ORGANİK KİMYA VE
BİYOKİMYAYA GİRİŞ,
LABORATUVAR ARAÇGEREÇLERİ IV
Doç.Dr. Mustafa ALTINIŞIK
ADÜTF Biyokimya AD
2006
1
Analiz yöntemleri
1) Işık şiddetinden faydalanarak yapılan ölçümler
-Kolorimetri
-Fotometri
-Alev fotometresi (flame fotometre) ile ölçüm
-Atomik absorpsiyon spektrofotometresi (AAS) ile ölçüm
2) İyon selektif elektrotlar (ISE) yardımıyla ölçüm
3) Nefelometri ve türbidimetri
4) Florometri
5) İmmünokimyasal yöntemler
6) Elektroforez
7) Kromatografi
2
Işık şiddetinden faydalanarak
yapılan ölçümler
Beyaz ışık, farklı dalga boyu ve farklı renklere sahip
ışınların bir bileşimidir.
Dalga boyu, uzunluk birimleri cinsinden ifade edilir:
1 nm=1 m=10Ao
3
Bir maddenin rengi, o maddeden gözümüze ulaşan
görünür bölgedeki elektromanyetik ışınlardır. Bu
ışınlar, saydam maddeler için maddenin içinden geçip
gelen, saydam olmayanlar için ise yansıyan ışınlardır.
4
Madde tarafından tutulan ışınların rengi ile maddenin
görünür rengini oluşturan ışınların rengi, tamamlayıcı
renkler olarak adlandırılır.
Sarı-Mavi
Kırmızı-Yeşil
5
Herhangi bir çözeltiye gönderilen ışığın çözelti
tarafından tutulmasına absorpsiyon (soğurulma-emilim),
ışığın çözeltiden geçişine transmisyon denir.
6
Çözeltiye gelen ışık şiddetiyle çözeltiden çıkan ışık
şiddeti arasında matematiksel bir ilişki vardır; bu
ilişki, Lambert-Beer kanunuyla ifade edilir.
Lambert-Beer kanunu: Bir
çözeltiden geçen ışık miktarı,
ışığın çözelti içinde katettiği yol
ve çözelti konsantrasyonu ile
logaritmik olarak ters orantılı,
emilen ışık miktarı ise doğru
orantılıdır.
7
8
Kolorimetri
Çözelti içindeki madde miktarını çözeltinin renginden
faydalanarak ölçme işlemine kolorimetri, bu tip
ölçümde kullanılan cihazlara da kolorimetre denir.
Kolorimetrik ölçümde, konsantrasyonu ölçülecek
çözeltinin rengi değişik konsantrasyonlardaki
standartların rengiyle karşılaştırılarak değerlendirilir.
9
Fotometri
Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya
çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme
işlemine fotometri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara
da fotometre denir.
Fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin
konsantrasyonu da ölçülebilir.
Aö =   cö  l
Astd =   cstd  l
cö = (Aö/ Astd)  cstd
cö = (cstd/ Astd)  Aö
cö = (Faktör)  A10
ö
11
Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını
filtreler kullanarak ayıran ve gönderen aletler
kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılırken,
yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan
aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar.
12
Alev fotometresi (flame
fotometre) ile ölçüm
Alev üzerine çözelti çok küçük damlacıklar halinde (sis
şeklinde) püskürtülür. Alevin ısı etkisiyle, çözeltideki
madde atomlarının elektronları uyarılır ve bu şekilde
daha üst bir enerji seviyesine çıkmış olan anstabil
elektronlar daha sonra eski enerji düzeylerine dönerken
aradaki enerji farkını ışık olarak dışarı salarlar. Bu ışık,
çözeltideki madde konsantrasyonuyla orantılıdır ve alev
fotometresinde ölçülür.
13
Atomik absorpsiyon
spektrofotometresi (AAS) ile ölçüm
Temel prensibi alev fotometresinin tersidir. Alev
fotometresinde uyarılmış atomun saldığı ışın ölçüldüğü
halde AAS’nde atomun tuttuğu ışın ölçülür. Bu cihazlarla
biyolojik sıvılarda bulunan Fe, Cu, Zn, Co, Pb, Li gibi
eser elementler ölçülür.
14
İyon selektif elektrotlar (ISE)
yardımıyla ölçüm
Özel elektrotlar yardımı ile
numunelerde iyon farkının bir
membranda (zarda) meydana
getirdiği potansiyel farkı ölçülür.
Böylece numunelerdeki madde
konsantrasyonu tayin edilir. Ölçülen
her bir element için ayrı bir elektrot
vardır.
15
Nefelometri ve türbidimetri
Bulanıklığın ölçümü esasına dayanan yöntemlerdir.
Nefelometride, çözeltideki partiküllerce geliş eksenine
göre 90o açıyla yerleştirilmiş olan fotosele doğru
saptırılan ışınlar ölçülür. Çeşitli açılarda saçılan ışınları
ölçen farklı tip nefelometreler vardır.
16
Türbidimetride, çözeltiye gelen ışık şiddetinde
çözeltideki partiküllerin neden olduğu saçılmadan dolayı
ortaya çıkan ışık kaybı ölçülür. Bunun için,
absorpsiyonun olmadığı dalga boyundaki ışık ve
fotometreler veya kolorimetreler kullanılır.
17
türbidimetre
nefelometre
18
Fluorometri
Bazı bileşikler, ışık (enerji) absorbe ettiklerinde
uyarılırlar; elektronları düşük enerji seviyesinden
yüksek enerji seviyesine çıkarlar. Sonra bu elektronlar
eski enerji seviyelerine veya onun biraz üstündeki bir
seviyeye dönerler ve dışarıya ilk aldıkları enerjiye eşit
veya biraz daha az enerjiyi ışık tarzında salarlar.
Uyarılma (eksitasyon) ortadan kalkınca ışımanın 10-1010-6 s sürmesi fluoresans, 10-6-102 s sürmesi
fosforesans olarak tanımlanır.
Fluorometride, fluorometre denilen cihazlarla madde
konsantrasyonu, fluoresans ışımanın ölçümü ile tayin
19
edilir.
20
İmmünokimyasal yöntemler
Düşük konsantrasyonlu maddelerin ölçümünde kullanılan
yöntemlerdir. Bu yöntemlerin ortak noktası, ölçülecek
maddeye karşı bir antikor içermesi ve ortamda bir işaretleyici
olmasıdır. Deney sonunda bu işaretleyicilerin miktarı ölçülerek
madde miktarı hesaplanır.
Radyoimmünoassay (RİA) yönteminde işaretleyici olarak
radyoaktif madde kullanılır.
Fluoresan immünoassay (FİA) yönteminde işaretleyici olarak
fluoresan madde kullanılır.
Luminoassay ve kemilüminoassay (LİA) yönteminde
işaretleyici olarak luminesan madde kullanılır.
Enzimimmünoassay (EİA) yönteminde işaretleyici olarak
enzim kullanılır.
21
Elektroforez
Elektroforez, yüklü partiküllerin bir elektrik akımının
etkisiyle birbirinden ayrılması işlemidir.
Elektroforez için dört şeye ihtiyaç vardır:
-iyonların hareket edebileceği uygun bir ortam (destek
ortamı)
-elektriksel alanı oluşturmak için doğru akım sağlayacak
güç kaynağı
-uygun pH’da bir tampon çözelti
-birbirinden ayrılan bantları kantitatif olarak
değerlendirebilen dansitometre.
22
Elektroforez çeşitleri:
-Kağıt elektroforezi
-Agaroz jeli elektroforezi
-Selüloz asetat elektroforezi
-Poliakrilamid jel elektroforezi
-Nişasta jeli elektroforezi
-Kapiller elektroforez
23
24
Kromatografi
Kromatografi, herhangi bir karışımdaki maddelerin biri
sabit diğeri hareketli olan iki ayrı çözücüye karşı olan
fizikokimyasal özelliklerinden faydalanılarak
birbirlerinden ayrılmaları işlemidir.
Hareketli faza göre gaz kromatografi ve sıvı (likit)
kromatografi olarak sınıflandırılır. Yüksek performanslı
likit kromatografi (HPLC), normal sıvı kromatogarafi
cihazının gelişmişidir.
Ayrıştırma işlemi için ya ince tabakalar veya kağıt ya da
kolonlar kullanılır.
25
26
Ayırma mekanizmalarına göre de farklı kromatografi
çeşitleri vardır:
-Adsorpsiyon kromatografisi
-Partitisyon kromatografisi
-İyon değişimi kromatografisi
-Afinite kormatogarfisi
-Jel filtrasyon kromatografisi
27
Laboratuvar uygulamalarında
kullanılan cam ve diğer malzemeler
Deney tüplerisantrifüj tüpleri
28
Beher (beherglas)-erlen (erlen
mayer)
29
kapsül
huni
ayırma hunisi
baget
ependorf tüpü
tüp sporları
30
Cam balonlar-balon jojeler
31
Dereceli silindirler (mezürler)
32
Havan ve havan eli-temizleme
fırçaları-damlalıklı şişeler
33
pH kağıtları-pipetler
34
Büret-bunzen beki-piset-puar
35
36
Benmari (su banyosu)
pHmetre
37
santrifüj
38
Download

04 Organik kimya ve biyokimyaya giriş