ELISA-VIDITEST anti-VZV IgG (CSF) a avidita IgG
OD-233
Návod k použití soupravy
VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: +420 261 090 565,
www.vidia.cz
1. NÁZEV SOUPRAVY:
ELISA-VIDITEST anti-VZV IgG (CSF) a avidita IgG - ELISA souprava pro detekci protilátek třídy IgG
proti viru varicella zoster (VZV) v séru (plazmě), stanovení jejich avidity a pro stanovení intrathekální
syntézy.
2. POUŽITÍ:
Souprava je určena pro diagnostiku chorob vyvolaných nebo spojených s VZV, např. planých neštovic a
pásového oparu, včetně infekcí provázených neurologickými komplikacemi (encefalitis, meningitis,
cerebellitis, vaskulitis, myelitis a zánětlivé neuropatie). Soupravu lze též využít pro diferenciální diagnostiku
neuroinfekcí, očních infekcí a kožních exanthematických onemocnění.
Souprava lze také použít pro rozlišení primární a rekurentní infekce VZV. Po primární infekci vytváří
organismus převážně IgG protilátky s nízkou aviditou (vazebnou schopností) k virovým antigenům. Později
začnou, v důsledku selekce antigenem, převládat protilátky s vysokou aviditou. Převaha nízkoavidních IgG
protilátek (nízký relativní index avidity RAI) tedy svědčí o recentní primární infekci, kdežto jedinci
s převahou vysokoavidních protilátek prodělali primární infekci v minulosti, a mají-li v současné době
známky aktivní infekce VZV, jedná se u nich o reaktivaci infekce.
3. PRINCIP TESTU:
ELISA-VIDITEST anti-VZV IgG (CSF) a avidita IgG je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch
jamek je navázán nativní antigen VZV. Každé sérum je aplikováno paralelně na dvě jamky (popřípadě na
čtyři jamky z důvodu vyloučení laboratorní chyby), přičemž příslušné protilátky se navážou na
imobilizované antigeny. V dalším kroku je pak jedna jamka inkubována s promývacím roztokem, druhá
jamka s roztokem močoviny. V první jamce zůstávají na antigen navázány specifické protilátky s vysokou i
nízkou aviditou. V druhé jamce dochází vlivem koncentrovaného roztoku močoviny k uvolnění
nízkoavidních protilátek a v komplexu s antigenem zůstávají jen protilátky s vysokou aviditou. Po promytí
jsou navázané protilátky rozpoznávány zvířecími protilátkami proti lidskému IgG značenými křenovou
peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí.
Přítomnost nízkoavidních protilátek se projeví výrazným snížením absorbance po působení roztoku
močoviny. Poměr mezi optickou denzitou jamky s roztokem močoviny a jamky s promývacím roztokem
v procentech vyjadřuje relativní index avidity (RAI).
4. OBSAH SOUPRAVY:
ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku potažené antigenem STRIPS Ag
1,3 mL pozitivního kontrolního séra s vysokou aviditou protilátek (vysokoavidní
kontrolní sérum), r.t.u.1) CONTROL HIGH AVID
1,3 mL pozitivního kontrolního séra s nízkou aviditou protilátek, (nízkoavidní
kontrolní sérum), r.t.u. CONTROL LOW AVID
1,3 mL Standardu A=negativního kontrolního séra, r.t.u. ST A/CTRL1,3 mL Standardu D=Standard 1 (kalibrátor), r.t.u. ST D/ST 1
1,3 mL Standardu E=Stamdard 2 (pozitivní kontrolní sérum), r.t.u. ST E/ST 2
1
1 x 12 ks
1 lahvička
1 lahvička
1 lahvička
1 lahvička
1 lahvička
13 mL protilátek proti lidskému IgG značených peroxidázou
(konjugát anti-IgG Px) r.t.u. CONJ
125 mL promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x
100 mL ředicího roztoku r.t.u. DIL
13 mL roztoku močoviny r.t.u. UREA
13 mL chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB
13 mL stop roztoku r.t.u.
STOP
Sáček se zipem
Návod k použití soupravy
Certifikát kontroly kvality
1)
r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci)
1 lahvička
1 lahvička
1 lahvička
1 lahvička
1 lahvička
1 lahvička
5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU:
Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro
rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr pro měření absorbance mikrotitrační
destičky při 450nm / 620-690 nm referenčním filtrem (není podmínkou).
6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ:
a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu.
b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér a kontrolní séra. Testovaná
séra řeďte ředicím roztokem 101x (např. 5 μL séra + 500 μL ředicího roztoku). Kontrolní séra
(standardy) neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use).
c. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu
destilované/deionizované vody (např. 100 ml promývacího roztoku + 900 ml H2O). Pokud jsou
v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni při +32 až +37oC a před naředěním
dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při
teplotě +2 až +10oC.
d. Konjugát anti-IgG Px, roztok močoviny, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou
v pracovní koncentraci (r.t.u.).
7. PRACOVNÍ POSTUP PRO STANOVENÍ AVIDITY IgG PROTILÁTEK:
a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby
nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně
s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte.
b. Naplňte jamky dvou sousedních stripů v duplikátech po 100 μL kontrolními séry a ředěnými testovanými
séry následujícím způsobem (viz Tab. 1): První jamky stripů č. 1 a 2 naplňte samotným ředicím roztokem DIL
pro stanovení pozadí reakce. Další řádek stripů 1 a 2 naplňte vysokoavidním kontrolním sérem CONTROL
HIGH AVID a třetí řádek naplňte duplikátem nízkoavidního kontrolního séra CONTROL LOW AVID.
Pokud chcete určit pozitivitu či negativitu testovaných sér na VZV IgG, nakapejte v jednom duplikátu také
Standard 1 ST D/ST 1. Zbývající jamky naplňte v duplikátech ředěnými testovanými séry (S1, S2, S3, …).
Každé sérum stačí aplikovat v jednom duplikátu jamek. Chcete-li vyloučit laboratorní chybu, aplikujte séra na
dvě jamky příslušného stripu. Inkubujte 60 minut (± 5 min.) při laboratorní teplotě.
c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní
předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 μL promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek.
Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty.
d. Napipetujte nejprve 100 μL promývacího roztoku WASH 1x (v pracovní koncentraci) do každé jamky
sudých stripů (tj. strip 2, 4, 6, 8, 10 a 12), a potom 100 μL roztoku močoviny r.t.u. UREA do každé jamky
lichých stripů (tj. strip 1, 3, 5, 7, 9 a 11). Inkubujte 10 minut (± 5 sec.) při laboratorní teplotě.
e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 μL promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte.
2
f. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-IgG Px r.t.u. CONJ a napipetujte do jamek po 100 μL
konjugátu anti-IgG Px r.t.u.. Inkubujte 60 minut (± 5 min.) při laboratorní teplotě.
g. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 μL promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte.
h. Napipetujte do všech jamek po 100 μL chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut
(± 30 sec.) při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky.
Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném
rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce
uložte na temné místo.
i. Zastavte reakci přidáním 100 μL stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování
chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu.
Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte.
j. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 10 minut po
zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm.
Tab. 1 Schéma aplikace vzorků pro stanovení avidity IgG protilátek:
Strip č.
A
B
C
D
E
F
G
H
UREA
1
DIL
CONTROL
HIGH AVID
CONTROL
LOW AVID
ST D/ST 1
S1
S2
S3
S4
WASH
2
DIL
CONTROL
HIGH AVID
CONTROL
LOW AVID
ST D/ST 1
S1
S2
S3
S4
UREA
3
S5
WASH atd.
4
5
S5
6
7
8
9
10
11
12
atd.
8. PRACOVNÍ POSTUP PRO STANOVENÍ HLADINY IgG PROTILÁTEK
a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby
nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně
s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte.
b. Naplňte příslušné jamky po 100 μL kontrolních sér a ředěných testovaných sér podle následujícího
schématu (viz Tab. 2): první jamku naplňte samotným ředicím roztokem pro stanovení pozadí reakce
DIL. Další dvě jamky naplňte Standardem 1 ST D/ST 1, které slouží jako kalibrátor. Další jamku naplňte
negativním kontrolním sérem ST A/CTRL-. Pro kontrolu je vhodné aplikovat také pozitivní kontrolní
sérum ST E/ST 2. Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými séry (S1…). Každé sérum stačí
aplikovat na jednu jamku (S1, S2, S3,…). Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte
ST D/ST 1 na tři jamky a vyšetřovaná séra aplikujte po dvou jamkách.
Inkubujte 60 minut (± 5 min.) při laboratorní teplotě.
c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz
Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 μL promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání
roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty.
d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-IgG Px r.t.u. CONJ a napipetujte do jamek po 100 μL
konjugátu anti-IgG Px r.t.u.. Inkubujte 60 minut (± 5 min.) při laboratorní teplotě.
e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 μL promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte.
f. Napipetujte do jamek po 100 μL chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut
(± 30 sec.) při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky.
Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném
rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po
dobu reakce uložte na temné místo.
3
g. Zastavte reakci přidáním 100 μL stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování
chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou
dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je
odstraňte.
h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 10 minut po
zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm.
Tab. 2: Schéma aplikace vzorků pro stanovení hladiny IgG protilátek:
1
2
a
DIL
b
ST D/ST 1
c
ST D/ST 1
d
ST A/CTRL-
e
S1
f
S2
g
S3
h
S…
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
9. HODNOCENÍ TESTU STANOVENÍ AVIDITY IgG PROTILÁTEK:
9.1. Nejdříve odečtěte absorbance jamek se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodnot
absorbancí kontrolních a testovaných sér, vždy podle toho zda jde o strip po aplikaci močoviny nebo
promývacího roztoku (hodnota pozadí reakce se může lišit).
Upozornění: Hodnocení avidity protilátek lze provádět pouze u pozitivních sér anti-VZV IgG. Pokud je
testované sérum anti-VZV IgG negativní nebo hraniční, nelze u něj relativní index avidity hodnotit.
Pro posouzení pozitivity séra stačí využít orientačního hodnocení dle postupu vit kap. 10.1. - kvalitativní
orientační hodnocení.
9.2. Pokud používáte dva duplikáty, spočítejte průměrné hodnoty OD kontrolních sér z jamek na stejném
stripu. Spočítejte v procentech relativní index avidity RAI tj. poměr mezi optickou denzitou jamek
s roztokem močoviny r.t.u. (liché stripy) a jamek s promývacím roztokem (sudé stripy). Obě kontrolní séra
CONTROL HIGH AVID, CONTROL LOW AVID slouží jako vnitřní kontrola pro provedení testu a musí
být proto zařazena v každém prováděném testu.
9.3. Stanovte u kontrolních a testovaných sér hodnotu relativního indexu avidity RAI v procentech tak, že
hodnotu OD séra s roztokem močoviny vynásobíte číslem 100 a vydělíte hodnotou OD séra s promývacím
roztokem:
OD séra s roztokem močoviny x 100 =
OD séra s promývacím roztokem
relativní index avidity RAI v %
HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ:
Hodnota RAI v %
< 40 %
40 % - 60 %
> 60 %
Vyhodnocení
indikace protilátek s nízkou aviditou
nerozhodná oblast
indikace protilátek s vysokou aviditou
Příklad: Získaná OD kontrolního séra s roztokem močoviny
= 1,306
Získaná OD kontrolního séra s promývacím roztokem = 1,399
Výpočet RAI v %
= (1,306 x 100) / 1,399 = 93%
4
10. HODNOCENÍ TESTU STANOVENÍ HLADINY IgG PROTILÁTEK:
Kvalitativní a semikvantitativní hodnocení lze využít pouze pro stanovení protilátek v séru. Pokud chcete
stanovit intrathekální syntézu protilátek v mozkomíšním moku, využijte kvantitativní stanovení pomocí
programu VIDISOFT a postup uvedený v příloze k návodu.
Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodnot
kontrolních a testovaných sér.
10.1. Kvalitativní orientační hodnocení
1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD Standardu 1 ST D/ST 1. Pokud jste aplikovali Standard 1 na tři
jamky, a některá z těchto tří hodnot se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a
spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot.
2. Stanovte cut-off hodnotu. Cut-off hodnotu stanovíte tak, že průměrnou hodnotu OD Standardu 1
ST D/ST 1 vynásobíte korekčním faktorem. Korekční faktor Standardu 1 uveden v Certifikátu
kontroly kvality pro danou šarži soupravy.
3. Séra s hodnotou OD < 90% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cut-off jsou považována
za pozitivní.
10.2. Semikvantitativní hodnocení
Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér:
1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (kap. 10.1., bod 2).
2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cut-off hodnotou.
3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra.
HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ:
Hodnota indexu
< 0,90
0,90 - 1,10
1,11 - 2,50
2,51 - 5,00
5,01 - 8,00
> 8,00
Vyhodnocení
Negativní
+/+
++
+++
++++
Příklad: Získaná OD Standardu 1
Průměrná hodnota OD
Korekční faktor Standardu 1
Cut-off hodnota
OD vzorku séra
Hodnota indexu
= 1,849; 1,895
= 1,872
= 0,17
= 1,872 x 0,17 = 0,318
= 0,800
= 0,800 / 0,318 = 2,52
Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte.
Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou
nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později.
11. PLATNOST, SPECIFITA A CITLIVOST TESTU:
11.1. Platnost testu
Hodnota RAI pozitivního kontrolního séra obsahujícího protilátky s vysokou aviditou CONTROL HIGH
AVID by měla být > 60 %.
Hodnota RAI pozitivního kontrolního séra obsahujícího protilátky s nízkou aviditou CONTROL LOW
AVID by měla být < 40 %.
Hodnota absorbance samotného ředicího roztoku (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,100.
Průměrná hodnota absorbance ST D/ST 1 by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality
dané šarže.
5
Hodnoty absorbancí kontrolních sér by měly být:
ST A/CTRL- < ST D/ST 1 < ST E/ST 2
11.2. Přesnost a opakovatelnost testu
Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy (interassay) a během testu (intraassay) bylo provedeno
srovnání vzorků s různými hodnotami RAI.
Příklad vyšetření několika pozitivních sér obsahujících protilátky s vysokou aviditou (n = 8):
Rozsah RAI:
63% - 100%
Příklad vyšetření několika pozitivních sér obsahujících protilátky s nízkou aviditou (n = 8):
Rozsah RAI:
17% - 35%
11.2.1 Opakovatelnost (intraassay)
Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně
na 12 paralelních jamkách téže destičky.
Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce)
n
A
±σ
CV opak.
16
1,335 0,050
3,8 %
16
0,614 0,023
3,7 %
Příklady intraassay variability pro různé hodnoty RAI v % (n = počet paralelních jamek na téže
destičce):
n
RAI v %
±σ
% průměru
16
76
2%
2,6 %
16
61
4%
6,6 %
16
43
2%
4,7 %
11.2.2 Reprodukovatelnost (interassay)
Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek
téhož séra v několika po sobě jdoucích testech.
Příklad:
(n = počet testů určitého vzorku)
n
A
±σ
min – max
18
1,369 0,064 1,223-1,476
18
0,463 0,060 0,337-0,569
CV repro
4,7%
12,9%
Příklad interassay variability pro různé hodnoty RAI v % (n = 8, n = počet testů určitého vzorku):
Průměrná RAI v %: 34 ± 4,8% tj. min – max 24 – 41%
Průměrná RAI v %: 87 ± 5,8% tj. min – max 77 – 95%
11.2.3 Recovery test
Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty.
11.3. Diagnostická citlivost a specifita testu
Stanovení diagnostické citlivosti a specifity testu bylo provedeno v rámci studie diagnostické účinnosti
soupravy.
panel sér
celkem
pozitivní hraniční negativní hodnocení
pozitivní
134
127
3
4 citlivost: 96,9%
negativní
90
3
2
85 specifita: 96,6%
6
Příklad stanovení RAI v % u nízkoavidních a vysokoavidních sér:
Panel sér
Počet sér
Průměr RAI
Rozpětí
Nízkoavidní
12
25,7%
15,5- 40%
Vysokoavidní
24
81,7%
65,8- 94,2%
11.4. Recovery test
Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty.
11.5. Interference
Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/mL pro
hemoglobin, 5 mg/mL pro bilirubin a 50 mg/mL pro triglyceridy.
12. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY:
Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely.
Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-HIV-1,2.
Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1
hodinu při 121 °C nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Tekutý odpad rovněž
dekontaminujte v 3% chloraminu nebo jiném vhodném desinfekčním prostředku.
Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem
hydrogenuhličitanu sodného.
Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte
postižené místo větším množstvím tekoucí vody.
Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku
(např. Incidur, Incidin, chloramin, ...) v koncentraci doporučené výrobcem.
Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte
ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě
aerosolu.
13. UPOZORNĚNÍ:
a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku.
b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u. a ředicí roztok r.t.u. pro
séra jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST, pokud není v návodu
k použití soupravy uvedeno jinak.
c. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií.
d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či
kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu.
e. Kontrolní séra (standardy), ředicí roztok, chromogensubstrátový roztok TMB a konjugát anti-IgG Px jsou
konzervovány ProClinem 300.
f.
Chromogensubstrátový roztok TMB nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy.
g. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména:
*
*
*
*
nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím
nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7.
špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem
použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů
7
14. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE:
a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10°C. Za těchto podmínek je
expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých
složek je uvedena na jejich obalu.
b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte, nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s
desikantem.
c. Soupravy se přepravují v termotaškách s ledem, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv.
Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte
výrobce.
d. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při
teplotě -18 až -28°C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě
+2 až +10°C, pak je spotřebujte do jednoho týdne.
e. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé.
Doporučená literatura:
Provost PJ, Krah DL, Kuter BJ, Morton DH et al. Antibody assays suitable for assesing immune response to
live varicella vaccine. Vaccine 1991; 9: 111
Wasmuth EH, Miller WJ. Sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for antibody to varicella zoster
virus using purified VZV glycoprotein antigen. J med Virol 1990; 32: 189-93.
Leung J, Harpaz R, Baughman AL, Heath K et al. Evaluation of laboratory methods for diagnosis of
varicella. Clin Infect Dis 2010; 51: 23-32.
Landry ML, Cohen SD, Mayo DR, Fong,CKY et al. Comparison of fluorescent antibody to membrane
antigen test, indirect immunofluorescence assay and commercial enzyme linked immunoassay for
determination of antibody to varicella zoster virus. J Clin Microbiol 1987; 25: 832-835.
Gershon AA, Steinberg SP. Antibody response to varicella zoster and the role of antibody in host defense.
Amer J Med Sci 1981;282: 12-17
8
15. TESTOVACÍ SCHÉMA STANOVENÍ AVIDITY IgG PROTILÁTEK:
Pozn.: Pokud provádíte test pouze pro stanovení pozitivity IgG protilátek a nikoliv stanovení avidity IgG
protilátek, vynechejte Krok 3.
Krok 1.
Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění
↓
Krok 2.
Aplikujte kontrolní a testovaná séra v duplikátech (100 μL / jamku)
↓
Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě
↓
4x promyjte (250 μL / jamku), vyklepněte
↓
Krok 3.
Aplikujte promývací roztok do sudých stripů (2, 4, 6, 8, …) (100 μL / jamku)
↓
Aplikujte močovinu r.t.u. do lichých stripů (1, 3, 5, 7, …) (100 μL / jamku)
↓
Inkubujte 10 minut (± 5 sec.) při laboratorní teplotě
↓
4x promyjte (250 μL / jamku), vyklepněte
↓
Krok 4.
Aplikujte konjugát anti-IgG Px r.t.u. (100 μL / jamku)
↓
Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě
↓
4x promyjte (250 μL / jamku), vyklepněte
↓
Krok 5.
Aplikujte chromogensubstrátový roztok TMB (100 μL / jamku)
↓
Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě
↓
Krok 6.
Aplikujte stop roztok (100 μL / jamku)
Krok 7.
↓
Změřte absorbanci při 450 / 620-690 nm do 10 minut
Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím
Ministerstva průmyslu a obchodu ČR.
Datum poslední verze tohoto návodu: 06/2014
9
10
Download

ELISA-VIDITEST anti-VZV IgG (CSF) a avidita IgG