa i imuni nedostatoci .......................................................... 66
6.3. Tolkuvawe rezultati od funkcionalni testovi vo kleto~en imunitet .................................................................. 67
6.3.1. Funkcionalen test za kletki prirodni ubijci ....................................................................................................... 67
6.3.1.1. O~ekuvani rezultati ............................................................................................................................................. 68
BLOK 3 - IMUNOGLOBULINI ....................................................................................................................................... 69
[email protected] 7: [email protected] PROTIVTELA - IMUNOPRECIPITACIJA ..................................................................... 71
7.1. Precipitacija vo te~na sredina ................................................................................................................................. 71
7.2. Dvojna imunodifuzija na agar...................................................................................................................................... 72
7.3. Edine~na (radijalna) imunodifuzija na agar .......................................................................................................... 74
7.4. Imunoelektroforeza.................................................................................................................................................... 77
7.5. Zada~i .................................................................................................................................................................................... 77
[email protected] 8: PROTIVTELEN ODGOVOR ............................................................................................................................... 79
8.1.Broewe protivtela sekretira~ki B limfociti ..................................................................................................... 79
8.2.Imunonefelometrisko opredeluvawe imunoglobulinski klasi i potklasi ......................................................... 81
8.2.1. Princip na imunonefelometrija............................................................................................................................... 81
8.2.2. Opti~ki pateki na svetlinata .................................................................................................................................... 81
8.2.3. Principi na imunoturbidimetrisko merewe .......................................................................................................... 82
8.2.4. Predreakcii ................................................................................................................................................................... 84
8.2.5. Proveruvawe turbiditet .............................................................................................................................................. 85
8.3. Zada~i .................................................................................................................................................................................... 85
8.3.1. Izbroj IgM sekretira~i splenociti od gotova plo~a ........................................................................................... 85
8.3.2. Izmeri koncentracija na Ig klasi so imunonefelometar .................................................................................... 86
[email protected] 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET ................................................................................................. 91
9.1. Normalni vrednosti od ispituvaweto humoralen imunitet ...................................................................................... 91
9.2. Klini~ko zna~ewe na imunoglobulinskite klasi i potklasi .................................................................................. 92
9.2.1. Hipogamaglobulinemii ................................................................................................................................................ 92
9.2.1.1. Prvi~ni imunonedostatoci ................................................................................................................................ 93
9.2.1.2. Vtori~ni imunonedostatoci ............................................................................................................................. 99
9.2.2. Poliklonski i oligoklonski gamopatii ................................................................................................................. 99
9.2.3. Monoklonski gamopatii .............................................................................................................................................. 100
BLOK 4 - KOMPLEMENTEN SITEM I CITOKINI .................................................................................................. 101
[email protected] 10: KOMPLEMENTEN SISTEM .......................................................................................................................... 103
10.1. Opredeluvawe CH50 na komplementot ........................................................................................................................ 104
10.2. Ispituvawe koncentracija na K3, K4 i K1inh .......................................................................................................... 107
10.2.1. Radijalna imunodifuzija (RID) ............................................................................................................................. 107
10.2.2. Odreduvawe na K3 komponentata od komplementot so radijalna imunodifuzija ........................................ 109
10.2.3. Odreduvawe na K4 komponentata od komplementot so radijalna imunodifuzija ......................................... 110
10.2.4. Odreduvawe na K1 inhibitor komponentata od komplementot so radijalna imunodifuzija ..................... 110
10.3. Zada~a ................................................................................................................................................................................. 111
[email protected] 11: CITOKINI ......................................................................................................................................................... 113
11.1. Zasituva~ki metodi ........................................................................................................................................................ 113
11.1.1. Op{ti principi na zasituva~kite metodi ............................................................................................................. 113
11.2. Imunoenzimski odreduvawa (ELISA) ........................................................................................................................ 114
11.2.1. Podgotovka na imunoatsorbentot .......................................................................................................................... 114
11.2.2. Kowugirawe ................................................................................................................................................................. 115
11.2.3. Spojuvawe enzim so protivtelo ili protivgen .................................................................................................... 115
11.2.4. Odvivawe na reakcijata ............................................................................................................................................. 115
11.2.5. ^itawe na rezultatot ................................................................................................................................................. 116
11.3. Odreduvawe koncentracija na citokini ..................................................................................................................... 116
11.3.1. Op{to za odreduvaweto citokini ......................................................................................................................... 116
11.3.2. Izveduvawe na ve`bata (Odreduvawe koncentracija na interleukin 1b) ......................................................... 118
11.3.2.1. Potreben materijal za izveduvawe na ve`bata ............................................................................................ 118
11.3.2.2. Priprema na pufer za plaknewe na bunar~iwata ........................................................................................ 118
11.3.2.3. Priprema na rabotniot rastvor na citokinskiot standard ............................................................... 119
11.3.2.4. Priprema na zasiluva~kiot rastvor Amdex ................................................................................................. 119
11.3.2.5. Standarden rastvor za razreduvawe ............................................................................................................... 119
11.3.2.6. Primerok ................................................................................................................................................................. 119
11.3.2.7. Protokol za rabota ............................................................................................................................................ 120
11.3.2.7.1. Prigotvuvawe na standardite ............................................................................................................ 120
11.3.2.7.2. Izveduvawe na testot ............................................................................................................................ 120
11.3. Zada~a ................................................................................................................................................................................... 123
[email protected] 12: ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI ............................................................ 125
12.1. Normalni vrednosti od ispituvawe komplementen sistem ..................................................................................... 125
12.2. Tolkuvawe rezultati od komplementen sistem ......................................................................................................... 126
12.2.1. CH50 .............................................................................................................................................................................. 126
12.2.2. K3 i K4 .......................................................................................................................................................................... 127
12.2.3. K1-inhibitor ............................................................................................................................................................... 127
12.2.4. Hiperkomplementemija ............................................................................................................................................. 127
12.2.5. Hipokomplementemija ............................................................................................................................................... 128
12.3. Normalni vrednosti od citokini .................................................................................................................................. 130
12.4. Dijagnosti~ko zna~ewe na citokinite ........................................................................................................................ 131
6
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected]
BLOK 5 - TRANSPLANTACIJA..................................................................................................................................... 133
[email protected] 13: [email protected] GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS ................................................. 135
13.1. Op{to za HLA ........................................................................................................................................................... 135
13.1.1. [to e HLA ............................................................................................................................................................ 135
13.1.2. Genomska struktura i polimorfizam ............................................................................................................... 137
13.1.3. Metodi za tipizirawe na HLA .......................................................................................................................... 137
13.1.4. Serolo{ki metodi ...................................................................................................................................................... 138
13.1.5. Nomenklatura ....................................................................................................................................................... 139
13.2. Serolo{ki metodi za tipizirawe na HLA .......................................................................................................... 139
13.2.1. Neophodni uslovi .................................................................................................................................................. 140
13.2.2. Prigotvuvawe limfocitna suspenzija ............................................................................................................ 140
13.2.3. Mikrolimfocitotoksi~en test ....................................................................................................................... 141
13.2.4. Rezultati ............................................................................................................................................................... 142
13.3. Zada~a ................................................................................................................................................................................. 143
[email protected] 14: GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS ............................... 145
14.1. Genska struktura na GTSK i negovi polimorfizmi ................................................................................................ 145
14.2. Molekulski metodi za HLA tipizacija ....................................................................................................................... 146
14.3. Principi na molekularnite metodi za HLA tipizacija ........................................................................................ 146
14.3.1. SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probing) ................................................................................................... 146
14.3.2. RLS (Reverse Line Strip) – reverzna hibridizacija ................................................................................................. 147
14.3.3. SSP (Sequence Specific Priming) ................................................................................................................................. 148
14.3.4. SBT (Sequence Based Typing) ....................................................................................................................................... 148
14.4. Nivoa na HLA tipizacija ............................................................................................................................................... 149
14.5. Dvojbenost (ambigvitet) ................................................................................................................................................. 149
14.6. Nomenklatura ..................................................................................................................................................................... 150
14.7. Izveduvawe na ve`bata .................................................................................................................................................. 152
14.7.1. RLS (Reverse Line Strip) .............................................................................................................................................. 152
14.7.2. SSP (SSP-Sequence Specific Priming) ......................................................................................................................... 153
14.8. Zada~i ................................................................................................................................................................................ 155
14.8.1. Interpretiraj gi alelite za HLA lokusot od nitroceluloznite lenti
dobieni so metodot na reverzna hibridizacija (RLS) ............................................................................. 155
14.8.2. Interpretiraj gi alelite za HLA lokusot so metodot na SSP na visoko razdelno nivo ............................ 157
[email protected] 15: ANALIZA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS ........................................................ 159
15.1. Normalni vrednosti za glavniot tkivno sovpadliv kompleks .............................................................................. 159
15.2. Bolesti povrzani so GTSK ............................................................................................................................................. 160
15.2. Analiza na GTSK asocijacija i bolesti ..................................................................................................................... 160
15.3. Asocijacija so haplotipovi ........................................................................................................................................... 162
15.4. Zna~ewe na HLA sistemot vo transplantacija .......................................................................................................... 162
15.4.1. Barawe daritel ........................................................................................................................................................... 163
15.4.2. Tolkuvawe rezultati ................................................................................................................................................. 163
BLOK 6 - PREOSETLIVOST ................................................................................................................................................. 165
[email protected] 16: TIP 1 PREOSETLIVOST ............................................................................................................................. 167
16.1. Reakcii na preosetlivost ............................................................................................................................................... 167
16.2. Odreduvawe vkupen IgE i specifi~ni IgE protivtela ........................................................................................ 167
16.2.1. Alergeni ...................................................................................................................................................................... 167
16.2.1.1. Vdi{eni (inhalatorni) alergeni .................................................................................................................... 168
16.2.1.2. Hrani ...................................................................................................................................................................... 168
16.2.1.3. Antibiotici, drugi lekovi i hemikalii .................................................................................................... 169
16.2.1.4. Profesionalni alergeni ................................................................................................................................... 170
16.2.1.5. Razli~ni rastitelni produkti ..................................................................................................................... 170
16.2.1.6. Kontaktni alergeni .......................................................................................................................................... 170
16.2.1.7. Osnovni principi za vkrstena reaktivnost me|u rastitelni alergeni ................................................ 170
16.2.2. IgE posreduvana alergija ......................................................................................................................................... 171
16.2.3. Dijagnosticirawe na IgE posreduvana alergija.................................................................................................. 172
16.2.4. Princip za opredeluvawe specifi~en IgE ........................................................................................................... 172
16.3. Razlikuvawe atopiski od ne-atopiski bolesti .......................................................................................................... 173
16.3.1. UniCap Phadiatop ........................................................................................................................................................... 173
16.3.2. UniCap fx5 ....................................................................................................................................................................... 174
16.3.3. UniCap vkupen IgE ...................................................................................................................................................... 175
16.4. Dijagnosti~ki pomagala za specifi~ni alergii ........................................................................................................ 175
16.4.1. UniCap specifi~en IgE ............................................................................................................................................ 175
16.4.2. UniCap specifi~en IgA ............................................................................................................................................ 177
16.4.3. UniCap glijadin IgA .................................................................................................................................................. 178
16.4.4. UniCap specifi~en IgG ............................................................................................................................................. 179
16.4.5. UniCap glijadin IgG ................................................................................................................................................... 180
16.4.6. UniCap eozinofilen katjonski protein (EKP) ..................................................................................................... 180
16.4.7. UniCap triptaza ........................................................................................................................................................... 181
16.5. Zada~i ................................................................................................................................................................................. 182
16.5.1. Odredi vkupen i specifi~en IgE vo serum .......................................................................................................... 182
[email protected] 17: TIP 2 I TIP 3 PREOSETLIVOST ............................................................................................................. 187
17.1. Aglutinacija .................................................................................................................................................................... 187
17.1.1. Objasnuvawe mehanizmot na aglutinacija ........................................................................................................ 189
17.2. Direkten protivglobulinski test (DPT) ............................................................................................................ 189
17.2.1. Zemawe primerok ................................................................................................................................................ 190
17.2.2. Materijal ............................................................................................................................................................... 190
17.2.3. Metod ...................................................................................................................................................................... 190
17.2.4. Zabele{ki ............................................................................................................................................................. 192
17.2.5. Titar kaj antiglobulinskite testovi ............................................................................................................... 193
17.3. Indirekten protivglobulinski test ..................................................................................................................... 195
17.3.1. Potrebni materijali .......................................................................................................................................... 195
17.3.2. Metod ...................................................................................................................................................................... 195
17.3.3. Zabele{ki ............................................................................................................................................................. 196
17.4. Opredeluvawe cirkulira~ki imuni kompleksi so precipitacija so polietilen glikol .................................. 196
17.5. Zada~a ........................................................................................................................................................................... 198
Institut za imunobiologija i humana genetika
7
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
[email protected] 18: ANALIZA NA PREOSETLIVOST ............................................................................................................. 199
18.1. Normalni vrednosti za vkupen i za specifi~en IgE ................................................................................................ 199
18.2. Klini~ki simptomi za alergija i nivno dijagnosticirawe ................................................................................... 199
18.2.1. Oddelno ispituvawe alergeni ................................................................................................................................. 201
18.2.2. Ispituvawe komplet alergeni ....................................................................................................................................201
18.2.3. Ispituvawe alergeni spored dijagnoza................................................................................................................... 203
18.3. Tolkuvawe rezultati od protivglobulinski test ...................................................................................................... 204
18.3.1. Direkten protivglobulinski test ......................................................................................................................... 204
18.3.2. Indirekten protivglobulinski test ...................................................................................................................... 206
BLOK 7 - AVTOIMUNITET .................................................................................................................................................. 207
[email protected] 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET ................................................................................................................. 209
19.1. Voved za avtoimunost ...................................................................................................................................................... 209
19.2. Otkrivawe na avtoprotivtela ....................................................................................................................................... 210
19.2.1. Indirektna imunofluorescencija .......................................................................................................................... 211
19.2.2. Aglutinacija ....................................................................................................................................................................211
19.2.3. Imunodifuzija ............................................................................................................................................................. 211
19.2.4. Imunoprecipitacija ................................................................................................................................................... 211
19.2.5. Imunoblotirawe ........................................................................................................................................................... 212
19.2.6. ELISA ......................................................................................................................................................................... 212
19.2.7. ELIA ............................................................................................................................................................................ 213
19.2.8. Primerok za ispituvawe ........................................................................................................................................... 213
19.2.9. Stabilnost na protivtelata ..................................................................................................................................... 213
19.3. Sistemski avtoimuni zaboluvawa ................................................................................................................................. 213
19.3.1. Protivtela povrzani so revmatska bolest ............................................................................................................ 213
19.3.1.1. Fosfolipidni protivtela ................................................................................................................................ 213
19.3.1.2. Nuklearni protivtela (ANA) ......................................................................................................................... 214
19.3.2. Protivtela kon neutrofilnata citoplazma ........................................................................................................ 214
19.3.3. Sistemski lupus eritematozus (SLE) ................................................................................................................... 215
19.3.3.1. O{tetuvawe na tkivoto .................................................................................................................................. 215
19.4. Zada~a ................................................................................................................................................................................... 216
19.4.1. Opredeluvawe IgM protivkardiolipinski protivtela ................................................................................... 216
19.4.1.1. Potreben materjal za izveduvawe na ve`bata ............................................................................................... 216
19.4.1.2. Priprema na pufer za plaknewe ........................................................................................................................ 217
19.4.1.3. Priprema na rastvor za razreduvawe ............................................................................................................... 217
19.4.1.4. Primerok ................................................................................................................................................................. 217
19.4.1.5. Protokol za rabota............................................................................................................................................ 218
19.4.1.6. Presmetuvawe na rezultatite ....................................................................................................................... 219
19.4.1.7. Presmetuvawe koncentracija na IgM protivkardiolipinskite protivtela .................................... 219
[email protected] 20: ORGAN SPECIFI^EN AVTOIMUNITET ............................................................................................ 221
20.1. Organ specifi~ni avtoimuni zaboluvawa ................................................................................................................ 221
20.1.1. Endokrini avtoimuni bolesti ................................................................................................................................. 221
20.1.1.1. Protivtela kon parietalni gastri~ni kletki ......................................................................................... 221
20.1.1.2. Protivtela kon intrinzik faktorot ........................................................................................................ 221
20.1.1.3. Avtoprotivtela povrzani so dijabetes ....................................................................................................... 222
20.1.1.4.Tiroidni avtoprotivtela ............................................................................................................................... 222
20.1.2. Gastrointestinalni avtoimuni bolesti ............................................................................................................... 223
20.1.2.1. Protivtela povrzani so celijakija ................................................................................................................ 223
20.1.3. Avtoimuna bolest na crniot drob .......................................................................................................................... 223
20.1.4. Protivtela povrzani so nevromuskularni bolesti ............................................................................................. 224
20.1.4.1. Protivtela kon acetilholinski receptori ............................................................................................... 224
20.1.5. Avtoprotivtela povrzani so bubre`na bolest ...................................................................................................... 224
20.1.5.1. Protivtela kon glomerulskata bazalna membrana ..................................................................................... 224
20.2. Zada~i ................................................................................................................................................................................ 225
20.2.1. Opredeli koncentracija na tiroidni avtoprotivtela (TG i TPO) .................................................................. 225
[email protected] 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA ...................................................................................... 229
21.1. Normalni vrednosti za sistemski avtoprotivtela................................................................................................... 229
21.2. Normalni vrednosti za organ specifi~ni protivtela ............................................................................................ 230
21.3. Tolkuvawe sistemski avtoprotivtela .......................................................................................................................... 231
21.3.1. Avtoprotivtela kon dvoveri`na DNK (dvDNK) ................................................................................................. 232
21.3.2. U1RNP ........................................................................................................................................................................... 232
21.3.3. RNP70 ............................................................................................................................................................................. 232
21.3.4. Sm ................................................................................................................................................................................. 232
21.3.5. Ro ................................................................................................................................................................................... 233
21.3.6. La ................................................................................................................................................................................... 233
21.3.7. CENP .......................................................................................................................................................................... 233
21.3.8. Scl-70 ............................................................................................................................................................................ 233
21.3.9. Jo-1 ................................................................................................................................................................................ 233
21.3.10. Avtoprotiv tela kon proteinaza 3 (PR3) .............................................................................................................. 233
21.3.11. Avtoprotiv tela kon mieloperoksidaza (MPO) ............................................................................................... 233
21.3.12. Avtoprotiv tela kon alfa3 lanecot na kolagen 4 (GBM) ................................................................................ 234
21.3.13. Kardiolipinski protivtela .................................................................................................................................. 234
21.4. Tolkuvawe organ specifi~ni avtoprotivtela ......................................................................................................... 235
21.4.1. Antitiroglobulinski protivtela (TG) ................................................................................................................ 235
21.4.2. TPO ............................................................................................................................................................................... 235
21.4.3. Protivtela kon parietalni kletki ........................................................................................................................ 236
21.4.4. Test za GBM protivtela ........................................................................................................................................... 236
21.4.5. Test za protivspermalni protivtela .................................................................................................................... 237
21.4.6. Protivmitohondrijalni protivtela ....................................................................................................................... 237
21.4.7. LKM1 protivtela........................................................................................................................................................ 238
22. OSNOVNI LABORATORISKI PRAVILA ................................................................................................................ 239
23. LITERATURA ....................................................................................................................................................................... 240
8
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 1: ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM
BLOK 1
BLOK 1 - VRODEN IMUN SISTEM
U^EBNI CELI:
[email protected] 1. ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN
SISTEM (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da:
“ go definiraat mestoto na fagocitozata vo vrodeniot
imunitet;
“ ja opredelat fagocitnata sposobnost vo eden fagocit.
[email protected] 2. ISPITUVAWE HUMORALEN IMUN
SISTEM (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat:
“ da gi protolkuvaat proteini na akutna faza;
“ da ja opredelat koli~inata na nekoi proteini na
akutna faza vo plazma.
[email protected] 3. ANALIZA NA SLU^AI OD VRODEN IMUN
SISTEM (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da:
“ tolkuvaat rezultati od vrodeniot imun sistem;
“ analiziraat slu~ai od vroden imun sistem.
POENI:
PRISUSTVO
1.5 poeni
ZNAEWE
3.0 poeni
VKUPNO: 4.5 poeni
Institut za imunobiologija i humana genetika
9
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
10
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 1: ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM
[email protected] 1: ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM
1.1.Ispituvawe imunolo{kata
funkcija na fagocitite
Fagocitnite kletki, polimorfonuklearnite neutrofili
i mononuklearnite fagociti (makrofagi, monociti), imaat
mnogu va`na imunolo{ka funkcija vo efektorniot del na
imunolo{kiot odgovor i vo vospalitelnata reakcija. Pri
bakteriska ili fungi~na agresija vrz organizmot prvi
reagiraat polimorfonuklearite, a potoa se vklu~uvaat i
mononuklearnite fagociti. Nivnata imunolo{ka funkcija
se izrazuva pred s# preku procesot na fagocitoza, koj
najkuso prika`ano, mo`e da se podeli vo nekolku fazi
(Slika 1.1):
Institut za imunobiologija i humana genetika
Slika 1.1: Sedumte fazi od fagocitoza na bakterii.
11
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
- naso~uvawe na fagocitite kon kletkata cel, tu|iot
agens (fenomen na lokomocija) i prilepuvawe do mikrobite;
- goltnuvawe na mikrobite so fagocitoza;
- sozdavawe fagozom;
- soedinuvawe na fagozomot so lizozomot i sozdavawe
fagolizozom;
- digestija na kletkata cel (kleto~no i biohemisko
ubivawe) niz procesot na oksidativen metabolizam;
- 1.5 mL krv
- 15 mkl endotoksin
- 0.3 mL NBT
- 10 min na 37oC
- 2h2 mL SFP
- 2 kapki HCL
- 2 mL voda
- sozdavawe ostato~no telce koe sodr`i nerazgraden
materijal;
- isfrlawe na ostato~niot materijal.
Pri ispituvawe na imunolo{kata funkcija na fagocitite
neophodno e da se postigne procenka vo site fazi od procesot na fagocitoza, za {to denes postojat brojni laboratoriski metodi, a del od niv ovde }e bide prika`an.
1.2. Kvalitativen NBT test
Vo osnova se opredeluva redukcijata na NBT preku
superoksid anjon, koj se javuva kako proizvod od aktiviranata oksidacija. Reduciraniot NBT ima karakteristika
da se talo`i vo forma na crni zrnca od formazan. Postojat
pove}e modifikacii na metodot, no najkoristeni se citohemiskite koi go opredeluvaat procentot na polimorfonukleari ili monociti {to sodr`at precipitirani zrnca
od formazan. Ovaa redukcija ne e specifi~na bidej}i NBT
mo`e da go reduciraat i drugi reduktazi nezavisno od
oksidativniot metabolizam. Sepak, ovoj test e mnogu
pogoden za dijagnoza na steknati ili vrodeni granulopatii.
A
-
B
5 mL dioksan
20 min na 70 oC
10 min na 1000g
se meri na 520 nm
Slika 1.2: [ematski prikaz na
kvantitativen nitroblu tetrazolium test (NBT) za
ispituvawe fagocitnata
sposobnost na imunite kletki.
12
Mo`e da se koristi polna krv ili ve}e izdvoeni kletki.
Na 100 mikrolitri periferna krv se dodava 100 mikrolitri
rastvor od NBT (2 mg/mL), se inkubira 15 min/37oC i potoa
se vr{i stimulirawe na fagocitite so rastvor od
endotoksin (15 mkg/mL), ili suspenzija od ubieni bakterii
ili phorbol myristate acetate (50 - 100 ng/mL). Povtorno se
inkubira 15 min na 37oC i se fiksira so formaldehid.Taka
se liziraat eritrocitite, a drugite kletki so pomo{ na
citocentrifuga se postavuvaat na predmetno staklence. Se
vr{i sprotivno obojuvawe so fuchsine i mikroskopski se
opredeluva procentot na kletkite koi sodr`at precipitiran reduciran NBT.
1.3. Kvantitativen NBT test
Dodavaweto `olta NBT boja vo plazmata doveduva do
formirawe NBT-heparin ili NBT-fibrinogen kompleks
{to mo`e da bide fagocitiran od neutrofilot. Kaj normalnite neutrofili mo`e da se zgolemi fagocitnata
aktivnost so dodavawe (stimulirawe) endotoksin. Ovoj
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 1: ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM
metod mo`e da se upotrebi za da se izmeri stepenot na
stimulacijata na nestimuliranite kletki ili nivniot
kapacitet za fagocitoza po stimulacijata. Stimuliranite
neutrofili go vgraduvaat kompleksot na boja vo fagozomite i po lizozomalnata fuzija, intracelularnata redukcija
doveduva do formirawe sini nerastvorlivi kristali na
formazan. Procentot na fagocitnite kletki mo`e da bide
opredelen so svetlosen mikroskop, a vkupnata redukcija
na bojata mo`e da bide kvantificirana spektrofotometriski po dioksanskata ekstrakcija.
A
Potrebno za izveduvawe na ve`bata:
Se zema venska krv so heparin (20 IE/mL); destilirana voda;
solen fosfaten pufer; endotoksin od escherihia coli 1 mg/mL
vo SFP; 4 mmol NBT vo SFP koj sodr`i 340 mmol saharoza;
dioksan; 0.1 mol HCl; najlonska volna 100 mg vo silikonizirani pasterovi pipeti; vodena bawa na 37 i na 70o C;
spektrofotometar; pasterovi pipeti ili mikrokoloni
(NEN); askorbinska kiselina.
Se prigotvuvaat slednive materijali:
B
- 340 mmol saharoza. Se merat 11.62 g saharoza, se stavaat vo
kolba od 100 mL, se dodava destilirana voda do 100 mL.
- Solen fosfaten pufer- KH2 PO4 0.20 g, Na2 HPO4 1.44 g,
KCl 0.20 g, NaCl 8.00 g, H2O destilirana do 1000 mL.
- 4 mmol NBT vo solen fosfaten pufer vo 340 mmol
saharoza. Se merat 11.628 g saharoza, 0.29 g NBT,
volumenot do 100 mL se dopolnuva so SFP.
- 0.1 mol HCl. Se zemaat 0.83 mL od 37% HCl i se dopolnuva do 100 mL so destilirana voda.
V
- 150 mikromoli askorbinska kiselina = 26.4 mg.
- 0.1 mol NaOH so 24 mmol Na2HCO3. Se merat 400 mg NaOH,
se stavaat vo kolba od 100 mL, se dodavaat 50 mL
destilirana voda za da se rastvori natrium hidroksidot
i vo nego se dodavaat 0.201 g Na2HCO3 i se dopolnuva so
destilirana voda do 100 mL.
- 4 mmol NBT vo 340 mmol saharoza. Se merat 3 mg NBT i
se stavaat 1 mL 340 mmol saharoza.
G
- Najlonska volna.
Najlonskata volna se vari vo destilirana voda i vodata se
menuva najmalku tri pati, potoa se ras~e{luva i se su{i
na sobna temperatura. Se merat 100 mg i se vnesuvaat vo
pasterovi pipeti ili vo mikrokoloni (NEN) na ~ie dno se
nao|a filter disk ili malo koli~estvo staklena volna.
Funkcijata na najlonskata volna e da gi zadr`i fagocitnite kletki, koi imaat sposobnost za prilepuvawe
(atherencija) za vlaknata od najlonska volna.
Po`elno e da se koristat plasti~ni epruvetki, no do kolku
se raboti so stakleni sadovi, tie treba da se silikoniziraat za da se spre~i atherencijata na kletkite za
nivniot yid. Treba da se zeme predvid deka i neutrofilite
i monocitite imaat sposobnost za goltnuvawe (ingestija)
na NBT so fagocitoza. Faktorot za konverzija za
presmetuvawe moli od formazan spored koeficientot na
Institut za imunobiologija i humana genetika
Slika 1.3: Stapkite za izveduvawe na kvantitativniot
nitroblu tetrazolium test
(NBT) za ispituvawe fagocitnata sposobnost na imunite
kletki. A, stavawe krv vo dve
epruvetki (levo nestimulirana, desno stimulirana). B,
Nanesuvawe krv vrz najlonska
volna. V, Prefrlawe na najlonskata volna vo epruvetki so
dioksan za nivna ektrakcija.
G, kolorimetrisko opredeluvawe intenzitetot na sozdadeniot formazan.
13
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
ekstincija mora da bide presmetuvan za sekoe {i{ence boja,
po hemiskata redukcija, opi{ana podolu.
Testot se izvr{uva na sledniov na~in (slika 2):
1. Se zema venska krv so heparin (20 IE/mL) i od nea
treba da se napravi diferencijalna krvna slika.
2. Se dodavaat 15 mkL endotoksinski rastvor (1 mg/mL
vo SFP) na 1.5 mL krv za stimulacija (A) ili 15 mkL
fiziolo{ki rastvor kako kontrola (B) i se inkubira
na 37oC, 10 min.
3. Se dodava 0.3 mL sve`o podgotven rastvor na NBT i
vnimatelno se me{a.
4. Se dodava celata krv kapka po kapka vo najlonskite
koloni.
5. Otkako krvta }e navleze vo volnata, se mie dva pati
so 2 mL SFP, a potoa so 2 mL destilirana voda.
Destiliranata voda }e gi lizira crvenite krvni zrnca.
6. Se dodavaat po dve kapki 0.1 N HCl za da se prekine
natamo{nata redukcija na vnatrekleto~nata (intracelularnata) boja i potoa se mie so 2 mL destilirana
voda.
7. Se otstranuva volnata so eza (ili igla za pletewe) i
se stava vo 5 mL dioksan (vo staklen sad).
8. Se inkubira na 70oC so povremeno pojako tresewe
dodeka najlonskata volna ne si ja vrati belata boja (stoi
okolu 20 min).
9. Se centrifugira dioksanskiot ekstrakt za da se
otstrani precipitatot ili najlonskite ni{ki (1000 g,
10 min na sobna temperatura).
10. Se meri ekstincijata na 520 nm so spektrofotometar (kako slepa proba se koristi dioksan).
Ekstincioniot koeficient za sekoe {i{ence NBT se
opredeluva na sledniov na~in:
1. Se dodavaat 150 mkmol askorbinska kiselina (26.4 mg
supstancija) na 0.2 mL NBT rastvor (4 mmol vo saharoza)
i se me{a.
2. Se dodava 2.0 mL 0.1 M natrium hidroksid so natrium
bikarbonat.
3. Se inkubira 10 min na sobna temperatura i se dodavaat
5 mL destilirana voda.
4. Se centrifugira na 1000 g, 15 min na sobna temperatura.
5. Se plakne edna{ so voda i so centrifugirawe kako
vo to~ka 4. Se otstranuva supernatantot i se resuspendira siniot nerastvoren formazanski precipitat vo
10 mL dioksan.
6. Se rastvora 1 mL od suspenzijata vo 9.0 mL dioksan i
se inkubira na 70oC, 20 minuti.
7. Se ladi do sobna temperatura i se meri ekstincijata
na 520 nm so spektrofotometar koristej}i dioksan kako
slepa proba.
8. Se presmetuva faktorot na konverzija od vrednosta
na ekstincijata. Grubo ovoj faktor treba da bide okolu:
14
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 1: ISPITUVAWE KLETO^EN VRODEN IMUN SISTEM
1 ekstinciona edinica = 40 nmol formazan
Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite (Tabela 1):
1. Koristej}i go faktorot na konverzija, se odreduva brojot
na moli na formazan ekstrahirani od nestimuliranata i
stimuliranata krv so endotoksin.
2. Se presmetuva brojot na potencijalni fagociti (% na
apsolutniot broj se dol`i na neutrofili i monociti).
3. Rezultatite se izrazuvaat kako femtomoli (10-15M) na
formazan po eden fagocit. Normalno rastojanie za
netretirana krv e do 129 femtomoli formazan za sekoj
fagocit. Normalni granici za stimulirana krv se do 290
femtomoli formazan po fagocit.
Za da se presmetaat ovie vrednosti neophodni se diferencijalna formula i broj na beli krvni kletki vo 1 mL krv.
1.4. Zada~a
Izvadi krv od vena od kole{ka ili kolega i izvedi
kvantitativen NBT test so nestimulirana i stimulirana
krv i presmetaj gi vrednostite vo Tabela 1.1.
1. So pomo{ na kolorimetar se meri intenzitetot na
Primer
Otklon na skalata
na kolorimetarot
Izmereni EE
Faktor na
konverzija (1EE)
Vkupno sozdaden
formazan vo 1.5 mL
krv
Vkupno sozdaden
formazan vo 1 mL
krv
Slu~aj
nestimulirana
stimulirana
0.18 (0.01=1EE)
0.4 (0.01=1EE)
18
40
40 nmol formazan
40 nmol formazan
720 nmol (18h40)
1600 nM formazan
(40h40)
480 nmol formazan
1066.7 nmoli
formazan
Broj na beli
kletki vo 1 mm3
6000
Broj na beli
kletki vo 1 mL
6000000 (6000h1000)
Broj na fagocite
vo 1 mL krv
(Ne+Mo)
Sozdaden formazan
na eden fagocit
Tabela 1.1: Formular za
presmetuvawe NBT.
nestimulirana
stimulirana
60% (55%+5%) od 6000000 = 3600000
0.0001333 nM
formazan/ fagocit
(133.3
femtomoli/fagocit)
0.0002963 nM
formazan/fagocit
(296.3
femtomoli/fagocit)
Institut za imunobiologija i humana genetika
15
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
obojuvawe na stimuliranata i nestimuliranata
epruveta.
2. Izmereniot otklon se pretvora vo ekstincioni
edinici. Na primer, dokolku za stimuliranata
epruveta otklonot na kolorimetarot e 0.4, toa zna~i
deka ima 40 ekstincioni edinici (1EE ima otklon na
kolorimetarot od 0.01).
3. Ekstincionite edinici se pretvoraat vo nanomoli na
formazan. Imeno 1 EE odgovara na 40 nanomoli na
formazan. Vo na{iot primer 40 EE }e odgovarat na
1600 nanomoli na formazan (40 EE h 40 nanomoli
formazan = 1600 nanomoli formazan).
4. Se presmetuva sozdadeniot formazan vo eden
mililitar krv. Presmetanite 1600 nanomoli
formazan odgovaraat na 1.5 mL krv. So pomo{ na
prosto trojno pravilo }e najdeme kolku nanomoli na
formazan ima vo 1 mL krv. Vo na{iot primer, vo 1 mL
stimulirana krv }e ima 1066.7 nanomoli formazan.
5. Se brojat belite kletki i se doteruva nivniot broj vo
1 mL krv. Na primer, neka so pomo{ na [ilingovata
ili Nojbauerovata komora vo 1 mm3 se izbrojani 6000
beli kletki. Toa zna~i deka vo na{iot 1 mililitar
krv }e ima 6000000 beli kletki.
6. Se brojat fagocitite vo eden mililitar krv. Ne se
fagociti site 6000000 beli kletki. Fagociti vo
krvta se samo neutrofilite i monocitite. Taka, ako
so leukocitarnata formula utvrdime deka vo na{iot
1 mililitar krv ima 55% neutrofili i 5% monociti,
toa zna~i deka od na{ite 6000000 beli kletki samo
3600000 se fagociti.
7. Se presmetuva sozdadeniot formazan na eden fagocit.
Vo na{iot primer imame 1 mililitar krv vo koj ima
3600000 fagociti koi sozdale 1600 nanomoli na
formazan. Za da utvrdime kolku formazan sozdal 1
fagocit treba vkupnata koli~ina na sozdaden
formazan da ja podelime so brojot na fagociti (1600
nmoli formazan / 3600000 fagociti). Na toj na~in
dobivame deka eden fagocit sozdal 0.0002963
nanomoli formazan. Dokolku nanomolite gi pretvorime vo femtomoli, }e dobieme deka eden fagocit
sozdal 296.3 femtomoli na formazan.
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
16
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM
[email protected] 2: ISPITUVAWE
HUMORALEN VRODEN IMUN
SISTEM
2.1. Proteini na akutna faza
(PAF)
Prvata reakcija vo organizmot kon imunolo{kiot stres
(ili prvata imunolo{ka reakcija) e vrodeniot, nespecifi~en odgovor koj mu prethodi na steknatiot imun odgovor.
Akutno fazniot odgovor e zna~ajna sistemska reakcija na
organizmot kon lokalnite ili sistemskite naru{uvawa na
homeostazata predizvikani od infekcija, tkivno o{tetuvawe, neoplasti~en (malignen) rast ili imunolo{ki
naru{uvawa.
Na mestoto na navleguvawe na mikroorganizmite i na
mestoto na tkivnoto o{tetuvawe zapo~nuvaat serija od
odgovori na samoto tkivo. Se osloboduvaat vospalitelni
citokini i se aktiviraat vaskularniot sistem i imunite
kletki. Vakvite reakcii predizvikuvaat la~ewe na u{te
pove}e citokini i drugi vospaliteli medijatori koi
minuvaat niz me|ukletkinite prostori, navleguvaat vo
krvta i cirkuliraat niz nea.
2.1.1. Akutno fazen odgovor
Akutno faznite promeni mo`at da se podelat kako promeni
vo koncentracijata na mnogu plazmini proteini, poznati
kako proteini na akutna faza (PAF) (Tabela 2.1) i vo
golem broj promeni vo odnesuvaweto, fiziolo{kite
procesi, biohemiskite reakcii i ishranata (Tabela 2.2).
Kako protein na akutna faza se definira onoj protein
~ija koncentracija se menuva (pozitivno ili negativno)
za vreme na vospalitelnoto zaboluvawe. Promenite vo
koncentracijata na proteinite se najmnogu zavisni od
sintetiziraweto vo crniot drob. Goleminata na promenite
varira od okolu 50% kaj ceruloplazminot i komplementnite
proteini do nad 1000 pati vo slu~aite na C-reaktivniot
protein i serumskiot amiloid A (plazmin prethodnik na
amiloid A koj sozdava vtori~ni skladi{ta vo tkivata)
(Slika 2.1).
Institut za imunobiologija i humana genetika
Tabela 2.1: ^ovekovi proteini na akutna faza (PAF).
Proteini ~ija {to plazmatski
koncentracija se zgolemuva
(pozitivni PAF)
Glavni PAF:
C-reaktiven protein
Alfa1 kisel glikoprotein
Serumski amiloid A
Komplementen sistem:
K3
K4
K9
Faktor B
C1 inhibitor
C4b vrzuva~ki protein
Manoza vrzuva~ki protein
Sosiruva~ki i fibrinoliti~en
sistem:
Fibrinogen
Plazminogen
Tkiven plazminogenski aktivator
Urokinaza
Protein S
Vitronektin
Plazminogen-aktivatorski
inhibitor 1
Antiproteazi:
Alfa1 proteazen inhibitor
Alfa1 antihimotripsin
Pankreati~en sekretoren
tripsinski inhibitor
Transportni proteini:
Ceruloplazmin
Haptoglobin
Hemopeksin
U~esnici vo vospalitelen odgovor:
Izla~ena fosfolipaza A2
Lipopolisaharid vrzuva~ki
protein
Interleukin 1 receptorski
antagonist
Granulociten kolonii
stimulira~ki faktor
Proteini ~ija {to plazmatskia
koncentracija se namaluva (negativni
PAF):
Albumin
Transferin
Transtiretin
alfa2-human serum glikoprotein
Alfa fetoprotein
Tiroksin vrzuva~ki globulin
Insulinoviden faktor za rast 1
Faktor 12
17
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Slika 2.1: Karakteristi~en
oblik na promeni vo plazminite koncentracii na nekoi
proteini na akutna faza posle
lesno vospalenie.
Naj~estite sostojbi koi doveduvaat do zna~ajni promeni vo
koncentracijata na proteinite na akutna faza vo plazmata
se: infekcijata, traumata, operacijata, izgorenicite,
tkivniot infarkt, razli~ni imunolo{ki ostvareni i
vospalitelni sostojbi pottiknati so kristali i naprednatiot malignen proces (kancer). Umereni promeni
nastanuvaat posle: intenzivno ve`bawe, toploten udar i
poroduvawe. Mali promeni nastanuvaat posle psiholo{ki
stres i nekolku psihijatriski zaboluvawa.
Iako koncentracijata na skoro site proteini na akutna
faza se zgolemuva istovremeno, nivniot porast ne e
uniformen kaj site pacienti so ista bolest. Zatoa,
febrilnite pacienti mo`at da imaat normalna koncentracija na C-reaktiven protein, no da imaat promeni vo
drugi komponenti od proteinite na akutnata faza.
Individualnata razlika vo reguliraweto koncentracijata
na proteinite na akutna faza sugerira deka kaj sekoja
edinka ima la~ewe na razli~ni citokini vo razli~ni
koncentracii vo razli~ni patolo{ki sostojbi.
2.1.2. Regulacija na akutno faznite
promeni
Akutno fazniot odgovor e reakcija na organizmot kon
naru{uvaweto na homeostazata (vnatre{nata sredina)
predizvikana od infekcija, tkivno o{tetuvawe, malignen
rast ili imunolo{ko naru{uvawe (Slika 2.2).
Akutno fazniot odgovor se sostoi od lokalna reakcija na
mestoto na o{tetuvaweto karakterizirano so brojni
18
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM
reakcii, kako {to se slepuvawe (agregacija) na krvnite
plo~ki (trombociti), sozdavawe sosirok (koagulum),
pro{iruvawe i propuslivost na krvnite sadovi, kako i
nasobirawe i aktivacija na ednojadreni kletki (granulociti, monociti) koi osloboduvaat citokini. Dopolnitelno,
aktiviranite fibroblasti i endotelni kletki se
osposobeni da la~at citokini. Ovie medijatori dejstvuvaat
vrz specifi~nite receptori od razli~ni celni kletki
doveduvaj}i do sistemska reakcija obele`ena so treska,
zgolemen broj beli kletki (leukocitoza), zgolemena
sedimentacija na crvenite kletki, zgolemeno la~ewe
adreno kortikotropen hormon (AKTH) i glikokortikoidi,
aktivacija na komplementnata i sosiruva~kata skala
(kaskada), smaleno nivo na `elezo i cink vo plazma,
negativna azotna ramnote`a i dramati~ni promeni vo
Institut za imunobiologija i humana genetika
Slika 2.2: Stapkite na akutno fazniot odgovor vo organizmot.
19
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
koncentracijata na nekoi plazmatski proteini. Ovie
proteini se nar~uvaat akutno fazni proteini (Slika
2.2).
Tabela
2.2:
Vidlivi
promeni kaj lu|eto pri
akutno fazen odgovor.
Nevroendokrini promeni:
Treska, pospanost i gubitok
na apetit.
Zgolemeno la~ewe
kortikotropen
osloboduva~ki faktor,
kotrikotoropin (AKTH) i
kortizol.
Zgolemeno la~ewe arginin
vazopresin.
Zgolemeno nadbubre`no
la~ewe kateholamini.
Hematopoetski promeni:
Slabokrvnost (anemija) od
dolgotrajna bolest.
Zgolemeni beli kletki
(leukocitoza).
Zgolemeni krvni plo~ki
(trombocitoza).
Metabolni promeni:
Gubitok na muskuli i
negativen azoten bilans.
Smalena glukoneogeneza.
Osteoporoza.
Zgolemeno sozdavawe masti
vo crn drob.
Zgolemena lipoliza vo
masnoto tkivo.
Smalena lipoprotein
lipazna aktivnost vo
muskulite vo masnoto
tkivo.
Kaheksija.
Crnodrobni promeni:
Zgolemen metalotionein,
inducirana azoten oksid
sintetaza, hem oksigenaza,
mangan superoksid
dizmutaza i tkiven inhibitor na metaloproteinaza-1.
Smalena aktivnost na
fosfoenolpiruvat
karboksilaza.
Promeni vo neproteinskite
delovi od plazmata:
Hipocinkemija,
hipoferemija,
hiperkupremija.
Zgolemena plazma
koncentracija na retinol i
glutation.
20
Krajnata cel na proteinite od akutnata faza e da se
otstranat naru{uvawata na homeostazata i da se vospostavi
zdrava odbrambena funkcija vo organizmot, {to se
definira kako negativna povratna sprega ili celosno
vozobnovuvawe. Nemo`nosta da se otstranat naru{uvawata
vo homeostazata doveduvaat do pozitivna povratna sprega,
odnosno hroni~no vospalenie (desno na Slika 2.2).
2.1.2.1. Indukcija na proteinite od akutna
faza so citokini i drugi signalni molekuli
Citokinite se vnatrekleto~ni signalni polipeptidi koi
gi sozdavaat aktiviranite kletki. Pove}eto citokini
proizleguvaat od pove}e kletki, vlijaat na pove}e celni
kletki i imaat pove}ekratni dejstva. Citokinite koi se
sozdavaat za vreme na vospalenieto i u~estvuvaat vo
vospalitelnite procesi, se glavnite stimulatori na
proteinite na akutnata faza. Vo vospalitelno asociranite
citokini spa|aat interleukin-6, interleukin-1beta, tumor
nekrozniot faktor alfa, interferonot-gama, transformniot faktor za rast-beta, i verojatno interleukin-8. Tie
se sozdavaat od razli~ni vidovi kletki, no niven najva`en
izvor se makrofagite i monocitite na mestoto na
vospalenieto.
Interleukin 6 (IL-6) e glavniot stimulator na sozdavaweto
na pove}eto akutno fazni proteini, dodeka drugite
citokini imaat vlijanie na oddelni podgrupi od akutno
faznite proteini. Pokraj negoviot efekt vrz crnodorobnite kletki, IL-6 dejstvuva i vrz nekolku drugi celni
kletki (Slika 2.3).
Citokinite dejstvuvaat i kako skala (kaskada) i kako mre`a
vo pottiknuva~koto dejstvo za sozdavawe proteini na akutna
faza. Mnogu citokini mo`at da go reguliraat sozdavaweto
na drugi citokini i citokinski receptori. Na primer,
tumor nekrozniot faktor-alfa e glavniot pottiknuva~ vo
sozdavaweto interleukin-1 kaj pacienti so revmatoiden
artrit (revmatsko vospalenie na zglobovite), a interleukin-1beta mo`e da go zgolemi ili da go namali
sozdavaweto na sopstvenite receptori.
Osven toa, citokinite se delovi od edna kompleksna
signalna mre`a. Kletkite mnogu retko se izlo`eni samo
kon eden citokin. Naj~esto kletkite se izlo`eni kon
kombinacija od citokini so razli~ni biolo{ki dejstva.
Efektite na citokinite vrz celnite kletki mo`at da
bidat inhibirani ili stimulirani so drugi citokini, so
hormoni, so citokinski receptorski antagonisti i so
cirkulira~ki receptori. Kombinaciite od citokinite
mo`at da imaat adidtivni, inhibitorni ili sinergisti~ki
efekti.
Ekspresijata na genite za akutno faznite proteini glavno
se regulira na transkripcisko nivo, no u~estvuvaat i posttranskripciskite mehanizmi. Post-translaciskite
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM
promeni vo glikozilacijata na plazmatskite proteini za
vreme na vospalitelniot odgovor vklu~uva o{tetuvawe na
oligosaharidnite granki, zgolemeno sijalirawe na
orozomukoidot i smalena galaktozilacija na IgG.
Promenite vo oligosaharidnite granki se pottiknuvat od
vospalitelnite citokini, nezavisno od nivnite efekti
vrz sozdavaweto akutno fazni proteini. Kone~no,
efikasnosta na la~ewe C-reaktiven protein (CRP), proces
razli~en od negovata sinteza, zna~itelno se zgolemuva za
vreme na akutno fazniot odgovor.
2.1.2.2. Regulacija na drugite akutno fazni
promeni so vospalitelno asociranite
citokini
Treskata e izraz na nevroendokrinite promeni koi go
obele`uvaat akutno fazniot proteinski odgovor. Iako
mo`at nekolku citokini da pottiknat treska, sozdadeniot
interleukin-6 vo mozo~noto steblo e neophoden za krajnite
stapki koi predizvikuvaat treska. Me|utoa, citokinite ne
se edinstvenite pottiknuva~i na treskata. Najnovite naodi
deka subdijafragmatskata vagotomija ja blokira treskata
predizvikana od vnatreperitonealna (no ne i vnatremuskulna) injekcija od lipopolisaharidi uka`uva na
neuralen prenos na febrilniot odgovor. Drugite
nevroendokrini promeni se odnesuvaat na kompleksnite
soodnosi pome|u citokinite, hipotalamo-hipofiznonadbubre`nata oska i drugi delovi od nevroendokriniot
sistem. Na primer, vospalitelnite citokini go stimuliraat
sozdavaweto kortikotropin osloboduva~ki faktor so
posledovatelno zgolemeno la~ewe na adreno kortikotropen
hormon (AKTH) i kortizol i direktna stimulacija na
nadbubre`nata `lezda. Zgolemenoto la~ewe arginin
Institut za imunobiologija i humana genetika
Slika 2.3: Pleotropnite (pove}ekratnite) dejstva na
interleukin-6 vo akutno fazniot odgovor.
21
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
vazopresin pod dejstvo na interleukin-6 ja objasnuva
hiponatriemijata koja se javuva posle nekoi vospalitelni
zaboluvawa (Slika 2.4).
Slika 2.4: Regulacija na crnodrobnata sinteza na akutno
faznite proteini so vospalitelnite medijatori.
Promenite vo odnesuvaweto se ~esto pati prisutni vo
vospalenieto, vklu~uvaj}i go gubeweto apetit (anoreksija),
pospanost (somnolencija), i slabost (letargija) i mo`at da
bidat pottiknati so citokinite.
2.1.3. Funkcii na akutno fazniot
odgovor
Vospalenieto e kompleksen, visoko orkestriran proces vo
koj se vklu~eni mnogu vidovi kletki i molekuli, od koi
edni zapo~nuvaat, zasiluvaat ili odr`uvaat procesi, drugi
go spre~uvaat, a treti ovozmo`uvaat procesot da se
vozobnovi.
Mnogu od akutno faznite proteini imaat potencijal da
vlijaat vrz eden ili vrz pove}e od stapkite na vospalenie.
Glavnata funkcija na C-reaktivniot protein, del od
vrodeniot humoralen imun sistem, e negovata sposobnost da
go vrze fosfoholinot i na toj na~in da prepoznae nekoi
tu|i predizvikuva~i kako i fosfolipidnite strukturi od
o{tetenite kletki. C-reaktivniot protein mo`e da go
aktivira komplementniot sistem ako se vrze za nekoj od
negovite ligandi, kako i da se vrze za fagocitnite kletki
{to se objasnuva so negoviot istovremen efekt vrz
otstranuvaweto na celnite kletki i preku humoralnite i
preku kleto~nite imuni sistemi.
22
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM
Serumskiot amiloid A e sostaven od familija apolipoproteini koi brzo se vrzuvaat za lipoproteinite so visoka
gustina (HDL) posle nivnoto sintetizirawe i vlijaat vrz
holesterolskiot metabolizam za vreme na vospalenieto.
Serumskiot amiloid A predizvikuva prilepuvawe
(adhezija) i hemotaksija na fagocitnite kletki i na
limfocitite i mo`e da pridonese do vospalenie na
ateroskleroti~nite koronarni arterii so zgolemuvawe
oksidacijata na lipoproteinite so niska gustina (LDL).
Nekolku akutno fazni proteini zapo~nuvaat ili odr`uvaat
vospalenie. Klasi~nite komplementni komponenti, od koi
pogolemiot del se akutno fazni proteini, imaat centralna
proinflamatorna uloga vo imunitetot, kako {to ima manoza
vrzuva~kiot protein. Komplementnata aktivacija doveduva
do hemotaksija, cedewe na plazminite proteini vo
vospalenoto mesto, i opsonizacija na vospalnitelnite
predizvikuva~i i o{tetenite kletki.
Sprotivno, drugi akutno fazni proteini mo`at da prika`at
protivvospalitelno dejstvo. Na primer, antioksidansite
haptoglobin i hemopeksin go {titat organizmot od
reaktivniot kislorod. Alfa1-proteazniot inhibitor i
alfa1-antihimotripsinot ja spre~uvaat aktivnosta na
proteoliti~kite enzimi. Lekuvaweto na ranata go
ovozmo`uva fibrinogenot preku prilepuvawe na endotelnite kletki, rasejka, razrasnuvawe i reparacija na tkivata,
dodeka haptoglobinot pomaga vo vozobnovuvaweto na
tkivata so stimulirawe na angiogenezata (sozdavawe novi
krvni sadovi).
Slika 2.5: Turbidimetar (Turbitajmer) od firmata Bering
(gore) i maksimalna brzina na
reakcija i reakciono vreme
zavisno od koncentracijata na
protivgenot (dolu).
2.2. Opredeluvawe koncentracija
na akutno fazni proteini so
imunoturbidimetrija
2.2.1. Principi na imunoturbidimetrija
Proteinite na akutna faza vo telesnite te~nosti se merat
so pove}e metodi, od koi kaj nas se koristi imunoturbidimetrijata so aparatot turbitajmer (Slika 2.5, gore).
Merniot sistem na turbidimetrijata bazira na principite
na kineti~ka turbidimetrija. Turbitajmerot meri istovremeno dva parametri:
Tabela 2.3: Maksimalna brzina na reakcija i reakciono
vreme za reakcijata IgG/
protivIgG.
1. brzinata na maksimalna reakcija (Vmax) na sozdadeniot
talog; i
2. vremeto potrebno da se postigne Vmax (tVmax) (Tabela
2.3).
Ako se postavat ovie vrednosti nasproti koncentracijata,
se dobiva grafikon kako na Slika 2.5.
Slika 2.5 (dolu) poka`uva deka, ako se zemat oddelno, nitu
Institut za imunobiologija i humana genetika
23
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Slika 2.6: Tridimenzionalna
kalibraciska kriva za imunoturbidimetrija (levo). ^itawe kalibraciska kriva za
imunoturbidimetrija od liniski kod (desno).
krivata za Vmax nitu za tVmax se precizni (nedvojbeni).
Me|utoa, ako se zemat dvata signali zaedno, jasno e deka
samo edna vrednost mo`e da se dobie vrz osnova na dvete
izmereni krivi so Turbitajmerot. Sostavot na reagensite
garantira deka dvete krivi se komplementarni edna na
druga. Merewata se izvr{uvaat na branova dol`ina od 340
nm (nanometri). Mereweto na kratkite branovi ovozmo`uva
da se otkrijat mali koncentracii od protivgen/protivtelo
kompleksi, koi se formiraat samo nekolku sekundi posle
me{aweto na reagensot i primerokot. Svetlosniot snop se
sozdava vo ksenonski izvor i se prenesuva so dvokanalna
kvarcna fibro optika. Svetlosniot snop koj navleguva vo
kivetata se registrira sekoi 0.1 sekunda i se analizira so
precizna kombinacija od softver i hardver.
Slika 2.7: Opredeluvawe tempera-turata (levo), temperaturnata kompenzacija zapo~nuva koga }e se vnese {i{enceto so reagens (desno).
2.2.2. Kalibracija
24
Za sistemot na Turbitajmer ne e neophodno da se napravi
kalibraciskata kriva od korisnikot, nitu da se napravi
kalibracija so merewe na edna to~ka. Reakciskite
parametri Vmax i tVmax za opredelena koncentracija se
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 2: ISPITUVAWE HUMORALEN VRODEN IMUN SISTEM
merat na razli~ni temperaturi (+18oC do +32oC) za vreme
na kalibraciskata postapka. Parametrite Vmax, tVmax i
koncentracijata se prika`uvaat vo eden grafikon, koj
sozdava tridimenzionalna kriva (Slika 2.6, levo). Ovaa
kriva ne dozvoluva neprecizni (dvojbeni) rezultati koi se
dobivaat od Hajdelberger-Kendalovata (Heidelberger-Kendall)
kriva.
Kalibraciskite krivi se utvrduvaat za sekoj reagens i broj
na lotot (prozvodstven broj). Tie krivi se pretvoraat vo
liniski kod (barkod) koi se pe~atat i se vnesuvaat so sekoj
reagens. Tie treba da bidat pro~itani samo edna{ za sekoj
reagens i broj na lotot (Slika 2.6, desno).
2.2.3. Sistem za temperaturna
kompenzacija
Kinetskoto merewe na imunoprecipitaciskata reakcija
zavisi od temperaturata. Turbitajmerot koristi nova
tehnika za da se izbegne periodot na zagrevawe. Toa se
postignuva so avtomatsko merewe na temperaturata vo
reakciskata smesa (Slika 2.7). Vrz osnova na ovaa postapka
kalibraciskata kriva matemati~ki se koregira za realno
izmerenata temperatura. Temperaturata na nosa~ot na
kivetata (TBI) i na {i{eto so reagens (TB0) se merat
direktno, dodeka T BI ja dava sobnata temperatura.
Reagensnata temperatura (T AS) se presmetuva od T B0.
Mereweto temperatura zapo~nuva koga }e se stavi {i{eto
so Turbikvant reagens. Aparatot prifa}a temperaturna
varijacija pome|u +18 i +320C.
2.2.4. Procedura
1. Se vnesuva {i{eto Turbikvant vo prostorot za
reagensi. Procesot na temperaturna kompenzacija
zapo~nuva vedna{ (Slika 2.8).
2. Se prigotuva razreduvawe na primerokot zavisno koja
belkovina na akutna faza ili imunoglobulin merime
(Tabela 2.4).
3. Se pipetiraat 50 mkL od prethodno razredeniot
primerok vo kivetata od Turbitajmerot.
4. Se vnesuva kivetata vo instrumentot.
5. Se pipetiraat 50 mkL od reagensot. Me{aweto na
reagensot i primerokot, kako i mereweto i pe~ateweto
na rezultatite se ostvaruva avtomatski bez intervencija
na korisnikot. Dodeka e mereweto vo tek (okolu 30 sek),
se prigotvuva sledniot primerok.
6. Izmerenite rezultati se vnesuvaat vo Tabela 2.5.
Institut za imunobiologija i humana genetika
Slika 2.8: [ematski prikaz za
imunoturbidimetrisko opredeluvawe na akutno fazni
proteini.
25
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 2.4: Protokoli za
turbidimetrisko merewe
belkovini na akutna faza.
2.3. Zada~a
Izmeri koncentracija na nekoj od proteinite na akutna
faza so imunoturbidimetar i vnesi ja dobienata vrednost
vo Tabela 2.5.
Tabela 2.5: Vnesuvawe rezultati od turbidimetrisko
merewe belkovini na akutna
faza.
Razreduvawe
na
primerokot
Protein na
akutna faza
Volumen na
primerokot
Plazmatska
koncentracija
vo mg/L
Transferin
Albumin
Haptoglobin
Alfa-1 kisel
glikoprotein
C-reaktiven
protein
Apo A1
Apo B
Antitrombin-3
K4
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
26
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 3: ANALIZA NA VRODEN IMUN SISTEM
[email protected] 3: ANALIZA NA VRODEN
IMUN SISTEM
3.1. Tolkuvawe rezultati od
vroden imun sistem
3.1.1. Normalni vrednosti od
ispituvawe kleto~en vroden imun
sistem
Sekoja laboratorija ima svoi normalni vrednosti i gi
iska`uva na razli~en na~in. Naj~esto rezultatite se
iska`uvaat kvalitativno vo procenti. Toa zna~i 50% NBT
bi zna~elo deka 50% od fagocitnite kletki na oboen preparat
od periferna krvna slika od ispitanikot ima sini obojuvawa
vo citoplazmata od fagocitite, odnosno ima pozitivni
fagocitni kletki. Poretko, rezultatite se iska`uvaat kako
kvantitativni vrednosti ili kako nano moli sozdaden
formazan vo mL krv, ili kako femtomoli sozdaden formazan
vo eden fagocit. Nie presmetuvame vo femtomoli sozdaden
formazan vo eden fagocit.
Normalnite vrednosti za NBT testot vo na{ata laboratorija
iznesuvaat za:
Nestimuliran primerok = 124 femtomoli/fagocit;
ANALIZA NA SLU^AJ
Stimuliran primerok = 293 femtomoli/fagocit.
Iako NBT testot se koristi za pove}e nameni, sepak
najzna~ajnata primena ima vo otkrivaweto na bolesta
hroni~na granulomatozna bolest (HGB). Dijagnozata na HGB
mo`e da se postavi kako najverojatna dijagnoza za HGB ili
kako kone~na dijagnoza za HGB.
Najverojatna dijagnoza za HGB: Pacient ili pacientka so
nepravilen (abnormalen) NBT test ili respiratoren kolaps
vo aktiviranite neutrofili (pomalku od 5 % od kontrolata)
koj ima edno od slednive:
1) Hroni~na infekcija (vo hepar; perirektalen ili
belodroben absces; adenitis ili osteomielitis)
predizvikana od stafilokoki;
Institut za imunobiologija i humana genetika
Hroni~na granulomatozna
bolest:
Slu~ajot na Dame Vidoevski,
blisku do smrtta od retki
bakterii i gabi~ki.
27
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
2) Difuzen granulom vo respiratoren, gastrointestinalen ili urogenitalen trakt;
3) Neuspeh (zastoj) vo razvojot i hepatosplenomegalija
ili limfadenopatija.
Kone~na (zavr{na) dijagnoza za HGB: Pacient ili pacientka
so nepravilen (abnormalen) NBT test ili respiratoren
kolaps vo aktiviranite neutrofili (pomalku od 5 % od
kontrolata) koj ima edno od slednive:
1) Mutacija vo gp91, p22, ili p67 phox;
2) Otsustvo na mRNK za eden od gorenavedenite geni
so Northern blot analiza;
3) Rodnini od majkata, vujkovci ili vnuci so abnormalen
NBT test ili respiratoren kolaps.
Dijagnosti~ka vrednost na NBT testot:Bidej}i dolna
granica na HGB iznesuva 5% od vrednosta kaj zdravite i za
najverojatnata dijagnoza i za kone~nata dijagnoza za HGB,
toa zna~i deka od 0 do 5% relativen odnos kaj kvalitativniot
test, kako i 0 do 6.2 femtomoli/fagociti kaj nestimuliran
NBT ili 0 do 15 femtomoli/fagociti kaj stimuliraniot
NBT bi bile elementi za hrni~na granulomatozna bolest.
Spektar na bolesta: Kaj pacientite so Iks-vrzana forma
na HGB (60-70% od pacientite), bolesta se javuva mnogu
porano i vo pojaka forma (po`estok oblik) za razlika od
pacientite so avtozomno recesivno nasledeni formi.
Tabela 3.1: Normalni vrednosti za nekoi proteini na
akutna faza. m, ma{ki; `,
`enski.
28
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 3: ANALIZA NA VRODEN IMUN SISTEM
Najgolem del od pacientite so Iks-HGB imaat zastoj vo
razvojot, te{ki bakteriski adenitisi, abscesi ili
osteomielit u{te vo prvata godina od `ivotot. Naj~estite
infekcii se pneumonija ili limfadenitis predizvikani od
katalaza-pozitivni organizmi (osobeno Staphylococcus) ili
fungi. Simptomite od strana na intestinalniot trakt ili
obstrukcii na urinarniot trakt se predizvikani od
granulomski formacii. Retko, vo dvete formi (i Iks
vrzanata i avtozomno recesivnata), prvite simptomi ne se
prepoznaeni se do polnoletstvoto.
3.1.2. Klini~ka primena na akutno
faznite proteini
Normalnite vrednosti na nekoi od proteinite od akutnata
faza koi se koristat na Institutot za imunobiologija i
humana genetika se dadeni na Tabela 3.1.
Glavnite primeni na mereweto akutno fazni proteini se: vo
sledeweto kako napreduva aktivnosta na ve}e dijagnosticirana bolest, za ocenuvaweto odgovor kon dadenata
terapija vo vospalitelnite zaboluvawa, kako i za otkrivawe
komplikacii kaj ve}e poznata bolest (Tabela 3.2).
Tabela 3.2. Najzna~ajnite
primeni vo mereweto akutno
fazni proteini.
1. Sledeweto kako napreduva
aktivnosta na ve}e dijagnosticirana bolest.
2. Ocenuvaweto odgovor kon
dadenata terapija kaj
vospalitelnite zaboluvawa
(na primer, revmatoiden
artrit, juvenilen hroni~en
artrit, ankilozira~ki spondilit, Rajterov sindrom, psorijati~na artropatija, vaskuliti i revmatska treska.
3. Otkrivawe komplikacii
kaj ve}e poznata bolest (na
primer, skladirawe imuni
kompleksi, postoperativna
infekcija).
Vo imunolo{kata dijagnostika na zaboluvawata se koristat
pove}e od 20 proteini na akutna faza. Najgolemiot del od
niv se glikoproteini (Tabela 3.3). Mereweto koncentracijata na C-reaktiven protein (CRP) vo plazma ili vo
serum mo`e da razlikuva vospalitelna od nevospalitelna
sostojba i e presudno za lekuvawe na pacientovata bolest. Vo
nekoi bolesti (kako {to e revmatoidniot artrit), seriskoto
merewe CRP ima prognosti~ka vrednost. Doktorite treba
da vnimavaat koga gi ~itaat rezultatite od CRP bidej}i
ponekoga{ tie se iska`uvaat kako mg na litar (mg/L), a drugi
laboratorii gi iska`uvaat kako mg na decilitar (mg/dL).
Obi~o koncentracijata na serumskiot amiloid A gi sledi
Protein
Normalna
koncentracija
(g/L)
Koncentracija
vo akutno
vospalenie (g/L)
Vreme za
odgovor
(~asovi)
C-reaktiven
protein
0.0008-0.004
0.4
6-10
Alfa1antihimotripsin
0.3-0.6
3.0
10
Alfa1- antitripsin
2.0-4.0
7.0
24
Orozomukoid
0.5-1.4
3.0
24
Haptoglobin
1.0-3.0
6.0
24
Fibrinogen
2.0-4.5
10.0
24
K3
0.55-1.2
3.0
48-72
K4
0.2-0.5
1.0
48-72
Ceruloplazmin
0.15-0.6
2.0
48-72
Institut za imunobiologija i humana genetika
Tabela 3.3. Primeri za klini~ka upotreba na akutno
faznite proteini.
29
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
ANALIZA NA SLU^AJ
Postoperativna infekcija:
Slu~ajot na Qubica
Gora~inova posle
holecistektomija.
Tabela 3.4. Prisustvo na Creaktivniot protein vo
bolestite.
Redovno
prisuten
Povremeno prisuten
Otsuten
Aktivna
revmatska
groznica
Akuten
miokarden
infarkt
Karcinom
Streptokokna
infekcija
Pnevmonija
Preikardit
Revmatoiden artrit
Pielit
Nefrit
Tuberkuloza
Ko`ni
zaboluvawa
Gorni
respiratorni
infekcii
Bubre`ni
zaboluvawa
Lokalni
infekcii
koncentraciite na CRP, iako vo nekoi studii e poka`ano
deka serumskiot amiloid A e poosetliv obele`uva~ za
vospalitelno zaboluvawe. Denes, mereweto na serumskiot
amiloid A ne e {iroko prifateno.
Vo momentov, naj~esto upotrebuvani pokazateli za akutno
fazniot odgovor se sedimentacijata na eritrociti i
plazmatskata koncentracija na CRP. Sedimentacijata na
eritrociti glavno zavisi od koncentracijata na fibrinogen
vo plazma. Kako ispituvawe, sedimentacijata na eritrociti
ima prednosti zatoa {to e poznato, ednostavno i postoi
literatura vo minatite sedumdeset godini. I pokraj toa,
mereweto na CRP ima nekolku prednosti nad sedimentacijata na eritrociti. Sedimentacijata na eritrociti e
indirektno merka za koncentracijata na proteinite od
akutnata faza i mo`e da bide pod golemo vlijanie na
goleminata, oblikot, brojot na crvenite kletki (eritrocitite) kako koncentracijata na imunoglobulinite.Poradi
toa, rezultatite od sedimentacijata na eritrociti se
neprecizni i ponekoga{ bez zna~ewe.
Sedimentacijata na eritrociti se smeta kako zastaren metod
za indirektno ispituvawe fibrinogenot vo plazmata bidej}i
denes postojat direktni i precizni metodi za negovo merewe.
So menuvaweto sostojbata na pacientot (podobruvawe ili
vlo{uvawe), sedimentacijata na eritrocitite malku se
menuva, dodeka koncentracijata na CRP vo plazma naglo se
menuva. [iro~inata na patolo{kite vrednosti za CRP se
mnogu po{iroki otkolku tie za sedimentacija na eritrociti
so posledici vo dijagnosticiraweto: kaj pacientite so
koncentracija na CRP vo plazma pogolema od 100 mg/L, 80 do
85% imaat bakteriska infekcija. Sedimentacijata na
eritrociti postojano se zgolemuva so vozrasta, dodeka
koncentracijata na CRP vo plazma ne se menuva. Me|utoa,
mnogu pacienti so aktiven sistemski lupus eritematozus
nemaat visoki koncentracii na CRP vo plazma, no imaat za
vreme na bakteriska infekcija. Primenata na ova soznanie
za diferencijalna dijagnoza na treska kaj pacienti so
sistemski lupus eritematozus e limitirano so naodite deka
koncentrcaijata na CRP vo plazma e zgolemena i kaj bolnite
so aktiven lupuzen serozit ili kaj hroni~en sinoviit.
Zdravite lica imaat koncentracija na plazma CRP od 2 mg/
L ili pomalku, no nekoi imaat koncentracii do 10 mg/L
(Tabela 3.1). Podocne`nite ispituvawa poka`aa deka
vrednostite pod 10 mg/L nemaat klini~ko zna~ewe. Sepak,
koncentracijata na CRP pod 10 mg/L, no zna~ajno nad
vrednostite vo zdravata populacija poka`uva zna~ajna
povrzanost so osteoartriot, a mo`e da predvidi i podocne`en
koronaren sindrom. Poradi toa se smeta deka lesno
zgolemenite koncentracii (od 2 do 10 mg/L) bi mo`ele da
uka`uvaat na lesna hroni~na vospalitelna reakcija vo
organizmot.
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
30
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM
BLOK 2
BLOK 2 - IMUNI KLETKI
U^EBNI CELI:
[email protected] 4. KLETKI VO IMUNIOT SISTEM (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat:
“ da dvojat limfociti i monociti od periferna krv;
“ kako da koristat imunofluorescencija.
[email protected] 5. PROTO^NA CITOMETRIJA (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat:
“ osnovni elementi na proto~nata citometrija;
“ da opredelat B-Li i T-Li od periferna krv.
[email protected] 6. ANALIZA NA SLU^AI OD KLETO^EN
IMUNITET (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da:
“ tolkuvaat rezultati od proto~na citometrija;
“ analiziraat slu~ai od kleto~en imunitet.
POENI:
PRISUSTVO
1.5 poeni
ZNAEWE
3.0 poeni
VKUPNO: 4.5 poeni
Institut za imunobiologija i humana genetika
31
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
32
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM
[email protected] 4: KLETKI VO IMUNIOT
SISTEM
4.1. Dvoewe limfociti i
monociti od periferna krv
4.1.1. Op{ti napomeni
So pomo{ na centrifugirawe ili gradienti so razli~na
gustina, kako i koristeweto na svojstvoto na razli~na
atherencija, kleto~nite elementi od krvta(limfociti,
monociti, granulociti, trombociti) mo`e da se izdvojat
edni od drugi. Denes postojat poslo`eni i posovremeni
metodi, kakvi {to se proto~nata citometrija i separacijata so monoklonski protivtela. Od prakti~ni pri~ini
(polesna aplikacija, ekonomi~nost) ovde }e bidat prika`ani najupotrebuvanite metodiki.
Pred s#, primerokot krv treba da se zeme so soodveten
protivkoagulans, zavisno od potrebata - koi kletki treba
da se separiraat. Isto taka, neophodno e da se koristi
plasti~na ambala`a za zemawe i dvoewe na kletkite, koja
za nekoi potrebi e zadol`itelno da bide sterilna. Dokolku
se koristi staklena ambala`a, taa treba da bide silikonizirana.
Postapka za silikonizirawe: epruvetkite i drugata
staklarija koja treba da se silikonizira, prethodno dobro
se ~isti i se mie so 2 -3 % rastvor na NaOH, a potoa dobro
se isplaknuva so destilirana voda i se su{i. Taka
podgotvenata staklarija se potopuva vo rastvorot od
silikon i vedna{ se isceduva. Potoa se plakne so obi~na
voda (ovoj del treba da se raboti so za{titni rakavici i na
otvoren prostor bidej}i silikonot i negovite isparuvawa
se toksi~ni). Vaka silikoniziranata staklarija se su{i
24 ~asa na sobna temperatura, a podobro vo su{ara na 100oC
za 10 min. Se obele`uva, posebno se ~uva i e spremna za
upotreba.
Institut za imunobiologija i humana genetika
33
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
4.1.2. Postapka za dvoewe limfociti od
periferna krv
Limfocitite se imunokompetentni kletki-nositeli na
humoralniot i kleto~niot imunitet. Se delat na T, B i
KPU limfociti, a ovie ponatamu se delat na suppopulacii.
Tie naj~esto se oddeluvaat od drugite kletki od periferna krv so metodot na centrifugirawe so pomo{ na gradient fikol-triozil. Bidej}i fikolot e polisaharid so
ograni~ena mo`nost za gustina, vo nego se dodava natrium
metrizoat (triozil, hipak, joduron i sl.) za da se zgolemi
negovata gustina. Ovoj gradient e so gustina od 1.077, a
limfocitite imaat pomala gustina i }e ostanat nad nego,
dodeka drugite kletki }e patuvaat kon dnoto.
Potreben e sledniov materijal i oprema: puferiran fiziolo{ki rastvor(PFR), fikol (limfoprep, fikol-pak),
hranliv medium (Henks, RPMI-1640 ili Parker 199),
silikonizirani plasti~ni epruvetki ili plasti~ni
epruvetki 12 * 75 mm, centrifuga so horizontalen rotor,
pasterovi pipeti i heparin.
Izveduvawe na testot:
1. Se zema venskata krv so venepunkcija vo heparinizirana
epruvetka ili vo plasti~en {pric so dodatok od 100
IE heparin na 10 mL krv. Krvta mo`e da se me{a vo
epruvetka so ednakov volumen na puferiran fiziolo{ki rastvor, ili da se koristi bez razreduvawe.
2. Se prigotvuva rastvor za dvoewe limfociti (Se
podgotvuva 9.2% fikol vo destilirana voda i se
autoklavira. Se me{aat 43.4 mL Fikolov rastvor so
6.6 mL Triozil 75). Postojat i gotovi sterilizirani
rastvori za dvoewe limfociti od razli~ni kompanii
(limfoprep, limfopak i drugi).
3. Se stavaat 2 mL od rastvorot za dvoewe limfociti vo
graduirana epruvetka i vrz nego se nalevaat 2 mL od
nerazredenata ili 4 mL od razredenata krv. Krvta se
nanesuva vnimatelno so pipeta po yidot od epruvetkata,
vnimavaj}i da ne se izme{a so rastvorot za dvoewe
limfociti. Toa najdobro se postignuva so iskosuvawe
na epruvetkata pod agol od 45 stepeni (Slika 4.1:A).
Vtorata varijanta e da se vnese najprvin krvta vo
epruvetkata, a podocna da se vnese rastvorot za dvoewe
limfociti so igla i {pric na dnoto od epruvetkata
(pod krvta) ili da se napravi so pipeta na ist na~in
(Slika 4.1:B).
Slika 4.1:Postapka za dvoewe
limfociti od periferna krv.
A, nanesuvawe krv vrz slojot
od rastvor za dvoewe limfociti (limfopak) so pipeta.
B, nanesuvawe rastvor za dvoewe limfociti pod prethodno naneseniot sloj krv so
{pric i so igla.
34
4. Epruvetkite se centrifugiraat vo horizontalen rotor na 300 g za 15 minuti na 4oC. Po zavr{enoto
centrifugirawe se dobivaat pet sloja vo peruvetkata.
Najgore se nao|a slojot od plazma i trombociti, pod
nego se nao|a sloj od limfociti i monociti, pod niv se
nao|a slojot od rastvorot za dvoewe limfociti
(limfopak), potoa tenok sloj od granulociti, i najdolu
se nao|aat crvenite kletki (eritrociti). Crvenite
kletki se najte{ki i poradi toa se smestuvaat na dnoto
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM
od epruvetkata po centrifugiraweto na krvta (Slika
4.2:gore).
5. So pasterova pipeta vnimatelno se sobiraat limfocitite od tenkiot me|usloj i se prenesuvaat vo drugi
dve graduirani epruvetki (nekoi ja vikaat ovaa
postapka `neewe na limfociti). Treba da se vnimava
da ne se zema od dolniot sloj (rastvorot za dvoewe
limfociti) bidej}i ima pogolema gustina i }e go
spre~i uspe{noto plaknewe na limfocitite. Nekoi
prepora~uvaat najprvin da se otstrani najgorniot sloj
(plazmata ili razredenata plazma), a potoa da se
sobiraat limfocitite (Slika 4.2:dolu).
6. Vo epruvetkite se dodava hranliv medium i se plaknat
tri pati po centrifugirawe na 150 g za 10 min na 4oC.
Ovaa postapka se izveduva za da se otstranat, kolku e
mo`no pove}e, krvnite plo~ki (trombocitite) od
limfocitite.
5. Supernatantot se otfrla i talogot od limfocitna
suspenzija se doteruva so hranliv medium spored
baranata koncentracija (potreben broj kletki vo 1 mL
suspenzija). Ovaa postapka se izveduva so browe na
limfocitite vo komora za broewe kletki.
Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite:
Na gradientot od fikol zaostanuvaat ne samo limfocitite tuku i monocitite, pa zatoa e pravilno da se ka`e deka
ovoj metod gi dvoi ednojadrenite (mononuklearnite)
kletki. Prisustvoto na drugi kletki mo`e da se kontrolira
so mikroskopski pregled na oboena razmaska od dobienata
suspenzija. Dokolku vo natamo{noto koristewe na
kletkite, monocitite zna~ajno interferiraat, tie mo`at
dopolnitelno da se izdvojat so inkubirawe na kletkite vo
plasti~ni epruvetki 2 ~asa na 37 o C. So ogled deka
monocitite se atherentni kletki, tie }e ostanat na dnoto.
Trombocitite se dvojat so pove}ekratno miewe na kletkite
na pomal broj vvm (vrtewa vo minuta, okolu 200 g, 10 min).
Mo`e da bidat prisutni i eritrociti, {to osobeno se
slu~uva pri izdvojuvawe limfociti od krv od bolni so
maligni bolesti, avtoimuni, sistemski bolesti, bolni na
dijaliza ili, pak, politransfundirani, odnosno transplantirani bolni vo faza na otfrlawe. Toga{ eritrocitite
se otstranuvaat so hemolizirawe. Se koristat destilirana
voda i hipertoni~en Henksov pufer (na 100 mL ve}e
podgotven Henksov pufer se dodava 2.5 g NaCl). Kleto~nata
suspenzija se stava 30 sekundi vo kontakt so destilirana
voda i potoa vedna{ se dodava hipertoni~en Henksov pufer
(odnosot e voda : Henksov hipertoni~en pufer = 3:1).
4.1.3. Broewe kletki so hemocitometar
Za broeweto kletki vo hemocitometar potrebno e slednovo:
suspenzija od kletki, 0.5% eozin vo 0.9% natrium hlorid,
komora za broewe kletki (modificirana Nojbauerova
komora (Neubauer)) so pokrivno staklo, svetlosen mikroInstitut za imunobiologija i humana genetika
Slika 4.2:Raspored na sloevite po centrifugirawe na
krvta vrz rastvor za dvoewe
limfociti (gore). Postapka
za sobirawe limfociti od
me|uslojot na ednojadreni
kletki so pasterova pipeta
ili so avtomatska pipeta
(dolu).
35
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Slika 4.3: Mre`a na modificirana Nojbauerova komora za
broewe kletki. Vo ~etirite
agolni kvadrati broime ako
ima pove}e kletki, dodeka vo
pette kvadrat~iwa od centralniot kvadrat broime koga ima pomalku kletki.
skop (po mo`nost so fazen kontrast), etanol 75%,
detergenet za ~istewe.
1. Komorata za broewe i pokrivnoto staklo se mijat
vnimatelno so detergent, voda i alkohol i vnimatelno
se su{at. Nad komorata se dodava pokrivno staklo.
2. Se dodavaat 10 mkL kleto~na suspenzija i 10 mkL
eozinski rastvor vo mali epruvetki (10 h 50 mm) i
vnimatelno se me{a.
3. Me|u pokrivnoto staklo i komorata za broewe se
dodavaat okolu 10 mkL oboena suspenzija.
4. Se ~eka 1 min kletkite da se istalo`at i se gledaat
kletkite pod objektiv 20. Eritrocitite se mali ~isti
kletki; limfocitite se so sli~na golemina, no temni
pod fazen kontrast; polimorfonuklearnite leukociti
se golemi i temni, trombocitite se kako mali temni
to~ki, mrtvite se oboeni crveno bidej}i eozinot gi
boi mrtvite jadra.
Slika 4.4:Broewe limfociti
vo edno kvadrat~e od hemocitometar. Se brojat kletkite vnatre, na leviot i gorniot rab. Na ovaa slika ima
vkupno 25 kletki.
36
5. Modificiranata Nojbauerova komora ima 4 kvadratni
milimetri vo aglite vo koi se brojat leukociti i eden
centralen vo koj se brojat eritrociti, trombociti i
leukociti (Slika 4.3). Centralniot kvadraten milimetar e podelen na 25 kvadrat~iwa oddeleni so trojni
linii, a sekoj od niv e podelen na 16 mali kvadrat~enca.
Volumenot {to go zafa}a edno malo kvadrat~e pod
pokrivnoto staklo iznesuva 0.004 mm3.
6. Se brojat limfocitite i mrtvite kletki vo pet golemi
kvadrati (vo 80 mali kvadrat~iwa). Ako e vkupniot
broj pomal od 100, toga{ se brojat vo site 25 kvadrati
(400 mali kvadrat~iwa). Broeweto vo edno kvadrat~e
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM
go vr{ime po~nuvaj}i od gornoto levo kvadrat~e i
zavr{uvaj}i vo dolnoto levo kvadrat~e. Gi broime site
limfociti vnatre vo kvadrat~eto, kako i tie na levata
i gornata linija od kvadrat~eto, dodeka tie na desnata
i dolnata linija ne se brojat (Slika 4.4).
7. Vkupniot broj kletki vo originalnata suspenzija e
ednakov na brojot na kletkite vo pet golemi kvadrati
h 105 vo 1 mL suspenzija.
4.1.4. Ispituvawe `ivi i mrtvi
kletki
Mora da se podvle~e deka site ispituvawa vo ovaa kniga se
izvedeni na `ivi kletki. Kletkite ostanuvaat `ivi
dokolku se ~uvaat na 00C (vo mraz i voda), osven limfocitite od morsko svin~e koi mora da se ~uvaat na sobna
temperatura.
1.
Kletkite treba brzo da se prigotvat, da se vnesat vo medium i da se upotrebat. Op{to zemeno, limfocitite ne
izdr`uvaat `ivi vo ladilnik ostaveni preku no}.
Membranata na `ivata kletka ne dozvoluva navleguvawe
boja vo vnatre{nosta i spored ovaa osobina mo`at da se
razlikuvaat mrtvite od `ivi kletki. Za ovaa namena
postojat pove}e boi: tripansko sinilo, eozin, nigrozin i
drugi.
Za ovaa postapka potrebni se slednive materii: 0.2%
tripansko sinilo vo fiziolo{ki rastvor, hemocitometar
(modificirana Nojbauerova komora za broewe kletki),
suspenzija od kletki, svetlosen mikroskop, vodeno bawa
(37oC), epruvetka (najdobro polistirenska, 12 h 75 mm).
2.
1. Vo plasti~na epruvetka se vnesuvaat 0.1 mL od
kleto~nata suspenzija i 0.1 mL od boja tripansko
sinilo. Epruvetkata se inkubira 3 min na 37oC, se vadi
i se ostava 5 min na sobna temperatura.
2. Modificiranata Nojbauerova komora se postavuva na
svetlosen mikroskop, se nao|a mre`ata i se nanesuva
pokrivno staklo.
3. Vo prostorot me|u pokrivnoto staklo i komorata se
vnesuva suspenzija od oboenite kletki, se ~eka 1 min
kletkite da se istalo`at i se brojat kletkite.
4. Kletkite se brojat vo pette mali kvadrati od centralniot kvadrat i toa se brojat site kletki (neoboeni i
oboeni) i oddelno se brojat samo mrtvite kletki, onie
koi se so oboeni jadra.
5. Pod mikroskop so fazen kontrast `ivite limfociti
prosvetluvaat, dodeka mrtvite kletki se gledaat kako
temni krugovi (Slika 4.5).
5. Procentot na `ivi limfocoti se presmetuva spored
slednava formula:
@ivi % = (Broj na `ivi kletki *100)/Vkupen broj kletki
Institut za imunobiologija i humana genetika
3.
Slika 4.5: Limfociti poglednati so fazen kontrast:
1. Inverten mikroskop so fazen
kontrast;
2. Sve`i limfociti vo odli~na sostojba;
3. Toplotno o{teteni limfociti (zagreani na 45oC).
Mrtvite kletki se gledaat
kako temni krugovi, a vo nekoi
kletki ima piknoti~ki jadra.
37
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
4.2. Imunofluorescencija
Slika 4.6: Spektrite na apsorpcija (polna linija) i na emisija
(isprekinata linija)na fluoresceinot (A) i na rodaminot
(B).
intenzitet na luminiscencija
A
intenzitet na luminiscencija
Imunofluorescentnite tehniki imaat visoka osetlivost
i specifi~nost na reakcijata protivgen-protivtelo, kako
i mo`nost za direktno mikroskopsko prika`uvawe na imunite kompleksi vo tkiva i kletki. Za da se ovozmo`i imunofluorescencijata, neophodno e eden od reaktivite vo
reakcijata prethodno da e obele`en so nekoj fluorohrom.
Fluorohromite se boi koi imaat svojstvo da apsorbiraat
svetlina so pomala branova dol`ina, pri {to del od apsorbiranata svetlina se pretvora vo svetlosno zra~ewe od
vidniot spektar so zna~aen intenzitet. Ovoj proces se ozna~uva kako FLUORESCENCIJA (slika 4.6). Vo imunohistohemijata kako otkriva~ki reagensi se koristat protivtela obele`eni so soodvetni fluorohromi. Obi~no se
upotrebuvaat fluorohromi koi raspolagaat so hemiski
aktivni grupi pogodni za kowugirawe na protivteloto so
B
frluorohromot. Pri kowugiraweto, zna~ajno e da se so~uva
imunolo{kata aktivnost na obele`enoto protivtelo. Koi
fluorohromi }e se upotrebat zavisi od supstancijta koja
}e se fiksira(proteini, DNK, RNK, mitohondrii ili dr.),
no naj~esto upotrebuvani fluorohromi se:
- fluorescein izotiocijanat (FITC);
- tetrametil rodamin izotiocijanat (TMRITC);
- rodamin B izotiocijanat (RBITC);
- lizamin rodamin B (RB200);
- 1-Dimetil-amino-naftalen-5
- sulfonova kiselina (DANCIL);
- etidium bromid;
- akridin oran`.
38
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM
Spomnatite fluorohromi zra~at svetlina so karakteristi~na boja: fluoresceinot i DANCIL-ot zra~at `oltozelena svetlina, dodeka drugite rodaminski soedinenija
zra~at portokalovo-crvena svetlina. Site imaat svoj spektar na apsorpcija i spektar na emisija. Na pr. FITC ima
tri dela vo spektarot na apsorpcija: eden na 490 nm, drug na
320nm i tret na 280nm, a spektarot na emisija e kon 520nm
(Slika 4.7).
Pogodnata fluorescencija,osven od kvalitetite na bojata
i nejzinata koncentracija, zavisna e i od izvorot na ekscitacija (dene{nite halogeni i `ivini lampi se mnogu pogodni) i od rN na rastvora~ot (najdobar e fiziolo{ki
rastvor so rN 7.2-7.4). Imunofluorescentnata tehnika naj~esto se upotrebuva za identificirawe i utvrduvawe lokalizacija na opredelen antigen vo tkivata i kletkite so
pomo{ na fluorohromno kowugirano protivtelo so poznata
specifi~nost. No mo`e da se koristi i za identificirawe
i opredeluvawe na protivtela za {to se potrebni purificirani antigeni markirani so opredeleni fluorohromi.
Osnovni fazi vo imunofluorescencijata se:
apsorpcioni spektri
emisioni spektri
Slika 4.7: [ema za spektri na
apsorpcija i spektri na emisija na pove}eto fluorohromi.
1. fluorescentna mikroskopija,
2. dobivawe kowugirani protivtela,
3. podgotovki na kletki i tkiva,
4. boewe, ~itawe i dokumentirawe.
4.2. 1. Fluorescentna mikroskopija
Za ~itawe na vaka specifi~no podgotvenite preparati (vitalni kletki ili tkiva) neophoden e poseben fluorescenten mikroskop i zatemneta prostorija. Site ovie specifi~nosti dovele do razvitok na t.n. fluorescentna mikroskopija. Fluorescentnata mikroskopija se odlikuva so visok stepen na osetlivost i kontrast vo prikazot. Ako vo
obi~nata svetlosna mikroskopija razlikata me|u gustinite
od dve zoni iznesuva 1%, taa vo fluorescentnoto prika`uvawe se razlikuva 100%. Postojat dva osnovni vida fluorescentna mikroskopija: fluorescentna mikroskopija so
propusno svetlo i fluorescentna mikroskopija so opa|a~ko
svetlo (epiosvetluvawe). Ovie dve mo`at da bidat kombinirani so fazen kontrast, kako i so ispituvawe na dve
branovi dol`ini (crvena i zelena) so {to se obezebduvaat
dopolnitelni mo`nosti (utvrduvawe `ivi i mrtvi kletki).
4.2.1.1. Fluorescentna mikroskopija so
propusno svetlo
Svetlosta se sozdava vo `ivina lamba so visok pritisok,
se odbiva od svetlosnoto ogledalo i se upatuva niz sobirnite le}i do ekscitira~kiot filter, koj oddava fluorescenten snop svetlina. Fluorescentniot snop svetlina minuva niz toplinsko apsorbira~ki filter i se odbiva niz
Institut za imunobiologija i humana genetika
39
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
okular
reflektor
svetlosen izvor
sobirni le}i
ekscitaciski
filter
filter
objektiv
primerok
podvi`no
masi~e
kondenzor
filter za
toplina
ogledalo
Slika 4.8: Fluorescenten mikroskop so propusno svetlo.
refleksnoto ogledalo, preku kondenzorot vo primerokot.
Sekundarniot filter (apsorbira~ki) gi otstranuva drugite svetlosni zraci, osven primarnata fluorescencija, i
po zgolemuvaweto se prenesuva do okularot (Slika 4.8).
Slika 4.9: Transmisija niz filtrite i pominatite branovi
dol`ini so UG1, BG3 i FIF (gore) i Wratten 2 + CG385 (dolu).
Kako izvor na svetlina se koristi svetlost so mala branova
dol`ina (ultravioletna, violetna ili sina), naj~esto od
`ivina lamba pod visok pritisok, smestena vo zatvoren
nosa~ i refleksno ogledalo za da gi naso~i zracite kon
le}ata. @ivinata lamba ima maksimum na 365 i na 437 nm.
Mo`at da se koristat i jodno kvarcna lamba ili ksenonska
lamba (Slika 4.8). Zada~ata na prvi~niot (ekscitaciski)
filter e da ja propu{ti samo svetlinata so branova dol`ina koja sozdava fluorescencija vo primerokot, dodeka
na vtori~niot (apsorbira~ki) filter e da gi zadr`i svetlinite so branovi dol`ini razli~ni od fluorescentnata
branova dol`ina vo primerokot, a da ja propu{ti samo
fluorescentnata svetlina od fluorohromot. Izborot na
primarniot i sekundarniot filter se mnogu zna~ajni za
kvalitetite na fluorescentniot mikroskop i zavisat od
izvorot na svetlinata i od apsorpcioniot i emisioniot
maksimum na fluorohromot. Taka na primer, za FITC }e
se zemat filtri koi imaaat apsorpciski maksimum na 492495 nm, a emisionen maksimum na 520-525 nm. Za rodaminskite metodi potrebni se filtri so apsorpciski maksimum
na 550 nm i emisionen maksimum na 580 nm (Slika 4.9).
4.2.1.2. Fluorescentna mikroskopija so
pa|a~ko svetlo
Ovaa mikroskopija ima nekolku prednosti vo sporedba so
propusnata: 1) Objektivite se so {irok otvor i mal fokus
pa ja koncentriraat ekscitaciskata svetlina vo pomala
zona; 2) centriraweto na svetlosta i fokusiraweto kon
objektot se vr{at istovremeno; 3) mo`no e istovremeno
gledawe pod fazen kontrast so {to se zgolemuva kvalitetot
na mikroskopiraweto (Slika 4.10). Tehni~ki e ovozmo`eno
gledawe so opa|a~ka svetlost koga se vneseni dihotomnite
40
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM
(razdeluva~ki) ogledala niz koi e ovozmo`eno minuvawe
na odbienata svetlost od primerokot.
Fluorescentniot snop minuva niz ekscitira~kiot filter
i pa|a vrz primerokot. Dihroi~noto ogledalo dozvoluva
svetlosta da se upati na ednata, no ne i na drugata strana.
Po osvetluvaweto na tkivoto, svetlosniot snop se odbiva,
minuva niz dihroi~noto ogledalo i se gleda zgolemen vo
okularot.
okular
reflektor
svetlosen izvor
sobirni le}i
sobirni le}i
ekscitaciski
filter
odbiena
fluorescentna
svetlina
filter za
toplina
napre~en filter
dihroi~no ogledalo
objektiv
primerok
podvi`na masi~ka
Slika 4.10: Fluorescenten mikroskop so gorno osvetluvawe.
4.2.2. Dobivawe kowugirani protivtela
Denes n$ stojat na raspolagawe golem broj visoko kvalitetni kowugati so razli~na specifi~nost, prigotveni od
mnogu firmi za skoro sekakva potreba. Nivniot broj postojano raste i se pro{iruva zavisno od potrebata na istra`uva~ite i dijagnosti~arite. Zatoa naj~esto e nepotrebno
da se prigotvuvaat sopstveni kowugirani protivtela. Samo
vo retki slu~ai, koga nema gotovi kowugati (osobeno pri
nekoi originalni istra`uvawa), potrebno e da se prigotvat
sopstveni kowugati. Vo takov slu~aj naj~esto se koristi
kowugiraweto so fluorescein- izotiocijanat (FITC), so
tetrametil-rodamid-izotiocijanat (TMRITC) i so
rodamin-B-izotiocijanat (RBITC).
Institut za imunobiologija i humana genetika
41
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
4.2.3. Podgotovka na tkiva i kletki
Postojat razli~ni podgotovki na supstratot vo tkivata
zavisno od celta na ispituvaweto. Vo imunohistohemijata
naj~esto se koristat tkivni preparati prigotveni so kriostat. Kriostatnite preparati mo`at da bidat fiksirani
ili sve`i. Poretko se koristat preparati kalapeni so parafin. Kletkite mo`at da se ispituvaat ili fiksirani
ili pri zapazena vitalnost na kletkite - membranska imunofluorescencija (vidi 2.1 i 2.2). Pri prigotvuvaweto
tkivni i kleto~ni preparati za imunofluorescentno ispituvawe, neophodno e:
- da se zapazat protivgenite determinanti vo supstratot;
- maksimalno da se so~uvaat morfolo{kite strukturi.
4.2.3.1. Tkivni preparati
Tkivnite preparati se prigotvuvaat so naglo smrznuvawe
na tkivoto, negovo se~ewe u{te dodeka e smrznato ili
~uvawe vo smrznata sostojba do momentot koga }e se se~e.
Tkivoto ne smee da se odmrznuva.
1. SMRZNUVAWE SO SO2 I ALKOHOL. Se me{aat
par~iwa komprimiran suv jagleroden dveoksid so alkohol
(metanol ili aceton) vo termos so {iroko grlo na -70oC.
Sme{ata mo`e da se koristi vedna{ ili po nejzino ~uvawe
vo zamrznuva~. Tkivoto (mali par~enca do 5 mm debelina)
se vnesuvaat na dnoto od {iroka epruvetka, se zatvora so
gumen zatvora~ i se vnesuva na dnoto na termosot. Zamrznuvaweto nastanuva momentalno. Smrznatoto par~ence se vadi so ladna pinceta i se stava vrz mikrotomnata masi~ka,
na koja prethodno bila stavena kapka puferiran fiziolo{ki rastvor. Par~enceto tkivo se pritiska so par~ence
suv mraz (zadol`itelno da se nosat azbestni rakavici) za
da se zalepi na masi~kata. Blokot se prefrla vo kriostat
i po dvaesetina minuti (za da se izedna~at temperaturite)
se se~e so debelini zavisni od celta na ispituvaweto.
2. SMRZNUVAWE VO TE^EN AZOT. Tkivoto se postavuva vrz kapka puferiran fiziolo{ki rastvor na mikrotomnata masi~ka i se potopuvaat zaedno vo te~en azot.
Smrznuvaweto nastapuva vedna{. Ponekoga{ se zabele`uvaat puknatinki vo primerokot.
3. SMRZNUVAWE VO IZOPENTAN. Se vnesuva izopentan vo metalen ili plasti~en sad koj celosno se potopuva
vo te~en azot za da se izladi. Koga na dnoto od izopentanot
}e se zabele`at matni kapki, zna~i deka temperaturata e
blizu negovoto mrznewe. Vo toj moment se vnesuva tkivoto
vo izopentanot isto kako i vo to~ka 1. (Smrznuvawe so CO2
i alkohol). Vo ovaa modifikacija ne nastanuva napuknuvawe na tkivoto, no e mo`no delumno rastvorawe na tkivnite strukturi (i da se dobie poslaba fluorescencija od
normalno) ili da se otkrijat nekoi protivgeni determinanti (i da se dobijat popozitivni fluorescentni naodi
od normalno).
42
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM
4. FIKSIRAWE NA KRIOSTATSKITE ISE^OCI.
Kriostatskite ise~oci mo`e da se koristat nefiksirani
ili fiksirani zavisno od rastvorlivosta i otpornosta na
protivgenot kon fiksatorot. Imunoglobulinite i kompleksite protivgen-protivtelo se fiksiraat vo etanol, metanol ili aceton (kratkotrajno i na ladno). Pri doka`uvawe
pnevmokokni polisaharidi, hormon za rast i drugi mo`e da
se fiksira so 4% puferiran formalin (rN 7.2-7.4).
4.2.3.2. Parafinski preparati
Se koristat pri nedostatok na kriostat i mo`nosti za smrznuvawe na tkivata. Pogodni se za ispituvawe imunoglobulini i komplement vo bubre`ni biopsii, imunoglobulini
vo plazmatskite kletki i na revmatoiden faktor vo tkivata, no ne i za ispituvawe protivjadreni protivtela.
1. Fiksacijata na tkivata so debelina od 5 mm se vr{i
vo 95% alkohol na 4oC za eden ~as. Potoa tkivoto se
se~e na 2-4 mm i se ostava vo 95% alkohol na 4oC vo tek
na 15-20 ~asa.
2. Dehidriraweto na tkivoto se vr{i niz ~etirikratno
minuvawe niz apsoluten alkohol, na 4oC (sekoe po 1-2
~asa).
3. Osvetluvaweto se vr{i niz trikratno minuvawe na
tkivoto niz laden ksilen na 4oC (sekoe po 1-2 ~asa).
4. Kalapeweto vo parafin se vr{i so ~etirikratno
minuvawe na tkivoto vo te~en parafin (sekoe po 1-2
~asa) na 56oC vo termostat.
5. Se~eweto na preparatite se izveduva kako za rutinsko
parafinsko se~ewe. Treba da se izbegnuva zagrevawe na
ise~ocite pri nivno stavawe vrz predmetno staklo.
6. Deparafiniraweto se vr{i dvokratno vo laden ksilen
(sekoe po 10-15 sekundi).
7. Plakneweto se vr{i trikratno so puferiran fiziolo{ki rastvor (po 1 min vo sekoe minuvawe).
4.2.3.3. Kleto~ni preparati
Pred boeweto intrakleto~ni antigeni se prepora~uva
fiksacija na kletkite vo 1% puferiran paraformaldehid
za 15 min na pH 7.2. Potoa kletkite se plaknat i se vnesuvaat
vo `elatinski kapsuli (5% `elatin i 5% govedski serumski albumin). Vaka prigotvenata suspenzija se zamrznuva i
se se~e kako za tkivnite preparati (vidi pogore). Postojat
specifi~ni postapki za oddelni vidovi kletki (timociti,
mielomski kletki i drugi), kako i za izveduvawe imunofluorescentni istra`uvawa vo metodiki koi baraat kletkite da bidat `ivi (citotoksi~ni testovi, klasi na diferencijacija i sl.). Ovie postapki korisnicite treba da gi
konsultiraat pred da po~nat so rabota.
Institut za imunobiologija i humana genetika
43
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
4.2.4. Boewe, ot~ituvawe i
dokumentirawe
Postojat dva vida metodiki, koi spored mehanizmot na reakciite se delat na direktna i indirektna imunofluorescencija (mnogu sli~no kako protivglobulinskata reakcija
na Coombs).
4.2.4.1. Direktna imunofluorescencija (DIF)
Vo ovaa tehnika, protivserumot {to sodr`i protivtela e
ve}e markiran so fluorohrom i direktno stapuva vo reakcija so soodvetniot antigen od ise~okot na tkivoto ili od
`ivite kletki, pa reakcijata se odviva vo "edno vreme".
(slika 67). Reakcijata e pogodna za otkrivawe antigeni na
bakterii, limfociti, detekcija na antitela i sekako za
koristewe dvojno boewe (imunofluorescencija so upotreba
na dva fluorohromi- tipi~en primer e dvojnoto boewe so
etidium bromid i akridin oran` pri razlikuvaweto mrtvi
od `ivi kletki kaj limfocitotoksi~niot test). Me|utoa,
testot mo`e da bide la`no pozitiven; bara rabotewe so
~ist materijal, isklu~uvawe na strani~nata ekstrafluorescencijata i osobeno izrazit afinitet, aviditet i specifi~nost me|u antigenot i protivtelata. So direktnata
direktna
imunofluorescencija
indirektna
imunofluorescencija
indirektna komplementno
zasilena
imunofluorescencija
protivtelo
protivtelo
plaknewe
plaknewe
flouresceinirano
protivtelo
tkiven
ise~ok
plaknewe
dodadi flouresceinirano protiv Ig
protivtelo
dodadi
komplement
plaknewe
Slika 4.11: Mehanizmi na direktna imunofluorescencijaobele`uvawe na protivgenot
so primarno protivtelo (levo); direktna imunofluorescencija so fluorosceiniran
protiv Ig (sredina); indirektna komplement zasilena imunofluorescencija (desno).
44
plaknewe
dodadi flouresceinirano protiv C3
protivtelo
plaknewe
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM
imunofluorescencija mo`e da se determiniraat i protivtela koga antigenot e poznat i markiran so opredelena
fluorescentna boja. Ovoj na~in poretko se koristi.
4.2.4.2. Indirektna imunofluorescencija
(IIF)
Indirektnata imunofluorescencija se koristi pri otkrivaweto protivtela i avtoprotivtela, koi se naso~eni kon
opredeleni antigeni vo kletkite i tkivata. Svrzuvaweto
na tie protivtela so soodvetniot antigen vo supstratot
se utvrduva so pomo{ na kowugati so gama globulin (nespecifi~en protivglobulinski kowugat) ili so kowugati
kon oddelni klasi imunoglobulini. Metodot mo`e da se
upotrebi za doka`uvawe protivtela sozdava~ki kletki kon
opredelen antigen, dokolku raspolagame so soodvetniot
antigen i kowugirano protivtelo naso~eno kon ispituvaniot antigen. IIF mo`e da se upotrebi i koga ne e mo`no
direktno obojuvawe poradi nedostatok na sootveten kowugat. Vo takov slu~aj, supstratot go tretirame so neobele`eno protivtelo (mo`e i so serum), a nastanatata imunolo{ka reakcija ja doka`uvame so dopolnitelno boewe
so specifi~en protivglobulinski kowugat (na primer,
protiv IgG1). Vo osnova na ovaa tehnika, koja se odviva vo
"dve vremiwa", e modifikacijata na indirektnata protivglobulinskata reakcija (Kumbsov test) ili tehnikata
koja sodr`i dvojni protivtela. Imunokompleksot se formira so inkubacija na antigenot vo supstratot so neobele`eno protivtelo. Potoa se dodava obele`eniot so fluorohrom protivglobulinski serum (Slika 4.11).
Indirektnata imunofluorescencija ima prednosti pred
direktnata. Taa e mnogu poosetliva (ponekoga{ i do deset
pati), a mo`at da se koristat pove}e vidovi specifi~ni
ispituvawa so ist kowugat kon op{tite imunoglobulini
ili nekoi od nivnite supklasi (protiv nuklearnite, protiv bazalnomembranskite i drugi protivtela mo`at da se
otkrijat so isti kowugirani imunoglobulini). Polispecifi~niot protivglobulinski serum ovozmo`uva da se
otkrijat imunokompleksite od site vidovi reakcii so
protivtela od ista vrsta, kako i protivtelata koi koristat komplement bidej}i protivglobulinskiot serum mo`e
da sodr`i i protivtela specifi~ni za komponentite na
komplementot.
4.2.4.3. Sistemot biotin-avidin
Poznato e deka biotinot (vitamin so slaba molekularna
masa, rastvorliv vo voda) ima svojstvo lesno da se povrzuva
so ogromen broj najrazli~ni biolo{ki molekuli. Taka toj
mo`e mnogu cvrsto da se vrze i so avidinot (4 molekuli
biotin se vrzuvaat so edna od avidinot). Avidin e glikoprotein koj se dobiva od albuminot od jajceto; ima molekulska masa od 68.000 i mo`e lesno da se obele`i so fluorohrom na pr. FITC ili rodamin, pri {to pove}e molekuli
fluoroboja se vrzuvaat za edna molekula avidin.Taka, vo
ovaa reakcija se koristat svojstvata na biotinot {to mo`e
lesno da se vrze za protivtelata so kovalentna vrska (Slika
Institut za imunobiologija i humana genetika
45
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
4.12), a potoa i so avidinot koj ve}e sme go obele`ale so
nekoja fluoroboja. Pri ispituvaweto na protivtelata so
ovoj sistem, reakcijata zapo~nuva so postavuvawe na serumot vo kontakt kade se ispituvaat protivtelata i soodvetniot antigen. Potoa se dodava protivprotivteloto (sli~no
kako pri protivglobulinskiot test na Coombs ) obele`eno
so biotin. Za da bide reakcijata vidliva, na kraj se dodava
avidin obele`an so fluorohrom. Se dobiva mnogu jasna
fluorescencija, a reakcijata e mnogu osetliva bidej}i otkriva i najmali koncentracii antitela zatoa {to tie se
biotinilizirani - zna~i pove}e molekuli biotin se vrzuvaat za edna molekula od protivteloto i ovoj nov kompleks
pak preku biotinot formira mnogu cvrsta vrska so dodadeniot avidin obele`en so fluorohrom. Ovie cvrsti vrski
ovozmo`uvaat mo}na i jasna fluorescencija. Na takov na~in, reakcijata izrazito e amplificirana bez da se vlijae
vrz to~nosta na rezultatot. Vo ovoj sistem, isto taka mo`e
da se koristi obele`uvawe so dva fluorohromi.
avidin
imunoglobulin
peroksidaza
Slika 4.12: Mehanizam na avidin biotin-peroksidazen
test za opredeluvawe imunoglobulini.
biotin
4.2.4.4. Kvantitativna
imunofluorescencija
Glavniot nedostatok na imunofluorescencijata e subjektivnosta pri ot~ituvawe intenzitetot na imunofluorescencijata. Denes ima razvieno nekolku tehnolo{ki postapki za kvantifikacija na imunofluorescencijata. So
pomo{ na mikrofluorometar mo`e precizno da se izmeri
koli~inata na svetlo so opredelena branova dol`ina koja
ja pra}a fluorescentniot primerok. Razvieni se imunofluorescentni testovi za kvantificirawe na IgG, IgA,
IgM, Ce3, Ce4 i drugi materii vo histolo{kite preparati, kako i protivjadreni i protiv DNK protivtela. Koli~inata na fluorescentnite protivtela vrzani za nerastvorliviot protivgen se merat so posebno vgradeni mikrofluorimetri i se pretvoraat vo mg% so pomo{ na standardna prava dadena od proizvoditelot na opremata i/ili na
hemikaliite.
46
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 4: KLETKI VO IMUNIOT SISTEM
4.2.4.5. Gre{ki i la`no pozitivni rezultati
Ponekoga{ vo imunofluorescentnite ispituvawa se javuvaat gre{ki i la`no pozitivni rezultati koi se dol`at
na nespecifi~ni imunolo{ki reakcii. Nespecifi~ni boewa mo`at da se dobijat poradi lo{o pre~istuvawe na kowugatite i prisustvo na fluorohromirani neimunoglobulinski materii vo niv. Nespecifi~ni boewa mo`at da se
dobijat pri nesoodvetno mrznewe na primerocite, grebnatinki na predmetnoto staklo, lo{o prilepuvawe na primerokot vrz stakloto, prisustvo na bakterii (koi apsorbiraat kowugat) vo kowugatot ili pak, nekroti~ni promeni vo tkivata. ^esto nespecifi~no boewe prika`uvaat granulite na eozinofilnite leukociti {to mo`e zna~itelno
da se namali so apsorpcija so crnodroben prav. Golema grupa
`ivotinski tkiva (koi se koristat kako supstrat za doka`uvawe tkivno specifi~ni protivtela vo serumot od bolni
lu|e) mo`e da dade la`no pozitivni rezultati zaradi heterospecifi~nite protivtela vo ispituvaniot serum,
osobeno ako toj e so visok titar. Pri ispituvawe membranski imunoglobulini kaj B-limfocitite, potrebno e da se
utvrdi brojot na monociti vo suspenzijata. Potpolnoto
otstranuvawe na monocitite e te{ko i so golemi gubitoci
na B-limfocitite, zatoa e najdobro da se utvrdi nivniot
broj so fazen kontrast ili so dopolnitelno boewe na preparatite za peroksidaza. Treba da znaeme deka nekoi tkivni
i kleto~ni materii imaat karakteristi~na avtofluorescencija (kalciumovite talozi, lipofuscinot i vitaminot
A (`olta boja), riboflavinot (`oltozelena boja), porfirinite (temno crvena boja) i sli~no.
4.2.4.6. Dokumentirawe na rezultatite
(fotografirawe)
Fotografiraweto na fluorescencijata zna~ajno ne se razlikuva od obi~noto mikroskopsko fotografirawe. Obi~no
me|u aparatot i objektivot se postavuva filter (naj~esto
OGI). Vremeto na ekspozicija zavisi od ja~inata na filmot
Slika 4.13: Inverten fluorescenten mikroskop so mo`nost
za fotografirawe (Nikon,
Diaphot 300).
Institut za imunobiologija i humana genetika
47
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
i se opredeluva od iskustvo (od 10 sekundi do 20 min). Ekspozicija podolga od 20 min ne dava dobri rezultati zatoa {to
doa|a do "gasnewe" na fluorescencijata po prodol`enoto
osvetluvawe. Dobri rezultati davaat crno belite ili
kolor filmovi so golema osetlivost (na pr. od 400 do 1.600
ASA).
4.3. Zada~a
Odvoi limfociti od ~ovekova periferna krv i opredeli
go brojot na `ivite i na mrtvite kletki vo 1 mL. Izbroj
kolku limfociti ima vo dadeniot mililitar Henksov
medium i nivniot broj doteraj go do 2*106 vo 1 mililitar.
Rezultatite vnesi gi vo Tabela 4.1.
Tabela 4.1: Tabela za vnesuvawe rezultati od izdvoenite limfociti.
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
48
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 5: PROTO^NA CITOMETRIJA
[email protected] 5: PROTO^NA
CITOMETRIJA
5.1. Sistem za proto~na
citometrija
Prvite citometri bazirani na svetlina, bea malku pove}e
od te~na pateka, izvor na ekscitacija i fotodetektor.
Kako i pove}eto instrumenti, i proto~nite citometri
stanuvaat sofisticirani aparati koi kombiniraat,
te~nosti, optika, elektronika i softver so {to se
ovozmo`uva mereweto da bide na mikroskopski ~esti~ki
so brzina od pove}e desetici ilijadi vo sekunda. Ovie
instrumenti go iskoristija razvojot na pove}e tehnolo{ki
dostignuvawa (kako poluprovodnici i telekomunikacii),so
{to ja zgolemija to~nosta i doverbata so zna~itelno
namaluvawe na goleminata.
Institutot za imunobiologija i humana genetika raspolaga
so proto~en citometar CyAnADP od firmata DAKO.
Aparatot ima tri laseri so mo`nost za analizirawe kletki
so pet boi i soodveten softver za analiza (Slika 5.1).
Slika 5.1: Sistem za proto~na
citometrija CyAnADP od firmata DAKO na Institutot
za imunobiologija i humana
genetika.
Institut za imunobiologija i humana genetika
49
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Slika 5.2: [ematski prikaz na
proto~en citometar.
5.1.1. Proto~na citometrija
Pripremenite primeroci ~esti~ki koi treba da se
ispituvaat, go po~nuvaat svoeto patuvawe niz proto~niot
citometar u{te vo epruvetakata za primerokot (plo~ka so
pove}e bunar~iwa ili nekoj sli~en nosa~). Koga }e
pristapime kon analiza, primerokot se vsmukuva (aspirira)
od epruvetkata i se prenesuva (transportira) niz cev~iwa
do proto~nata kiveta ili prskalkata. Vo proto~nata
kiveta, primerokot se vnesuva vo centarot na najbrziot
proto~en nosa~ i patuva do svetlosniot izvor koj se
ekscitira (Slika 5.2). Svetlosnoto rasejuvawe i/ili
fluorescencijata se registrira, spektralno se filtrira
i se naso~uva kon soodvetnite fotodetektori za konverzija
vo elektri~ni signali. Elektronskoto kru`ewe se koristi
za obrabotka na ovie signali za analiza, klasifikacija,
kategorizacija i ~uvawe na podatocite. Za sortirawe,
sekoja ~esti~ka se sledi vo instrumentot kako {to minuva
niz centralniot mlaz, se oddeluva od nego i kako
polarizirana ~esti~ka se sortira. Kapkata pominuva niz
elektri~no pole i na krajot se sobira vo soodveten
kontejner za ponatamo{no analizirawe ili izu~uvawe,
ili se frla kako otpad.
5.1.2. Te~ni sistemi
Slika 5.3: Hidrodinami~nite
osobini na te~nostite vo
vrvot na proto~nata igla od
citometarot.
50
Te~nite sistemi na proto~niot citometar se koristat za
transportirawe na ~esti~ki od slu~ajna tridimenzionalna
suspenzija na primerocite do ureden protok na ~esti~ki
koi patuvaat niz eden ili pove}e osvetluva~ki branovi.Vo
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 5: PROTO^NA CITOMETRIJA
sorterite ovie ~esti~ki se transportirani vo elektri~no
provodliv te~en nosa~. Te~niot sistem ~esto koristi
regulacija so vozdu{en pritisok za stabilno rabotewe i
se sostoi od najmalku edna mlazna linija i linija na
primeroci za snabduvawe na proto~nata kiveta.
So vleguvawe na primerokot vo komorata od proto~nata
kiveta, nadvore{nata, brza mlazna te~nost, hidrodinami~no ja fokusira te~nosta vo tesen centralen mlaz od
edine~ni ~esti~ki do izvorot na ekscitacija (Slika 5.3).
Ovaa geometrija ovozmo`uva zgolemena to~nost za
pozicionirawe na to~kata od laserskoto ispituvawe, za
postojanosta na ekscitira~koto zra~ewe i vo golema mera
go namaluva blokiraweto na ~esti~kite vo proto~nata
kiveta. Za instrumentite samo za analiza, proto~nata
kiveta ima tipi~na kvadratna ili pravoagolna forma so
dimenzii od redot na nekolku stotici mikroni. Za
sorterite te~nosta izleguva od prskalkata niz kru`en
otvor (obi~no so dijametar 50 -200 mikrometri) i se sozdava
kontinuiran mlaz pred da se rasprsne vo kapki. Vo zavisnost
od dizajnot na instrumentot, ~esti~kite se ili ispituvaat
dodeka se vo proto~nata kiveta, ili koga izleguvaat i se
zadr`uvaat vo mlazot vo vozduhot. Po ispituvaweto
primerokot se isfrla vo otpadot, osven ako ne se pobara
sortirawe na ~esti~kite. Za da se odre‘i vklu~uvaweto i
~isteweto na instrumentot, obi~no e obezbedena vakum
linija.
5.1.3. Opti~ki sistem
Opti~kiot sistem e klu~en za proto~nata citometrija - za
osvetluvawe na obele`enite i neobele`enite ~esti~ki
kako i za otkrivawe (detekcija) na rasprskanite i
fluroscentnite svetlosni signali.
Ekscitacija i emisija. Pove}eto proto~ni citometri
koristat eden ili pove}e laseri za kleto~na ekscitacija.
Emisijata, vo forma na svetlosno rasprsnuvawe, se javuva
koga svetlinata od ekscitacijata e absorbirana i potoa
povtorno rasprostraneta od ~esti~kite koi gi ispituvame,
bez promena vo branovata dol`ina. Rasprskuva~ot e,
tipi~no, najsilen vo direktnoto naso~uvawe, vo odnos na
incidentnata drazba od izvorot.Fluorescencija se javuva
koga molekulata e nadrazneta od svetlinata so edna branova
dol`ina, a se vra}a na ponisko nivo so emitirawe na
svetlina so podolga branova dol`ina. Svetlinata od
emisijata i ekscitacijata, koja vo toj moment e od vi{okot
branovi dol`ini, mo`e da bide blokirana ili diferencirana so opti~ki filter. Nekoi kleto~ni komponenti
mo`at da se izmerat so primena na nekolku izvori na
ekscitacija i nekolku kleto~ni obele`uva~i koi
emitiraat na razli~ni branovi dol‘ini. Ovaa klu~na
sposobnost za otkrivawe (detektirawe) na fluroscencija,
istovremeno od pove}e razli~ni komponenti vrzana za
edna ili pove}e kletki, doveduva proto~nata citometrija
da bide tehnika na izbor za pove}eparametarski
fluroscentni analizi na kleto~nite populacii.
Institut za imunobiologija i humana genetika
Slika 5.4: Dihroi~ni filtri
(gore) i apsorpciski filtri
(dolu) ovozmo`uvaat prostorno odvojuvawe na svetlinata.
51
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Sobirawe na svetlinata. Vo voobi~aenite proto~ni
citometri,svetlinata se sobira preku dve le}i, nare~eni
predna i strani~na le}a za sobirawe, zavisno od nivnata
postavenost kon vleguva~kiot laserski snop svetlina.
Prednata sobira~ka le}a ja sobira rasprsnatata svetlina
okolu centarot na vlezniot snop. Podatocite od ovaa le}a
se koristat za opredeluvawe goleminata na ~esti~kite.
Strani~nata sobirna le}a ima golem otvor za efikasno
sobirawe na fluorescencijata i sobira svetlina postavena
90 stepeni (perpendikularno) na svetlosniot lasrski snop.
Strani~noto sobirawe se koristi za razlikuvawe na
kletkite vrz osnova na nivniot izgled (morfologija).
Opti~ki filtri. Koga fluorescentnata svetlina od
kletkata e ulovena od sobira~kite le}i, spektralniot del
koj ne interesira za sekoj obele`uva~ mora prostorno da se
odvoi zaradi detekcija. Ova odvojuvawe na branovite
dol`ini se postignuva so dihroni~ni (45 stepeni) i
emisioni filtri. Dolgobranovite filtri dozvoluvaat
transmisija na dolgi branovi dol`ini, a kratkobranovite
na kratki branovi dol`ini. Selektivnite filtri
dozvoluvaat pominuvawe na odredeni branovi dol`ini
koi ni se od interes, dodeka ostanatite nesakanite branovi
dol`ini ne gi propu{ta (Slika 5.4).
Detektori. Dvata glavni tipovi na fotodetektori koi se
koristat vo proto~nata citometrija se silikonskite
fotodiodi i fotomultiplikaciski cevki. Silikonskite
fotodiodi obi~no se koristat za naso~eno rasprskuva~ka
detekcija, kade {to nivoto na signalot e visok. Dodeka
fotomultiplikaciskite cevki imaat visoka senzitivnost,
i zatoa se zadol`eni za strani~niot rasprskuva~ i
fluroscentnata detekcija.
Elektronika. Ulogata na elektronikata e za nadgleduvawe
i kontrola na raboteweto na proto~niot citometar, od
momentot na otkrivawe na ~esti~kata koja pominuva niz
fokusot na laserot, do fizi~koto skr{nuvawe na taa
~esti~ka vo sadot za sobirawe. Koga ~esti~kata od interes
pominuva niz fokusot, fluorescira, i e zabele`ana od
fotodetektorot, se sozdava elektri~en signal, a
elektronikata go obrabotuva toj signal. Ovoj instrument
se vklu~uva koga ovoj signal go nadminuva odnapred
odredenoto nivo na {umot. Ovoj {um se koristi prvenstveno
za da gi otfrli slu~uvawata koi ne se predizvikani od
~esti~kite, kako {umovi od opti~kite i elektronski
izvori. Pulsnite karakteristiki se determinirani od
goleminata i brzinata na ~esti~kite, {irinata na
osvetluva~kiot bran, a vo slu~aj na fluroscencija, od
distrubucija na flurohromi vo ~esti~kata.
Slika 5.5: Osobini na pulsnite
merewa.
52
Razli~nite formi na obrabotka na pulsnite karakteristiki ovozmo`uva razli~nite merewa da se napravat od
ist signal kako visina na vrv, integral (povr{ina), {irina,
kosina, itn (Slika 5.5). Vo nekoi slu~ai, linearnata
amplifikacija i analizata na fluroscencijata ili
rasprsnuvaweto e soodvetna so osobinite na ~esti~kite,
kako {to e slu~aj kaj DNK ispituvawata. Vo mnogu slu~ai,
kako kaj studiite na imnunofenotipizacija, mereweto i
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 5: PROTO^NA CITOMETRIJA
na obele`enite i neobele`enite ~esti~ki, bara merewe
na pove}e golemini. Za da se postigne ovoj {iroko
dinami~en rang, se koristat razli~ni analogni, digitalni
ili hibridni elektronski sistemi za obrabotka na
signalot. Analognite aparati, kako logaritmi~kite
amplifikatori, obezbeduvaat visoka amplifikacija na
mali signali, i edine~na amplifikacija na golemi signali,
dodeka aparatite za obrabotka na digitalnite signali se
koristat za digitalizacija na pulsnite parametri. Nekoi
instrumenti koristat kombinacija od analogni i digitalni
elektronski elementi za da se iskoristat prednostite na
dvete napravi. Vremenata kaklkulacijata i sposobnosta za
donesuvawe odluka ovozmo`uva i dvete funkcii da se
odvivaat so golema brzina.
Softver. Prvite proto~ni citometri koristea osciloskop za ednostavni poka`uvawe na visinata na pulsnite
karakteristiki i nivna analiza. Denes, pove}eto
instrumenti koristat softver za kontrola na instrumentot, skladirawe, analizirawe i prika`uvawe na
podatocite.
Slika 5.6: Fluorescentna
{ema (histogram) so 8 vrva za
PE parametarot. Vnatre vo
histogramot ima ~esti~ki
koi se distribuirani na baza
na detektitraniot intenzitet na boja. Onie koi {to
emitiraat pojak signal se
postaveni na povisokite kanali po dol`ina na H oskata,
dodeka poslabite se locirani
vo poniskite kanali.
5.1.4. Analiza na podatocite
Proto~niot citometar vo kombinacija so mo}en softverski program im ovozmo`uva na istra`uva~ite
sofisticirana metoda za brzo sobirawe i analizirawe na
podatoci za golema populacija kletki. Komercijalnite
instrumenti se dostapni i mo`at da obrabotat preku 70.000
~esti~ki (partikli) vo sekunda i da gi otkrijat so pomo{
na devet fluorescentni boi i dva rasprsnuva~i na svetlina.
Sposobnosta da se analiziraat pove}ekratni (multipli)
parametri, simultano za edna dadena kletka, im ovozmo`i
na istra`uva~ite podobro da gi razberat kompleksnite
kleto~ni procesi kako {to se: onkogenezata, apoptozata
ili kleto~nata regulacija so pomo{ na fenotipski
definirani populacii.
5.1.4.1. Analiza
Dene{nite softverski programi davaat mo`nost za
prika`uvawe i analizirawe na podatocite od proto~nata
citometrija. Edna od opciite vklu~uva histogram kade
istra`uva~ot mo`e da gleda vo proto~nata {ema samo eden
parametar od edna populacija. Histogramot prika`an na
Slika 5.6 ni prika`uva fikoeritrin (phycoerythrin – PE)
fluorescentna {ema za primerok od 8-vrva ({ilci). Koga
se anlaizira so proto~en citometar, ovie vrvovi se
dizajnirani taka da ni prika`at osum razli~ni populacii
so razli~ni fluorescentni intenziteti. Vrvovite se
inducirani od 488 nm laser, a podatocite se skladiraat i
se za~uvuvaat so koristewe na logaritamska skala. Za
upotreba na podatocite, vklu~uvaj}i gi i fluorescentnite
8-vrva, podatocite od logaritamskite skali podobro e da
bidat prika`ani na linearna skala. Ova e voobi~aeno koga
se raboti so fluorohromi za da se prika`e prostornoto
sobirawe na izlo`enata fluorescencija.
Institut za imunobiologija i humana genetika
Slika 5.7: Prepokrivawe. Limfocitite se odbele`eni i
analizirani so FITC kowugirani protiv-CD3 protivtela.
53
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Prepokrivaweto formira specijaliziran tip na histogram
koj dozvoluva (dava mo`nost) za simultano prika`uvawe
podatoci od brojni primeroci (Slika 5.7). So ovoj priod,
oddelni primeroci mo`at da se sporeduvaat vrz osnova na
odreden fluorescentni parametri ili da se izvr{i pregled
na podatocite. Nekolku primeni koi se prednost na ovoj
tip analizirawe vklu~uvaat prika`uvawe na specifi~ni
proteini od genite, identifikacija na kleto~ni linii so
nepravilno (so anomalno) gensko prika`uvawe, ili
sledewe na genskoto prika`uvawe vo odredena populacija
kako odgovor za nadvore{nite faktori, kako {to se
biolo{kite zna~ajni sostavni delovi.
Slika 5.8: Grafikon od to~ki
od Jurkatovi T-limfociti.
To~kite i gustinata na crte`ite davaat mo`nost za vzaemna
vrska i da se utvrdi fluorescentnata informacija
simultano za dva parametra. Na primer, ovaa {ema od
to~ki na Jurkat (JKT) T-limfociti koristi preden i
strani~en parametar od rasprskuva~ot na svetlo. Signalot
od predniot rasprskuva~ (FSC) nastanuva od prekr{enite
zraci vo prednata nasoka kako {to kletkite pominuvaat
niz to~kata na laserskoto ispituvawe i voobi~aeno se
zarobuva (fa}a) so pomo{ na fotodioda povrzana so (ili
vo par so) `leb ili grupa na filtri so konfiguracija(struktura) za emisija na spektrum od izvorot na
svetlina. Ovoj parametar e vo korelacija so goleminata na
~esti~kata, dodeka stra-ni~niot rasprskuva~ na svetlina
(SSC) slu`i za kleto~nata granuliranost ili vnatre{nata
morfologija na kletkata ili ~esti~kata (Slika 5.8).
Naizmeni~nite metodi za prika`uvawe podatoci se
dostapni za dve-parametarski {emi. Edna od opciite e
oblikot(reqefot), koj ni prika`uva podatoci za niza
(serija) od kleto~ni linii, ne{to sli~no na toa {to se
nabquduva so topografski mapi. Reqefnata {ema e vo
korelacija so distribucijata i nivoto na gustina na
kletkite ili ~esti~kite vnatre vo {emata i mo`at da se
koristat za olesnuvawe (pomagawe) na analizata na
podatoci ili da se skicira (zacrta) populacijata koja ni e
od interes (Slika 5.9:desno).
Razli~ni statistiki se dostapni za analiza na podatocite
vnatre vo histogramite i {emite od to~ki. Statistikata
vklu~uva vkupni presmetki, populaciski procenti,
prosekot, sredinata, koeficientot na varijacija (KV) i
standardnata devijacija. Na primer, vkupnata presmetka i
Slika 5.9: [ema od to~ki i
oblik za E.coli odbele`eni so
boja nukleinska kiselina,
SYTO-9.
54
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 5: PROTO^NA CITOMETRIJA
procentot za specifi~na kleto~na populacija mo`at da se
iskoristat vo klini~kata dijagnoza na bolesta. Vo slu~aj
na HIV inficirani pacienti utvrduvaweto (procenuvaweto) na T kleto~nata ekspresija na CD4i CD8 mo`e da
se koristi za da se utvrdi imunolo{kata sostojba na
pacientot. Statisti~kiot iskaz na koeficientot na
varijacija tradicionalno se koristi zaedno so vrvovite na
kalibracijata i dnevnata kontrola na kvalitetot vo
instrumentot, a istotaka mo`e da se koristi i za
kvantificirawe na fluorescentniot intenzitet na
kletkite so koristewe na standardni kalibracioni
edinici ili molekuli na ekvivalenten solubilen
fluorohrom (Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome
(MESF)).
Za da se napravi statistika za subpopulaciite, vnatre vo
histogramite mo`at da se sozdadat podra~ja. Vo slu~aj na
dijagnoza na bolest, klini~arite ~esto se potpiraat na
statistikite od razli~nite limfocitni podsetovi za da
okarakteriziraat i tretiraat mnogu tipovi na leukemii i
limfomi. Najgolem del od studiite za ovie poremetuvawa
se baziraat na identifikacija na kletkite koi sodr`at
odredeni {emi za prika`uvawe (ekspresija) na povr{inskite kleto~ni proteini. Faktorite kako {to se
celosen broj na kletki, procenti na populacija, svetlina
(bistrina) ili fluorescentni razliki me|u populaciite
i statisti~kiot odnos (sooodnos) pome|u populaciite,
mo`at da se iskoristat za da se analiziraat i kvantificiraat podatocite.
Slika 5.10: [ema od to~ki i
Porti za analiza na limfocitni subpopulacii. Podatocite se kompenzirani za da se
koregira fluorescentnoto
preklopuvawe pome|u fluorohromite.
Regionite mo`e da se koristat i za sozdavawe i primena na
porti. Portite mo‘e da vklu~uvaat eden ili pove}e regioni
i se koristat primarno za minimizirawe ili eliminirawe
na nadvore{ni (neva`ni) slu~uvawa vnatre vo {emata za
analiza ili da se izoliraat specifi~ni kletki i partikli
koi ni se od interes. Nekoi softverski programi istotaka
ovozmo`uvaat da se izbiraat boi za tie nastani koi se
nao|aat vnatre vo odreden region ili porta, a spored toa
ni se ovozmo‘uva lesna identifikacija na onie kletki koi
se vo drugi histogrami ili {emi so to~ki.
[emite na Slika 5.10 ni ilustriraat pateka na polna krv
koja e analizirana so proto~na citometrija. Platoto na
levata strana ni prika`uva malku od celata kleto~na
populacija i mo`e da se identifikuva so koristewe na
prednite i strani~nite rasprskuva~ki parametri. Vo ovoj
eksperiment kletkite se oboeni so fluorescentno
obele`eni protivtela naso~eni kon specifi~ni povr{inInstitut za imunobiologija i humana genetika
55
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
ski kleto~ni protivgeni, specifi~no FITC – kowugirano
protivtelo protiv CD3, PE-kowugirano protivtelo kon
CD19, i PE-Cy5 kowugirano protivtelo protiv CD45.
Slika 5.11: Grafikon na spektralno emitirawe. Poliwata b i d ni go poka`uvaat
o~ekuvanoto prelevawe vo
FITC i PE detektorite.
Sozdadena e porta specifi~na za limfocitna populacija
(R1) i istata se primenuva za drugi histogrami koi sodr`at
eksperimentalno dosta zna~ajni parametri. Ova ovozmo`uva identifikacija i analiza na limfocitnite
subpopulacii koi prika`uvaat na svojata povr{ina
razli~ni proteini. Sredi{nata slika ni gi identifikuva
onie limfociti koi prika`uvaat ili CD3 ili CD19
protivgen. Limfocitite koi prika`uvaat CD3 se zeleni
(dolu desno), onie koi prika`uvaat CD19 se sini (gore
levo), a onie koi ne prika`uvaat nieden od ovie proteini
se so violetova boja (dolu levo) (na Slikata 5.10 desno,
site se vo sivi nijansi). Ovaa mo`nost za simultano
analizirawe na multipli parametri za dadena kleto~na
populacija e edna od najgolemite pridobivki od koristeweto na proto~nata citometrija.
5.1.4.2. Nadomest (kompenzacija)
Koga se sproveduva pove}eoboen (multikoloren) eksperiment mora da se zeme vo predvid mo`nosta za
fluorescentno me{awe i popre~uvawe koe se sozdava kako
rezultat od boewe ili od fluorohromite koi se sostojat od
blisko ili od preklopuva~ko emituvawe na spektar.
Mnogu programi vo proto~nite citometri imaat algoritmi
koi mo`at matemati~ki da gi koregiraat spektralnite
preklopuvawa. Vo svetot na proto~nata citometrija ovoj
proces e poznat kako nadomest (kompenzacija). Ova se
odnesuva na specifi~ni softverski ili hardverski
postapki koi matemati~ki gi otstranuvaat fluorescentnite preklopuvawa za da se poednostavat tolkuvawata
na pove}eoboenite podatoci i da se razlikuvaat
populaciite vo dvojno-parametarskiot histogram (Slika
5.11). Edna od pridobivkite od ovoj proces e deka na kraj im
ovozmo`uva na istra`uva~ite podobro da gi skiciraat
populaciite, vrz osnova na prika`uvawe ili nerika`uvawe na specifi~ni kleto~ni komponenti, kako
{to se povr-{inskite kleto~ni protivgeni.
5.1.4.3. Skladirawe podatoci
Prednost na proto~nata citometrija e mo`nosta za
simultana detekcija i analiza na multipli parametri.
Informaciite sobrani od golem broj komercijalni
proto~ni citometri se za~uvani vo standardizirani dosijea
poznati kako FSC (Flow Cytometry Standard). Prifa}aweto
na ova uniformirano dosie im dade na istra`uva~ite
mo`nost da sobiraat podatoci od razli~ni instrumenti, a
potoa da gi analiziraat podatocite koristej}i razli~ni
softverski programi.
56
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 5: PROTO^NA CITOMETRIJA
5.1.5. Proto~no sortirawe kletki
Upotrebata na sortira~kata proto~na citometriska
tehnologija privlekuva vnimanie vo raznovidni segmenti
od biologijata i industrijata.
Zasega ovaa tehnologija ovozmo`uva mo}na i unikatna
sposobnost za brza izolacija na ~isti populacii kletki
ili ~esti~ki so posakuvaniot (pobaraniot) set na biolo{ki
karakteristiki. Potoa ovie populacii se dostapni za
morfolo{ko ili genetsko ispituvawe, kako i za
funkcionalni i terapevtski analizi.
Istoriski gledano, ovaa tehnologija bila razviena za da se
olesni sortiraweto na kletki i drugi ~esti~ki, a mnogu
brzo e prifatena i iskoristena vo ispituvawata koi se
koristat vo imunologijata za pro~istuvawe na limfocitnite podtipovi. Ottoga{ pa navamu primenata na ovaa
tehnologija postojano se pro{iruva, taka da tekovnoto
podra~je za upotreba se dvi`i od ekolo{ko sledewe do
industrisko sozdavawe enzimi.
Postojat dva metoda za sortirawe ~esti~ki so proto~nata
citometrija: elektrostatski i mehani~ki metod.
Vo elektrostatskiot metod (Slika 5.12 gore), ~esti~ki
se isfrlaat niz prskalka i se prisiluvaat da se razdelat
vo vid na kapka so upotreba na vibracii vo samata prskalka.
Kapkite sodr`at ~esti~ki koi mo`at da skr{nat od
glavnata nasoka na dvi`ewe so primena na polne` vo
samite kapki.
So mehani~kiot metod (Slika 5.12 dolu), ~esti~kite koi
ni se od interes se prenaso~uvaat ili so dvi`ewe na
kapilara za fa}awe ili se otklonuvaat so pomo{ na
akusti~en (zvu~en) puls vo fiksirana kapilara.
Slika 5.12: Elektrostatsko
sortirawe (gore) i mehani~ko
sortirawe (dolu).
5.2. Funkcionalen test za kletki
prirodni ubijci (KPU)
5.2.1. Osnovi na testot
Vo ovoj test kako celni kletki se upotrebuva kleto~nata
linija K562 dobiena od pacient so hroni~na mieloidna
leukemija vo terminalna blastna kriza. Vakvite celni
kletki ne poseduvaat klasa 1 i klasa 2 molekuli od GTSK
i se isklu~itelno osetlivi kon dejstvoto na KPU.
Osnovno kaj sekoj test so koj se ispituva citotoksi~nata
aktivnost e da se pravi razlika pome|u efektornite i
celnite kletki. Poradi toa kletkite od K562 kleto~nata
linija se oboeni so zelena fluorescentna boja, koja se
pozicionira vo nivnata membrana. Ovaa boja ne se vrzuva
za efektornite kletki.
Liti~kiot proces e karakteriziran od nekolku fazi:
prepoznavawe na celnata kletka, vrzuvawe na efektornata
kletka za celnata, aktivirawe na procesite koi }e dovedat
Institut za imunobiologija i humana genetika
57
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
do liza i umirawe na celnata kletka. KPU gi ubivaat celnite kletki ili preku mehanizmite zasnovani na dejstvoto
na perforinite i granzimite ili preku direktno/indirektno aktivirawe na apoptozata vo celnata kletka. Po
inkubacijata na efektornite i na celnite kletki vo
sme{ata se dodava crvena fluorescentna boja za boewe na
DNK. Ovaa boja gi obojuva samo onie kletki koi imaat
o{tetena kleto~na membrana. Na ovoj na~in mo`at da se
razlikuvaat ~etiri populacii kletki: `ivi celni kletki,
mrtvi celni kletki, `ivi efektorni kletki i mrtvi
efektorni kletki. Ottuka mo`e da se presmeta so-odnosot
pome|u efektornite i celnite kletki. Rutinski, za
odreduvawe na citotoksi~nata aktivnost, se presmetuvaat samo FL1 pozitivnite signali (mrtvi i `ivi celni
kletki).
5.2.2. Protokol za rabota
5.2.2.1. Op{ti podgotovki
1. Se zagreva vodenoto kupatilo na 370C.
2. Se zagreva kompletniot medium na 370C.
3. Vo kupatiloto so mraz se stavaat nosa~ite za epruveti.
4. Se vklu~uva i se kalibrira proto~niot citometar.
Od osobeno zna~ewe e da postoi precizna kontrola na
temperaturata.
5.2.2.2. Izolacija na efektornite kletki
(Slika 5.13)
So venepunkcija od sekoj pacient se zema po 5 mL
heparinizirana krv. Zemaweto na krv mora da bide vo
asepti~ni uslovi. Efektornite kletki se izdvojuvaat so
pomo{ na Ficoll-Hypaque (so gustina 1.077).
Dobieniot talog posle vtoroto centrifugirawe se
resuspendira vo 1 mL kompleten medium, se brojat kletkite
i nivniot broj se doteruva do 5h106 kletki/mL kompleten
medium.
Slika 5.13: Izolacija na limfociti od periferna krv
(efektorni kletki) za koristewe vo testot za KPU.
58
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 5: PROTO^NA CITOMETRIJA
5.2.2.3. Odmrznuvawe na K562 kleto~nata
linija (Slika 5.14)
Za da se dobijat vijabilni celni kletki neophodno e
odmrznuvaweto na K562 kleto~nata linija da bide brzo.
1. Plasti~nata epruveta od 50 mL se polni so 50 mL
prethodno zagrean na 370C kompleten medium.
2. Se odmrznuva edno {i{ence celni kletki. Odmrznuvaweto treba da bide vo vodena bawa, za vreme od 2060 sekundi, so kontinuirano me{awe.
3. Otkoga }e se rastopi, {i{enceto se otstranuva od
vodenata bawa. Negovata sodr`ina se prefrla vo
epruveta koja sodr`i 50 mL kompleten medium.
Epruvetata vnimatelno se me{a.
Slika 5.14: Odmrznuvawe K562
celni kletki za koristewe vo
testot za KPU.
4. Kleto~nata suspenzija se centrifugira 5 minuti na
120 g. Supernatantot se frla.
Kleto~niot talogot se resuspendira vo 1 mL kompleten
medium. Se brojat kletkite i se doteruvaat do koncentracija od 1h105/mL kompleten medium.
5.2.2.4. Priprema na primerokot za merewe
(Slika 5.15)
Efektornite kletki (E) se me{aat so K562 celnite kletki
(C) vo opredeleni soodnosi po~nuvaj}i od 50:1 pa se do
12.5:1 (Tabela 5.1). Sme{ata od efektornite i celnite
kletki (vo kraen volumen od 200 mkL) se inkubira.
Tabela 5.1: [ema za priprema na kontrolnite i ispituvanite primeroci.
1. Se pipetira sme{ata od efektorni/celni kletki vo
epruveti (12h75 mm) spored {emata dadena vo Tabela
5.1. Vo edna epruveta se dodavaat samo celni kletki
(kontrolen primerok). Ovaa epruveta }e ni slu`i kako
kontrola za da vidime kolku od celnite kletki }e
liziraat sami od sebe za vremeto za koe se izveduva
testot (na pr. poradi starosta na kletkite, nivnata
vijabilnost, dejstvoto na nekoi komponenti od mediumot
i dr.)
2. Vo nekoi od primerocite se dodava po 30 mkL
interleukin-2 (200 E/mL). Ovie primeroci ni slu`at
kako ”visoki kontroli”. Interleukinot-2 sekoga{ treba
da se dodade vo suspenzijata od efektorni kletki pred
da se dodadat celnite kletki.
3. Site epruveti se centrifugiraat 2-3 minuti na 120 g.
4. Potoa site epruveti se inkubiraat vo inkubator, vo
atmosfera so 5% CO2 vo vremetraewe od 120 ili 240
minuti. Po inkubacijata epruvetite se prefrlaat na
mraz i taka se ~uvaat se dodeka ne se po~ne so mereweto.
5. Vo sekoja od epruvetite se dodava 50 mkL boja za boewe
na DNK. Epruvetite se me{aat i se inkubiraat 5 minuti
na 00C (vo kupatilo so mraz, za{titeni od svetlina).
Kleto~nata suspenzija se meri vo rok od 30 minuti po
dodavaweto na bojata za obojuvawe na DNK molekulata.
Institut za imunobiologija i humana genetika
Slika 5.15: Izveduvawe na
funkcionalniot test za
KPU.
59
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
A
B
Slika 5.16: Tipi~en FL histogram na funkcionalniot test
za KPU.
V
5.2.2.5. Merewe i analiza na podatocite
dobieni so proto~niot citometar
Kletkite se analiziraat so proto~en citometar koj koristi
plavo-zeleno ekscitira~ko svetlo (480 nm argon-jonski
laser).
Merewe. Vo tekot na pribiraweto na podatocite “Live”
kapijata se pozicionira vo FL1 histogramot na zelenite
fluorescentni celni kletki, za da mo`e da se napravi
razlika pome|u efektornite i celnite kletki. Za ovaa cel
se upotrebuva kontrolnata epruveta koja sodr`i samo celni
kletki. Bidej}i FL1 intenzitetot na fluorescencijata od
mrtvite kletki opa|a za odreden stepen, dolnata granica
na kanalot treba da se postavi onaka kako {to e prika`ano
na Slika 5.16A. Od sekoja epruveta treba da se izmerat
najmalku 2500 celni kletki.
Analiza na podatocite. Se analizira procentot na mrtvi
celni kletki (= FL2 ili FL3 pozitivni). Crvenata
fluorescencija koja poteknuva od obojuvaweto na DNK
molekulite mo`e da se otkrie so pomo{ na FL2 ili FL3
kanalot. Za ovaa cel kapijata za analiza se postavuva vo
FL3/FL1 delot okolu site `ivi i mrtvi celni kletki
(Slika 5.16B).
Tabela 5.2: [ema za vnesuvawe rezultati od izbroeni
kletki so proto~en citometar.
Procentot na specifi~nata citotoksi~nost se presmetuva
preku odzemawe procentot na mrtvi kletki izmereni vo
inkubiranata epruveta koja sodr`i samo celni kletki
(kontrolniot primerok, Slika 5.16A) od procentot na
ubieni celni kletki izmeren vo epruvetite so primerokot
od pacientot (Slika 5.16B, V).
5.3. Zada~a
Izmeri go brojot na KD3+, KD4+, KD8+ i KPU so pomo{ na
proto~en citometar i vrednostite vnesi gi vo Tabelata
5.2.
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
60
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 6: TOLKUVAWE REZULTATI OD KLETO^EN IMUNITET
[email protected] 6: TOLKUVAWE
REZULTATI OD KLETO^EN
IMUNITET
6.1. Normalni vrednosti na beli
kletki
Normalnite vrednosti na belite kletki (neutrofilite,
eozinofilite, bazofilite i monocitite), vkupnite
limfociti, T-limfocitite (KD4+ i KD8+), B-limfocitite i trombocitite se dadeni na Tabela 6.1.
Za pogolemiot broj beli kletki nivniot broj varira spored
vozrasta, a se iska`uvaat kako apsoluten broj kletki vo
eden litar krv, ili kako procent od site beli kletki.
Metodite za opredeluvawe brojot na belite kletki se
razli~ni, po~nuvaj}i od najednostavnite so hemocitometar
i komora, preku avtomatiziranite broja~i do metodite so
proto~na citometrija.
Tabela 6.1. Normalen broj na
beli kletki i trombociti
vo periferna krv od lu|e.
Institut za imunobiologija i humana genetika
61
Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A, Efinska-Mladenovska O. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
6.2. Imunofenotipizirawe
6.2.1. Voved
Pod imunofenotipizirawe na biolo{kite primeroci se
podrazbira upotreba na imunolo{ki materii (na pr.
monoklonski i/ili poliklonski protivtela) za specifi~no otkrivawe na protivgenite. Ovie protivgeni, koi
naj~esto poteknuvaat od proteinite, se prika`ani vrz
kletkite ili vrz drugi ~esti~ki (na pr. apoptoti~nite
telca) i se lokalizirani ili na nivnata povr{ina ili vo
nivnata vnatr{nost. Vo sporedba so porano upotrebuvanite
metodi, proto~nata citometrija e poednostavna za
izveduvawe, poosetliva e i ni ovozmo`uva istovremeno
kvantitativno odreduvawe na pove}e protivgeni vo golem
broj kletki. Nejziniot glaven nedostatok e {to ima potreba
od ednoredna kleto~na suspenzija. Isto taka, informaciite
koi gi dobivame za morfologijata i lokalizacijata na
molekulite vnatre vo kletkata se ograni~eni. Poradi ova
proto~nata citometrija pogolema primena nao|a vo
ispituvaweto na hematopoetskite kletki odkolku na
kletkite koi poteknuvaat od organite ili od tkivata.
Tabela 6.2: Klini~ka primena na imunofenotipiziraweto so proto~na citometrija.
Deneska imunofenotipiziraweto so proto~nata citometrija nao|a {iroka primena. So boeweto na kletkite so
pomo{ na protivtela mo`at da se identificiraat, da se
izbrojat i da se karakteriziraat bilo koi kletki ili
subkleto~ni elementi. Vo poslednite godini proto~nata
citometrija naj~esta primena na{la vo hematologijata i
imunologijata (Tabela 6.2).
Dijagnosti~koto zna~ewe na definiraweto na kletkite od
krvta so koristewe na protivtela proizleguva od to~nosta,
objektivnosta i visokata reproducibilnost na tehnikata.
62
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 6: TOLKUVAWE REZULTATI OD KLETO^EN IMUNITET
Imunofenotipizacijata e od kriti~no zna~ewe za
inicijalna dijagnoza i klasifikacija na akutni leukemii,
hroni~ni limfoproliferativni bolesti ili maligni
limfomi, imaj}i predvid deka terapevtskiot pristap kaj
ovie bolesti vo mnogu zavisi od protivgenskite parametri.
Ponatamu, imunofenotipizacijata ovozmo`uva prognosti~ki informacii koi ne se dostapni so drugi tehniki,
sledewe progresijata na bolesta kaj bolni posle
hemoterapija ili transplantacija na koskena srcevina i
Tabela 6.3: Definirawe na
krvnite kletki so pomo{ na
monoklonski protivtela.
~esto ovozmo`uva otkrivawe minimalna rezidualna
bolest. Proto~no citometriskite analizi za apoptoza,
otpornost kon lekovi, citokinski receptori i drugi
parametri bi mo`ele da obezbedat dopolnitelni
dijagnosti~ki ili prognosti~ki informacii vo bliska
idnina (Tabela 6.3).
6.2.2. Dijagnoza na hematolo{ki
maligniteti
ANALIZA NA SLU^AJ
Leukemiite pretstavuvaat abnormalna proliferacija na
hematopoetski kletki zarobeni vo odredena faza na
kleto~nata diferencijacija. Klasificirani se vo akutni
ili hroni~ni formi vo zavisnost od klini~kite i
laboratoriskite analizi. Vrz osnova na morfolo{kite i
imunofenotipskite karakteristiki na aberantnite
kletki, leukemiite ponatamu se delat na pove}e podtipovi.
Imunofenotipiziraweto na malignite hematolo{ki
zaboluvawe e edna od naj~estite klini~ki primeni na
proto~nata citometrija. Negovata primena e fokusirana
na karakteriziraweto na malignite kletki i klasifikacija na zaboluvaweto, otkoga prethodno }e bide postavena
dijagnozata za postoewe na leukemija/limfoma. Vo tekot
na ovoj period imunofenotipiziraweto e od golema pomo{
vo:
Institut za imunobiologija i humana genetika
T-kleto~en limfom:
Slu~ajot na Donka
Momirovska, posledica od
nezadr`liv rast na citokin
sozdava~ki klon od Tlimfociti.
63
Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A, Efinska-Mladenovska O. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
1) razlikuvaweto pome|u limfoidna i mieloidna
leukemija, osobeno ako postoi somnitelen/nejasen
morfolo{ki i citohemiski naod;
2)subklasifikaciite na akutnite limfoblastni
leukemii;
3) dijagnoza na subtipovite na minimalno diferenciranite eritroidni i megakariocitni akutni mieloblastni leukemii; i
4) prepoznavawe na T i B kleto~nite hroni~ni
limfoproliferativni rastrojstva.
Imunofenotipiziraweto na malignite hematolo{ki
zaboluvawa so pomo{ na pove}eparametriskata proto~na
citometrija e visoko senzitiven i specifi~en metod za
identifikacija na malignite kletki, duri i koga tie se
prisutni vo mnogu mal broj pome|u mno{tvoto na normalni
Tabela 6.4: Frekfencija na
aberantnite fenotipovi kaj
malignite hematolo{ki
zaboluvawa otkrieni so
proto~na citometrija.
NA: ne se analizirani na golem
primerok.
hematopoetski kletki. Ova e poradi toa {to kaj malignite
hematopoetski kletki ima prika`uvawe na aberantni
fenotipovi. So leukemija/limfoma asociranite fenotipovi (na primer, vkrstenoto prika`uvawe na liniskite
protivgeni, asinhronoto prika`uvawe na protivgenite,
Tabela 6.5: Imunofenotipski karakteristiki na Bkleto~ni limfoproliferativni bolesti.
Legenda:
sIg – membranski imunoglobulin; CLL – hroni~na limphocitna leukemija; MCL – mantle cell
limfom; FL – folikularen limfom; MZL – limfom od marginalna zona; HCL – hairy cell
leukemija; PL – prolimfocitna leukemija; LPL – limfoplazmocitna leukemija.
prekumernoto prika`uvawe na protivgenite, tkivnoograni~enite fenotipovi, abnormalniot na~in na sozrevawe) mnogu lesno se otkrivaat so proto~nata citometrija
(Tabela 6.4).
Tabela 6.6: Imunofenotipski karakteristiki na Tkleto~ni limfoproliferativni bolesti.
Legenda: MF- Mycosis fungoides; SS Sezary sindrom; ATLLT kleto~na leukemija/limfom kaj ozrasni; ALCLAnaplasti~en golemokleto~en limfom; ETL- Tkleto~en limfom od tip enteropatija.
64
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 6: TOLKUVAWE REZULTATI OD KLETO^EN IMUNITET
Postoi golem broj na razli~ni protivtela koi se koristat
za analiza na kleto~nite protivgeni kaj hematolo{kite
maligniteti. Za potvrduvawe na B ili T-klonalnosta na
maligniot klon, se koristat t.n. pan-B panel koj vklu~uva
protivtela kon KD19, KD20 i KD22 (Tabela 6.5) ili panT panel koj se sostoi od protiv-KD2, -KD3, KD4 i/ili KD7
protivtela (Tabela 6.6), dodeka dopolnitelni paneli ili
edine~ni protivtela se koristat za definitivno tipizirawe na specifi~nata limfoproliferativna bolest.
6.2.3. Ostanati klonalni/genetski
hematolo{ki i imunolo{ki zaboluvawa
Denes imunofenotipiziraweto e edna od primarnite
dijagnosti~ki metodi za dijagnosticirawe na paroksizmalnata no}na hemoglobinurija, sistemskata mastocitoza,
primarnite trombocitopatii i imunite nedostatoci. Kaj
site ovie zaboluvawa genskite abnormalnosti koi se
prisutni vo klonskite hematopoetski klatki se preveduvaat kako promeni vo fenotipot i vo distribucijata na
nivnite specifi~ni populacii. Vakvite fenotipski
promeni, koi se visoko asocirani so soodvetnite genski
abnormalnosti, mo`at mnogu lesno da se identifikuvaat
so imunofenotipizirawe so proto~en citometar.
ANALIZA NA SLU^AJ
Iks vrzan te`ok kombiniran
imunonedostatok:
Slu~ajot na Martin
Delivanov, bez T-Li `ivotot
ne mo`e da se odr`i.
I pokraj faktot deka so imunofenotipiziraweto ne
mo`eme da postavime krajna dijagnoza kaj najgolem broj
prvi~nite nedostatoci vo imunolo{kiot sistem, toa ima
golemo zna~ewe kako metoda za skrining. Bidej}i ve}e
izvesno vreme se znae deka postoi asocijacija pome|u
distribucijata na razli~nite populacii limfociti od
perifernata krv, nivnite imunofenotipovi i promenite
vo genite, se pove}e se upotrebuva imunotipiziraweto so
proto~nata citometrija za to~na genska lokalizacija na
defektot kaj prvi~nite imuni nedostatoci. Na primer, za
identifikacija na defektot kaj Iks-vrzaniot sindrom,
koj se karakterizira so zgolemena produkcija na IgM, se
pove}e se upotrebuva imunofenotipiziraweto so proto~en
citometar za ispituvawe na sposobnosta na in vitro
aktiviranite T limfociti da prika`uvaat KD154.
6.2.4. Transplantacija
Imunofenotipiziraweto so proto~en citometar vo
posledno vreme se pove}e se upotrebuva i vo transplantacijata, kako na hematopoetski kletki taka i na solidni
organi. Taa se pove}e se upotrebuva za broeweto na KD34+
hematopoetskite progenitori, so cel da se kontrolira
kvalitetot na biolo{kite produkti koi se dobivaat posle
transplantacijata na koskenata srcevina. Taka, denes se
znae deka odreduvawe vkupniot broj na KD34+/KD45dim
hematopoetskite progenitori vo transplantantot e
najsigurniot pokazatel za pre`ivuvawe na kalemot.
Najnovite studii poka`aa deka vrz pre`ivuvaweto na
kalemot mo`e da vlijae i prisustvoto na drugi tipovi
kletki, razli~ni od KD34+ progenitorite. Spored toa, se
Institut za imunobiologija i humana genetika
65
Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A, Efinska-Mladenovska O. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
poka`alo deka frekfencijata na te{kite infekcii kaj
pacientite koi bile podlo`eni na avtologne transplantacija e direktno povrzana so brojot na KD4+ T limfociti
prisutni vo kalemot.
U{te edna primena na imunofenotipiziraweto so
proto~en citometar vo transpalantacijata e takanare~enata vkrstena reakcija. So vakvata reakcija se odreduva
prisustvoto na protiv-HLA protivtela vo serumot na
potencijalniot daritel, se odreduva nivniot titar i
nivnata specifi~nost.
6.2.5. Dijagnoza i sledewe na
infektivnite zaboluvawa i imuni
nedostatoci
Mo`ebi naj~estata primena na imunofenotipiziraweto
so proto~en citometar vo dijagnoza i sledewe na
infektivnite zaboluvawa e negovata upotreba za sledewe
absolutniot i relativniot broj na KD4+ T limfocitite
kaj zabolenite od SIDA. Kaj ovie pacienti identifikacijata na KD4+ T limfocitite se bazira vrz boeweto na
primerocite od perifernata krv so protiv-KD45
monoklonski protivtela vo kombinacija so protiv KD45 i/
ili protiv-KD3 monoklonski protivtela. Pokraj gubeweto
na KD4+ T limfocitite, kaj bolnite so SIDA, ima
zgolemuvawe i na protiv-virusniot imun odgovor,
pretstaveno preku zgolemenoto sozdavawe na citokini i
ostanati rastvorlivi proteini. Seto toa odi zaedno so
modulacija na ostanatite proteini asocirani so T
kleto~nata membrana, kako na primer KD38. Imeno, se
poka`alo deka srednata vrednost na KD38 molekulite, koi
se prika`ani vrz membranata na KD8+ T limofocitite, se
zgolemuva kaj HIV pozitivni pacienti. Deneska mnogu
dobro se znae deka zgolemuvaweto na prika`uvaweto na
KD38 vrz KD8+ limfocitite ne samo {to e nezavisen
prognosti~ki pokazatel za predviduvawe na progresijata
na bolesta vo SIDA i smrten ishod, tuku slu`i i za
sledewe efektot od terapijata kaj HIV-1 pozitivnite
pacienti koi primaat visoko aktivna protiv-retroviralna
terapija.
Za `al imunofenotipiziraweto so proto~en citometar
seu{te ne nao|a pogolema primena vo dijagnosticiraweto
i sledeweto na ostanatite infektivni zaboluvawa. Sepak
postojat napori za negovata primena vo ispituvaweto na
virusno- i peptidno-specifi~niot T kleto~en odgovor kaj
imunodeficientni pacienti kaj koi postoi somnevawe
deka se inficirani so citomegalovirus, Ep{tajn-Barov
virus ili so Mycobacterium tuberculosis. Vo ovie slu~ai se
vr{i procenka na citokinskiot odgovor i identifikacija
na protivgen-specifi~nite T limfociti so upotrebata na
HLA-multimeri povrzani so specifi~ni virusni peptidi.
66
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 6: TOLKUVAWE REZULTATI OD KLETO^EN IMUNITET
6.3. Tolkuvawe rezultati od
funkcionalni testovi vo
kleto~en imunitet
6.3.1. Funkcionalen test za kletki
prirodni ubijci
Ovoj test slu`i za ispituvawe citotoksi~nata aktivnost
na kletkite prirodni ubici (KPU). Vo nego kako celni
kletki se koristat zamrznati (krioprezervirani) kletki
od kleto~nata linija K562. Za da mo`eme da gi razlikuvame
ovie kletki od efetornite, nivnata membrana se obele`uva
so edna zelena lipofilna fluorescentna boja. Posle
inkubacioniot period, ubienite celni kletki gi
prepoznavame blagodarenie na obojuvaweto na DNK
mlekulata vo nivnite jadra, bidej}i bojata za boewe na
DNK molekulata mo`e da prodre vo ubienata kletka. Na
ovoj na~in mo`e da se odredi procentot na ubieni
celnikletki od strana na KPU. Na ovoj na~in se ispituvaat
promenite vo aktivnosta na KPU koi mo`at da nastanat
kaj razli~ni zaboluvawa ili pod dejstvo na nekoi lekovi.
Kletkite prirodni ubici na po~etokot bile definirani
kako “nulta” limfociti, koi svoeto citotoksi~no dejstvo
go ostvaruvale vrz nekoi tumorski ili virusno zarazeni
kletki, bez da ima potreba od prisustvo na klasa 1 i klasa
2 molekulite od glavniot tkivno sovpadliv kompleks
(GTSK) vrz celnite kletki. Okolu 70-95% od kletkite koi
projavuvaat aktivnost karakteristi~na za KPU morfolo{ki imaat izgled na golemi granulirani limfociti.
KPU na svojata povr{ina imaat IgG Fc 3 receptor (KD16
protivgen) i KD56 NCAM protivgen. Poradi ova
imunofenotipski se definiraat kako KD3- i KD16+ i/ili
KD56+. Mora da se spomene deka i mal del od T limfocitite
(KD3+KD56+) mo`at da projavat aktivnost karakteristi~na
za KPU.
Namaluvawe aktivnosta na KPU e edno od mnogute
imunolo{ki naru{uvawa koe mo`e da se sretne kaj
zabolenite od SIDA. Naru{uvaweto aktivnosta na KPU
mo`’ da se sretne i kaj bolnite od multipla skleroza,
bolnite so sistemski lupus eritematozus, kako i kaj bolnite
so sindromot na Sjogren. Namaluvawe aktivnosta na KPU
se sretnuva i kaj bolnite od sindromot na hroni~en zamor,
kako i kaj pacientite so Tip 1 {e}ernata bolest.
Depresija vo aktivnosta na KPU mo`e da se sretne i kaj
pacientite vo naprednat stadium na maligno zaboluvawe,
pri postoewe metastazi i kaj pacienti so akutna/hroni~na
leukemija. Odreduvawe aktivnosta na KPU ima prognosti~ko zna~ewe vo mo`nosta za razvoj na metastazi kaj
bolni so primarni tumori. KPU igraat centralna uloga i
vo odbranata od virusi. Zolemuvawe na nivnata aktivnost
mo`e da se javi pri nekoi akutni virusni infekcii.
Zabele`ano e deka razli~ni imunomodulatori (na pr. ILInstitut za imunobiologija i humana genetika
67
Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T, Strezova A, Efinska-Mladenovska O. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
2, interferoni) mo`at da ja zasilat aktivnosta na KPU in
vitro i in vivo.
6.3.1.1. O~ekuvani rezultati
Vrednostite na normalnata citotoksi~nata aktivnost na
KPU so pomo{ na analizi na ednojadrenite kletki od
Tabela 6.7: Normalni vrednost za aktivnosta na KPU
posle inkubacija od 2 ~asa.
perifernata krv kaj zdravi lica. Rezultatite se prika`ani
vo Tabela 6.7 (po inkubacija od 2 ~asa) i Tabela 6.8 (po
inkubacija od 4 ~asa).
Tabela 6.8: Normalni vrednosti za aktivnosta na KPU
posle inkubacija od 4 ~asa.
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
68
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 7: [email protected] PROTIVTELA-IMUNOPRECIPITACIJA
BLOK 3
BLOK 3 - IMUNOGLOBULINI
U^EBNI CELI:
[email protected] 7. [email protected] PROTIVTELA - IMUNOPRECIPITACIJA (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat:
“ da ot~itaat rezultat od RID plo~ka;
“ da presmetaat koncentracija na imunoglobulin.
[email protected] 8. PROTIVTELEN ODGOVOR (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat:
“ da izbrojat i presmetaat imunoglobulin M
sekretira~ki splenociti;
“ opredelat imunoglobulinski klasi so imunonefelometar.
[email protected] 9. ANALIZA NA KLETO^EN IMUNITET (1
~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da:
“ tolkuvaat rezultati od kleto~en imunitet;
“ analiziraat slu~ai od kleto~en imunitet.
POENI:
PRISUSTVO
1.5 poeni
ZNAEWE
3.0 poeni
VKUPNO: 4.5 poeni
Institut za imunobiologija i humana genetika
69
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
70
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 7: [email protected] PROTIVTELA-IMUNOPRECIPITACIJA
[email protected] 7: [email protected]
PROTIVTELA IMUNOPRECIPITACIJA
Imunolo{kata precipitira~ka reakcija e otkriena od
Kraus vo 1897 god., a potoa postavena kako imunohemiski
metod od Heidelberger i Kendall vo 1929 god. Pomasovno se
upotrebuva vo dijagnostikata po negovoto postavuvawe
kako metod vo gel sredina (Oudin 1946, Mancini 1960, Laurell
1966). Denes imunoprecipitira~kite metodi mnogu se
perfekcionirani i za opredeluvawe na precipitira~kite
protivtela se koristat turbidometrija i nefelometrija.
Za postignuvawe na imunoprecipitacijata pokraj soodvetniot kvantitativen soodnos me|u protivgenot i protivtelata, potrebno e ispolnuvawe na opredeleni fizikohemiski uslovi {to se: rN, TºC, jonski sili, solenost na
sredinata i dr. Imunoprecipitacijata mo`e da se izveduva vo te~na i vo gel sredina.
Sposobnosta na protivtelata da gi istalo`at (precipitiraat) protivgenite od rastvor e edna od nivnite najpoznati
karakteristiki. Vo ovoj proces se sozdava kompleks od vkrstena molekula protivgen-protivtelo koja e pregolema za
da ostane rastvorliva vo rastvorot. Treba da se spomene
deka talo`ewe ne nastanuva sekoga{ koga protivteloto }e
dojde vo dopir so protivgenot. Koncentracijata na
protivgenot i na protivteloto koga nastanuva imunolo{ko
talo`ewe e vo opredeleni granici i se nare~uva "zona na
ekvivalencija". Nadvor od ovoj soodnos, bilo koj od protivgenot ili protivteloto da e vo vi{ok, se formira samo
mal del (rastvorliv) od nivniot zaedni~ki kompleks. Vo
izvesni slu~ai (kaj monovalentni protivgeni i monoklonalni protivtela) nikoga{ ne doa|a do imunoprecipitacija.
protivgen
protivtelo
7.1. Precipitacija vo te~na
sredina
Precipitacijata vo te~na sredina (precipitacija vo krugprsten, "ring test") lesno e aplikabilna kaj solubilni protivgeni i precipitira~ki protivtela (slika 7.1).
Institut za imunobiologija i humana genetika
Slika 7.1: Reakcija na protivgen i protivtelo vo te~na sredina (Oudin-ova reakcija)
71
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Vo mikroepruvetka (visina do 1 cm) na dnoto se postavuva
serum i vnimatelno vrz nego se dodava ednakva koli~ina
protivgen (na pr. 2 kapki + 2 kapki). Se postavuva i kontrolen test. Za celo vreme na ispituvaweto, epruvetkite
se postaveni vertikalno. Po opredelena inkubacija, so
pomo{ na strani~no svetlo na temna zadnina, se ~ita reakcijata. Reakcijata e pozitivna ako se pojavi precipitira~ki prsten vo interfazata (na dopirnoto mesto me|u
serumot i protivgenot) za vreme od 5 min. Vo kontrolnata
epruvetka ne se pojavuva takov prsten.
7.2. Dvojna imunodifuzija na agar
Slika 7.2: Dvata naj~esto
koristeni oblici za ispituvawe dvojna imunodifuzija.
Ova e edna od najednostavnite i dosta informativni
tehnikia vo imunologijata na protivtelata. Se prigotvuva
puferiran agarozen gel, a protivgenot i protivteloto se
vnesuvaat vo oddelni bunar~iwa od agarot, oddale~eni 0.5
do 2 sm edno od drugo. Po inkubacija od 12-48 ~asovi se
sozdava imunoprecipitira~ka linija me|u protivgenot i
soodvetnoto protivtelo. Prednosta na ovaa tehnika e {to
avtomatski se sozdava koncentraciski gradient na protivgenot i protivteloto vo tekot na difuzijata. Imunoprecipitaciskata linija }e nastane nekade me|u dvete
bunar~iwa zavisno od mestoto kade }e se postigne ekvivalentna koncentracija me|u protivgenot i protivteloto.
Za izveduvawe na metodov potrebni se slednive materijali
i oprema: kvadriperm plasti~ni plo~i, agar, sad so voda
(zaradi ramnewe na povr{inata), solen fosfaten pufer
koj sodr`i 0.02% natrium azid(SFP-azid), vakuum pumpa,
ostra igla so ramen vrv, serumski albumin 1 mg/mL vo SFPazid, protiv-human serum ili protiv-human serum albumin, kontrolen pre-imun serum, vodena bawa, inkubator za
kletki.
Izveduvawe:
1. Se prigotvuva 1% agar so zagrevawe na 1 g agar vo 100 mL
SFP-azid vo vodena bawa se dodeka kompletno da se
ratsvori (proyiren rastvor).
2. Se ladi agarot na 45ºC vo vodena bawa, se stavaat kvadriperm plo~ite da plivaat vo vodenata bawa i vo sekoja
pregrada se vnesuvaat po 5 mL od agarot (da se koristi
pipeta od 10 mL so {irok vrv). Po izramnuvawe na agarskata povr{ina, plo~ite se prefrlaat vo kadi~ka so ladna
voda i tamu se ~uvaat do zacvrstuvawe na agarozniot gel.
Plo~ite se bri{at i se stavaat vo ladilnik polovina ~as
za da se stvrdne gelot.
3. Plo~ata se stava vrz crte` (Slika 7.2) i so iglata priklu~ena na vakuum se prigotvuvaat bunar~iwa. Vo sekoja
pregrada se pravat po tri grupi bunar~iwa.
4. Se prigotvuvaat razreduvawa na protivserumot, kontrolniot serum i protivgenot vo SFP-azid. Najdobri razredu-
72
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 7: [email protected] PROTIVTELA-IMUNOPRECIPITACIJA
vawa za pove}eto sistemi se 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 i 1:32.
5. Vo gorniot sistem bunar~iwa, se pipetiraat 10 mikrolitri (mkL) nerazreden protivserum vo centralnoto
bunar~e, a vo okolnite bunar~iwa se vnesuvaat po 10 mkL
od razreduvawata na ~ove~ki albumin.
6. Vo sredniot sistem bunar~iwa se pipetiraat 10 mkL
nerazreden ~ove~ki albumin vo centralnoto bunar~e, a vo
okolnite bunar~iwa po 10 mkL od razredeniot protivserum. Plo~ite se inkubiraat preku no} vo inkubator za
kletki na 37oC.
7. Vo dolniot sistem bunar~iwa se pipetiraat 10 mkL od
pre-imun serum (serum zemen od istoto `ivotno ili ~ovek
pred imunizacija), a vo okolnite bunar~iwa se vnesuvaat
po 10 mkL od razredeniot protivserum. Ovie bunar~iwa
slu`at za kontrola na protivserumot.
Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite:
Se analiziraat imunoprecipitira~kite linii vo sekoj od
sistemot bunar~iwa. Ako e potrebno plo~ite se bojat i se
odbojuvaat. Prisustvoto na imunoprecipitira~ka linija
poka`uva deka serumot sodr`i protivtela specifi~ni za
protivgenot. Dokolku se dobijat pove}e linii toa uka`uva na heterogenost na protivgenot i na protivtelata.
Oddale~enosta na precipitira~kata linija od bunar~eto
zavisi od koncentracijata na reagensite i nivnata
molekularna masa (koi vlijaat na brzinata na difuzija).
Otsustvoto na precipitira~ka linija uka`uva deka:
-nema protivtela specifi~ni kon protivgenot;
-ima protivtela, no ne se sposobni da go precipitiraat protivegnot;
-ima prisutni protivtela, no koncentracijata na
protivgenot i/ili protiv serumot ne se soodvetni,
ne se postignuva ekvivalencija.
Ovie varijanti mo`at da se ispitaat so probuvawe drugi
koncentracii reagensi ili so upotreba na drugi tehniki
koi otkrivaat neprecipitira~ki protivtela. Ovaa tehnika
ovozmo`uva prika`uvawe na protivgenata identi~nost ili
neidenti~nost. Ovie poimi uka`uvaat na sposobnosta na
protivtelata da go prepoznae protivgenot kako identi~en
ili razli~en, so zna~ewe deka protivgenite se strukturno
ednakvi ili razli~ni. Stepenot na identi~nost analiziran
so dvojnata difuzija gi ima slednive karakteristiki
(Slika 7.3):
a) ednakva kontinuirana precipitira~ka linija me|u
dvete protivtela (Pt1 i Pt2) so protivgenot uka`uva
na imunohemiska identi~nost me|u dvete protivtela
Pg1
Pg1
Pt1
A
Pg1
Pg2
Pg1
Pg2
Pt1
Pt2
Pt1
Pt2
B
V
Institut za imunobiologija i humana genetika
Slika 7.3: Interpretacija na
protivgenata identi~nost so
dvojna radijalna imunodifuzija.
a) identi~nost;
b) neidenti~nost;
v) parcijalna identi~nost;
73
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
A
B
V
G
D
(Pt1 i Pt2).
b) dvojno vkrstuvawe na imunoprecipitira~kite linii
me|u protivtelata (Pt1 i Pt2) uka`uva na celosna
neednakvost.
v) delumnoto vkrstuvawe na imunoprecipitira~ki linii
uka`uva na parcijalna identi~nost, vo slu~ajov protivgenot 2 (Pg2) ima nekoi determinanti koi ne gi
deli so protivgenot 1 (Pg1), no site determinanti od
Pg1 gi ima i vo Pg2 (Slika 7.3).
Vnesuvaweto 3% polietilen glikol 6.000 vo gelot ja zgolemuva precipitacijata na golemite molekularni kompleksi i mo`e da ja zgolemi senzitivnosta. Ova osobeno se
koristi pri analizirawe monoklonski protivtela.
7.3. Edine~na (radijalna)
imunodifuzija na agar
Vo ovaa tehnika se prigotvuva agarozen gel so fiksna
koncentracija protivtela. Protivgenot difundira vo
gelot i se soedinuva so protivteloto koga }e se postigne
ekvivalencija. Vo taa to~ka se sozdava imunoprecipitira~ko zamatuvawe okolu bunar~eto, a Mancini poka`a deka
dijametarot na ova zamatuvawe pri ekvivalencijata e vo
soodnos so koncentracijata na protivgenot. Kvantitativniot aspekt na ovaa tehnika e nejzinata najgolema
prednost.
Materijal i oprema: kvadriperm plasti~ni plo~i, agar,
sad so voda (zaradi ramnewe na povr{inata), solen fosfaten pufer koj sodr`i 0.02% natrium azid(SFP-azid),
vakuum pumpa, ostra igla so ramen vrv, serumski albumin
1 mg/mL vo SFP-azid, protiv-human serum ili protiv-human serum albumin, kontrolen pre-imun serum, vodena bawa,
inkubator za kletki, linear (postojat i gotovi plo~i za
radijalna imunodifuzija na IgG, IgA i IgM).
Izveduvawe so komercijalni plo~i:
1. Plo~ite se otvoraat i se bri{e kapakot za da se otstrani kondenziranata voda.
2. Serumot se razreduva: za IgG 1:10 (0.1 mL serum + 0.9 mL
fiziolo{ki rastvor); za IgA 1:2 (0.1 mL serum + 0.1 mL
fiziolo{ki rastvor); IgM se ispituva ne e razreden.
Slika 7.4: Edine~na imunodifuzija na agar. A) nanesuvawe
serum so mikropipeta; B)
{emtaski prikaz na vnesuvawe
serum; V) difuzija na serumot
niz agarot; G) imunoprecipitacija vo agarot; D) serisko
razbla`uvawe na serumot 2, 4 i
8 pati.
74
3. Prvoto bunar~e se polni so 5 mkL (mikrolitri) standard od IgG, IgA ili IgM, 5 mkL od serumot se vnesuva vo
edno od drugite bunar~iwa (spored porano napravenite
razreduvawa). Plo~ata vnimatelno se zatvora i se ostava
na sobna temperatura ili vo inkubator na 37oC.
Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite:
Se meri dijametarot na istalo`eniot prsten okolu sekoe
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 7: [email protected] PROTIVTELA-IMUNOPRECIPITACIJA
R
g/L
ImunoglobulinG(IgG)
4.0
0.154
4.1
0.171
4.2
0.188
4.3
0.206
4.4
0.225
4.5
0.244
4.6
0.263
4.7
0.282
4.8
0.302
4.9
0.323
5.0
0.344
5.1
0.365
5.2
0.386
5.3
0.409
5.4
0.431
5.5
0.454
5.6
0.478
5.7
0.501
5.8
0.526
5.9
0.550
R
g/L
R
g/L
6.0
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5
6.6
6.7
6.8
6.9
7.0
7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
0.575
0.601
0.626
0.653
0.680
0.707
0.734
0.762
0.791
0.820
0.849
0.879
0.909
0.939
0.970
1.002
1.034
1.066
1.098
1.131
8.0
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
8.6
8.7
8.8
8.9
9.0
9.1
9.2
9.3
9.4
9.5
9.6
9.7
9.8
9.9
1.165
1.199
1.233
1.268
1.303
1.339
1.375
1.411
1.448
1.485
1.523
1.561
1.600
1.639
1.678
1.718
1.758
1.779
1.840
1.881
Tabela 7.1: Ot~ituvawe koncentracijata na imunoglobulin G (IgG) od gotovi plo~i
bunar~e so linear, so lupa ili so RID-metar. Se postavuva
dijametarot na prstenot nasproti log10 od koncentracijata
na protivgenot za da se dobie standardna prava. Nepoznatiot primerok se ot~ituva od ovaa prava. Vo komercijalno
napravenite imunodifuziski plo~i se dadeni tabeli za
ot~ituvawe za sekoj imunoglobulin. Ovde se dadeni
tabelite za ot~ituvawe na site imunoglobulini so komercijalnite kompleti (Tabeli 7.1 do 7.3).
Neophodno e da nastane kompletno izedna~uvawe. Za toa
se potrebni najmalku 24 ~asovi na sobna temperatura (ili
6 ~asovi na 37oC), no se prepora~uvaat 48 ~asovi (12 ~asovi
vo inkubator na 37oC), ili 3 do 5 dena. Dokolku serumot
sodr`i zna~ajni koli~estva IgM neophodna e inkubacija
R
g/L
R
Imunoglobulin A (IgA)
4.0 0.134
6.0
4.1 0.157
6.1
4.2 0.181
6.2
4.3 0.205
6.3
4.4 0.230
6.4
4.5 0.255
6.5
4.6 0.281
6.6
4.7 0.307
6.7
4.8 0.334
6.8
4.9 0.361
6.9
5.0 0.389
7.0
5.1 0.418
7.1
5.2 0.447
7.2
5.3 0.477
7.3
5.4 0.507
7.4
5.5 0.538
7.5
5.6 0.569
7.6
5.7 0.601
7.7
5.8 0.634
7.8
5.9 0.667
7.9
g/L
R
g/L
0.701
0.735
0.770
0.805
0.841
0.878
0.915
0.952
0.991
1.029
1.069
1.109
1.149
1.190
1.232
1.274
1.317
1.360
1.404
1.448
8.0
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
8.6
8.7
8.8
8.9
9.0
9.1
9.2
9.3
9.4
9.5
9.6
9.7
9.8
9.9
1.494
1.539
1.585
1.632
1.679
1.727
1.776
1.824
1.874
1.924
1.975
2.026
2.078
2.130
2.183
2.237
2.291
2.345
2.401
2.456
Institut za imunobiologija i humana genetika
Tabela 7.2: Ot~ituvawe koncentracijata na imunoglobulin A (IgA) od gotovi plo~i
75
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 7.3: Ot~ituvawe koncentracijata na imunoglobulin M (IgM) od gotovi
plo~i
R g/
L
R
Imunoglobulin M (IgM)
4.0 0.605
6.0
4.1 0.638
6.1
4.2 0.668
6.2
4.3 0.701
6.3
4.4 0.735
6.4
4.5 0.770
6.5
4.6 0.805
6.6
4.7 0.841
6.7
4.8 0.878
6.8
4.9 0.916
6.9
5.0 0.954
7.0
5.1 0.993
7.1
5.2 1.033
7.2
5.3 1.074
7.3
5.4 1.116
7.4
5.5 1.158
7.5
5.6 1.201
7.6
5.7 1.245
7.7
5.8 1.290
7.8
5.9 1.335
7.9
g/L
R
1.381
1.428
1.476
1.525
1.574
1.624
1.675
1.727
1.779
1.832
1.886
1.941
1.996
2.053
2.110
2.168
2.226
2.286
2.346
2.407
8.0
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
8.6
8.7
8.8
8.9
9.0
9.1
9.2
9.3
9.4
9.5
9.6
9.7
9.8
9.9
g/L
2.469
2.531
2.595
2.659
2.724
2.789
2.856
2.923
2.991
3.059
3.129
3.199
3.270
3.342
3.415
3.488
3.562
3.637
3.713
3.790
od 80 ~asovi na sobna temperatura (24 ~asovi vo inkubator
na 37oC). Upotrebata na pre~isteni IgG ili protivtela
mo`e da dade podobri rezultati.
Boeweto na talo`nite prsteni so Komasi sino mo`e da
dade podobri rezultati, osobeno pri pomalite koncentracii. Potrebno e da se vnese kontrolen serum od `ivotnite pred nivnata imunizacija, zatoa {to radijalnata imunodifuzija e osobeno ~uvstvitelna na artefakti. Postojat i gotovi aparati za avtomatsko ~itawe i presmetuvawe
na radijalnata imunodifuzija (Dinatech i drugi).
7.4. Imunoelektroforeza
Vo ovaa tehnika belkovinite najprvin se dvojat so elektroforeza na agar ili agaroza. Potoa se dodava protivserum vo centralnata brazda (paralelna so elektroforetskoto patuvawe) ostavaj}i go spontano da difundira niz
gelot. Na mestoto kade {to se sretnuvaat protivgenot i
protivteloto se sozdava talo`en (precipitaciski) lak.
Najgolemoto ograni~uvawe na ovoj metod e relativno maloto razdvojuvawe (rezolucija) za najgolemiot broj protivgeni, koga se upotrebuva agarna elektroforeza.
Materijal i oprema: seka~i za imunoelektroforeza, ~ove~ki serum, vla`na komora, 2% agar vo barbitonski pufer, barbitonski pufer, mikroskopski stakla, 7% ocetna
kiselina, aparat za elektroforeza so pridru`ni delovi
(Slika 7.5), Komasi brilijantsko sinilo.
Izveduvawe :
Slika 7.5: [ematski prikaz na
aparatot za elektroforeza.
76
1. Se zagreva agarot vo voda {to vrie.
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 7: [email protected] PROTIVTELA-IMUNOPRECIPITACIJA
2. Se bri{at staklata so alkohol i eter, se obele`uvaat
staklata so brojki i nivnata pozicija vo odnos na anoda i
katoda i se stavaat vo specijalnite le`i{ta.
3. So ~etki~ka vnimatelno se prema~kuvaat kraevite na
staklata i ramkata so topol agar. Se razlevaat po 10 mL
te~en agar vo sekoja kolona (ima po tri stakla). Plo~ata
se stava vo ladilnik 24 ~asovi.
A
B
4. So poseben kalap se pravat po dve bunar~iwa i edna
brazda na sekoe mikroskopsko staklo. So vakuum i so pinceta se vadat agaroznite otpadoci.
5. Vo bunar~iwata se nanesuva okolu 10 mkL od ispituvaniot primerok obele`en so brom fenolno sinilo.
6. Se polnat rezervoarite so pufer, se postavuvaat plo~ite, se nanesuva filter hartija i se vklu~uva elektri~na
struja (po 8 mA za sekoe staklence).
7. Otkako }e zavr{i patuvaweto na belkovinite, vnimatelno se vadi sredi{niot del od brazdata, se nanesuva po
okolu 1 mL protivserum. Se ostava 24 ~asovi vo vla`na
komora za spontano da se istalo`at lacite.
8. Plo~ata se potopuva vo fiziolo{ki rastvor 24 ~asovi
za da se otstranat neistalo`enite belkovini. Se plakne
so destilirana voda i se potopuva 5-10 min vo 7% ocetna
kiselina (fiksacija na lacite).
9. Plo~ata se potopuva vo boja (Komasi brilijantsko sino)
i stoi 6-10 min. Plo~ata se odbojuva vo ocetna kiselina i
metanol 12-24 ~asovi.
10. Primerocite se su{at na 37oC najmalku 24 ~asovi. Staklencata vnimatelno se oddeluvaat i se lepat etiketi so
objasnuvawe {to ima na niv (slika 7.6).
Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite:
Zavisno od elektri~niot polne`, belkovinite patuvaat
kon anodata ili kon katodata. Za razlika od drugite frakcii, gama globulinite patuvaat kon katodata, albuminite
zaradi svojata najmala molekulska masa patuvaat najdaleku kon anodata. Najmalku patuvaat IgM i fibrinogenot
zaradi najgolemata molekulska masa.
V
G
D
\
Slika 7.6: Prika`uvawe na
elektroforetskite postapki: A, izgled na plo~kata; B,
nanesuvawe primerok; V, elektroforetsko dvi`ewe; G,
nanesuvawe protivtela; D,
difuzija na protivtelata i
primerokot; \, imunoprecipitaciski laci.
7.5. Zada~i
Izmeri dijametar na precipitaciskite prsteni od IgG,
IgA i IgM, vnesi gi vo Tabela 7.4 i presmetaj ja nivnata
koncentracija.
Institut za imunobiologija i humana genetika
77
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 7.4: Formular za
vnesuvawe koncentracija na
imunoglobulin G (IgG), A
(IgA) i M (IgM) od gotovi
plo~i.
Primer
Slu~aj
Primerok
Dijametar
(mm)
Koncentracija
(g/L)
Primerok
Dijametar
(mm)
Koncentracija
(g/L)
Standard 1
IgG
2.5
0.1
Standard 1
IgG
0.1
Standard 2
IgG
7.75
1.0
Standard 2
IgG
1.0
Primerok 1
IgG
4.6
2.63 (0.263h10)
Primerok 1
IgG
Primerok 2
IgG
8.8
14.48 (1.448h10)
Primerok 2
IgG
Standard 1
IgA
4.8
0.5
Standard 1
IgA
0.5
Standard 2
IgA
6.75
1.0
Standard 2
IgA
1.0
Primerok 1
IgA
5.8
1.268 (0.634h2)
Primerok 1
IgA
Primerok 2
IgA
9.4
4.366 (2.183h2)
Primerok 2
IgA
Standard 1
IgM
2.75
0.5
Standard 1
IgM
0.5
Standard 2
IgM
5.0
1.0
Standard 2
IgM
1.0
Primerok 1
IgM
5.0
0.954
Primerok 1
IgM
Primerok 2
IgM
9.5
3.488
Primerok 2
IgM
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
78
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 8: PROTIVTELEN ODGOVOR
[email protected] 8: PROTIVTELEN
ODGOVOR
8.1.Broewe protivtela sekretira~ki B limfociti
B limfocitite od slezinkata na staorec koi ne do{le vo
dopir so tu|i protivgeni ne la~at imunoglobulini i gi
narekuvame limfociti devici. Po intraperitonealnoto
vnesuvawe ovne{ki crveni krvni zrnca kaj staorecot, tie
stapuvaat vo kontakt so niv, se osposobuvaat da la~at
imunoglobulin M i pri povtornoto me{awe vo polucvrsta
sostojba, vo prisustvo na komplement, imunoglobulinot
M difundira vo okolinata po {to se vr{i hemoliza na
ovne{kite crveni krvni zrnca.
Potreben e sledniov materijal i oprema: Isplaknati
ovne{ki crveni krvni zrnca, staorci, Quadriperm plo~i,
Indubioza, solen fosfaten pufer, komplement, ~eli~no
sito od 100 mikroni, staklen klip, inverten mikroskop.
Izveduvawe na testot: Metodot za broewe imunoglobulin M sekretira~ki splenociti e modificiran metod vrz
osnova na originalnite postapki od Jerne i sor., 1963 i
Dreser i Vortis, 1967 (Slika 8.1).
Ovne{kite eritrociti se plaknat tri pati vo fiziolo{ki
rastvor i se pravi 10% suspenzija. Na sekoj staorec mu se
vnesuvaat po 0.5 mL od ovaa suspenzija i.p. za da se izvr{i
primarna imunizacija (primaren imunolo{ki odgovor). Po
~etiri dena staorcite se `rtvuvaat so iskrvavuvawe od
aorta, a slezinkata se se~e na mali par~enca i se pasira
niz ~eli~no sito od 100 mikrometri so 10 mL Henksov
rastvor. Za celo vreme na rabotata, suspenzijata od
splenociti se ~uva vo mraz.
Metodata se izveduva vo plasti~ni plo~i Quadriperm od
firmata Hereaeus (ili sli~ni). Se prigotvuva 1% rastvor
od Indubioza vo solen fosfaten pufer i se razlevaat po
2.5 mL za da se formira dolen sloj. Gorniot sloj se pravi od
0.5% Indubioza vo solen fosfaten pufer i toa vo stakleni
epruvetki na 45oC vo sledniov sostav: 0.5 mL Indubioza,
Institut za imunobiologija i humana genetika
79
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
0.05 mL plakneti ovne{ki eritrociti (10% suspenzija), i
0.02 mL od suspenzijata na splenociti. Sme{ata se nanesuva
vo rok od 3-5 sekundi vrz dolniot sloj. Za sekoj primerok se
pravat po dva testa (Slika 8.2:A).
Plo~ite se zatvoraat, se inkubiraat 60 min na 37oC vo
inkubator so 5% SO2, se dodava komplement od zamorec
(razreden 1:10 so Henksov rastvor) i se inkubira u{te 60
min. Se istura komplementot, se su{i i se brojat hemoliti~nite prsteni pod stereo mikroskop pod malo zgolemuvawe so dolno svetlo (Slika 8.2:B).
Slika 8.1: [ematksi prikaz za
izveduvawe na testot za broewe imunoglobulin M sekretira~ki splenociti vo Quadriperm plo~i.
80
Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite:
Broeweto hemoliti~ni zoni se vr{i zavisno od vkupniot
broj. Ako se malku, se brojat na celo vidno pole, ako gi
ima vo sredna gustina se pravat podelbi na dnoto od plo~ata, a dokolku gi ima vo golem broj, toga{ se lepi mre`a
od letraset i se broi vo malite kvadrat~iwa so korekcija
na nivniot vkupen broj. Rezultatite se iska`uvaat kako
broj na imunoglobulin M sekretira~ki splenociti vo cela
slezinka.
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 8: PROTIVTELEN ODGOVOR
B
A
Slika 8.2: Izveduvawe na testot za broewe imunoglobulin
M sekretira~ki splenociti
vo Quadriperm plo~i (A) i izgledot na hemoliti~nite zoni pod mikroskop so malo zgolemuvawe (B).
8.2.Imunonefelometrisko opredeluvawe imunoglobulinski
klasi i potklasi
8.2.1. Princip na imunonefelometrija
Nefelometrijata e naj~esto upotrebuvaniot princip za
imunohemisko merewe na proteinite vo serumot, urinata
i drugite telesni te~nosti. Na IIBHG raspolagame so
avtomatiziran imunonefelometar (Slika 8.3). Ako se
vnesat vo kiveta soodvetniot protivgen i soodvetnoto
protivtelo, se formiraat protivgen-protivtelo kompleksi. Vo ovaa metoda se meri svetlosta koja se rasprsnuva od
sozdadenite protivgen-protivtelo kompleksi.
8.2.2. Opti~ki pateki na svetlinata
Laserskata dioda sozdava svetlost so branova dol`ina od
840 nm. Svetlosniot snop e zbir od prakti~no paralelni
zraci i minuva niz kivetata. Svetlosta se rasprsnuva od
~esti~kite sozdadeni vo kiveta od strana na protivgenprotivtelo kompleksite i pod agol od 13-240 se upatuva kon
detektorot (dioda).
Institut za imunobiologija i humana genetika
81
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Slika 8.3: Avtomatiziran
imunonefelometar na IIBHG
PN ProSpec System.
Sozdadenata rasprsnata svetlina se fokusira kon
fotodetektorot so sistem od le}i. Poradi geometriskiot
oblik na detektorot, se otkriva samo mal del od
rasprsnatata svetlina. Detektorot ja pretvora rasprsnatata svetlina vo elektri~en impuls. Koncentracijata na
proteinite vo primerokot se meri kako razlika pome|u
signalot pred zapo~nuvawe na reakcijata i signalot po
zavr{uvawe na reakcijata so matemati~ki postapki i so
sporeba so referentnata kriva. Poradi intenzitetot na
upadnata svetlina, ne e potrebno dopolnitelno zasiluvawe
(postamplifikacija) vo svetlosniot zasiluva~ (fotomultiplikatorot) (Slika 8.4).
8.2.3. Principi na
imunoturbidimetrisko merewe
Hajdelberger-Kendalovata kriva go prika`uva soodnosot
pome|u nivoto na protivgenot i mereniot svetlosen signal
pri konstantno nivo na protivtela (Slika 8.4).
Hajdelberger-Kendalovata kriva mo`e da se podeli vo tri
podra~ja:
1. Vi{ok na protivtela. Vo ova podra~je ima vi{ok
protivtela, odnosno ima mnogu slobodni vrzni
mesta. Dodavaweto na sekoja molekula protivgen,
vedna{ se vrzuva i doveduva do natamo{no vkrsteno
vrzuvawe.
2. Ramnote`ni granici. Pri pribli`no ednakvi
koncentracii na protivgenot i protivteloto
povr{inata na krivata se nare~uva ramnote`ni
granici. Ovde vkrstenoto vrzuvawe e najjako i
rastvorlivosta na kompleksot protivgen-protivtelo
e najmala.
3. Vi{ok na protivgen. Vo slu~aj na vi{ok protivgen,
rastvorlivost na imunite kompleksi povtorno se
zgolemuva bidej}i pove}e nema vi{ok protivtela za
82
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 8: PROTIVTELEN ODGOVOR
da gi vrzat site protivgeni. Ova zna~i deka
izmereniot signal e pomal otkolku toj vo ramnote`nite granici.
Slika 8.4: Opti~ki sistem na
imunonefelometarot.
Vo avaluacijata na Hajdelberger-Kendalovata kriva, dve
koncentracii na protivgenot bi mo`ele da bidat odgovorni
za opredeleno merewe na signalot (Slika 8.6):
- Prvata to~ka le`i vrz nagorniot del od vi{okot
protivtelo (niska koncentracija na protivgen).
- Vtorata to~ka le`i vrz nadolniot del od vi{okot na
protivgen (visoka koncentracija na protivgen).
So optimizacija na uslovite na reakcija vo BN ProSpec,
maksimumot na Hajdelberger-Kendalovata kriva e
Slika 8.5: Haidelberger-Kendelova (Heidelberger-Kendall)
kriva za imunonefelometrisko opredeluvawe imunoglobulinski klasi i potklasi.
Institut za imunobiologija i humana genetika
83
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Slika 8.6: Optimizirana Hajdelberger-Kendelova kriva.
pomestena kon povisokite koncentracii na protivgen do
toj stepen {to izmereniot signal seu{te pa|a vo leviot
del od krivata, duri i pri pogolemi koncentracii na
proteini (Slika 8.7). Za da se garantira to~nost vo uslovi
na vi{ok na protivgen, duri i vo slu~ai koga se prisutnite
proteini vo visoki koncentracii, ili koga poka`uvaat
golemi biolo{ki varijacii (na primer, urinarnite
proteini), za opredeleni metodi se koristat predreakcii.
8.2.4. Predreakcii
Vo predreakciite, del od primerokot se prigotvuva so
kompletno koli~estvo reagens.
- Dokolku, za vreme na predreakcijata, ne se nadmine
pragot na reakcijata, se pipetira voobi~aenoto
koli~estvo i se izveduva mereweto. Presmetanata
sirova vrednost se opredeluva od referentnata
kriva.
- Dokolku postoi zna~ajno zgolemuvawe na signalot
koj go nadminuva definiraniot prag na reakcijata,
mereweto se povtoruva avtomatski so slednoto
razreduvawe, dokolku e napravena konfiguracija na
aparatot za avtomatsko povtoreno merewe.
Predreakcijata isto taka prvo se meri za novo razreduvawe.
-Ako ima povtorno zna~ajno zgolemuvawe, primerokot
se prigotvuva so slednoto razreduvawe i se proveruva
so predreakcija.
Ovaa postapka se povtoruva se dodeka rezultatot od
predreakcijata ne le`i pod propi{aniot prag na
84
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 8: PROTIVTELEN ODGOVOR
reakcijata ili dodeka sistemot ne gi dostigne granicite
dozvoleni za razreduvawe na primerokot. Ako i posle toa
ne mo`e da se dobie rezultat, do izmerenata vrednost se
dodava znakot ">".
Pragot na reakcijata se presmetuva od predreakciskiot
signal na gornata to~ka od kalibracionata kriva, ovaa
vrednost se mno`i so faktor specifi~en za opredeleniot
esej, i na kraj se dodava specifi~na konstanta za esejot.
8.2.5. Proveruvawe turbiditet
Ako mereniot signal go nadminuva definiraniot prag na
reakcija, rezultatot se ozna~uva so taka nare~eniot
turbiditeten znak. Proveruvaweto turbiditet se
izveduva vrz osnova na dva kriteriumi:
1. Ako razlikata pome|u po~etnata vrednost (prvata
merena vrednost posle 7.5 sekundi) i vrednosta na
slepata proba e pogolema od 1800 bita. Vrednosta od
1800 bita se nare~uva op{t turbiditeten prag. So
ovoj kriterium se merat primeroci so mnogu visok
intenzitet (na primer lipemi~ni serumi) ili brzi
reakcii (na primer monoklonski imunoglobulini).
2. Ako razlikata pome|u po~etnata vrednost (prvoto
merena vrednost posle 7.5 sekundi) i slepata proba
vo kivetata se pogolemi od 800 bita plus 15% od
razlikata pome|u vtoroto merewe i po~etnata
vrednost. Ovoj kriterium e razvien za da se isklu~i
nespecifi~niot turbiditet, ili pojava na
atipi~ni reakcii so mali razliki na izmereniot
signal pome|u vtoroto merewe i po~etnata vrednost.
Vrednosta od 800 bita se nare~uva turbiditeten prag, a
15% se nare~uva turbiditeten faktor. Dade Bering gi
presmetuva op{tiot turbiditeten prag i op{tiot
turbiditeten faktor i gi gi dava kako standardni
vrednosti.
Dokolku se pojavi nespecifi~na reakcija, se vadi
primerokot od aparatot i se o~istuva (na primer,
lipemi~niot serum se o~istuva so centrifugirawe 10
minuti na 15.000 vvm). Primerokot se vra}a vo analizatorot
i se procesira bez merewe na nespecifi~nata reakcija.
8.3. Zada~i
8.3.1. Izbroj IgM sekretira~i
splenociti od gotova plo~a
1. Na zadnata strana od plo~kata damkata (koja odgovara na
sodr`inata na epruvetata) vo sekoja od pregradite,so
pomo{ na flomaster, se deli na 4 pribli`no ednakvi
delovi.
2. Se stava plo~kata pod mikroskop i se nabquduva so
Institut za imunobiologija i humana genetika
85
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
najmaloto zgolemuvawe.
3. Se brojat site poliwa na liza (defekti vo homogeniot
raspored na eritrocitite). Na primer, da zememe deka vo
edna ~etvrtina od damkata se izbrojani 25 poliwa na liza.
4. Za da utvrdime kolku poliwa na liza ima vo celata
damka, 25 treba da go pomno`ime po 4 (25x4=100). Ova zna~i
deka vo celata damka ima vkupno 100 poliwa na liza,
odnosno ima 100 B limfociti. Imeno sekoe pole na liza
odgovara na eden B limfocit koj okolu sebe izla~il IgM.
IgM za sebe vrzal eritrociti, koi vo tekot na vtorata
inkubacija se uni{teni od strana na dodadeniot
komplement.
5. Ovie 100 B limfociti se sodr`at vo 20 mikrolitri na
splenocitnata suspenzija, kolku {to be{e staveno vo
epruvetata. Bidej}i celata slezina e pasirana vo 10 mL
Henksov rastvor, {to e 500 x pove}e od 20 mikrolitri,
dobieniot broj na B limfociti treba da go koregirame.
Taka dobieniot broj 100 }e go pomno`ime po 500
(100x500=50000). Dobieniot broj se izka`uva kako cel broj
x10n. Vo na{iot primer, rezultatot bi se prika`al kako
5x104 Blimfociti vo edna slezina (Slika 8.7).
Primer
Slika 8.7: Formular za vnesuvawe rezultati od imunoglobulin M sekretira~ki splenociti.
Izbroeni
poliwa na
liza
Vkupen broj na
plazma kletki vo
slezinata
25 h 4 =100
100 * (10 mL/0.02
mkL) = 50.000 ili
5.0 h 104
Slu~aj
Izbroeni
poliwa na liza
Vkupen broj na
plazma kletki vo
slezinata
8.3.2. Izmeri koncentracija na Ig klasi
so imunonefelometar
Vo glavnoto meni (Slika 8.8) so kliknuvawe na soodvetnata
ikona, najprvin se odbira opcijata Lab journal. Vo dobieniot
prozorec se kliknuva na kop~eto New. Sega mo`eme da gi
Slika 8.8: Glavnoto meni na
avtomatiziraniot nefelometar BN ProSpec.
86
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 8: PROTIVTELEN ODGOVOR
Slika 8.9: Pristap kon prozorecot za vnesuvawe na podatoci za pacientite i za vidot
na analizite koi treba da se
napravat.
vneseme podatocite za pacientot i analizite koi treba da
se izrabotat (Slika 8.9). Najprvin se vnesuvaat podatocite
za pacientite: laboratoriskiot broj na pacientot (Sample
ID), negovoto ime (First name) i prezime (Last name), datumot
na negovoto ra|awe (Date of birth) i koj go ispratil za
analiza (Comment). Dvi`eweto pome|u poliwata e so
kop~eto Tab ili so ednostavno kliknuvawe na kursorot na
dadenoto pole. Otkoga }e gi vneseme podatocite za
pacientot vo dolniot lev prozorec (Speciemen type) gi
nazna~uvame analizite koi }e treba da se izrabotat. Po
proveruvaweto na to~nosta na site vneseni podatoci
kliknuvame na ikonata Apply, pa na ikonata Close (Slika
8.10).
Potoa aparatot sam si presmetuva kolku od reagensite }e
mu bidat potrebni za da se izvedat potrebnite analizi.
Dokolku vo rotorot za reagensi nekoj od reagensite e so
pomala koli~ina od potrebnata, ikonata Reagents&controls
na glavnoto meni }e dobie crvena boja. So kliknuvawe na
nea, aparatot vedna{ }e ni poka`e koi od reagensite imaat
Slika 8.10: Prozorec za vnesuvawe podatoci za pacientite
i za vidot na analizite koi
treba da se napravat.
Institut za imunobiologija i humana genetika
87
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Sika 8.11: Prozorec za zamena
na reagensite.
pomala koli~ina od potrebnata. Se osvetluva dadeniot
reagens i se kliknuva na kop~eto Access (Slika 8.11). Duri
otkoga aparatot }e ne izvesti deka leviot kapak na aparatot
e osloboden, mo`eme da pristapime kon negovo otvorawe.
Otkoga }e go otvorime leviot kapak na aparatot, go otvorame i kapakot na rotorot za reagensi i go zamenuvame
dadeniot reagens. Po zamenuvaweto na reagensot, gi zatvarame kapakot na rotorot za reagensi i leviot kapak na
aparatot i go stisnuvame kop~eto Close. Po izvestuvaweto
deka reagensot e zamenet, kliknuvame na kop~eto OK.
Sika 8.12: Zamena na kivetite
i bunar~iwata za razreduvawe.
Istovremeno so presmetuvaweto kolku od reagensite }e
bidat potrebni da se izvedat zadadenite analizi, aparatot
presmetuva i kolku od kivetite za merewe i bunar~iwata
za razreduvawe }e mu bidat potrebni. Dokolku nema dovolen
broj od kivetite i/ili bunar~iwata za razreduvawe, toga{
ikonata Cuvettes&Dilutions cups na glavnoto meni }e stane
crvena. So kliknuvawe na nea, se otvara nov prozorec vo
koj mo`eme da izbereme dali }e gi zamenuvame samo
88
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 8: PROTIVTELEN ODGOVOR
Slika 8.13: Prozorec za vnesuvawe na primerocite serum vo
avtomatiziraniot nefelometar BN ProSpec.
kivetite, samo bunar~iwata za razreduvawe ili i kivetite
i bunar~iwata za razreduvawe. So kliknuvawe na sakanata
ikona, aparatot }e ni dozvoli da go otvorime leviot kapak
i da gi zamenime iskoristenite kiveti vo rotorot za kiveti
ili iskoristenite bunar~iwa za razreduvawe od nivniot
nosa~. Otkoga }e ja izvr{ime sakanata zamena, so kursorot,
na {ematskiot prikaz na rotorot za kiveti i nosa~ot na
bunar~iwata, gi osvetluvame kivetite i bunar~iwata za
razreduvawe koi sme gi zamenile. Potoa kliknuvame ne
ikonite Save i Close. Po izvestuvaeto na aparatot deka
zamenata e izvr{ena, kliknuvame na OK.
Sledniot ~ekor e da gi vneseme primerocite serum vo
aparatot. Gi redime ependorfite so serum na nosa~ot za
primeroci. Kliknuvame na ikonata Replace samples od
glavnoto meni. Po izvestuvaweto na aparatot deka desniot
kapak e osloboden go otvorime i go stavame nosa~ot na
primeroci. Kliknuvame na ikonata Close i otkoga aparatot
}e ne izvesti deka nosa~ot e staven, kliknuvame na OK. Vo
ovoj moment aparatot raspoznava deka e postaven nosa~ na
Slika 8.14: Lista na napraveni
analizi.
Institut za imunobiologija i humana genetika
89
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
primeroci, no ne rasoznava koj ependorf na koja pozicija
vo nosa~ot e postaven. Poradi toa kliknuvame na ikonata
Loading od glavnoto meni. Ni se otvara nov prozorec na koj
e prika`an rotorot za primeroci, a vo desniot del ima
prozor~e vo koj se prika`ani laboratoriskite broevi na
primerocite koi treba da se izrabotat. Pozicijata na koja
e postaven nosa~ot na primeroci e prika`ana so `oltozelena boja. So kliknuvawe na nea, aparatot ni dva vizuelen
prikaz na nosa~ot. Sega so kursorot go osvetluvame
dadeniot laboratoriski broj i go vle~eme do pozicijata na
nosa~ot kade e smesten soodvetniot ependorf so serum.
Otkoga na ovoj na~in }e ja definirame pozicijata na sekoj
ependorf na nosa~ot, kliknuvame na ikonata Apply.
Aktivnot nosa~ od `olto zelena-boja, }e premnie vo plavo`olta boja.
Za da ja nabquduvame rabotata na aparatot, povtorno
kliknuvame na ikonata Lab journal. Sekoja zapo~nata anliza,
aparatot }e ja ozna~i so mal ~asovnik. Po zavr{uvawe na
istata, do imeto na analizata aparatot, }e ja vpi{e
izmerenata vrednost.
Po zavr{uvaweto na site analizi, rezultatite se pe~atat.
Toa se pravi na toj na~in {to najprvin se osvetluvaat site
analizi, pa se kliknuva na ikonata Print. Se otvara nov
prozorec na koj ni e dadeno kako }e izgleda otpe~ateniot
izve{taj. Se kliknuva na ikonata na koja ima pe~atar.
Otkoga }e go otpe~atime izve{tajot, go zatvarame ovoj
prozorec i se vra}ame na glavnoto meni preku kliknuvaweto
na ikonata System.
Dobienite vrednosti se vnesuvaat vo Tabelata 8.1.
Tabela 8.1: Formular za
vnesuvawe rezultati od
imunoturbidimetrisko opredeluvawe imunoglobulinski klasi.
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
90
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET
[email protected] 9: ANALIZA NA
HUMORALEN IMUNITET
9.1. Normalni vrednosti od
ispituvaweto humoralen
imunitet
Normalnite vrednosti na imunoglobulinskite klasi i
potklasi variraat vo prvite meseci i godini, kako i spored
polot na decata (Tabela 9.1). Najgolemi promeni vo prvite
meseci od `ivotot na decata imaat IgM i IgG, pomalku
IgA, a imunoglobulinskite potklasi se menuvaat pomalku
i nemaat zna~ajni razliki pome|u ma{kite i `enskite
deca.
Tabela 9.1: Normalni vrednosti za imunoglobulinskite klasi (IgM, IgA i IgG),
i za imunoglobulinskite
potklasi (IgG1, IgG2, IgG3 i
IgG4) kaj deca.
Institut za imunobiologija i humana genetika
91
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 9.2: Normalni vrednosti za imunglobulinskite
klasi (IgM, IgA i IgG), za
imunoglobulinskite potklasi (IgG1, IgG2, IgG3 i
IgG4), kako i za lesnite i za
te{kite verigi (lambda i
kapa) kaj vozrasni lu|e.
Normalnite vrednosti se iska`uvaat vo g/L i se pribli`no
ednakvi za vozrasnite ma`i i `eni, osven za IgM.
Normalnite vrednosti za imunoglobulinskite klasi (IgM,
IgA i IgG), za imunoglobulinskite potklasi (IgG1, IgG2,
IgG3 i IgG4), kako i za lesnite i za te{kite verigi (lambda
i kapa) se dadeni na Tabela 9.2.
9.2. Klini~ko zna~ewe na
imunoglobulinskite klasi i
potklasi
Promenite vo koncentracijata na imunoglobulinite obi~no
se klasificiraat kako:
- Hipogamaglobulinemii koi mo`at da bidat zdru`eni so
razli~ni zaboluvawa. Smalenata koncentracija mo`e da
bide poradi smalena sinteza, zgolemen gubitok, zgolemeno
razgraduvawe ili nivna kombinacija.
- Poliklonski i oligoklonski gamopatii koi mo`at da
nastanat so zgolemuvawe na pove}e ili na edna imunoglobulinska klasa. Spektrumot na zaboluvawa koi
doveduvaat do poliklonski gamopatii e golem i vklu~uva
vospalenija, hroni~ni bolesti na crniot drob, kolageni
vaskularni zaboluvawa i drugi.
- Monoklonski gamopatii koi se karakteriziraat so tesna
lenta vo gama-globulinskata zona od elektroforezata na
serumskite proteini. Monoklonskite linii gi predizvikuvaat masovnite proliferacii (razrasnuvawa) na Blimfocitnite klonovi kletki koi sintetiziraat
imunoglobulini od edna klasa ili eden tip.
9.2.1. Hipogamaglobulinemii
Imunonedostatocite mo`eme da gi podelime vo ~etiri
kategorii: fiziolo{ki imunonedostatok (kaj novorodeni
i vo starosta), primarni specifi~ni imunonedostatoci,
92
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET
sekundarni specifi~ni imunonedostatoci i jatrogeni
imunonedostatoci (Tabela 9.3).
9.2.1.1. Prvi~ni imunonedostatoci
Prvi~nite imunonedostatoci se relativno retki
poremetuvawa na imuniot sistem i se odlikuvaat so
zgolemena osetlivost kon pojava na infekcii. Se
klasificiraat vo zavisnost od toa koj del od imuniot
sistem e zafaten.
Prvi~nite imunonedostatoci mo`at da se manifestiraat:
- vo neonatalnata vozrast, vo forma na zgolemena
prevalenca na infekciite (vrodeni imunonedostatoci).
Ovaa forma e relativno retka (so prevalenca od 1:10,000
do 1:1,000,000) i mnogu te{ko kombinirano poremetuvawe na imuniot sistem. Dijagnozata i lekuvaweto na
ovaa forma na imunonedostatok se vr{i vo terciernite
pedijatriski centri (Klinikata za detski bolesti pri
Medicinskiot fakultet).
- vo tekot na adolescencijata ili ranoto polnoletstvo.
Tuka spa|aat naj~estite prvi~ni imunonedostatoci,
kako na primer selektivniot IgA nedostatok (so
prevalenca od 1:700), nedostatocite vo IgG subklasite
i zaedni~kiot varjabilen imunonedostatok. Ovie
imunonedostatoci se mnogu ~esti i se predmet na
razgleduvawe kako vo razli~nite medicinski disciplini taka i vo rutinskata laboratoriska praksa.
Zaedni~ka karakteristika na site klini~ki zna~ajni
imunonedostatoci e zgolemenata osetlivost i/ili
nevoobi~aeno te{kite infekcii nekaraktristi~ni za
vozrasta na pacientot. Voobi~aeno, vakvite infekcii ne
se pri~ineti samo od eden predizvikuva~, nitu se
ograni~eni samo na eden organ.
Vo osnova, iako mo`e da se javat vrodeni poremetuvawa
(prvi~ni imunonedostatoci) vo site delovi od imuniot
sistem, dominiraat poremetuvawata vo oblasta na
humoralniot imunitet proprateni so poremetena sinteza
na imunoglobulini.
Tabela 9.3: Vidovi imunonedostatoci kaj vozrasni lu|e.
Institut za imunobiologija i humana genetika
93
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 9.4: Imunonedostato~ni sindromi na B limfocitite.
94
Vo slu~aj na postoewe na nekoj kombiniran imunonedostatok, site ovie tipovi na infekcii se so zgolemena
prevalenca. Ovie slu~ai vsu{nost pretstavuvaat te`ok
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET
vid na imunonedostato~en sindrom koj se manifestira
ve}e vo neonatalnata vozrast. Vakviot sindrom, bez
soodvetna terapija (na pr. presaduvawe na koskena
srcevina), brzo rezultira so smrt.
Za razlika od seto dosega ka`ano nekoi anomalii, koi
mo`at da se otkrijat so laboratoriskite testovi, ne se
Tabela 9.5. Kombinirani
imunonedostato~ni sindromi.
sekoga{ proprateni so zgolemena osetlivost kon
infekciite. Primer za ova e selektivniot IgA imunonedostatok (bez istovremeno postoewe i na defekt vo
sozdavaweto na IgG podklasite) ili poremetuvaweto na
mieloperoksidaznata aktivnost.
Na Tabela 9.4 e daden kratok prikaz na prvi~nite
imunonedostatoci na B-limfocitite so karakteristi~ni naodi za sekoj od niv. Na Tabela 9.5 se dadeni
kombiniranite imunonedostatoci.
Na imunonedostatok treba da se pomisli dokolku:
- postojat povtoruva~ki ili nevoobi~aeno te{ki
infekcii koi zafa}aat pove}e organski sistemi, a se
predizvikani od razli~ni patogeni;
- postojat povtoruva~ki zaboluvawa karakteristi~ni
za pedijatrijata, a za koi normalno postoi dobro razvien
imun odgovor
- se javat nesakani komplikacii pri vakciniraweto i/
ili dokolku vakciniraweto e bez uspeh, kako i pri
infekciite so pri~initeli koi voobi~aeno ne bi
mo`ele da predizvikaat zaboluvawe.
Za razgrani~uvawe dali se raboti za prvi~en ili vtori~en
imunonedostatok od osobena va`nost e vozrasta na
pacientot, kako i podatocite za postoewe te{ki sistemski
zaboluvawa i/ili podatoci za primaweto na imunosupresivna/zra~na terapija i citotoksi~ni lekovi. Dokolku
postoi za~estena pojava na infekcii vo tekot na detstvoto,
Institut za imunobiologija i humana genetika
95
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Slika 9.1: Dijagnosti~ki priod kon somnitelni vrodeni
imunonedostatoci ako e prisutna bakteriska infekcija.
MPO, mieloperoksidaza, KPU,
kletki prirodni ubijci.
ANALIZA NA SLU^AJ
pubertetot i po~etokot na polnoletstvoto, a dokolku nema
podatoci za postoewe na nekoi od ovie pri~ini za vtori~ni
imunonedostatoci, mo`e da se razmisluva za postoewe na
prvi~en imunonedostatok.
Dijagnosticiraweto na imunolo{kite poremetuvawa kaj
pomalku te{kite imunonedostatoci, koi se javuvaat vo
tekot na detstvoto i na po~etokot na polnoletstvoto,
obi~no po~nuva so voobi~aenite klini~ki isleduvawa:
- kompletna krvna slika, vkl~uvaj}i ja tuka i krvnata
razmaska (diferencijalna krvna slika);
- elektroforeza na serumskite belkovini i odreduvawe
na koncentracijata na imunoglobulinskite klasi i
podklasi;
- odreduvawe na koncentracijata na feritinot za da se
isklu~i postoeweto na nedostatok na `elezo;
- detekcija na protivtela kon voobi~aenite patogeni i
/ili postvakcinalni protivtela;
- mikrobiolo{ko doka`uvawe na patogenot vo tekot na
akutnata faza na infekcijata;
Iks vrzana
agamaglobulinemija:
Slu~ajot na Bogdan
Gligorovski, student na
medicina skoro bez
protivtela.
96
- in-vivo ko`ni testovi so ve}e doka`anite patogeni
pri~eniteli za da se ispita funkcijata na T limfocitite.
Vo najgolem broj na slu~ai, ovie laboratoriski testovi ni
ovozmo`uvaat da go isklu~ime ili potvrdime postoeweto
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET
Slika 9.2: Dijagnosti~ki priod kon somnitelni vrodeni
imunonedostatoci ako se
prisutni te{ki me{ani infekcii so virusi i gabi.
na najgolem broj od sekundarnite imunonedostatoci, kako
i da gi isklu~ime ostanatite zaboluvawa koi mo`at da go
kompromitiraat imuniot sistem (na pr. sistemskite
hematolo{ki zabolouvawa, sindromite proprateni so
gubitok na belkovini, nedostatokot na `elezo, sindromite
proprateni so nedostatok na imunoglobulini i/ili
sindromite so selektiven imunoglobulinski nedostatok,
monoklonalnata gamopatija i dr.)
Na Slika 9.1 i Slika 9.2 se prika`ani dijagnosti~kite
postapki koi treba da se prevzemat vo zavisnost od
spektarot na patogeni i rezultatite od bazi~nite
(preliminarni) isleduvawa.
Sindrom na nedostatok na protivtela. Ovoj sindrom,
kako i selektivniot nedostatok na imunoglobulinite (na
primer nedostatokot na IgA), mo`e da se dijagnosticira
vrz osnova na imunoelektroforezata na serumskite
belkovini i kvantitativnoto odreduvawe na imunoglobulinskite klasi. Od Tabela 9.3 mo`e da se vidi deka
dosega se poznati nekolku te{ki vrodeni formi na ovoj
sindrom na nedostatok na protivtela, me|u koi spa|a i
Brutonovata bolest. Kaj site ovie formi otsustvoto na B
Institut za imunobiologija i humana genetika
97
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
limfocitite mo`e da se doka`e so odreduvaweto
limfocitni subpopulacii, a kaj Brutonovata bolest mo`e
da se doka`e i postoeweto na mutacija na genot za btk.
Sindrom na obi~niot/op{tiot varjabilen imunonedostatok (OVIN) [Common variable immunodeficiency syndrome
(CVID)]: Ovoj imunonedostatok e zna~itelno po~est odkolku
sindromot na nedostatok na protivtela. Toj prestavuva
heterogena grupa od zaboluvawa, ~ija {to zaedni~ka
karakteristika e prisustvo na sindrom na nedostatok na
protivtela. Prvite klini~ki manifestacii kaj ovoj
imunonedostatok se javuvaat pome|u 15-35 vozrast.
Imunfenotipiziraweto na krvnite limfociti mo`e da
pomogne vo karakteriziraweto na kleto~nite anomalii i
vo nivnoto odvojuvawe od vtori~nite sindromi na
protivtelni nedostatoci, kako na pr. onie koi se povrzani
so limfomite.
Zaedni~ko obele`je na site formi na OVIN e neadekvatnoto sozrevawe na naivnite zreli limfociti vo
imunoglobulin-sozdava~ki plazma kletki, po stimulacijata so protivgenot. Vakvoto ne{to mo`e da se doka`e
so testovite za ispituvawe funkcionalnosta na B
limfocitite. Vo somnitelnite slu~ai, za da se isklu~i
postoewe na sistemsko hematolo{ko zaboluvawe, treba da
se napravi i biopsija na koskenata srcevina. Vo slu~aite
na OVIN karakteristi~en naod e redukcijata na brojot na
plazma kletkaite.
Selektiven nedostatok na poedine~nite imunoglobulinski klasi: Ovie nedostatoci, a osobeno selektivniot
IgA nedostatok, se obi~no naj~esti vo prirodata i ne
iziskuvaat op{irno i specijalizirano dijagnosti~ko
ispituvawe. Vo slu~aite na kompleten IgA nedostatok
(serumskiot IgA da e <0.05 g/L), obvrzno treba da se proveri
dali nedostasuva i sekretorniot IgA. Za da se proceni
kompletnoto klini~ko zna~ewe vo ovie slu~ai treba da se
ispita i koncentracijata na podklasite na IgG. I vo
slu~aite na parcijalen nedostatok na IgA, dopolnitelno
treba da se ispita nivoto na IgG i IgA podklasite. Vo site
slu~ai na kompleten IgA nedostatok ili so kompleten
nedostatok na IgA podklasite, treba da se o~ekuva mo`na
pojava na protivtela naso~eni kon IgA. Zatoa na vakvite
pacienti ne treba da im se davaat krvni produkti koi
sodr`at IgA.
Hiper-igM sindrom: Ovoj sindrom se odlikuva so otsustvo
na prevklu~uvawe na IgM kon IgG i IgA vo tekot na
infekcijata. Kaj ovie pacienti ima defekt vo CD40
ligandot koj se nao|a na T limfocitite, a koj igra mnogu
va`na uloga vo T-B limfocitnata interakcija. Ovoj defekt
mo`e da se otkrie so imunofenotipizirawe i so
molekularno-biolo{ki metodi.
Nedostatok na imunoglobulinskite podklasi: Vo serumot
kaj pacientite ima nezna~itelni koli~ini na imunoglobulinskite klasi i podklasi. Vakvite pacienti stradaat
od povtoruva~ki bakteriski infekcii, osobeno na
respiratorniot trakt, predizvikani naj~esto od piogeni
bakterii. Vo zavisnost od lokacijata na genot odgovoren
98
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 9: ANALIZA NA HUMORALEN IMUNITET
za razli~nite podklasi, so zgolemena stapka istovremeno
se sretnuvaat slednite defekti:
- nedostatoci na IgG1 i IgG3
- nedostatoci na IgG2 i IgG4 so mo`en nedostatok na
IgA2.
9.2.1.2. Vtori~ni imunonedostatoci
Smaluvawe koncentracijata na imunoglobulinite poradi
zgolemeno razgraduvawe (hiperkatabolizam) se javuva vo
hipermetabolni sostojbi. Na primer, vakva sostojba gledame
kaj bolnite so zgolemena aktivnost na tiroidnata `lezda
(hipertiroidizam) koga mo`at da bidat namaleni site
imunoglobulinski klasi. Serumskite imunoglobulini
mo`at da bidat namaleni i kaj pacientite so miotoni~na
distrofija poradi smaleniot polu`ivot. Protiv protivtelata se retka pri~ina za zgolemena eliminacija na
imunoglobulinite od cirkulacijata.
9.2.2. Poliklonski i oligoklonski
gamopatii
Poliklonskiot ili oligoklonskot imun odgovor, koj se
javuva za vreme na infekcija so kompleksni protivgeni
(mikroorganizmi), doveduva do zgolemuvawe na serumskite
imunoglobulini od edna ili od pove}e klasi. Dijagnozata
na poliklonalni gamopatii se postavuva so kvantitativno
merewe na imunoglobulinskite klasi i potklasi, koga }e
najdeme zgolemuvawe nad normalnata vrednost na pove}e
klasi ili potklasi imunoglobulini.
Izolirano zgolemuvawe na IgM se smeta kako znak za
primarna reakcija na infekcija. Kaj novorodeni,
zgolemuvaweto IgM vo papo~nata vrvca se smeta kako
nespecifi~en znak na vnatreuterusna infekcija. ZgoleTabela 9.6. Pri~ini za oligoklonski gamopatii.
Institut za imunobiologija i humana genetika
99
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
muvawe koncentracija samo na IgG, i lesno zgolemuvawe na
IgM e znak za vtori~en imun odgovor kon ve}e poznat
predizvikuva~ za organizmot. Hroni~nite aktivni
infekcii ja zgolemuvaat koncentracijata na IgG, no vo
isto vreme se zgolemeni i/ili IgM i IgA. Relativno
golemi koncentracii na IgA mo`at da se najdat kaj
crnodrobnite zaboluvawa (poradi toksi~ni o{tetuvawa,
alkohol, kontarceptivni lekovi, antidepresivi i sli~no).
Pri~inite za oligoklonalno zgolemuvawe na imunoglobulinite se dadeni na Tabela 9.6.
9.2.3. Monoklonski gamopatii
ANALIZA NA SLU^AJ
Multipen mielom:
Slu~ajot na Violeta
Babunska, posledici od
neprekinat rast na
protivtelno sozdava~ki
klon od B-Li.
Koncentracijata na lesnite imunoglobulinski verigi vo
serumot e vo korelacija so koncentracijata na intaktnite
imunoglobulinski molekuli. Otstapuvawe od ova ima koga
vo serumot }e se pojavat slobodni lesni ili te{ki
imunoglobulinski verigi. Pokraj ovie slu~ai, zgolemuvaweto ili namaluvaweto koncentracijata na lesnite
imunoglobulinski verigi mo`e da se javi i poradi pojava na
proliferacija (poliklonalna ili monoklonalna) ili
gubewe na intaktnite inunoglobulinski molekuli.
Dodeka kaj poliklonalnite imunoglobulini imame
srazmerno zgolemuvawe i na kapa i na lambda lesnite
verigi (naj~esto vo sooodnos 2:1), kaj monoklonskite imunoglobulini ima zgolemuvawe na koncentracijata na samo
eden tip lesni verigi. Zgolemenoto sozdavawe kako na
monoklonalnite imunoglobulini taka i na slobodnite lesni
verigi }e dovede do promena i na kapa/lambda soodnosot.
Poradi ova vrednostite na kapa/lambda soodnosot koi
izleguvaat od normalnite granici uka`uvaat na postoewe
na monoklonski gamopatii (na primer kaj multipniot
mielom). I dodeka intaknite imunoglobulini ne mo`at da
projdat niz intaktnata glomerulska filtraciska bariera,
lesnite imunoglobulinski verigi mo`at da se filtriraat
i povtorno da se reabsorbiraat vo tubulite. Taka, dokolku
imame zgolemeno sozdavawe na imunoglobulinskite lesni
verigi, kako na primer kaj monoklonskite gamopatii, mo`e
da dojde do nadminuvawe na reabsorpciskiot kapacitet na
tubulite i do pojava na lesnite imunoglobulinski verigi
vo urinata. Spored toa otkrivaweto na slobodnite lesni
imunoglobulinski verigi vo urinata ({to e isto so BensXonsonovite proteini) e va`en pokazatel za postoewe
monoklonskaa gamopatija i mo`e da se iskoristi kako za
dijagnosti~ki celi taka i za sledewe tekot na bolesta.
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
100
Institut za imunobiologija i humana genetika
[email protected] 10: KOMPLEMENTEN SISTEM
BLOK 4
BLOK 4 - KOMPLEMENTEN
SISTEM I CITOKINI
U^EBNI CELI:
[email protected] 10. KOMPLEMENTEN SISTEM (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat:
“ da opredelat SN50 vo serum;
“ da opredelat K3, K4, K1inh.
VE@BA 11. CITOKINI (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat:
“ da opredelat koncentracija na citokin.
VE@BA 12. ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM
I CITOKINI (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da:
“ tolkuvaat rezultati od komplementen sistem;
“ tolkuvaat rezultati od citokini;
“ analiziraat slu~ai od komplementen sistem i
citokini.
POENI:
PRISUSTVO
1.5 poeni
ZNAEWE
3.0 poeni
VKUPNO: 4.5 poeni
Institut za imunobiologija i humana genetika
101
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
102
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM
VE@BA 10: KOMPLEMENTEN
SISTEM
Komplementniot sistem e grupa od dvaesetina plazmatski
proteini koi se vo neaktivna forma, no pri opredeleni
uslovi mo`e da se aktiviraat skalesto (aktiviraniot protein go aktivira sledniot i toj sistem prodol`uva s# dodeka ne se aktiviraat site komponenti) (Tabela 10.1).
Oznaka
kirilica
Oznaka
latinica
KLASI^EN PAT
Ce1Kju
C1q
Ce1Er
C1r
Ce1Es
C1s
Ce4
C4
Ce2
C2
Ce1inh
Ce4bp
I
C1 - inh
C4 - bp
I
P
H
I
DAF
MCP
CR1-4
ZAEDNI^KI
Ce5
Ce6
Ce7
Ce8
Ce9
PAT
C5
C6
C7
C8
C9
Konc. vo serum
(mkg/mL)
400 000
85 000
85 000
200 000
110 000
60 - 80
30 - 50
30 - 40
200 - 600
25
regulacija
105 000
570 000
88 000
180 - 240
250
35
ALTERNATIVEN PAT
Ce3
C3
Be
B
De
D
Pe
Ha
I
DAF
MKP
Cr1-4
Mol. masa
(daltoni)
190 000
90 000
24 000
regulacija
170 - 280 000
150 000
88 000
70 000
45 - 70 000
145 - 400 000
190 000
106 000
120 000
151 000
71 000
regulacija
Es protein S protein
80 000
HRF
HRF
20 - 65 000
Institut za imunobiologija i humana genetika
Tabela 10.1: Belkovini na
komplementot.
DAF=Decay Accelerating factor
MCP=Membrane Cofactor Protein
CR1-4=Complement Receptor
HRF=Homologous Restriction Factor
1 300
200
1
20 - 25
360 - 550
35
76 - 80
60 - 80
55 - 60
55 - 60
60
500
-
103
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Nivnoto aktivirawe mo`e da po~ne so prisustvo na
bakteriski polisaharidi (t.n. alternativen pat na aktivacija) ili pak, so prisustvo na kompleks protivgen protivtelo, {to pretstavuva klasi~en pat na aktivacija.
Ispituvawata mo`e da bidat kvalitativni koga se opredeluva vkupnata aktivnost na celiot sistem preku merewe
na hemoliti~kiot kapacitet na serumot izrazen vrz eritrociti od oven koi se senzibilizirani so protivtela od
zajak (mo`e da se koristat i ~ove~ki eritrociti). Kako
edinica obi~no se koristi CH50, definirana kako koli~ina na serum neophodna da lizira 50% od eritrocitite. No,
ispituvawata mo`e da bidat i kvantitativni koga se vr{i
poedine~no dozirawe na sekoja komponenta na komplementot sli~no kako i kaj protivtelata, so pomo{ na radijalnata
imunodifuzija ili pak, nefelometriski.
10.1. Opredeluvawe CH50 na komplementot
Koga se dodava komplement (sve` serum) na crveni krvni
zrnca oblo`eni so protivtela vo raste~ki proporcii, se
dobiva karakteristi~no lizirawe na kletkite (Slika
10.2). Krivata dostignuva 100% liza asimptotski, zaradi
{to e mnogu te{ko da se dobie vkupnata liti~ka aktivnost
na komplementot (CH100), pa voobi~aeno se meri to~kata
na 50% liza (CH50).
Fon Krog (von Krogh) napi{al formula koja ja pretstavuva
sigmoidnata kriva od hemolizata so komplement, koja glasi:
x = k(y/(100-y))1/n
kade {to:
104
procent na hemoliza
Slika 10.2: Soodnos me|u
koncentracijata na komplementot i liziranite eritrociti. Se gleda nelinearen
soodnos vo pomalite i pogolemite razreduvawa na serumot.
opti~ka gustina na 541 nm
x= koli~inata na komplementot (mL od razreden serum);
mL serum 1:1000
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM
y= proporcija na liziranite ovne{ki eritrociti, del
od edinica (0.3/(1-0.3)) ili kako celi procenti (30/
(100-30));
k= 50% edinica na komplement, edna komplementna
edinica;
1/n= konstanta koja zavisi od gustinata na eritrocitite
vo testot. Pri gustina na eritrocitnata suspenzija
od 0.6-1.2*10^8 konstantata ima vrednost od 0.2-0.02.
Za izvr{uvawe na testot e potrebno: solen veronalen pufer (SVP), ovne{ki eritrociti, 0.04% amonium sulfat,
sve` ili sve`o zamrznat zamore~ki serum, kowski hemoliti~en serum, spektrofotometar, ispituvaniot serum, 0.1
% rastvor od Na2CO3, higroskopen pamuk, kalibrirani
pipeti, mraz, termostat, centrifuga.
Standardizirawe (senzibilizirawe) suspenzija od ovne{ki eritrociti:
1. Se razreduva veronalniot pufer do rabotna koncentracija. Se vnimava da nema bakterisko ili gabi~no zagaduvawe bidej}i tie imat protivkomplementna aktivnost.
2. Se plaknat 4 mL eritrocitna suspenzija (od 25% suspenzija vo Alseverov rastvor) tri pati vo solen veronalen
pufer (centrifugirawe 200 g za 3 min).
3. Se resuspendiraat isplaknatite eritrociti vo odnos
1:18 mL solen veronalen pufer (se dobiva pribli`no 5%
suspenzija). Suspenzijata se filtrira niz tenok sloj pamuk.
4. Se me{aat 1 mL eritrocitna suspenzija so 25 mL amonium
sulfaten rastvor (ili 1 mL suspenzija so 14 mL 0.1%
rastvor od Na2CO3) za da se liziraat kletkite i se ~ita
apsorbancijata na hemoliti~kiot rastvor na 541 nm
nasproti slepata proba. Za 6% suspenzija od ovne{ki
eritrociti, vo 1 sm kiveta apsorbancijata treba da bide
0.48-0.50. Dokolku e potrebno se prilagoduva suspenzija vo
ovie granici.
5. Se me{aat 15 mL solen veronalen pufer, 0.1 mL kowski
hemoliti~en serum (razreden liofiliziran hemolizin
1:150 do 1:1000), 15 mL 6% suspenzija od ovne{ki eritrociti.
6. Se inkubira na 37oC za 15 min. Se upotrebuvaat senzibilizirani eritrociti vo tek na 24 ~asa.
Ponatamu se postavuvaat epruvetkite kako {to e dadeno
na tabela 14. Se koristi sve`, smrznat ili liofiliziran
serum kako izvor za komplement.
Epruvetka broj
1. Pufer (SVP) (mL)
2. Rastvoren komplement, 1:30 (mL)
3. Senzibilizirana
Er suspenzija (mL)
1
2
3
4
5
1.10 1.05 1.00 0.90 0.80
0.10 0.15 0.20 0.30 0.40
0.30 0.30 0.30 0.30 0.30
Institut za imunobiologija i humana genetika
6
7
0.04%
amon.
Tabela 10.2: Protokol za
ispituvawe CH50 na komplementniot sistem vo serum.
1.20 1.20
-
-
0.30 0.30
105
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
- Epruvetkite se me{aat i se inkubiraat na 37oC 60 min.
- Se prenesuvaat epruvetkite vo mraz i im se dodavaat po
2.0 mL solen veronalen pufer.
- Epruvetkite se me{aat i se centrifugiraat na 200 g 10
min na 4oC.
- Se zema supernatantot od sekoja epruvetka i se meri
apsorbancijata na 541 nm.
Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite:
- Pretpostavuvaj}i deka sedmata epruvetka ja prika`uva
vkupnata liza, se presmetuva lizata vo drugite 6 epruvetki kako procent od sedmata.
- Se postavuva % na liza nasproti koncentracijata na komplementot (mL nerazreden serum). Ova }e dade sigmoidna
kriva kako na slikata 18. Ovaa kriva ja sledi ravenkata na
fon Krog. Ravenkata mo`e da bide logaritamski transformirana za da se dobie prava linija:
log x = log k + (1/n)log(y/(100-y))
Se postavuva log x nasproti log (y/(100-y)) za sekoe razreduvawe na upotrebeniot komplement. Pravata linija ima
koeficient na opa|awe (sloup = angliski slope) 1/n so vrednosti koi zavisat od eksperimentalnite uslovi, no se dvi`at okolu 0.2-0.04 (Slika 19). Interceptot na linijata e
na apscisata, kade {to log(y/(100-y)) = 0 i pretstavuva
logaritam od razreduvaweto {to doveduva do 50% liza.
Presmetuvaweto mo`e da se napravi i spored formulata:
log k = log x - 1/n log ((y/100-y)),
mL serum 1:500
kade {to log k odgovara na edna CH50. Nivoto na komplementot vo serumot normalno se iska`uva kako broj na CH50
edinici po 1 mL serum (CH50 * mL-1). Titarot na komplementot se koregira so razreduvaweto na serumot, dokolku
go ima vo pogolema koli~ina (Slika 10.2, Tabela 10.2).
Slika 10.2: Logaritamska
transformacija na krivata na
Fon Krog od koja se ekstrapolira vrednosta na SN50 za
komplementnata aktivnost
vo serumot.
106
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM
Normalni vrednosti za komplementot vo ~ove~kiot serum
iznesuvat 25-50 CH50 edinici na mL. Dobienite normalni
vrednosti ne isklu~uvaat vrodeni ili zdobieni varijacii
na oddelnite komponenti od komplementniot sistem.
Golemi varijacii vo komplementniot sistem nastanuvaat
zaradi nesoodvetno zemawe i ~uvawe na serumot. Zemawe
krv so oksalat, citrat, EDTA ili heparin ima protivkomplementen efekt. Krvta treba da se zeme vo suva i ~ista
epruvetka, bez protivkoagulans, a serumot ili sinovijalnata te~nost treba da se ispitaat vedna{ ili da se zamrznat
na -70oC. Ne smeat smrznatite primeroci da se odmrznuvaat pove}e pati.
Klini~kata va`nost na serumskoto nivo na komplementot
e uka`uvaweto na intenzitetot na sozdavaweto, kako i
negovoto razgraduvawe. Smaleni koncentracii mo`e da
ima pri pomalo sozdavawe i/ili pogolemo razgraduvawe
na komplementniot sistem. Namaluvawe ima pri akutniot
glomerulonefrit (do 25% od normalnoto nivo), formi od
hroni~en nefrit (hipokomplementen nefrit), pri sistemskiot lupus eritematodes, revmatoidniot artrit (osobeno vo sinovijalnata te~nost) i kaj drugi bolesti.
10.2. Ispituvawe koncentracija
na K3, K4 i K1inh
10.2.1. Radijalna imunodifuzija (RID)
Edine~na radijalna imunodifuzija na plo~a: rastvor od
primerok koj sodr`i protivgen se raspredeluva vo kru`ni
bunar~iwa od agarozen gel koj sodr`i monospecifi~ni
protivtela (protivserum). Po opredeleno vreme na
inkubacija (24 ~asa) se formiraat jasno vidlivi
imunoprecipitaciski prsteni (Slika 10.3).
Slika 10.3. Edine~na radijalna
imunodifuzija na plo~a za
opredeluvawe K3, K4 i K1inh.
Institut za imunobiologija i humana genetika
107
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Pribor i reagensi:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Vodeno kupatilo.
Greja~ so me{alka.
Stakleni plo~i 10 h 10 sm, 1.5 mm visoki, prethodno
izmieni so detergent i isplaknati so topla voda i
etanol (1 ~as - 1 nedela). Pred upotreba plo~ite se
plaknat so sme{a od aceton i etanol (50%-50%)
(1:1).
Dup~alka za gelot i kalap.
Vla`na komora (nepropustliva za vozduh koja e
dovolno golema za da go dr`i gelot).
Fen za su{ewe.
Dr`a~ za plo~ite.
Kalibriran instrument za zgolemuvawe.
Veronalen solen pufer (VSP) (5 pati koncenriran
rastvor).
Podgotvuvawe rastvori i gelovi:
Rastvor A:
- 85 g NaCl.
- 3.75 g natrium barbiturat.
- do 1 litar so H2O.
Rastvor B:
- 5.75 g barbiturna kiselina vo 600 mL topla H2O.
Se me{aat dvata rastvora (A+B) i se nadopolnuva do 1.8
litri so H2O. Po ladeweto se podesuva pH na 7.4±0.5 so 1M
HCl. Se dopolnuva voda do 2 litra, a ostanatiot del od VSP
mo`e da se ~uva na 4-10 °C do 6 meseci.
Veronalen pufer (e isto so barbituraten pufer):
•
•
•
•
•
•
0.1 M EDTA rastvor.
33.6 g Na2 – EDTA.
800 mL H2O.
Se podesuva pH na 7.6±0.05 so 2N NaOH.
Se dopolnuva voda do 1 litar.
Se ~uva na 4-10°C vo tek na 6 meseci.
Pufer za agaroza:
VSP pufer 9 dela.
0.1 M EDTA 1 del.
Podgotvuvawe agaroza:
1.5 g agaroza.
0.01 g natrium azid.
100 mL pufer za agaroza.
Se zagreva so me{awe, vo tek na 5 min. Po topeweto
gelot se raspredeluva na podednakvi delovi (10 do 15
mL) i se ~uva na 4°C.
Rastvor za boewe:
1 g amidoblek.
250 mL metanol.
200 mL destilirana voda.
50 mL ledena ocetna kiselina (mo`e da se upotrebi i
96% ocetna kiselina).
108
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM
Rastvorot e filtrira pred upotreba.
Rastvor za odbojuvawe:
500 mL metanol.
100 mL ledena ocetna kiselina (mo`e da se upotrebi i 96%
ocetna kiselina).
400 mL H2O.
Primerok:
Kako primerok mo`e da se koristi serum ili plazma od
krvzemena so EDTA kako protivsosiruva~).
Rabota so primerocite:
Pri koisteweto serum epruvetkata so venska krv se ostava
60-120 min na sobna temeperatura za da nastane sosiruvawe
i retrakcija na sosirokot. Potoa epruvetkata se
centrifugira na 2500 vvm na 4°C vo tek na 5 min. Taka
dobieniot serum se prefrla vo ependorvi (epruvetki za
~uvawe so kapa~e). Zemenite primeroci mo`at da se ~uvaat
i nekolku godini (bez da izgubat od svojata aktivnost) na 70°C ili pokratko, ako se ~uvaat na -20°C. Treba da se
izbegnuva odmrznuvawe i povtorno zamrznuvawe na
primerocite.
10.2.2. Odreduvawe na K3 komponentata
od komplementot so radijalna
imunodifuzija
1. Se rastopuvaat 15 mL od prethodno podgotvenata
1.5% agaroza so vnimatelno zagrevawe. Po ladewe na
56°C vo nea se dodava 55 mkL protiv-human K3 IgG
(Diasorin) pri kontinuirano me{awe.
2. Se istura sme{ata od protivtela i agaroza, na 5255°C, na ~ista staklena plo~a za da se oformi 1.5 mm
tenok gel (15 mL za plo~a so dimenzii 10h10). Se ~eka
okolu 10 min.
3. Vo gelot se pravat bunar~iwa so dijametar od 2.5 mm.
4. Vo bunar~iwata se vnesuvaat po 5 mkL od primerocite
razredeni 1:16 (10-1.2) i po 5 mkL Human Kalibrator
(DAKO) (ili sme{a od zdrav human serum kako standardi
1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; (10-0.3; 10-0.6; 10-0.9; 10-1.5; 10-1.8)
razredeni vo pufer koj go koristime za prigotvuvawe
agarozen rastvor.
5. Se inkubira vo vla`na komora na sobna temperatura,
24 ~asa.
6. Plo~ite se plaknat so potopuvawe vo solen fosfaten
pufer ili 0.9% NaCl, 2-20 ~asa.
7. Po plakneweto plo~ite se vadat od rastvorot za
plaknewe i gelot se pokriva so vla`na filter hartija.
8. Plo~ite se su{at so pomo{ na fen (so topol vozduh)
ili se stavaat vo zagreana komora.
9. Plo~ite se mestat na dr`a~ i se potopuvaat vo rastvor
Institut za imunobiologija i humana genetika
109
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
za boewe 10-15 min.
10. Po boeweto plo~ite se plaknat so voda i se
potopuvaat vo rastvor za odbojuvawe 1- 2 min.
11. Plo~ite povtorno se su{at so fen ili vo zagreana
komora.
12. Se pravi standardna prava od koncentraciite na
poznatite standardi nasproti kvadratot od dijametarot
(d2 vo odnos na mm2) na odgovara~kite precipitaciski
zoni i koncentracijata na protivgenot od primerocite
se odreduva so interpolacija od standardnata prava.
Normalni vrednosti:
0.70 - 1.80 g/L
10.2.3. Odreduvawe na K4 komponentata
od komplementot so radijalna
imunodifuzija
Protokolot za odreduvawe na K4 komponentata od
komplementot so RID e ista kako za K3 komponentata
(vidi 10.2.2.). Razliki ima samo vo to~kite 1 i 4.
1. Se rastopuvaat 15 mL od prethodno podgotvenata
1.5% agaroza so vnimatelno zagrevawe. Po ladewe na
56°C vo nea se dodava 55 mkL protiv-human K4 IgG
(Diasorin) pri kontinuirano me{awe.
4. Vo bunar~iwata se vnesuvaat po 5 mkL od primerocite
razredeni 1:2 (10-0.3) i po 5 mkL Human Kalibrator
(DAKO) (ili sme{a od zdrav human serum kako standardi
1:1; 1:2; 1:4; 1:8 (100; 10-0.3; 10-0.6; 10-0.6; 10-0.9) razredeni vo
pufer koj go koristime za prigotvuvawe agarozen
rastvor.
Normalni vrednosti:
0.15 - 0.55 g/L.
10.2.4. Odreduvawe na K1 inhibitor
komponentata od komplementot so
radijalna imunodifuzija
Protokolot za odreduvawe na K1 inhibitor komponentata od komplementot so RID e ista kako za K3
komponentata (vidi 10.2.2.). Razliki ima samo vo to~kite
1 i 4.
1. Se rastopuvaat 15 mL od prethodno podgotvenata
1.5% agaroza so vnimatelno zagrevawe. Po ladewe na
56°C vo nea se dodava 120 mkL protiv-human K1inh IgG
(Calbiochem) pri kontinuirano me{awe.
4. Vo bunar~iwata se vnesuvaat po 5 mkL od primerocite
110
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 10: KOMPLEMENTEN SISTEM
razredeni 1:2 (10-0.3) i po 5 mkL Human Kalibrator
(DAKO) (ili sme{a od zdrav human serum kako standardi
1:1; 1:2; 1:4; 1:8 (10-0.3; 10-0.3; 10-0.6; 10-0.6; 10-0.9) razredeni vo
pufer koj go koristime za prigotvuvawe agarozen
rastvor.
Normalni vrednosti:
64 % - 166 % od onaa vrednost dobiena so normalen
serum.
Odreduvawe koncentracijata na K3, K4 komponentite, kako
i K1 inhibitorot, mo`e da se napravi i so pomo{ na
imunonefelometrija kako {to e opi{ano vo 8.2.
Imunonefelometrisko opredeluvawe imunoglobulinski
klasi i potklasi.
Edinstvenata razlika e vo vidot na monoklonskite
protivtela koi se koristat (vo slu~ajov bi koristele
monoklonski protivtela kon K3, K4 i K1 inhibitor).
10.3. Zada~a
Da se opredeli komplementnata aktivnost vo serum od
pacient i da se presmeta standardnata prava na Slika 10.3,
kako i SN50 vo Tabelata 10.3.
mL
10
1
0,1
0,1
1
10
y/1-y
Slika 10.3: Formular za presmetuvawe SN50 za komplementnata aktivnost vo serumot.
Institut za imunobiologija i humana genetika
111
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 10.3: Primer za presmetuvawe CH50 na komplementot i formular za negovo
presmetuvawe.
Primer
Slu~aj
Epruveta
Serum
(mL)
Ekst.
(nm)
y/1-y
Epruveta
Serum
(mL)
1
0.1
0.12
0.12
(0.10/0.96-0.10)
1
0.1
2
0.15
0.17
0.19
(0.15/0.96-0.15)
2
0.15
3
0.2
0.22
0.26
(0.20/0.96-0.20)
3
0.2
4
0.3
0.29
0.39
(0.27/0.9-0.27)
4
0.3
5
0.4
0.37
0.57
(0.35/0.96-0.35)
5
0.4
6
/
0.02
/
6
/
7
/
0.96
/
7
/
Hemoliti~ki
edinici
(HE)
46.8 HE vo 1 mL (1.56h30) (0.64 mL
ima 1 HE)
Ekst. (nm)
y/1-y
Hemoliti~ki
edinici
(HE)
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
112
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 11: CITOKINI
VE@BA 11: CITOKINI
11.1. Zasituva~ki metodi
Od zasituva~kite metodi najprvin se vovedeni radioimunolo{kite metodi za opredeluvawe mali koncentracii
materii vo tkivata i telesnite te~nosti (1960). Yalow i
Berson dobija Nobelova nagrada za imunologija, za
istra`uvaweto pri opredeluvawe na insulinot vo serumot.
Podocna se vovedeni enzimoimunolo{kite metodi so ne{to
pomala osetlivost, a najdocna imunofluorescentnite
metodi za opredeluvawe mali koncentracii materii.
Zaedni~ki beleg na site metodi e principot na zasituvawe
voveden od Ekins vo 1960 godina, objavuvaj}i go metodot za
opredeluvawe tiroksin vo serumot.
11.1.1. Op{ti principi na
zasituva~kite metodi
Slika 11.1: [emata na Ekins
vo koja se postaveni osnovite
na zasituva~kite metodi od
koi se razvija radioimunolo{kite, enzimoimunolo{kite i
fluoroimunolo{kite odreduvawa. Zasen~enoto pole go
prika`uva obele`eniot del od
supstancijata.
Osnovniot princip na zasituva~kite metodi e prika`an
od Ekins so ednostavniot primer na kofa so voda i edna
Institut za imunobiologija i humana genetika
113
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
~a{a: sekoga{ kofata voda mo`e da se izmeri so edna ~a{a
(ako se znae nejziniot volumen). Osnovno vo ovoj metod e da
mu se ovozmo`i na soedinenieto {to se meri (P) da reagira
so specifi~en receptoren reagens (Q), koj ima ograni~en
kapacitet na vrzuvawe.
Soedinenieto P po zasituvaweto so Q, se deli na dva dela
(slobodno P i vrzano P-Q), taka {to nivniot soodnos varira
kako funkcija od vkupnata koli~ina na soedinenieto P
(Slika 11.1).
Za da mo`at ovie metodi da se koristat neophodno e efikasno da se odvoi vrzanata od slobodnata materija i da se
izmerat nivnite koli~ini.
11.2. Imunoenzimski odreduvawa
(ELISA)
Imunoenzimskite metodi koristat enzim kako odbele`uva~ za opredeluvawe specifi~nata reakcija protivgen:
protivtelo. So niv mo`e da se doka`uvaat protivtela i
protivgeni. Ovaa metodologija se pojavi vo 1971 godina so
zada~a da ja zameni radioimunolo{kata metodologija,
odnosno da koristi reagensi koi ne se radioobele`eni, a
pritoa da ne izgubi od osetlivosta, to~nosta i drugite
visoko oceneti karakteristiki na radioimunolo{kite
tehniki.Taka, imunoenzimskite metodi koristat dosta
iskustva od radioimunologijata i imunofluorescencijata.Od 1972 godina ovie odreduvawa ve}e se koristat kako
mnogu pogodni i vo histo- i citohemiskite metodi.
Podgotovkite na reagensite, odvivaweto na reakcijata i
~itaweto na rezultatite e prili~no slo`ena procedura,
me|utoa dava mnogu precizni rezultati.
11.2.1. Podgotovka na imunoatsorbentot
Se koristat brojni atsorbenti sposobni da gi fiksiraat
protivgenite ili protivtelata pasivno ili so kovalentna vrska. Pri pasivnata atsorpcija proteinite se
diluirani od 1 do 10 mkg/mL vo alkalen rastvor so rN 9.6 i
na plastika ili staklo se atsorbiraat za nekolku ~asa.
Kako solidni nosa~i se upotrebuvaat na pr. polistiren,
polikarbonat, propilen ili lateks vo forma na top~iwa,
plo~ki, yvezdi~ki, epruvetki ili mikroplo~ki. Denes,
naj~esto se koristat mikroplo~kite od polistiren koi
ovozmo`uvaat istovremeno testirawe pogolem broj
primeroci i koristewe avtomatika.
Adsorpcijata so kovalentna vrska dobiena vo solidna faza so protivgenot ili protivteloto e cvrsta, ireverzibilna vrska i ovozmo`uva maksimalna preciznost vo ispituvaweto, dodeka kaj pasivnata vrska, plastikata nema sekoga{ ist kapacitet za vrzuvawe-atsorbirawe i vrskata ne
e tolku cvrsta pa ima pu{tawe - dezatsorbirawe so kraen
efekt - pogre{ni rezultati. Se koristat sefadeks,
114
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 11: CITOKINI
celuloza, agaroza, akrilamid ili polistiren so glutaraldehid ili avidin. Denes ovaa faza fabri~ki e izvr{ena i komercijalno se nabavuvaat gotovi reaktivi.
11.2.2. Kowugirawe
Kako kowugat se koristi enzim {to treba da zadovoli opredeleni karakteristiki za da bide pogoden obele`uva~. Toj
treba da e solubilen, da obezbedi visok stepen na ~istota,
da ima soodvetna kataliti~ka aktivnost, da ja zadr`uva
specifi~nata aktivnost dodeka e vrzan za reagira~kiot
supstrat, da e stabilen za vreme na ~uvaweto i vo tekot na
reakcijata, da ovozmo`uva ednostavna, brza i osetliva
enzimska reakcija, da ne stapuva vo reakcija so biolo{kata
sredina i da e otsuten vo okolnata sredina {to se
upotrebuva vo reakcijata.
11.2.3. Spojuvawe enzim so protivtelo
ili protivgen
Vo imunoenzimskite reakcii se koristat posebni hemiski
agensi koi ovozmo`uvaat spojuvawe na enzimot so protivteloto ili pak, so protivgenot. Tie ne treba da vlijaat
vrz aktivnosta na enzimot, nitu vrz tekot na imunolo{kata reakcija. Za vakva cel, najmnogu se koristi 1% rastvor
glutaraldehid po takanare~eniot metod vo dve vremiwa,
koj e vospostaven 1971 godina. Vo prvo vreme nastapuva
fiksirawe na molekulata od glutaraldehidot (toj e
dialdehid) za NH2 grupata od enzimot. Za da se otstrani
vi{okot na reaktivite agensite se filtriraat niz gel.
Potoa vo vtoro vreme nastapuva fiksirawe na vtorata
aldehidna reakcija od glutaraldehidot {to ostanal
sloboden za NH2 grupata od proteinskata molekula od
protivteloto ili od protivgenot. Za ova spojuvawe mo`e
da se koristat i p-benzoquinone, carbodiimide, dimaleimide,
cyanobromide i dr.
11.2.4. Odvivawe na reakcijata
Reakcijata mo`e da se odviva vo t.n. homogena ili heterogena faza. Vo homogena faza reakcijata se odviva direktno. Aktivnosta na enzimskiot obele`uva~ e modificirana vo protivgen-protivtelo reakcijata, a protivtelata
igraat uloga na specifi~en reaktiv so izrazen princip
na kompeticija. Reakciite so homogena faza se ednostavni, brzi, mo`e da se avtomatiziraat, no pomalku se osetlivi od onie so heterogena faza.
Ovde se koristat razli~ni enzimi i supstrati kako na pr.
lizozim so mre`a od micrococcus luteus ( se ~ita turbidometriski) ili pak, beta D-galactosidase so 0-nitrophenil beta
D galactopyrannoside- (se ~ita spektrofotometriski). Vo
heterogenata faza vo prviot del postoi reakcija me|u
atsorbiraniot protivgen za supstrat (dokolku se doka`uvaat protivtela, a pri doka`uvawe protivgen
Institut za imunobiologija i humana genetika
115
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
reakcijata se postavuva sprotivno) so specifi~no
protivtelo i so serumot {to se ispituva, a potoa se dodava
protivprotivtelo obele`eno so enzim koe stapuva vo
reakcija so vrzanite protivtela za fiksiraniot protivgen, doveduva do promena na bojata i ovozmo`uva ~itawe
na testot. I vo ovaa faza se koristat razli~ni enzimi i
supstrati, no naj~esto peroxydase so supstrati: diaminobenzidine, tetramethylbenzidine; Phosphatase alcaline so P-nitrophenylphosphate; Beta-D-galactosidase so 0-nitrophenil-B-Dgalactopyrannoside i site se ~itaat spektrofotometriski.
Denes imunoenzimolo{kite reakcii najmnogu ja koristat
heterogenata faza i kako naj~esto upotrebuvaniot metoda
e ELISA (Enzyme Linked Immunoadsorbent Assay) testot.
Metodot e opi{an vo 1971 godina od Engvall i Permann i vo
osnova sodr`i direkten natprevar me|u protivtelata
(imunoatsorbirani za mikroplo~ka i onie {to se spoeni
so enzimot) za vrzuvawe so specifi~niot protivgen koj
treba da se opredeli.
11.2.5. ^itawe na rezultatot
Enzimite zaedno so drugite supstrati treba da ovozmo`at
to~no ~itawe, {to se vr{i so nivno merewe-opredeluvawe:
turbidometriski, spektrofotometriski, kolorimetriski,
a u{te poprecizno so pomo{ na fluorimetrija ili
luminiscencija.
Za opredeluvawe protivgeni, se koristat pove}e internacionalno opredeleni (etalonirani) standardi. Potrebno
e da se ima i sopstveni vnatre{ni i nadvore{ni kontroli.
Koli~inata na protivgenot se presmetuva od dobienite
vrednosti za intenzitetot na aktivnosta interpolirana
od dobienata standardna kriva.
Kvalitativnoto opredeluvawe pozitiven naod za protivtela se dobiva od presmetaniot indeks spored opti~kata gustina (OG):
- OG pozitivna/ OG negativna> 1.5 ;
- OG silno pozitivna/ OG slabo pozitivna> 1.8.
Titarot na protivtelata mo`e da se dobie od opredelena
kriva koja e konstruirana spored naodite od razli~ni
opti~ki gustini.
11.3. Odreduvawe koncentracija
na citokini
11.3.1. Op{to za odreduvaweto
citokini
Dijagnosti~kata procenka na citokinite se vr{i in vivo,
eks vivo i in vitro. Celokupnata postapka opfa}a
116
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 11: CITOKINI
odreduvawe na nivnata genska ekspresija, odreduvawe na
nivnata koncentracija i procenka na nivniot efekt.
In vivo procenkata slu`i za doka`uvawe prisustvoto na
citokinite vo krvta, telesnite te~nosti i tkivata. Poradi
redundantniot i pleotropniot efekt na citokinite,
nivnata in vivo procenka e popogodna za procenkata na
aktivnosta na procesot na zaboluvaweto (na pr. nekoj vid
na nesakani imunolo{ki odgovori, kakvi {to se
otfrlaweto na presadeniot organ, avtoimunite zaboluvawa, infektivnite zaboluvawa i dr.), odkolku za
diferencijalno dijagnosti~ki celi.
Kako rutinska dijagnosti~ka postapka, odreduvaweto na
citokinite na nivo na gRNK ili na nivo na belkovina,
seu{te ima ograni~ena upotreba. Vakvata ograni~enost,
osobeno pri odreduvaweto na citokinite vo krvta i/ili
kletkite, se dol`i na faktot {to imunolo{kiot odgovor
naj~esto se odviva vo razli~nite kompartmani, nedavaj}i
ja pri toa vstinskata slika na sistemsko nivo. No i pokraj
se, postojat izvesni indikacii kaj koi odreduvaweto na
kocentracijata na citokinite mo`e da ima klini~ko
zna~ewe.
In vitro odreduvaweto na koncentracijata na citokinite
ni ovozmo`uva da ja odredime sposobnosta na odredeni
kletki da la~at citokini po nivnata stimulacija so
razli~ni materii. Eks vivo odreduvaweto na nivnata
koncentracija ni ovozmo`uva da ja odredime sposobnosta
na oddelni kletki da la~at citokini in vitro, otkako bile
izlo`eni in vivo na odreden vid na terapija. Vakvite in
vitro/eks vivo odreduvawa, nare~eni i u{te “testovi so
polna krv”, ve}e se izborija za svoeto mesto vo rutinskata
dijagnostika. Za taa cel se zema krv so protivkoagulans, se
razreduva so medium i se inkubira nekolku ~asa so razli~ni
stimulansi. Potoa se meri koli~inata na citokinskite
receptori koi }e se pojavat na kletkite, kako i/ili
koli~estvoto na odredeni citokini vo supernatantot.
Vakvata postapka e lesna za izveduvawe, mo`e da se povtori,
a {to e najva`no od se, mnogu e sli~na na ona {to se slu~uva
vo organizmot. Vakvite testovi se upotrebuvaat vo
dijagnosticiraweto na prvi~nite i vtori~nite imuni
nedostatoci, vo procenkata na imunomodulatorniot efekt
vo tekot na terapijata, otkrivaweto na prisustvo na
endotoksini vo tkivnite te~nosti, kako i pri reakciite
kon tu|ite protivgeni.
Odreduvaweto koncentracijata na citokinite ne prestavuva nekoj pogolem problem, so ogled na faktot deka
postojat pove}e metodi koi slu`at za direktnoto merewe
na nivnata koncentracija. Problemot se javuva koga treba
da se protolkuvaat dobienite rezultati. Nekoga{ upotrebuvanite bioeseji sega kompletno se zameneti so
enzimatiski imunotestovi.
Bidej}i citokinite svojata aktivnost ja projavuvaat vo
pikomolarni koli~ini, potrebno e upotrebuvanite metodi
da poseduvaat golema senzitivnost. Edno od najgolemite
ograni~uvawa vo mo`nosta za dijagnosti~ka primena na
odreduvaweto na citokinite, proizleguva od nivniot
Institut za imunobiologija i humana genetika
117
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
kratok biolo{ki polu`ivot vo plazmata, koj naj~esto e
meren vo minuti (so isklu~ok na nekoi, kako na pr. IL-12).
Vo ostanatite pri~ini spa|aat i: vrzuvaweto na citokinite
za nivnite receptori na povr{inata na kletkite, kako i za
rastvorenite receptori vo krvta; vrzuvaweto za belkovinite na plazmata; nivnoto proteoliti~ki razgraduvawe;
kako i nivnoto eliminirawe preku bubrezite. Dopolnitelno ograni~uvawe prestavuva i faktot deka po
stimulacija, citokinite se la~at samo nekolku ~asa i toa
pove}e lokalno otkolku sistemski.
11.3.2. Izveduvawe na ve`bata
(Odreduvawe koncentracija na
interleukin 1b)
11.3.2.1. Potreben materijal za izveduvawe
na ve`bata
Za odreduvawe na koncentracijata na citokinite vo serum/
plazma neophodni se:
- primerok na serum/plazma
- plasti~en nosa~ za stripovi
- stripovi (sekoj strip ima 8 bunar~iwa)
- pufer za plaknewe (pH 7.8)
- vtori~no protivtelo (protivtelo kon soodvetniot
citokin za koe ima vrzano biotin)
- standardi za IL-1beta (0.31 pg/mL; 0.63 pg/mL; 1.25 pg/
mL; 2.5 pg/mL; 5.0 pg/mL; 10.0 pg/mL)
- standarden rastvor za razreduvawe
- zasiluva~ki rastvor Amdex
- pufer za plaknewe na bunar~iwata
- 3,3’5,5'-tetra-metil benzidin (TMB) substrat
- rastvor za stopirawe na reakcijata (0.18 M sulfurna
kiselina)
- samoleplivi lenti za pokrivawe na polo~kata
- pipeti od 25 μL, 100 μL, 200 μL, 500 μL i 1000 μL
- plasti~ni prodol`etoci
- aparat za kontinuirano me{awe
- aparat za avtomatsko plaknewe bunar~iwa
- spektrofotometar (Victor2)
11.3.2.2. Priprema na pufer za plaknewe na
bunar~iwata
Se zemaat 50 mL od koncentratot za plaknewe i se prefrlaat
vo ~ista kolba od 2000 mL. Koncentratot se razreduva 30
118
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 11: CITOKINI
pati so dodavawe na 1500 mL destilirana voda. Vaka
pripremeniot pufer za plaknewe e stabilen 2 nedeli na
temperatura od +2 do +8oC dokolku se ~uva vo dobro
zatvoren kontejner.
11.3.2.3. Priprema na rabotniot rastvor
na citokinskiot standard
Suvata supstanca vo {i{enceto se rastvora so destilirana
ili dejonizirana voda. Koli~inata na potrebnata destiliranata/dejoniziranata voda potrebna da se rastvori suvata
supstanca e dadena na samoto {i{ence. Se me{a vnimatelno
(so prevrtuvawe na {i{enceto).
11.3.2.4. Priprema na zasiluva~kiot
rastvor Amdex
Se priprema vedna{ (ne podolgo od 15 minuti) pred
negovoto stavawe vo bunar~iwata. Na suvata supstanca se
dodavaat 11 mL destilirana ili dejonizirana voda. Vaka
prigotveniot zasiluva~ki rastvor e stabilen 1 nedela na
temperatura od -15 do -30oC dokolku se ~uva vo dobro
zatvoren kontejner.
11.3.2.5. Standarden rastvor za razreduvawe
Mnogu e va`no rastvorot za razreduvawe da ja otslikuva
prirodnata sredina na primerokot. Vo slu~aite koga kako
primerok koristime serum, plazma ili urina, za
razreduvawe upotrebuvame standarden rastvoruva~. Ako
rabotime so supernatant od kultura na kletki, kako
razreduva~ }e go koristime mediumot vo koj e odr`uvana
kulturata na kletki.
11.3.2.6. Primerok
So razvojot na testovi vo ~ija osnova le`at imunolo{kite
reakcii, ovozmo`eno e odreduvawe na nivoto na citokinite
vo razli~ni telesni te~nosti (na primer urina, sinovijalnata te~nost, serum, plazma i dr.) Sepak kako naj~esti
primeroci se koristat plazmata i serumot. Kon site ovie
primeroci, koi se koristat za odreduvawe koncentracijata
na citokinite, treba da se odnesuva kako kon potencijalno
inefektivni materjali, pa zatoa so niv treba da se rakuva
spored zakonskite upatstvata za rabota so takvi materjali.
Vo zavisnost od kompletot za rabota koj se koristi,
potrebni se od 50-200 μL serum ili plazma (iako najgolem
del od avtorite smetaat deka e podobro da se koristi
plazma). Dokolku se koristi serum krvta se zema so
venepunkcija, se ostava da sosiri i se odvojuva serumot so
centrifugirawe (5 minuti na 4000 vvm). Za dobivawe plazma
se koristi krv zemena so natrium citrat, heparin ili
EDTA. Dokolku e toa mo`no, potrebno e plazmata i
kletkite da se izdvojat od 30 minuti do 2 ~asa od zemaweto
na primerokot na krv, za da se spre~i enzimskoto raspa|awe
Institut za imunobiologija i humana genetika
119
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
i inaktivacijata na citokinite, no i poradi faktot {to
nekoi od faktorite koi predizvikuvaat sosiruvawe mo`at
da predizvikaat aktivacija na citokinite/receptorite.
Op{to zemeno, primerocite mo`at da se ~uvaat na +4oC
kratko vreme. Ako e neophodno primerokot da se ~uva
podolgo od 1 den, toa treba da se napravi na -20oC, a ako
treba da se ~uva podolgo od edna nedela, toaga{ treba da se
~uva na -80oC. Isto se postapuva i so primerocite od
drugite telesni te~nosti. Treba da se izbegnuva
odmrznuvawe i povtorno zamrznuvawe na primerokot.
Dokolku se koristi serum, ne treba da se koristat
hemolizirani primeroci i primeroci koi stoele
nesmrzanti pove}e od 24 ~asa.
Dokolu se dobijat rezultati nad gornata granica na testot,
toga{ primerokot treba da se razredi (so standardnior
razreduva~ ili so medium za kultura na kletki) i povtorno
da se izvede testot.
11.3.2.7. Protokol za rabota
11.3.2.7.1. Prigotvuvawe na standardite
1. Se obele`uvaat 6 polipropilenski epruveti (0.31 pg/mL,
0.63 pg/mL, 1.25 pg/mL, 2.5 pg/mL, 5 pg/mL i 10 pg/mL).
2. Vo epruvetata obele`ena so 10 pg/mL se pipetira 990 μL
od standardniot razreduva~.
3. Vo site ostanati epruveti se pipetira po 500 μL od
standardniot razreduva~.
4. Vo epruvetata obele`ena so 10 pg/mL se pipetira 10 mL
od rabotniot rastvor na citokinskiot standard i dobro se
prome{uva.
5. Od epruvetata obele`ena so 10 pg/mL se prefrlaat 500
μL vo epruvetata obele`ena so 5 pg/mL i dobro se
prome{uva.
6. Vakviot na~in na dvojno razreduvawe se povtoruva
posledovatelno vo site preostanati epruveti.
11.3.2.7.2. Izveduvawe na testot
Koncentracijata na citokinite ili nivnite receptori vo
primerokot se odreduva so pomo{ na ELISA metodot ili
so pomo{ na drugi enzimski imunotestovi. Deneska postojat
najrazli~ni komercijalno dostapni kompleti za odreduvawe na koncentracijata na citokinite koi ne sekoga{
davaat pribli`no ednakvi rezultati. Nekoi od rezultatite
koi se dobivaat od ovie razli~ni testovi, za `al nemo`at
da se sporedat.
So napredokot na imunolo{kite tehniki, sozdadeni se
razli~ni vidovi na imunolo{ki testovi koi ovozmo`uvaat
brzo, to~no i ednostavno merewe na razli~ni parametri vo
telesnite te~nost (serum, plazma, sinovijalna te~nost,
urina i dr). ELISA testovite se pove}e se koristat za
ovie nameni.
Samite imuni testovi prestavuvaat alternativa za
120
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 11: CITOKINI
biolo{kite metodi i proto~nata citometrija. Tie se
ednostavni za izveduvawe, a rezultatite se dobivaat za
nekolku ~asa.
Naj~esto upotrebuvanata ELISA metoda koristi dva vida
na protivtela. Ednite, nare~eni u{te i imobilizira~ki
protivtela, se vrzani za cvrstata faza na testot, naj~esto
mikrotitraciona plo~a so 96 bunar~iwa. Kako cvrsta faza
mo`e da se javat i polistirenski top~iwa i magnetni
partikli, koi isto taka ~esto se koristat vo avtomatiziranite ELISA tehniki. Protivtelata koi se
nao|aat vo cvrstata faza, a koi se so visok afinitet,
slu`at da ja vrzat za sebe materijata od interes koja se
nao|a vo ispituvaniot primerok. Posle prvoto miewe na
bunar-~iwata, se dodava vtoroto protivtelo. Toa e
specifi~no za razli~en epitop na odreduvanata materija,
poradi {to so negovoto vrzuvawe za ve}e vrzanata
ispituvana materija za prvi~noto protivtelo, se sozdava
sendvi~. Za vtoroto protivtelo, koe u{te se narekuva i
detektira~ko protiv-telo, e vrzan enzim biotin, HRP
(horseradih peroksidase) ili alkalna fosfataza (Slika11.2).
Vo nekoi metodi vtoroto protivtelo se obele`uva so edna
materija so mala molekulska masa, kako {to e na pr. FITC
(fluorescenten tiocijanat), a potoa celiot kompleks se
odreduva so protiv-FITC za koj e vrzan enzim. Ova treto
protivtelo za koe e vrzan enzim, naj~esto HRP, e univerzalno
protivtelo, koe mo`e da se koristi vo razli~ni testovi
kaj koi {to specifi~noto protivtelo e naso~eno kon
materiite koi sakame da gi odreduvame vo primerokot. So
malata molekulska masa na FITC (389 Da) se otstranuvaat
site problemi koi mo`at da se javat poradi slo`enite
~etiridimenzioni strukturi vo prostorot, kako koga
detekti-ra~koto protivtelo bi bilo obele`ano so golemi
molekuli, kakva {to e HRP (40 kDa). Posle vtoroto miewe
na bunar~iwata, se dodava zasiluva~kiot rasvor Amdex.
Zasiluva~kiot rastvor prestavuva specifi~en multifunkcionalen kowugat so unikatna struktura koja sodr`i
Slika 11.2: Principot na odreduvawe koncentracija na citokini vo primerokot.
Institut za imunobiologija i humana genetika
121
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
molekuli na HRP i streptavidin. Ovoj kowugat se vrzuva za
citokinot za kogo se vrzani i prvi~noto i vtori~noto
protivtelo. Vrzuvaweto na protivtelata stanuva vidlivo
koga enzimot vrzan za detektira~koto protivtelo i
zasiluva~kiot rastvor reagira so dodadeniot substrat
3,3’5,5'-tetra-metil benzidin (TMB). Po izvesno vreme
reakcijata se stopira so dodavawe na 0.18 M sulfurna
kiselina. Na kraj obojuvaweto se ~ita na soodvetna branova
dol`ina so spektrofotometar ili ELISA ~ita~. Intenzitetot na obojuvaweto e pravoproporcionalen so koncentracijata na ispituvaniot citokin vo primerokot.
Site standardi i primeroci se rabotat vo duplikat. Za
sekoj test treba da se napravi nova standardna prava. Site
hemikalii i primeroci pred da se po~ne so rabota treba da
se zagreat na sobna temperatura (+20 - +250C).
1. Vo nosa~ot se stava potrebniot broj na stripovi
(plasti~ni bunar~iwa). Vi{okot na stripovi se vra}aat
vo plasti~noto kese. Od keseto se istisnuva vozduhot i
vnimatelno se zatvora.
2. Se pipetira po 100 μL od standardniot razreduva~ (Sr),
standardite (St) i nepoznatite primeroci (Pr) vo
bunar~iwata, spored prika`anata {ema (Slika 11.3, dolu).
3. Nosa~ot se pokriva so samolepliva lenta i se inkubira
2 ~asa (±5 minuti) na sobna temperatura. Za vreme na
celata inkubacija nosa~ot vnimatelno se me{a.
Slika 11.3: Raspored na standardite i primerocite za
opredeluvawe citokini.
4. Site bunar~iwa se plaknat ~etiri pati so pufer za
plaknewe.
5. Vo sekoe od bunar~iwata se dodava po 100 μL od vtori~noto
protivtelo (protivtelo kon soodvetniot citokin za koe
ima vrzano biotin). Pri negovoto stavawe treba da se
vnimava vrvot na prodol`etokot da ne go dopre nitu
bunar~eto nitu negovata sodr`ina (Slika 11.3, gore).
4. Nosa~ot povtorno se pokriva so samolepliva lenta i se
inkubira eden ~as (±5 minuti) na sobna temperatura. Za
vreme na celata inkubacija nosa~ot vnimatelno se me{a.
6. Site bunar~iwa se plaknat ~etiri pati so pufer za
plaknewe.
7. Vo sekoe od bunar~iwata se dodava po 100 μL na prethodno
pripremeniot zasiluva~kiot (Amdex) rastvor. Dodavaweto
na zasiluva~kiot (Amdex) rastvor se izveduva na ist na~in
Slika 11.4: Mehanizam na dejstvo na zasiluva~kiot rastvor pri opredeluvaweto citokini.
122
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 11: CITOKINI
kako i dodavaweto na vtori~noto protivtelo (Slika 11.4).
8. Nosa~ot se pokriva so samolepliva lenta i se inkubira
30 minuti (±5 minuti) na sobna temperatura. Za vreme na
celata inkubacija nosa~ot vnimatelno se me{a.
9. Site bunar~iwa se plaknat ~etiri pati so pufer za
plaknewe.
10. Direktno od {i{enceto se dodava 100 μL od 3,3’5,5'tetra-metil benzidin (TMB) substratot.
11. Nosa~ot se inkubira 1 ~as (±5 minuti) na sobna
temperatura. Za vreme na celata inkubacija nosa~ot
vnimatelno se me{a. Vo tekot na ovaa inkubacija nosa~ot
ne se pokriva so samolepliva lenta.
12. Se proveruva dali sekoj strip e pravilno namesten vo
svoeto le`i{te i se meri absorbancata na 450 nm, so
pomo{ na spektrofotometar (Victor2).
12. Presmetuvawe na rezultatite. Aparatot Victor2 sodr`i
program za avtomatsko generirawe na standardni pravi od
izmerenite vrednosti za standardite, kako i za avtomatsko
presmetuvawe na nepoznatite primeroci.
Ext (nm)
10
1
0,1
0,01
0,1
1
10
pg/mL
11.3. Zada~a
Da se presmeta koncentracijata na interleukinot 1β spored
protokolot . Konstruiraweto na standardnata prava se
izveduva na Slika 11.5. Ot~itanite i presmetanite
rezultati od citokinote se vnesuvaat vo dadenata Tabela
11.1.
Institut za imunobiologija i humana genetika
Slika 11.5: Bilogaritamski
formular za opredeluvawe koncentracija na citokini.
123
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 11.1: Primer za presmetuvawekoncentacija na
IL-1beta.
Primer
Slu~aj
Stand./
primerok
Ext (nm)
Sredna
vred.(nM)
Konc.
(pg/mL)
Stand./
primerok
St 1
0.067/0.060
0.0635
0.31
St 1
0.31
St 2
0.212/0.221
0.2165
0.63
St 2
0.63
St 3
0.472/0.502
0.487
1.25
St 3
1.25
St 4
1.049/1.082
1.0655
2.5
St 4
2.5
St 5
1.763/2.032
1.8975
5
St 5
5
St 6
2.469/2.391
2.43
10
St 6
10
Poz
2.00/2.10
2.053
5.72
Poz.
Neg
0.082/0.086
0.084
0.31
Neg.
8109
0.066/0.066
0.066
0.25
8139
0.403/0.384
0.3935
1.27
8155
0.066/0.072
0.069
0.26
8175
0.061/0.057
0.93
2.7
8243
0.061/0.054
0.0575
0.22
8249
1.95/1.95
1.95
5.46
8321
0.123/0.124
0.1235
0.44
8324
0.076/0.075
0.075
0.28
8351
0.649/0.669
0.659
2.03
8377
1.619/1.620
1.6195
4.61
8379
0.105/0.103
0.104
0.38
8418
0.079/0.064
0.0715
0.27
8477
0.071/0.060
0.0655
0.25
8501
0.830/0.834
0.832
2.51
Ext (nm)
Sredna
vred.(nM)
Konc.
(pg/mL)
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
124
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 12: ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI
VE@BA 12: ANALIZA NA
KOMPLEMENTEN SISTEM I
CITOKINI
12.1. Normalni vrednosti od
ispituvawe komplementen
sistem
Normalnite vrednosti od komponentite na komplementniot
sistem se razli~ni za deca i za vozrasni, osobeno za K3 i za
K4 i se iska`uvaat vo g/L (Tabela 12.1).
Tabela 12.1: Normalni
vrednosti na K3 i K4 zavisno
od vozrasta na ispitanikot.
Rezultatite od komplementniot sistem mo`at da se
analiziraat kako koncentracija na faktorite, koga
zboruvame za proteinska koncentracija, ili kako aktivnost
(funkcija) na komponentite.
Ako proteinskata molekula koja se sintetizirala nema
biolo{ki efekt, toga{ zboruvame za neefikasen
proteinski faktor (nezrel faktor, nedostatok na aktivnost
na faktorot). Vo takov slu~aj neophodno e istovremeno da
se odreduvaat i koncentracijata i biolo{kata aktivnost
na soodvetniot faktor.
Na Tabela 12.2. dadeni se koncentraciite na proteinite na
nekoi faktori kaj vozrasni lu|e i biolo{kata aktivnost
na nekoi komplementni faktori koi naj~esto se ispituvaat
Institut za imunobiologija i humana genetika
125
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
vo imunologijata. Koncentracijata na proteinite
(komponenti na komplement) se iska`uva vo g/L, dodeka
biolo{kata aktivnost mo`e da se iska`e vo edinici na
litar (E/L), efektivni molekuli na eden mL (ef.mol.mL
(ili kako relativen odnos (%) (Tabela 12.2).
Tabela 12.2: Normalni
vrednosti na komponentite od komplemetniot
sistem i biolo{kata aktivnost na nekoi komplementni faktori.
12.2. Tolkuvawe rezultati od
komplementen sistem
Klini~ki, odreduvaweto na komplementot slu`i za:
- da se otkrie dali komplementniot sistem se aktiviral,
i dokolku ima hipokomplementemia, da se utvrdi dali
se aktiviral klasi~niot ili alternativniot pat na
komplementot;
-da se dijagnosticiraat kongenitalnite defekti na
komplementniot sistem.
Ispituvawata koi se pravat rutinski za evaluacija na
komplementniot sistem, vklu~uvaat odreduvawe na CH50,
merewe na proteinskata koncentracija na K3 i/ili K4,
faktor B, i K1-inhibitor.
12.2.1. CH50
Kaj pacienti koi prv pat odreduvaat komplement, treba da
se napravi ispituvawe na CH50, K3 i/ili K3c, i K4.
126
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 12: ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI
Odreduvaweto na CH50, ni dava informacija za formiraweto na K3 konvertaza i formiraweto na klasi~niot
pat na aktivacija, t. e na toj na~in }e dobieme evaluacija za
K1-K8. Generalno, odreduvaweto na CH50, e skrining test
za dijagnoza na sostojbi asocirani so niska aktivnost na
komplementot. Testot e pomalku korisen za monitoring na
bolesti, bidej}i mu nedostasuva neophodniot stepen na
analiti~ka senzitivnost, koja e potrebna za da se
zabele`uvaat promenite vo koncentraciite na K3 i K4.
12.2.2. K3 i K4
Iako odreduvaweto na K3, ~esto se koristi kako rutinski
laboratoriski test za odreduvawe aktivacija na komplementot, toj e neosetliv parametar i ne se namaluva se
dodeka stapkata na potro{uva~ka ne ja premine na stapkata
na sinteza. No, ovaa sostojba dosta retko se slu~uva, bidej}i
vo pove}eto sostojbi za aktivacija na komplement se javuva
akuten odgovor koj e zdru`en so zgolemeno sozdavawe na
K3. Promeni vo koncentracijata na K3 mo`at da se vidat
kaj aktivna forma na SLE i membransko proloferativen
glomerulonefritis. Vo slu~aj na avtoimuna hemoliti~na
anemija i hereditaren angioneurotski edem, K3 obi~no
ima normalna vrednost dodeka K4 ima namalena vrednost.
Genetskiot nedostatok na K4 e povrzan so visoka
prevalencija na avtoimuni zaboluvawa, posebno so SLE.
ANALIZA NA SLU^AJ
Nedostatok na Faktor I:
Slu~ajot na Momir
Temelkovski,
nekontrolirana
komplementna aktivacija
doveduva do podlo`nost za
infekcii i isip (jade`).
12.2.3. K1-inhibitor
Odreduvawe na K1-esteraza inhibitor e zna~ajno kaj
pacienti so povtoruva~ki angioedemi na ko`a, gastrointestinalen trakt, i trahea.
12.2.4. Hiperkomplementemija
Pove}eto komponenti na komplementot, osobeno, K3, K4, i
K1-inhibitor, se reaktanti na akutnata faza. Za vreme na
vospalenie, tie se sozdavaat ne samo vo crniot drob, tuku
i vo makrofagite. Takvi sostojbi se: sistemski infektivni
bolesti, ne-infektivni hroni~ni vospalitelni zaboluvawa kako revmatiden artrit i fiziolo{ki sostojbi
(kako bremenost). Otkrivawe na zgolemeni vrednosti vo
vakvi slu~ai ne e od osobena va`nost. Kaj aktivnite
zaboluvawa so imuni kompleksi, so aktivacija na
komplement, dobivame redukcija na CH50 ili na koncentraciite na komponentite od komplementot, ako tie
vrednosti ne se namaleni, tuku se normalni, treba vedna{
da se posomnevame na zgolemena sinteza na komponentite
na komplement.
Institut za imunobiologija i humana genetika
127
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
12.2.5. Hipokomplementemija
Hipokomplementemijata e va`en indikator za prisustvo
na bolesti na imuni kompleksi ili za analizirawe na
aktivnosta na zaboluvaweto. Koga se bara klini~ka
asocijacija na hipokomplementemija, mora da se ima na um
deka:
Tabela 12.3: Bolesti kade
{to hipokomplementemijata
e predizvikana od sozdavawe imuni kompleksi.
128
-mnogu ne-imunolo{ki iducirani zaboluvawa, mo`at
da predizvikaat namaluvawe na serumskite koncentracii na komponentite od komplementot. Ovie bolesti
mo`at da bidat multisistemski zaboluvawa so
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 12: ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI
pridru`na redukcija na komplementot, so klini~ka
slika sli~na na vaskulit predizvikan od imuni
kompleksi.
-bolesti na imuni kompleksi mo`at da bidat prisutni
iako ima normalna aktivnost na komplement, vo
prisustvo na odgovor na belkovinite na akutna faza
(CRP).
-komplementnite nedostatoci (deficiencii), kako
rezultat na nasledni sostojbi ili malnutricii, golemo
o{tetuvawe na hepar ili nefrotski sindrom mo`at da
nalikuvaat na sostojbite koi se javuvaat pri aktivacija
Institut za imunobiologija i humana genetika
Tabela 12.4: Bolesti i sostojbi kade {to hipokomplementemijata ne e predizvikana od sozdavawe imuni
kompleksi.
129
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
na bolestite na imuni kompleksi.
Tabela 12.5: Laboratoriski
naodi kaj povtoruva~ki
angioedem.
ANALIZA NA SLU^AJ
Hereditaren
angionevrotski edem (HAE):
Slu~ajot na Ratko Slaveski,
nedostatok na komunikacija
i na komplementna
regulacija.
130
Pribli`no 50% od licata so hereditaren K3 nedostatok
ili nedostatok na eden od komponentite na klasi~niot pat
na aktivacija, imaat klini~ki prisuten SLE ili simptomi
sli~ni na SLE.
Iako hipokomplementemijata e ~est naod kaj bolesti na
imuni kompleksi so vklu~eno bubre`no naru{uvawe, vo
nekoi bubre`ni zaboluvawa predizvikani od imuni
kompleksi, hipokomplementemijata se nao|a mnogu retko
ili nikoga{. Vakvi zaboluvawa vklu~uvaat glomerulopatii kaj [enlain-Henoh (Shonlein- Henoch) purpura, IgA
glomerulopatija, K1kju glomerulopatija, membranozna
nefropatija (idiopatska, inducirana so lekovi, ili od
malignen tumor) i Gud-Pasteroviot (Good-Pasture’s)
sindrom.
12.3. Normalni vrednosti od
citokini
Normalnite vrednosti na nekoi citokini vo telesnite
te~nosti se dadeni vo Tabela 12.6. Nivnata koncentracija
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 12: ANALIZA NA KOMPLEMENTEN SISTEM I CITOKINI
mo`e da se opredeluva vo serum, vo plazma, vo urina ili vo
drugi telesni te~nosti. Koncentracijata na citokinite se
iska`uva vo pikogrami vo eden mL (pg/mL). Normalnite
vrednosti na citokinite vo telesnite te~nosti zavisat od
laboratoriskiot metod so koj se opredeluvaat. Vrednostite
dadeni na Tabela 12.6 se dobieni so ELISA metodot (Tabela
12.6).
Citokin
Normalno
Citokin
Normalno
IL-1alfa
serum 0-5.4 pg/ml
plazma 0 pg/ml
urina 0-4.34 pg/ml
IL-8
serum 1.2-16.7 pg/ml
plazma 0-8.1 pg/ml
urina 0-204.0 pg/ml
IL-1beta
serum 0-1.5 pg/ml
plazma 0 pg/ml
urina 0 pg/ml
IL-10
serum 0-6.8 pg/ml
plazma 1-15 pg/ml
urina 0-2.7 pg/ml
IL-2
serum 0-4.0 pg/ml
plazma 0-6.5pg/ml
urina 0 pg/ml
IL-13
serum 0-6.9 pg/ml
EDTA plazma 0-23.2 pg/ml
urina 0 pg/ml
IL-4
serum 0-4.6 pg/ml
plazma 0 pg/ml
urina 0 pg/ml
IFN
serum 0-1.1 pg/ml
plazma 0-1.5 pg/ml
urina 0-23.5 pg/ml
IL-5
serum 0 pg/ml
plazma 0 pg/ml
urina 0 pg/ml
IFN
serum 0-1.5 pg/ml
plazma 0-2.6 pg/ml
urina 0.5-1.2 pg/ml
IL-6
serum 0-14.9 pg/ml
plazma 0-1.6 pg/ml
urina 0-0.6 pg/ml
TNF
serum 0.9-4.9 pg/ml
plazma 0-1.8 pg/ml
urina 0 pg/ml
Tabela 12.6: Koncentracii
na IL-1 vo serum i plazma
kaj zdravi lu|e.
12.4. Dijagnosti~ko zna~ewe na
citokinite
I pokraj toa {to do deneska se otkrieni golem broj na
citokini, zasega vo rutinskata dijagnosti~ka praksa
zna~ajno e odreduvaweto samo na nekoi od niv (IL-6, IL-8
i TNFalfa (Tabela 12.7). Nivnoto odreduvawe vo telesnite
te~nosti se koristi za procenka na intenzitetot na te{kite
vospalitelni reakcii. Poradi pleotropnoto i redundantno
dejstvo na citokinite seu{te ne e doka`ano deka mo`at da
bidat specifi~en marker za nekoe zaboluvawe, iako vo
posledno vreme e doka`ano deka odredeni zaboluvawa se
rezultat na poremetuvaweto vo citokinskata mre`a.
Odreduvaweto na koncentracijata na citokinite deneska
naj~esto se koristi koga sakame da ja odredime te`inata na
edno zaboluvawe, so ogled na faktot deka prevklu~uvaweto
vo citokinskata mre`a naj~esto korelira so stepenot na
o{tetuvawata karakteristi~ni za dadenoto zaboluvawe.
Ova naj~esto se odnesuva na sistemskite zaboluvawa
povrzani so aktivirawe na vrodeniot ili zdobieniot imun
sistem (na pr. hroni~nata srceva insuficiencija), poradi
{to i doa|a do zna~itelno zgolemuvawe na nivoto na
citokinite vo plazmata. Kaj nekoi zaboluvawa (revmatoidniot artrit, Kron-ovata bolest, Lajmskata bolest i
dr.), doa|a do zgolemeno sozdavawe na citokinite na
““ospalenieto”, kakvi {to se IL-1 i TNF, dodeka kaj drugi
Institut za imunobiologija i humana genetika
131
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 12.7: Indikacii za
odreduvawe na koncentracijata na citokini i citokinski receptori.
Tabela 12.8: Koncentracii
na IL vo plazmata kaj zdravi lu|e i kaj nekoi zaboluvawa.
Klini~ka sostojba
Koncentracija
(pg/mL)
Otfrlawe na presaden bubreg
30-300
Revmatoiden artrit (IL-1beta)
20-230
Septi~en {ok (IL-1beta)
40-1250
Te{ka mozo~na malarija (IL-1beta)
17-131
Eksperimentalna endotoksemija (IL1beta)
60-200
Citokin
IL-6
(plazma/serum)
Zaboluvawe
Zabele{ka
Sepsa, trauma
Dobar prognosti~ki parametar (podobar od CRP)
Pokazatel za stepenot na sistemskoto vospalenie
Pokazatel za stepenot na o{tetuvaweto na organot
Za rana dijagnoza na neonatalna sepsa
Pokazatel za stepenot na periferna hipooksija
Srceva
insuficiencija
IL-6 (urina)
Presaduvawe na
bubreg
Znak za otfrlawe i infekcija na presadeniot bubreg
IL-6 (plazma)
Revmatoiden
artrit
Nespecifi~en marker za aktivnost
rIL-2R
(plazama, serum)
Presaduvawe
Sarkoidoza
Nespecifi~en marker za aktivnost (znak za alarm)
Marker za aktivnost
IL-8 (plazma,
serum)
Sepsa, trauma
Srceva
insuficiencija
Pokazatel za stepenot na sistemskoto vospalenie Za
rana dijagnoza na neonatalna sepsa
Pokazatel za stepenot na periferna hipooksij
IL-8
(bronhoalveolaren lavat)
Pove}ekratna
trauma,
izgorenici
Rana dijagnoza na ARDS (adult respiratory distress syndrome
IL-10 (plazma,
serum)
Pove}ekratna
trauma, operacii,
sepsa
Pokazatel za stepenot na imunosupresija
Marker za rizik od infekcij
TNF (plazma,
serum)
Sepsa
Srceva
insuficiencija
Pokazatel za stepenot na sistemskoto vospalenie
Prognosti~ki parametar za meningokokna sepsa
Negativen prognosti~ki parametar
TNF
(cerbrospinalna
te~nost)
Multipla
skleroza
Meningitis
Marker za aktivnost , osobeno vo slu~aj na bakteriski
meningi
(SIDA i sistemskiot lupus eritematozus) imame namaleno
sozdavawe na IL-2 i IFN-gama, citokini koi mo`at da go
zasilat imuniot odgovor. Podatocite dobieni od
istra`uvawata napraveni kaj pacientite so neonatalna
sepsa, poka`ale deka odreduvaweto na koncentracijata na
citokinite vo plazmata/serumot mo`e da pomogne vo ranata
dijagnoza. Na primer, neonatalnata sepsa mo`e so sigurnost
da se predvidi ve}e prvite nekolku ~asa po ra|aweto
dokolku postoi poka~uvawe na koncentracijata na IL-8 i
IL-6. Za razlika od ova, so dosega upotrebuvaniot metod na
merewe na koncentracijata na belkovinata na akutnata
faza - CRP, toa be{e mo`no duri otkako }e izminat 24-48
~asa. Odreduvaweto pak na koncentracijata na IL-1b koj
cirkulira vo krvta, mo`e da ima prognosti~ka vrednost.
Nivoto na IL-1 vo krvta se zgolemuva 1-2 dena pred da se
javi otfrlawe na presadeniot bubreg. Kaj septi~niot {ok,
pre`ivuvaweto e vo pozitivna korelacija so nivoto na
IL-1b vo plazmata, dodeka pak te`inata na zaboluvaweto
e vo korelacija so koncentracijata na TNF. Nivoto na IL1b se zgolemuva i pri vlo{uvaweto na simptomite kaj
revmatoidniot artrit (Tabela 12.8). Za razlika od IL-1b,
IL-1a e primarno povrzan so kletkite, pa zatoa se sre}ava
kaj odredeni zaboluvawa (na pr. kaj fatalni slu~ai na
cerebralna malarija.
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
132
Institut za imunobiologija i humana genetika
13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
BLOK 5
BLOK 5 - TRANSPLANTACIJA
U^EBNI CELI:
VE@BA 13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO
SOVPADLIV KOMPLEKS (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat:
“ serolo{ki da opredelat glaven tkivno sovpadliv
kompleks.
VE@BA 14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN
TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat:
“ da opredelat genska struktura na glaven tkivno
sovpadliv kompleks;
“ da opredelat haplotipovi na glavniot tkivno
sovpadliv kompleks kaj edna familija.
VE@BA 15. ANALIZA NA GLAVEN TKIVNO
SOVPADLIV KOMPLEKS (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da:
“ tolkuvaat rezultati od glaven tkivno sovpadliv
kompleks;
“ analiziraat slu~ai od transplantacija.
POENI:
PRISUSTVO
1.5 poeni
ZNAEWE
3.0 poeni
VKUPNO: 4.5 poeni
Institut za imunobiologija i humana genetika
133
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
134
Institut za imunobiologija i humana genetika
13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
VE@BA 13: PRIKA@UVAWE
GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV
KOMPLEKS
13.1. Op{to za HLA
13.1.1. [to e HLA
HLA e kratenka od zborovite Humani Leukocitni Antigeni
koi u~estvuvaat vo imuniot odgovor. Toa se zbir od molekuli
(glikoproteini) prika`ani vrz povr{inata na skoro site
kletki koi se sposobni da gi prika`at protivgenite i da
bidat prepoznaeni od limfocitite. HLA molekulite go
kontroliraat imuniot odgovor preku prepoznavawe svoe od
tu|o. Tie pripa|aat na grupata molekuli poznati kako
Imunoglobulinska supergenska familija, vo koja se
vklu~eni imunoglobulinite, T-kleto~nite receptori, KD4,
KD8 i drugi. Glavna funkcija na HLA molekulite e
prika`uvawe na protivgenot (proteinska veriga od
protivgenot) kon T- limfocitite i zapo~nuvawe specifi~en imun odgovor. HLA molekulite gi kodiraat dve
grupi geni, HLA klasa 1 i HLA klasa 2, a funkciite na
dvete grupi se sosema razli~ni.
HLA klasa 1 proteinite gi kodiraat genite HLA-A, HLAB i HLA-Cv (za da se razlikuva od komplementot, podolu
samo kako HLA-C). Klasa 1 molekulite se nao|aat na skoro
sekoja kletka vo ~ovekovoto telo i tie im gi prika`uvaat
protivgenite na citotoksi~nite T limfociti (Tct-Li)
(KD8+ T-Li). Klasa 1 molekulite se izgradeni od dve
verigi (Slika 13.1), te{ka veriga (transmembranski
polipeptid) kodirana od genite za HLA-A, HLA-B i HLAC na kusiot krak od 6 hromozom, i lesna veriga, beta-2
mikroglobulin (koj ne e transmembranski polipeptid, a e
kodiran od gen na 15 hromozom).
HLA klasa 2 proteinite gi kodiraat genite HLA-DR,
HLA-DKu i HLA-DP. Klasa 2 molekulite, sprotivno od
klasa 1 molekulite, se nao|aat samo na B-Li, makrofagite
Institut za imunobiologija i humana genetika
135
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Slika 13.1: Prikaz na klasa 1
nasproti klasa 2 molekulite
od HLA.
i drugi protivgen prika`uva~ki kletki (PPK). Klasa 2
molekulite se sostojat od dva transmembranski polipeptidi, alfa veriga i beta veriga (Slika 13.1). Beta
verigata e mnogu pove}e polimorfna vo sporedba so alfa
verigata. Poradi toa HLA tipiziraweto se vr{i na beta
verigata (HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5,
HLA-DKuB1 i HLA-DPB1).
Razli~ieto na glavniot tkivno sovpadliv kompleks (GTSK)
pome|u individuite od ist vid pretstavuva polimorfizam
na GTSK. Polimorfizmot zna~i prisustvo na pove}e aleli
vo odreden genski lokus kaj razli~ni edinki od ist vid so
pogolema frekvencija od 1% vo populacijata.
Struktura na molekulite od HLA klasa 1 i klasa 2.
Molekulite na HLA klasa 1 imaat po edna kopija od dvata
polipeptidni lanci: te`ok lanec-alfa (α) - polimorfen; i
lesen lanec - beta 2 (β2) mikroglobulin-monomorfen. Genot
koj go kodira (β2) mikroglobulinot e nadvor od HLA
kompleksot i se nao|a na 15-ot hromozom kaj ~ovekot.
Polimorfizmot na HLA-A, -B i -C molekulite e rezultat
na razlikite vo aminokiselinskata sekvenca na te{kiot
lanec na HLA klasa 1. Najve}e od ovie razliki proizleguvaat od nukleotidna supstitucija vo egzon 2 i 3.
Molekulite na HLA klasa 2 se izgradeni od edna alfa i
edna beta veriga. Za razlika od polimorfizmot kaj HLA
klasa 1, koj se dol`i na polimorfizmot na genite za te{kiot
lanec, polimorfizmot na HLA klasa 2 poteknuva od alfa
i beta lancite, a najpolimorfen e egzon 2.
Polimorfizam na genite od HLA. Klasi~ni HLA geni za
136
Institut za imunobiologija i humana genetika
13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
HLA klasa 1 se HLA-A, B i C, a neklasi~ni se HLA-E, F,
G, H, J, K, L. Genite za HLA prva klasa se visoko polimorfni
i do denes (oktomvri, 2006) vo svetot se objaveni 489 aleli
za HLA-A lokusot, 830 za HLA-B, 226 za HLA-C, 9 za HLAE, 21 za HLA-F, 23 za HLA-G, 12 za HLA-H, 9 za HLA-J, 6 za
HLA-K, i 5 za HLA-L lokusot od prata klasa. Za HLA od
vtorata klasa se objaveni 3 za HLA-DRA, 545 za HLA-DRB,
34 za HLA-DKA1, 78 za HLA-DKB1, 23 za HLA-DPA1, 125 za
HLA-DPB1, 4 za HLA-DMA, 7 za HLA-DMB, 12 za HLADOA i 9 za HLA-DOB. Vkupniot broj HLA aleli (oktomvri
2006) iznesuva 2607 od site lokusi (Slika 13.2).
Broj na protivgeni/aleli
So razvojot na molekularnite tehniki, brojot na novootkrienite aleli sekojdnevno se zgolemuva, a novootkrienite aleli se objavuvaat vo posebna baza koja e
dostapna vo nau~nite spisanija i na Internet.
Klasa 1 protivgeni
Klasa 1 aleli
Klasa 2 protivgeni
Klasa 2 aleli
Slika 13.2: Brojot na HLA protivgenite i alelite 19682006.
Godina
13.1.2. Genomska struktura i
polimorfizam
HLA genite se locirani na hromozomot 6p21.31 (kusiot
krak od 6 hromozom) i pokriva podra~je od okolu 3.6 Mbp
(megabazni parovi) zavisno od haplotipot. Klasi~nite HLA
protivgeni se kodirani od HLA-A, -B i -C od klasata 1 i
HLA-DR, -DKu i -DP od klasa 2 podra~jeto. Site klasa 1
geni se so golemina pome|u 3 i 6 kb, dodeka klasa 2 genite se
dolgi od 4-11 kb. Edna od glavnite osobini na HLA e
ekstremno golemiot polimorfizam (razli~ie). Vo
prika`anite podra~ja HLA ima najgolem stepen na polimorfizam vo ~ovekoviot genom. Brojot na poznatite aleli
postojano se zgolemuva (Slika 13.2).
13.1.3. Metodi za tipizirawe na
HLA
Protivgenite se obrabotuvaat vo dve pateki. Vo vnatre{nata pateka virusnite ~esti~ki ili maligno transformiranite kletki sozdavaat vnatrekleto~ni antigeni koi
Institut za imunobiologija i humana genetika
137
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Serolo{ki metodi za
klasa 1 od GTSK
Serolo{ki metodi za
klasa 2 od GTSK
Ekstrakcija na genomska
DNK
Slika 13.3: Dvete pateki za
obrabotka na protvgenite
kako osnova za serolo{kite
metodi i genomskata DNK
kako osnova za molekulskite
metodi.
Molekulski metodi za
klasa 1 i za klasa 2 od
GTSK
se obrabotuvaat vo proteazomite i zaedno so klasa 1 od
GTSK se prika`uvaat vrz povr{inata na kletkata. Vo
nadvore{nata pateka goltnatite (fagocitirani) predizvikuva~i (bakterii i drugo) se obrabotuvaat i se
prika`uvaat vrz povr{inata na imunite kletki zaedno so
klasa 2 od GTSK. Poradi toa, so serolo{ki metodi mo`eme
da gi ispitame molekulite na GTSK prika`ani vrz
povr{inata na kletkata (Slika 13.3).
Vo jadroto na kletkite se nao|aat genite za glavniot tkivno
sovpadliv kompleks i so izolacija na genomskata DNK i
polimerazno veri`na reakcija mo`e da se analiziraat
molekulite na GTSK od klasa 1 i od klasa 2 so molekulski
metodi (Slika 13.3).
Dokolku postoi gen vo DNK za opredelen alel, no toj ne se
prika`uva vrz povr{inata na kletkite, toga{ zboruvame
za nula alel (neiska`an alel). Sekako deka organizmot ne
mo`e imunolo{ki da reagira na nula alelite.
13.1.4. Serolo{ki metodi
Serolo{ki baziranite metodi za HLA koristat protivgen
specifi~ni serumi za da se opredeli HLA tipot kaj
ispitanicite. Serumite se ~ove~ki produkti koi reagiraat
specifi~no so HLA protivgenite prika`ani na povr{inata od belite krvni kletki. Serolo{kata metoda
opredeluva koj tkiven tip od HLA vo belite kletki od
ispitanikot so koj serum reagira, a so koj serum ne reagira.
Posle inkubacijata so koja se ovozmo`uva vreme
protivteloto da se vrze so soodvetnite protivgeni vo
kletkite, se dodava komplement za da se pottikne kleto~noto
138
Institut za imunobiologija i humana genetika
13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
raspa|awe. Potoa reakcijata se gleda pod mikroskop i se
stepenuva zavisno od brjot na umrenite kletki. Tipiziraweto se ozna~uva posle analiza na reakciskite oblici za
razli~ni serumi. Serolo{kata tipizacija e pomalku
specifi~na otkolku metodite za molekularno tipizirawe.
13.1.5. Nomenklatura
Oficijalna nomenklatura koja se koristi za serolo{ka
definicija na protivgenite od HLA e taa na Svetskata
zdravstvena organizacija (SZO). Bukvite (A, B i sli~no)
ozna~uvaat genetski lokus, a brojot soodvetniot protivgen
{to go kodira toj lokus. Brojkite vo zagradi ozna~uvaat
{iroko prisutni protivgeni od koi se razdeluvaat
specifi~nosti (Slika 13.4).
Lokus
Protivgeni
Razdeluvawe
(Split)
Slika 13.4: Serolo{ka nomenklatura za HLA.
13.2. Serolo{ki metodi za
tipizirawe na HLA
Za serolo{ka tipizacija na HLA se koristi testot na
mikrolimfocitotoksi~nost koj gi koristi limfocitite
od ispitanikot kako celni kletki. Postojat pove}e prizvoditeli na kompleti za serolo{ko ispituvawe na HLA.
Podolu }e bide opi{an eden od niv. Vo tekot na ve`bite
mo`no e da bidat upotrebeni i poinakvi kompleti, no tie
zna~ajno ne se razlikuvaat pome|u sebe.
@ivi kletki lesno se izdvojuvaat od periferna krv, limfni
Slika 13.5: [ematski prikaz
na serolo{kite metodi za
opredeluvawe HLA.
Institut za imunobiologija i humana genetika
139
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
jazli, slezina i drugo. Vo ovie serolo{ki metodi se brojat
mrtvite kletki so aktivacija na komplementot (zaja~ki) vo
kombinacija so prisutnite specifi~ni protivgen-protivtelo kompleksi. Reakcijata protivtelo-protivgen-komplement se meri so nabquduvawe na testot pod mikroskop so
zgolemuvawe od 150 pati so fazen kontrast i so vitalni boi
kako {to se Eozin ipislon ili Propidium jodid. Mrtvite
kletki (vrz koi se nao|a protivgen otkrien od specifi~niot
protivserum) }e ja adsorbiraat bojata i poka`uvaat
soodvetna promena na bojata. Negativnite kletki (tie {to
nemaat protivgen otkrien od specifi~niot protivserum)
ostanuvaat `ivi i ja isfrlaat bojata (ostanuvaat neoboeni)
(Slika 13.5).
13.2.1. Neophodni uslovi
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Limfocitna suspenzija se prigotvuva od 10 mL polna
krva zemena so heparin, ACD ili natrium citrat.
Koncentracijata se podesuva do 2-3 h 106 kletki/mL.
Limfocitnata suspenzija mora da se podgotvi
najdocna 48 ~asa od zemaweto krv za da se obezbedat
optimalno `ivi kletki. Suspenzijata se ~uva na
sobna temperatura do upotreba.
Nu`no e `ivite kletki da bidat nad 80% bez
zna~ajno zagaduvawe so ne-limfocitni kletki.
Zagaduvawe so granulociti ili visok broj na nelimfocitni kletki mo`e da dade la`no pozitivni
rezultati.
Zagaduvawe so trombociti mo`e da dovede do
necelosno lizirawe na limfocitite i da dade la`no
negativni rezultati.
13.2.2. Prigotvuvawe limfocitna
suspenzija
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
140
Se zemaat 10 mL polna krv vo vakutajner so heparin,
ACD ili natrium citrat (najdeno e deka EDTA ne
e dobar protivsosiruva~). Se ~uva primerokot do
upotreba na sobna temperatura.
Krvta se centrifugira 10 min na 700-900 g za da se
dobie plazma. Ovaa postapka mo`e da se zabrza so
agregira~ka supstanca kako {to e 5% Dekstran (se
me{aat 2 mL 5% Dekstran so 10 mL polna krv i se
ostavaat crvenite kletki da se istalo`at na 370C
za 15 min).
So Pasterova pipeta vnimatelno se vadi plazmata
(okolu 2 mL) i se prenesuva vo ~ista epruvetka 17 h
100 mm koja sodr`i 5 mL HBSS rastvor. Se me{a
epruvetkata.
Se vnesuvaat 4 mL Fikol-Hipak rastvor (220C) vo
Institut za imunobiologija i humana genetika
13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
~ista epruvetka 17 h 100 mm. Vrz rastvorot od
Fikol-Hipak vnimatelno se nanesuva izdvoenata
plazma.
Epruvetkata se centrifugira 20 min na 700 h g.
Posle centrifugiraweto ednojadrenite kletki se
nao|aat kako tesen sloj pome|u plazmata i rastvorot
na Fikol-Hipak.
Se aspiriraat site ednojadreni kletki od slojot i
se prenesuvaat vo epruvetki 17 h 100 mm. Se razreduva
so 4 mL HBSS.
Se otstranuva supernatantot i kletkite se
resuspendiraat vo 1 mL RPMI-1640 so 20% FTS
(fetalen tele{ki serum).
Se brojat kletkite od suspenzijata vo hemocitometar. Se ocenuva ~istotata, se brojat kletkite
i se podesuva nivniot broj do 2-3 h 106 kletki/mL.
Se izveduva testot na vijabilnost (`ivi i mrtvi
kletki). Se dodava edna kapka Tripan sino i edna
kapka kleto~na suspenzija vo ~ista epruvetka i se
me{a. Epruvetkata se inkubira na sobna temperatura 15 min. Se ispituvaat `ivite kletki vo hemocitometar. @ivite kletki imaat neo{teteni
membrani i izgledaat mazno, dodeka mrtvite kletki
imaat neramna membrana. Limfocitnata suspenzija
e gotova za upoteba za serolo{kiot mikrolimfocitotoksi~en test za klasa 1 so upotreba na isfrawe
na boja. Procentot na `ivi kletki treba da e
najmalku 80%.
13.2.3. Mikrolimfocitotoksi~en test
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Se prigotvuva limfocitna suspenzija so najmalku
80% `ivi kletki bez zna~itelno zagaduvawe so nelimfocitni kletki.
Se vadi plo~kata za HLA serolo{ka tipizacija od
zamrznuva~ i se ostava da se zatopli na sobna
temperatura.
So 50 mkL mikropipeta se dodavaat 1 mkL od
limfocitnata suspenzija (okolu 3.000 limfociti)
na vrvot od sekoe vedrence vnimavaj}i da ne se
dopre specifi~niot protivserum. Vnimavaj da se
sme{aat limfocitite i protivesrumot (Slika
13.6).
Inkubiraj gi plo~kite na sobna temperatura za:
o klasa 1 (isfrlawe na boja)
30 min
o klasa 1 (fluorescencija)
30 min
o klasa 2 (fluorescencija)
45 min
So koristewe na 250 mkL pipeta se dodavaat po 5
mkL od zaja~ki komplement bez da se dopre
specifi~niot protivserum.
Plo~ite se inkubiraat na sobna temperatura za:
o klasa 1 (isfrlawe na boja)
60 min
Institut za imunobiologija i humana genetika
Slika 13.6: Nanesuvawe limfociti, komplement i boja vo
plo~ka za serolo{ko tipizirawe na HLA.
141
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
o klasa 1 (fluorescencija)
50 min
o klasa 2 (fluorescencija)
60 min
So 100 mkL pipeta se dodavaat po 2 mkL filtriran
5% voden rastvor od Eozin Ipsilon kon sekoe
bunar~e i se inkubira na sobna temperatura 3-5
minuti. Se vnimava da ne se dopre specifi~niot
protivserum so pipetorot. Ovaa stapka se skoknuva
ako se koristat fluorescentni boi.
So upotreba na 250 mkL pipeta se dodavaat po 5 mkL
filtriran neutraliziran formalin kon sekoe
vedrence, vnimavaj}i da ne se dopre specifi~niot
protivserum. Ovaa stapka se skoknuva ako se
koristat fluorescentni boi. Vo fluorescentnite
tehniki se dodavaat po 5 mkL od propidium jodid vo
sekoe bunar~e, vnimavaj}i da ne se dopre specifi~niot protivserum.
Se stava kapak vrz plo~kata i se ostavaat plo~kite
na sobna temperatura 15 min za da se stalo`at
limfocitite. Plo~kite oboeni so Eozin Ipsilon
se ~itaat posle eden ~as ili sledniot den. Plo~kite
oboeni so fluoresceinski boi mo`at da se ot~ituvaat posle 30 min ili sledniot den (ot~ituvaweto
na plo~kite oboeni so fluorescentni boi posle 36
~asa mo`at da dadat zgolemeni la`no pozitivni
rezultati).
Testot se ot~ituva mikroskopski na 150 h zgolemuvawe pod fazen kontrast.
13.2.4. Rezultati
Mrtvite kletki (tie koi sodr`at protivgen) ja absorbiraat
bojata, izgledaat pogolemi i potemni i imaat razli~en
oblik na jadroto. @ivite kletki (tie koi nemaat protivgen),
ja isfrlaat bojata, izgledaat posvetli i pomali vo golemina
vo sporedba so mrtvite kletki.
Dokolku se koristat fluorescentni boi, `ivite kletki se
zeleni, a mrtvite kletki se crveni (Slika 13.7).
Posle korekcija za procentot na mrtvite kletki vo
negativnite kontrolni bunar~iwa, testot se stepenuva na
sledniov na~in:
Slika 13.7: Imunofluorescentno boewe na limfociti.
Gore negativen mikrolimfocitotoksi~en test, dolu
pozitiven limfocitotoksi~en test (mrtvi limfociti).
142
% Mrtvi kletki Stepen
Tolkuvawe
0-10
11-20
21-50
51-80
81-100
-
Negativno
Somnitelno negativno
Slabo pozitivno
Pozitivno
Silno pozitivno
Ne~itlivo
1
2
4
6
8
0
Institut za imunobiologija i humana genetika
13. PRIKA@UVAWE GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
13.3. Zada~a
Opredeli ja serolo{kata tipizacija na HLA od plo~ki i
rezultatite vnesi go vo Tabela 13.1 i Tabela 13.2.
Tabela 13.1: Formular-1 za
vnesuvawe rezultati od serolo{ka tipizacija na HLA.
Ime i prezime
Primerok ID
_____________________________________ Pol _________
____________
Etni~ka pripadnost _______________
HLA-ABC (Plo~ka 1)
Bunar~e
broj
1A
1B
1C
1D
1E
1F
2F
2E
2D
2C
2B
2A
3A
3B
3C
3D
3E
3
A1
A1
A1
(36)
A1
36
(80)
A2
A2
28
A2
69
A3
A3
A23
A23
A23
24
80
A24
A24
A25
A25
A25
26
34
6
Rezultat
Specifi~nost
Serum
ID
Neg.
kon.
PFR 1654
PFR 1800
PFR 1656
PFR 1655
PFR 1722
PFR 1725
PFR 1730
PF 1388
P
PFR 1736
PF 378
RF
PFR 1650
PF M013
C
PFR 1649
PFR 1627
PF 145
RN
PFR 1612
PFR 158
Bunar~e
broj
4F
4E
4D
4C
4B
4A
5A
5B
5C
5D
5E
5F
6F
6E
6D
6C
6B
6A
Specifi~nost
A26
A26
25
66
(34)
A30
B18
(A31)
A31
(30)
A31
(30)
A32
A33
A74
25
31
32
33
(26)
(29)
(34)
A74
25
32
(31)
(33)
A74
31
32
33
(29)
(30)
Serum
ID
PF 964 D
Bunar~e
broj
Rezultat
A34
A34
(66)
A34
66
A11
A11
A29
A29
A30
31
PFR 1596
PF 1705
PF 684
AD
PF 1706
PF 1732
PFR 1605
PF 1636
PF 1533
PF 1699
PF 1317
P
PF 1787
PF 1534
PF 1774
A
PF 1845
PF 1185
D
PFR 1588
PFR 1595
7A
7B
7C
7D
7E
7F
8F
8E
8D
8C
8B
8A
9A
9B
9C
9D
9E
9
Specifi~nost
A28
A28
(34)
(66)
A36
B51
B51
52
B51
78
B52
(49)
(51)
B52
(49)
(50)
(63)
B7
B7
13
41
60
61
73
81
(48)
B7
27
73
81
B7
42
81
B8
B8
B44
B44
B44
45
B44
45
76
Serum
ID
PF 1666
A
PF 1477
A
PF 1708
PF 1702
PFR 1738
PFR 1747
PF 1714
PF 1669
PF 1450
A
PFR 1614
PFR 1801
PFR 1840
PF 1813
PFR 1554
PF 1322
PF 1571
PF 219 X
PF 768
AA
Bunar~e
broj
10F
10E
10D
10C
10B
10A
11A
11B
11C
11D
11E
11F
12F
12E
12D
12C
12B
12
Specifi~nost
B45
B45
76
B13
B13
B14
B14
B62
B62
B62
75
(57)
(63)
B62
75
77
(63)
(76)
(B63)
49
51
52
B63
51
52
53
77
(49)
(75)
B38
B38
39
B38
39
B39
B39
64
67
Serum
ID
PF 1483
PF 458
AC
PF 1458
P
PFR 1615
PFR 1659
PF 1387
B
PF 1667
PF 1717
PF 1303
B
PFR 1623
PFR 1664
PF 1017
PF 1677
PF 1695
PF 1330
A
PF 1536
PF 1687
A
Rezultat
Rezultat
Poz.
kon.
Institut za imunobiologija i humana genetika
Izraboteno od: _____________
^itano od: _____________
Kontrolirano od: _____________
Datum: __________ HLA-A ____________________
Datum: __________ HLA-B ____________________
Datum: __________ HLA-C _____________________
Institut za imunobiologija i humana genetika
143
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 13.2: Formular-2 za
vnesuvawe rezultati od serolo{ka tipizacija na HLA.
Ime i prezime
Primerok ID
_____________________________________ Pol _________
____________
Etni~ka pripadnost _______________
HLA-ABC (Plo~ka 2)
Bunar~e
broj
1A
1B
1C
1D
1E
1F
2F
B57
B57
58
B58
57
2E
2D
2C
2B
2A
3A
3B
3C
3D
3E
3
B58
57
(46)
B18
B18
(14)
B49
B49
50
B49
51
52
63
B50
(56)
(62)
(72)
B55
56
(Cw7)
B54
55
57
(56)
(58)
(63)
B55
B55
(67)
B56
B56
(55)
B27
Rezultat
Specifi~nost
Serum
ID
Neg.
kon.
PF 716 N
PF M012
PFR 1593
PFR 1753
PFR 1598
PF 1465
P
PFR 1625
A0
PF 1696
PFR 1664
PF 1352
C
PF 357 Y
PF 1527
PF 1718
PF 1715
PF 1844
PF 1470
A
PFR 1820
Bunar~e
broj
4F
4E
4D
4C
4B
4A
5A
5B
5C
5D
5E
5F
6F
6E
6D
6C
6B
6A
Specifi~nost
B27
B27 47
B35
50
75
(71)
(78)
B35
50
75
(78)
B35
51
52
53
78
B35
51
53
78
B35
53
(62)
B35
53
(75)
B37
B37
B60
B60
B61
60
13
47
B61
60
48
81
B41
B41
B42
B42
7
27
81
Serum
ID
PF 1709
PF 1682
PF 1011
H
PF 932 E
PF 1355
C
PF 1320
C
PFR 160
PF 1402P
PF 917 C
PF 1814
PF 1771
PF 004
RNC
PF 1464
P
PFR 1601
PF 1567
PF 1710
PF 1775
PFR 1804
Bunar~e
broj
7A
7B
7C
7D
7E
7F
8F
8E
8D
8C
8B
8A
9A
9B
9C
9D
9E
9
Specifi~nost
B42
7
81
(73)
B46
54
56
59
(62)
B47
18
37
48
52
(B47)
60
61
(13)
B48
60
(61)
B48
60
(81)
B53
35
(78)
B53
35
(51)
B59
8
B59
8
14
(39)
(73)
B70
45
50
62
75
(35)
(56)
(76)
(78)
B71
46
59
60
(8)
(55)
(56)
(61)
(62)
B73
B73
B75
77
(62)
Cw1
Cw1
Cw2
Serum
ID
PFR 1825
PFR 1586
PF 952 D
PFR 1822
PFR 1799
PF M018
B
PF 1490
PF 1551
PF 436
BD
PFR 1610
PF 1719
PF 1688
A
PF 1678
PF 157
BB
PF 1741
PF 1834
PFR 1831
PFR 1648
Bunar~e
broj
10F
10E
10D
10C
10B
10A
11A
11B
11C
11D
11E
11F
12F
12E
12D
12C
12B
12
Specifi~nost
Cw2
Cw3
Cw3
B46
Cw4
Cw4
(Cw17)
Cw5
Cw5
Cw6
Cw6
Cw7
A2
(28)
Cw7
(28)
Cw8
Cw9
Bw4
Bw4
(A23)
(A24)
Bw6
Bw6
Serum
ID
PF 318
AA
PFR 1590
PF 380 P
PFR 1591
PF 1777
PF 1537
PF 1575
PF 1693
PF 1791
PF 1837
PF 1532
PF 1443
B
PF 1812
PF 1772
B
PF 1769
PF 1566
PF 1574
Rezultat
Rezultat
Rezultat
Poz.
kon.
Institut za imunobiologija i humana genetika
Izraboteno od: _____________
^itano od: _____________
Kontrolirano od: _____________
Datum: __________ HLA-A ____________________
Datum: __________ HLA-B ____________________
Datum: __________ HLA-C _____________________
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
______________________
__________________________
144
Institut za imunobiologija i humana genetika
14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
VE@BA 14: GENSKA STRUKTURA
NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV
KOMPLEKS
14.1. Genska struktura na GTSK i
negovi polimorfizmi
Klasa 1 molekulite se nao|aat na skoro sekoja kletka vo
~ovekovoto telo i tie im gi prika`uvaat protivgenite na
citotoksi~nite T limfociti (Tct-Li) (KD8+ T-Li). Klasa
1 molekulite gi prika`uvaat vnatre{nite (endogeni)
protivgeni. Vnatre{en protivgen mo`e da bide del od
virusen protein ili tumorski proteini. Prika`uvaweto
vakvi protivgeni uka`uva na vnatre{ni kleto~ni o{tetuvawa, koi ako ne se spre~at }e se ra{irat niz ~ovekovoto
telo. Poradi toa, uni{tuvaweto na vakvite kletki e
prednost za teloto kako celina.
Klasa 2 molekulite mu go prika`uvaat protivgenot na
pomaga~kiot T-Li (Tpo-Li). Klasa 2 molekulite prika`uvaat nadvore{ni protivgeni. Nadvore{nite protivgeni
mo`at da bidat delovi od bakteriski kletki ili virusi koi
Slika 14.1: Karta na HLA
podra~jeto.
Institut za imunobiologija i humana genetika
145
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
se goltnati i obraboteni i potoa prika`ani na pomaga~kite
T-Li. Za vozvrat Tpo-Li mo`at da gi aktiviraat B-Li za da
sozdavaat protivtela koi }e ovozmo`at uni{tuvawe na
patogenot.
Da se potsetime deka HLA e lociran na hromozomot 6p21.31
i pokriva podra~je od okolu 3.6 Mbp (megabazni parovi)
zavisno od haplotipot. Klasi~nite HLA protivgeni go
kodiraat sekoe podra~je od HLA-A, -B i -C od klasata 1 i
HLA-DR, -DKu i -DP od klasa 2 podra~jeto. Site klasa 1
geni se pome|u 3 i 6 kb, dodeka klasa 2 genite se dolgi od 411 kb (Slika 14.1). Edna od glavnite osobini na HLA e
ekstremno golemiot polimorfizam (razli~ie). Vo
prika`anite podra~ja HLA ima najgolem stepen polimorfizam vo ~ovekoviot genom. Brojot na poznatite aleli
postojano se zgolemuva (Slika 13.2).
14.2. Molekulski metodi za HLA
tipizacija
So napredokot na molekulskite tehniki i otkrivaweto na
polimerazno veri`nata reakcija (PVR), zapo~nato e HLA
tipizirawe na nivo na DNK molekulata, so {to zna~itelno
se zgolemuva brojot na novootkrienite aleli.
Za molekulskite metodi ne se neophodni `ivi limfociti,
bilo koj izvor na kletki mo`e da poslu`i kako izvor za
izolacija na DNK. Poradi standardizacija na probite i
prajmerite, molekularnoto tipizirawe e poto~no od
serolo{koto tipizirawe. Toa isto taka dava pove}e
informacii i detali na povisoko nivo poradi {to e mo`no
da se identificiraat site aleli kako i protivgeni. Alelite
opredeluvaat koi protivgeni se prisutni vrz povr{inata
na kletkite.
Zaradi unapreduvawe na metodite za HLA tipizacija,
postojano se odr`uvaat me|unarodni HLA rabotilnici na
koi se usoglsasuvaat i standardiziraat metodite za HLA
tipizacija.
14.3. Principi na molekularnite
metodi za HLA tipizacija
14.3.1. SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probing)
SSOP e hibridizaciska tehnika, kade posle amplifikacijata na regionot od interes so PVR sledi hibridizacija
na celnata sekvenca so probnata sekvenca.
146
Institut za imunobiologija i humana genetika
14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
Principot na ovoj priod zna~i deka razli~ni aleli vo
lokusot mo`e da se detektiraat so probi koi gi prepoznavaat
razlikite vo alelite i se koristat za da go detektiraat
komplementarniot region na amplificiranata celna
sekvenca. Za da se izvede toa, potrebno e edna od DNK
ni{kite da bide imobilizirana vo reakcijata. Denes
postojat tehniki za imobilizacija i na celnite i na
sekvencite od probite.
Dokolku e imobiliziran ampplificiraniot produkt, toga{
probata se obele`uva i aplicira. Toa e tradicionalna dot
blot tehnika, imenuvana taka zatoa {to celnata sekvenca e
nanesena kako to~ki na filter ili membrana. Materijalot
mo`e da bide nanesen i kako linija, toga{ procesot e
ozna~en kako slot blot. Dokolku probata e imobilizirana,
a amplificiraniot produkt e obele`en, metodata se
ozna~uva kako reverzna dot blot ili blot dot.
Ovie metodi se pogodni, bidej}i golem broj na primeroci
mo`e da se nanesat vo edine~na dot-blot reakcija, a
primerokot mo`e da se testira za mnogu probi vo edine~na
blot-dot reakcija.
14.3.2. RLS (Reverse Line Strip) – reverzna
hibridizacija
Vo metodata na reverzna hibridizacija se koristat
nitrocelulozni lenti na koi komercijalno se naneseni
oligonukleotidni probi od ednoveri`na DNK (Slika 14.2).
Dvoveri`nata DNK od dobieniot amplificiran produkt
se denaturira so NaOH i se aplicira vo kadi~ka kade se
nao|aat nitro-celuloznite lenti za da se ovozmo`i
hibridizacija so oligonukleotidite probi, pod posebni
hibridizacioni uslovi. Prisustvoto na biotiniliziran
PVR produkt vrzan za specifi~nata proba se detektira so
koristewe na streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) i
hromogen substrat, so dobivawe na sini linii na mestoto na
Slika 14.2: Opredeluvawe HLA
na Institutot za imunobiologija i humana genetika so
avtomatiziran sistem za
reverzna hibridizacija so
aparatot Bee Robotics.
Institut za imunobiologija i humana genetika
147
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
pozitivnata proba.
Pozitivni osobini na RLS:
Metodot na RLS vklu~uva egzon specifi~na amplifikacija,
a alelskata diskriminacija se vr{i vo tek na fazata na
hibridizacija.
+Odedna{ mo`e da se tipiziraat pove}e primeroci
+Lesno za avtomatizacija
+Potrebno e malo koli~estvo na DNK
Negativni osobini na RLS:
- Vremenski dolgotrajno - minimum 4 - 5 ~asa
- Visoka stapka na ambigviteti vo sporedba so SSP
14.3.3. SSP (Sequence Specific Priming)
SSP e tehnika bazirana na PVR, dizajnirana za visoka
rezolucija na pottipovi za HLA klasa 1 i 2. Se koristat
alelski ili grupno specifi~ni prajmeri za amplifikacija
na genomskata DNK vo termalna plo~ka so 96 alveoli vo
termosajkler. Po zavr{eniot PVR ciklus, PVR produktot
se detektira na 2% agarozen gel so elektroforeza.
Pozitivni osobini na SSP:
+Alelska diskriminacija vo fazata na
amplifikacija
+Pomalku ambigviteti vo sporedba so RLS
+Visoka specifi~nost
+Brzina - ne se potrebni specifi~ni post
amplifikaciski proceduri (vremetraewe - 2.5
~asa od izolacija na DNK)
Negativni osobenosti na SSP:
- Te{ko mo`e da se avtomatizira
- Neizbe`ni se mnogu PVR-ii
- Sklonost kon kontaminacija
- Te{ko e da se tipiziraat mnogu primeroci
14.3.4. SBT (Sequence Based Typing)
Naj~esto koristen metod za DNK sekvencionirawe e
dideoksi metodot (od Fred Sanger vo 1970 god.) koj vklu~uva
ekstenzija na kratok prajmer so DNK polimeraza.
Dvoveri`nata DNK se denaturira vo ednoveri`na so
toplina. Potoa, kratok oligonukletiden prajmer se anilira
za edna od edno-veri`nite DNK ni{ki. Za sekoe
sekvencionirawe se koristat ~etiri oddelni reakcii.
Sekoja reakcija sodr`i ednoveri`na DNK koja treba da se
sekvencionira, prajmer {to treba da se anilira za taa
DNK, DNK polimeraza, 4 normalni deoksinukletodni
prekurzori (dATP, dCTP, dTTP, i dGTP) i mala koli~ina
na modificirani prekurzori, dideoksinukleotidi
(ddNTP). Kaj dideoksinukleotidite nedostasuva 3`-OH
grupata koja e neophodna za elongacija na DNK. Koga
148
Institut za imunobiologija i humana genetika
14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
prajmerot }e se ekstendira, DNK polimerazata na nekoe
mesto }e vklu~i dideoksinukleotid namesto normalniot
deoksinukleotid, {to }e ja prekine poli-merizacijata.
DNK verigite vo sekoja reakcija se detektiraat na
poliakrilamidna gel elektroforeza.
14.4. Nivoa na HLA tipizacija
Nivoto na razdeluvawe na molekularnite metodi zavisi od
specifi~nosta na probite koi se upotrebuvaat za
tipizacija. Nekoi probi mo`at da razlikuvaat protivgen
so nisko nivo na razdeluvawe, dodeka drugi probi
ovozmo`uvaat razlikuvawe na alelite so visoko razdelno
nivo (Slika 14.3). Postapkite so niskorazdelno
oligotipizirawe SSP (Sequence Specific Primer) ili SSOP
(Sequence Specific Oligonucleotide Probe) ovozmo`uvaat nisko
do sredno razdelno nivo na tipizirawe.Za visoko razdelno
nivo na tipizirawe denes se koristi metodata na
sekvencionirawe, SBT (Sequence Based Typing) ili
visokorazdelno SSP tipizirawe.
Slika 14.3: [ematski prikaz
na serolo{ki i molekulski
metodi za HLA tipizacija.
14.5. Dvojbenost (ambigvitet)
Nekoi probi koi se upotrebuvaat vo molekulskoto
tipizirawe mo`at da otkrijat prisustvo na nekolku
razli~ni aleli od istiot gen i ne opredeluvaat precizno
koj specifi~en alel e prisuten. Vo takov slu~aj zboruvame
za sredno razdelno nivo ili dvojbenost na rezultatot. Ili
poinaku ka`ano, nemo`nosta da se utvrdi edine~en alel so
~etiri decimalni mesta, se nare~uva dvojbenost ili
ambigvitet. Na primer, HLA-A*02011/012/014/09/30/31 ne
go opredeluva edine~niot alel, tuku dava razli~en (grupen)
rezultat od *02011, ili 02012, ili 02014, ili 0209, ili 0230,
ili 0231.
Institut za imunobiologija i humana genetika
149
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Ambigvitetite mo`at da bidat:
1. Alelski - nemo`nost za dobivawe na edine~en
(nedvojben) rezultat na nivo na aleli, alelite se
tipiziraat kako grupa na aleli. Primer: HLA-A* 02011/
012/014/09/30/31
2. Genotipski - nemo`nost za razdvojuvawe na
oddelnite genotipovi. Primer: HLA-A*0501/03 i
A*07011/012/06 ili HLA-A*0707/09 i A*0802/07.
14.6. Nomenklatura
Ozna~uvaweto HLA aleli za sekoj lokus se vr{i spored
slednata nomenklatura. Se upotrebuvaat ~etiri brojki za
da se identificiraat alelite:
HLA lokusot (A, B, C, DR, DP i DKu) se oddeluvaat so
simbolot * od dvete brojki, koi go ozna~uvaat serolo{kiot
ekvivalent na protivgenot. Posle toa sledat dve brojki
koi go ozna~uvaat specifi~niot alel. Povremeno se
dodavaat dopolnitelni brojki za da se opredeli razli~en
podtip koj se dobiva so nukleotidna substitucija koja ne
vlijae vrz amino-kiselinskata sekvenca i prika`uvaweto
protivgeni vo proteinskiot produkt. Ottuka, HLA-A*03012
e alel od A lokusot koj kodira HLA-A3 serolo{ki
protivgen i e 01 alelski podtip na A3. Toj alel vo isto
vreme ima skriena nukleotidna substitucija koja go
razlikuva od A*03011 (Slika 14.4).
Ne-kodira~kite i intronskite brojki se koristat mnogu
retko. Nula (Null) i Nisko (Low) go definiraat nivoto na
prika`uvawe na alelite vrz povr{inata na kletkite i
isto taka retko se koristi (Tabela 14.1). Nivo na razdvoenost: Nisko
A*02
Sredno
A*0201/0205/0209/0240
Visoko
A*0201
Nisko nivo
Visoko nivo
Gen
Slika 14.4: Nomenklatura na
molekulskoto tipizirawe na
HLA.
150
Yvezda
Alelska
familija
ednkva so
serolo{ki
protivgen
Alelski
podtip
(amino kiselinski
razliki
Nekodira~ki
(sinonimen)
polimorfizam
Intron- N=null
L=low
ski 3'
ili 5'
polimorfizam
Institut za imunobiologija i humana genetika
14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
Nomenklatura
Zna~ewe
HLA
HLA podra~je i prefiks za HLA geni
HLA-DRB1
Opredelen HLA lokus, vo slu~ajov DRB1
HLA-DRB1*13
Grupa aleli koi go kodiraat DR13
protivgenot
HLA-DRB1*1301
Specifi~en HLA alel
HLA-DRB1*1301N
Nula alel
HLA-DRB1*130102
Alel koj se razlikuva vo sinonimska
mutacija
HLA-DRB1*13010102
Alel koj sodr`i mutacija nadvor od
kodira~koto podra~je
HLA-DRB1*13010102N
Nula alel koj sodr`i mutacija nadvor od
kodira~koto podra~je
HLA-DRB1*13X
Ne e napravena visoka razdelnost
HLA-DRB1*13?
Napravena e visoka razdelnost, no bez
diskriminacija
Tabela 14.1: Terminologija
za molekulskoto tipizirawe na HLA genite.
Dvojbenosta nastanuva poradi vkrsteni reakcii na probite
koi se koristat za tipizirawe i se ozna~uvaat so dva simboli
-(crti~ka) ili / (kosa crta).
ƒ
-(crti~ka) zna~i site mo`nosti pome|u prviot i
posledniot naveden broj;
ƒ / (kosa crta) zna~i samo spomenatite mo`nosti.
Kako primer e daden sledniov genotip:
DRB1*0401-04 DRB1*0401 ili 0402 ili 0403 ili 0404
DRB1*0401/04 DRB1*0401 ili DRB1*0404
Genotipot HLA-B*1501/02/05/15/21/45/56/70 zna~i deka
probata ne mo`e da otkrie prisustvo na alelite 03, 04, 06
i sli~no, zatoa nie ne znaeme dali pacientot nema ili ima
aleli 03 ili 04 i ne znaeme koj od navedenite aleli gi ima.
Koga ozna~uvame dvojben rezultat kako {to e vo primerot
za HLA-B*1501/02/05/15/21/45/56/70 mnogu e va`no da ne se
skratuva rezultatot zatoa {to mo`e da se izgubi zna~ajna
informacija koja mo`e da dade precizen rezultat.
Smaluvawe na rezultatot vo gorniot primer samo na HLAB*1501 e pogre{en, zatoa {to vsu{nost pacientot bi mo`el
da ima rezultat HLA-B*1502 ili nekoj tret.
Vo ozna~uvaweto na rezultatite vo laboratorijata mo`no
e da se dade i druga nomenklatura. Toa e alfanumeri~ki kod
vospostaven od National Marrow Donor Program (NMDP). Koga
se dobiva kompleksna nomenklatura, kako vo gorniot slu~aj
so HLA-B*1501/02/05/15/21/45/56/70 razli~nite mo`ni aleli
mo`at da se kodiraat so nekolku bukvi spored nomenklaturata od NMDP:
Institut za imunobiologija i humana genetika
151
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
B*1501/02
=B*15AB
HLA-B*1501/02/05/15/21/45/56/70
=B*15FGR
14.7. Izveduvawe na ve`bata
14.7.1. RLS (Reverse Line Strip)
Protokol za reverzna hibridizacija (RLS) na 13-ta
Internacionalna rabotilnica za histokompatibilnost:
1. Izolacija na genomska DNK so standarden protokol na
fenol-hloroformna ekstrakcija.
2. PVR amplifikacija na egzon 2 i 3 od genite na HLA - A,
- B, i - C so biotinilirani prajmeri (Slika 14.5).
Protokol za PVR na egzon 2 i 3 na HLA-A, B i C
genite
Za HLA-A, -B i C lokus:
1. Master miks za HLA-A, B i C
(koj gi sodr`i prajmerite)
2. MgCl2
3. H2O
4. DNK
Vkupen volumen
30 mkL
15 mkL
10 mkL
5 mkL
60 mkL
Termalen ciklus na amplifikacija:
1. 95oC
5 min
2. 95 oC
1min
3. 62 oC
1min
o
4. 72 C
1min
5. 4 oC
do upotreba
Uspe{nosta na PVR se proveruva so elektroforeza na
2% agarozen gel, oboen so etidium bromid.
Slika 14.5: PVR amplifikacija na egzon 2 i 3 od HLA
klasa 1.
152
Institut za imunobiologija i humana genetika
14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
3. Reverzna hibridizacija – Reverse Line Strip – Roche Molecular
Systems,USA (Slika 14.6).
Po amplificirawe na egzon 2 i 3 od HLA-A, B i C
genite i proverka na uspe{nosta na amplifikacijata,
sledi reverzna hibridizacija na dobieniot produkt. Vo
metodata na reverzna hibridizacija se koristat
nitrocelulozni lenti na koi komercijalno se naneseni
oligonukletodini probi od ednoveri`na DNK. Dvoveri`nata DNK od dobieniot amplificiran produkt se
denaturira so NaOH i se aplicira vo kadi~ka kade se
nao|aat nitroceluloznite lenti za da se ovozmo`i
hibridizacija so oligonukleotidnite probi, pod posebni
hibridizacioni uslovi.
Slika 14.6: Prika~uvawe ednoveri`na DNK na nitrocelulozni lenti.
Uspe{nosta na hibridizacijata se potvrduva so
prisustvoto na sino oboeni linii na mestoto na
pozitivnata proba.
4. Softverska analiza - Reverse Line Strip Pattern
Interpretation Software.
Rezultatite od nitroceluloznite lenti se interpretiraat so poseben kompjuterski program, koj sino
oboenite pozitivni lenti gi identifikuva kako aleli.
14.7.2. SSP (SSP-Sequence Specific Priming)
Protokol za SSP od 13-ta Internacionalna rabotilnica
za histokompatibilnost:
1) Izolacija na genomska DNK so standarden protokol na
fenol-hloroformna ekstrakcija.
2) PVR amplifikacija na genomska DNK so setovi na
alelski specifi~ni prajmeri vo termalna plo~ka so 96
alveoli – High Resolution SSP UniTray, PEL-FREEZ. Vo sekoe
vedrence se nao|a specifi~en zapo~nuva~ za amplifikacija
na odredena sekvenca, rasporeden po opredelen redosled,
Institut za imunobiologija i humana genetika
153
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Slika 14.7: Raspored na zapo~nuva~i vo vedrencata od
termalnata plo~a.
spored proizvoditelot (Slika 14.7 i Tabela 14.2).
Termalen ciklus na amplifikacija:
1. 96oC 5 min.
2. 96 oC 1min.
3. 70 oC 1min.
5 povtoruvawa
4. 72 oC 1min.
5. 96 oC 1min.
6. 65 oC 1min.
21 povtoruvawe
7. 72 oC 1min.
8. 96 oC 1min.
9. 55 oC 1min.
4 povtoruvawa
10. 72 oC 1min.
11. 4 oC do upotreba
}
}
}
3) Detekcija na PVR produktot - elektroforeza na 2%
agarozen gel oboen so etidium bromid.
Tabela14.2: Podgotovka na
primerokot.
Pri analiza na rezultatite so metodata na SSP, se
analiziraat fragmentite dobieni na gel elektroforeza.
Vo sekoja alveola na termalnata plo~ka ima prajmeri za
vnatre{na kontrola, koi amplificiraat fragment so
soodvetna golemina, nazna~ena od proizvoditelot. Prisus-
Broj na reakcii
PVR
pufer (ì l)
Taq DNK
polimeraza (ì l)
Voda
(ì l)
Volumen
na DNK (ì l)
2-8 alveoli
9-12 alveoli
13-16 alveoli
17-24 alveoli
25-32 alveoli
33-40 alveoli
41-44 alveoli
45-48 alveoli
96 alveoli
75.0
85.0
120.0
150.0
200.0
250.0
275.0
300.0
580.0
1.2
1.4
1.9
2.4
3.2
4.0
4.4
4.8
9.3
30.0
34.0
48.0
60.0
80.0
100.0
110.0
120.0
268.0
14.0
15.0
20.0
25.0
34.0
42.0
46.0
50.0
80.0
154
Kone~en
volumen na
DNK i voda
(ì l)
44.0
49.0
68.0
85.0
114.0
142.0
156.0
170.0
348.0
Institut za imunobiologija i humana genetika
14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
Slika 14.8: HLA tipizacija so
metodot na SSP.
tvoto na tie fragmenti na gel elektroforeza ja osiguruva
uspe{nosta na PVR reakcijata. Lentite za vnatre{nata
kontrola na gel elektroforeza mora da bidat prisutni vo
sekoja alveola, so isklu~ok na lentite kade ima specifi~en
produkt, kade mo`e no, ne mora da gi ima. Specifi~niot
produkt, odnosno pozitivnite lenti se fragmenti so
soodvetna golemina na bazni parovi. Specifi~niot prajmer
za oddelen alel se nao|a vo sekoja alveola. Dokolku toj alel
e prisuten vo primerokot za analiza, na gel elektroforeza
}e se zabele`i specifi~en produkt, a dokolku vo
primerokot go nema toj alel nema da ima specifi~en
produkt. Goleminata na fragmentite za sekoj specifi~en
produkt e nazna~ena vo upatstvoto od proizvoditelot.
Pri sekoja gel elekroforeza vo lentata broj 9 se stava
marker so golemina od 50-200 bazni para, za da se sporedat
goleminite na dobienit fragmentite so onie od markerot
(Slika 14.8).
4) Softverska analiza – UniMatch Plus, Version 3.0, PELFREEZ.
So vnesuvawe na brojot na lentite od specifi~en produkt
vo softverot za analiza, se dobiva soodvetniot rezultat.
14.8. Zada~i
14.8.1. Interpretiraj gi alelite za HLA
lokusot od nitroceluloznite lenti
dobieni so metodot na reverzna
hibridizacija (RLS)
Startuvaj go so dvoen klik softverskiot program Dynal
Pattern Matching Program 5.30 (Slika 14.9A).
1. Na po~etok se vnesuvaat podatocite od pacientot za
analiza.
Odberi go kop~eto Browse. Odberi Browse patients→ new
Institut za imunobiologija i humana genetika
155
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
A
B
V
G
Slika 14.9: Interpretacija na
rezultat od HLA klasa 1 so
specijalen softver (Dynal
Pattern Matching Program 5.30).
patient→ vnesi podatoci za pacientot→ next→ vnesi
komentari za pacientot→ next→ finish (Slika 14.9B).
2. Ponatamu se kreira raboten list (worksheet) za sekoj
pacient ili za familijata na pacientot (Slika 14.9V).
Vrati se na Browse. Odberi Browse Worksheets→ Create
new Worksheet. Vo prozor~eto Worksheet ID vnesi go brojot
na pacientot ili familijata za analiza→ vo prozor~eto
sample odberi add a new sample→ vo prozor~eto kit odberi
go lokusot za tipizacija i seriskiot broj na kitot so
reagensite (za sekoj HLA lokus ima soodveten broj od
proizvoditelot)→ vo prozor~eto patient odberi go
pacientot {to vo prethodniot ~ekor go vnese za analiza.
3. Sledi analiza na pozitivnite probi i interpretacija
na rezultatot (Slika 14.9G).
Odberi Save and manually input data→ vnesi gi pozitivnite
probi (sino oboenite lenti)→ odberi interpret→ vo
prozorecot od levata strana }e gi dobiete alelite za
ispituvaniot lokus→ odberi finish.
156
Institut za imunobiologija i humana genetika
14. GENSKA STRUKTURA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
14.8.2. Interpretiraj gi alelite za HLA
lokusot so metodot na SSP na visoko
razdelno nivo
Startuvaj go so dvoen klik softverskiot program UniMatch
Plus v3.0 (Slika 14.10levo).
Od desnoto prozor~e odberi go soodvetniot kit za analiza→
odberi analyze a reaction pattern. Vo prozor~eto {to }e se
pojavi vnesi go vtoriot alel (Slika 14.11), dokolku e poznat
so prethodna analiza so niska rezolucija ili odberi unknown
dokolku ne e poznat.
Vo prozor~eto analysis form vnesi gi podatocite za pacientot,
negovata etni~ka pripadnost, dali se raboti za primatel
ili daritel, podatocite za ispituva~ot, serolo{kite
rezultati od HLA tipizacija, kako i podatoci za kitot koj
go koristime za analiza (Slika 14.12gore).
Slika 14.10: Aktivirawe na
softverot za analiza na HLA
klasa 1 so metodot SSP (UniMatch Plus v3.0).
Odberi select lines→ odberi gi pozitivnite lenti dobieni
od gel elektroforezata i vnesi gi na soodvetnata predvidena
linija. Liniite od skalata na elektroforezata so poznata
dol`ina se ozna~eni so M (Slika 14.12sredina). Potoa
odberi → perfect match. Postoi mo`nost da se odbere i
parcijalna analiza na rezultatot, odnosno so mininum na
gre{ki vo analizata. Takva analiza ne se prepora~uva, no
ponekoga{ e neophodna, osobeno ako sme nai{le na nov
Slika 14.11: Vnesuvawe podatok dali e poznat drugiot
alel vo softverot za analiza
na HLA klasa 1 so meotodot
SSP (UniMatch Plus v3.0).
Institut za imunobiologija i humana genetika
157
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Slika 14.12: Vnesuvawe podatoci za ispitanikot i za
kompletot od HLA klasa 1
(gore), vnesuvawe rezultati od
elektroforezata na specifi~nite amplikoni (sredina),
i dobieniot rezultat od HLA
klasa 1 genotipizacija (dolu)
so specijalen softver za SSP
(Uni-Match Plus v3.0).
Tabela14.3: Formular za
vnesuvawe resultati od
HLA.
alel. Vo prozorecot }e se pojavat alelite i mo`nite
kombinacii na aleli (Slika 14.12dolu).
Rezultatite se vnesuvaat na Tabela 14.3
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
__________________________
____________________________
158
Institut za imunobiologija i humana genetika
15. ANALIZA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
VE@BA 15: ANALIZA NA
GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV
KOMPLEKS
Zna~eweto na glavniot tkivno sovpadliv kompleks (GTSK)
mo`e da bide za:
1. Antropolo{ki studii - odreduvawe i sporeduvawe
na alelski frekvencii me|u populacii i odreduvawe na
vlijanieto na migraciite i etni~koto me{awe vrz
potekloto na populaciite.
2. Bolesti povrzani so GTSK- odreduvawe na
povrzanosta na odredeni aleli so razli~ni bolesti.
3. Transplantacija - odreduvawe na sovpadlivosta me|u
primatelot i potencijalniot daritel pri transplantacija na solidni organi i tkiva vo ramkite na
familijata i kaj nesrodni daruvawa.
Tabela 15.1: Frekvencii na
HLA-A alelite vo makedonskata populacija (216 nesrodni ispitanici ili 432
geni).
15.1. Normalni vrednosti za
glavniot tkivno sovpadliv
kompleks
Normalnite vrednosti za glavniot tkivno sovpadliv
kompleks se iska`uvaat kako frekvencija na opredelni
aleli od HLA vo zdrava populacija, ako se opredeluvani so
molekulski metodi. Naj~esto frekvencijata na alelite se
iska`uva kako decimalen broj so tri decimalni mesta.
Frekvencijata na fenotipovite, odnosno antigenite
opredeleni so serolo{ki metodi se iska`uvaat kako
procenti.
Poradi univerzalnoto zna~ewe, poradi mo`nostite za
etni~ki, populaciski i regionalni sporedbi, kako i poradi
potrebata od globalni analizi (meta analizi), frekvenciite na alelite i na antigenite se skladiraat vo
me|unarodni bazi na podatoci dostapni do site istra`uva~i
i gra|ani vo Svetot.
Institut za imunobiologija i humana genetika
159
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 15.2: Frekvencii na
HLA-B alelite vo makedonskata populacija (216 nesrodni ispitanici ili 432
geni).
Postojat pove}e bazi na podatoci za HLA antigenite i za
alelite, no najpoznati i najkoristeni se:
Bazata za glavniot tkivnosovpadliv kompleks (http::/
www.ncbi.nlm.nih.gov/mhc) i
Bazata
za
alelski
www.allelefrequencies.net).
frekvencii
(http://
Podatocite od alelite za HLA-A, -B, -Cv i za -DRB1 vo
makedonskata populacija se vneseni vo Bazata za alelski
frekvencii. Treba da se pojasni deka podatocite za HLADRB1 se vneseni so ~etiri decimalni mesta, odnosno se
prika`ani alelite, dodeka vo HLA-A, -B, i -Cv se prika`ani
kombinirano: pomaliot del se prika`ani kako aleli, a
pogolemiot del se prika`ani kako grupno specifi~ni
aleli. Ovie razliki proizleguvaat od toa {to podatocite
za HLA-DRB1 se bez dvojbenosti (ambigviteti), dodeka
podatocite za HLA-A, -B i -Cv se so dvojbenosti i treba
dopolnitelno da se genotipiziraat i prika`at kako aleli
(so ~etiri decimalni mesta).
Frekvenciite od HLA-A alelite vo makedonskata populacija poka`uvaat najgolemi frekvencii za HLA-A*02
(0.322), sleduvaat HLA-A*24 (0.132), HLA-A*01 (0.113), i
HLA-A*03 (0.112). Dosega se indentificari vkupno 21
rali~ni aleli, odnosno grupno specifi~ni aleli (Tabela
15.1). Retki aleli vo makedonskata populacija se HLAA*66 (0.002).
Frekvenciite od HLA-B alelite vo makedonskata populacija se prika`ani na Tabela 15.2. Podatocite poka`uvaat
najgolemi frekvencii za HLA-B*51 (0.153), sleduvaat HLAB*35 (0.135), i HLA-B*18 (0.134). Dosega se indentificirani
vkupno 31 razli~ni aleli, odnosno grupno specifi~ni aleli.
Retki aleli vo makedonskata populacija se HLA-B*1401,
HLA-B*3802, HLA-B*4102, HLA-B*45, i HLA-B*4501
(0.002).
Frekvenciite od HLA-Cv alelite vo makedonskata populacija se prika`ani na Tabela 15.3. Podatocite poka`uvaat
najgolemi frekvencii za HLA-Cv*07 (0.243), sleduvaat
HLA-Cv*04 (0.160), i HLA-Cv*12 (0.139). Dosega se
indentificari vkupno 20 rali~ni aleli, odnosno grupno
specifi~ni aleli. Retki aleli vo makedonskata populacija
se HLA-Cv*020201, i HLA-Cv*1403 (0.002).
Frekvenciite od HLA-DRB1 alelite vo makedonskata populacija se prika`ani na Tabela 15.4. Podatocite poka`uvaat
najgolemi frekvencii za HLA-DRB1*1601 (0.149), sleduvaat
HLA-DRB1*1104 (0.139), HLA-DRB1*1101 (0.092), HLADRB1*0101 (0.082),HLA-DRB1*0701 (0.073), i HLADRB1*1301 (0.073). Dosega se indentificari vkupno 29
rali~ni aleli, odnosno grupno specifi~ni aleli. Retki
aleli vo makedonskata populacija se HLA-DRB1*0408, HLADRB1*0804, HLA-DRB1*0806, HLA-DRB1*1307, i HLADRB1*1404 (0.003).
160
Institut za imunobiologija i humana genetika
15. ANALIZA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
15.2. Bolesti povrzani so GTSK
Odredeni bolesti poka`uvaat asocijacija so soodvetni
HLA aleli, a stepenot na povrzanost se opredeluva so
odreduvawe na relativniot rizik (RR).
Tabela 15.3: Frekvencii na
HLA-Cv alelite vo makedonskata populacija (216 nesrodni ispitanici ili 432
geni).
RR mo`e da se presmeta so ravenkata
RR = (N * P+) * (N * K-) / (N * P-) * (N * K+)
N e brojot na pacientite (P) i na kontrolni primeroci (K)
so pozitivni (+) ili negativni (-) HLA aleli.
RR isto taka mo`e da se presmeta dokolku se poznati
soodvetnite frekvencii na alelite:
RR = hp * (1 - hc) / hc* (1 - hp)
Primer: okolu 90% od pacientite koi boleduvat od
specifi~no zaboluvawe imaat ekspresija na HLA antigen
HLA-Bh, koj se nao|a kaj 9% od kontrolnata populacija.
Relativniot rizik toga{ }e bide:
RR = 0.9 (1-0.09) / 0.09 (1-0.9) = 91
Vrednostite na RR> 1 zna~i deka licata koi ja imaat
soodvetnata determinanta imaat zgolemen rizik, dodeka
onie so vrednost RR < 1 imaat pomal rizik za razvoj na
bolesta.
Vo gorniot primer, individuite koi imaat prika`ano HLABh imaat 91 pati pogolema mo`nost da razvijat bolest
otkolku onie koi go nemaat alelot za HLA-Bh. No, toa ne
zna~i deka site lica koi imaat HLA-Bh alel }e zabolat od
taa bolest.
Opi{ani se i pove}e od edna asocijacija za mnogu HLA
determinanti, na primer HLA-DR3, determinanta koja
pripa|a na haplotipot HLA-A1, B8, DR3. Ovoj haplotip e
mnogu ~est vo severna i sredna Evropa i voop{to kaj beloto
naselenie. Se smeta deka ovoj haplotip poka`uva asocijacija
so razvojot na avtoimunite zaboluvawa, no pri~inata za toa
seu{te ne e poznata (Tabela 15.1) .
15.2. Analiza na GTSK asocijacija i bolesti
Za HLA sistemot e karakteristi~na vrzanata neramnote`a
(linkage disequilibrium). Vrzanata neramnote`a pretstavuva
razlika pome|u najdenata frekvencija za odredena
kombinacija na aleli i o~ekuvanata frekvencija spored
frekvencijata na individualnite aleli. O~ekuvanata
frekvencija za kombinaciite mo`e da se presmeta so
mno`ewe na frekvenciite od dvata aleli. HLA alelite na
nekoj lokus, na primer HLA-A1 se ~esto povrzani so
specifi~ni aleli od drugi lokusi, na primer HLA-B8.
Dokolku HLA-A1 se javuva kaj 16% vo populacijata
(frekvencija=0.16) i HLA-B8 vo 9% od taa grupa
(frekvencija = 0.09) se o~ekuva 1.4% od taa grupa da gi
imaat dvata alela (0.16h0.09=0.014). Sepak, podatocite
Institut za imunobiologija i humana genetika
161
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 15.4: Frekvencii na
HLA-DRB1 alelite vo makedonskata populacija (158
nesrodni ispitanici ili
316 geni).
poka`uvaat deka HLA-A1 i HLA-B8 se nao|aat zaedno vo
8.8% od ispituvanite individui. Ovaa razlika e merka za
vrzanata neramnote`a pome|u ovie aleli od HLA klasa 1.
Pokraj toa, frekvencijata na HLA alelite se razlikuva od
onaa na normalnite ili tie kaj zdravata populacija. Na toj
na~in, ~estiot alel vo grupata na pacienti ne sekoga{
zna~i i asocijacija so bolest, osobeno koga toj alel e mnogu
~est vo populacijata.
Od druga strana zgolemenata zastapenost na odreden alel
mo`e da poso~uva na indirektna asocijacija so bolest,
bidej}i toj alel mo`e da bide vo nevrzana ramnote`a so
drugi, cvrsto vrzani aleli. Na primer, kaj idiopatski
membranski glomerulonefritis e najdeno deka ovaa bolest
e povrzana so HLA-B8 so RR od 2.3. Za HLA-DR3, antigen koj
se nao|a vo vrzana neramnote`a so HLA-B8 RR e 12.0.
Antigenite koi se definirani so vrzana neramnote`a vo
populacijata isto taka sozdavaat haplotipovi na familii.
15.3. Asocijacija so haplotipovi
Nekoi bolesti poka`uvaat pogolem stepen na povrzanost
so specifi~en haplotip otkolku so edine~ni antigeni ili
aleli. Takov primer e juvenilniot dijabetes melitus tip 1.
Se smeta deka licata koi imaat HLA-DR3 + HLA-DR4
imaat pogolema mo`nost za razvoj na bolesta, otkolku onie
koi imaat samo HLA-DR3 ili HLA-DR4.
15.4. Zna~ewe na HLA sistemot
vo transplantacija
Za transplantacija na bubreg dovolno e polovina od HLA
genite poma|u davatelot i primatelot da bidat identi~ni
(poluidenti~ni ili haploidenti~ni) za da se prifati
kalemot uspe{no. Poradi toa, za transplantacija na bubreg
e dovolna serolo{ka tipizacija za HLA. Bidej}i roditelite
i decata se sekoga{ poluidenti~ni (osven vo retki slu~ai
pri rekombinacija na HLA genite) davaweto bubreg od
roditel na dete e naj~estata kombinacija (srodni transplantacii).
Za transplantacija na koskena srcevina (TKS), stepenot na
HLA sovpa|awe pome|u daritelot i primatelot se kriti~ni
za uspe{nata transplantacija, ili verojatnosta da se razvie
bolesta kalem protiv doma}in (BKpD) e golema. Taa e
naj~estata forma na otfrlawe vo klini~kite transplantati pri TKS. Vo obid da se minimiziraat vakvite alogeni
odgovori se pravi tipizacija na HLA klasa 1 i klasa 2
genite na daritelot i na primatelot kolku e mo`no
poprecizno.
Me|utoa, poradi isklu~itelniot polimorfizam, HLA
identi~en daritel retko se dobiva. Najgolem del primateli
162
Institut za imunobiologija i humana genetika
15. ANALIZA NA GLAVEN TKIVNO SOVPADLIV KOMPLEKS
Tabela 15.5: HLA asocijacii
so bolesti so zgolemen rizik
za razvoj na bolest.
se podlo`eni na imunosupresivni lekovi za da se spre~i
ili da se zapre alogeniot odgovor, no istovremeno ovoj
nespecifi~en priod go naru{uva imuniot odgovor i toj
stanuva osetliv kon infekcii.
15.4.1. Barawe daritel
Koga se bara daritel za koskena srcevina, prvata stapka e
da se bara pome|u bra}ata i sestrite (sroden daritel). Ako
nema HLA identi~en daritel vo rodninite ili ako
pacientot nema bra}a i sestri, odlukata se bazira vrz
bolesta na pacientot, medicinskite uslovi i HLA
tipizacija vo po{irokata familija (tetki, ~i~kovci,
bratu~edi i sli~no) ili direktno se bara nesroden daritel.
Nesroden daritel se bara niz nacionalnite i internacionalnite registri za transplantacija na koskena srcevina
vo koi ima iljadnici HLA tipizacii, a vo nekoi slu~ai
milioni potencijalni dariteli.
ANALIZA NA SLU^AJ
15.4.2. Tolkuvawe rezultati
Nitu edna molekulska tehnika, sama po sebe ne e dovolna za
dobivawe na edine~en, nedvojben rezultat (rezultat so
~etiri decimalni mesta). Re{avaweto na ambigvitetite e
skapa i iscrpuva~ka rabota, zatoa sekoja laboratorija
razviva sopstvena strategija pri tipiziraweto na
pacientite i kombiniraweto na metodite so cel da se dobie
edine~en rezultat na visoko razdelno nivo vo zavisnost od
opremata i uslovite za rabota.
Tuka }e ja prika`eme strategijata i algoritamot na
Institutot za imunobiologija i humana genetika, pri
tipiziraweto na pacientite za transplantacija na koskena
srcevina (TKS).
Institut za imunobiologija i humana genetika
Bubre`niot kalem kako
komplikacija od avtoimuna
insulin zavisna {e}erna
bolest: Slu~ajot na
Hristijan \oreski: saga za
otfrlaweto i
prifa}aweto organ.
163
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
ANALIZA NA SLU^AJ
Baraweto soodveten daritel za TKS se vr{i vo ramkite na
familijata (srodno daruvawe). Prviot skrining na
potencijalnite dariteli se izveduva so metodot na reverzna
hibridizacija, RLS.
Po zavr{enata reverzna hibridizacija i skrining na
pacientot i potencijalnite donori, voobi~aeno se dobivaat
rezultati so visok procent na ambigviteti, odnosno
tipiziraweto e od nisko do sredno razdelno nivo na
tipizacija.
Bolest kalem protiv doma}in: Slu~ajot na Ilija
Popov, lekuvaweto
predizvika problem.
Pri srodnoto daruvawe, sovpadlivosta pome|u pacientot
i potencijalniot donor mo`e da se identifikuva vrz osnova
na haplotipovite koi gi nasleduvaat od majkata i od tatkoto.
Zaradi toa, pri sekoja tipizacija potrebni se primeroci
krv od site ~lenovi na potesnoto semejstvo (majka, tatko,
brat, sestra), dokolku se dostapni.
Za poprecizni rezultati, ili kade ne postoi mo`nost za
srodno daruvawe, sleduva fazata na barawe nesroden
daritel. Za nesrodnoto daruvawe neophodno e visoko
razdelno tipizirawe, koe kaj nas se izveduva so metodata na
SSP. Nesrodnoto daruvawe za sega se izveduva vo
pogolemite internacionalni centri za transplantacija na
koskena srcevina.
Pacientot i potencijalniot donor, koj e otkrien so metodata
na RLS, se tipiziraat na visoko razdelno nivo so metodata
na SSP, so {to zna~itelno se namaluva procentot na
ambigviteti do poptolno dobivawe na edine~en nedvojben
rezultat.
Tabela 15.6: Formular za vnesuvawe rezultati od molekulska
tipizacija na HLA.
Scenario: Kaj pacientot e dijagnosticirana akutna
mieloidna leukemija. Lekarite prepora~uvaat transplantacija na koskena srcevina.
Zada~a: Pronajdete dali pacientot ima soodveten daritel
od ~lenovite na negovata familija (Tabela 15.2).
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
__________________________
____________________________
164
Institut za imunobiologija i humana genetika
16. TIP 1 PREOSETLIVOST
BLOK 6
BLOK 6 - PREOSETLIVOST
U^EBNI CELI:
VE@BA 16. TIP 1 PREOSETLIVOST (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat:
“ da opredelat vkupen i specifi~en IgE;
“ koi analizi se potrebni za ispituvawe tip 1
preosetlivost.
VE@BA 17. TIP2 I TIP 3 PREOSETLIVOST (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat:
“
da opredelat indirekten
protivglobulinski test;
i
direkten
“ kako se opredeluva koli~inata na cirkulira~kite
imuni kompleksi.
VE@BA 18. ANALIZA NA PREOSETLIVOST (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da:
“ tolkuvaat rezultati od tip 1 preosetlivost;
“ analiziraat slu~ai od tip 1 preosetlivost.
POENI:
PRISUSTVO
1.5 poeni
ZNAEWE
3.0 poeni
VKUPNO: 4.5 poeni
Institut za imunobiologija i humana genetika
165
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
166
Institut za imunobiologija i humana genetika
16. TIP 1 PREOSETLIVOST
VE@BA 16: TIP 1
PREOSETLIVOST
16.1. Reakcii na preosetlivost
Vnesuvaweto protivgeni po primarna imunizacija doveduva
do vtori~na (sekundarna) imunizacija vo najgolem broj
slu~ai, no ponekoga{ mo`e da se razvie preosetlivost
(hipersenzitivnost). Denes razlikuvame pet tipovi
preosetlivost:
Tip 1. Anafilakti~ka preosetlivost;
Tip 2. Citotoksi~na preosetlivost;
Tip 3. Imunokompleksna preosetlivost;
Tip 4. Odlo`ena (kleto~na) preosetlivost;
Tip 5. Stimulaciska preosetlivost.
Vo site reakcii na preosetlivost od tipovite 1-3 vklu~eni
se humoralni protivtela, dodeka od tipot 5 preosetlivost
vklu~eni se protivreceptorski protivtela. Nasproti toa,
vo preosetlivost od tipot 4 vklu~eni se T-limfocitite.
16.2. Odreduvawe vkupen IgE i
specifi~ni IgE protivtela
16.2.1. Alergeni
To~nata alergolo{ka dijagnoza zavisi od vistinskiot
izbor na alergen za testirawe. Vo ovoj del se objasnuvaat
razlikite pome|u alergenite i nivnata primena vo
dijagnosti~kite testovi. Ponekoga{ kaj pacientite mo`e
da se javat simptomi predizvikani od prethodno
neidentifikuvani supstancii koi mo`e da bidat novi
alergeni, pa pacientite treba da se ispituvaat za da se
identifikuva noviot alergen. Sepak, za supstancii kako
boja za pe~atewe tekst, formaldehid, ~ad od cigari, smog,
Institut za imunobiologija i humana genetika
167
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
pamuk, {e}er i ~ove~ki prvut ne postojat dovolno podatoci
za da bidat koristeni kako test alergeni.
16.2.1.1. Vdi{eni (inhalatorni) alergeni
Aeroalergenite koi se dobro poznati kako predizvikuva~i
na IgE posreduvana alergija gi vklu~uvaat polenite, fungi,
algi, `ivotinski otpadoci, insekti, mikrokrle`i,
proteini od hrana, dodatoci na hrana, antibiotici, lekovi
i profesionalni alergeni. Postojat i slu~ai koga ne se
identifikuvani specifi~ni alergeni adekvatni za
dijagnosti~ko testirawe.
Odreduvaweto brojot i vidot na alergeni pogodni za
ispituvawe zavisi od nivnata povrzanost so podatoci od
istorijata na pacientot, vklu~uvaj}i zna~ajna izlo`enost,
objektiven dokaz za alergenosta na supstancata od interes
i od postoeweto na soodveten alergen materijal za
testirawe.
Nekoi poleni poka`uvaat vkrstena reaktivnost i klini~arot mora da bide svesen za nivnoto klini~ko zna~ewe za
da se izbegne nepotrebno udvojuvawe. Koga voobi~aeni
poleni ne predizvkuvaat vkrstena reaktivnost, ispituvaweto i le~eweto so pove}e lokalno prevalentni poleni
mo`e da e neophodno za da se izbegne zna~itelno
proma{uvawe.
Ekstrakti od doma{na pra{ina sodr`at razli~ni
alergeni. Razli~nosta vo sostavot i potentnosta na
alegenite vo komercijalnite ekstrakti od doma{na
pra{ina i dostapnosta na pove}e selektivni alergenski
ekstrakti za ispituvawe na poedine~ni komponenti (na pr.
mikrokrle`i, buba{vaba, epidermi) od doma{nata
pra{ina go namaluva zna~eweto na komercijalniot
ekstrakt od doma{na pra{ina.
Fungite (muvlite) mo`e da dovedat do simptomi na
respiratorna alergija. Tehni~kite pote{kotii vo
izoliraweto na specifi~ni fungalni protivgeni od
sporite ili hifite go ote`nuvaat i karakteriziraweto
na klini~ki zna~ajnite alergeni za nekoi od ovie vidovi.
Za klini~ki celi, fungite mo`e da se klasificiraat kako
nadvore{ni (na pr. Alternaria sp. i Cladosporium sp.) i/ili
vnatre{ni (na pr. Aspergillus sp. Penicillium sp.)
16.2.1.2. Hrani
Momentna preosetlivost posreduvana od IgE kon razli~ni
vidovi na hrana e prakti~no va`na za mali deca i
adolescenti, no treba da se zeme vo predvid vo bilo koja
vozrast ako podatocite od anamnezata sugeriraat na toa.
Skoro sekoja hrana mo`e da bide alergena. Bidej}i
alergenosta e visoko specifi~na za odredena hrana,
nereaktivnost kon nekoja hrana pretstavnik na grupa na
168
Institut za imunobiologija i humana genetika
16. TIP 1 PREOSETLIVOST
sli~ni hrani ne mo`e da se zeme kako dokaz za otsustvo na
reaktivnost kon drugi hrani od taa grupa. Iako mnogu
alergeni od hrana se dobro karakterizirani, seu{te ne
postojat standardizirani ekstrakti od hrana. Ponatamu,
relevantnite alergeni prisutni vo nativnata hrana mo`e
da ne bidat prisutni vo ekstraktot za testirawe. Mnogu
hrani sodr`at protivgeni koi brzo se gubat verojatno
poradi proteoliti~kata digestija za vreme na ~uvaweto,
pa zatoa korisno e testirawe so sve`i prirodni sokovi,
posebno ako postoi somnevawe za alergiski reakcii kon
ovo{je.
Istorijata (anamnezata) na pacientot e najva`na vo
izborot na hrani za testirawe, a nekoga{ treba anamnezata
na pacientot da se dopolni so podatoci za simptomite
posle jadewe spored dieta koja precizno mu e odredena.
Vakov priod e potreben prvenstveno za pacienti so potencijal za anafilaksa predizvikana od hrana.
Kaj deca pomladi od 3 godini, najva`ni alergeni od hrana
se mleko, belka od jajce, kikiriki, soja, p~enka i ovo{ja od
grupata na citroni.
16.2.1.3. Antibiotici, drugi lekovi i
hemikalii
Mehanizmi posreduvani od IgE mo`e da se odgovorni za
nesakani dejstva na mnogu antibiotici, drugi farmacevtski
i biolo{ki proteini. Za mnogu od ovie supstancii seu{te
ne se identificirani relevantnite alergeni ili ne
postojat kako komercijalni ekstrakti za testirawe.
Peniciloil polilizin e reagensot koj se koristi za
otkrivawe na IgE protivtela kon glavnata alergenska
determinanta na penicilinot (peniciloil) i e pozitiven
vo 80% od pacientite osetlivi na penicilin.
Iako pove}eto reakcii na penicilin se dol`at na
senzibilizacija so metaboli~ki produkti {to poteknuvaat
od beta-laktamskiot prsten, specifi~ni determinanti od
strani~niot lanec na razli~ni penicilini mo`e da se
odgovorni za nekoi reakcii na preosetlivost kon betalaktamskite antibiotici.
Ko`ni i in vitro testovi mo`e da se koristat za otkrivawe
na osetlivost kon biolo{ki preparati (insulin, enzimi,
protamin, heparin, intravenski imunoglobulinski
preparati i drugi krvni produkti) i odredeni vakcini koi
sodr`at supstancii so golema molekulska masa vo tragi.
Ne e e dobro poznato kakva e klini~kata vrednost na ovie
testovi.
Mnogu hemikalii (sulfonhloramidi, azotni boi, aromi)
koi se koristat vo hranite kako aditivi, lekovi,
kozmeti~ki preparati mo`e da predizvikaat ili IgE
posreduvani reakcii ili kontakten dermatitis ili i dvete.
Institut za imunobiologija i humana genetika
169
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
16.2.1.4. Profesionalni alergeni
Poka`ano e deka pove}e od 200 supstancii so golema i mala
molekulska masa koi se koristat vo industrijata predizvikuvaat alergiski simptomi so klasi~ni imunolo{ki
mehanizmi.
Koga vnesuvaweto na ovie supstancii e preku respiratorniot pat, naj~esti manifestacii na senzibilizacija se
rinitis, astma i/ili hipersenzitiven pneumonitis. Mnogu
nisko molekularni hemikalii od rabotnite mesta se
poznati kako predizvikuva~i na naj~estata imunolo{ka
profesionalna bolest, alergiski kontakten dermatitis.
16.2.1.5. Razli~ni rastitelni produkti
Mnogu rastitelni produkti kako himopapain, piretrum,
seme od pamuk, psilium i rastitelni gumi se povrzani so
alergiski simptomi.
Prevalencijata na osetlivost i anafilaksa kon lateks
proteinot koj se sodr`i vo medicinskite rakavici, vozduh
i drugi medicinski preparati mnogu e zgolemena i kaj
pacienti i kaj medicinskiot personal. Osetlivite
individui mo`e da reagiraat na lateks vo kateterite,
endotrahealni tubi, delovi koi se instaliraat intravenski
ili drugi bolni~ki materijali koi sodr`at lateks.
Testirawe so lateks protein i/ili drugi rastitelni
produkti mo`e da e indicirano kaj odredeni pacienti, no
treba da se potencira deka standardizirani i dobro
karakterizirani ekstrakti za ovie alergeni seu{te nema.
16.2.1.6. Kontaktni alergeni
Hemikalii, rastitelni smoli i masti se glavna pri~ina
za alergiski kontakten dermatitis.
So pe~ test so 20 do 30 alergeni od skrining panel se
otkrivaat do 70% od site alergiski kontaktni dermatitisi.
Otkrivawe na pri~inata za alergiski kontakten
dermatitis vo individualni slu~ai vklu~uva skrining pe~
testovi, po {to sledat testovi za specifi~ni komponenti
ako postoi mo`nost za nivno odreduvawe.
16.2.1.7. Osnovni principi za vkrstena
reaktivnost me|u rastitelni alergeni
Postoi zna~itelna alergenska razli~nost pome|u polenite
od drva. Isklu~oci postojat kaj nekoi iglolisni drva i
~lenovi na familiite brezi i buki (dab, negundo i leska).
Postoeweto na zaedni~ki protivgeni e pravilo za golema
podfamilija na trevi “severni pastirski trevi”; sepak
170
Institut za imunobiologija i humana genetika
16. TIP 1 PREOSETLIVOST
kompletna vkrstena reaktivnost retko se javuva. Trevite
ma~kina opa{ka i metla imaat dodatni edinstveni
protivgeni koi mo`e da se od klini~ko zna~ewe. Obi~niot
troskot ne reagira vkrsteno so severnite trevi, no
poka`uva mala vkrstena reaktivnost so zapadnite preriski
trevi.
Korovite od slo`enata familija koja go vklu~uva rodot
ambrozija, se potentni senzibilizatori i ekstenzivno
vkrsteno reagiraat. Pelinite (rod Artemisia) silno
vkrsteno reagiraat pome|u sebe. Vkrstena reaktivnost
postoi i kaj korovite diva loboda, {tir i loboda. Kaj
nekoi korovi postoi samo parcijalna vkrstena reaktivnost.
16.2.2. IgE posreduvana alergija
IgE protivtelata sozdadeni po prviot kontakt so odreden
alergen se fiksiraat na povr{inata na mastocitite vo
ko`a i sluznici. Dokolku alergenot koj go predizvikal
sozdavaweto na IgE protivtelata povtorno se najde vo
cirkulacijata (po povtorno vnesuvawe na inkriminiranata
hrana) toj e vrzan od IgE protivtelata fiksirani na
membranata na mastocitite. Rezultat na reakcijata
protivgen-prtoivtelo koja se odviva na povr{inata na
mastocitite e nivna degranulacija pri {to se osloboduvaat
biolo{ki aktivni supstancii (histamin, leukotrieni i
prostaglandini). Ovie pak predizvikuvaat vazodilatacija
i zgolemena propustlivost na krvnite sadovi i se odgovorni
za simptomite karakteristi~ni za alergiskata reakcija
(vospalenie, urtikarija, sekrecija na sluz, ~e{awe ili
kivawe) (Slika 16.1).
Slika 16.1: [ematski prikaz
na mehanizmite vklu~eni vo
sozda-vaweto alergiska reakcija kaj lu|e (tip 1 preosetlivst).
Najserioznata, opasna po `ivot alergiska reakcija e
Institut za imunobiologija i humana genetika
171
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
anafilakti~kiot {ok. Vo ovaa sostojba momentnoto
osloboduvawe na razli~ni biolo{ki medijatori doveduva
do otekuvawe na grloto, bronhokonstrikcija, namaluvawe
na krvniot pritisok, gubewe na svesta, a nekoga{ duri i do
smrt. Hrani koi obi~no se povrzani so ovaa inaku retka
sostojba se kikiriki, morska hrana, jajca i mleko.
16.2.3. Dijagnosticirawe na IgE
posreduvana alergija
IgE posreduvanata alergija e nesakana reakcija kon nekoj
alergen koja naj~esto e lesna za identifikuvawe, najmnogu
zatoa {to postojat doverlivi dijagnosti~ki testovi.
A
B
IgE
Vo rutinska primena se dva na~ini za dijagnosticirawe na
IgE posreduvana alergija. Prviot e injektirawe
(potko`no) na somnitelniot alergen vo podlakticata na
pacientot i sledewe na posledovatelnata reakcija.
Vtoriot, ponov metod podrazbira otkrivawe na cirkulira~ki IgE protivtela kon razli~ni alergeni vo serumot
na ispitanikot vo in vitro uslovi. Pome|u rezultatite
dobieni so primena na dvata metodi postoi visoka
korelacija i taa e nad 90%. Dobrite osobini na
kvantitativnoto odreduvawe na specifi~nite IgE
protivtela se:
1.
Alergen
V
G
rezultatot ne zavisi od eventualno koristenata
terapija;
2. mo`e da se primeni i kaj bolni so silno izrazeni
ko`ni promeni;
3. mo`e da se izveduva bez nikakov rizik po
ispitanikot (od anafilakti~ki {ok na pr.);
4. serumot za ispituvawe mo`e da se zamrznuva pa da
se pravat i sporedbi na koncentracijata na
protivtelata kaj istiot ispitanik vo tekot na
vremeto;
5. posebno e prepora~liv za ispituvawe na deca
pomali od 3 godini bidej}i so edno bockawe (zemawe
krv) mo`e da se ispita prisustvo na IgE protivtela
kon mnogu alergeni).
Relativni nedostatoci na in vitro odreduvaweto na IgE
protivtela se ograni~uvaweto samo na cirkulira~ki
protivtela, a ne i na tie fiksirani na mastocitite i vo
tkivata, kako i negovata visoka cena.
16.2.4. Princip za opredeluvawe
specifi~en IgE
Slika 16.2: Princip za opredeluvawe specifi~en IgE.
172
Specifi~niot IgE se opredeluva so sendvi~ imunolo{ko
opredeluvawe. Alergenite se vrzuvaat za crvsta faza i
reagiraat so specifi~nite IgE protivtelata vo primeInstitut za imunobiologija i humana genetika
16. TIP 1 PREOSETLIVOST
rokot. So IgE protivtelata se otkrivaat fluores-centno
obele`eni protiv IgE protivela (Slika 16.2).
A. Alergenot kovalentno se vrzuva za top~ence (imunokap)
koe {to reagira so specifi~niot IgE vo serumot od
pacientot;
B. Posle isplaknuvawe (isfrlawe) na nespecifi~niot
IgE, se dodavaat protivtela kon IgE koi sozdavaat
kompleksi;
V. Posle inkubacija, se isfrla nevrzaniot obele`en protiv
IgE so plaknewe, a vrzanite kompleksi se inkubiraat so
soedinenie za razvivawe;
G. Posle stopirawe na reakcijata se meri fluorescencijata
na eluatot (ispirokot). Kolku pove}e specifi~en IgE se
vrzal za kugli~kite tolku povisoka fluorescencija se
dobiva. Za da se opredeli koli~estvoto na specifi~en
IgE, serumot od pacientot se sporeduva so kalibraciskite
primeroci.
16.3. Razlikuvawe atopiski od neatopiski bolesti
Poimot atopija ozna~uva lokalna reakcija na preosetlivost tip 1. Najnovata definicija za atopija e deka
atopijata e li~na ili familna tendencija:
„ da se sozdavaat IgE protivtela vo odgovor na
niski dozi alergeni, obi~no proteini i kako rezultat na
toa
„ da se razvijat tipi~ni simptomi kako {to se
astma, rinokonjunktivit ili egzem/dermatit.
Za razlikuvawe atopiski od neatopiski bolesti se koristat
tri alergolo{ki ispituvawa: UniCap Phaditop, UniCap fx5 i
UniCap vkupen IgE.
16.3.1. UniCap Phadiatop
[to meri UniCap Phadiatop? Phadiatop e test so koj se
razlikuvaat atopiskite od neatopiski bolesti. Toj e prviot
~ekor {to se prezema vo ispituvaweto na atopiska alergija.
Testot se sostoi od balansirana me{avina na relevantni
alergeni koi reagiraat so specifi~ni IgE protivtela vo
serumot na pacientot. UniCap Phadiatop uka`uva na atopiska
alergija na voobi~eni di{ni alergeni.
Koja e klini~kata korist od ovoj test? Phadiatop
ovozmo`uva diferencijalno ispituvawe na atopijata. Kaj
deca, tinejxeri i vozrasni, dava odgovor na pra{aweto:
Institut za imunobiologija i humana genetika
173
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
dali simptomite na pacientot se dol`at na alergija?
UniCap Phadiatop dava objektiven odgovor da ili ne:
„pozitiven rezultat uka`uva na atopiska alergija.
Lekarot mo`e da prodol`i so pospecifi~ni testovi za
da go potvrdi alergenot pri~initel;
„negativen rezultat uka`uva deka simptomite ne se
predizvikani od voobi~aeni alergeni i lekarot mo`e
da ispituva drugi mo`nosti.
Kolku se doverlivi rezultatite? Kombinaciite na
alergeni {to se koristat, kako i na~inot na koj se
kombinirani rezultiraat so verojatnost od 90% vo to~no
klasirawe na atopi~ni i ne-atopi~ni pacienti postari od
6 godini.
Klini~kata osetlivost i specifi~nost e sledna:
„osetlivost: 93%;
„specifi~nost 89%.
16.3.2. UniCap fx5
[to meri UniCap fx5? UniCap fx5 e multi-alergenski test
koj uka`uva na prisustvo na IgE protivtela vo serum ili
plazma kon alergeni od soja, kikiriki, mleko, jajca, p~enica
ili riba. Alergenskiot panel pretstavuva voobi~aeni
nutritivni alergeni.
Koja e klini~kata korist od ovoj test? UniCap fx5 e test
za ispituvawe osetlivost kon voobi~aeni nutritivni
alergeni:
„kaj vozrasni i kaj deca, pozitiven odgovor potvrduva
alergija na hrana i treba da bide sleden od testirawa so
posebni nutritivni alergeni;
„ kaj mnogu mali deca (pod 3 godini), ovozmo`uva
potvrduvawe na atopiski status.
Pozitiven rezultat kaj mnogu mali deca potvrduva
osetlivost kon nutritivni alergeni vklu~eni vo testot.
Pojavuvaweto na IgE protivtela tolku rano vo `ivotot e
~esto povrzano so pokasno razvivawe na alergiska bolest.
Zatoa, individuite treba da bidat sledeni za da se vidi
dali razvile simptomi i stanale osetlivi i na drugi
alergeni.
Kolku doverlivi se rezultatite? Osetlivosta i specifi~nosta na fx5 e presmetana i se dobieni slednite
rezultati:
„osetlivost: 89%;
„specifi~nost 96%.
174
Institut za imunobiologija i humana genetika
16. TIP 1 PREOSETLIVOST
16.3.3. UniCap vkupen IgE
[to meri UniCap vkupen IgE? UniCap vkupen IgE
kvantitativno meri koli~ina na vkupen IgE vo serum ili
plazma. IgE se sozdavaat vo organizmot kako rezultat na
povtoruvana stimulacija so alergeni.
Koja e klini~kata korist od testot? Visoki nivoa na
cirkulira~ki vkupni IgE protivtela se obi~no povrzani
so alergii.
Merewe na vkupen IgE:
„obezbeduva vredni informacii za vkupnata opteretenost so alergii;
„obezbeduva uvid vo atopiskiot status na pacientot;
„ vo profesionalna alergija, testot uka`uva na
atopiski status i mo`e da ne postoi povrzanost so
voobi~aeni alergeni, pa e potrebno pospecifi~no
ispituvawe.
Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Koncentracijata
na IgE vo serum e povrzana so vozrasta. Na okolu 10 godini,
vkupniot IgE dostignuva vrednosti koi se odr`uvaat
ponatamu. Kako normalni vrednosti za vkupniot IgE se
definiraat gornite granici bidej}i postoi asimetri~na
distribucija na dobienite vrednosti. Preporaka e sekoja
laboratorija da ima sopstveni o~ekuvani vrednosti.
16.4. Dijagnosti~ki pomagala za
specifi~ni alergii
Protivtelata {to se merat so metodot na UniKap (UniCap)
mo`eme da gi podelime vo ~etiri grupi. Prvite tri grupi
opfa}aat protivtela od trite imunoglobulinski klasi
IgE, IgA i IgG, a ~etvrtata grupa se kleto~ni obele`uva~i
(Tabela 16.1). Globalno, IgE protivtelata uka`uvaat na
alergiski procesi, IgA protivtelata uka`uvaat na
promeni vo mukozno asociranoto limfoidno tkivo
(MALT), dodeka IgG protivtelata uka`uvaat na citotoksi~ni reakcii vo organizmot. Kleto~nite obele`uva~i
uka`uvaat na stepenot (ili intenzitetot) na reaktivnosta
na nekoi kletki vklu~eni vo tip 1 preosetlivost
(eozinofili, bazofili i drugi).
16.4.1. UniCap specifi~en IgE
[to meri UniCap specifi~en IgE? UniCap specifi~en
IgE meri IgE protivtela kon specifi~ni alergeni vo
~ove~ki serum ili plazma. Specifi~nite IgE se pojavuvaat
vo ~ove~kiot serum ili plazma kako rezultat na senzibiInstitut za imunobiologija i humana genetika
175
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 16.1: UniCap testovi
po klini~ki oblasti.
UNICAP TEST
KLINI^KA OBLAST
Inunoglobulin E
alergii, atopija/ne-atopija
diferencijalna dijagnoza
UniCap fx5
alergii, dijagnoza na alergija na
hrana
UniCap vkupen IgE
dijagnoza na alergii
UniCap specifi~en IgE alergii, dijagnoza na specifi~ni
alergeni
Imunoglobulin A
UniCap specifi~en IgA alergii, enteropatii osetlivi
na hrana, celijakija
UniCap glijadin IgA
celijakija
UniCap Phadiatop
Imunoglobulin G
UniCap specifi~en IgG alergii, celijakija, imunoterapija,
UniCap glijadin IgG
bolest na beli drobovi,
avtoimunitet
celijakija
UniCap TPO
tiroiden avtoimunitet
UniCap TG
tiroiden avtoimunitet
Kleto~ni obele`uva~i
UniCap EKP
astma, vodewe na le~ewe so
kortikosteroidi
UniCap triptaza
alergija, anafilaksa
lizirawe so alergen i mo`e da se otkrijat posle povtorno
izlo`uvawe.
Koja e klini~kata korist od testot? Mereweto na
cirkulira~ki IgE protivtela kon specifi~en alergen
obezbeduva objektivno merewe na senzibilizacijata so
alergenot. Denes za ispituvawa postojat pove}e od 450
alergeni.
Merewe na specifi~ni IgE pomaga vo identifikuvaweto
na predizvikuva~kite alergeni, predviduva rizik za
alergisko zaboluvawe i gi naso~uva klini~kite odluki:
- Identifikuvawe na predizvikuva~ki alergeni.
Odreduvawe na reaktivnost kon nekoj alergen
obezbeduva informacii za mo`nite pri~initeli na
alergiski simptomi i vospalenie. Mereweto na IgE
zaedno so informaciite za vozrasta, simptomite,
klini~kite uslovi i vremeto koga simptomite se
vidlivi mo`e da pridonesat za lekuvawe na pacienti so
atopi~en ekzem, alergiski bronhitis, rinitis,
konjuktivitis i astma.
- Predviduvawe na iden razvoj na alergija.
176
Institut za imunobiologija i humana genetika
16. TIP 1 PREOSETLIVOST
Posebno kaj mali deca, raniot IgE odgovor mo`e da gi
napravi individuite podlo`ni na idna osetlivost kon
alergeni. Mereweto IgE kaj mali deca ovozmo`uva
sledewe na razvojot na atopijata.
- Naso~uvawe na klini~kite odluki kaj mladi so
atopi~en dermatit.
Za nekoi alergii na hrana vrednosta kEA/L (kilo
edinici specifi~en alergen na eden litar) na
specifi~nite IgE mo`e da bide od korist.
Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Zdravite
individui imaat mnogu niski nivoa na specifi~ni IgE vo
krvta, normalno pod 0.35 kEA/L (kilo edinici specifi~en
alergen vo eden litar). Senzibiliziranite pacienti
poka`uvaat zgolemeni nivoa, nad 0.35 kEA/L. UniCap
specifi~nite IgE otkrivaat IgE protivtela vo interval
0.35-100 kEA/L. Rezultatot se izrazuva kvantitativno,
kako nivo ili kako klasa specifi~en IgE (Tabela 18.2) .
Klini~kata osetlivost i specifi~nost e sledna:
„osetlivost: 89%;
„specifi~nost 91%.
16.4.2. UniCap specifi~en IgA
[to meri UniCap specifi~en IgA?UniCap specifi~niot
IgA meri IgA protivtela specifi~ni za protivgeni vo
serum i plazma. Specifi~nite IgA protivtela se del od
normalnata imunolo{ka odbrana na organizmot. Prisutni
se vo sekreti kako plunka, vo sluznici, kako i vo krvta.
Nivoto na specifi~ni IgA se zgolemuva koga imuniot
sistem odgovara, na primer, na nutritiven alergen.
Slednite protivgeni se otkrivaat vo IgA sistemot:
glijadin (AGf98), α-laktalbumin (AGf76), β-laktalbumin
(AGf77) i kazein (AGf78).
Koja e klini~kata korist od testot? Vo serum, visoki
nivoa na specifi~ni IgA kon alergeni od hranata mo`e da
uka`uvaat na zgolemena izlo`enost na vakvi alergeni
poradi o{tetuvawe na crevnata sluznica. Kaj celijakija,
na primer, nivoata na specifi~ni IgA protivtela kon
glijadin se zna~ajni za dijagnoza na bolesta.
Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Kaj zdravi
individui, nivoata na specifi~ni IgA protivtela kon
razli~ni protivgeni variraat zna~ajno vo zavisnost od
izlo`uvaweto. Za da se odredi dali nivoata se zgolemeni,
referentnoto nivo na specifi~no IgA protivtelo mora
da se meri na pove}e primeroci od zdravi individui i, ako
e mo`no, da se sporedi so nivoata na IgA kaj bolni
individui. Ne postojat prepora~ani grani~ni vrednosti
za specifi~ni IgA protivtela bidej}i tie se obele`uva~i
za izlo`enosta na protivgeni i ne se direktno povrzani so
Institut za imunobiologija i humana genetika
177
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
bolest. Rezultatite variraat vo odnos na eden protivgen,
kako i pome|u razli~ni protivgeni. Geografskite
varijacii se isto taka va`ni.
16.4.3. UniCap glijadin IgA
[to meri UniCap glijadin IgA? UniCap glijadin IgA
meri specifi~ni IgA protivtela protiv glijadin vo
~ove~ki serum i plazma. Glijadin e frakcija na glutenot
rastvorliva vo alkohol, a koja se sretnuva vo p~enica,
ja~men, r` i oves.
Koja e klini~kata korist od ovoj test? Nepodnesuvawe
na glijadin mo`e da dovede do celijakija, koja e enteropatija
so osetlivost na hrana {to trae cel `ivot, a se
karakterizira so o{tetuvawa na sluznicata na tenkoto
crevo po zemawe na hrana. Mereweto na IgA i IgG kon
glijadin e prviot ~ekor vo ispituvaweto na pacientite
suspektni za celijakija i vo podobruvaweto na le~eweto na
ovie pacienti. Mereweto na IgA protiv-glijadinski
protivtela so UniCap glijadin IgA e va`no vo nekolku
sostojbi.
- Vo dijagnoza:
- kako prv ~ekor vo ispituvawe na pacienti so simptomi
na celijakija;
- vo otkrivawe na asimptomatski bolni od celijakija i
bolni so rizik za razvivawe na pridru`ni bolesti na
celijakija;
- kako dodatok za biopsija za dijagnoza na celijakija.
- Vo sledewe na le~eweto:
A. Dieta bez gluten:
- da se proceni vremeto za koe }e se postigne remisija po
dietata (toa e razli~no kaj razli~ni lu|e);
- kako povtoren rezultat za sledewe na bolesta.
Niska koncentracija na IgA protivtela po eliminirawe na glutenot uka`uva na mo`na remisija i ~esto
dobro korelira so simptomite.
B. Izlo`uvawe na gluten:
- da se poka`e relaps na bolesta, normalno za nekolku
nedeli do nekolku meseci po izlo`uvaweto (razli~no
kaj razli~ni lu|e).
Nivoto na protiv-glijadinski protivtela brzo se
zgolemuva kako odgovor na primawe na gluten i se
koristi za sledewe na pacientot za vreme na izlo`uvaweto.
Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Kaj 192 zdravi
subjekti, na vozrast od 2-74 godini se poka`aa 95-ti
percentil od 3.5 mg/L.
178
Institut za imunobiologija i humana genetika
16. TIP 1 PREOSETLIVOST
16.4.4. UniCap specifi~en IgG
[to meri UniCap specifi~en IgG? UniCap specifi~en
IgG meri protivgen-specifi~ni IgG protivtela vo
~ove~ki serum ili plazma. Ovie protivtela se del od
prirodnata odbrana na organizmot i se sozdavaat vo krvta
kako odgovor na dopir so tu|i supstancii. Kaj avtoimuni
bolesti protivtelata se naso~eni kon sopstveni
protivgeni (avtoprotivgeni).
Koja e klini~kata korist od testot? Sozdavaweto na
IgG protivtelata e del od kompleksni nastani so koi
organizmot se obiduva da go inaktivira i uni{ti ili da go
otstrani protivgenot. Taka prisustvoto na IgG protivtela
specifi~ni za nekoj protivgen e siguren pokazatel za
izlo`enost na toj protivgen. Nivoto na IgG protivtela
obi~no uka`uva na intenzitetot na izlo`uvaweto.
So merewe na specifi~nite IgG protivtela se obezbeduvaat vredni klini~ki informacii vo pove}e poliwa.
Alergiski bolesti
Kaj alergiski bolesti, specifi~nite IgG se koristat:
- vo klini~ki studii na astma, rinitis, urtikarija,
ekzem i gastrointestinalni poremetuvawa;
- kako obele`uva~ za izlo`enost kaj razli~ni bolesti
na belite drobovi; na pr. alergiski alveolitis,
aspergilom i aspergiloza.
Alergija na hrana
Protivgen specifi~ni IgG protivtela se mereni kaj
pacienti somnitelni za alergija na hrana:
- prisustvoto na IgG protivtela e znak za izlo`enost;
- nivoto na specifi~ni IgG protivtela e od dijagnosti~ka va`nost za odredeni nutritivni protivgeni,
kako glijadin.
Imunoterapija
Vo sledewe na imunoterapija so inhalira~ki alergeni
i otrov od tvrdokrilci, zgolemenite nivoa na
specifi~ni IgG:
- poka`uvaat generalna (no ne definitivna) povrzanost
so klini~kiot ishod;
- poka`uvaat deka imuniot sistem odgovara na
terapijata.
Avtoimunitet
Zgolemeni nivoa na specifi~ni IgG protivtela kon
protivgeni kako tiroidna peroksidaza i tiroglobulin
mo`e:
- da uka`at deka pacientot strada od avtoimuna bolest;
- pomognat vo dijagnozata na bolesta.
Institut za imunobiologija i humana genetika
179
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Nivoto na
specifi~ni IgG protivtela kaj zdravi lica kon razli~ni
protivgeni mo`e da varira zna~itelno, zavisno od
izlo`enosta. Za da se odredi dali nivoata se zgolemeni
mora da se izmerat referentni vrednosti za IgG na pove}e
primeroci na serum od zdravi lica i tie da se sporedat so
nivoata na IgG na bolnite.
Ne postoi grani~na vrednost za specifi~ni IgG
protivtela, bidej}i tie se obele`uva~i za izlo`enost na
protigen i ne se direktno povrzani so bolest. Rezultatite
variraat za eden protivgen i pome|u razli~ni protivgeni.
Geografskite razliki se isto taka va`ni.
16.4.5. UniCap glijadin IgG
[to meri UniCap glijadin IgG? UniCap glijadin IgG meri
specifi~ni IgG protivtela protiv glijadin vo ~ove~ki
serum i plazma. Glijadin e frakcija na glutenot
rastvorliva vo alkohol, a koja se sretnuva vo p~enica,
ja~men, r` i oves.
Koja e klini~kata korist od ovoj test? Nepodnesuvawe
na glijadin mo`e da dovede do celijakija, koja e enteropatija
so osetlivost na hrana {to trae cel `ivot, a se
karakterizira so o{tetuvawa na sluznicata na tenkoto
crevo po zemawe na hrana. Mereweto na IgA i IgG kon
glijadin e prviot ~ekor vo ispituvaweto na pacientite
suspektni za celijakija i vo podobruvaweto na le~eweto na
ovie pacienti. Ovoj test ovozmo`uva selektiven skrining
na somnitelnite i rizi~nite grupi za celijakija.
Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Kaj 192 zdravi
subjekta, na vozrast od 2-74 godini se poka`aa 95-ti
percentil od 3.5 mg/L.
16.4.6. UniCap eozinofilen katjonski
protein (EKP)
[to meri UniCap EKP? UniCap EKP go meri nivoto na
eozinofilni katjonski proteini (EKP) vo serum. EKP e
silno citotoksi~en protein koj go ima vo eozinofilnite
granuli. Eozinofilite se kletki, glavno odgovorni za
predizvikuvaweto vospalenie karakteristi~no za astma.
Koga eozinofilite vo di{nite pati{ta se aktiviraat ,
tie se obezzrnuvaat (degranuliraat) i predizvikuvaat
o{tetuvawe i odlupuvawe na di{niot epitel. Ova mo`e
da ja zgolemi preosetlivosta i da dovede do hroni~na
vospalitelna bolest na di{nite pati{ta. EKP se
osloboduva od aktiviranite eozinofili za vreme na
vospalitelniot proces.
Koja e klini~kata korist od ovoj test? Astmati~nite
pacienti so eozinofilsko vospalenie imaat zgolemeni
180
Institut za imunobiologija i humana genetika
16. TIP 1 PREOSETLIVOST
nivoa na EKP vo serum i drugi telesni te~nosti kako
bronhijalen i alveolaren sekret i plunka. Koli~inata na
EKP vo serumot e objektivna merka za eozinofilskiot
vospalitelen status kaj astmata. Visoko nivo na EKP
uka`uva na vospalenie, {to e rizik faktor za astma.
Mereweto na EKP vo serum mo`e da se koristi:
- za sledewe na vospalenieto kaj astma;
- za vodewe na le~eweto so kortikosteroidi kaj astma;
Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Kaj normalni
vozrasni se izmereni vrednosti so geometriska sredina od
4.4 mkg/L i 95-ti percentil od 11.3mkg/L. Vrednosti nad 15
mkg/L treba da se smetaat za zgolemeni. Sepak, pacientite
treba da bidat svoja kontrola vo sledeweto na lekuvaweto.
16.4.7. UniCap triptaza
[to meri UniCap triptaza? UniCap triptaza meri nivo
na triptaza oslobodena od mastocitite vo serum. Mastocitite imaat klu~na uloga vo alergiskite reakcii i
nivniot broj se zgolemuva vo uslovi na vospalenie. Koga se
aktivirani, tie osloboduvaat razli~ni medijatori koi
vodat do simptomi na alergiski reakcii, kako anafilaksa.
Ovie medijatori vklu~uvaat triptaza i histamin.
Koja e klini~kata korist od testot? Triptazata se
osloboduva vo cirkulacijata otkako kaj pacientot se slu~i
anafilakti~ka reakcija predizvikana od lekovi, otrovi
od insekti i hrana. Ova zgolemuvawe na koli~inata na
triptaza mo`e da pomogne vo ispituvaweto stepenot na
reakcijata.
UniCap triptaza mereweto na primeroci od serum od zdravi
individui i primeroci od serum od pacienti so anafilaksa,
poka`a jasno razdeluvawe na dve grupi. Zgolemeni nivoa
na triptaza uka`uvaat na:
- anafilaksa {to se dol`i na lekovi, ubod od insekti
ili hrana;
- mastocitoza.
Nivoto (ili koncentracijata) na triptaza se zgolemuva i
vo nazalnite te~nosti kaj:
- aktiven alergiski rinitis;
- izlo`uvawe na alergen kaj pacienti so alergiski
rinitis.
Kakvi vrednosti treba da se o~ekuvaat? Kaj normalni
lica na vozrast od 2-74 godini se izmereni vrednosti so
geometriska sredina od 5.6 mkg/L i 95-ti percentil od 13.5
mkg/L. Zgolemeno nivo na triptaza obi~no mo`e da se
izmeri vo vreme 3-6 ~asa po anafilakti~ka reakcija. Toa
se vra}a na normala 12-14 ~asa po osloboduvaweto.
Institut za imunobiologija i humana genetika
181
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Primerocite e najdobro da se sobiraat pome|u 15 minuti i
3 ~asa po nastanot za koj se misli deka }e predizvika
aktivacija na mastocitite.
16.5. Zada~i
16.5.1. Odredi vkupen i specifi~en IgE
vo serum
UniKap (UniCap) e avtomatiziran laboratoriski sistem
koj od primerok na krv obezbeduva kvantitativni rezultati
za koncentracijata na specifi~ni i vkupni IgE
Slika 16.2: UniKap-100 (UniCap-100) avtomatiziran laboratoriski sistem na Institutot za imunobiologija i
humana genetika, Medicinski
fakultet, Skopje.
protivtela. Kvalitetnata informacija dobiena na ovoj
na~in pomaga vo dijagnosticiraweto i donesuvaweto na
odluki vo lekuvaweto na alergiskite bolesti (Slika 16.2).
Slika 16.3: Po~etniot ekran
za vklu~uvawe na aparatot
UniKap-100 (UniCap-100).
182
Institut za imunobiologija i humana genetika
16. TIP 1 PREOSETLIVOST
Prvo se vklu~uva kompjuterot, a vedna{ potoa aparatot.
So dvojno kliknuvawe na ikonata ImmnunoCAP Information
Data Manager se vleguva vo programata (softver) preku koja
se povrzani aparatot i kompjuterot.
Otkoga }e se vklu~i progarmata na ekranot so slika se
prika`ani dvata aparata (UniCap 100 i UniCap 101), a pod
niv na dolniot del se gledaat ikoni preku koi se kontrolira
rabotata. Vedna{ pod slikata na aparatot mo`e da se vidi
dali aparatot e vklu~en (vo toj slu~aj ima `olto svetlo i
pi{uva “free”-slobodno), isklu~en (crveno svetlo i pi{uva
“off-line”) ili ako raboti imame zeleno svetlo i pi{uva
“assay” (Slika 16.3). Koga }e vidime deka aparatot ja
postignal potrebnata temperatura i se povrzal so
kompjuterot (toa se gleda so `olta boja na ekranot ili na
ekranot od samiot aparat pi{uva: prepare run? (podgotvi se
za rabota)), kliknuvame edna{ na ikonata na dolniot del
od ekranot na koja pi{uva “reqest” (barawe) ili pritiskame
Slika 16.4: Ekranot za vnesuvawe primeroci na aparatot
UniKap-100 (UniCap-100).
F2. Toga{, ni se prika`uvaat site pacienti koi dotoga{
se izraboteni. Od desnata strana na ekranot ima 3 ikoni
preku koi se vnesuvaat novi pacienti (ikonata so oznaka
“new”), se otvaraat ve}e izrabotenite (ikona – “open“) ili
se bri{at nekoi podatoci (ikona – “delete” ) (Slika 16.4).
Pod niv ima naredbi so ~ie selektirawe mo`e da se vidat
site izraboteni pacienti, onie koi ne se po~nati da se
rabotat, onie koi vo momentot se rabotat i podatocite ili
rezultatite koi sme go odobrile ili odbile. So klik na
prvata ikona (“new”) vleguvame vo programata kade{to se
vnesuva laboratoriskiot broj na pacientot i kade{to se
biraat analizite koi treba da se izrabotat. Vo kvadrat~eto
so oznaka “Sample Id” se vnesuva laborato-riskiot broj na
pacientot i se pritiska “enter”. Sega od stranata ni se
aktiviraat dve ikoni od koi vo prvata gi ima site testovi
koi se rabotat so ovoj aparat,a vo vtorata se testovi koi se
rabotat spored dijagnozata na pacientot i tie se narekuvaat
paneli. So klik na prvata ikona "add test" se poka`uva
tabela koja e podelena na dva dela i od levata strana se
Institut za imunobiologija i humana genetika
183
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Slika 16.5: Ekranot za vnesuvawe alergeni (paneli) na
aparatot UniKap-100 (UniCap-100).
metodite koi se rabotat na ovoj aparat. Metodot se bira so
negovo ozna~uvawe i pritiskawe na “enter”. Na desnata
strana se nao|aat specifi~nite alergeni koi se biraat na
ist na~in. Potoa se zatvora tabelata i se kliknuva na
ikonata “save” za da se zapametat baranite podatoci. Na
ovoj na~in se vnesuvaat site pacienti (Slika 16.5).
Po vnesuvaweto na pacientite i nivnite analizi se vra}ame
so pritiskawe na ikona na koja {to pi{uva “back” na
po~etnata strana (stranata na koja {to ima slika od
aparatite). Potoa kliknuvame dva pati na aparatot koj
{to sakame da go pu{time. Ni se otvaraat dve tabeli. Na
levata strana gi gledame site metodi koi se rabotat so ovoj
aparat i so kliknuvawe na praznite kvadrat~iwa se biraat
metodite koi planirame da gi rabotime (Slika 16.6). So
samoto birawe na metodot na desnata strana ni se
prika`uvaat site laboratoriski broevi na vnesenite
neizraboteni pacienti koi gi sodr`at baranite analizi.
Otkoga }e go odbereme metodot i }e ni se poka`at na
ekranot pacientite koi treba da se rabotat po~nuvame so
Slika 16.6: Ekranot za izbor
na metodite koi sakame da gi
rabotime na aparatot UniKap-100 (UniCap-100).
184
Institut za imunobiologija i humana genetika
16. TIP 1 PREOSETLIVOST
Slika 16.7: Ekranot za izbor
na pacientite koi sakame da
gi rabotime na aparatot UniKap-100 (UniCap-100).
nivno selektirawe na ist na~in odnosno so kliknuvawe na
kockite pred laboratoriskiot broj.
Na dolniot del od stranata od levo se gledaat podatocite
za kalibraciite, a od desnata strana se gleda kolku prazni
mesta ima ostanato vo aparatot. Vkupniot broj na alergeni
koi mo`e da se izrabotat so edno vklu~uvawe na aparatot
e 44 (Slika 16.7). Otkoga }e se napolni aparatot, odnosno
}e se vnesat site pacienti i brojot na analizi }e dostigne
44 se kliknuva na ikonata ozna~ena so "send" so{to
zapo~nuva prefrluvaweto na podatocite od kompjuterot
vo aparatot. Aparatot {tom }e gi dobie podatocite ni
dava lista na raspredelba (distribution list) od koja mo`e da
se vidi pozicijata na sekoj serum, reagens i alergen (Slika
16.8). Otkoga }e se prefrlat podatocite za analizite koi
}e se rabotat treba da se podgotvi aparatot za rabota.
Aparatot e sostaven od dva nosa~a. Prviot nadvore{niot
se vika nosa~ na primeroci, a vtoriot ili vnatre{niot e
nosa~ot na koj se redat alergenite. Od stranata na aparatot
ima tri kanti~ki koi se ozna~eni so razli~na boja (plava,
Slika 16.8: Lista na raspredelba (Distribution list) e na
aparatot Uni-Kap100 (UniCap-100).
Institut za imunobiologija i humana genetika
185
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
zelena i `olta). Vo plavata kanti~ka stoi "wash solution"
(rastvor za perewe). Ovoj rastvor se prigotvuva od
specifi~en koncentrat koj se rastvara vo 1000 mL
destilirana voda. Ovaa kanti~ka mora da bide napolneta
do vrvot pred da se zapo~ne so rabota. Vo zelenata kanti~ka
ima "rinse solution" (rastvor za plaknewe), a toa e destilirana
voda koja mora da ja napolnime pred da zapo~neme. Na
`oltata kanti~ka ima oznaka "waste" (otpadok) i ovaa
kanti~ka ostanuva prazna za da mo`e aparatot vo tekot na
rabotata da gi isfrla te~nostite vo nea (Slika 16.9gore).
Slika 16.9: Strani~en pogled
(gore) i mestata za vnesuvawe
primeroci od serum, hemikalii
i top~enca (dolu) na aparatot
Uni-Kap100 (Uni-Cap-100).
Tabela 16.3: Vnesuvawe rezultati od UniCap-100.
Site stapki od ponatamo{niot proces se avtomatizirani
i od ekranot na samiot aparat ~itame {to treba da se
napravi. Prvo ne pra{uva dali gore opi{anite kanti~ki
se polni i pravilno rasporedeni. Odgovorot se vr{i so
pritiskawe na kop~iwata "yes" i "no" na tastaturata od
samiot aparat. Potoa se vnesuvaat serumite na pacientite
(ima to~no opredelena pozicija za sekoj serum, a taa mo`e
da se vidi i od listata na raspredelba). Otkoga }e se vnesat
serumite se stavaat vedna{ do niv kontrolite na
kalibracionite krivi (po dve kontroli za sekoja kriva) i
tie se so oznaka sKK-1 i sKK-2 za specifi~nite IgE
protivtela i vKK-1 i vKK-2 za vkupnite IgE protivtela.
Potoa se vnesuvaat reagensi koi ni se potrebni: Kowugat
za specifi~en IgE, koj stoi sekoga{ na pozicija A na
nadvore{niot nosa~, a kowugatot za vkupen IgE stoi na
pozicija B. Pri stavaweto na kowugatite aparatot bara da
se vnese specifi~niot kod od kalibracijata za toj mesec.
Se vnesuva razvoen rastvor (development solution) na pozicija
E i zapira~ki rastvor (stop solution ) na pozicija H. Otkoga
}e gi vneseme serumite i reagensite aparatot zapo~nuva so
edna slepa proba koja{to trae 2 min, pri{to toj gi
proveruva kanti~kite i dali se e staveno na pravilnoto
mesto. Potoa od ekranot mo`e da vidime koj alergen treba
da se vnese. Alergenite se redat na vnatre{niot nosa~
(Slika 16.9 dolu). Vo ovoj sistem alergenite se fiksirani
na kuglici koi se naredeni vo penkala. Od nadvor se
postavuva penkaloto, a aparatot sam gi zema i gi redi na
to~no opredelenata pozicija.
Dobienite rezultati se vnuvaat vo formular pogoden za
taa namena (Tabela 16.3).
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
186
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 17: TIP 2 TIP 3 PREOSETLIVOST
VE@BA 17: TIP 2 I TIP 3
PREOSETLIVOST
17.1. Aglutinacija
Aglutinacijata pretstavuva specifi~no fiksirawe na
specifi~ni protivtela za opredeleni protivgenski epitopi koi se nao|aat na povr{inata na nekoi humani kletki,
bakterii ili virusi, pri {to doa|a do nivno me|usebno
slepuvawe i grupirawe. Ovie grupi na kletki se narekuvaat aglutinati, protivtelata (antitelata) koi u~estvuvaat
vo ovoj proces se narekuvaat aglutinini; protivgenite se
imenuvani kako aglutinogeni, a reakcijata kako aglutinacija. Ovaa reakcija najmnogu se koristi vo krvnogrupnata
imunohematologija, kade pretstavuva osnoven test, pa kako
takva, niz reagiraweto na eritrocitnite protivgeni i
protivtela, }e bide pretstavena. U~esnici vo reakcijata
se protivgeni i protivtela. Protivgenite se nao|aat na
kleto~nata membrana i se osnoven faktor vo reakcijata,
predizvikuvaat sozdavawe protivtela i pretstavuvaat
specifi~ni receptori vo procesot na fiksacija na
protivtelata (slika 17.1).
Celosno
protiv H
protivtelo
Test eritrociti
so H protivgen
reakcija
protivgen-protivtelo
= aglutinacija
Institut za imunobiologija i humana genetika
Slika 17.1: [ematski prikaz
na aglutinacija na erotrocitite.
187
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Pritoa, va`na e nivnata gustina na kleto~nata membrana
(kvantitativno prisustvo), kako i polo`bata vo membranata. Taka na pr., protivgenot A od krvnogrupniot sistem
AVO, ima 1.000.000 mesta na eritrocitnata membrana i za
dobivawe reakcija potrebna e 2% eritrocitna suspenzija,
a za D protivgenot od Rh sistemot potrebna e 40%, bidej}i
toj e prisuten so 10-30.000 mesta na membranata. Ili pak,
protivgenot A prominira nad membranata i protivtelata
lesno se fiksiraat za nego, dodeka D protivgenot e postaven podlaboko vo membranata i neophodno e nejzino enzimsko tretirawe za da se ovozmo`i kontakt so protivtelata.
Protivtelata glavno se od IgM klasa, no mo`e da bidat i
od IgG klasa. Spored na~inot na postanuvawe mo`e da
bidat prirodni i imuni, pri {to prirodnite se od IgM, a
imunite pred s#, se od IgG klasa. Prirodnite protivtela
gi dobivame po ra|awe vo tek na prvite 6 meseci, a imunite
kako odgovor na alo ili druga imunizacija (iako vo princip site protivtela se imuni).
Za da se dobie aglutinacija, neophodno e adekvatno kvantitativno prisustvo na protivtelata. Taka na pr., dovolni
se 25 molekuli protiv A aglutinini od IgM klasa, dodeka
za protiv D aglutininite, koi se od IgG klasata, se
potrebni 20.000 molekuli.
Za da se odviva reakcijata, potrebno e da se ispolnat i
drugi uslovi kakvi {to se: temperatura, pH, jonski sili,
inkubacija, prome{uvawe i centrifugirawe.
- postojat optimalni temperaturni granici vo koi najdobro se fiksiraat protivtelata za protivgenite i
odvivaweto na aglutinacijata e pogodno. Nekoi reakcii se odvivaat najdobro na 4oC ili na sobna temperatura od 18oC do 22oC, toa se studeni protivtela (kako
na pr. od AVO sistemot); odnosno na 37oC t.n. topli
protivtela (kako {to se na pr. od Rh sistemot).
- Za aglutinacija pogoden pH e od 6.9 do 7.2. Dokolku pH
e nad 8 ili pod 6, neophodno e da se puferira za{to
evidentno ja namaluva senzibilnosta na reakcijata.
- Namaluvaweto na jonskite sili doveduva do zgolemuvawe na fiksacijata na protivtelata za epitopite i
do la`ni reakcii, odnosno do avtoaglutinacija. Zatoa,
neophodno e reakcijata da se izvr{uva vo solena sredina i so precizno opredelena koncentracija na eritrocitite kako protivgenski supstrat.
- Kaj prirodnite aglutinini reakcijata e brza i ~esto
nema potreba od inkubacionen period. No, kaj iregularnite inkompletni protivtela, taa e potrebna i se
odviva vo vremenski interval od 15 do 60 min zavisno
od uslovite {to gi baraat soodvetnite epitopi i
nivnite specifi~ni protivtela.
- ^estopati e potrebno prome{uvawe i centrifugirawe 1 do 2 min na 500 g za da se podobri fiksacijata na
protivtelata.
188
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 17: TIP 2 TIP 3 PREOSETLIVOST
17.1.1. Objasnuvawe mehanizmot na aglutinacija
Pove}e teorii go objasnuvaat ovoj mehanizam. Teorijata
na Marrak objasnuva deka protivtelata povrzuvaj}i gi
me|usebno eritrocitite formiraat mostovi i tridimenzionalna slika na aglutinirawe na ovie kletki. Teorijata
na Bordet zboruva deka me|u kletkite postojat sili na
kohezija i repulzija koi gi odr`uvaat razdvoeni, no koga
pod dejstvo na protivtelata tie }e se naru{at, toga{ nastapuva aglutinacija. Me|utoa, najprifatlivo e objasnuvaweto na Pollack koj govori za postoeweto na zeta potencijal okolu eritrocitite. Vsu{nost, zeta potencijalot
pretstavuva razlika me|u potencijalot na katjonskiot prsten okolu eritrocitot i jonskiot naboj na okolinata
(Slika 17.2). Normalna vrednost za zeta potencijalot e -16
mV, a ako padne pod-7 mV }e se javi la`na aglutinacija.
Aglutinacijata ne e mo`na nad -23 mV . Aglutininite od
IgM klasa najdobro reagiraat na -18 do -23 mV, a IgG od 8 do -10 mV.
eritrocit
gusto smesteni
katjoni okolu
eritrocitot
Z potencijal
Slika 17.2: Eritrocit vo neutralna sredina obikolen so
katjonski prsten.
Aglutinacijata mo`e da bide direktna koga aglutininite
od serumot deluvaat direktno vrz epitopite od eritrocitnata membrana ili arteficielna koga se potrebni dodatni
reagensi za promena na zeta potencijalot (proteoliti~ki
enzimi-tripsin, papin, bromelin; makromolekularni supstancii - albumin, plazmagel, dekstran, fikol; protivglobulinski serum) za da se ovozmo`i fiksirawe na protivtelata za protivgenite. Inaku, treba da se istakne deka
aglutinacijata e reverzibilen proces. Pri promena na
uslovite, na pr. temperaturata (so 10 min zagrevawe na
56oC se razdvojuvaat aglutinatite, se defiksiraat protivtelata od protivgenite,odnosno se eluiraat - proces na
elucija) se dobiva sostojba ista kako pred po~etokot na
reakcijata.
17.2. Direkten protivglobulinski test (DPT)
Direktniot protivglobulinski test ni slu`i za otkrivawe
protivtela koi se vrzani za kletkite, no koi ne mo`at da
izvr{at nivna aglutinacija (nekompletni protivtela).
Protivhumaniot globulin (protivglobulinski serum) gi
aglutinira eritrocitite koi se oblo`eni so soodvetnite
globulini. Vo zavisnost od specifi~nosta na protivglobulinskiot serum, mo`e ponatamu da se doka`uva i
specifi~nosta na ovie globulini (na pr. dali se protiv
IgG, protiv IgM, protiv IgA, protiv C3d ili protiv C3c
protivtela). Aktivacijata na komplementot in vitro, od
strana na prisutnite ladni avtoantitela, se spre~uva so
upotrebata na EDTA ili natrium citrat. So pove}ekratno
Institut za imunobiologija i humana genetika
189
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
miewe na eritrocitite se otstranuvaat rasvorlivite ili
nespecifi~no vrzanite globulini za niv. Na toj na~in se
ovozmo`uva otkrivawe na imunoglobulinite ili faktorite na komplementot koi se specifi~no vrzani za
eritrocitite in vivo.
17.2.1. Zemawe primerok
Krvta za direktniot protivglobulinski test najdobro e da
se zeme so protivkoagulans EDTA (0.01M) za da mo`e da se
inaktivira komplementot, so {to bi se spre~ila in vitro
senzibilizacijata na eritrocitite so klini~ki nezna~ajni
ladni protivtela (na pr. nekompletni ladni protivtela
koi normalno gi ima vo krvta). Na toj na~in bi se spre~ilo
dobivawe na la`no-pozitivni rezultati. Eritrocitite
od primerokot krv zemen so EDTA ili citrat, najprvin se
mijat 6 pati so fiziolo{ki rastvor ili so fosfaten
pufer. Otkoga }e se isplaknat 6 pati, od niv se prigotvuva
2-3% suspenzija.
Dokolku se dobie pozitiven rezultat so upotrebata na
eritrociti koi se izdvoeni od koaguliran ili od primerok
zemen so nekoj drug protivkoagulans, a koj {to primerok
stoel na sobna temperatura ili vo fri`ider, toga{ DPT
treba da se povtori so primerok zemen so EDTA.
17.2.2. Materijal
Suspenzija na eritrociti od primerok na krv (2-3%),
najmalku dva polispecifi~ni protivglobulinski serumi
(koi sodr`at najmalku protiv-IgG i protiv-C3d), monospecifi~ni protivglobulinski serumi (najmalku dva,
protiv IgG i protiv C3d), AB serum, epruvetki ili
predmetni stakla, centrifuga, mikroskop i jak izvor na
svetlo.
17.2.3. Metod
Test za prosejuvawe (skrining test). Direktniot
protivglobulinski test se izveduva so upotreba na najmalku
dva polispecifi~ni protivglobulinski serumi. Vo
Slika 17.3: Direkten protivglobulinski test.
190
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 17: TIP 2 TIP 3 PREOSETLIVOST
obele`anite epruveti edna kapka (1 kapka odgovara na
pribli`no 50 μL) od polispecifi~niot protivglobulinski serum se me{a so edna kapka od eritrocitnata
suspenzija. Potoa epruvetkata se inkubira 15 minuti na
sobna temperatura. Po inkubacijata, epruvetkata se centrifugira 15-30 sekundi na 1000 vvm (120g). Rezultatot se
~ita, so lesno protresuvawe na epruvetata, nasproti izvor
na svetlina. Na~inot na koj talogot od eritrociti }e se
resuspendira e presuden za rezultatot na testot.
Epruvetata se nakosuva i vnimatelno se me{a. Potoa so
lesni dvi`ewa napred-nazad se nabquduva sodr`inata na
epruvetata nasproti izvor na svetlina (dali ima
aglutinati) (Slika 17.3). Dokolku rezultatot e negativen
se zema edna kapka od epruvetata i se nabquduva pod
mikroskop.
Vtoroto ~itawe se izveduva posle povtorno inkubirawe
vo vremetraewe od 1 ~as na sobna temperatura i povtorno
centrifugirawe na 1000 vvm (120g) 15-30 sekundi. Ova e
neophodno bidej}i senzitivnosta na protivglobulinskiot
test, osobeno za otkrivawe na C3, zna~itelno se zgolemuva
so inkubacijata.
Slika 17.4: Ja~ina na aglutinacija iska`ana vo vid na
poeni.
Ja~inata na aglutinacijata se iska`uva vo vid na poeni
(Slika 17.4):
4+ prisustvo na eden soliden aglutinat, bez prisu-tni
slobodni kletki
3+ nekolku golemi aglutinati i prisustvo na mal broj
slobodni kletki
2+ prisustvo na sredno golemi agregati so slobodni
kletki vo zadninata
1+ prisustvo na mali agregati na matno crvena zadnina
+ ne`ni agrgati na matno crvena zadina ili agre-gati
vidlivi pod mikroskop
0 nema aglutinacija
Diferencirawe. Najdobro e DPT prvin da se izvede so
Institut za imunobiologija i humana genetika
191
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
polispecifi~en serum koj sodr`i protivtela so najmalnku
dve specifi~nosti (protiv-IgG i protiv-C3). Dokolku se
dobie pozitiven protivglobulinski test, ponatamu treba
da se odredi tipot (specifi~nosta) na protivteloto ili
protivtelata so upotrebata na monospecifi~ni protivglobulinski serumi.
Kontroli. Vo princip, sekoga{ koga se raboti protivglobulinskiot test, istovremeno treba da se napravat i
pozitivna, negativna i avto-kontrola.
Kako pozitivna kontrola se koristat test kletki na koi
ima vrzno protivtela (na pr. Coombs-ovi kontrolni kletki).
Ovie kletki ili se me{aat so polispecifi~niot protivglobulinski serum i/ili protiv-IgG serumot so koj se
izveduva protivglobulinskiot test ili se dodavaat vo
epruvetite vo koi e dobien negativen DPT. Dokolku dojde
do pojava na aglutinacija toa zna~i deka DPT e navistina
negativen. Ako i po dodavaweto na senzibi-lizirani kletki
ne dojde do pojava na aglutinacija, zna~i deka ili ima
gr{ka vo procesot na rabota ili protiv-globulinskiot
serum e so lo{ kvalitet. Najdobro e kako pozitivna
kontrola da se koristat kletki oblo`eni so C3. Tie bi se
dodavale vo epruvetite vo koi e dobien negativen DPT so
upotreba na monospecifi~en protivglobulinski serum
(koj sodr`i samo protiv-C3 protivtela). Pojavata na
aglutinacija pri povtornoto centrifugirawe ni uka`uva
na faktot deka ne do{lo do inhibicija na protivglobulinskiot serum so IgG i/ili C3 kako rezultat na
nesoodvetnoto miewe na eritrocitite na pacientot.
Kako negativna kontrola naj~esto se koristat test
kletki koi ne se oblo`eni so protivtela. Vo slu~aj da ne
raspolagame so vakvi test kletki, negativnata kontrola
mo`e da se izvede i so dodavawe na 1% govedski serumski
albumin ili rastvoruva~ za protivglobulinskiot serum
na izmienite eritrociti od pacientot. Vo negativnata
kontrola ne smee da dojde do pojava na aglutinacija.
Avto-kontrolata se izveduva so me{awe na eritrocitite
od pacientot so AB kontrolen serum.
17.2.4. Zabele{ki
- So prodol`enata inkubacija mo`e zna~itelno da se
zgolemi otkrivaweto na komponentite na komplementot
koi se vrzani za eritrocitite.
- Edno miewe na eritrocitite so normalen fiziolo{ki
rastvor (vklu~uvaj}i i centrifugirawe na 2000 vvm za
vreme od 2 minuti) posle vtoroto ~itawe mo`e da ja
zasili reakcijata, so {to bi se spre~ila pojavata na
prozon fenomenot.
- Upotrebata na fosfaten pufer za plaknewe (pH 7.0),
EDTA i govedski serumski albumin ja spre~uvaat
192
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 17: TIP 2 TIP 3 PREOSETLIVOST
elucijata na labavo vrzanite protivtela, kako i
nespecifi~noto aktivirawe na komplementot.
- Podobro e testot da se izvr{uva vo epruveti otkolku
na predmetni stakla, bidej}i predmetnite stakla
nemo`at da se centrifugiraat.
- Nesoodvetnoto plaknewe, kako i visokata koncentracija na imunoglobulini vo serumot na pacientot,
mo`e nepovolno da vlijaat na testot.
17.2.5. Titar kaj antiglobulinskite
testovi
Za da mo`e da se sudi za ja~inata na aglutinacijata
nastanata pome|u oblo`enite eritrociti i monospecifi~niot protivglobulinskiot serum, korisno e
najprvin da se odredi negoviot titar. Odreduvaweto na
titarot po`elno e da se napravi i na komercijalno
dostapnite protiv-IgG i protiv-C3 monospecifi~ni
protivglobulinski serumi. Otkoga }e se odredi titarot,
sekoja od aglutinaciite koi }e se dobijat od razli~nite
razreduvawa na monospecifi~niot protiv-globulinski
serum }e ni poslu`i za sozdavawe skala na poeni, preku
koja ponatamu }e se izrazuva ja~inata na aglutinacijata.
So vakov na~in na izrazuvawe e ovozmo`ena mnogu
poprecizna procenka na ja~inata na aglutinacijata,
odkolku koga bi procenuvale samo vrz osnova na edno
razreduvawe na protivglobulinskiot serum. No, so ogled
na faktot deka izrabotkata na edna vakva skala e
proizvolna i zavisi od protivglobulinskiot serum koj go
upotrebuvame, nejzinata va`nost e ograni~ena samo na
laboratorijata koja i ja izrabotila.
Potrebni materijali: 2-5% suspenzija na eritrociti
prigotveni od krv zemena od pacient, monospecifi~en
Coombs-ov serum (protiv-IgG, protiv-C3c, protiv-C3d,
protivtela kon lesnata veriga), epruveti, centrifuga,
rastvor za miewe eritrociti (fiziolo{ki rastvor,
fosfaten pufer), izvor na svetlo, mikroskop.
Metod:
1. Se prigotvuva serija na dvojno razreduvawe na protivglobulinskiot serum vo fiziolo{ki rastvor. Se zemaat 12
epruveti i se obele`uvaat na sledniot na~in: NR
(nerazreden), 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512,
1:1024, K (kontrola). Koli~inata na protivglobulinski
serum koja }e ja stavime vo prvata epruveta zavisi od toa
kolku ~esto se izveduva protivglobulinskiot test. Dokolku
toj se izveduva mnogu ~esto, toga{ taa koli~ina mo`e da
bide i 10 mL. Vo ostanatite epruveti, osven vo epruvetata
obele`ana so K, se stavaat po 5 mL fiziolo{ki rastvor.
Potoa polovina od sodr`inata od prvata epruveta se
prefrla vo vtorata epruveta, od vtorata epruveta polovina
od sodr`inata se prefrla vo tretata epruveta, od tretata
Institut za imunobiologija i humana genetika
193
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Slika 17.5: Priprema na epruvetite za odreduvawe titarot na protivglobulinskiot serum
.
vo ~etvrtata, se do epruvetata obele`ana so 1:1024.
Polovina od sodr`inata na epruvetata obele`ana so 1:1024
se frla. Vaka pripremenite epruveti se ~uvaat na +40C
(Slika 17.5).
2. Se zemaat 11 novi epruveti i se obele`uvaat od NR do
1:512. Vo sekoja od niv se stava po edna kapka 2-5%
eritrocitna suspenzija prigotvena od primerok zemen od
pacient. Pozitiven rezultat retko se dobiva vo razreduvawata pogolemi od 1:512, no dokolku e toa potrebno
mo`at da se prigotvat i razreduvawa pogolemi od 1:1024.
3. Epruvetite se mijat 4 pati so izotoni~en fiziolo{ki
rastvor. Po poslednoto miewe epruvetite kompletno se
dekantiraat za da na dnoto ostane samo talog od eritrociti.
4. Vo sekoja od epruvetite se dodava po 2 kapki od
soodvetnite razreduvawa na protivglobulinskiot serum.
5. Epruvetite se me{aat i se centrifugiraat 1.000 do 1.500
vvv 15-20 sekundi.
6. Se nabquduva aglutinacijata na ist na~in kako i kaj
direktniot protivglobulinski test.
7. Razli~nite ja~ini na aglutinacii koi se javuvaat vo
epruvetite se obele`uvaat so poeni. Taka aglutinacijata
4+ odgovara na 10, 3+ odgovara na 8, 2+ odgovara na 6, 1+ na
4, + na 2, a 0 zna~i deka nema aglutinacija (Tabela 17.1).
Tabela 17.1: Primer za titar
na DAT.
Razreduvawe
nerazreden
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
Kontrola
194
Stepen na aglutinacija za
protiv-IgG
protiv-C3
4+
4+
4+
3+
4+
3+
3+
2+
2+
1+
1+
0
0
0
0
0
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 17: TIP 2 TIP 3 PREOSETLIVOST
17.3. Indirekten
protivglobulinski test
Dodeka so direktniot protivglobulinski test mo`at da se
otkrijat in vivo vrzanite globulini za eritrocitite so
pomo{ na aglutinacijata so protivglobulinskiot serum,
indirektniot protivglobulinski test ni slu`i za
otkrivawe na protivtela koi slobodno cirkuliraat vo
serumot i koi mo`at specifi~no da se vrzat za
eritrocitite in vitro. Op{to ka`ano, polispecifi~niot
protivglobulinski serum se upotrebuva za da se otkrijat
in vitro vrzanite protivtela (IgG, IgM), bilo da se
vrzani direktno za kletkite bilo preku nivnoto
aktivirawe na komplementot. So upotrebata na regensi
koi sodr`at protivtela so to~no opredelena specifi~nost,
na primer test serumi, indirektniot protivglobulinski
test ni ovozmo`uva i specifi~no i senzitivno testirawe
na protivgenite.
17.3.1. Potrebni materijali
Ispituvan serum, polispecifi~en Coombs-ov serum
(protiv-IgG, protiv-C3c, protic-C3d, protivtela kon
lesnata veriga), centrifuga, rastvor za miewe eritrociti
(fiziolo{ki rastvor, fosfaten pufer), Coombs-ovi
kontrolni kletki, O test eritrociti, epruveti.
17.3.2. Metod
Vo obele`ena epruveta se kapnuvaat 2-4 kapki od serumot
na pacientot (vo koj se ispituva dali postojat slobodni
protivtela) i 1-2 kapki od prethodno pripremenite test O
eritrociti (3-5% suspenzija napravena so me{awe 7 O Rh+
i 3 O Rh- primeroci na krv od zdravi krvodariteli, pereni
6 pati so fiziolo{ki rastvor ili fosfaten pufer). Po
inkubacijata od 45 minuti na 37oC eritrocitite se perat 3
pati so fiziolo{ki rastvor ili fosfaten pufer. Se
mijat na toj na~in {to najprvin se dodava 3 mL od
fiziolo{kiot rastvor ili fosfatniot pufer, potoa
vnimatelno se resuspendiraat i na krajot se centrifugiraat na 1500-2000 vvm vo tek na 1 minuta. Po sekoe
centrifugirawe supernatanot kompletno se otstranuva
so aspiracija ili so dekantirawe. Po tretoto plaknewe vo
epruvetkata se dodavaat 1-2 kapki od protivglobulinskiot
serum i se centrifugira 15-30 sekundi na 1000 vvm.
Rezultatot vnimatelno se ~ita nasproti izvor na svetlina
(Slika 13).
Dokolku testot e negativen se zema edna kapka i se
Institut za imunobiologija i humana genetika
195
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
nabquduva pod mikroskop. Potoa se izveduva pozitivna
kontrola so upotreba na Coombs-ovi test kletki. Dokolku
se dodade 1 kapka na silno oblo`eni eritrociti (na nivnata
povr{ina ima vrzano ogromen broj na IgG i C3d) toga{
testot treba da stane pozitiven (da se pojavi vidliva
aglutinacija) vo rok od 5 minuti bez centrifugirawe.
Dokolku se upotrebat slabo oblo`eni kletki (za svojata
povr{ina imaat vrzano ne tolku golem broj na IgG i C3d)
toga{ e potrebno epruvetata da se centrifugira 15 sekundi
na 1000 vvm.
I kaj indirektniot protivglobulinski test, kako i kaj
direktniot, paralelno se izveduvaat i negativna i avtokontrola.
17.3.3. Zabele{ki
Faktori koi mo`at pozitivno da vlijaat na testot:
optimalna temperatura na sredinata, optimalna pH (glavno
pome|u 6.50-7.0), golem broj na protivgeni na edna kletka
(visoka gustina na protivgenot), pomal broj na kletki,
pogolema koli~ina na serum i/ili pogolema koncentracija
na protivtela, vnimatelno i potpolno me{awe na
epruvetkite vo koi se izveduva testot.
Faktori koi mo`at negativno da vlijaat na testot:
raspadnat protivgen, stari test kletki, prekratko ili
predolgo vreme na inkubacija (optimalno pome|u 30-60
minuti),
Testirawe na protivtela: Voobi~aeno soodnosot pome|u
suspenzijata na eritrociti i serumot treba da bide 1:2-3
(vi{ok na protivtela) a vremeto na inkubacija treba da e
podolgo i da se dvi`i pome|u 30 i 120 minuti.
IgM i slabo vrzanite komplement aktivira~ki protivtela
so indirektniot protivglobulinski test se otkrivaat
glavno preku otkrivawe na komplementot (IgM i preku
protiv-telata kon lesnata veriga). Poradi toa poprepora~livo e, barem koga se bara prisustvo na protivtela
kaj pacienti, da se upotrebuva serum namesto plazma.
17.4. Opredeluvawe cirkulira~ki imuni kompleksi so precipitacija so polietilenglikol
Ova e najednostaven i lesno primenliv metod koj vo su{tina pretstavuva dodavawe 4.166% rastvor na polietilen
glikol (PEG) vo serumskata proba koja sodr`i imuni
kompleksi i doveduva do zgolemuvawe na opti~kata gustina
nad nekoja grani~na vrednost (Slika 17.6). Potreben e sled196
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 17: TIP 2 TIP 3 PREOSETLIVOST
Test serum
Dodadi PEG vo
test serumot za
da se sozdade
talog
PEG
Supernatantot
sodr`i
slobodni IgG
Talogot sodr`i
IgG kompleksi,
se plaknat vo
PEG, se rastvoraat i se merat
Slika 17.6: Vo serumot {to
sodr`i kompleksi od IgG i
IgG monomer se dodava PEG za
da se dobie krajna koncentracija od 2% PEG. Pri ovaa
koncentracija kompleksite
selektivno se talo`at, a
supernatantot sodr`i slobodni protivtela. Epruvetkata se centrifugira i kompleksite pa|aat na dnoto.
Slobodnite protivtela se
otstranuvaat so plaknewe, a
talogot se rastvora i kompleksnite IgG se merat kvantitativno so nefelometrija.
niov materijal i oprema: H3BO4, Na2B4O7 * 10 H2O, PEG so
molekulska masa 6.000, (NH4)SO4, BaCl2, spektrofotometar,
lateks za opredeluvawe revmatoiden faktor, 0.1 mol/L
boraten pufer pH 8.4 (rastvor A 1.24% H3BO4 vo destilirana voda, rastvor B 1.9% Na2B4O7 * 10 H2O vo destilirana
voda. Se me{aat 55 mL od rastvor A, 45 mL rastvor B i 100
mL destilirana voda, pH 8.4), rastvor na PEG (se rastvoraat 10 g PEG vo 240 mL boraten pufer), razreduvawa od
lateks (od osnovnoto razreduvawe 1:40 vo boraten pufer,
se pravat razreduvawa 1:640 i 1:1280), rastvori za standardno ot~ituvawe apsorbcija na 450 nm (1. se me{aat 2
mL 0.025 mol/L (NH4)SO4 i 0.01 mL 0.025 mol/L BaCl2 - ot~itanata ekstincija * 1.000 = 12.4 = 1.8; 2. se me{aat 2 mL
0.025 mol/L (NH4)2SO4 so 0.02 mL 0.025 mol/L BaCl2 - ot~itanata ekstincija * 1.000 = 23.8 = 4.7; 3. se me{aat 2 mL 0.025
mol/L (NH4)2SO4 so 0.03 mL 0.025 mol/L BaCl2 - ot~itanata
ekstincija * 1.000 = 35.4 = 5.5).
Izveduvawe na testot: Se zemaat 0.3 mL od ispituvaniot
serum i se me{aat so 0.6 mL boraten pufer. Vo dve
epruvetki se sme{uvaat po 2 mL rastvor na PEG i po 0.22
mL od razreduvaweto na ispitaniot serum. Se prigotvuva
"slepa proba" so me{awe 2 mL boraten pufer i 0.22 od
razredeniot serum. Epruvetkite dobro se me{aat i se
ostavaat na sobna temperatura eden ~as. Se meri apsorpcijata na dvete epruvetki na 450 nm na-sproti "slepata
proba".
Prika`uvawe i tolkuvawe na rezultatite: Se presmetuva srednata aritmeti~ka golemina od apsorbancijata na
dvete epruvetki i se mno`i so 1.000 za da se dobie rezultat
izrazen vo me|unarodni edinici (ME). Normalna vrednost
za lu|e iznesuva 12.1 - 7.4 ME. Spektrofotometarot se
proveruva so pomo{ na prigotvenite standardni rastvori.
Institut za imunobiologija i humana genetika
197
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Treba da se dobijat ve}e prika`anite vrednosti. Pogruba
proverka mo`e da se napravi so lateksni probi (so razreduvaweto 1:640 treba da se dobijat pozitivni vrednosti, a
so razreduvaweto 1:1280 da se dobijat negativni).
Nedostatok na metodot e {to ne se talo`at imunite kompleksi so mala golemina.
Pogoden e metodot koj koristi konsumacija na S1q komponentata na komplementot. So pomo{ na enzim ili izotop,
se markira S1q koj potoa od imunite kompleksi e iskoristen. Koli~inata na konsumiraniot S1q (se meri vo serumot
pred i po reakcijata) pretstavuva vrednost za imunite kompleksi.
17.5. Zada~a
1. Da se napravi direkten i indirekten protivglobulinski
test.
2. Da se presmeta titarot na dadenite protivglobulinski
serumi i da se vnese vo dadenata Tabela 17.2.
Tabela 17.2: Formular za
vnesuvawe rezultati od
titar na protivglobulinski
serum.
Razreduvawe
Primer
Slu~aj
Stepen na aglutinacija za
Stepen na aglutinacija za
protiv-IgG
protiv-C3
Ja~ina
Poeni
Ja~ina
Poeni
nerazreden
4+
10
4+
10
1:2
4+
10
3+
8
1:4
4+
10
3+
8
1:8
3+
8
2+
6
1:16
2+
6
1+
4
1:32
1+
4
0
0
1:64
0
0
0
0
Kontrola
0
0
0
0
Vkupno
68
protiv-IgG
Ja~ina
Poeni
protiv-C3
Ja~ina
Poeni
36
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
198
Institut za imunobiologija i humana genetika
18. ANALIZA NA PREOSETLIVOST
VE@BA 18: ANALIZA NA
PREOSETLIVOST
18.1. Normalni vrednosti za
vkupen i za specifi~en IgE
Koncentracijata na vkupniot IgE vo serum e povrzana so
vozrasta. Na okolu 10 godini, vkupniot IgE dostignuva
vrednosti koi se odr`uvaat ponatamu. Kako normalni
vrednosti za vkupniot IgE se definiraat gornite granici
bidej}i postoi asimetri~na distribucija na dobienite
vrednosti. Gornata granica se presmetuva kako geometriska
sredna golemina + 1.96 standardni devijacii (SD).
Preporaka e sekoja laboratorija da ima sopstveni
o~ekuvani vrednosti (Tabela 18.1).
Zdravite individui imaat mnogu niski nivoa na specifi~ni IgE vo krvta, normalno pod 0.35 kEA/L (kilo edinici
specifi~en alergen vo eden litar). Senzibiliziranite
pacienti poka`uvaat zgolemeni nivoa, nad 0.35 kEA/L.
UniCap specifi~nite IgE otkrivaat IgE protivtela vo
interval 0.35-100 kEA/L. Rezultatot se izrazuva kvantitativno, kako nivo ili kako klasa specifi~en IgE (Tabela
18.2) .
18.2. Klini~ki simptomi za
alergija i nivno dijagnosticirawe
Alergenot kaj atopi~no lice mo`e da predizvika momentna
reakcija so egzem, rinit, konjuktivit, bronhokostrikcija,
povra}awe i prolivi, a vo retki slu~ai i anafilaksa.
Simptomite mo`at da bidat ednostavni, kako {to se
zacrveneti o~i ili komplicirani, kako {to e astma, rinit
Institut za imunobiologija i humana genetika
Tabela 18.1: Normalni vrednosti na vkupen IgE opredelen so UniCap.
Geometriska
sredna
vrednost
(kE
IgE/L)
Gorna
granica
+ 1.96
SD (kE
IgE/L)
0.6
4.5
3
1.0
8.0
6
1.8
14.3
9
2.6
19.6
12
3.2
25.5
2
5.7
45.1
3
8.0
62.7
4
10.0
78.4
5
12.0
94.1
6
14.0
109.8
7
16.0
123.5
8
18.0
139.2
9
20.0
152.9
10 i
pove}e
22.0
166.7
Vozrast
Nedeli
6
Meseci
Godini
199
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 18.2: Tolkuvawe na
rezul-tatite od specifi~en
IgE spored koli~ina (vo kEA/
L), nivo i klasi na specifi~en
IgE.
Kvantitativni
rezultati
(kEA/L)
Nivo na alergen
specifi~ni
protivtela
Polukvantitativni rezultati
(Klasi na
specifi~en
IgE)
pod 0.35
Otsutno ili
nemerlivo
0
0.35 do 0.7
Nisko
1
0.7 do 3.5
Sredno
2
3.5 do 17.5
Visoko
3
17.5 do 50.0
Mnogu visoko
4
50.0 do 100.0
Mnogu visoko
5
nad 100.0
Mnogu visoko
6
i urtikarija. Tie mo`at da bidat lesni ili te{ki.
Hroni~nite reakcii mo`at da se vidat kako ko`ni reakcii
(egzem), a vo bronhijalnata astma prisutnoto vospalenie
na belodrobnoto tkivo mo`e da dovede do astmati~ni napadi
posle dopir so alergenot. Manifestaciite na atopiskite
zaboluvawa zna~ajno variraat so vozrasta i vklu~enite
alergeni. Vo detstvoto naj~esti se alergii kon hrana,
osobeno jajca i mleko. Posle tretata godina dominantni
alergeni se di{nite alergeni.
Razvojot na alergiite vo razli~na vozrast mo`e da se
opi{e kako alergiski mar{. Toa zna~i deka, naj~esto
postoi nasoka na razvoj na atopiite od novorodenoto pa se
do starosta (Slika 18.1).
Alergiskite reakcii na razli~ni organi se javuvaat so
razli~ni simptomi (Tabela 18.3). Tie mo`at da bidat
lokalni na ko`ata, o~ite, nosot, ustata, di{niot sistem
ili gastrointestinalniot sistem (atopii) ili sistemski
(anafilaksija)
Slika 18.1: Alergiski mar{ od
ra|awe do starost.
200
Institut za imunobiologija i humana genetika
18. ANALIZA NA PREOSETLIVOST
Ko`a
Atopiski dermatit, urtikaria
O~i/nos
Rinokonjuktivit
Usta
Oralen alergiski sindrom (OAS)
Di{en sistem
Svire`i vo detstvoto, astma
Gastrointestinalno
Prolivi, povra}awe,koliki
Sistemski
Anafilaksija
Tabela 18.3: Klini~ki simptomi za alergiski reakcii
spored razli~ni lokalizacii.
Ispituvawata na specifi~niot IgE mo`at da se izveduvaat
♦ oddelno za sekoj somnitelen alergen;
♦ so komplet alergeni za opredeleno zaboluvawe; ili
♦ spored dijagnoza.
18.2.1. Oddelno ispituvawe alergeni
Vo prirodata postoi ogromen broj alergeni. Za pogolemiot
broj od niv lu|eto razvivaat alergii, no za samo mal del od
alergenite postojat laboratoriski metodi za nivno
ispituvawe. Denes postoi tehnologija za ispituvawe okolu
1000 alergeni, no vo medicinskite institucii (pa i na
IIBHG) se ispituvaat samo naj~estite alergeni (Tabeli
18.4 i 18.5). Za sekoja grupa alergeni postoi me|unarodno
definirana mala latini~na bukva koja se koristi za nivno
ozna~uvawe, a posle nea sledi broj. Na primer, mlekoto se
ozna~uva so f2, polen od ambrozija w1 i sli~no.
Pokraj alergenite koi se nao|aat vo prirodata, izgotveni
se i specijalni i rekombinantni alergeni za oddelni
epitopi so koi se vr{at prodlabo~eni i istra`uva~ki
analizi na bolnite so alergii. Tie se ozna~uvaa so golemata
bukv R (Research) i do nea se stavaat drugite oznaki (primer
Rf261 e oznaka za specijalen alergen od asparagus)
Oddelnoto ispituvawe na sekoj somnitelen alergen e
najevtino, no poradi kombinaciite od razli~ni alergii
koi mo`e da gi ima pacientot, tie davaat samo poedine~na
informacija poradi {to ne se celosni i efikasni.
18.2.2. Ispituvawe komplet alergeni
Kompletite alergeni se ispituvaat kako sme{i od razli~ni
alergeni, obi~no po pet alergeni zaedno, i se grupirani
spored sli~nost. Sme{ite alergeni se ozna~uvaat so
latini~nata bukva Iks (x) posle prvata latini~na bukva
koja ja ozna~uva grupata alergeni. Zad niv sledi brojot na
sme{ata i eventualno podgrupata. Taka, sme{ata od hrana
se ozna~uva kako: fx5E (f1-belka, f2-mleko, f3-riba, f4p~enica, f13-kikiriki, f14-soja) (Tabela 18.6). Treba da se
napomene deka postojat ogromen broj sme{i vo sekoja od
Institut za imunobiologija i humana genetika
Tabela 18.4: Razli~ni vidovi poedine~ni alergeni.
ALERGENI OD HRANA
Belka od jajce (f1)
@ol~ka od jajce (f75)
Mleko (f2)
Mleko vareno (f231)
Riba (f3)
P~enica (f4)
Kikiriki (f13)
Soja (f14)
Jagoda (f44)
Saccharomyces Cerevisiae (f45)
Meso svinsko (f26)
Meso tele{ko (f27)
Meso pile{ko (f83)
α-laktalbumin (f76)
β-laktoglobulin(f77)
Kazein (f78)
Gluten(f79)
Sirewe ~adeno (f81)
Sirewe muvlosano(f82)
Kakao (f93)
PRA[INI I @IVOTINSKI
BELKOVINI
Vlakna od ma~e (e1)
Vlakna od ku~e (e5)
Dom.pra{ina (h2)
D. pteronissinus (d1)
D.farinae (d2)
INSEKTI I NIVNI OTROVI
Otrov od p~ela (i1)
Otrov od osa (i3)
Otrov od str{len(i5)
Blatella germanica (i6)
Aedes communis (i71)
PROFESIONALNI ALERGENI
Pamuk (o1)
ANTIBIOTICI
Penicilin G (c1)
Penicilin V (c2)
Ampicilin (c5)
Amoksicilin (c6)
Cefahlor (c7)
GABI I MUVLI
Asperg. fumigatus (m3)
Candida albicans (m5)
Cladosp.herbarum(m2)
Penicill. notatum (m1)
Alternaria alternata(m6)
201
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 18.5: Poleni.
POLENI OD TREVA
Anthoxanthum odora. (g1) - obi~na
mirizliva treva
Cynodon dactylon (g2) – obi~en troskot
Dactylis glomerata (g3) – obi~na e“ovka
Festuca elatior (g4) – livadska treva
Lolium perene (g5) – pove}egodi{en
rajgras-quq
Phleum pretense (g6) – ma~kina opa{katreva
Lolium perenne (g7)- obi~na trska
Poa pratensis (g8)- livadarka
Agrostis stolonifera (g9) – plevica
Sorghum halepense (g10) - metla
Bromus inermis (g11) - klasica
Secale cereale (g12) – ‘r` kultiviran
Holcus lanatus (g13) – volnesta medovica
Avena sativa (g14) – oves
Triticum sativum (g15) – p~enica
Alopecurus pratensis (g16) – lisi~ja
opa{ka
Paspalum notatum (g17) – troskot
Elymus triticoides (g70) – div rajgras
Phalaris arundinacea (g71) – troskovidna
svetlivka
Hordeum vulgare (g201) – ja~men
Zea mays (g202) -p~enka
POLENI OD KOROV
Ambrosia elatior (w1) - ambrozija
Ambrosia psilostachya (w2) – zapadna
abrozija
Ambrosia trifida (w3) – xinovska
ambrozija
Franseria acanthicarpa (w4) – la‘na
ambrozija
Artemisia absinthium (w5) - pelin
Artemisia vulgaris (w6) - crn pelin
Chrysanthemum leucanthemum (w7) margarita
Taraxacum vulgare (w8) – gluvar~e
Plantago lanceolata (w9) - tegavec
Chenopodium album (w10) – diva loboda
Salsola kali (pestifer) (w11) - solenka
Solidago virgaurea (w12) - zlatica
Xanthium commune(w13) – butrak
Amaranthus retroflexus (w14) – {tir
Atriplex lentiformis Scale, (w15) – loboda
Iva ciliate (w16) – metla
Kochia scoparia (w17) – ov~e{ka
Rumex acetosella (w18) - kiselec
Parietaria officinalis (w19) – ru{itelka
Urtica dioica (w20) - kopriva
Parietaria judaica (w21) – ru{itelka
POLENI OD DRVA
Acer negundo (t1) - javor
Alnus incana (t2) – evla, bela
Betula verrucosa (t3) - breza
Corylus avellana (t4) - leska
Fagus grandifolia (t5) - buka
Juniperus sabinoides (t6) - smreka
Quercus alba (t7) - dab
Ulmus amerikana (t8) - brest
Olea europaea (t9) - maslinka
Juglans californica (t10) - orev
Platanus acerifolia (t11) – platan, ~inar
Salix caprea (t12) – vrba, iva
Pop.deltoides-topo. (t14) – crna topola
Fraxinus americana (t15) - jasen
Pinus strobes (t16) - bor
Cryptomeria japonica (t17) – Japonski
kedar
Eucalyptus spp. (t18) - eukaliptus
Acacia longifolia (t19) - akacija
Carya pecan (t22) - karija
Cupressus sempervirens (t23) - kiparis
Morus alba (t70) – crnica, dudinka
Arecastrum romanzoffianum (t72) – kralska
palma
Casuarina equisetifolia (t73) - bor
Tilia cordata (t208) - lipa
Ligustrum vulgare (t210) - ‘iva ograda
202
navedenite grupi, no tuka se dadeni samo naj~estite.
Rezultatot koj se dobiva so ispituvaweto sme{i se
iska`uva kvalitativno kako ima (pozitiven naod) ili
nema (negativen naod) alergija kon taa sme{a alergeni.
Dokolku ima pozitiven naod, toga{ se ispituvaat oddelno
site alergeni koi gi ima vo soodvetnata sme{a alergeni,
za da se otkrie na koj od niv i so kakov intenzitet reagira
pacientot.
Vtoriot na~in na grupno ispituvawe se vr{i spored
dijagnozata na pacientot, smetaj}i deka predlo`enite
alergeni za ispituvawe na soodvetnata bolest se naj~estite
predizvikuva~i:
Astma
g6 - Phleum pretense (treva-ma~kina opa{ka)
t3 – Bettula verucosa (breza)
t9 – Olea europaea (maslinka)
w21 – Parietaria judaica (br{len)
e1 – vlakna od ma~e
e5 – vlakna od ku~e
d1 – Dermatophagoides pteronissinus
w6 – Artemisia vulgaris (crn pelin)
m2 – cladosporium herbarum (muvla)
i6 – Blatella germanica (buba{vaba)
Rinitis kaj vozrasni
g6 - Phleum pretense (treva-ma~kina opa{ka)
t3 – Bettula verucosa (breza)
t9 – Olea europaea (maslinka)
w21 – Parietaria judaica (br{len)
e1 – vlakna od ma~e
e5 – vlakna od ku~e
d1 – Dermatophagoides pteronissinus
w6 – Artemisia vulgaris (crn pelin)
m2 – cladosporium herbarum (muvla)
i6 – Blatella germanica (buba{vaba)
Rinitis kaj deca
g6 - Phleum pretense (treva-ma~kina opa{ka)
t3 – Bettula verucosa (breza)
t9 – Olea europaea (maslinka)
w21 – Parietaria judaica (br{len)
e1 – vlakna od ma~e
e5 – vlakna od ku~e
d1 – Dermatophagoides pteronissinus
f1 – Belka od jajce
f2 – Mleko
f13 – Kikiriki
Ekcem
f1 – Belka od jajce
f2 – Mleko
f3 – Riba
f4 – P~enica
f13 – Kikiriki
Institut za imunobiologija i humana genetika
18. ANALIZA NA PREOSETLIVOST
f17 – Le{nik
f14– Soja
d1 – Dermatophagoides pteronissinus
e1 – vlakna od ma~e
e5 – vlakna od ku~e
Nastinka so svire`i
g6 - Phleum pretense (treva-ma~kina opa{ka)
t3 – Bettula verucosa (breza)
t9 – Olea europaea (maslinka)
Tabela 18.5: Sme{i od alergeni.
Sme{a poleni od trevi (gx1) (Cocksfoot-g3, Meadow fescue-g4, Rye- grass-g5, Timothy-g6, Meadow grass, Kentucky blueg8) (obi~na e`ovka ,livadska treva, quq, ma~kina opa{ka, livadarka)
Sme{a poleni od drva (tx6) (Acer negundo-t1, Betula verrucosa-t3, Fagus grandifolia-t5, Quercus alba-t7, Juglans
californica-t10) (javor, breza, buka, dab, orev)
Sme{a poleni od korovi (wx5) (Ambrosia elatior-w1, Artemisia vulgaris-w6, Chrysanthemum leucanthemum-w7, Taraxacum
vulgare-w8, Solidago virgaurea-w12) (ambrozija, crn pelin, margarita, gluvar~e, zlatica)
Sme{a od hrana (fx5E) (f1-belka, f2-mleko, f3-riba, f4-p~enica, f13-kikiriki, f14-soja)
Sme{a od pra{ini (hx2) (Hollister-Stier Labs.-h2, Dermatophagoides pteronissinus-d1, Dermatophagoides farinae-d2,
Blatella germanica -i6)
Sme{a perduvi (ex73) (e70-perduvi od guska, e85-perduvi od koko{ka, e86-perduvi od patka, e213-perduvi od
papagal)
Sme{a od meso (fx10) (f26-svinsko meso, f27-tele{ko meso, f83-pile{ko meso, f75-`ol~ka od jajce, f284misirkino meso)
Sme{a od muvli (mx2) (Penicillium notatum-m1, Cladosporium herbarum-m2, Aspergillus fumigatus-m3, Candida albicansm5, Alternaria alternata-m6, Helminthosporium halodes-m8)
Sme{a od ovo{je (fx15) (f33-portokal, f49-jabolko, f92-banana, f95-praska)
Sme{a od apetisani (fx1) (kikiriki-f13, le{nik-f17, brazilski orev-f18, badem-f20, kokos-f36)
Sme{a `ivotinski vlakna (ex1) (e1-vlakna od ma~e, e3-vlakna od kow, e4-vlakna od krava, e5-vlakna od ku~e)
Sme{a poleni od drva (tx5)(Alnus incana-t2, Corylus avellana-t4, Ulmus americana-t8, Salix caprea-t12, Populus deltoidst14)
Sme{a od zelen~uk (fx14) (f25-domat, f214-spana}, f216-zelka, f218-piperka)
Sme{a od `itarici (fx20) (f4-p~enica, f5- r‚, f6-ja~men, f9-oriz)
Sme{a od morski plodovi (fx2) (f3-riba, f24- rak, f37-{kolka, f40-tuna, f41-losos)
w21 – Parietaria judaica (br{len)
e1 – vlakna od ma~e
e5 – vlakna od ku~e
d1 – Dermatophagoides pteronissinus
f1 – Belka od jajce
f2 – Mleko
f13 – Kikiriki
ANALIZA NA SLU^AJ
18.2.3. Ispituvawe alergeni spored
dijagnoza
Atopiski dermatit. Atopiskiot dermatit e prvata
manifestacija vo alergiskiot mar{ so vrv na pojavuvawe
pred tretiot mesec od `ivotot. Prevalencijata na
atopiskiot dermatit e okolu 20%, dodeka 60% od pacientite
prvoto pojavuvawe go imaat vo tek na prvata godina od
`ivotot i 85% pred pettata godina od `ivotot.
Atopiskiot dermatit e docna reakcija (kleto~na reakcija),
Institut za imunobiologija i humana genetika
Alergiska astma:
Slu~ajot na Filip
Davidovski, 12 godi{no dete
so hroni~na astma i rinit.
203
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
nasproti urtikarijata koja e rana reakcija (vaskularna
reakcija). Pacientite so atopiski dermatit imaat
hiperreaktivnost na ko`ata kon holinergiski supstanci
analogno na bronhijalnata hiperreaktivnost kaj astma.
Opi{an e visok procent prevalencija na astma, od 30 do
76%, kaj deca so atopiski dermatit i soodvetstvuva na
te`inata na atopiskiot dermatit. Kaj nekoi pacienti
mo`e da se vidi i bronhijalna hiperreaktivnost, bez
simptomi na astma.
Urtikarija. Urtikarijata mo`e da se javi kaj deca ili kaj
vozrasni. Kaj deca postoi golema verojatnost deka e
povrzana so zgolemeno nivo specifi~en IgE.
Alergiski rinit. Najva`ni simptomi na alergiskiot rinit
se: kivawe, te~ewe videnesta sluz od nosot, ~e{awe vo
nosot i o~ite, zatnat nos.
Oralen alergiski sindrom. Oralniot alergiski sindrom
(OAS) e vid kontaktna urtikaria koja se javuva nekolku
minuti posle vnesuvawe opredelni hrani kon koi{to bil
pacientot senzibi-liziran. Simptomite se javuvaat na
usnite i na usnata praznina i po definicija ne vklu~uvaat
drugi organi.
Oralniot alergiski sindrom (OAS) e vtor simptom po
frekfencija od grupata IgE ovozmo`eni preosetlivosti
na hrana kaj vozrasnite lica. Redosledot e sledniov:
urtikarija/angioedem (70%), oralen alergiski sindrom
(54%), astma (37%), i anafilaksija 27.5%).
Svire`i vo detstvoto. Kaj deca do tri godini svire`ite
vo gradite se javuvaat do 30%, dodeka kaj deca do 6 godi{na
vozrast tie se zgolemuvaat do 50%. Okolu 60% od decata so
svire`i vo gradite gi gubat simptomite posle tretata
godina i ne razvivaat astma.
Astma. Astma e hroni~no vospalitelno naru{uvawe na
di{nite pati{ta vo koe {to u~estvuvaa mnogu kletki, a
osobeno mastocitite i eozinofilite. Vo predisponira~ki
lica, ova vospalenie mo`e da dovede do razvoj na astma so
razli~en stepen, naj~esto povratliv, i so stesnuvawe na
di{nite pati{ta.
18.3. Tolkuvawe rezultati od
protivglobulinski test
18.3.1. Direkten protivglobulinski test
Rezultatot na titarot za protiv-IgG e 48, a za protiv-C3 e
36. Ova se dobiva koga }e se soberat vrednostite koi
odgovaraat za soodvetnite stepeni na aglutinacija dobieni
204
Institut za imunobiologija i humana genetika
18. ANALIZA NA PREOSETLIVOST
od epruvetite so razli~no razreduvawe na protivglobulinskiot serum. Taka aglutinacijata 4+ odgovara na
10, 3+ odgovara na 8, 2+ odgovara na 6, 1+ na 4, + na 2, a 0
zna~i deka nema aglutinacija. Vakov slu~aj mo`e da se
dobie koga bi pome{ale jak monospecifi~en serum i
eritrociti silno senzibilizirani so IgG i umereno-silno
senzibilizirani so C3, sostojba sli~na kako kaj zabolenite
od AIHA predizvikana od topli protivtela.
Vo klinikata direktniot protivglobulinski test e korisen
pri dijagnozata na:
- akutna i docna hemoliti~ka posttransfuziska
reakcija, isleduvawe na postransfuziskite reakcii
voop{to;
- avtoimunite hemoliti~ki rakcii;
- hemoliti~kata bolest na novorodeno;
- imunolo{kite hemoliti~ki reakcii predizvikani od
lekovi;
- kako pozitivna avto-kontrola pri krvnogrupnoto
tipizirawe, pri prosejuvaweto (skriningot) za protivtela i pri vkrstenata proba.
Iako skalata za procenka na ja~inata na aglutinacijata e
od golemo zna~ewe pri tolkuvawe na rezultatite dobieni
od bolnite od avtoimuna hemoliti~ka anemija (AIHA),
sepak nejzinata va`nost ne treba da se prezgolemuva. Iako
mo`e da se ka`e deka stepenot na destrukcija na
eritrocitite e pravoproporcionalen so koli~inata na
protivtela vrzani na niv, sepak postojat brojni isklu~oci.
Kako i da e, hemoliza vo primerokot e obi~no prisutna
koga imame oblo`uvawe na eritrocitite so golema
koli~ina na IgG i C3.
DAT titarot i skalata za procenka na ja~inata na
aglutinacijata mo`at da ni pozlu`at i pri sledeweto na
terapijata kaj pacientite. Iako ne retko se slu~uva
protivglobulinskiot test da ostane pozitiven i kaj onie
pacienti kaj koi AIHA e vo faza na remisija, sepak i kaj
niv titarot na DAT e namalen.
ANALIZA NA SLU^AJ
Vo slu~aj na pozitiven protivglobulinski test treba da se
misli na slednive mo`nosti:
- profilaksa so imuni globulini na Rh negativna majka;
- postoewe na topli avtoprotivtela bez hemoliti~ka
aktivnost;
- promeni vo membranata na crvenite kletki, predizvikana naj~esto pri koristeweto na nekoi lekovi (na pr.
cefalosporini) i posledo-vatelna nespecifi~na
apsorpcija na globulini na niv;
- nespecifi~na adsorpcija na globulini pri hipergamaglobulinemija, paraproteinemija;
- in vitro aktivacija na komplementot poradi postoewe
Institut za imunobiologija i humana genetika
Hemoliti~ka bolest na
novorodeno:
Slu~ajot na Magda
Srbinovska, plod vo
imunolo{ki distres.
205
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
na ladni avtoprotivtela, na pr. kaj koagulirana krv
posle ladewe;
- poliaglutinacija, dokolku dojde do izlo`uvawe na
skrienite protivgeni (kriptoprotivgeni) ili dokolku
protivglobulinskiot serum e zagaden so protiv-T (op{t
protivgen normalno prisuten vo membranata na
eritrocitite, da ne se me{a so protivT-Li serum).
18.3.2. Indirekten protivglobulinski
test
Doka`uvawe na protivgeni: Golem broj na protivgeni
seu{te se otkrivaat i doka`uvaat so pomo{ na indirektniot protivglobulinski test (na pr. Fya, Fyb, K, k, S, s, Jka,
Jkb). Indirektniot protivglobulinski test, dokolku kako
sredstvo za miewe so koristi fosfatniot pufer, e metod
na izbor pri doka`uvawe na retki protivgeni (Lua, Wra,
Kpa ), ~esti protivgeni (Coa, Jsb, Kpb) kako i na slabi
protivgenski varijanti (Dslabo, DVI, Cw).
Doka`uvawe na protivtela: Indirektniot protivglobulinski test e neophoden del od testovite za
prosejuvawe (skrining) na protivtela i vkrstenata proba.
Pri toa ponekoga{ e potrebno i da se napravat nekoi
modifikacii vo samiot test. Na primer, protivtelata
koi se va`ni pri upotrebata na transfuzija na krv najdobro
se otkrivaat dokolku se upotrebi albuminskata tehnika
(30 min na 370C). Isto taka, izveduvaweto na testot vo
epruveti so upotrebata na LISS (fiziolo{ki rastvor so
niska koncentracija na joni), ja zgolemuva senzitivnosta
vo otkrivaweto na protivtelata kon Rh protivgenot, iako
ponekoga{ neuspeva da go otkrie prisustvoto na protiv-K.
Osoben problem mo`e da prestavuvaat i ladnite
protivtela so {irok temperaturen optimum na deluvawe.
Vo dene{no vreme metodot so epruvetki, koi se upotrebuvaat za izveduvawe na indirektniot protivglobulinski
test, se pove}e se zamenuvaat so upotreba na posenzitivni
metodi, (kakvi {to se gel testovite ili tehnikite so
cvrsta faza), osobeno pri prosejuvaweto (skriningot) i
identifikacijata na protivtela.
Indirektniot protivglobulinski test, so upotreba na
albuminskata tehnika, seu{te e metodot na izbor pri
procenkata na klini~koto zna~ewe na protivtelata koi se
otkrivaat na ovoj na~in. Toj, isto taka, pretstavuva
standarden test i pri titracijata na protivtelata.
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
206
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET
BLOK 7
BLOK 7- AVTOIMUNITET
U^EBNI CELI:
VE@BA 19. SITEMSKI AVTOIMUNITET (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da:
“ go definiraat mestoto na sistemskiot avtoimunitet;
“ opredelat antikardiolipinski fosfolipidni
protivtela.
VE@BA 20. ORGAN SPECIFI^EN IMUNITET (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat:
“ go definiraat mestoto na organ specifi~niot
avtoimunitet;
“ opredelat koli~ina na protivtiroglobulinski
protivtela.
VE@BA 21. TOLKUVAWE AVTOIMUNITET (1 ~as)
Po zavr{uvawe na ve`bata, studentite }e znaat da:
“ tolkuvaat rezultati od sistemskiot i organ
specifi~niot avtoimunitet;
“ analiziraat slu~ai od avtoimunitetnite zaboluvawa.
POENI:
PRISUSTVO
1.5 poeni
ZNAEWE
3.0 poeni
VKUPNO: 4.5 poeni
Institut za imunobiologija i humana genetika
207
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
208
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET
VE@BA 19: SISTEMSKI
AVTOIMUNITET
19.1. Voved za avtoimunost
Poimot avtoimunost se odnesuva na odredeni patolo{ki
sostojbi vo koi se javuva o{tetuvawe na sopstvenoto tkivo
poradi aktivacija na imunolo{kiot sistem naso~ena kon
komponenti na normalnite tkiva ili organi. Tkivnite
o{tetuvawa mo`e da se ograni~eni na oddelni organi
(koga se raboti za organ-specifi~a avtoimunost) ili da se
manifestiraat so zasegawe na pove}e sistemi, kako na pr.
kaj revmatska bolest (koga se raboti za sitemska
avtoimunost ili organ-nespecifi~na avtoimunost).
Preminot od organ specifi~ni vo sistemski avtoimuni
zaboluvawa ne e oster (jasen) tuku tie se prepokrivaat vo
oblik na skala na avtoimuni zaboluvawa (Slika 19.1).
Od poseben nau~en interes e golemata razlika vo
zastapenost na avtoimunite bolesti pome|u polovite, so
mnogu pogolema zastapenost (pove}e od 75%) na ovie
bolesti me|u pacienti od `enski pol. Humoralni, kleto~ni
Slika 19.1: Skala na avtoimunite zaboluvawa.
Institut za imunobiologija i humana genetika
209
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
mehanizmi ili i dvata mo`at da se odgovorni za
patolo{kite procesi kaj avtoimunite bolesti, a malku
podobro karakterizirani se protivtela so razli~na tkivna
specifi~nost. Sepak ostanuva da se razjasnat golem broj na
pra{awa vo pogled na zapo~nuva~kiot impuls vo
avtoimunosta. Postojat dokazi deka nekoi protivtela se
patogeni, na pr. transferot na maj~ini IgG protivtela kaj
tireotoksikoza rezultiraat so minliva neonatalna
tireotoksikoza. Za mnogu drugi protivtela ne mo`e da se
doka`e deka direktno se patogeni, no tie pak mo`e da
slu`at kako dijagnosti~ki pokazatel za avtoimuna bolest.
Tradicionalno, avtoprotivtelata se identifikuvaa
naj~esto subjektivno, so koristewe na indirektna
imunofluorescencija. Napredokot vo molekulskite i
biohemiskite tehniki ovozmo`ija poprecizno identifikuvawe na protivgenite i razvivawe na pove}e
imunolo{ki metodi kako na pr. radioimunoesej, precipitacija vo gel, aglutinacija, nefelometrija i osobeno,
ELISA. So zgolemuvawe na potencijalot za standardizirawe, kvantificirawe i avtomatizacija, testovite za
ispituvawe na avtoprotivtela stanaa dostapni za pove}e
laboratorii, Sepak, zna~itelno razli~ie vo odgovorot
kon razli~ni komercijalni testovi seu{te postoi, glavno
zaradi razli~nata priprema na protivgenot vrzan za
cvrstata faza, no i zaradi razlikite vo afinitetot ili
aviditetot pome|u protivtelata od razli~ni individui.
19.2. Otkrivawe na avtoprotivtela
Avtoprotivtelata prisutni vo biolo{ki te~nosti se
otkrivaat isklu~ivo so imunohemiski tehniki bazirani
na detekcija na imuni kompleksi formirani pome|u avtoprotivteloto i celniot protivgen koj se nao|a vo tkivata,
kletkite ili pak e vo rekombinantna forma.
Slika 19.2: Kvantitativna
imunoprecipitaciska kriva
(Heidelberger-Kendall).
210
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET
Vo imunohemiskite reakcii, dodavawe na raste~ka
koli~ina protivgen na konstantna koli~ina na protivtelo,
rezultira so raste~ka precipitacija, dostignuva plato i
potoa pa|a, kako {to objasnile u{te vo 1935 godina
Heidelberger i Kendal (Slika 19.2). Namaluvaweto na
precipitacijata pri povisoki koncentracii na protivgen
se dol`i na formiraweto na pomali, polesno rastvorlivi
kompleksi i mo`e da vodi do la`no negativen rezultat.
19.2.1. Indirektna imunofluorescencija
Indirektna imunofluorescencija e naj~esto koristen test
za skrining za prisustvo na avtoprotivtela. Kako supstrat
vo reakcijata protivgen - protivtelo se koristi tkivo od
gluvci, staorci ili primati koi ne poka`uvaat vkrstena
reaktivnost me|u razli~nite `ivotinski vidovi.
19.2.2. Aglutinacija
Testovite na aglutinacija vklu~uvaat premostuvawe so
specifi~no protivtelo na specifi~ni partikli oblo`eni
so protivgeni, so {to se formiraat golemi, makroskopski
agregati. Vo najgolem del, prvite testovi za ispituvawe na
avtoprotivtela bea bazirani na hemaglutinacija vo koja
kako nosa~ za protivgenite se koristele eritrociti. Vo
ovie testovi, IgM protivtelata podobro aglutiniraa od
IgG protivtelata poradi nivnata pentamerna struktura
koja ovozmo`uva postoewe na 10 protivgen - vrzuva~ki
mesta po molekula. Pokraj eritrociti, kako nosa~i na
protivgeni se koristat `elatin i lateks, a tie obezbeduvaat pogolema inertnost i stabilnost na sistemot. Iako
ovie testovi glavno se dizajnirani za otkrivawe na
klini~ki va`nite IgG avtoprotivtela, nizok titar na
IgM protivtela koi vkrsteno reagiraat ili klasi~niot
IgM revmatoiden faktor, potencijalno vlijaat na
rezultatot. Ovie metodi se vo golem del nadminati od
posenzizitvni i reproducibilni novi tehniki.
19.2.3. Imunodifuzija
Imunodifuzijata e tehnika so dobra specifi~nost, no
mala senzitivnost. Sozdavaweto na precipitaciska linija
vo gel e zavisna od upotrebata na soodvetni koncentracii
na protivgen i test protivtelo.
19.2.4. Imunoprecipitacija
Imunoprecipitacijata na kleto~ni ekstrakti so avtoimuni serumi e senzitivna tehnika za demonstracija na
protivtela kon snRNP ili sli~ni partikli. Principot se
sostoi vo analiza na RNP-protivtelo kompleksite spored
sodr`inata na RNK po SDS-akrilamidna elektroforeza.
Ovaa tehnika e prili~no komplicirana i dolgotrajna, pa
ne e pogodna za rutinska laboratoriska primena.
Institut za imunobiologija i humana genetika
211
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
19.2.5. Imunoblotirawe
Ovaa isklu~itelno senzitivna tehnika e va`na za
karakterizacija na specifi~nost na protivtela od ist
primerok serum, ili za definitivna identifikacija na
poinaku neidentifikuvano protivtelo. Proteinite od
kleto~niot ekstrakt (koi gi sodr`at i ispituvanite
protivgeni) se razdeluvaat na SDS-PAGE i se prenesuvaat
na nitrocelulozna membrana. Damkite od membranata potoa
se inkubiraat so serumot koj se ispituva, pa rezultira~kiot
kompleks protivgen-protivtelo se vizuelizira so enzimski
obele`eni probi. Protivtela kon konformaciski epitopi,
kako na pr. SS-A (Ro), se odnesuvaat nekonzistentno vo
ovaa tehnika.
19.2.6. ELISA
ELISA tehnikata e mnogu senzitivna i reproducibilna.
Vo ovie testovi bunar~iwa od mikrotitarska plo~ka se
oblo`uvaat so prigotven protivgen. Pritoa, ~istotata na
prigotveniot protivgen e od fundamentalno zna~ewe za
specifi~nosta na testot. Slobodnite vrzni mesta se
blokiraat so inerten protein, a so efikasnosta na
blokira~kata stapka mo`e da se vlijae na senzitivnosta na
testot.
Slika 19.3: VARELISA metod
za opredeluvawe avtoprotivtela na Institut za imunobiologija i humana genetika.
212
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET
19.2.7. ELIA
EliA dvDNK testot se raboti vo bunar~iwa oblo`eni so
dvoveri`na plazmidska DNK. Po dodavawe na ispituvaniot
serum, nevrzanite protivtela se plaknat, a na formiranite
kompleksi DNK-protivtela se dodavaat sekundarni, protiv
IgG protivtelata (IgG konjugat) obele`ani so enzim (za
da se formira protivtelo-konjugat kompleks). Po odredena
inkubacija nevrzaniot konjugat se izmiva i vrzaniot
kompleks se inkubira so rastvor za razvivawe na reakcijata.
Kvantifikacijata se pravi preku merewe na fluorescencija i sporedba so kalibraciski krivi dobieni vrz
osnova na rastvori so poznata koncentracija na protivtela
(Slika 19.4).
19.2.8. Primerok za ispituvawe
Site serolo{ki testovi za ispituvawe na avtoprotivtela
se izveduvaat na primeroci od serum. Tie treba da se
~uvaat na 4 C dodeka se analiziraat ili pak na -20 C, ako
treba da se analiziraat po podolgo vreme (nekolku meseci).
Za nekoi aglutinaciski testovi, serumot treba prethodno
da se zagree 30 min na na 56oC za da se inaktivira
komplementot. Pritoa treba da se ima predvid deka
temperaturnata inaktivacija go pravi serumot neadekvaten
za pove}eto ELISA testovi.
19.2.9. Stabilnost na protivtelata
Pove}eto avtoprotivtela se isklu~itelno stabilni.
Primerocite serum mo`e da se ~uvaat 2-3 nedeli na 4oC
bez da dojde do degradacija, ako primerokot ne se
kontaminira so bakterii ili fungi. Isklu~ok od ova se
protivtelata kon glikoprotein povrzan so mielinot koi
mora da se ~uvaat na -20oC do analizata.
Slika 19.4: [ematski prikaz
na ELIA metod za opredeluvawe avtoprotivtela na
Insttitut za imunobiologija i humana genetika.
19.3. Sistemski avtoimuni zaboluvawa
19.3.1. Protivtela povrzani so revmatska
bolest
19.3.1.1. Fosfolipidni protivtela
Ova e generi~ko ime za pogolema grupa protivtela,
povrzani so istoimeniot sindrom. Protiv-kardiolipinskite protivtela pripa|aat na familija vkrsteno
reaktivni protivtela koi reagiraat so negativno
naelektrizirani fosfolipidi. Ovie protivtela nao|aat
primena vo ispituvaweto na rizik od tromboza kaj pacienti
so SLE ili povrzani bolesti, kako i za sledewe na
bremenost kaj pacientki so rizik od spontan abortus. Pri
Institut za imunobiologija i humana genetika
213
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
toa, niski ili vremeno pozitivni rezultati ne se
relevantni za dijagnoza na antifosfolipiden sindrom.
Najdobro so ovoj sindrom koreliraat IgG protivtelata.
Spored kriteriumite od 1999 godina za antifosfolipiden
sindrom se zboruva koga se ispolneti najmalku eden
klini~ki i eden laboratoriski kriterium od dvata
klini~ki i dvata laboratoriski:
Klini~ki kriteriumi:
1. Vaskularna tromboza: edna ili pove}e epizodi na
arteriska, venska ili tromboza na mali krvni sadovi vo
bilo koe tkivo ili organ.
2. Komplicirana bremenost: edna ili pove}e neobjasneti
smrtnosti na morfolo{ki oformen plod po 10-tata
nedela na bremenost. Edno ili pove}e predvremeni
ra|awa pred 34-nedela na bremenost poradi seriozna
pre-eklampsija, eklampsija ili insuficiencija na
placentata. Tri ili pove}e neobjasneti posledovatelni
spontani abortusi pred 10-tata nedela na bremenost.
Laboratoriski kriteriumi:
1. Protivkardiolipinski protivtela: prisustvo na
protivkardiolipinski protivtela od IgG ili IgM
izotip vo sreden ili visok titar vo dva ili pove}e
navrati na rastojanie od 6 nedeli.
2. Lupus antikoagulant: lupus antikoagulant prisuten
vo plazmata vo dva ili pove}e navrati na rastojanie od
6 nedeli.
19.3.1.2. Nuklearni protivtela (ANA)
Nuklearnite protivtela se heterogena grupa na avtoprotivtela koi ~esto se nao|aat kaj pacienti so sistemski
revmatski bolesti. Se delat na dve grupi, protivtela kon
strukturni, nerastvorlivi proteini i protivtela kon
rastvorlivi proteini.
Sistemskiot lupus eritematozus e bolest karakterizirana
so mnogu razli~ni avtoprotivtela. Eden prose~en pacient
so lupus ima najmalku 3 razli~ni vida na avtoprotivtela.
Vakva poliklonalnost na avtoprotivtelata postoi u{te
kaj skleroderma. Prevalencata na razli~nite protivtela
kaj bolnite od SLE varira od 70% za protivtela kon
ednoveri`na DNK, do 3% za protiv AluRNK protivtela.
Protivtelata kon nativna ili dvoveri`na DNK se silno
povrzani so SLE.
19.3.2. Protivtela kon neutrofilnata
citoplazma
Opi{ani se protivtela kon razli~ni vnatrekleto~ni
enzimi od neutrofilite, a povrzani so nekrotizira~ki
vaskulitis i vaskulitisi kaj revmati~na bolest. So
indirektna imunofluorescencija na neutrofili fiksirani so etanol, se otkrivaat dva razli~ni oblici na boewe,
214
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET
edniot so potencirawe na centralniot interlobularen
del (t.n. C-ANCA) i vtoriot, perinuklearen ili P-ANCA.
Ovoj vid na boewe mo`e da se sretne i kaj prisustvo na
protivnuklearni protivtela (ANA), osobeno protivtela
kon dvoveri`na DNK i protivhistonski protivtela.
19.3.3. Sistemski lupus eritematozus
(SLE)
Sistemskiot lupus eritematozus e prototip na avtoimuna
bolest, koja se karakterizira so sozdavawe paleta od
razli~ni avtoprotivtela i pove}esistemsko zasegawe.
Sli~no kako i drugi avtoimuni bolesti, SLE verojatno se
dol`i na kombinacija od genetski i faktori od okolinata
koi pridonesuvaat za sostojbata na imuna hiperreaktivnost.
Glavnata serolo{ka karakteristika na SLE e sozdavawe
avtoprotivtela naj~esto naso~eni kon komponenti od
kleto~noto jadro. Ovie protivjadreni protivtela (ANA)
se vrzuvaat za razli~ni makromolekuli koi vklu~uvaat
DNK, RNK, histoni i pove}e kompleksi proteini-RNK
nare~eni snRNP (od small nuclear ribonucleoproteins). Kaj
SLE, celnite molekuli za ANA se ubikvitarno prisutni
vo kletkite, dodeka kaj zdravi individui tie se nedostapni
za imuniot sistem.
Iako ANA se skoro sekoga{ prisutni vo serumot od bolni
so SLE, ovie protivtela ne se edinstveno prisutni kaj
bolni so SLE, tuku se javuvaat i kaj bolni so bolesti na
svrznoto tkivo, revmatoiden artrit ili sindrom na Sjegren
(Sjögren). Ponatamu ANA mo`e da se otkrie i kaj 5% od
normalnite lica. Sepak, odredeni ANA se nao|aat
isklu~ivo kaj bolni so SLE i mo`e da slu`at kako
obele`uva~ za ova zaboluvawe. Taka, protiv-DNK i protiv
Sm protivtelata se identifikuvani kako eden od
kriteriumite za klasifikacija na pacientite so SLE.
Tabela 19.1: Avtoprotivtelata, nivnata molekulska
cel i klini~kata asocijacija kaj sistemski lupus
aritematozus (SLE).
Imaj}i ja predvid heterogenosta na SLE, dijagnozata SLE
se postavuva vrz osnova na nekolku kriteriumi koi
vklu~uvaat i klini~ki i laboratoriski naodi (Tabela
19.1).
19.3.3.1. O{tetuvawe na tkivoto
Od razli~nite manifestacii na SLE, nefritisot ja
Institut za imunobiologija i humana genetika
215
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
ilustrira kompleksnosta na bolesta. Toj se dol`i na
talo`eweto imuni kompleksi vo glomerulite koi go
aktiviraat komplementniot sistem i promoviraat
vospalenie. Vo imunite kompleksi, protiv-DNK protivtelata se glavna pri~ina za glomerulskoto o{tetuvawe.
Tie se del od golemiot spektar na protivtela naso~eni kon
nukleozomot, forma na DNK prisutna vo jadroto koja
sodr`i i proteinska i nukleinska komonenta. Bidej}i
DNK e vrzana za histonskoto jadro, oddelni pacienti mo`e
povremeno da sozdavaat protivtela kon DNK, histoni, ili
nukleozomi.
Sozdavaweto imuni kompleksi mo`e da se slu~i vo
cirkulacijata so protivtela koi vrzuvaat DNK ili
nukleozomi oslobodeni od mrtvi kletki. Alternativno,
kompleksite mo`e da se napravat vo bubregot so proces
nare~en in situ sozdavawe na imuni kompleksi.
Pokraj nefritot, avtoprotivtelata mo`e da posreduvaat
vo hematolo{kite manifestacii na bolesta. Citopenii,
kako avtoimuna hemoliti~ka anemija i trombocitopenija,
mo`e da se rezultat na vrzuvawe na avtoprotivtelata na
povr{inskite protivgeni od crvenite kletki (eritrocitite) ili trombocitite, po {to sleduva liza posreduvana
od komplement ili protivtelno posreduvana citotoksi~nost.
Zasegawe na centralniot nerven sistem, venski i arteriski
trombozi, kako i drugi antifosfolipidni sindromi mo`at
da bidat povrzani so SLE.
19.4. Zada~a
19.4.1. Opredeluvawe IgM
protivkardiolipinski protivtela
19.4.1.1. Potreben materjal za izveduvawe na ve`bata
Za odreduvawe IgM protivkardiolipinskite protivtela
(PKP) vo serum/plazma neophodni se:
- primerok na serum/plazma;
- plasti~en nosa~ za stripovi;
- stripovi (sekoj strip ima 8 bunar~iwa);
- razreduva~ na primerocite;
- pufer za plaknewe;
- standardi za PKP (0 E/ml; 4 E/ml; 8 E/ml; 20 E/ml; 40 E/
ml; 100 E/ml) vo SFP, koj sodr`i BSA, 0.095% natrium
azid i human serum serum;
- pozitivna kontrola; SFP koj sodr`i BSA, 0.095%
natrium azid i human serum;
- negativna konrola; SFP koj sodr`i BSA, 0.095%
natrium azid i human serum;
216
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET
- IgM HRP (horse-radish peroxidase) kowugat;
- TMB substrat (3,3',5,5' - tetrametilbezidin);
- rastvor za stopirawe na reakcijata (0.5 M H2SO4);
- pipeti od 10 mkL, 50 mkL, 100 mkL i 1000 mkL;
- plasti~ni prodol`etoci;
- kontejneri za puferot za plaknewe i razreduva~ot za
primerocite;
- destilirana ili dejonizirana voda;
- aparat za avtomatsko plaknewe;
- spektrofotometar (Victor2) sposoben da ja izmeri
absorbancata na 450 nm.
19.4.1.2. Priprema na pufer za plaknewe
Se zemaat 50 mL od koncentratot za plaknewe i se
prefrlaat vo ~ista kolba od 1000 mL. Koncentratot se
razreduva 20 pati so dodavawe na 960 mL destilirana voda
ili dejonizirana voda.
19.4.1.3. Priprema na rastvor za razreduvawe
Mnogu e va`no rastvorot za razreduvawe da ja otslikuva
prirodnata sredina na primerokot. Se priprema
neposredno pred stavaweto vo koli~ina ne pogolema od
onaa neophodna za soodvetniot broj na bunar~iwa. Za eden
strip e dovolen 1.5 mL od koncentratot na razreduva~ot za
primeroci. Na ovaa koli~ina se dodava 6 mL destilirana
ili dejonizirana voda. Vaka pripremeniot razreduva~ za
primerocite e stabilen 2 nedeli na temperatura od +2 do
+8oC, dokolku se ~uva vo dobro zatvoren kontejner.
19.4.1.4. Primerok
Za odreduvawe koncentracijata na PKP potrebno e 1 mL
primerok. Dokolku se koristi serum, krvta se zema so
venepunkcija, se ostava da sosiri i se odvojuva serumot so
centrifugirawe (5 minuti na 4000 vvm). Za dobivawe plazma
se koristi krv zemena so Heparin ili EDTA. Hemoliti~nite (hemoglobin ≤500 mg/dL), lipemi~nite (≤125 mg/
dL), ikteri~nite primeroci (bilirubin ≤30 mg/dL) ili
primerocite zagadeni so mikroorganizmi mo`at da vlijaat
vrz to~nosta na rezultatite pa poradi toa ne treba da se
upotrebuvaat. Ne treba da se koristat primeroci koi
stoele nesmrzanti pove}e od 24 ~asa.
Stabilnosta na primerokot iznesuva okolu 24 ~asa na
temperatura od 4-8oC. Dokolu e potrebno podolgotrajno
~uvawe na primerokot, toga{ toa treba da se napravi na
temperaturi poniski od -25oC.
Pred da se premine na izveduvawe na testot, primerokot
treba da se razredi so specijalen razreduva~ vo odnos 1:101.
Ova razreduvawe se pravi koga na 10 mkL od primerokot }e
mu se dodadat 1000 mkL od razreduva~ot.
Institut za imunobiologija i humana genetika
217
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
19.4.1.5. Protokol za rabota
Site standardi i primeroci se rabotat vo duplikat. Za
sekoj test treba da se napravi nova standardna prava. Site
hemikalii i primeroci pred da se po~ne so rabota treba da
se zagreat na sobna temperatura (+20 do +250C).
1. Se razreduva serumot/plazmata vo odnos 1:101.
2. Vo ramkata se mestat potrebniot broj na stripovi.
3. Bunar~iwata neposredno pred po~etokot na rabota se
izmivaat so pufer za plaknewe. Izmivaweto se vr{i na
toj na~in {to bunar~iwata se polnat so 300 mkL pufer
za plaknewe. Puferot stoi vo bunar~iwata 20 sekundi
i potoa se frla.
4. Vo soodvetnite bunar~iwa se dodava po 100 mkL od
standardite, kontrolite i razredenite primeroci
(Slika 19.5)
5. Se ikubira 30 minuti na sobna temperatura (18-250C)
bez da se me{a.
6. Po inkubacijata site bunar~iwa se plaknat 3 pati so
pufer za plaknewe.
Slika 19.5: [ema za postavuvawe standardi, kontroli
i primeroci od pacienti za
opredeluvawe avtoprotivtela so VARELISA.
7. Vo site bunar~iwa se dodava 100 mkL od kowugatot.
8. Se ikubira 30 minuti na sobna temperatura (18-250C)
bez da se me{a.
9. Po inkubacijata site bunar~iwa povtorno se plaknat
3 pati so pufer za plaknewe.
10. Vo site bunar~iwa, direktno od {i{enceto, se dodava
po 100 mkL od 3,3',5,5' - tetrametilbenzidin (TMB)
substratot.
11. Se inkubira 10 minuti na temno na sobna temperatura
(18-250C) bez da se me{a.
12. Vo site bunar~iwa se dodava po 50 mkL od rastvorot
za stopirawe na reakcijata.
13. Se proveruva dali sekoj strip e pravilno namesten
218
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 19: SISTEMSKI AVTOIMUNITET
vo svoeto le`i{te i se meri absorbancata na 450 nm so
pomo{ na spektrofotometar (Victor2). Se prepora~uva
absorbancata da se izmeri vo rok od 30 minuti po
dodavaweto na rastvorot za stopirawe na reakcijata, za
da se izbegne bilo kakvo vlijanie na nadvore{nite
faktori.
19.4.1.6. Presmetuvawe na rezultatite
Za sekoj test se pravi nova standardna prava. Najprvin se
presmetuvaat srednite vrednosti na standardite i se
nanesuvaat na bilogaritamski grafikon vo odnos na
nivnite koncentracii. Nepoznatite primeroci se
ot~ituvaat od standardnata prava. Primerocite koi imaat
absorbanca pogolema od vrednosta na najgolemiot standard
se ozna~uvaat so >100 E/mL. Ovie primeroci treba da se
razredat i povtorno da se odredi koncentracijata na
protivkardiolipinskite protivtela.
Kvalitativno presmetuvawe: Vo kvalitativnite
presmetki najprvin se odreduva OGcut-off na sekoj ispituvan
primerok posebno. OGcut-off se odreduva na sledniov na~in:
OGcut-off = OGpozitivna kontrola x Faktor
Vrednosta na faktorot za pozitivnata kontrola se zema od
sertifikatot za kontrola koj se nao|a vo sekoj komplet za
rabota.
Primer (Tabela 19.2):
OGpozitivna kontrola = 0.587
Faktor
= 0.3
OGcut-off
= 0.587 x 0.3 = 0.18
Presmetuvawe na soodnosot: Za da se dobie pretstava
kolku eden pacient e pozitiven za dadenata analiza treba
da se presmeta soodnosot. Soodnosot za sekoj primerok
posebno se presmetuva na sledniot na~in:
Soodnos = OGispituvan primerok / OGcut-off
Primer (Tabela 19.2):
OGcut-off
= 0.18
OGispituvan primerok = 0.235
Soodnos
= 0.235/0.18= 1.30
19.4.1.7. Presmetuvawe koncentracija na
IgM protivkardiolipinskite protivtela
Koncentracijata na IgM protivkardiolipinskite protivtela se presmetuva spored prethodno opi{aniot protokol.
Rezultatite se vnesuvat vo Tabela 19.
Institut za imunobiologija i humana genetika
219
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 19.2: Primer za presmetuvawe koncentracija na
avtoprotivtela (gore) i
mesto za presmetuvawe (dolu).
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
220
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 20: ORGAN SPECIFI^EN AVTOIMUNITET
VE@BA 20: ORGAN
SPECIFI^EN AVTOIMUNITET
20.1. Organ specifi~ni avtoimuni zaboluvawa
20.1.1. Endokrini avtoimuni bolesti
Protivtelata kon parietalnite gastri~ni kletki i
intrinzi~niot faktor, sekretoren produkt na parietalnite kletki, se silno povrzani so avtoimuniot (tip A)
gastritis i perniciozna anemija. Vo kombinacija, dvete
avto-protivtela se visoko specifi~ni (90%) za avtoimun
gastritis i perniciozna anemija, dodeka ne postoi
povrzanost so antralniot (tip B) gastritis koj tipi~no se
sretnuva kaj duodenalen ulkus i infekcija so Helicobacter
pylori.
20.1.1.1. Protivtela kon parietalni
gastri~ni kletki
Avtoprotivtelata kon gastri~nite parietalni kletki
~esto (40%) se prisutni kaj drugi organ-specifi~ni
avtoimuni bolesti, osobeno kaj bolni od avtoimuna
tiroidna bolest. Prisutni se vo pomal titar kaj 10-15% od
postari pacienti bez da postoi nekakov dokaz za prisustvo
na avtoimuna bolest.
Ovie protivtela se specifi~ni za parietalnite kletki i
reagiraat ili so beta-podedinicata od H+ i K+ ATP-aza ili
so intrinzik faktorot.
20.1.1.2. Protivtela kon intrinzik
faktorot
Intrinzik faktorot e glikoprotein so masa 70 kDa
sekretiran od parietalnite kletki od gastri~nata mukoza,
a slu`i kako vrzuva~ki i transporten protein za vitaminot
B12. Avtoprotivtelata naso~eni kon nego mo`e da se
Institut za imunobiologija i humana genetika
221
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
podelat vo dve grupi. Tip 1 protivtelata se blokira~ki
protivtela koi go inhibiraat vrzuvaweto na vitamin B12
i se sretnuvaat kaj 70% od bolnite so perniciozna anemija.
Tip 2 protivtelata se vrzuva~ki protivtela koi se
vrzuvaat za intrinzik faktorot i za kompleksot intrinzik
faktor-vitamin B12 i taka spre~uvaat da dojde do
apsorbcija vo crevata, a se sretnuvaat kaj okolu 35% od
bolnite so perniciozna anemija.
20.1.1.3. Avtoprotivtela povrzani so
dijabetes
Postojat pove}e avtoprotivtela povrzani so insulin
zavisniot dijabetes, no site se so ograni~eno klini~ko
zna~ewe za terapijata na bolesta. Nivnoto zna~ewe e za
eventualno predviduvawe razvojot na bolesta kaj rodnini
na bolni so dijabetes. Pri ispituvawe na asimptomatska,
a visoko rizi~na populacija za dijabetes, pozitiven odgovor
na dve ili pove}e protivtela od avtoprotivtelata kon
dekarboksilaza na glutaminskata kiselina, kon kletki od
pankreasnite ostrov~iwa ili kon insulin, e povrzan so
visoka incidenca za po~etok na dijabet vo slednite 5 do 7
godini. Naj~esto, okolu 75% od pacientite so dijabet se
pozitivni za avtoprotivtela kon pankreasnite ostrov~iwa
vo momentot na dijagnoza na bolesta. Ovie protivtela se
reaktivni so celite ostrov~iwa, vklu~itelno so alfa- i
beta-kletkite, a prepoznavaat i kletki koi sozdavaat
glukagon, somatostatin i insulin. Protivinsulinskite
protivtela se prisutni kaj okolu 40% od novo dijagnosticiranite pacienti so dijabet. Nivnata koncentracija
se namaluva so vozrasta pa taka prisutni se skoro kaj site
pacienti pod 4 godini starost, no samo kaj okolu 4% od
vozrasnite.
20.1.1.4.Tiroidni avtoprotivtela
Postojat razli~ni avtoprotivtela povrzani so avtoimunata tiroidna bolest, koi se karakterizirani kako
primarni (naso~eni kon membranskite receptori i se
direktno patogeni) ili sekundarni (ne se direktno
patogeni, no slu`at kako korisni dijagnosti~ki markeri).
Primarni tiroidni protivtela. Najdobro poznatoto
primarno tiroidno avtoprotivtelo e dolgo-deluva~kiot
tiroiden stimulator LATS (long-acting thyroid stimulator),
koe e IgG protivtelo naso~eno kon ekstracelularniot
domen na TSH receptorot. Ova stimulatorno protivtelo e
od zna~ewe za dijagnostika na Graves-ova bolest i ima
golemo zna~ewe za to~na klasifikacija na neonatalna
tiroidna disfunkcija.
Sekundarni tiroidni protivtela. Najva`ni vo ovaa grupa
avtoprotivtela se protivtela kon tiroglobulinot (TG) i
protivtela kon tiroidnata peroksidaza (TPO). Poka`ano
e deka samo kaj 1% od pacientite so avtoimuna tiroidna
bolest mo`e da se utvrdat protiv-TG protivtela vo otsustvo
na protiv-TPO protivtela. Taka, klini~koto zna~ewe na
protiv-TG protivtelata e ograni~ena na mala grupa na
222
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 20: ORGAN SPECIFI^EN AVTOIMUNITET
pacienti so simptomi za avtoimuna tiroidna bolest koi se
negativni za protiv-TPO protivtela.
20.1.2. Gastrointestinalni avtoimuni
bolesti
20.1.2.1. Protivtela povrzani so celijakija
Celijakijata e postojana intolerancija na gluten koja
vodi do atrofija na crevnite resi~ki kaj osetlivite lica
za gluten, {to pretstavuva definitivna dijagnoza na celijakijata. Za pove}eto kleto~ni i humoralni imunolo{ki abnormalnosti, odgovoren e alfa-glijadinot, proteinska
frakcija od p~enicata. Za dijagnoza na celijakijata se
koristi skrining na protiv-glijadinski protivtela,
protivtela kon retikulin i protiv-endomizijalni
protivtela. Sekoj od ovie testovi e so razli~na specifi~nost i senzitivnost. Cirkulira~kite IgA protivtela
kon glijadin imaat skoro 100% specifi~nost, no se so relativno niska senzitivnost. IgG protivtelata kon glijadin, pak, imaat poniska specifi~nost, no povisoka senzitivnost. Ako se koristat istovremeno, dvata vida protivtela ovozmo`uvaat specifi~nost od 90% i senzitivnost
od 95% vo dijagnosticiraweto na celijakija. IgG protivtela kon glijadin mo`e da se sretnat kaj mal procent na
bolni od ulcerativen kolitis, IgA nefropatija, Kronova
bolest, revmatoiden artrit i intolerancija na kravjo
mleko.
20.1.3. Avtoimuna bolest na crniot drob
Naj~esto, protivtela koi se povrzuvaat so avtoimuni
bolesti na crniot drob se mitohondrijalni protivtela,
Tabela 20.1: Protivtela
povrzani so avtoimuna bolest na crniot drob.
Institut za imunobiologija i humana genetika
223
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
protivtela kon maznite muskuli i protivtela kon
crnodrobni/bubre`ni mikrozomi. Vo najgolem del od
slu~aite, titarot na ovie protivtela e od klini~ko
zna~ewe. Taka, visok titar na mitohondrijalni protivtela
e povrzan so primarna bilijarna ciroza vo pove}e od 95%
od slu~aite, dodeka nizok titar na ovie protivtela se
sretnuva kaj hroni~en aktiven hepatit, mehani~ka
bilijarna opstrukcija i nekolku drugi avtoimuni bolesti.
Za pove}eto od razli~nite mitohondrijalni protivtela,
numerirani od M1 do M9, glavno se poznati protivgenskite
celi, a povrzani se so razli~ni bolesti.
20.1.4. Protivtela povrzani so
nevromuskularni bolesti
20.1.4.1. Protivtela kon acetilholinski
receptori
Ovie protivtela se otkrieni kaj bolni so mijastenija
gravis, a se sretnuvaat vo poniska koncentracija i kaj
bolni so okularna mijastenija. Postojat 3 tipa vakvi
protivtela: vrzuva~ki, blokira~ki ili modulira~ki
protivtela. Vrzuva~kite protitela se reaktivni kon
nekolku epitopi od motornata plo~a i ne go prepoznavaat
acetilholinskoto vrzuva~ko mesto. Se sretnuvaat kaj 88%
od bolnite so aktivna mijastenija. Blokira~kite
protivtela reagiraat so acetilholinskoto vrzuva~ko
mesto i se sretnuvaat kaj 50% od bolnite so aktivna bolest.
Modulira~kite protivtela nekoga{ se od pomo{ za
dijagnoza na bolni so mijastenija gravis, koi se negativni
za ostanatite dva vida na protivtela.
20.1.5. Avtoprotivtela povrzani so
bubre`na bolest
20.1.5.1. Protivtela kon glomerulskata
bazalna membrana
Ovie protivtela se sretnuvaat kaj klasi~en nelekuvan
Gudpasterov sindrom (Goodpasture syndrom) i se naso~eni
kon nekolagenskiot del od alfa-3 verigata vo tip IV
kolagenot. Klasi~nata prezentacija na ovaa bolest e
rapidno progresiven glomerulonefrit. Poradi sli~nosta
na protivgenskite epitopi pome|u renalnata i belodrobnata alveolarna membrana, mo`na e istovremena pojava
i na pulmonalni hemoragii i hemoptizii. Visok titar na
ovie protivtela mo`e da perzistira duri i po klini~ka
remisija i sporo se namaluva vo tek na nekolku meseci.
Renalna transplantacija e opcija za lekuvawe samo kaj
pacienti negativni za protivtela, zaradi izbegnuvawe na
remisija na bolesta.
224
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 20: ORGAN SPECIFI^EN AVTOIMUNITET
20.2. Zada~i
20.2.1. Opredeli koncentracija na
tiroidni avtoprotivtela (TG i TPO)
Koncentracijata na tiroidnite avtoprotivtela na
Institutot za imunobiologija i humana genetika se
opredeluva so UniCap-101 posvten samo za taa namena (Slika
20.1). Poradi visokata fluorescencija koja se koristi pri
opredeluvaweto na avtoprotivtelata, istovremenoto
koristewe na aparatot za ispituvawe alergii i za
ispituvawe avtoprotivtela doveduva do zagaduvawe na
diskot, poradi {to e najdobro da se koristat dva oddelni
aparati za ovie dve nameni.
Prvo se vklu~uva kompjuterot, a vedna{ potoa aparatot.
So dvojno kliknuvawe na ikonata ImmnunoCAP Information
Data Manager se vleguva vo programata (softver) preku koja
se povrzani aparatot i kompjuterot.
Otkoga }e se vklu~i progarmata na ekranot so slika se
prika`ani dvata aparata (UniCap 100 i UniCap 101), a pod
niv na dolniot del se gledaat ikoni preku koi se kontrolira
rabotata. Vedna{ pod slikata na aparatot mo`e da se vidi
dali aparatot e vklu~en (vo toj slu~aj ima `olto svetlo i
pi{uva “free”-slobodno), isklu~en (crveno svetlo i pi{uva
Slika 20.1: UniKap-101 (UniCap-101) avtomatiziran laboratoriski sistem na Institutot za imunobiologija i
humana genetika, Medicinski
fakultet, Skopje specijalno
namenet za opredeluvawe avtoprotivtela.
“off-line”) ili ako raboti imame zeleno svetlo i pi{uva
“assay” (Slika 16.3). Koga }e vidime deka aparatot ja
postignal potrebnata temperatura i se povrzal so
kompjuterot (toa se gleda so `olta boja na ekranot ili na
ekranot od samiot aparat pi{uva: prepare run? (podgotvi se
za rabota)), kliknuvame edna{ na ikonata na dolniot del
od ekranot na koja pi{uva “request” (barawe) ili pritiskame
F2. Toga{, ni se prika`uvaat site pacienti koi dotoga{
se izraboteni. Od desnata strana na ekranot ima 3 ikoni
preku koi se vnesuvaat novi pacienti (ikonata so oznaka
Institut za imunobiologija i humana genetika
225
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Slika 20.2: Ekranot za vnesuvawe avtoprotivtela (paneli) na aparatot UniKap-101
(Uni-Cap-101).
“new”), se otvaraat ve}e izrabotenite (ikona – “open“) ili
se bri{at nekoi podatoci (ikona – “delete” ) (Slika 20.2).
Pod niv ima naredbi so ~ie selektirawe mo`e da se vidat
site izraboteni pacienti, onie koi ne se po~nati da se
rabotat, onie koi vo momentot se rabotat i podatocite ili
rezultatite koi sme gi odobrile ili odbile. So klik na
prvata ikona (“new”) vleguvame vo prozorecot kade{to se
vnesuva laboratoriskiot broj na pacientot i kade {to se
biraat analizite koi treba da se izrabotat. Vo kvadrat~eto
so oznaka “Sample Id” se vnesuva laboratoriskiot broj na
pacientot i se pritiska “enter”. Sega od stranata ni se
aktiviraat dve ikoni od koi vo prvata gi ima site testovi
koi se rabotat so ovoj aparat, a vo vtorata se testovi koi se
rabotat spored dijagnozata na pacientot i se narekuvaat
paneli. So klik na prvata ikona "add test" se poka`uva
tabela koja e podelena na dva dela. Od levata strana se
metodite koi se rabotat na ovoj aparat. Metodot se bira so
negovo ozna~uvawe i pritiskawe na “enter”. Na desnata
strana se nao|aat specifi~nite alergeni koi se biraat na
Slika 20.3: Ekranot za izbor
na metodite koi sakame da gi
rabotime na aparatot UniKap-101 (UniCap-101).
226
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 20: ORGAN SPECIFI^EN AVTOIMUNITET
Slika 20.4: Ekranot za izbor
na pacientite koi sakame da
gi rabotime na aparatot UniKap-101 (UniCap-101).
ist na~in. Potoa se zatvora tabelata i se kliknuva na
ikonata “save” za da se zapametat baranite podatoci. Na
ovoj na~in se vnesuvaat site pacienti (Slika 20.3).
Po vnesuvaweto na pacientite i nivnite analizi se vra}ame
na po~etnata strana (stranata na koja {to ima slika od
aparatite) so pritiskawe na ikona na koja {to pi{uva
“back” . Potoa kliknuvame dva pati na aparatot koj {to
sakame da go pu{time. Ni se otvaraat dve tabeli. Na levata
strana gi gledame site metodi koi se rabotat so ovoj aparat
i so kliknuvawe na praznite kvadrat~iwa se biraat
metodite koi planirame da gi rabotime (Slika 20.4). So
samoto birawe na metodot na desnata strana ni se
prika`uvaat site laboratoriski broevi na vnesenite
neizraboteni pacienti koi gi sodr`at baranite analizi.
Otkoga }e go odbereme metodot i }e ni se poka`at na
ekranot pacientite koi treba da se rabotat po~nuvame so
nivno selektirawe na ist na~in odnosno so kliknuvawe na
kockite pred laboratoriskiot broj.
Slika 20.5: Lista na raspredelba (Distribution list) e na
aparatot Uni-Kap101 (UniCap-101).
Institut za imunobiologija i humana genetika
227
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Site stapki od ponatamo{niot proces se avtomatizirani
i od ekranot na samiot aparat ~itame {to treba da se
napravi. Prvo ne pra{uva dali gore opi{anite kanti~ki
se polni i pravilno rasporedeni. Odgovorot se vr{i so
pritiskawe na kop~iwata "yes" i "no" na tastaturata od
samiot aparat. Potoa se vnesuvaat serumite na pacientite
(ima to~no opredelena pozicija za sekoj serum, a taa mo`e
da se vidi i od listata na raspredelba). Otkoga }e se vnesat
serumite se stava kontrola za kalibracionata kriva koja
e so oznaka EL-GCC1.
Potoa se vnesuvaat reagensite koi ni se potrebni.
Kowugatot za ELIAIgG, stoi sekoga{ na pozicija A na
nadvore{niot nosa~. Pri stavaweto na kowugatot aparatot
bara da se vnese specifi~niot kod od kalibracijata za toj
mesec.
Tabela 20.2: Vnesuvawe rezultati od avtoprotivtela
od UniCap-101.
Se vnesuva razvoen rastvor (development solution) na pozicija
E i zapira~ki rastvor (stop solution ) na pozicija H i se
vnesuva rastvor za razreduvawe (diluent) na pozicija G.
Pri vnesuvawe na serumite, posle sekoj serum se stava
prazna epruvetka vo koj samiot aparat avtomatski pravi
razreduvawe na serumot od pacientot. Potoa zapo~nuva so
edna slepa proba koja{to trae 2 min, pri{to toj gi
proveruva kanti~kite i dali se e staveno na soodvetnoto
mesto. Od ekranot mo`e da vidime koe avtoprotiv-telo
treba da se vnese. Avtoprotivtelata se redat na
vnatre{niot nosa~. Vo ovoj sistem avtoprotivtelata se
fiksirani na top~iwa koi se naredeni vo penkala. Od
nadvor se postavuva penkaloto, a aparatot sam gi zema i gi
redi na to~no opredelenata pozicija.
Dobienite rezultati se vnesuvaat vo formular pogoden za
taa namena (Tabela 20.2).
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
228
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA
VE@BA 21: ANALIZA NA
AVTOIMUNI ZABOLUVAWA
21.1. Normalni vrednosti za
sistemski avtoprotivtela
Normalnite vrednosti za sistemskite avtoprotivtela se
iska`uvaat razli~no zavisno od upotrebenata metoda. Vo
morfolo{kite ispituvawa, kako {to e imunofluorescencijata, tie se definiraat kako pozitivni (so
iska`uvawa na intenzitet vo oblik na plusevi) ili
negativni. Imunofluorescencijata mo`e da dade i opisni
rezultati, kako na primer vo koj del od kletkata se gleda
fluorescencijata, kakov oblik ima i sli~no.
Vo kvantitaivnite merewa avtoprotivtelata mo`at da se
iska`at kako titar na avtoprotivtela (titar e recipro~na
vrednost vo najgolemoto razreduvawe koga e vidliva
reakcija), kako apsolutna vrednost vo me|unarodni edinici
vo eden mililitar (IE/mL), ili kako relativni kvantitativni soodnosi (Tabela 21.1). Na tabelata se dadeni
sme{i i oddelni avtoprotivtela. Sme{ite se ispituvaat
koga sakame da vidime dali voop{to postoi zgolemuvawe
na bilo koe od sostavnite avtoprotivtela. Ako e rezultatot
negativen ne pravime dopolnitelni ispituvawa, no dokolku
e pozitiven se ispituvaat site oddelni avtoprotivtela
koi gi ima vo sme{ata. Na toj na~in se racionalizira
potrebniot broj ispituvawa, se {tedat vreme i pari. Za
polesno komunicirawe so klini~kite doktori vneseni se
krateni za sekoe avtoprotivtelo, kako i metodot so koj se
ispituvaat (VARELISA ili ELIA).
Interpretacijata na rezultatite mo`e da bide kvantitativna i/ili kvalitativna. Se gleda deka sme{ite od
protivtela mo`at da se analiziraat samo kvalitativno
(negativno, grani~no ili pozitivno), dodeka oddelnite
avtoprotivtela mo`at da bidat analizirani samo
kvantitativno (negativno, grani~no ili pozitivno) ili i
na dvata na~ini. Sekako deka vrednostite na oddelnite
avtoprotivtela variraat zavisno od osetlivosta na
upotrebenata metoda i od nivnata koli~ina vo serumot.
Institut za imunobiologija i humana genetika
229
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
Tabela 21.1: Normalni vrednosti na avtoprotivtelata
kaj sistemskite zaboluvawa.
21.2. Normalni vrednosti za organ specifi~ni protivtela
Normalnite vrednosti za organ specifi~nite avtoprotivtela se dadeni na Tabela 21.2. Nivnoto prika`uvawe
e sli~no kako i kaj sistemskite avtoprotivtela, samo {to
molekulite koi se ispituvaat se odnesuvaat specifi~no za
opredelen organ.
Na tabelata se dadeni normalnite vrednosti na avtoprotvtelata vo endokriniot sistem i avtoprotivtelata vo
gastrointestinalniot sistem, dodeka normalnite
vrednosti za avtoprotivtelata na drugite organski sistemi
ne se dadeni.
230
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA
Tabela 21.2: Normalni vrednosti na avtoprotivtelata
kaj organ specifi~nite
zaboluvawa.
21.3. Tolkuvawe sistemski avtoprotivtela
Princip na procedurata. EliA bunar~iwata se oblo`eni
so soodveten protivgen. Dokolku se prisutni vo analiziraniot primerok, avtoprotivtelata se vrzuvaat za
protivgenot. Po plaknewe na nevrzanite protivtela,
protiv IgG protivtelata obele`ani so enzim (IgG
kowugat) se dodavaat za da se formira protivtelo-kowugat
kompleks. Po inkubacija nevrzaniot kowugat se izmiva i
vrzaniot kompleks se inkubira so rastvor za razvivawe.
Potoa se meri fluorescencija i se sporeduva so standardna
prava izrabotena za soodvetni kalibratori po {to se
dobiva kvantitativen rezultat izrazen kako IE/mL
(internacionalni edinici na mililitar).
Presmetuvawe i interpretacija na rezultatite.
Aparatot meri koncentracija na IgG vo mg/L. So koristewe
faktor na konverzija definiran od specifi~niot kod na
EliA rezultatite avtomatski se konvertiraat vo IE/mL
(internacionalni edinici na mililitar) (IE/ml).
Institut za imunobiologija i humana genetika
231
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
21.3.1. Avtoprotivtela kon dvoveri`na
DNK (dvDNK)
Primena. EliA dvDNK testot slu`i za kvantitativna in
vitro detekcija na IgG protivtela naso~eni kon
dvoveri`na DNK vo serum ili plazma. Spa|a vo antinuklearni antitela (ANA) i e visoko specifi~en
obele`uva~ koj pretstavuva eden od dijagnosti~kite
kriteriumi za SLE. Duri 90% od pacientite so aktiven
SLE imaaat avto protivtela kon dvoveri`na DNK. Ovoj
marker e va`en i za sledewe na aktivnosta na bolesta,
osobeno kaj onie bolni so zasegawe na bubrezite preku
sledewe titarot na avto protivtelata.
21.3.2. U1RNP
Primena. EliA U1RNP testot slu`i za in vitro kvantitativno merewe na IgG protivtela kon U1RNP vo ~ove~ki
serum i plazma, koi se va`ni vo klini~kata dijagnoza na
me{ana bolest na svrznoto tkivo i sistemski lupus
eritematozus.
Objasnenie na testot. Odreduvaweto na antinuklearnite
antitela (ANA) e od centralno zna~ewe za klini~ka
dijagnoza na bolesti na svrznoto tkivo. U1-snRNP
protivtelata tipi~no se prisutni kaj bolni od SLE (vo 3040% od slu~aite) i me{ana bolest na svrznite tkiva
(sindrom na Sharp), kade se neophodni za postavuvawe na
dijagnozata. Iako imunolo{kiot odgovor so protiv-U1snRNP protivtela podrazbira prisustvo kon trite
proteinski komponenti (70 kDa, A, C), protiv-70 kDa
protivtelata - osobeno kaj slu~aite so visok titar, se
pospecifi~ni za me{ana bolest na svrznite tkiva, bidej}i
se poretko prisutni kaj bolni so SLE (pribli`no kaj
12%), otkolku protivtelata kon A i C proteinite
(pribli`no kaj 23%). Nekolku studii poka`uvaat deka
protiv-U1-snRNP odgovor vo otsustvo na protiv-70 kDa
protivtela e silno asociran so SLE.
21.3.3. RNP70
Primena. EliA RNP70 testot slu`i za in vitro
kvantitativno merewe na IgG protivtela kon RNP70 vo
~ove~ki serum i plazma, koi se va`ni vo klini~kata
dijagnoza na me{ana bolest na svrznoto tkivo i sistemski
lupus eritematozus.
21.3.4. Sm
Primena. EliA Sm testot slu`i za in vitro kvantitativno
merewe na IgG protivtela kon Sm vo ~ove~ki serum i
plazma, koi se va`ni vo klini~kata dijagnoza na sistemski
lupus eritematozus.
232
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA
21.3.5. Ro
ANALIZA NA SLU^AJ
Primena. EliA Ro testot slu`i za in vitro kvantitativno
merewe na IgG protivtela kon Ro vo ~ove~ki serum i
plazma, koi se va`ni vo klini~kata dijagnoza na Sjegrenov sindrom i sistemski lupus eritematozus.
21.3.6. La
Primena. EliA La testot slu`i za in vitro kvantitativno
merewe na IgG protivtela kon La vo ~ove~ki serum i
plazma, koi se va`ni vo klini~kata dijagnoza na Sjegrenov sindrom i sistemski lupus eritematozus.
21.3.7. CENP
Sistemski lupus
eritematozus:
Slu~ajot na Nikolina
Cekovska, premnogu sonce na
pla`a.
Primena. EliA CENP testot slu`i za in vitro
kvantitativno merewe na IgG protivtela kon CENP vo
~ove~ki serum i plazma, koi se va`ni vo klini~kata
dijagnoza na sklerodermija (CREST sindrom).
21.3.8. Scl-70
Primena. EliA Scl-70 testot slu`i za in vitro
kvantitativno merewe na IgG protivtela kon Scl-70 vo
~ove~ki serum i plazma, koi se va`ni vo klini~kata
dijagnoza na sklerodermija (difuzna forma).
21.3.9. Jo-1
Primena. EliA Jo-1 testot slu`i za in vitro kvantitativno
merewe na IgG protivtela kon Jo-1 vo ~ove~ki serum i
plazma, koi se va`ni vo klini~kata dijagnoza na
polimiozitis/dermatomiozitis.
21.3.10. Avtoprotiv tela kon proteinaza
3 (PR3)
So ovaa metoda se vr{i in vitro kvantitativno merewe na
IgG protivtela naso~eni kon proteinaza 3 (PR3) vo serum
i plazma.
Spa|a vo ANKA i e marker za Vegenerova granulomatoza
(visoko specifi~ni - 97%, i senzitivni - 81%), a pozitiven
e i kaj pacienti so mikroskopski poliangiitis (vaskulitis
na malite krvni sadovi), Chrug – Strauss Sy (alergi~en
granulomatozen vaskulit), nekrotizira~ki glomerulonefritis.
21.3.11. Avtoprotiv tela kon
mieloperoksidaza (MPO)
So ovaa metoda se vr{i in vitro kvantitativno merewe na
IgG protivtela naso~eni kon mieloperoksidaza (MPO)
Institut za imunobiologija i humana genetika
233
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
vo serum i plazma.
Spa|a vo ANKA i e pozitiven kaj pacienti so mikroskopski
poliangiitis (vaskulitis na malite krvni sadovi), Chrug –
Strauss Sy (alergi~en granulomatozen vaskulit), nekrotizira~ki glomerulonefritis.
21.3.12. Avtoprotiv tela kon alfa3
lanecot na kolagen 4 (GBM)
So ovaa metoda se vr{i in vitro kvantitativno merewe na
IgG protivtela naso~eni kon alfa3 verigata od kolagen 4.
Spa|a vo ANKA i e pozitiven kaj pacienti so Gudpasteroviot sindrom (Goodpasteure syndrom), anti-GBM bolest,
ANKA asociran vaskulitis.
21.3.13. Kardiolipinski protivtela
Primena. Varelisa testot za kardiolipinski protivtela
(PKP) slu`i za semikvantitativno i kvalitativno
odreduvawe na IgG ili IgM protivtela kon kardiolipin
vo human serum ili plazma, koi se va`ni za dijagnoza na
primarna antifosfolipiden sindrom i za evaluacija na
trombo-ti~niot rizik kaj pacienti so SLE.
Objasnenie na testot. Antikardiolipinskite protivtela
pripa|aat na grupata antifosfolipidni protivtela.
Najprvo tie bile otkrieni kaj bolni od sifilis, a pokasno
i kaj bolni od SLE i drugi revmatski bolesti. Antifosfolipidniot sindrom poznat i kako sindrom na Hughes, se
karakterizira so tipi~na klini~ka slika koja vklu~uva
arteriska/venska tromboza ili rekurentni abortusi i
prisutni antifosfolipidni protivtela.
Okolu 5% od normalnata navidum zdrava populacija mo`e
da bide pozitivna za PKP. Goleminata na ovaa grupa se
zgolemuva so tekot na stareeweto. Protiv-kardiolipinskite protivtela se karakteristi~ni za protivfosfolipidniot sindrom (PFS) (primaren ili sekundaren), a se
sre}avaat so prevalenca od 30-40% i kaj pacientite so
SLE. Nivna klini~ka manifestacija bi bila pojavata na
tromboza, povtoruva~ki abortusi, trombo-citopenija,
nevrolo{ki poremetuvawa i dr. PKP kaj protivfosfolipidniot sindrom se sretnuvaat so slednava prevalenca:
a) Kaj primaren PFS - Kardiolipinski IgG 81%, IgM
40% i IgA 24%.
b) Kaj sekundaren PFS - Kardiolipinski IgG 85%,
IgM 65% i IgA 10%.
Normalnite vrednosti mo`at da variraat vo zavisnost od
Tabela 21.3: Normalni vrednosti na protivkardiolipinski protivtela (PKP).
234
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA
populacijata, na~inot na ishrana, laboratoriskite tehniki
koi se koristat i od selekcijata na kontrolnata grupa od
koja se izvedeni.
Anti kardiolipinskite protivtela prisutni kaj infektivni bolesti ili kaj antifosfolipiden sindrom mo`e da
se razlikuvaat spored nivnata zavisnost od kofaktori: kaj
pacientite so infektivna bolest protivtelata se naso~eni
kon ~ist fosfolipid kako protivgen, dodeka protivtelata
kaj pacienti so PFS baraat glikoprotein 1 kako kofaktor.
Ovie protivtela se zna~ajni zaradi zgolemena tendencija
za venska/arteriska tromboza (vklu~itelno apopleksija),
trombocitopenija, ~esti abortusi i neurolo{ki manifestacii na pacienti pozitivni za ovie protivtela.
Zgolemeni nivoa na ovie protivtela se sretnuvaat i kaj
pacienti so cerebrovaskularna insuficiencija ili
miokarden infarkt.
21.4. Tolkuvawe organ specifi~ni avtoprotivtela
21.4.1. Antitiroglobulinski protivtela
(TG)
Primena. Varelisa TG (Tiroglobulin) testot slu`i za
kvantitativno i kvalitativno odreduvawe na protivtiroglobulinski protivtela vo serum ili plazma koi se
va`ni za klini~ka dijagnoza na tiroidna bolest kako na pr.
avtoimun tiroiditis i Graves-ova bolest.
Objasnenie na testot. Tiroidnite avtoimuni bolesti se
grupa na razli~ni, no patogenetski povrzani organspecifi~ni zaboluvawa na tiroidnata `lezda, karakterizirani pred se so prisustvo na avto protivtela kon
tiroidni protivgeni, kako na pr. tiroglobulinot (TG),
tiroidnata peroksidaza (TPO) ili TSH receptorot.
Pove}e od 98% od bolnite so tiroiditis imaat protivtela
kon TG, TPO ili i dvata. Avtoprotivtela kon TG se
prisutni kaj pove}eto pacienti so gu{avost (Ha{imotov
tiroidit), kaj pove}e od 30% od bolnite so Graves-ova
bolest i vo varijabilen procent od pacienti so druga
avtoimuna bolest na tiroideja, kako na pr. tivok
tiroiditis, postpartalen tiroiditis, ili pak perniciozna
anemija, dijabet i Adisonova bolest. Zgolemeni nivoa na
TG protivtela se sretnuvaat i kaj zdravi individui (od
3,2% do 17,8% vo selektirana `enska populacija).
21.4.2. TPO
Primena. Varelisa TPO testot slu`i za kvantitativno i
kvalitativno odreduvawe na protiv-TPO (tiroidna
peroksidaza) protivtela vo serum ili plazma koi se va`ni
Institut za imunobiologija i humana genetika
ANALIZA NA SLU^AJ
Ha{imotov tiroidit:
Slu~ajot na Blaguwa
Setolska, bezbolno
ote~uvawe na vratot.
235
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
za klini~ka dijagnoza na tiroidna bolest kako na pr.
avtoimun tiroiditis i Graves-ova bolest.
Objasnenie na testot. Hroni~niot avtoimun tiroiditis
(Ha{imoto tiroiditis) e originalnata paradigma za
avtomuna bolest voop{to. Gi zafa}a `enite 4 do 20 pati
po~esto od ma`ite, a naj~esto se javuva kaj `eni na vozrast
pome|u 30 i 60 godini. Protivtela kon TPO imaat pove}e
od 70% od bolnite so Graves-ova bolest i vo razli~en
procent pacienti so netiroidna avtoimuna bolest i
normalni individui. Titarot na ovie avtoprotivtela ne
korelira so funkcionalniot tiroiden status.
21.4.3. Protivtela kon parietalni
kletki
Primena. Varelisa testot za avtoprotivtela kon
parietalni kletki slu`i za semikvantitativno i
kvalitativno odreduvawe na ovie protivtela vo serum ili
plazma koi se va`ni za klini~ka dijagnoza na perniciozna
anemija.
Objasnenie na testot. Pernicioznata anemija e organ
specifi~na avtoimuna bolest na gastri~nata mukoza, koja
se karakterizira so hroni~en atrofi~en gastritis od tip
A, ahlorhidrija, nedostatok na produkcija na intrinzik
faktor, malapsorbcija na vit. B12 i prisustvo na
protivtela kon parietalnite kletki i kon intrinzik
faktorot. Bolesta prete`no zafa}a belci so Severno
evropsko poteklo. Naj~esta pri~ina e deficit na vit. B12.
Kaj pove}e od 90% od site pacienti so perniciozna anemija
mo`e da se detektiraat cirkulira~ki protivtela kon
parietalnite kletki. Ovie protivtela ~esto mo`e da se
najdat i kaj rodnini na pacienti so perniciozna anemija
(20-30%).
21.4.4. Test za GBM protivtela
Primena. Varelisa testot GBM slu`i za semikvantitativno i kvalitativno odreduvawe na protivtela kon
konstituent na glomerularnata bazalna membrana (alfa3
verigata od kolagen tip 4) vo human serum ili plazma, a
va`ni se za dijagnoza na bubre`ni zaboluvawa.
Objasnenie na testot. Protivtelata kon bazalnata
glomerularna membrana se eden od trite specifi~ni
kriteriumi za dijagnoza na Gudpasteroviot sindrom.
Ostanatite dva kriteriumi za organ-specifi~no avtoimuno zaboluvawe vklu~uvaat rapidno progresiven
glomrulonefritis i pulmonalni hemoragii. Dopolnitelno
i drugi avtoimuni bolesti (kako ANCA asociran vaskulitis) mo`e da se pridru`eni na Gudpasteroviot sindrom.
Bidej}i GBM protivtelata se patogeni za bubregot, nivno
detektirawe uka`uva na visok rizik za razvivawe na akutna
bubre`na slabost. Zatoa nivnoto otkrivawe ne e samo
va`no za dijagnoza na ovoj sindrom, tuku e va`no i za
pacienti so glomerulonefritis, pozitiven rezultat za
236
Institut za imunobiologija i humana genetika
VE@BA 21: ANALIZA NA AVTOIMUNI ZABOLUVAWA
ANCA ili vo priprema na transplantacija. Protivgenot
za koj GBM protivtelata se specifi~ni se nao|a skoro
isklu~ivo vo bazalnite membrani na bubregot i belite
drobovi. Bidej}i protivtelata se naso~eni kon t.n.
“nekolageni” domeni koi se skrieni vo nivnata nativna
struktura, za detekcija na protivtelata se koristi
denaturiran protivgen. Toa e te{ko da se postigne so
indirektnata imunofluorescencija i zaradi toa ovie
testovi se so mala senzitivnost. Toa gi pravi ELISA
testovite koi koristat denaturiran pro~isten protivgen
(vklu~itelno i Varelisa GBM testot) metod od izbor za
detekcija na GBM protivtelata.
21.4.5. Test za protivspermalni
protivtela
Primena. Varelisa testot za protivspermalni protivtela
slu`i za semikvantitativno i kvalitativno odreduvawe
na ovie protivtela vo human serum ili plazma, koi se
va`ni za dijagnoza na imunolo{ki uslovena subfertilnost
ili infertilnost.
Objasnenie na testot. Vo zapadnite op{testva, incidencata na infertilnost se dvi`i pome|u 10 i 15%.
Postoeweto na protivtela kon spermatozoidi se pretpostavuvalo dolgo vreme. Denes so sigurnost se znae deka i
ma`ite i `enite sozdavaat protivspermalni protivtela,
{to vo golema mera mo`e negativno da vlijae na uspehot vo
reprodukcijata. Iako pri~inite za postoeweto na ovie
protivtela seu{te ne se jasno definirani, tie se priznati
kako zna~aen faktor vo etiologijata na imunolo{ki
uslovenata subfertilnost. Kaj ma`ite, spermatozoidite
se skrieni od imuniot sistem so pomo{ na t.n. krvnotestikularna bariera. Koga ovaa bariera e poremetena,
kako pri testikularna trauma, vazektomija, opstrukcija
na kanalot na epididimis ili infekcija, spermatozoidite
stanuvaat imunogeni.
Pomalku se znae za uslovite pod koi se sozdavaat izoprotivtelata kaj `eni. Se pretpostavuva deka nespecifi~ni bakteriski ili virusni infekcii mo`e da vodat
do sozdavawe na protivtela koi vkrsteno gi prepoznavaat
spermatozoidite. Edinstveni protivtela so klini~ko
zna~ewe se onie koi se specifi~ni za spermalnata
plazmatska membrana. Tie go zasegaat motilitetot na
spermatozoidite i voop{to nivnoto u~estvo vo oploduvaweto preku pre~ki vo penetracijata niz cervikalniot
mukus, prika~uvaweto na spermatozoidot za jajce kletkata,
kako i negovata penetracija vo jajce kletkata i kone~no
samoto oploduvawe.
21.4.6. Protivmitohondrijalni
protivtela
Primena. Varelisa M2 testot slu`i za semikvantitativno
i kvalitativno odreduvawe na mitohondrijalni M2
Institut za imunobiologija i humana genetika
237
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
protivtela vo human serum ili plazma, koi se va`ni za
dijagnoza na primarna bilijarna ciroza.
Objasnenie na testot. Primarnata bilijarna ciroza e
hroni~na inflamatorna bolest na crniot drob. Ranata
faza na bolesta histolo{ki se karakterizira so
inflamatorni infiltrati vo periportalnite porostori,
osobeno vo regionot na septalnite i interlobularni
`ol~ni kanali. Bolesta napreduva kon progresivna
destrukcija na malite i srednite `ol~ni kanali {to vodi
do crnodrobna fibroza, a vo terminalniot stadium na
bolesta doa|a do kompletna ciroza. Bolesta mo`e dolgo
vreme da perzistira bez simptomi. Naj~esto zapo~nuva
me|u 40 i 60 godini vozrast, a 6 do 10 pati e po~esta kaj `eni.
Etiologijata seu{te ne e poznata, no se pretpostavuva
deka e od avtoimuna priroda. Tipi~na karakteristika na
bolesta e prisustvo na avtoprotivtela naso~eni kon
mitohondrijalni protivgeni. Denes se razlikuvaat 9
razli~ni protiv-mitohondrijalni protivtela (M1 do M9).
Od zna~ewe za primarnata bilijarna ciroza se M2, M4, M8
i M9. M2 protivtelata se sretnuvaat kaj okolu 95% od
bolni so ovaa bolest.
21.4.7. LKM1 protivtela
Primena. Varelisa LKM1 testot slu`i za semikvantitativno i kvalitativno odreduvawe na LKM1 protivtela
vo human serum ili plazma, koi se va`ni za dijagnoza na
avtoimun hepatitis (AIH).
Objasnenie na testot. Generalno, na avtoimuniot
hepatitis otpa|aat 10-40% od site hroni~ni aktivni
hepatitisi koi se negativni za HbsAg. Postojat nekolku
pove}e ili pomalku specifi~ni protivtela koi se
sretnuvaat kaj AIH. Antinuklearnite protivtela (ANA)
i protivtelata kon mazni muskuli i aktin se dijagnosti~ki
relevantni za AIH tip1, poznat kako lupoiden AIH. Toa
e klasi~niot i naj~est tip na avtoimun hepatitis. AIH
tip 2 se javuva kaj pove}e od 50% od decata so AIH. Se
karakterizira so protivtela kon mikrozomite od bubreg/
crn drob (LKM). Tie reagiraat predominantno so 50 kD
protein identifikuvan kako P450 2D6. Vo ovoj test se
koristi rekombinanten human citohrom P450 2D6
protivgen. Serolo{koto razdvojuvawe na dvata tipa na
AIH e zna~ajno bidej}i AIH tip 2 se smeta za poprogresiven i kaj nego pobrzo se razviva ciroza na crn drob. 82%
od bolnite so AIH tip 2, nasproti 43% od bolnite so AIH
tip 1 razvivaat ciroza vo tek na 3 godini. Retko postoi
pozitiven rezultat za LKM protivtelata i kaj virusen
hepatit C (HCV). Bidej}i terapijata na avtoimun i virusen
hepatit e razli~na, terapevtskite ~ekori treba vnimatelno
da se izbiraat.
Vkupno bodovi: ___________________ (prisustvo 0.5 boda, znaewe od 0.0 do 1.0 bod)
Data
Student (ime i prezime)
Asistent (potpis i pe~at)
______________
____________________________
__________________________
238
Institut za imunobiologija i humana genetika
22: OSNOVNI LABORATORISKI PRAVILA
22. OSNOVNI LABORATORISKI
PRAVILA
1. Za poefikasno da gi sovladate prakti~nite ve`bi po imunologija,
predvidenata sodr`ina nau~ete ja pred doa|awe na ve`bi;
2. Ne e dozvoleno zamenuvawe na ve`bite (vo isklu~itelni sostojbi
konsultirajte se so [efot na katedrata);
3. Za{titna obleka (mantil) mora da se nosi za celo vreme na izveduvawe
na ve`bite/eksperimentite;
4. Sekoj student e odgovoren za odr`uvawe na negovata uredna i sredena
rabotna povr{ina;
5. Ne frlajte hartija, staklo ili plastika vo mijalnicite;
6. Ne koristete mobilni telefoni za vreme na izveduvaweto na
prakti~nata nastava;
7. Za o{tetuvawe na oprema ili prekumerno tro{ewe na reagensi }e
se napla}a soodveten pari~en nadomestok.
Bezbedonosta e va{a osnovna gri`a za vreme na va{iot prestoj vo
laboratoriite, zatoa zemete gi vo predvid slednive preporaki:
1. Biolo{kite primeroci koi se koristat vo laboratoriskite testovi
(na pr. krv) treba sekoga{ da se tretiraat kako potencijalno
infektivni. Primerocite od visoko rizi~ni pacienti se posebno
ozna~eni i se rabotat vo izdvoeni rabotni povr{ini.
2. Direktno izlo`uvawe na ultravioletno svetlo mo`e da dovede do
akutno o{tetuvawe na retinata od 30 minuti do 24 ~asa po
izlo`uvaweto. Zatoa UV svetloto sekoga{ se gleda preku soodvetno
za{titno staklo;
3. Ne jadete, ne pijte i ne pu{ete vo laboratoriite;
4. Ne rabotete vo laboratoriite, osven vo vremeto prevideno za
izveduvawe na ve`bi;
5. Ne vnesuvajte posetiteli vo laboratoriite bez prethodna dozvola
na nastavnicite;
6. Ne probuvajte da pravite eksperimenti koi ne se predvideni. Za
bilo kakvi modifikacii vo rabotata, prethodno pobarajte dozvola od
nastavnikot;
7. Ne tr~ajte niz laboratoriite.
Koga rabotite so hemikalii:
8. Ne pipetirajte so usta, sekoga{ koristete pipetori so prodol`etoci
za edna upotreba;
9. Sekoga{ nosete za{titni rakavici i izbegnuvajte kontakt na ko`ata
so reagensite, kontrolnite primeroci ili primerocite za ispituvawe;
10. Nikoga{ ne dodavajte voda na koncentrirani bazi ili kiselini;
11. Nikoga{ ne me{ajte koncentrirani bazi i kiselini;
12. Nikoga{ ne isturajte zapalivi supstancii vo blizina na plamen;
13. Nikoga{ ne vra}ajte koristen reagens vo novo {i{ence.
Vo slu~aj na nesre}a:
14. Za bilo kakov incident (duri i isturawe nekolku kapki od nekoj
reagens) vedna{ izvestete go va{iot nastavnik.
Institut za imunobiologija i humana genetika
239
Spiroski M i sorabotnici. IMUNOLO[KI PRAKTIKUM
23. LITERATURA
1. Hyde RM. National Medical Series for Independent Study.
Immunology. Williams & Wilkins: Philadelphia, 1995:1-316.
2. Spiroski M, Kolevski P. Osnovni imunolo{ki metodi.
MEDIS - informatika: Skopje, 1995.
3. Roitt I. Roitt’s Essential Immunology. Blackwell Science: Oxford,
1997.
4. Spiroski M@. IMUNOST - 1. Imunolo{ka {kola.
Katedra za imunologija: Skopje, 1998.
5. Andreis I, ^ulo F, Maru{i} M, Taradi M. Imunologija.
Medicinska Naklada - Zagreb, 1998.
6. Paul WE. Fundamental Immunology. Lippincott - Raven:
Philadelphia, 1999.
7. Janeway CA, Travers PWalport M, Capra JD. Immunobiology.
The Immune System in Health and Disease. Current Biology
Publications: London, 1999.
8. Roitt I, Brostoff J, Male D. Immunology. Mosby: London, 2000.
9. Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA. Kuby Immunology. Freeman:
New York, 2000.
10. Abbas AK, Lichtamn AH, Pober JS. Cellular and Molecular
Immunology. Saunders Company: Philadelphia, 2000.
11. Nastavni sodr`ini od imunologija 1999/2000. Institut
za imunobiologija i humana genetika, Instituti,
Medicinski fakultet: Skopje 2000.
12. Spiroski M, Trajkov D, Petli~kovski A, Arsov T,
Strezova A, Efinska-Mladenovska O. Imunolo{ki
praktikum. Institut za imunobiologija i humana genetika,
Instituti, Medicinski fakultet: Skopje 2005.
240
Institut za imunobiologija i humana genetika
Download

IMUNOLO[KI PRAKTIKUM - Институт за имунобиологија и хумана