IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-prakti~na nastava-
FARMACEVTSKI FAKULTET
2010/2011 GOD.
As. Aleksandra Grozdanova
As. Nadica Matevska
Imunologija so imunohemija - programa za ve`bi
Ve`ba 1 Imunolo{ki tehniki za izolirawe na imuni kletki
Ve`ba 2 Izolirawe i pro~istuvawe na antigeni i antitela
Ve`ba 3 Elektroforetski metodi i imunobloting
Ve`ba 4 Reakcii na aglutinacija
Ve`ba 5 Imunohemoliti~ki testovi, reakcija na vrzuvawe na komlement
Ve`ba 6 Odreduvawe i kvantifikacija na rastvorlivi antigeni i antitela
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
2
Obvrski i zada~i na studentot:
Sekoj student vo ramki na predmetot Imunologija so imunohemija }e bide
zadol`en da :
¾ Redovno gi posetuva laboratoriskite ve`bi. Dozvoleno otsustvo od
maksimum eden termin na laboratoriski ve`bi, {to povlekuva namaluvawe na
osvoenite poeni predvideni za prakti~na nastava.
¾ Odnesuvaweto vo laboratorija mora da e vo ramki na predvidenite
pravila na rabotewe vo laboratorija.
¾ Vodewe na laboratoriski dnevnik vo koj se zapi{uvaat site ~ekori od
laboratoriskata ve`ba, protokolot na istata, crtawe i ozna~uvawe na
grafi~kite prikazi. Dnevnikot se dostavuva na pregled kaj asistentot po sekoja
zavr{ena ve`ba.
¾ Aktivno u~estvo vo tek na izrabotkata na ve`bata. Zadol`enieto koe
studentot go dobiva vo tek na ve`bata treba da go odgovori (izvede, pripremi,
nacrta) vo predvideniot termin na ve`bata. Za istoto e zadol`en da go vodi
dnenikot i za toa e soodvetno ocenet.
¾ Pred po~etokot na ve`bata i po zavr{uvawe na istata predvideni se
mini kvizovi ili kratki test pra{awa koi se vo odnos na problematikata koja
ja obrabotuva tekovnata ve`ba.
¾ Zavr{nata ve`ba e zadol`itelna za sekoj student, i so nejzino uspe{no
sovladuvawe studentot se steknuva so pravo za zavr{en ispit.
Opis na laboratoriskata nastava:
Prakti~natna nastava i predvidenite laboratoriski ve`bi imaat za cel
da go educiraat studentot so osnovnite principi i pravila na rabotewe vo
imunolo{ka laboratorija, rakuvawe so biolo{ki materijal i koristewe na
aparati i metodi vo oblasta na imunologijata i imunohemijata.
Preku kompjuterski animacii i grafi~ki prikazi, }e se objasnat
imunolo{kite procesi, gradba i funkcija na imunokompetentni kletki,
osnovni imunohemiski metodi i imunodijagnosti~ki postapki.
Studentite }e imaat mo`nost da se zapoznaat i prakti~no da gi izvedat
osnovnite imunohemiski metodi kako rabota so krv i krvni derivati, kletki i
proteini, kako i teoretski osvrt za primena na imunolo{kite metodi vo
biomedicinskite nauki.
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
3
Organizacija i rabota vo imunolo{ka laboratorija
Rabotata vo imunolo{ka laboratorija, kako i vo drug tip na laboratorii vo
koi se raboti so biolo{ki materijal (za molekularna biologija i genetika,
mikrobiolo{ka, hematolo{ka i dr. laboratorii) bara posebni uslovi i
aparati kako i specifi~en na~in na rakuvawe so materijalot i posebno
educiran personal koj }e raboti vo ovoj vid laboratorii. Naj~esto,
zagrozuvaweto na li~nata bezbednost kako i bezbednosta na okolinata,
nastanuva poradi nevnimanie. Zatoa sekoja postapka pri prakti~nata rabota
bara potpolna anga`iranost, serioznost, sigurnost i spremnost pri izveduvawe
na odredeni operacii. Samata priroda na rabotata vo biolo{ka laboratorija
bara neposreden dopir so razli~ni supstancii vo cvrsta, te~na ili gasovita
sostojba, pa odtuka sekoga{ e prisutna i mo`nosta na direktno izlo`uvawe na
opasnostite i toa preku neposreden kontakt, oralno ili preku organite za
di{ewe.
Mnogu ~esto vo imunolo{kite laboratorii se rakuva so t.n
biohazarden materijal, materijal koj mo`e da bide opasen (toksi~en,
kancerogen, radiolo{ki) pa ottuka obezbeduvaweto na bezbednost pri rabota e
primarno. Vospostaveni se tri nivoa na bezbednost vo biohazard laboratorii,
definirani kako nivo na bioza{tita 1, 2 i 3 (Biosafety level 1, 2, 3) vo
zavisnost od vidot na rabotata {to se izveduva i stepenot na merki na
pretpazlivost {to treba da se prezemat.
Merkite na pretpazlivost se podeleni i definirani kako:
¾
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
¾
1.
2.
3.
Standardna laboratoriska praksa
Laboratoriite se ozna~eni so biohazard simbol
Limitiran e pristapot na lu|e
Obezbedeni aparati za miewe race
Zabraneto e jadewe, piewe, pu{ewe, vadewe/stavawe na kontaktni le}i,
koristewe na kozmeti~ki sredstva
Zabraneto e pipetirawe so usta - se koristat mehani~ki pipeti
^ekorite pri raboteweto se taka organizirani da ima minimalno
sozdavawe na aerosoli i dvi`ewe na vozduhot
Rabotnite povr{ini se dekontaminiraat najmalku edna{ dnevno
Site koristeni rastvori, plastika i staklarija po i pred koristewe se
avtoklaviraat (i vo slu~aj da treba da frlat, i za plastika koja e za edna
upotreba)
Za{titna oprema
Zadol`itelno e nosewe na laboratoriski mantil ili odela so cel da se
spre~i kontminacija na oblekata
Laboratoriskite rakavici se zadol`itelni
Za{titnite maski i nao~ari se potrebni ako se rakuva so rasprsnuva~ki
materijal, mikroorganizmi ili dr. isparliv material
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
4
¾
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Posebni merki na za{tita
Bezbedosen laboratoriski prira~nik vo koj se objasnuvaat site
bezbednosni ~ekori se priprema ili usvojuva.
Personalot koj raboti vo vakov vid laboratorii e so poseben trening
educiran za vakov tip na rabota
Laboratoriskiot personal e imuniziran od potencijalno prisutnite
agensi na koi bi bile izlo`eni pri rabota vo laboratorijata
Koga se smeta za potrebno se zemaat primeroci od krv od site ~lenovi na
laboratoriskiot personal koi imat na rizi~na rabota i se ~uvaat za
ispituvawa
So visok stepen na pretpazlivost se rakuva so site o{tri objekti (igli,
no`evi, no`ici, skalperi, stakleni o{tri objekti, {pricevi)
Pri nivo na za{tita 2 i 3, biolaboratoriite se opremeni so posebni
sistemi za vlez i izlez (so dvojni vrati, vrati pod pritisok, posebni me|u
prostorii za priprema, dekontaminacija, proverka) a samite laboratorii
tehni~ki se izvedeni spored propisite za biolaboratori (bez ivici na
yidovite, so specijalni laboratoriski povr{ini izraboteni od materijal
koj lesno se odr`uva)
Laboratorii se opremeni i so posebni sistemi za pro~istuvawe i
odr`uvawe na vnatre{niot prostor (filtrirawe na vozduh, UV svetlo za
sterilizacija, aparati za gasnewe po`ar i dr.)
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
5
LABORATORISKI PRAVILA I BEZBEDNOSNI POSTAPKI
Pred zapo~nuvawe so laboratoriska rabota...!!!
1.
Da se prou~i pi{aniot materijal od laboratoriskiot praktikum i
teoretskite predavawa koi se odnesuvaat na problematikata za ve`bata
koja }e se raboti i da se definiraat site poimi i termini koi se koristat
pri izveduvawe na ve`bata
2.
Zapoznavawe so tipot i celta na ve`bata, site metodi koi taa gi opfa}a,
supstanciite potrebni za izveduvawe, nivnite koli~ini i svojstva
(toksi~nost, kancerogenost, eksplozivnost, zapalivost itn.) i priborot i
aparatite koi se koristat za izveduvawe na istata.
→ Samo dobro podgotven student }e mo`e uspe{no da ja zavr{i svojata zada~a i
maksimalno da go iskoristi vremeto vo laboratorija!!!
Za vreme na ve`bata...
Da se vodi laboratoriski dnevnik vo koj ke se zabele`uvaat site ~ekori od
ve`ba i }e se crtaat sliki i {ematski prikazi koi se objasnuvaat vo tek na
ve`bata.
Neophodno e pridr`uvawe kon site merki za predpazlivost:
1. nosewe na za{titna oprema
2. vnimatelna rabota so toksi~ni, zapallivi, ekslozivni i korozivni
supstancii,
3. so isparlivite toksi~ni supstancii da se raboti vo digestor so ispravna
ventilacija;
4. vnimatelno rakuvawe so aparaturi pod zgolemen pritisok i vakum;
5. pro~itaj gi opasnosnite oznaki na site hemiskite supstancii koi se
koristat vo eksperimentot.
6. zapoznaj se so merkite koi treba da se prevzemat vo slu~aj na opasnost koja
mo`e da nastane pri samata izvedba na eksperimentot.
7. ve`bata i laboratoriskata rabota sekoga{ se izveduva po propisot i
instrukciite dadeni od asistentot.
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
6
HAZARDNI SIMBOLI
Materijalot e mnogu nestabilen
Mo`e nenadejno da oslobodi gas, pritisok ili
toplina koga }e se izlo`i na udar, pritisok ili
visoka temperatura
E EXPLOSIVE
Pri kontakt predizvikuva seriozna iritacija na
o~i i ko`a
Pri prodol`en kontakt predizvikuva seriozni
o{tetuvawa na tkivoto
Mo`e da bide {teten dokolku se vdi{e
C COROSIVE
Materijalot e potencijalna opasnost od po`ar
Mo`e da bide zapaliv na niska temperatura
Iskri, plamen ili toplina mo`e da predizvikaat
negovo zapaluvawe
Dokolku postoi golema koncentracija na parei
mo`no e i samiot sponatno da se zapali
F HIGHLY FLAMMABLE
F+ EXTREMELY FLAMMABLE
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
7
Materijalot e potencijalno fatalna, toksi~na
supstanca
Mo`e da bide fatalna ili da predizvika privremeno
o{tetuvawe ako se inhalira, vnese preku usta ili
absorbira preku ko`a
Mo`e da predizvika iritacija ili izgoretini koi se
opasni po zdravjeto
T TOXIC
T+ VERY TOXIC
Mo`e da e potencijalen karcinogen
Materijal koj e opasen po zdravje pomalku od T i T+
Pri kontakt mo`e da predizvika reverzibilen
inflamatoren efekt na ko`a i o~i (o{tetuvaweto
zavisi od vremeto na kontakt i koncentracijata na
materijalot)
Xi IRRITANT
Xn HARMFUL
Materijal koj pri prva ekspozicija predizvikuva mala
ili voop{to na predizvikuva reakcija, no po
pove}ekratno izlo`uvawe mo`e da predizvika reakcija
Materijalot predstavuva potencijalna opasnost od
eksplozija dokolku se najde blizu plamen ili
zapaliv materijal
Osloboduva kislorod koj go zasiluva zapalivosta na
organskiot materijal
Vo kontakt so ko`ata i o~ite mo`e da predizvika
izgoretini
O OXIDISING
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
8
Imunolo{ki tehniki za izolirawe na imuni kletki ve`ba br. 1
Limfocitite se glavni u~esnici vo imunolo{kite i imunohemiskite
reakcii. Site limfociti se voglavno podeleni vo dve populacii: B i T
limfociti koi ponatamu se delat na subpopulacii. B limfocitite se vklu~eni
vo produkcija na antitela, a T limfocitite posreduvaat vo realizacija na
imunolo{kiot odgovor na kleto~no nivo. Materijal za izolacija i
frakcionirawe na limfocitite pretstavuva perifernata krv i limfa ili
cvrsti tkiva i organi kako: tonzili, slezina, timus, mezenteri~ni limfni jazli
i dr.
1. Izolacija na limfociti od polna krv
Limfocitite mo`at da se izoliraat od polna krv so pomo{ na
centrifugirawe vrz baza na gustinskiot gradient. Pri toa se iskoristuva
razlikata vo gustinata na razli~nite krvni kletki. Kletkite se
centrifugiraat se dodeka ne se postigne ramnote`a me|u nivnata gustina i
gustinata na nivnata okolna sredina. Kako medium za dvoewe na limfocitite se
koristi gradientna mikstura od fikol-triozil koja ima gustina od 1.077.
Limfocitite imaat pomala gustina od gradientnata mikstura i po
centrifugiraweto }e obrazuvaat sloj nad nea, dodeka drugite krvni kletki }e
patuvaat kon dnoto.
Slika 1. Izolacija na limfociti od polna krv
Zabele{ka: Ovoj metod gi dvoi mononuklearnite kletki: monociti i
limfociti. Dokolku vo ponatamo{nata upotreba na kletkite, monocitite
zna~ajno interferiraat, tie mo`at da se otstranat so inkubacija 2 ~asa na 37°S,
pri {to poradi atherentnite svojstva monocitite }e ostanat na dnoto na
epruvetata.
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
9
2. Izolacija na limfociti od cvrsti tkiva i organi:
Limfocitna suspenzija mo`e da se prigotvi i od cvsti limfoidni organi:
splinka, limfni jazli, burza ili timus. Limfocitite mo`at od ovie organi
direktno da se istisnat vo medium na tkivna kultura, koristej}i {irok
forceps (kle{ta) ili mehani~ki se istisnuvaat preku `elezna mre`a ili
cedilka so fin forceps.
Makrofagite se otstranuvaat od limfocitnata suspenzija so pomo{ na
`elezni strugotini. Makrofagite gi ingestiraat `eleznite strugotini po {to
se eliminiraat so upotreba na jak magnet.
[email protected] ZA SEPARACIJA NA T- OD V- KLETKI
Pokraj receptori za specifi~niot antigen limfocitite poseduvaat i
nespecifi~ni receptori za razli~ni strukturi kako: eritrociti, Fc
fragmentot na imunoglobulinskata molekula, komponentite na komplementot,
virusi i dr. Receptorite pretstavuvaat
to~no definirani strukturi,
lokalizirani naj~esto na povr{inata na kleto~nite membrani. Preku niv se
odigruvaat site interakcii i se primaat site stimulaciski i inhibitorni
signali. Prisustvoto na specifi~ni receptori na razli~ni subpopulacii na
limfociti dava mo`nosti za nivna separacija.
Postojat glavno pet metodi za separacija na B- od T-kletki i toa: komplement
ili toksin posreduvana citotoksi~nost, adherencija na najlonska volna,
matodot “panning”, tehnikata na rozetirawe i upotrebata na fluorescentno
aktivirani kleto~ni sorteri.
1. Komplement ili toksin posreduvana citotoksi~nost
[to se odnesuva do komplement posreduvana citotoksi~nost, so ovoj metod bi
mo`el da si polaska bilo koj totalitaren sistem. Metodot se zasnova na
eliminacija na kletkite koi ne treba da se prisutni vo limfocitnata
suspenzija, na primer V- limfocitite ili pak obratno T- limfocitite. Toa se
postignuva taka {to potrebno e najprvo da se proizvedat specifi~ni antitela
vpereni protiv selektivniot i specifi~niot antigenski repertoar na
kletkite koi treba da bidat eliminirani, koi potoa }e se povrzat so C1q
komponentata na komplementot, za da se pokrene negovata kaskada. So ovaa
komplementna aktivacija se sozdavaat uslovi za prezentirawe na liti~kata
aktivnost na komplementot vrz kletkite koi treba da se eliminiraat. Pri
sozdavaweto na liti~kiot tunel vo membranata na celnite kletki tie se
odnesuvaat metafori~no ka`ano kako brod koj tone, i nabrgu umiraat.
Vtor na~in da se sprovede istata cel e da se konjugira specifi~no
proizvedenoto antitelo so nekoj toksin (pr. ricin) i da se oformi imunotoksin
koj na sli~en na~in so pokrenuvawe na avtokrinite liti~ki sistemi na celnata
kletka (endoliti~ki organeli) uspeva da ja uni{ti istata.
2. Adherencija na najlonska volna
Sledniot separativen pat se sostoi vo upotreba na najlonska volna, so koja se
polni eden {pric niz koj potoa se istisnuva limfocitnata suspenzija koja
treba da se separira. Pritoa, na najlonskata volna se adheriraat 90-95% od Bkletkite, so ~istota 95-98%. Dokolku sepak ni se potrebni B-kletkite za
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
10
ponatamo{ni istra`uvawa, postapkata za nivna separacija }e odi razbirlivo
pote{ko, zaradi ednovremenoto prisustvo na makrofagite, mrtvite kletki i
zaostanatite T- limfociti.
3. Panning metoda
Ovaa tehnika se bazira na selektivna adhezija na B- ili T- limfocitite na
kolona oblo`ena so visokomolekularni partikli na koi so hemiska reakcija,
specifi~nite imunoglobulini se fiksirani so Fc fragmentot, taka da im se
slobodni Fab fragmentite i nalikuvaat na trapez- akrobati so ra{ireni race,
so koi mo`at da intereagiraat so razli~niot antigenski repertoar na V- ili Tkletkite. Kako visokomolekularni partikli se koristat dekstran (Sephadex),
agaroza (Sepharose), poliakrilamid ili stakleni top~iwa. Selektivno
nafatenite limfociti treba da se eluiraat naj~esto so promena na rN na
sredinata, koja treba da gi oslobodi od specifi~nite antitela. No, ova odi
tolku te{ko, {to e ramno na postapkata na izmivawe vo “tav~e” (angl. pan) na
zlatoto za otstranuvawe na zemjata {to go praktikuvale porane{nite traga~i
po zlato. Ottamu i celata metoda go nosi nazivot Panning.
4. Tehnikata na rozetirawe
Ova tehnika pretstavuva osnova za separacija na T od B limfociti od
limfocitna suspenzija. Se bazira na prisustvoto na nespecifi~ni receptori
za neobraboteni ov~i eritrociti poseduvaat samo humanite T-limfociti. Tlimfocititepreku ovie receptori se vrzuvaat za ov~ite eritrociti i sozdavaat
rozeti (t.n. direktni ili E - rozeti). Rozetite se sozdavaat spontano vo tek na 12 ~asa od me{aweto na humanite limfociti so ov~ite eritrociti na sobna
temperatura. Preparatot obi~no se tretira so Gimza ili druga tehnika na
boewe, a potoa se nabquduva pod mikroskop. Rozetite obi~no se definiraat
kako formacii od centralno postaven limfocit, opkru`en so 5 ili pove}e
eritrociti.
Pokraj direktnite rozeti, poznati se i metodite za formirawe na
indirektni rozeti od tipot EA (eritrocit-antitelo) kako i EAC (eritrocitantitelo-komplement).
5. Fluorescentno aktivirani kleto~ni sorteri
Ovaa metoda e najverojatno najelegantnata od prethodno spemenatite metodi,
a se izveduva vo specijalni aparati. Vo ramki na metodata najprvo se vr{i
obrabotuvawe na kleto~nata suspenzija so imunoglobulini koi se
fluorescentno markirani i specifi~no proizvedeni samo protiv repertoarot
na antigeni na samo eden vid na kletki (pr. V- limfociti). Potoa, kleto~nata
suspenzija ultrasoni~no se razbiva do kapki, pri {to sekoja kapka pretstavuva
edna kletka, koja }e se karakterizira so razli~na fluorescencija osvetlena vo
UV svetlo. Ovaa fluorescencija se detektira i se preveduva vo odreden naboj,
koj po postavuvaweto na kletkite kapki vo elektromagnetno pole doveduva do
nivno odbivawe ili zadr`uvawe prema {to tie kletki se sortiraat.
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
11
PRAKTI^NA RABOTA:
1. Izolacija na limfociti od polna krv so upotreba na centrifugirawe so
gradient na gustina
Periferna krv (3ml) zemena so venepukcija vo epruveta so antikoagulans
(heparin, EDTA) se diluira vo odnos 1:1 so fiziolo{ki rastvor. Vo postapkata
se koristat plasti~ni ili stakleni (specijalno staklo za krvni derivati)
epruveti za ednokratna upotreba ili silikonizirani stakleni epruveti za
pove}ekratna upotreba.
Vo epruveta se pipetira 1ml na gradientna mikstura fikol-triozil. Ova
mikstura se prigotvuva od 43.4ml 9.2% avtoklaviran voden rastvor na Fikol i
6.6ml Triozil 75. Postojat i komercijalni rastvori za dvoewe na limfociti od
razli~ni proizvoditeli. (Limphoprep, Histopaque i sl.)
Vrz slojot od fikol-triozil se nalevaat 3ml od diluiranata krv. Ova se
izveduva vnimatelno so cel da ne dojde so me{awe na dvata sloja. Epruvetata se
centrifugira 30 minuti na 4°C, 1200rpm. Pri toa na dnoto na epruvetkata se
istalo`uvaat eritrocitite, granulocitite i mrtvi kletki, bidej}i imaat
pogolema gustina, a na grani~niot sloj me|u povr{inata na gradientnata
mikstura i krvnata plazma se nafa}aat limfocitite kako bel sloj. Slojot od
limfociti se sobira vnimatelno so pomo{ na pasterova pipeta i se prenesuva
vo nova epruveta. ^ist proizvod od limfociti se dobiva otkoga tie dva pati }e
se izmijat so fiziolo{ki rastvor (3000rpm, 5 min. na 4°C). Talogot od
limfociti se doteruva do baranata koncentracija so medium Hanks.
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
12
2. Separacija na T-limfocitite so rozetna tehnika
Po separacijata na limfocitite so gradient na gustina se podesuva nivnata
koncentracija do 3x107 /ml vo medium koj e zbogaten so 5% fetalen tele{ki
serum ili so normalen ~ove~ki AB serum. Vaka prigotvenata suspenzija od
limfociti se me{a vo odnos 1:1 so 0.5% ov~e{ki eritrociti. Sme{ata se
inkubira na vodena bawa na 37°S za 10min., potoa se sedimentira so
centrifugirawe na 1000rpm. Potoa epruvetata se inkubira 18 ~asa na 4°S.
Dobieniot talog vnimatelno se resuspendira da ne se razbijat rozetite, od nego
se pravi razmaska i se nabquduvaat rozetite mikroskopski.
Dvoeweto na T-limfocitite so rozeti od drugite limfociti mo`e da se
izvr{i so centifugirawe so gradient na gustina. Suspenzijata od Tlimfocitinite rozeti vnimatelno se nanesuva na gradientna mikstura i se
centrifugira 20 min. na 1500-2000rpm. So pasterova pipeta se sobira slojot vo
koj se nao|aat T-limfocitnite rozeti. Za izolacija na T-limfocitite
neophodno e da se razru{at eritrocitite od nivnata povr{ina {to se pravi so
dodavawe na sekoj eden del limfocitna suspenzija po tri dela amonium hlorid i
inkubacija 10 min. na sobna temperatura. Potoa limfocitite se plaknat tri
pati so medium na 1000rpm po 10 min. i povtorno se resuspendiraat vo medium.
data:
osvoeni bodovi:
asistent:
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
13
Izolirawe i pro~istuvawe na antigeni i
antitela
Ve`ba br.2
Imunolozite ~esto manipuliraat so ~isti antitela koi se antigen
specifi~ni ili antigen nespecifi~ni. Izolacija na antigen nespecifi~ni
antitela se vr{i so edna od slednite metodi :
1. Isoluvawe so 30 -50% (NH4)2SO4
2. Gel filtracija
3. Jonoizmenuva~ka hromatografija (naj~esto za izolirawe na pozitivno
naelektrizirani ~esti~ki pri neutralno pH)
4. Afinitetna hromatografija (so prirodni ligandi za vrzuvawe na
imunoglobulini)
Izolacija na antigen specifi~nite antitela se vr{i so afinitetna
hromatografija, pri {to se koristi antigen naj~esto vrzan so sefaroza.
IgG ~ini 3/4 od imunoglobulinskiot bazen. IgG dominira vo cirkulacijata i
zatoa pojdoven materijal za dobivawe na IgG pretstavuva serumot. Izoliraweto
na IgG e zna~ajno za aplikacija na imunoglobulinite IgG per os, na primer pri
nekoi intestinalni infekcii, vo hibridoma tehnologijata i za proizvodstvo na
anti-IgG. IgG mo`e da se izoliraat so isoluvawe so (NH4)2SO4, jonoizmenuva~ka
hromatografija i gel filtracija, dodeka afinitetnata hromatografija
poretko se koristi za ovaa cel. Koncentracijata na IgM vo serumot e dovolno
visoka, za da toj se izolira od serum, no naj~esto vo praksa se koristat serumi od
pacienti so Valden{tremova makroglobulinemija ili serum od glu{ec so
plazmocitom kade e zgolemeno nivoto na IgM. Inaku IgM e voobi~aeno pentamer
povrzan so mal polipeptiden lanec (J lanec) za Fc fragmentot. Poradi golemata
molekularna masa pred se se dobiva so gel filtracija. IgA mo`e da se izolira
od serum na zdrava li~nost, od mleko ili kolostrum i drugi sekreti. IgA e
pretstaven preku obi~en i sekretoren IgA. Obi~niot IgA e naj~esto monomer a
sekretorniot IgA e dimer ili tetramer so α, λ, J lanec i sekretorna komponenta
koi se nadovrzuvaat vo voobi~aenata imunoglobulinska struktura. Naj~esto IgA
se dobiva so jonoizmenuva~ka hromatografija.
Gel filtracija
Gel filtracija pretstavuva edna od naj~estite metodi za frakcionirawe na
proteini. Proteinska smesa se nanesuva vo kolona ispolneta so gel, sostaven od
sferi~ni strukturi so pori so kontrolirana dimenzija. Pogolemite proteini
so dimenzija nad grani~nata dimenzija na porite na gelot ne mo`at da
navleguvaat niz negovite pori. Tie proteini ostanuvaat vo te~nosta me|u
top~iwata na gelot {to iznesuva 1/3 od vkupniot volumen na kolonata.
Najmalite proteinski molekuli minuvaat niz porite na gelot, go izminuvaat
vkupniot volumen na kolonata i se eluiraat. Proteinite so sredna dimenzija,
parcijalno navleguvaat vo porite i se eluiraat me|u totalniot i volumenot
me|u gel partiklite vo pozicija koja logaritamski zavisi od molekularnata
masa na tie proteini. Kolonite mo`e da se ispolneti so jagleni hidrati ili
poliakrilamid vo gel sostojba.
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
14
Slika 2. Princip na gel filtraciska hromatografija.
Slika 3. Separacija na molekuli so gel filtracija. Primerokot, koj
pretstavuva smesa od razli~ni molekuli, se aplicira vo gorniot den od
staklena ili plasti~na kolona ispolneta so permeabilen cvrst matriks.
Razli~nite frakcii paruvaat niz kolonata so razli~na brzina, {to
ovozmo`uva nivno pro~istuvawe i razdvojuvawe.
Jonoizmenuva~ka hromatografija
Ovoj metod se temeli na principot na reverzibilno povrzuvawe na
proteinite od smesata so jonoizmenuva~kite smoli, blagodarenie na jonski
interakcii me|u sprotivno naelektrezirani grupi. Imeno matriksot, koj nosi
jonski polne`, gi zadr`uva proteinite so sprotiven polne`. Proteinite
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
15
separativno se eluiraat so postepeno zgolemuvawe na jonskata ja~ina na
puferot. Ovoj na~in ili promenata na pH na mediumot vodat do kompetitiven
prekin na jonskite interakcii ili gubitok na polne`ot na proteinite. Sepak
pH rangot treba da e vnimatelno izbran taka da ne se izgubi elektri~niot
polne` na jonoizmenuva~ot, inaku site proteini bi se eluirale odedna{.
Kako matriksi za jonoizmenuva~ka hromatografija na proteini naj~esto se
koristat dietiaminoetil celuloza, koja e pozitivno naelektrizirana, i
karboksimetil
celuloza
ili
fosfoceluloza,
koi
se
negativno
naelektrizirani.
Slika 4. Princip na jonoizmenuva~ka hromatografija.
Afinitetnata hromatografija
Afinitetnata hromatografija pretstavuva ednostavna postapka za
izolirawe, frakcionirawe i pre~istuvawe na biolo{ki aktivni molekuli na
pr. imunoglobulini. Principot se sostoi od interakcija me|u nesolubilen
ligand (A) postaven na cvrst nosa~ (imunoadsorbent) i solubilna molekula (B)
pr. imunoglobulin, koja privremeno minuva vo nesolubilna molekula. So
preodot vo nesolubilna molekula fizi~ko - hemiskite svojstva na supstancata
(B) se menuvaat vo odnos na srodnite supstanci vo smesata, koi ostanuvaat
solubilni. Solubilnite kontaminenti se otstranuvaat so eluirawe od
kolonata. Potoa (B) povtorno se preveduva vo solubilna molekula i se eluira
vo ~ista forma od kolonata. Nesolubilniot ligand (A) mora da ima specifi~en
afinitet kon (B), od kade poteknuva i imeto afinitetna hromatografija.
Osnovata na pre~istuvaweto na imunoglobulinite pretstavuva izborot na
ligandi koi }e stapat vo specifi~na i reverzibilna interakcija so
imunoglobulinite. Takvi se na primer monoklonalnite antitela koi se
koristat za izolirawe i pro~istuvawe na povr{inskite imunoglobulinski
molekuli na B- kletkite. Na ova prethodi tretmanot na B - kletkite so
detergentni sredstva (povr{inski aktivni materii) za solubilizacija na
nivnata povr{inska membrana. Ako se koristat polivalentni ligandi so
razli~en afinitet za razli~ni molekuli (B1, B2, ... Bn) so postepena promena
na uslovite za disocijacija na nastanatite kompleksi (AB1), (AB2) itn. mo`e
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
16
da se izvr{i frakcionirawe na tie razli~ni no srodni molekuli (B1, B2, ...
Bn). Za izolacija na nekoi subklasi na IgG kako : IgG1, IgG2 i IgG4 se koristi
prirodniot ligand - proteinot A. Proteinot A e izoliran od kleto~niot zid
na Staphilococcus aureus i poka`uva afinitet za regionite Cγ2 i Cγ3 na
spomenatite subklasi na IgG.
Za polnewe na hromatografskite koloni naj~esto se koristi agar gel ili
aktivirana sefaroza. Pokraj izborot na specifi`en ligand, vo afinitetnata
hromatografija treba da se vnimava i na izborot na eluira~koto sredstvo koe
mo`e da pretstavuva: pufer, kompetitivna molekula za (B) ili sredstvo za
disocijacija na nekovalentnata vrska me|u ligandot (A) i odreduvanata
molekula (B), koja vo kompleksot (AB) e nesolubilna. Takvo na pr. disocira~ko
sredstvo ili haotrop pretstavuva tiocijanatot.
Slika 5. Princip na afinitetna hromatografija
Frakcionirawe na proteinite mo`e da se vr{i i so HPLC hromatografija
pod visok pritisok. Taa se temeli na istite principi kako i afinitetnata
hromatografija, gel filtracija i jonoizmenuva~ka hromatografija. Metodata e
brza, reproducibilna i so pogolema rezolucija poradi koristeweto na
pokvalitetni smoli, koloni za razdeluvawe i kontrolen sistem.
PRAKTI^NA RABOTA:
1. Frakcionirawe na antitela so gel filtracija niz kolona so Sephadex G25 gel:
Protokol za rabota :
1. Podgotovka na gel :
Sephadex G200 pretstavuva vkrsteno povrzan dekstran so opseg na
frakcionirawe na globularni proteini od 5000-200000Da. Sephadex G200 doa|a
vo forma na pra{ok koj treba da se nababri so soodveten volumen na pufer (so
minimalna jonska ja~ina ekvivalentna na 0.15mol/l NaCl). Vremeto na babrewe
zavisi od uslovite pod koi toa se odviva (3 ~asa na 20oS ili 1 ~as na 90oS).
Obi~no od 1g pra{ok se dobivaat 9-11ml nababren gel. Po babreweto,
supernatantot se dekantira i povtorno se dodava pufer so volumen potreben za
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
17
dobivawe na 75% suspenzija. Potoa suspenzijata se degazira i prefrla vo
soodvetnata kolona na ~ie dno ima staklena volna ili vata. Nababreniot gel se
prefrla odedna{ i po mo`nost so stakleno stap~e po yidovite na kolonata kako
bi se izbegnalo navleguvawe i zarobuvawe na vozduhot vo gelot koj bi ja
namalil rezolutivnata mo} na kolonata. Potoa se otvora ventilot na kolonata
i se ispu{ta puferot (so brzina od 3-4 ml/min) so simultano dodavawe na sve`
pufer od gornata strana so {to se zapo~nuva so procesot na gravitacisko
pakuvawe na kolonata. Pakuvaweto na kolonata se smeta deka e zavr{eno koga
}e se eluira volumen na pufer 3-4 pati pogolem od toj na kolonata. Kolonata ne
smee da se ~uva isu{ena. Proizvoditelot prepora~uva ~uvawe vo 20% etanol ili
0.2mol/l NaOH ili rastvor na nejonski PAS
2. Frakcionirawe na antitela :
Dokolku kolonata e konzervirana vo gorenavedenite rastvori, prvo treba da
se proplakne so volumen na pufer 3-4 pati pogolem od volumenot na kolonata.
Se ispu{ta vi{okot na pufer, se zatvora ventilot po {to od gornata strana
vnimatelno po yidovite se dodava rastvorot so smesa od antitela koi treba da se
frakcioniraat (volumenot na rastvorot na smee da bide pogolem od 20% od
volumenot na kolonata). Se otvara ventilot da eluira pufer so brzina od 23ml/min. Se ~eka primerokot da vleze vo kolonata po {to se dodava pufer
kontinuirano do zavr{uvawe na procesot. Frakcii od 3-5 ml se sobiraat vo
posebni epruveti se dodeka poslednata frakcija ne izleze od kolonata. Potoa
kolonata se ispira so 3-4 volumeni na pufer po {to se konzervira so ve}e
navedenite mediumi.
data:
osvoeni bodovi:
asistent:
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
18
Elektroforetski metodi i imunobloting
Ve`ba br.3
Elektroforezata pretstavuva proces na dvi`ewe na naelektizirani
molekuli pod dejstvo na elektri~no pole. Poradi toa {to vo elekti~no pole
razli~nite molekuli se dvi`at so razli~na brzina koja zavisi od nivnata
golemina, oblik i naboj, elektroforetskite metodi mo`at da se koristat za
razdvojuvawe na makromolekuli od smesa.
Kako matriksi za razdvojuvawe naj~esto se koristat vrsteno-povrzani
agarozni i poliakrilamidni gelovi, koi mo`at da bidat vo oblik na
horizontalna ili vertikalna plo~a. Goleminata na porite na ovie gelovi e
varijabilna vo zavisnost od koncentracijata na upotrebenite monomeri, {to
ovozmo`uva prigotvuvawe na gelovi so razli~na rezoluciska mo} i
razdvojuvawe na makromolekuli so razli~ni molekulski masi. Od aspekt na
razdvojuvawe na proteini (so Mr od 5.000 do 200.000 Da), mnogu po~esto se
koristat poliakrilamidnite gelovi bidej}i tie imaat pomali pori vo odnos na
agaroznite. Agaroznite gelovi po~esto se koristat za razdvojuvawe na
nukleinski kiselini, mnogu golemi proteini i proteinski kompleksi.
Slika 6. Agarozni i poliakrilamidni gelovi. (a)
Agaroznite gelovi se formiraat so nekovalentni
vodorodni vrski i hidrofobni interakcii. (b)
Poliakrilamidnite gelovi gelovi se formiraat so
kovalentni vkrsteni vrski.
Poliakrilamid gel elektroforeza (PAGE)
Poliakrilamidniot gel se podgotvuva so ko-polimerizacija na akrilamid i
N,N'-metilen bisakrilamid kako vrsten-povrzuva~ vo prisustvo na amonium
persulfat (APS), koj slu`i kako inicijator na polimerizacijata, i N,N,N’,N’tetrametiletilendiamin, kako katalizator. Goleminata na porite zavisi od dva
parametri:
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
19
-
%T {to pretstavuva vkupna masa na akrilamid i bisakrilamid vo
rastvorot izrazena kako % m/v. Zavisnosta e obratnoproporcionalna,
imeno, kolku e pogolema vrednosta na %T, tolku porite se pomali
%S {to pretstavuva masen udel na vrsniot provrzuva~ bisakrilamid vo
odnos na vkupna masa na akrilamid i bisakrilamid izrazena kako %
m/m. Za gelovi so bilo koja vrednost na %T, najmali pori se dobivaat
dokolku vrsniot povrzuva~ e zastapen vo 5% m/m, odnosno vrednosta na
%S =5. Nad i pod ovaa vrednost porite na gelot se zgolemuvaat.
Slika 7. Presmetuvawe na %T i %S za poliakrilamidni gelovi.
Proteinite pretstavuvaat amfoterni (cviterjonski) soedinenija bidej}i
sodr`at i pozitivni i negativni strani~ni grupi. Najgolemiot del od nivniot
naboj poteknuva od pH-zavisnata jonizacija na strani~nite karboksilni i amino
grupi. Spored toa vkupniot naboj na eden protein e odreden od brojot i vidot na
aminokiselinite od koi e sostaven i pH sredinata na mediumot. Za sekoj
protein postoi edinstvena pH vrednost na koja toj ne poseduva elektri~en naboj,
koja e nare~ena izoelekri~na to~ka (pI). Vo medium so pH pogolema od negovata
pI toj }e ima vkupen negativen polne` i pri elektroforeza }e se dvi`i kon
pozitivnata elektroda (anoda), i sprotivno vo medium so pH pomala od negovata
pI toj }e ima vkupen pozitiven polne` i }e se dvi`i kon negativnata elektroda
(katoda). Ova uka`uva na va`nosta od odr`uvawe na konstantna vrednost na pH
sredinata pri elektroforeza, osobeno koga proteinite se separiraat vo
nivnata nativna sostojba.
Mnogu po~esto razdvojuvaweto na proteinite se izveduva vo denaturira~ki
uslovi, pri {to doa|a do gubewe na nivnata sekundarna i tercierna struktura.
Vo ovoj slu~aj oblikot na molekulata pove}e ne pretstavuva faktor koj go
ograni~uva dvi`eweto na proteinite pri elktroforeza. Denaturacijata na
proteinite naj~esto se izveduva so koristewe na anjonski detergenti kako
natrium dodecil sulfatot (SDS - sodium dodecyl sulphat). Ovoj vid na
elektroforeza se narekuva SDS-PAGE. Natrium dodecil sulfat gi denaturira
proteinite preku naru{uvawe na hidrofobnite interakcii, raskinuvawe na
vodorodnite vrski i i formirawe na stabilni kompleksi so molekulite, na toj
na~in {to gi obvitkuva polipeptidnite verigi so svojata hidroofobna opa{ka.
Koli~inata na SDS koja se kompleksira so proteinite ne zavisi od nivniot
polne` i aminokiselinska sekvenca, tuku samo od nivnata golemina. Visokiot
negativen polne` na SDS od kompleksot gi maskira razlikite vo pI (polne`ot)
pome|u razli~nite proteini koi vlijaat na elektroforetskata podvi`nost.
Obraboteni na ovoj na~in, site proteini }e imaat negativen polne` i pritoa
goleminata na negativniot polne` pretstavuva funcija od nivnata golemina.
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
20
Kako posledica na ova, edinstveniot faktor od koj zavisi elektroforetskata
podvi`nost na proteinite pri SDS-PAGE pretstavuva molekulskata masa.
Vrz osnova na brojot na puferi koi se upotrebuvaat pri edna proteinska gel
elektroforeza, taa mo`e da bide kontinuirana ili diskontinuirana. Vo
kontinuiraniot sistem se koristi samo eden pufer i za izrabotka na gelot i
kako medium za te~ewe na elektroforezata, dodeka vo diskontinuiraniot
sistem se koristat pove}e razli~ni puferi so razli~na pH. Iako prviot e
mnogu polesen za izvedba, diskontinuiraniot sistem e mnogu podobar bidej}i na
ovoj na~in se izbegnuvaat mnogu problemi povrzani so precipitacija i
agregacija na primerocite i ima mnogu pogolema rezoluciska mo}. Gelovite koi
se koristat pri diskontinuirani sistemi se sostaveni od dva dela (Slika 6):
- separaciski gel, koj ima pomali pori i vo koj se vr{i razdeluvaweto na
proteinite. pH sredinata vo ovoj gel ovozmo`uva odr`uvawe na
negativniot polne` na proteinite, a so toa i nivna podvi`nost.
- aplikaciski gel, koj e nerestiktiven i se izleva nad separaciskiot gel.
pH sredinata vo ovoj gel go delumno poni{tuva negativniot polne` i
elektroforetskata podvi`nost so {to se ovozmo`uva koncentrirawe na
proteinite vo oblik na lenta na dopirnata povr{ina me|u dvata gela.
Diskontinuiranata denaturira~ka poliakrilamid elektroforeza, poznata
pod imeto Laemmli SDS-PAGE (spored nejziniot pronao|a~) denes pretstavuva
naj~esto upotrebuvanata metoda za separacija na proteini.
Slika 8. Diskontinuirana SDS poliakrilamid gel elektroforeza
Analizata na elektroforegramite vklu~uva detekcija i kvantifikacija na
separiranite proteinski frakcii po nivna vizuelizacija so upotreba na
soodvetni boeni tehniki. Naj~esto koristeni tehniki na boewe se Coomassie blue
vo rastvor za fiksacija i redukcija na srebroto od negovite soli po fiksacija
na elektroforegramite. Limitot na detekcija Coomassie blue tehnikata e 100300ng protein/traka, dodeka tehnikata na boewe so srebro e okolu 100 pati
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
21
posenzitivna, so limit na detekcija od 1ng protein. Odreduvaweto na
goleminata na trakite (Mr na proteinot) e ovozmo`eno preku sporeduvawe so
standardi so poznata golemina koi sekoga{ se apliciraat paralelno so
ispituvanite primeroci. Najednostaven na~in za kvantifikacija na
ispituvaniot protein pretstavuva vizuelno sporeduvawe na intenzitetot na
trakata so intenzitetot na standardite, te~eni na istiot gel, koi se so poznata
koncentracija. Poto~en metod na kvantifikacija pretstavuva denzitometrisko
skenirawe na oboenite gelovi.
Proteinski (Western) bloting
Ponatamo{nite analizi koi vklu~uvaat reaktivnost na antitela na
proteinite separirani so elektroforeza imaat potreba od otstranuvawe na
elektroforetskiot matriks. Ova najednostavno se postignuva so proteinski
bloting. Proteinskiot bloting podrazbira ednostaven transfer (elucija) na
separiranite proteinski frakcii od {irokata strana na poliakrilamidniot
gel na postabilen medium za imobilizacija, odnosno membranski filter koj gi
vrzuva proteinskite molekuli vo momentot koga tie go napu{taat gelot.
Mediumot za imobilizacija pretstavuva membrana od razli~en materijal
nitroceluloza, najlon ili poliviniliden difluorid (PVDF).
Slika 9. Elektroforetski bloting sistemi. (a) {ematski prikaz
na vertikalen sistem i horizontalen “polusuv” sistem. (b) pravec
na dvi`ewe na proteinskite frakcii.
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
22
Proteinskiot bloting mo`e da se izvede kako kapilaren ili
elektroforetski bloting. Kapilarniot bloting se vr{i taka {to nekolku
listovi filterna hartija so golema apsorptivna mo} se natopuvaat so
transferen pufer i se povrzuvaat so rezervoarite so pufer. Na filternata
hartija se stava ise~okot od poliakrilamidniot gel a nad nego
nitroceluloznata membrana. Nad membranata se stavaat nekolku listovi
filterna hartija i sun|er. Kapilarniot bloting te~e 24 - 48 ~asa. Pri
elektroforetskiot bloting, proteinite se prenesuvaat od gelot na membranata
po pat na elektroforeza vo rok od samo 30 min. do nekolku ~asa. Gelot i
membranata se postavuvaat vo vertikalen sistem potopen vo transferen pufer.
Pod dejstvo na elekti~no pole separiranite proteini izleguvaat od gelot i
navleguvaat vo membranata. Alternativno, puferskiot sistem mo`e da se
zameni so filterna hartija potopena vo tranferen pufer. Ova e t.n.
horizontalen “polusuv” elekroforetski bloting.
Po tranferot proteinsite frakcii, sega ve}e povrzani za membranata,
mo`at da se detektiraat ili preku vrzuvawe so specifi~ni antitela ili
nespecifi~no so upotreba na razli~ni tehniki na boewe. Detekcijata so
antitela se izveduva na toj na~in {to nitroceluloznata membrana se tretira so
antitela specifi~no vpereni protiv odreden protein, a potoa se voveduvaat
sekundarni antiimunoglobulinski antitela koi se kowugirani so enzim. So
upotreba na hromogen supstrat specifi~en za enzimot so koj e markirano
antiteloto se javuva obojuvawe na membranata.
PRAKTI^NA RABOTA:
1. Separacija na proteini od smesa so upotreba na Laemmli SDS-PAGE.
Protokol za rabota:
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
23
Rezultati:
Interpretacija na rezultatite:
data:
osvoeni bodovi:
asistent:
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
24
Reakcii na aglutinacija
Ve`ba br.4
Aglutinacijata pretstavuva pojava na slepuvawe na kletki (bakterii,
eritrociti) ili krupni ~esti~ki (polistirenski lateks, bentonit, kaolin,
mikrokristali na holesterol i dr.) na ~ija povr{ina se locirani antigeni koi
stapuvaat vo interakcija so specifi~ni antitela. Pri intereagiraweto so
barem dva antigena, antitelata vospostavuvaat eden vid mostovi me|u niv i
doveduvaat do slepuvawe na kletkite ili ~esti~kite na koi se smesteni tie
antigeni. Pri toa antitelata mora da ja sovladaat jonskata obvivka na kletkata
na koja se nao|a antigenot so koj se povrzuvaat. Aglutinacijata doveduva do
formirawe na golemi agregati na kletki ili ~esti~ki, nare~eni aglutinati,
koi mo`at da bidat vidlivi mikroskopski ili makroskopski. Antitelata koi
u~estvuvaat vo reakcijata na aglutinacija se narekuvaat aglutinini, a
antigenite so koi intereagiraat aglutinogeni. Na reakcijata na aglutinacija
vlijaat koncentracijata na aglutininite i aglutinogenite, prirodata na
antigenskata struktura, jonskata jakost na mediumot, temperaturata i dr.
faktori. Iako vo reakciite na aglutinacija stapuvaat IgG, IgM i poretko IgA
antitelata, na~elno IgM antitelata pretstavuvaat najdobri aglutinini poradi
golemata valentnost.
Slika 10. Princip na reakcija na aglutinacija
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
25
Vrz osnova na principot na reakcijata testovite na aglutinacija se delat na:
1. testovi na aktivna (direktna) aglutinacija koi slu`at za detekcija na
partikularni antigeni;
2. testovi na pasivna (indirektna) aglutinacija koi slu`at za detekcija
na solubilni antigeni;
3. testovi na inhibicija na aglutinacija.
Testovite na aktivna aglutinacija se delat na testovi na brza aglutinacija,
koi se izveduvaat na predmetni stakla i testovi na spora (klasi~na)
aglutinacija koi se izveduvaat vo epruveti. Testovite na brza aglutinacija se
kvalitativni testovi (+/-). Odreduvaweto na krvnite grupi pretstavuva
klasi~en primer na brza direktna aglutinacija. Se ispituva prisustvo na
aglutinat po inkubacija na eritrocitite od ispituvanoto lice so anti-A, antiB i anti-AB serum.
Slika 11. Odreduvawe na krvni grupi
Slika 12. (a) izvedba na test na brza aglutinacija; (b) negativen i
pozitiven razultat.
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
26
Testovite na spora aglutinacija mo`at da poslu`at za kvantifikacija na
aglutininite vo serumot. Odreduvaweto se vr{i vo epruveti ili
mikrotitarski plo~i so upotreba na konstantna koli~ina na aglutinogeni
dodeka serumot se dodava vo razli~ni razreduvawa. Naj~esto se raboti so dvojni
razreduvawa na serumot (1:20, 1:40, 1:80…). Najgolemoto razreduvawe na serumot
so koe seu{te se postignuva aglutinacija go dava titarot na aglutininite. Pri
pozitivna reakcija aglutinatite se talo`at na dnoto na epruvetata a
preostanata te~nost e bistra, pri {to talogot e so neramni rabovi. Pri
negativnata reakcija, sodr`inata vo epruvetata ima ednomerno zamatuvawe,
mo`na e pojava na talog so mazni rabovi koj so protresuvawe homogeno se
suspendira.
Slika 13. Odreduvawe na titar na antitela so reakcija na spora
aglutinacija. (a) pozitina reakcija, (b) negativna reakcija
Kaj pasivnata aglutinacija doa|a do aglutinirawe na solubilni antigeni
vrzani za nekoj nosa~ kako polistirenski lateks (lateks aglutinacija) ili ov~i
eritrociti (hemaglutinacija). Samiot nosa~ ne e imunogeni~en. Eritrocitite
lesno se vrzuvaat za polisahariden antigen, no ako antigenot po poteklo e
proteinski ili nukleinska kiselina moraat prethodno da se obrabotat so
taninska kiselina ili hrom hlorid. Primer za pasivna hemaglutinacija
pretstavuva Waaler - Rose -oviot test za odreduvawe na reumatidniot faktor. Se
izveduva so dodavawe na serum od pacient na serum od hiperimuniziran zajak so
ov~i ili humani eritrociti. Ako se javi aglutinacija zna~i deka vo serumot na
pacientot e prisuten reumatiden faktor koj pretstavuva anti - IgG.
Postojat i t.n. neaglutinaciski antitela koi mo`at da se doka`at so Coombsov antiglobulinski test. Primer za Kumbsov test pretstavuva odreduvaweto na
antitelata protiv eritrocitniot antigen Rho ili D antigen. Toj isto taka
mo`e da vklu~uva direktna ili indirektna aglutinacija. Pri direktniot
Kumbsov test se odreduva prisustvoto na aglutinini od Rh- majka na povr{inata
na eritrocitite na Rh+ novoroden~e, Testot se izveduva so dodavawe na
antiglobulinski antiserum koj se vrzuva za Fc fragmentot na aglutininite i
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
27
doveduva do pojava na aglutinacija na
eritrocitite. Pozitivnata reakcija na
aglutinacija upatuva na prisustvoto na
aglutinini vo serumot na majkata. Ovie
aglutinini
gi
opkru`uvaat
eritrocitite na novoroden~eto no bez
u~estvoto na antiimunoglobulinski
antitela ne mo`at da izvr{at
aglutinacija na eritrocitite na
novoroden~eto in vitro.
Indirektniot Kumbsov test se
koristi za utvrduvawe na prisustvoto
na aglutininite naso~eeni protiv Rho
antigenot na fetusnite eritrociti vo
serumot na gravidna `ena. Testot se
izveduva taka {to na serumot na `enata
se dodava serum od lice so krvna grupa
O Rh+, a potoa antiimunoglobulinski
antiserum koj }e ovozmo`i in vitro
aglutinacija na senzibiliziranite
eritrociti so pripadnost na krvnata
grupa Rho. Pozitivnata reakcija na
aglutinacija potvrduva deka vo serumot
na `enata se prisutni aglutinini.
Slika 13. Izveduvawe na direkten i
indirekten Kumbsov test.
Testovite na inhibicija na aglutinacijata se temelat na sposobnosta na
nekoi virusi i mikoplazmi da se vrzat za povr{inskite receptori od
eritrocitite na nekoi `ivotinski vrsti i da izvr{at nivna aglutinacija.
Pojavata sozdava uslovi za utvrduvawe na prisustvoto na antivirusni antitela
vo serum na pacienti. Vo kolku na me{avinata virus i eritrociti se dodade
ispituvaniot serum od pacientot i ne dojde do aglutinacija zna~i vo serumot se
prisutni antivirusni antitela koi go blokiraat virusot da izvr{i
aglutinacija na eritrocitite. So toa se izdava pozitivna dijagnoza deka
pacientot e inficiran so ispituvaniot virus.
Slika 14. Hemaglutinacija (a) i inhibicija na hemaglutinacija (b)
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
28
PRAKTI^NA RABOTA:
1. Reakcija na brza direktna aglutinacija (Roze Bengal test) spored
protokolot na proizvoditelot.
Postapka na izveduvawe na testot:
Rezultati:
Interpretacija na rezultatite:
data:
osvoeni bodovi:
asistent:
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
29
Imunohemoliti~ki testovi, reakcija na
vrzuvawe na komlement
Ve`ba br.5
Dejstvoto na razli~ni fizi~ko - hemiski faktori (temperatura, pH, jonska
ja~ina, prisustvo na detergenti, toksini i dr.) doveduva do fragmentirawe na
eritrocitnata membrana i osloboduvawe na hemoglobinot, proces ozna~en kako
hemoliza. Vrzuvaweto na antitela za nekoj eritrociten membranski antigen i
vklu~uvaweto na sistemot na komplement isto taka doveduva do hemoliza na
eritrocitite, {to e iskoristeno vo golem broj na funkcionalni analizi
ozna~eni kako imunohemoliti~ki testovi.
Sistemot na komplement pretstavuva del od vrodeniot imunolo{ki sistem.
Klasi~nata pateka na aktivirawe na komplementot zapo~nuva so interakcijata
na prisutnite antigeni i antitelata koi se specifi~no naso~eni protiv niv.
Sposobnost za vrzuvawe i aktivacija na komplementot imaat IgG i IgM
antitelata. Nastanatiot imunolo{ki kompleks antigen-antitelo preku
promena vo steri~kata konformacija na antiteloto ovozmo`uva povrzuvawe na
C1q komponenta od komplementot za Fc fragmentot na antiteloto. Ova doveduva
do sukcesivno, kaskadno aktivirawe na drugite komponenti od komplementot
koi doveduvaat do uni{tuvawe na patogenot preku reakcii na opsonizacija,
hemotaksija i liza.
Reakcija na vrzuvawe (fiksacija) na komplementot (RVK). Prvobitno ovoj
metod bil voveden vo 1909 godina za serolo{ko doka`uvawe
(serodijagnosticirawe) na sifilis (Wasserman-ova reakcija). Denes metodot e
adaptiran i voveden vo rutinska upotreba za doka`uvawe na infekcija so
razli~ni pri~initeli, prvenstveno virusi. Na~elno metodot mo`e da se
iskoristi za doka`uvawe na prisustvo i odreduvawe na titarot na bilo koi
antitela vo serum na pacienti pod uslov da raspolagame so soodvetno
specifi~en antigen i obratno.
Vo su{tina, testot na vrzuvawe na komplement se sostoi od dve antigenantitelo reakcii. Prvata e pome|u antitelata ~ie prisustvo se ispituva vo
serumot na pacientot i specifi~en antigen (glavna reakcija ili t.n. test
sistem), a vtorata e pome|u ov~i eritrociti senzitizirani so hemolizin koj
pretstavuva antiserum od zajak odnosno specifi~ni antieritrocitni antitela
dobieni so specifi~na senzibilizacija na zajakot so ov~i eritrociti. Ovaa
vtora (sporedna) reakcija se narekuva indikatorski ili hemoliti~en sistem.
Dvete reakcii vklu~uvaat aktivacija na sistemot na komplement.
Slika 15. Reakcija na vrzuvawe na komplement: test sistem (desno) i
indikatorski sistem (levo).
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
30
Testot na vrzuvawe na komplement se izveduva vo dve fazi (Slika 9):
Vo prvata faza na testot se izveduva glavnata (test) reakcija na toj na~in
{to vo serumot od pacientot, kaj kogo go odreduvame prisustvoto na specifi~ni
antitela, se dodava standarden (komercijalen) antigen i to~no opredelena
(konstantna) koli~ina na komplement dobien od zamor~e (guinea pig). Serumot
dobien od pacientot prethodno se inkubira 30 minuti na 56°C so {to doa|a do
inaktivacija na avtologniot komplement, poradi {to edinstveniot komplement
koj mo`e da se upotrebi vo tek na reakcijata antigen-antitelo koja se o~ekuva e
onoj koj e dodaden vo tekot na izveduvaweto na testot.
Po zavr{enata inkubacija na test sistemot (30 minuti na 37°C) se izveduva
vtorata faza od testot so dodavawe na indikatorskiot (hemoliti~en) sistem na
prethodnata reakcija i inkubacija pod istite uslovi (30 minuti na 37°C).
Dokolku vo serumot od pacientot bile prisutni antitela za ispituvaniot
antigen, }e nastane reakcija na obrazuvawe na imunolo{ki kompleksi pome|u
niv pri {to dodadeniot komplement }e bide konzumiran (vrzan). Bidej}i
komplementot e isto taka potreben i za interakcijata pome|u ov~ite
eritrociti i hemolizinot, dodavaweto na indikatorskiot sistem vsu{nost go
detektira prisustvoto na preostanat komplement. Pozitivna reakcija
(prisustvo na antitela vo serumot na pacientot) }e bide detektirana kako
otsustvo na liza na ov~ite eritrociti, i obratno, negativna reakcija (otsustvo
na antitela vo serumot na pacientot) }e bide vizualizirana kako liza na ov~ite
eritrociti od indikatorskiot sistem.
Iako testot na vrzuvawe na komplement se smeta za relativno ednostaven
test, negovoto izveduvawe e komplicirano i odzema mnogu vreme poradi toa {to
vo nego se vklu~eni 5 varijabli. So cel da se odredi titarot na antitelata vo
serumot na pacientot potrebno e site ostanati varijabli koi vlijaat na testot
da bidat strogo kontrolirani. Pri sekoe izveduvawe na testot treba da se
koristi optimalna koncentracija na hemoliti~kiot sistem, antigenot i
komplementot koja se odreduva so titracija na sekoja komponenta posebno. Na
toj na~in, so standardizirawe na uslovite na reakcijata, sekoja promena na
koncentracijata na antitelata }e dovede do promena na intenzitetot na
hemoliza. Titarot na antitelata se odreduva so pravewe na seriski razreduvawa
na serumot na pacientot, pri {to se zabele`uva najgolemoto razreduvawe pri
koe seu{te ne se javila hemoliza (Slika 8).
Slika 16. Reakcija na vrzuvawe na komplement: izveduvawe na testot (a) i
princip na odreduvawe na titar na antitela vo serum na pacient (b).
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
31
Slika 17. Interpretacija na rezultati od test na vrzuvawe na komplement
PRAKTI^NA RABOTA:
1. Izveduvawe na reakcija na vrzuvawe na komplement spored protokolot na
proizvoditelot.
Postapka na izveduvawe na testot:
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
32
Rezultati:
Interpretacija na rezultatite:
data:
osvoeni bodovi:
asistent:
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
33
Odreduvawe i kvantifikacija na rastvorlivi
antigeni i antitela, RIA i ELISA
Ve`ba br.6
Radioimunolo{ki testovi (RIA = Radioimmunoassay) pretstavuva zbiren
naziv za testovi vo koi se koristi radioaktiven obele`uva~ (marker),
konjugiran za antigen ili antitelo pri {to so upotreba na scintilaciski
broja~ se dobiva kvantitativen uvid vo ispituvaniot materijal. Metodata e
senzitivna i reproducibilna, a od druga strana mo`e da se primeni vo
odreduvawe na {iroka lepeza na materii: antigeni, antitela, hormoni, lekovi
(digitoksin, morfin), angiotenzin I i II, cAMP i cGMP, karcinoembriski
antigen, prostaglandini i dr. Kako radioaktiven marker se
koristat
131,
125,
3
,
12
H C i dr.
radioaktivnite J J
Imunoenzimskite testovi (ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assays,
poznati i kako EIA = enzyme immunoassays) se temelat na istite principi kako
i radioimunolo{kite testovi, me|utoa vo ovoj slu~aj kako marker za
obele`uvawe na specifi~nata antigen-antitelo reakcija se koristi enzim.
Ovaa metodologija e vovedena vo 1971 godina so cel da se izbegne upotrebata na
radioaktivni markeri, a pritoa da ne se izgubi osetlivosta, to~nosta i
specifi~nosta koja ja nudat radioimunolo{kite testovi. Denes pretstavuva
eden od naj~esto upotrebuvanite serolo{ki testovi i mo`e da se iskoristi za
detekcija i kvantifikacija na bilo koi antigeni ili antitela.
Detekcijata kaj ELISA e ovozmo`ena so upotreba na hromogeni supstrati
koi produciraat zabele`liva promena na bojata pod dejstvo na enzimot vo
prisustvo na imunolo{ki kompleksi antigen-antitelo. Promenata na bojata se
detektira spektrofotometriski. Naj~esto upotrebuvani enzimi kako markeri
pri ELISA se peroksidaza i alkalna fosfataza koi koristat razli~ni
supstrati:
1. za alkalna fosfataza naj~esto se koristi p-nitrofenil fosfat (pNPP), koj
pod dejstvo na enzimot se konvertira p-nitrofenol so `olta boja koja mo`e da
se izmeri na 405nm branova dol`ina.
2. za peroksidaza kako supstrat se koristi vodoroden peroksid, koj pod
dejstvo enzimot osloboduva nascenten kislorod odgovoren za oksidacija
hromogen supstrat koj pritoa ja menuva bojata.
- 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin (TMB) koj dava sino obojuvawe koe mo`e
da se izmeri na 450nm branova dol`ina;
- o-fenilendiamin dihidrohlorid (OPD) koj dava portokalovo
obojuvawe koe mo`e da se izmeri na 492nm branova dol`ina i
- 2,2’-azino-di-[3-etil-benzotiazolin-6-sulfonska kiselina] diamonium
sol (ABTS) koj dava zeleno obojuvawe koe mo`e da se izmeri na 416nm
branova dol`ina.
Osven kako kvalitativen test, ELISA (i RIA) mo`e da se koristi i kako
kvantitativen
test.
Intenzitetot
na
obojuvaweto
se
odreduva
spektrofotometriski, a od dobienata vrednost na apsorbanca na primerokot
mo`e da se odredi koncentracijata preku ekstrapolacija na standardna kriva.
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
34
Titarot na antitelata mo`e da se odredi i so pravewe na seriski razreduvawa
na serumot na pacientot, pri {to kako vrednost se zema najgolemoto
razreduvawe pri koe seu{te se razviva boja.
Vrz osnova na principot na izveduvawe na reakcijata radioimunolo{kite i
imunoenzimskite testovi mo`at da bidat kompetitivni i nekompetitivni.
Nekompetitivnite od svoja strana se delat na indirektni, direktni i t.n.
sendvi~ metodi.
1. Nekompetitivna ELISA
Indirektna ELISA
Indirektnata ELISA pretstavuva metod koj naj~esto se koristi za
detekcija na prisustvo na antitela vo serum na pacienti. Kako i site drugi
tipovi na ELISA, postapkata se izveduva vo polistirenski ili PVC
mikrotitarski plo~i koi vo ovoj slu~aj se oblo`uvaat so komercijalno
prigotven antigen (specifi~en za potencijalnite antitela od ispituvaniot
krven serum). Dokolku ispituvanite antitelata se prisutni vo serumot na
pacientot tie ke se vrzat za antigenite so koi se oblo`eni bunar~iwata na
mikrotitarskata plo~a. Za detekcija na imunolo{kite kompleksi se koristi
vtoro t.n. sekundarno antihumano antitelo (naj~esto IgG) koe e kowugirano so
enzim i soodveten enzimski supstrat. Sekundarnite antitela se nadovrzuvaat na
antitelo-antigen kompleksot preku Fc fragmentot od humanoto antitelo.
Intenzitetot na obojuvawe na supstratot }e bide pravoproporcionalen so
koncentracijata na ispituvanite antitela vo serumot na pacientot.
Direktna ELISA
Direktnata ELISA pretstavuva metod koj naj~esto se koristi za detekcija
na prisustvo na antigeni vo serum na pacienti. Pri ovoj metod, za razlika od
indirektniot, istituvaniot antigen direktno se vrzuva za bunar~iwata od
mikrotitarskata plo~a i se koristi samo edno antitelo koe e obele`ano so
enzim. Intenzitetot na obojuvawe na supstratot e pravoproporcionalen so
koncentracijata na ispituvaniot antigen vo serumot na pacientot.
Slika 18. Direktna i indirektna ELISA
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
35
Sendvi~ ELISA
Sendvi~ ELISA se izveduva taka {to najprvo se vr{i imobilizacija na
komercijalni nemarkirani antitela vo bunar~iwata od mikrotitarskata plo~a,
vo koi potoa se nanesuva ispituvan serum na pacient so potencijalen,
specifi~en, suspekten antigen. Ako vakov antigen prisustvuva vo serumot na
pacientot, toj }e se vrze za imobiliziranoto antitelo (so edna antigenska
determinanta). Detekcijata se izveduva so pomo{ na vtoro antitelo koe e
kowugirano so enzim a se vrzuva za druga antigenska determinanta na istiot
antigen. Kolku e pogolema koncentracijata na suspektniot antigen od krvniot
serum, tolku }e bide pogolema koli~inata na nastanatite imunokompleksi
nemarkirano antitelo-antigen-markirano antitelo, odnosno }e bide pogolem
intenzitetot na obojuvawe. So ovoj metod mo`at da se odreduvaat samo
multivalentni antigeni i obi~no se koristi vo slu~ai koi ispituvaniot
antigen e vo mnogu mala koli~ina ili dokolku vo primerokot ima prisustvo na
golemi koli~ini na proteinski kontaminenti.
Slika 19. Izveduvawe na naj~estite tipovi na ELISA
2. Kompetitivna ELISA
Kompetitivnata ELISA isto kako i nekompetitivnata mo`e da se iskoristi
za detekcija i na antigeni i na antitela vo serumot na pacienti, vo zavisnost od
toa koja komponenta e imobilizirana a koja kowugirana so enzim. Principot,
kako {to uka`uva i samo ime na metodata, e kompeticija za ista antigenska
determinanta na ispituvanite antitela (ili antigeni) od serumot na pacientot
i dodadenite antitela (ili antigeni) koi se kowugirani so enzim. Kolku e
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
36
pogolem titarot na antitelata vo serumot na pacientot, vo tolku pomala
koli~ina }e se vrzat markiranite antitela. Spored toa, za razlika od
nekompetitivnata ELISA, vo ovoj slu~aj intenzitetot na obojuvawe e
obratnoproporcionalen so koncentracijata na ispituvanite antitela vo
serumot na pacientot.
PRAKTI^NA RABOTA:
1. Индиректен ELISA метод за утврдување на постоење на вкрстена реактивност на
антиганглиозидните антитела кај пациенти со Guillain-Barre синдром кон LPS од
Campylobacter jejuni и хуманите ганглиозиди
Крвта од пациентите со Guillain-Barre синдром (кај кои се испитува присуство на
присутни анти-GM1 антитела) се собира во епрувети без антикоагуланс. Штом се
формира коагулум епруветите се центрифугираат со цел да се одвои серумот.
Хемолизирани, липемични и иктерични примероци не треба да се користат. Доколку
тестот не се изведува веднаш по собирањето на примероците, серумот може да се чува
на -20 оC (или на -80 оC за подолго чување). Смрзнатите примероци не треба да се
одмрзнуваат и повторно смрзнуваат бидејќи со тоа ќе се намали активноста на
антителата.
Потребни реагенси:
Антигени за обложување на плочите: липополисахариди (LPS) изолирани од C.
jejuni и ганглиозиди (GM1)
Секундарно антитело (анти-IgG) конјугирано со ензим алкална фосфатаза или
пероксидаза
Супстрат за алкална фосфатаза (pNPP: p-нитрофенилфосфат) или супстрат за
пероксидаза (OPD: о-фенилдиамин)
Раствор за блокирање: BSA (bovine serum albumin)
Раствор за промивање: вообичаено PBS (фосфатен пуфер) или TBST (раствор на
NaCl со 0.05% (v/v) Tween20 пуфериран со Tris).
Реагенс за стопирање на реакцијата ензим-супстрат: 3 М NaOH (алкална фосфатаза)
односно 3 M HCl или H2SO4 (пероксидаза)
Протокол за работа:
Обложување на плочите со антиген
1. Стандардната ELISA плоча (со 96 бунарчиња) се обложува со LPS изолирани од
C. jejuni. Како позитивна контрола служат бунарчињата обложени со GM1, а
бунарчињата без GM1 и LPS служат како негативни контроли. Обложувањето се
изведува така што бунарчињата од секоја наредна колона се обложуваат со 100
μl/бунарче раствори на антигените (200 ng GM1, односно 5 µg LPS), а колоните измеѓу
се исполнуваат само со 100 μl/бунарче растворувач за антигените (негативни
контроли).
2. Плочата се покрива со адхезивна пластична фолија и се инкубира 2 часа на собна
температура или се остава да стои на 4 ОC преку ноќ.
3. Се отстранува остатокот од растворот за обложување и плочата се промива 2-пати
со полнење на бунарчињата со 200 μl/бунарче раствор за промивање. Реагенсите и
растворите за промивање се отстрануваат со превртување на плочата над чешмен
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
37
одвод. Капките кои преостануваат, се отстрануваат со тапкање на плочата на мека
хартија.
Блокирање на преостанатите протеин-врзувачки места од бунарчињата
4. Во сите бунарчиња се додава 200 μl/бунарче раствор за блокирање.
5. Плочата се покрива со адхезивна пластична фолија и инкубира 2 часа на собна
температура.
6. Плочата се промива 2-пати со полнење на бунарчињата со 200 μl/бунарче раствор
за промивање.
Додавање на примарното и секундарното антителото
7. Во секое од бунарчињата се аплицираат 100 µl од растворите на серумите во PBS0.1% BSA.
8. Плочата се покрива со адхезивна пластична фолија и инкубира 2 часа на собна
температура или на 4 oC преку ноќ.
9. Плочата се промива 4-пати со раствор за промивање.
10. Во секое од бунарчињата се додава 100 μl секундарно антитело конјугирано со
ензим, кое веднаш пред употреба е разредено до оптимална концентрација (според
инструкциите на производителот).
11. Плочата се покрива со адхезивна пластична фолија и инкубира 2 часа на собна
температура или на 4 oC преку ноќ.
12. Плочата се промива 4-пати со раствор за промивање.
Детекција
13. Се додава 100 μl (или 50 μl) од растворот на супстратот во секое бунарче. Во
бунарчињата со позитивна реакција, се очекува да се развие обојување по 20-30 минути
(жолто или портокалово, за pNPP или OPD соодветно).
14. Реакцијата се прекинува со додавање на 50 µl реагенс за стопирање.
15. Апсорбанцата се отчитува со микротитарен читач (на 405 nm или 450 nm, за
pNPP или OPD соодветно).
Интерпретација на резултатите
16. Оптичката густина (ОГ) која е изразена со вредноста на апсорбанцата на
примероците се однесува на секое поединечно бунарче. Резултатите се добиваат со
одземање на средната вредност на оптичката густина на бунарчињата без антиген од
средната вредност на оптичката густина на соодветните бунарчиња со антиген.
ОГ помала од 0.1 укажува на негативен примерок.
ОГ помала од 0.1 укажува на позитивен примерок.
Позитивните примероци повторно се испитуваат со ЕЛИСА со користење на двојни
сериски разредувања отпочнувајќи со 1:100.
Титарот на антитела се одредува како најголемото разредување на серумот со
оптичка густина поголема од 0.1 (корегирана за ОГ во бунарчињата без антиген)
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
38
Rezultati:
Interpretacija na rezultati:
data:
osvoeni bodovi:
asistent:
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
39
IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA
-Prakti~na nastava-
40
Download

IMUNOLOGIJA SO IMUNOHEMIJA