Mikroorganizmalar protista (tek hücreli hayvan
veya bitki) aleminin üyesidirler. Bakteriler,
mantarlar, protozoonlar ve helmintleri içerirler.
Protistalar prokaryot ve ökaryot olarak iki gruba
ayrılırlar.
Bakteriler prokaryotik hücre yapısına sahipken,
mantar ve protozoonlar (tek hücreli en küçük
hayvan organizmaları) ökaryotik yapıdadır.
Helmintler hayvanlar alemine dahildir.
Virüsler tamamen farklı bir gruptur. Bunlar hücre
değilse de sadece hücrelerin içinde çoğalırlar. Işık
mikroskobunda görülmezler. En küçük enfeksiyöz
partiküllerdir.
Ökaryotik hücre nükleusu, nükleer membran
aracılığı ile sitoplazmadan ayrılmıştır. Ökaryotik
hücre sitoplazmasında lizozom, ER, ribozom ve
golgi aygıtı bulunur.
Prokaryotların belirgin bir çekirdek yapıları ve
çekirdek membranı yoktur.
Tıbbi açıdan önemli mikroorganizmaların
karşılaştırılması
Özellikler
Virüsler
Bakteriler Mantarlar Protozo
onlar
Hücre
---
Var
Var
Var
Ortalama
ölçüler (nm)
0.02-0.2
1-5
3-10
15-20
protozoon
Nükleik asit
DNA veya
RNA
DNA+RNA
DNA+RNA
RNA+RNA
Çekirdek tipi
Yok
Prokaryotik
Ökaryotik
Ökaryotik
Ribozom
Yok
Var
Var
Var
Mitokondri
Yok
Yok
Var
Var
Hareket
Yok
Bazılarında
var
Yok
Pekçoğunda
var
Laboratuvara kültür/antibiyogram
için gelen başlıca numuneler
Boğaz
Kulak
Burun
Yara
İdrar
Gaita
Sonda
Vajen
Akıntı
Mantar
Mayi
Balgam
BOS
Swap testi
Boğaz kültürü
Eküvyonda gelen boğaz kültürleri, 1 adet koyun kanlı
petri plağına, tek koloni düşürme metodu ile ekilir.
37 °C’de 24-48 saat aerob etüvde inkübe edilir.
İdrar kültürü
Steril kapta gelen idrar hiç vakit kaybetmeden 2’li petri plağına
(koyun kanlı, EMB) veya 3’lü petriye (koyun kanlı, insan kanlı, EMB)
iç çapı 0,5 mm olan öze ile ekilir. Ekim yapılırken öze dik olarak
batırılır ve özenin bu konumda aldığı idrar 10 μl’dir. Bu işlem steril
pipet ucu ile 10 μl çekilerek de yapılabilir. 2’li petri aerob
ortamda, 24-48 saat inkübe edilir. Santrifüj işlemi yapılmamış
steril idrardan bir öze dolusu idrar örneği ile lam üzerinde
preparat hazırlanır. Kurutulur ve gram boyama yapılır.
Gelen örnekteki lökosit ve
eritrosit sayısı neubauer
lamında değerlendirilir veya
santrifüj işlemi sonrası
lökosit ve eritrosit sayısı
not edilir.
Gaita kültürü
Gelen örnek makroskobik ve mikroskobik yönden
değerlendirilir ve kültür defterine not edilir.
Salmonella ve shigella izolasyonu için numune bekletilmeden
koyun kanlı, EMB ve XLD besiyerine ekilir. Aerob koşullarda
37 °C’de, 24-48 saat inkübe edilir. 10 g kadar da GN Broth
(selenit) sıvı besiyeri tüpüne alınır. Üzerine hasta bilgileri
yazılarak aerob koşullarda 37 °C’de bekletilir. 6-8 saat
sonra bir başka XLD besiyerine tek koloni düşürmek
amacıyla ekim yapılır (pasaj). Diğer petrilerle beraber
değerlendirilir.
Gaita kültürü
Campylobacter spp izolasyonu için, özellikle
mikroskobisinde çok sayıda eritrosit görülen (beraberinde
lökosit görülen) numunelere, diğer işlemlere ilaveten
campylobacter besiyerine ekilir, etrafı parafilmle kapatılıp
% 10 CO2’li ortamda inkübe edilirler.
Vajen kültürü
Vajinal sürüntü örnekleri direk mikroskobi ile birlikte
değerlendirildikleri için iki ayrı eküvyon olmalıdır.
Materyal hiç vakit kaybetmeden 3’lü petriye ( koyun
kanlı, modifiye Thaer-Martin, EMB) ekilir.3’lü petri % 10
CO2’li ortamda 24-48 saat inkübe edilir. Aynı eküvyon
ile diamond besiyerine ekim yapılır ve 48-72 saat içinde
her gün üreme kontrolü yapılarak inkübe edilir.
Direk mikroskobi için gönderilen diğer eküvyon, 40’lık
objektif ile candida ve trichomonas
vaginalis, lökosit ve epitel, cluecell
yönünden incelenir. Ekimlerden sonra
gram ve giemsa ile boyalı preparatlar
hazırlanır.
Balgam kültürü
Gelen örnek ışık mikroskobunda x100 büyütmede incelenir.
Epitel sayısı bu büyütme alanında 10 adetten fazla, lökosit
sayısı 25 adetten az olan örnekler, tükürükle kontamine
olmuş kabul edilip reddedilir.
Materyalin en mukoid ve pürülan (iltihaplı görünümlü)
görülen kısmından öze ile alınarak 3’lü petri plağına (koyu
kanlı, çikolatamsı, EMB) ve bir adet saboraud besiyerine
ekilir. 3’lü petri % 10 CO2’li ortamda, saboraud besiyeri
ise aerobik ortamda 24-48 s inkübe
edilir. Mantar kültürü de istenen
örneklerde mantar kültürü
protokolu uygulanır.
Ekimlerden sonra gram ve
giemsa boyalı preparatlar hazırlanır.
Kateter ve sondalar
Kateter;
Damar içi kateter ve endotrakeal-trakeostomi tüpleri
içinden aspirasyon yapılmış kateterlerin hiç vakit
kaybetmeden 3’lü petriye (koyun kanlı, çikolatamsı,
EMB) ve 1 adet saboraud besiyerine ekimi yapılır.
Mantar kültürü de istenen örneklerde mantar kültürü
protokolu uygulanır. Aynı materyal 2 ml %0.9 NaCl ile
yıkanır. İşlem sonunda 10 μl alınarak, 3’lü petriye (koyun
kanlı, çikolatamsı, EMB) ve 1 adet saboraud besiyerine
ekimi yapılır. 3’lü petri % 10 CO2’li ortamda, saboraud
besiyeri ise aerobik ortamda 24-48 s inkübe edilir.
Ekimlerden sonra gram, giemsa ile boyalı preparatlar
hazırlanır.
Sondalar;
İdrar sondaları hiç vakit kaybetmeden 2’li petri plağına
(koyun kanlı, EMB) veya 3’lü petriye (koyun kanlı,
insan kanlı, EMB) ve 1 adet saboraud besiyerine ekilir.
Mantar kültürü de istenen örneklerde mantar kültürü
protokolu uygulanır. Aynı materyal 2 ml %0.9 NaCl ile
yıkanır. İşlem sonunda 10 μl alınarak, 2’li petriye (koyun
kanlı, EMB) ve 1 adet saboraud besiyerine ekimi yapılır. 2’li
petri % 10 CO2’li ortamda, saboraud besiyeri ise aerobik
ortamda 24-48 s inkübe edilir.
Hastanın aynı gün idrar örneğinin gelip gelmediği araştırılıp
gelmemiş ise idrar kültürü için steril idrar örneği istenir.
Ekimlerden sonra gram, giemsa ile boyalı preparatlar
hazırlanır.
Eküvyonda gelen yara, abse ve pü kültürleri
Gelen eküvyon 3’lü petri plağına (koyun kanlı, çikolatamsı,
EMB) ve bir adet saboraud besiyerine ekilir. 3’lü petri
% 10 CO2’li ortamda, saboraud besiyeri ise aerobik
ortamda 24-48 s inkübe edilir. Mantar kültürü de
istenen örneklerde mantar kültürü protokolu uygulanır.
Ekimlerden sonra gram, giemsa ve metilen mavisi ile
boyalı preparatlar hazırlanır.
BOS kültürü
Gelen örnek makroskobik olarak değerlendirilir. Kanlı,
pürülan vs. olup olmadığı not edilir.
Bekletilmeden 3’lü petri plağına (koyun kanlı,
çikolatamsı, EMB) ve bir adet saboraud besiyerine
ekilir. 3’lü petri % 10 CO2’li ortamda, saboraud besiyeri
ise aerobik ortamda 24-48 s inkübe edilir.
Zenginleştirme besiyeri olarak kan kültürü besiyeri
kullanılabilir. Pediatrik kan kültürü şişesine 1-3 ml
aktarılır ve kan kültür cihazına yerleştirilir.
Ekimlerden sonra gram, giemsa ve metilen mavisi ile
boyalı preparatlar hazırlanır.
BOS kültürü
Gelen örneğin neubauer veya thoma sayım kamaralarında,
lökosit ve eritrosit sayımları yapılır. Kalan BOS örneği
steril şartlarda 3000 rpmde 5 dk santrifüj edilir. Eğer tek
tüp numune geldiyse süpernatan biyokimyasal çalışmalar
için kullanılır. Sedimentten gram, giemsa ve metilen mavisi
ile boyalı preparatlar yeniden hazırlanır.
Bir miktar BOS sterilitesini korunarak 2-8 °C’de saklanır.
Kan kültürü
Kan kültürü şişelerinin üzerinde cihazın okuduğu barkod,
numunenin alındığı gün, saat yazılmış mı diye kontrol edilir.
Numuneler Bactec 9050 cihazına yüklenir.
Aerob, Anaerob, Ped’s Plus vesiyeri içine alınan örnekler 7
günlük inkübasyonlarının ardından cihazdan manuele uygun
çıkartılırlar. Bu şişeler negatif numune olarak kabul edilir
ve gram boyalı preparatları hazırlanır. Boya
değerlendirmesinde mikrooranizma görülür ise gerekli
sayıda 3’lü petri plağına (koyun kanlı, çikolatamsı, EMB)
ekilir.
Kan kültürü
İnkübasyonları sırasında, pozitif alarm veren şişeler,
cihazdan manuele uygun çıkartılırlar. Materyal hiç vakit
kaybetmeden
Aerob ve Ped’s Plus şişe ise 3’lü petri plağına (koyun
kanlı, çikolatamsı, EMB) ekilir, % 10 CO2’li ortamda 48 s
inkübe edilir.
Eğer Anaerob şişe ise 2 adet 3’lü petri plağına (koyun
kanlı, çikolatamsı, EMB) ekilir. Petrilerden biri aerob
koşullarda inkübe edilirken diğeri anaerobik jara
kaldırılır, 48 s inkübe edilir.
Bir lam üzerinde gram boyalı preparatlar hazırlanır.
Herhangi bir ortamda bulunan bütün canlı
organizmaların öldürülmesi veya uzaklaştırılması olarak
tanımlanır. Mikrobiyoloji için çok önemlidir. Çünkü
mikrobiyolojideki deneyler saf kültürle gerçekleştirilir.
Steril şartlar yerine getirilmemişse, istenmeyen
mikroorganizmalar (kontaminantlar) gelişecek ve elde
edilen sonucun hangisine ait olduğu anlaşılamayacaktır.
Sterilizasyon tüpleri:
 sıcaklık kullanılarak (direk alevle, kuru sıcaklıkta, nemli
sıcaklıkta)
 kimyasal
 radyasyonla
 filtrasyonla
Sıcaklıkla sterilizasyon
Direk alevle sterilizasyon: Alevle direkt olarak
yakma ile yapılan en basit sterilizasyon tipidir.
Öze ve cam malzemelerin açık ağızları gibi
sıcaklıktan etkilenmeyen malzemeler bu
yöntemle sterilize edilirler.
Kuru sıcaklıkla sterilizasyon: Sıcak hava
fırınlarında yapılan sterilizasyondur. Genelde 175
°C’de 1 saat şeklinde yapılır. Petri kutusu, erlen,
beher, mezür gibi boş cam malzemeler için
kullanılır.
Nemli sıcaklıkla sterilizasyon: En çok
kullanılan yöntemdir. Sıcaklığı 100 °C’nin üzerine
çıkarılmayan sıvıların basınç yardımıyla 121
°C’de 15 dk şeklinde, otoklavlar yardımıyla
sağlanır. Besiyerleri için kullanılır.
Kimyasal sterilizasyon
Isıya duyarlı katı malzemelerin sterilizasyonu
kimyasal maddelerle yapılır. En yaygın olanı
etilenoksittir, bu madde protein ve nükleik
asitleri inaktive eder ve mikroorganizmaları
öldürür. Plastik petri, şırınga gibi malzemeler için
kullanılır.
Radyasyonla sterilizasyon
Isıya duyarlı katı malzemelerin sterilizasyonu için
Bazen kimyasal str. yerine bu yöntem kullanılır.
Genelde radyoaktif kobalt-60 veya sezyum139’dan elde edilen gama radyasyonu uygulanır.
Gama radyasyonu hücredeki su
moleküllerine etki ederek serbest radikal
oluşuma neden olur. Oluşan bu serbest
radikaller, oldukça reaktiftirler ve başta
enzim ve nükleik asitler olmak üzere
hücredeki birçok molekülün bozulmasına
neden olur. Plastik maddeler bu yolla sterilize
edilebilirler.
Filtrasyonla sterilizasyon
Vitamin ve antibiyotik gibi ısıya duyarlı
maddelerin ve gazların sterilizasyonu için
kullanılır. Günümüzde çoğunlukla membran
filtreler kullanılır. Bu filtreler değişik delik
çaplarına sahiplerdir. Bakteriler için genelde 0,45
μm delik çapına sahip olan filtreler kullanılır.
Sterilize edilecek sıvı, enjektör yardımıyla
filtreden geçirilir. Bu esnada sıvıda bulunan
mikroorganizmalar filtreden geçemezler ve
yüzeyde kalırlar, sıvı steril elde edilmiş olur.
Mikroorganizmaları üretmek için kullanılan besin
karışımına besiyeri denir. Üretmek istenilen
mikroorganizmaya göre değişik şekillerde hazırlanır.
Besiyeri kabaca katı, yarıkatı ve sıvı şeklinde
gruplandırılır. Katı besiyerinde % 1,5-2, yarıkatı
besiyerinde % 0,75 oranında agar vardır. Tek koloni
elde etmek için kullanılır. Sıvı besiyerinde agar
bulunmaz, homojen üretimde kullanılır.
‘Genel besiyeri’ birçok mikroorganizmanın
gelişimine uygundur. Mikroorganizmaların
genel üretimi ve saklanması için
hazırlanır.
‘Ayırıcı besiyeri’, istenen
mikroorganizmayı geliştiren diğerlerini
yok eden besiyeridir. Ayırıcı besiyeri,
antibiyotik, boyalar veya tuz ilavesiyle
seçici hale gelir. Örneğin, nutrient agar
(NA), yüksek tuzlu agar (YTA) ve mannitol
tuz agar (MTA).
NA, genel amaçlı, seçici ve ayırıcı
olmayan bir besiyeridir ve en yaygın
olarak kullanılanıdır.
Yüksek tuzlu agar (YTA), % 7,5 oranında NaCl içerir
ve birçok mikroorganizma bu tuz konsantrasyonunda
gelişmezken sadece Staphylococcus cinsi gelişme
gösterir. Bu nedenle seçici besiyeri olarak
tanımlanır.
Mannitol tuzlu agar (MTA), hem ayırıcı hem de
seçicidir. % 7,5 oranında NaCl içerir, bu yüzden
seçicidir. Fenol ve mannitol içerdiğinden de
ayırıcıdır. Bakteri ancak tuza toleransı varsa
gelişebilir. Gelişebilenlerden bazıları, mannitolu
fermente ederse kolonilerin etrafındaki pH düşer ve
fenolün rengi pembeden sarıya döner.
Staphylococ aureus gibi pek çok patojen safilokok
mannitolu fermente ederlerken, patojen olmayan ve
insan derisinde bulunan s.epidermidis mannitolu
fermente etmez. Bu şekilde stafilokoklar ayrılmış
olur.
Besiyerinde bulunması gereken maddeler:
su
karbon kaynağı
enerji kaynağı
azot kaynağı
mineral maddeler
gelişme faktörleri
hidrojen iyonu konsantrasyonu
boya madeleri
antibiyotikler
agar
Besiyerlerinin hazırlanması
Nutrient agar besiyeri
Genel kullanım amaçlı bir besiyeri olup kan veya
diğer biyolojik sıvılar eklenerek zenginleştirilir.
Lab-Lamb powder
Yeast extract
Peptone
Sodium chloride
Agar
1 gr
2 gr
5 gr
5 gr
15gr
28 gr besiyeri 1000 ml distile suda çözülür. Kaynatarak
tamamen çözünmesi sağlanır. 121 °C’de 15 dk sterilize edilir
Staphylococcus aureus: iyi gelişir, saman renkli/beyaz koloni
Escherichia coli: iyi gelişir, saman renkli koloni
S. aureus
Kanlı agarda s. aureus
S. aureus mannitol tuzlu agarda
Staphyococcus antibiyogramı
E.coli
E.coli EMB de
E.coli on blood plate
E. coli antibiyogramı
Download

Mikrobiyoloji I