Iveta Valášková
Jitka Kadlecová
Oddělení lékařské diagnostiky FN Brno
Sekvence DNA se liší mezi jednotlivci.
Přítomnost několika alel v určitém místě je nazývaná polymorfismus.
Jinak můžeme polymorfismus vyjádřit jako místo v sekvenci DNA,
v němž jsou jedinci rozdílní.
•rozdíly v jednom nukleotidu v určitém místě
•vyskytuje se asi jedenkrát na 1000 párů bazí.
•celý lidský genom obsahuje více než 1,5 milionu SNPs
•vyskytují se v intronech, v extragenových oblastech
•jen asi 50 000 SNP v kódujících sekvencích genů.
•Jedna třída polymorfizmů je způsobena tandemovou inzercí
několika kopií sekvence DNA o délce 10 až 100 párů bází,
•Variabilní počet tandemových repetic je charakterizována větším počtem alel,
které se liší podle toho, kolik kopií minisatelitu je přítomno.
•Délka základní repetície je větší než 6 bp a počet opakovaní repetície 10 –100.
•Vyskytují se preferenčně v telomerických oblastech.
•Odhadovaný počet je cca 104.
•Jejich využití je velmi omezené.
Hypervariabilní - 9–24 bp, hlavně v centromrických oblastech
Telomerické - 6 bp dlouhé(TTAGGG)n, několik 1000 repeatů na telomerách
€
€
€
€
€
€
€
€
€
Specificky opakující se sekvence DNA
délka základní repetice 2 – 6 bp
počet opakování repetice 2 – 100 bp
Délka těchto sekvencí je tedy vysoce variabilní, což je pro diagnostiku
velmi výhodné.
Rozptýlené rovnoměrně v lidské genomu
Vyskytují se běžně v populaci
Nejsou přepisovány do proteinu
leží v intronech
Nejsou příčinou choroby
Tvoří vzorce bez vztahu s fenotypem
Mezi jednotlivci se velmi liší
Odlišují jednoho člověka od druhého
‰
‰
‰
‰
‰
‰
Nepřímá diagnostika monogenních chorob
Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce
(QF-PCR) diagnostika nejčastějších aneuploidií
Identifikace osob/vzorků DNA (A. Jeffreys 1985)
(lidé obvinění z kriminálních činů, oběti katastrof)
Určování příbuznosti
Genealogické studie DNA
Hledání nových genů (poziční klonování genů)
Analýza mikrosatelitů
Analýza mikrosatelitů
gelová elektroforéza
kapilární elektroforéza
Analýza mikrosatelitů
€
€
Metoda PCR amplifikuje STR oblasti a vytváří fluorescenčně
značené amplikony za pomocí lokus specifických primerů
Vzniklé PCR produkty jsou separovány a analyzovány pomocí
automatického genetického analyzátoru.
Analýza mikrosatelitů
STR se liší mezi jedinci velikostí,
podle toho, kolikrát se opakují
trojice, čtveřice nebo pětice
nukleotidů.
Relativní množství každé STR alely
je kvantifikováno pomocí
výpočtu poměru obsahu píků,
příp. jejich výšek.
•Stutter píky jsou detekovány jako
samostatné píky, které jsou o jednu nebo několik repetic menší, než
aktuální STR alela. Typický stutter pík má obsah menší, než 15% vůči
příslušnému STR píku.
.
•-A píky (obr. 8.9) jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o
jeden pár bazí kratší, než PCR produkt s plnou délkou (+A pík)
+A
-A
Nepřímá diagnostika
užitím vazebních markerů v rodiných studiích
odhalí chromozom v asociaci s nemocí v rodině
Nepřímá diagnostika
GTATCACACACATTCGG
od otce
od matky
chr.n
alela A1:
------ GTATCACATTCGG----
alela A2:
-----GTATCACACACATTCGG---
délka alely m bp
délka alely m+4 bp
Nepřímá diagnostika
chr.n
[mt]+[=]
[A1]+[ A3]
chr.n
chr.n
[?]+[=]
[A1]+[A2]
[mt]+[?]
chr.n
[=]+[=]
[A1]+[A2]
[A1]+[A3]
informativní
Nepřímá diagnostika
chr.n
[mt]+[=]
[A1]+[A3]
chr.n
chr.n
[?]+[=]
[A1]+[A1]
[mt]+[?]
chr.n
[=]+[=]
[A1]+[A1]
[A1]+[A3]
neinformativní
Nepřímá diagnostika
Neurofibromatóza typu 1
Autozomálně dominantní dědičbńost
131 131
179 179
135 131
187 179
135 131
181 179
131 131
179 179
135 131
181 179
neznámá mutace
131 135
179 179
135 131
181 179
135 135
181 185
haplotyp v asociaci s neznámou mutací
Polymorfní systémy
GXAlu / i27b
IVS38GT /i38
Nepřímá diagnostika
Cystická fibróza
Autozomálně recesivní dědičnost
AB
3 1
AC
2 2
AA
6 6
AC
3 5
AC
3 5
CA
5 6
CA
5 6
AC
3 2
F508del
neznámá mutace
AB
3 1
AA
2 3
BA
1 3
AD
3 2
AA
3 2
AD
2 2
AD
2 2
AD
2 2
Polymorfní systémy IVS17BTA alely 1 -6
IVS8BTA alely A - D
haplotyp v asociaci s neznámou mutací
AA
2 2
Nepřímá diagnostika
Cystická fibróza
Lokalizace extra a intragenních polymorfních míst genu CFTR
XV-2C
KM19
TaqI
PsrI
IVS6A IVS8
J44
(GATTI)n
Xba1
kb 0
CFTR
50
(CA)
100
T854T
IVS17b
TUB20
AvaII
(CA)n
PrsII
150
200
230
Nepřímá diagnostika
Cystická fibróza
BA
1 3
AA
3 2
AD
2 2
K určení patologického haplotypu slouží
genotyp zdravé sestry zemřelého probanda
AC
3 2
F508del
neznámá mutace
AD
2 2
AD
2 2
Polymorfní systémy IVS17BTA alely 1 -6
IVS8BTA alely A - D
haplotyp v asociaci s neznámou mutací
AA
2 2
Nepřímá diagnostika
Cystická fibróza
AB
3 1
AC
2 2
AA
6 6
AC
3 5
AC
3 5
CA
5 6
CA
5 6
AC
3 2
F508del
neznámá mutace
AB
3 1
BA
1 3
AA
2 3
AA
3 2
AD
2 2
AD
2 2
AD
2 2
Polymorfní systémy IVS17BTA alely 1 -6
IVS8BTA alely A - D
haplotyp v asociaci s neznámou mutací
AA
2 2
Nepřímá diagnostika
Cystická fibróza
[F508]+[=]
[=]+[=]
[A1]+[A3]
[A2]+[A5]
[F508]+[=]
[A1]+[A2]
[=]+[=]
[A3]+[A5]
[F508]+[G542X]
[A1]+[A1]
Nepřímá diagnostika
Duchennova svalová dystrofie
X vázaná dědičnost
243,251
247,242
170,153
193,198
243
251
178
193
243,251
251,242
178,153
193,198
243
251
175
190
243
251
175
190
243
251
178
193
neznámá mutace
243
247
170
193
243,251
251,242
175,153
190,198
243
251
175
190
Legenda
STR50
STR49
STR45
STR50
haplotyp v asociaci s neznámou mutací
Nepřímá diagnostika
Duchennova svalová dystrofie
Polymorfní místa v dystrofinovém genu
BamH I
Taq I
5´(CA)n
5´UTR
1
2
3
4
5
6
12 13
STR45
STR50
STR44
STR49
44 45 46 47 48 49 50
3´(CA)n
79 3´UTR
Legenda
•5´(CA)n
alely 172 – 184 pb
•pERT 87-8/Taq I
alela 145 pb (-), 71 pb a 74pb (+)
•pERT 87-15/BamH I
alela 216 pb (-), 166 pb a 50 pb (+)
•STR sekvence /(CA)n/: STR44 alely 174 – 204 pb, heterozygozyta 87%
STR45 alely 156 – 184 pb, heterozygozyta 89%
STR49 alely 227 – 257 pb, heterozygozyta 93%
STR50 alely 233 – 251 pb, heterozygozyta 71%
•3´(CA)n
alely 131 – 137 pb
Nepřímá diagnostika
Duchennova svalová dystrofie
proband
sestra
matka
otec
Nepřímá diagnostika
Duchennova svalová dystrofie
K určení patologického haplotpu slouží
genotyp zdravého bratra zemřelého
probanda
243,251
247,242
170,153
193,198
243
251
178
193
243,251
251,242
178,153
193,198
243
251
175
190
243
251
178
193
243
247
170
193
Ženy jsou jasné přenašečky
vzhledem k příbuzným DMD mužům
243,251
251,242
175,153
190,198
243
251
175
190
neznámá mutace
Legenda
STR50
STR49
STR45
STR50
haplotyp v asociaci s neznámou mutací
Nepřímá diagnostika
Duchennova svalová dystrofie
Nelze určit haplotyp probandky
vzhledem neznalosti genotypu
otce a matky
[184]+[188]
[172]+[170]
[226]+[222]
[237]+[239]
[184]
[172]
[226]
[237]
[184]
[172]
[230]
[237]
Probandka není DMD přenašečka
[188]
[170]
[240]
[241]
[xxx]
[xxx]
[xxx]
[xxx]
[xxx]
[xxx]
[xxx]
[xxx]
haplotypy polymorfních markerů
STR44
STR45
STR49
STR50
haplotyp polymorfních markerů
ve vazbě s patologií
Nepřímá diagnostika
HemofilieA
146
79
137
?
mutace mohla
vzniknout de novo
při transmisi gamety
?
140 140
79 81
- 137 137
142 142
79 81
- +
141 135
?
142
81
+
135
142 142
79 81
- +
141 135
142 146
79 79
- 141 137
140
81
137
140
81
137
142
81
137
Legenda
neznámá mutace
haplotyp v asociaci s neznámou mutací
STR13
STR22
RFLP18
STR24
Retinoblastom
RB1
Provedena mutační analýza genu Rb1
• sekvenace kódující oblasti
• sekvenace promotorové oblasti
• MLPA pro detekci velkých delecí a duplikcí
• metylační analýza
Nebyla detekována patologie v genu Rb1
Nepřímá diagnostika
Retinoblastom
Používány polymorfní místa
•extragenová (DS13S 1307, DS13S 272, DS13S 164)
•intragenová (Rb1.20B)
[A1]+[A2] [A3]+[A4] [A7]+[A8]
A1: DS 13S 1307 [141] DS 13S 272 [133] DS13S 164 [179] Rb1.20B [3]
A2: DS 13S 1307 [151] DS 13S 272 [133] DS13S 164 [188] Rb1.20B [4]
A3: DS 13S 1307 [139] DS 13S 272 [127] DS13S 164 [179] Rb1.20B [1]
A4: DS 13S 1307 [139] DS 13S 272 [133] DS13S 164 [186] Rb1.20B [1]
A5: DS 13S 1307 [139] DS 13S 272 [131] DS13S 164 [188] Rb1.20B [1]
A6: DS 13S 1307 [126] DS 13S 272 [133] DS13S 164 [188] Rb1.20B [2]
A7: DS 13S 1307 [126] DS 13S 272 [129] DS13S 164 [188] Rb1.20B [4]
A8: DS 13S 1307 [139] DS 13S 272 [127] DS13S 164 [178] Rb1.20B [5]
[A5]+[A6]
RB1
[A1]+[A3]
[A6]+[A7]
Nelze určit haplotyp v asociaci s patologií v RB1 genu
Vysvětlení:
• výskyt mutace v jiném systému regulace buněčného dělení a růstu
(např. dráha p14)
• nehereditární forma retinoblastomu u obou bratranců
Preimplantační genetická diagnostika
monogenně dědičných chorob
¾Selekce embryí pro in vitro fertilizaci (IVF)
pro páry s rizikem přenosu dědičné choroby na potomky
Pro genetickou analýzu vhodné tři typy buněk
1.Polární tělíska odebrané ze stádia oocyt/zygota
2.Buňky (blastomery) z embryí ve stádiu rýhování
3.Buňky trofoblastu z blastocyst
Monogenní choroby - metoda PCR
Komplikace : ADO (alelic drop out)
amplifikace jedné alely pod úrovní detekovatelnosti
Minimalizace ADO
protokol monitorující výskyt ADO:
•multiplex PCR (koamplifikace mutace s polymorfními markery)
•SSCP nebo DGGE analýzy ( detekující obě alely současně, potvrdí genotyp)
•fluorescenční PCR - redukuje výskyt ADO, detekce DNA fragmentu je až
1000x citlivější ve srovnání s konvenční PCR technikou
Preimplantační genetická diagnostika
monogenně dědičných chorob
Detekce mutace F508del v genu CFTR
Multiplex PCR – koamplifikace lokusu mutace F508del s intragenním
mikrosatelitem IVS17bTA
F508del
nonF508del
Kapilární elektroforéza
IVS17bTA
Genotyp blastomery: [F508del]+[=]
Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce
(QF-PCR)
představuje metodu vhodnou k rychlé diagnostice
nejčastějších aneuploidií
a umožňuje okamžitý management patologických těhotenství
Při analýze se využívá PCR amlifikace
chromozom-specifických polymorfních STR markerů.
Metody využíváme v prenatální i postnatální diagnostice
a analýze potracených plodů
€
€
€
€
speciální aplikací klasické PCR metody, sloužící k namnožení
definovaného úseku DNA.
V rámci prenatální diagnostiky se lze také setkat s označením
amnioPCR (v souvislosti s amniocentézou - jako metodou,
použitou k získání vzorku).
Tato metoda umožňuje vyloučit / potvrdit numerické odchylky
vybraných chromozomů a to v extrémně krátkém časovém období
jednoho, maximálně dvou dnů.
Nejčastěji jde o chromozomy, jejichž numerické abnormality tvoří
většinu (cca 90 %) chromozomálních aberací: 13, 18, 21, X a Y.
€
€
Ze vzorku AMC, CVS se pomocí některé ze standardních metod
nejprve izoluje DNA.
Polymerázová řetězová reakce-PCR
Pro vlastní PCR metodu jsou připravené speciální „kity"
s fluorescenčně značenými primery.
Tyto primery ohraničují specifické lokusy na příslušných chromozomech
(13, 18, 21, X a Y), které se pro potřeby této metody též označují jako markery.
Jedná se o takové úseky, které obsahují vysoce polymorfní sekvence
mikrosatelitní DNA - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats).
Multiplex PCR
Multiplex PCR
7 markerů pro diagnostiku chromosomu 21
7 markerů pro diagnostiku chromosomu 18
7 markery pro diagnostiku chromosomu 13
7 markerů pro diagnostiku chromosomů XY.
€
€
€
V případě diploidie, je signál dvou alel 1:1, když se jedná o
homozygota, pak jeden peak s dvojitým signálem.
Při trizomii dostaneme signál 2:1, 1:2, nebo 3 peaky 1:1:1.
Chybějící chromozom X u Turnerova syndromu je detekován
pomocí poměru X vs. 7. chromosom. U normální ženy je tento
poměr 1:1, u postižené je 1:2.
DNA amplifikovaná z normálního heterozygotního jedince (má
alely s různou velikostí)pro specifickou STR sekvenci bude mít
dva píky s odlišnou délkou v daném rozsahu
Heterozygotní marker (poměr ploch 1:1)
DNA amplifikovaná z trinomických jedinců vykáže
buď další pík (tři různé alely) se stejnou plochou
nebo jen dva píky (dvě různé alely), z nichž jeden má dvojnásobnou
plochu, než ten druhý
Trizomický troj-alelický marker (poměr
ploch 1:1:1)
Trizomický dvoj-alelický marker (8.3:
poměr ploch 2:1; 8.4: poměr ploch 1:2)
QF-PCR Homozygotní jedinci (mají alely se stejnou délkou)
nebo monozomní vykážou pouze jeden pík
Homozygotní/monozomní marker
Jedinci homozygotní nebo monozomní jsou největším problémem pro testování
abnormalit pohlavních chromozomů.
Pokud použijeme STR specifické pro chromozom X, některé vzorky z normální ženy XX
můžou vykázat homozygotní QF-PCR výsledek, který nelze odlišit od vzorků s jediným
X, jako při Turnerově syndromu. Začleněním dalších STR markerů chromozomu X do
analýzy redukuje pravděpodobnost homozygotnosti, ale neeliminuje ji zcela.
Problém monosomie X řeší 7X marker pro relativní kvantifikaci chromozomů 7 a X. Pro
normální ženu je poměr 7X 1:1 Pro normálního muže a ženu s monosomií X je typický
poměr 2:1
Normální muž s poměrem 7X 2:1. .
Normální muž s poměrem 7X 2:1. .
Typical electrophoretogram (Mix 1) showing the profile of a trisomic sample (47, XY +21)
•odstraňuje nutnost opakovat některé testy s nejasným výsledkem (jako u karyotypizace),
protože je každý syndrom analyzován pomocí mnoha STR současně.
•pro každý chromozom jsou zahrnuty i velmi krátké STR úseky,
díky nimž lze analyzovat i částečně degradovanou DNA.
•test odhalí kontaminaci mateřskými buňkami, není nutné analyzovat současně
vzorky rodičů.
•test zjistí i případný mosaicismus
•detekce Turnerova syndromu
•reagencie v alikvotech zjednodušují použití a snižuje možnost kontaminace
•. analýza trvá méně než 5 hodin, takže lze mít výsledky ještě týž den.
• Hands-on doba je cca 90 minut
numerické abnormality
chromosomu 13, 18, 21, X a Y
tvoří většinu (cca 90 %) chromozomálních aberací
QF-PCR - zavádíme
QF-PCR kit analýza pro aneuploidie
chromosomů 13, 15, 16, 18, 21, 22 X and Y,
asociované s spontánními aborty
Finnzymes' Direct PCR – forget DNA purification
Direct protocol
Dilution protocol – Dilution Buffer
DNARelease Additive
PCR master mix
celkový objem 20ųl
dle guidelines
PCR
3-step protocol dle guidelines
TA dle doposud používaných protokolů
Kontrolní reakce
1. plodová voda direct protocol 0,5ųl
2. plodová voda direct protocol 1,0ųl
3. plodová voda direct protocol 1,5ųl
4. plodová voda direct protocol 2,0ųl
5. bukální stěr dilution protocol 0,5ųl
6. bukální stěr dilution protocol 0,5ųl
7. periferní krev direct protocol 0,5ųl
8. periferní krev direct protocol 1,0ųl
9. periferní krev direct protocol 1,5ųl
10. periferní krev direct protocol 2,0ųl
11. pBr/Alu1
1
2
3
4 5 6
7
8
9 10 11
1. plodová voda direct protocol 0,2ųl, final extension 30´
1. STR 21 A
plodová voda direct protocol 0,5ųl
2. STR 21 B
plodová voda direct protocol 0,5ųl
60 min
20 min
Download

Využití mikrosatelitní DNA v molekulární diagnostice