1. MOLEKULARNA ORGANIZACIJA HROMOZOMA
Celije svih organizama imaju zajednicke neke strukturne osobine i slicne metabolicke procese.
Celija eukariota predstavlja slozen zivi sistem karakteristicnog oblika, sastava, organizacije i
uloge. Ona cini osnovu grade biljnih organizama, zivotinja kao i coveka. Geneticki materijal,
hromozomi, nalaze se kod eukariota unutar jedra, za razliku od prokariota kod kojih ne
postoji jedro i geneticki materijal se nalazi slobodan u citoplazmi. (Rec eukariot potice od grcke
reci eu=pravi i karion=jedro). Eukariotska celija se pojavljuje u razlicitim oblicima i velicinama,
od sitnog jednocelijskog organizma, amebe, do kompleksnog multicelularnog organiz.ma
coveka.
Tab. 1.1. Osnovne razlike izrndu celije prokariota i u celije ljudi
Celija prokariota
Velicina celije
Celijski zid
Citoplazma
Mitohondrije
Ribozomi
Endoplazmaticni retikulum
Goldzisistem
Jedro
Jedarce
Hromozom (DNK)
DNK
RNK
Mitoza
Mejoza
oko 1-10~m
sadrzi muramicnu kiselinu
ne postoji citoskelet
ne postoje
70S (30S, 50S)
ne postoji
ne postoji
ne postoji
ne postoji
cirkularan
ogoljena
sinteza u citoplazmi
ne postoji
ne postoji
Celija ljudi
oko i0-100~m
nemaga
postoji citoskelet
postoje
80S (40S, 60S)
postoji
postoji
Postoji
Postoji
linearan
sa proteinima
sinteza u jedru
postoji
postoji
ORGANIZACIJA NUKLEARNOG GENOMA
Jedro (nukleus, karion) je jedna od najkrupnijih organela koja se nalazi kod
eukariota. Otkrio ju je Brown (1835). Okruglog je ili ovalnog oblika, mada moze biti i
reznjevito (kod leukocita), mrezasto ili koncasto (zlezdane celije). U manjoj meri oblik
jedra moze i da se menja promenom fizioloskog stanja celije. Smatra se da je velicina jedra
srazrnema kolicini DNK u njemu. Obicno se u celiji nalazi jedno jedro, ali moze biti i dva
ili vise jedara.
Jedro je od citoplazme odvojeno jedrovom ili nuklearnom membranom. To je
dvojna membrana (debljine oko 7,5-1Onrn), lipoproteinskog sastava. Izmedu membrana je
perinukleami prostor (sirine 10-30nm), koji je u vezi sa prostorom koji se nalazi izmedu
membrana endoplazmaticnog retikuluma (S1. 1.3). Na taj nacin je olaksan transport
metabolita u oba pravca. Na spoljasnjoj membrani se mogu naci ribozomi, a unutrasnja
membrana je u vezi sa heterohromatinskim delovima interfaznog hromatina (hromozoma).
Na jedrovoj membrani se nalaze pore, promera 300 do 1000 angstrema. Broj pora
zavisi od aktivnosti celije, aktivnije celije imaju vise pora. Na tangencionalnom preseku
pore mogu se uociti anulusi, gradeni od dva prstena. Kroz pore prolaze mali molekuli
(seceri, amino kiseline, polipeptidi, razne RNK i dr.). Iz jedra u citoplazmu odlaze iRNK,
tRNK, 5 8 RNK, 18 8 RNK i 28 8 RNK, a u suprotnom pravcu proteini, lipidi, prekursori
nukleinskih kiselina ATP, GTP.
JEDROV OMOTAC
HROMATIN -
__
ENDOPLAZMAllCNI
RETIKULOM
RIBOZOMI
Slika 1.3. Shematski prikazgrade
.
jedra
Unutar jedra nalazi se matriks (karioplazma;. nukleoplazma), viskozniji od
citoplazme. U njemu se nalazi hromatin, ribonukleinske kiseline, subjedinice ribozoma,
nukleolus, razne organske i neorganske materije.
U jedru moze da se nalazi jedno
jedarce (nukleolus), ili vise njih. U obrazovanju jedarca ucestvuje sekundarno suzenje
akrocentricnih hromozoma, tzv. nukleolusni organizator - NOR. To je ustvari oblast
hromozoma u kojoj su smesteni geni koji kontrolisu sintezu rRNK. Hemijskim analizama
je ustanovljeno da se u nukleolusu nalazi DNK, rRNK i proteini, pa su prema tome
utvrdene i komponente jedarca:
- hromozomski deo je deo DNK u kojem se nalaze geni za sintezu rRNK,
- koncasti deo (fibrilarni) cine molekuli rRNK
- granularni deo sadrzi sitne granule, a to su kratki molekuli rRNK od 28 8, 18 8,
5,8 8 i proteini.
ORGANIZACIJA
HROMOZOMA
Osnovnu jedinicu organizacije hromozoma eukariota predstavlja hromatinska nit, koja
se sastoji od molekula DNK povezanog sa histonskim i nehistonskim proteinima koji odreduju
strukturu hromozoma i imaju ulogu u regulaciji funkcije hromozoma. Moze se rece da u sastav
hromozoma ulazi i mala kolicina RNK koja se uvek prepisuje sa nekog od gena.
Nehistenska frakcija protein a se sastoji od oko 100 razlicitih proteina, molekulske
mase 10-300 kDa (kilodaltona). U ovu grupu spadaju razliciti proteini koji ucestvuju u
procesima replikacije DNK' i u transkripciji RNK, kao polimeraze, nukleaze, ligaze ,
transkripcioni faktori i s1. Druga grupa nehistonskih proteina ima uticaja na ekspresiju gena i
njihovu regulaciju i obicno je tkivno specificna,
Histoni su u velikoj meri odgovorni za strukturu hromatina. Postoji pet glavnih tip-ova
histona koji su prisutni u celijama ljudi: HI, IDA, H2B, H3 i H4. To su uglavnom proteini
male molekulske mase 10-12 kDa. Histoni irnaju visok sadrzaj (> 10%) pozitivno naelektrisa.nih
aminokiselina lizina i arginina sto im ornogucuje lako povezivanje sa negativno naelektrisanim
fosfatnim grupama u DNK. Histoni razlicitih organizama su slicni (sem HI), pa se moze reci. da
SD to visoko konzervirani proteini jer su tokom evolucije pretrpeli veoma male izmene. Hist oni
omogucuju specificno pakovanje hromatinske niti u hnnozom.
Osnovna jedinica grade hromatina je nukleozom koji se sastoji od molekula DNK i
oktamera histona. Histoni H2A i H2B, kao i H3 i H4 su povezani u dimere, a ova dva dim era
cine tetramer. Dva tetramera konacno Cine funkcionalni nukleozomski oktamer, koji je obavijen
(nepuna dva puta) sa molekulom DNK od 146bp (S1. 1.1).
N'lideosome
V
Core of 8 Histone Motecubes
Nucleosome
Slika 1.1. Prikaz grade nukleozoma
Amino krajevi svakog histona pruzaju se izvan molekula DNK i omogucuju pojavu
visestrukih hemijskih modifikacija koje uticu na promene strukture i funkcije hromatina.
Molekuli histona HI se nalaze izmedu kompaktnih delova histona (core particle) i
regulisu njihov prostorni raspored stabilisuci razlicite nivoe organizacije hromatinskih niti. Ova
struktura sastavljena od molekula DNK obmotanog oko histonskih molekula podseca na "nisku
perli" (beads on a string).
Dalji nivo organizacije hromatina omogucen je zahvaljujuci interakcijama histonskih
amino krajeva. Tako se kombinuje po 6 nukleozoma u solenoidnu strukturu u vidu niti od 30
run. Ova struktura se dalje uvija i spiralizuje dajuci tipicnu strukturu metafaznog hromozoma
(SI. 1.2).
Na taj nacin hromatinska nit uspesno pakuje relativno malo jedro. Na primer najduzi od
23 para hromozoma coveka sadrzi molekul DNK duzine 82 mm koji se do metafaze kontrah.uje
do velicine od 10 mikrometara.
.
i:~·" ~i=::_
'J>,
.
v.' ; ••••
~~:~~~;);:.":
.
.~~ :.:~~~:~-:
J.;:/"'/.
~r~~.
I~"m
:.~=:,.);::\", :}~«c;';.::-,:,:: :~;:i".:~:~::::
...:-,~~?
1300 nm
11«JO nm
Slika 1.2. Shematski prikaz pakovanja hromatina
U jedru celija biljaka i zivotinja nalaze se hromozomi, organele koje su nosioci
naslednih osnova, gena. Oni obezbeduju stabilnost i preciznu raspodelu naslednog materijala.
Hromozomi se razlikuju po velicini i strukturi, a njihova DNK po sastavu i rasporedu
nukleotidnih sekvenci. Najveca razlika u strukturi i genetickoj organizaciji postoji 'izmedu
hromozoma prokariota i eukariota, kao i izmedu prokariota i virusa.
Virusi mogu imati DNK ili RNK. Prokarioti (kao na primer bakterije) poseduju
nukleoid, u vidu jednog hromozoma, slobodnog u citoplazmi (nije okruzen membranom). On
je izgraden od kruzne molekule DNK, koja na primer u hromozomu Escherichia coli sadrzi oko
4700 kb parova. Kod nekih prokariota u citoplazmi se moze naci i nekoliko kopija malih
kruznih molekula DNK koje su nazvane plazmidi. Celije eukariota imaju u jedru linearne
hromozome gradene od DNK, histonskih i nehistonskih proteina i malo RNK.
Broj hromozoma je odlika vrste i uglavnom nije u vezi sa evolucionim stupnjem razvica
organizma. Telesne celije svih organiyama sadrze diploidan broj (2n) hromozoma.
Hromozomi su prisutni u parovima i zovu se hornologi hromozomi, Covek ima 2n=46, tj. ima
23 para hromozoma, jedan od hromozoma iz para pot ice ad majke, a drugi od oca. Homologi
hromozomi su .iste duzine i oblika, nose iste lokuse, te iste ili razlicite alele. Polne eel .ije,
gamete, sadrze sarno po jedan hromozom iz para i one imaju haploid an (n) broj hromozoma.
Na hromozomu se mogu uociti svetlije i tamnije obojeni delovi hromatinske niti, tj.
euhromatinski i heterohromatinski regioni. Euhromatin (pravi hromatin) predstavlja delove
hromozoma koji sadrze gene (transkribuju se), oni su disperzniji pa su svetlije boje i rano se
repliciraju u S fazi interfaze.
Heterohromatin
predstavlja kondenzovaniji deo hromozoma koji je uglavnom
rasporeden oko centromere a nalazi se i na krajevima hromozoma. Sadrzi najvecim delom
sekvence DNK koje su neaktivne u pogledu transkripcije, Kasno se replikuje u S fazi, vise je
spiralizovan od euhromatina i tamnije je obojen. Deli se na:
~ fakultativni heterohromatin, koji predstavlja funkcionalno neaktivno stanje delova
hromozoma. Pojavljuje se sarno na jednom od homologih hromozoma, na primer to je
delimicno neaktivni X polni hromozom zenki sisara, tzv. Barovo telo. Inaktivacija se
odvija u ranim fazama embriogeneze. Broj Barovih tela je uvek za jedan manji od broja
polnih X hromozoma u celiji,
- konstitutivni heterohromatin se nalazi oko centromere i sekundamog suzenja, kao i
na krajevima hromozoma-Sadrzrvisoko ponovljivu DNK, pojavljuje se na oba homologa
hromozoma u razlicitim kolicinarna, Narocito j'e zastupljen u hromozomima 1, 9, 16, Y
kao i na kratkim kracima hromozoma 13,14,15,21 i 22.
U -genomu eukariota nalaze se razliciti tipovi DNK koji se razlikuju po sastavu azotnih
baza i stepenu zastupljenosti pojedinih nizova nukleotida u haploidnoj garnituri DNK.
Eukariotski genom se sastoji od: jedinstvenih' (single copy) sekvenci DNK, srednje ponovljivih
sekvenci i visoko ponovljivih sekvenci (satelitske DNK).
- Jedinstvene sekvence DNK predstavljaju glavnu komponentu DNK i zastupljene su u
~ oko 3% hromozomske DNK coveka. Tuje smesten najveci broj struktumih gena.
- Srednje ponovljive sekvence predstavljaju krace nizove DNK koji se ponavljaju do
10s po genomu. Tu se nalaze geni za:
-rRNK
-tRNK.
- iRNK. sarno za histone.
Visoko ponovljive sekvence se nazivaju i satelitska DNK i cini oko 50% genoma.
Zastupljene su sa ucestaloscu vecorn od 10s po genornu, Sastoje se od mnogostruko
ponovljenog kraceg niza nukleotida, pa se prema tome bazni sastav ove DNK razlikuje od
prosecnog sastava ostale DNK jedra. Pri centrifugiranju se odvajaju lako od glavnine DNK pa
se zato i zovu satelitska DNK. Satelitska DNK se kasno replicira, a na njoj se ne odvija
transkripcija. Ova DNK se moze naci u skoro svim hromozomima i to vecinom u
heterohromatinskim delovima, a rede moze biti razbacana po euhromatinskim delovirna.
Funkcija satelitske DNK nije sasvim poznata, a smatra se da odrzava odredenu strukturu i
organizaciju hromozoma.
Mitotski hromozom se sastoji od dve hromatide povezane centro merom. Centromera,
tj. primamo suzenje hromozoma, predstavlja deo hromozoma pretezno izgraden od
heterohromatina, koji se sastoji od visoko ponovljive - repetitivne DNK. Uocava se lako na
hromozomu u svim fazama celijskog ciklusa. Odgovoma je za pokretanje hromozoma tokorn
celijskih deoba (mitoze i mejoze), jer se za nju vezuju niti deobnog vretena. Hromozom obicno
ima jednu centromeru (a retko se mogu naci i hromozomi sa dye centromere-dicentricni,
vise centromera -policentricni).
m.et8Centrican
\.
ili sa
·akrocen:lricWl
",bmetaocutri..n
\.
tel"'~.'"
Slika 1.3. Oblici hromozoma
Centromera se moze nalaziti u sredini hromozoma, te su kraci iste duzine, a takav tip
hromozoma je metacentrican
(S1. 1.3). Ako se centromera nalazi blize jednom kraju
hromozoma, kraci su nejednake duzine, a hromozom je submetacentrican.
Kada se centromera
. nalazi veoma blizu kraja hromozoma, nastaju veoma kratki, a sa druge strane dugacki kraci,
hromozom je akrocentrican.
Kao posledica hromozomskih aberacija moze se pojaviti i telocentrican hromozom koji
ima centromeru postavljenu terminalno, dicentrican hromozom koji ima dye centro mer Hi
acentrican hromozom koji je bez centromere.
Dugi krak bromozoma oznacava sa q,. a kratki sa p. Ukoliko dode do povecanja duzine
oznaka je +, a ako do]e do delecije to se oznacava kao -. Na primer povecanje duzine dugog
.kraka polnog bromozoma Y se pise kao: Yq +, dok se skracenje istog kraka pise kao Yq-.
Oko 5% normalne ljudske populacije poseduje varijacije u morfoloskoj gradi
hromozoma koje nisu povezane sa sindromima niti sa nekim klinickim nalazima. Ova pojava se
naziva hromozomska polimorfnost ijavlja se u vidu:
- povecanih satelita akrocentricnih hromozoma grupe D
- promena u duzini dugog kraka polnog Y hromozoma
- despiralizacija centromemog hromatina bromozoma 1
s.,
·J1~man~~B'
EqQ~ttIDt;,I$,~nq$qt "pg~tB
:0{tt(e: ;iX nucleotl~:$.!.qUenC$.TIA~
Slika 1.4. Telomemi region
Telomere se nalaze na krajevima krakova hromozoma (terminalno). To su specijalne
kratke ponovljive sekvence DNK koje se pridodaju krajevima hromozoma eukariota uz uce~ce
enzima telomeraze (S1. 1.4). Kod sisara to je sekvenca 5'-TTAGGG-3' i ona osigurava
stabilnost hromozoma. Na primer, ako dode do prekida na hromozomu i gubitka telomera
krajevi hromozoma tete da se spoje, tako da mogu da se obrazuju prstenasti ili dicentri cni
hromozomi. Smetra se da telomere imaju ulogu u celijskim deobarna i celijskom starenju.
Sekundarno suzenje predstavlja despiralizovan deo DNK hromozoma koji ucestvuj e II
obrazovanju nukleolusa te se zove i nukleolusni organizator (NOR). Tu se nalaze sekvence
DNK, odnosno tandem ski ponovljeni geni, koji kontrolisu sintezu 45S rRNK. Sekundarno
suzenje se nalazi na akrocentricnim hromozomima. Na sarnom kraju akrocentrieriih
hromozoma moze se obrazovati loptasti deo koji se zove satelit. Sateliti se nalaze redovno na
akrocentricnim hromozomima 13, 14, 15, 21 i 22 i 0 omogucavaju laksu identifikaciju 'tih
hromozoma.
hromatide
p
q
telomere
Slika 1.5. Oblici hromozoma
KARIOTIP L.JUDI
Za proucavanje hromozoma se najeesce priprema kultura limfocita perifeme krvi. Celije
se tretiraju mitogenom (fitohemaglutininorn) koji stimulise deobu celija. Dodavanjem kolhicina
sprecava se formiranje niti deobnog vretena te se celije zaustavljaju u metafazi mitoze i
proucavaju. Skup svih hromozoma koji se vide u celiji predstavlja kariotip (S1.1.5). Za
detaljnije proucavanje hromozomi se redaju po velicini i obliku pa se dobija kariogram (S1.
1.9).
".
'"
Slika 1.5. Kariotip - skup svih hromozoma u celiji
~~~H~HHHH
HHH"tl"HHH
t
••
1
1
II
15
12
b
11
U
.5
7
a
9
16
17
.11
~N~~ilH
18
20
n
2,
y
.
Slika 1.7. Idiogram - dijagramski prikaz hromozoma
Ljudi u telesnim celijama imaju 2n=46 hromozoma, od kojih su 44 autozomi ili telesni
hromozomi, a jedan par su alozomi ili polni hromozomi. Polni hromozomi XX uslovljavaju
pojavu zenskog pola, a XY muskeg. Prema prihvacenoj nomenklaturi kariogram ljudi sadrzi
sedam grupa u koje su svrstani telesni hromozomi (Tab 1). Polni hromozom X je srednje
velicine i submetacentrican (slican sa hromozomima C grupe) , dok je Y hromozom sitan i
akrocentrican (slican hromozomima G grupe).
Slika 1.8. Polni hromozomi X i Y
Oil'
,.
'~I
X
c
Ii 4t
,18
U
.D
:.~I
119
If
••
;9.
"
1!J
II
1-16
••
III
G
•••
11
'J!
.,PI
II
131
I
y
Slika l. 9. Kariogram coveka
TblllR
a ea
asp ore dh umaruih hr omozoma po grupama
Grupa
Hromozomski pari
Oblik hromozoma
A
1,2,3.
B
4,5
veliki, 1 i 3 par su rnetacentricni, 2 par je
subrnetacentrican
veliki, submetacentricni
C
6,7,8,9,10,
D
13, 14, ]5
srednji, akrocentricni
E
16, 17, 18
F
19,20
16 par je metacentrican, parovi 17 i 18 su
submetacentricni
mali, metacentricni
G
21,22
mali, akrocentricni
II, 12
srednji, submetacentricni
Poslednjih godina razvijene su razne tehnike bojenja hromozoma tzv. tehnike traka: Ggirnza bojenje, R -reverzno bojenje, C -centromerno bojenje, Q - quinacrin bojenje i dr. Po sle
bojenja.specificnom bojom na svakom paru hromozoma pojavljuju se karakteristicne trake koje
omogucuju precizno razlikovanje hromozoma slicnih po velicini i obliku, kao i prepoznavanje
strukturnih aberacija.
Tehnike traka:
G trake - za bojenje se koristi boja Giemsa, Ova metoda se najcesce koristi u
citogenetickim laboratorijama, Pod rnikroskopom se vide na hromozomu obojene tamne
traketzv.
G trake, dok su svetle trake G negativne. Ovo bojenje omogucuje uspesnu
analizu hromozoma sa oko 400 do 500 traka po haploidnom setu. Svaka od traka odgovara
6 do 8mb u DNK. Obojene trake su kasnoreplicirajuci regioni DNK, tj. kondenzovani
regioni hromatina,
Q trake - koristi se boja quinacrin a trake su slicne G trakama, sarno se moraju
posmatrati pod fluorescentnim mikroskopom. Fluorescentne trake se nazivaju Q trake a
predstavljaju regione DNK bogate A- T parovima.
R trake (Reverse) -hromozomi se tretiraju visokorn ternperaturom da bi se
denaturisali regioni DNK bogati A- T parovima. Nakon bojenja sa Giemsom, dobijaju se
trake obrnute Oobojene od G traka. Ustvari R trake su G negativne trake. U R trakama su
vecinom koncentrisani geni.
T trake - trake su ustvari intenzivno obojene trake u telomernim regionima
C trake (centromerni region) pretretrnan hromozoma se izvrsi sa barijum
hidroksidom, zatim se koristi Giemsa. Dobiju se tarnno obojeni heterohrornatinski
centromemi regioni.
Najnovije molekularne metode zasnivaju se na fluorescentnoj in situ (DNK-DNK)
hibridizaciji (FISH) i koriste se u klinicko dijagnosticke svrhe.
Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH - primenjuje se u metafazi ali i u
interfazi kada su hromozomi despiralizovaniji. DNK proba (jednolancani fragment DNK)
'sa modifikovanirn nukleotidirna hibridizuje sa delom DNK pacijenta. Posmatranjem pod
fluorescentnim mkroskopom obicno se pojavljuju dva signala, prosvetljena mesta, na
•.••
'.
..
'
'
j
... ;
-
-
:~
.. ,
);
.','::~.·~i~~~W~::;·::;;®~Sj~~~~;~~~;~;'}
Slika
Satelitska DNK
Polimorfizam
nukleotida
Novija istrazivanja s~ pokazala da su ljudi mnogo vise geneticki slicni nego sto se
mogio predpostaviti, Naucnici su proucavali single nucleotide polymorphisms, SNPs,
humanog hromozoma 21 za svaku od 20 etnickih razlicitih individua. Nasli su isti SNPs
hromozorna, nezavisno da li je donor bio afrikanac, azijat, ili kavkazoid.
Uporedivanjem DNK dye osobe utvrdeno je da je 99,9% DNK sekvence identicno.
Ako se po de od toga da je velicina humanog genoma 3200Mb to je 0,1% varijacije, tj.
3,2Mb. Sarno jednojajcani blizanci imaju isti genom.
.
Najces6i tip ponovljenih genetickih elemenata je SNP. Varijabilnost je povezana sa
razlikama upopulaciji,
individualnosti, osetljivosti na bilesti. Ovaj tip varijabilnosti je je
zapazen u regionima koji se :ne prevode u proteine, medu intronima i ekstragenskim
regionima DNK. Vise od 90% humanih gena sadrzi makar jedan SNP, a otprilike 3 miliona je
otkriveno od kada je zavrseno sekvencioniranje humanog genoma.
Od 2.1 milion SNPs, manje od 1%, ili oko 21,000, su nadeni u gemma i veoma u
znacajni jer imaju uticaja na proteine, dok SNPs u regulatornom regionu izvan gena, uticu na
kolicinu proizvedenog proteina. SNPs smesteni unutar gena mogu imati i negativan uticaj i
poremetiti sintezu odgovarajuceg proteina, te dovesti do nastanka neke bolesti.
PopuJ~tlon With
norm~lget'le
.•.•~~.~.J
L
I
Chttlrnoso me
Slika
P op1..-tIIJ'jUoo y.Ath
fill.lta nt glSne
A~j
t~lt
SNP-Razlika u DNK sekvenci samo u jednom nukleotidu (baznom paru)
SNPs se desava na oko svakih 1250 baza, i predstavljaju korisne geneticke markere za
lokaciju gena koji izazivaju bolesti. Postoji velik broj radova koji povezuju SNP sa nekim
bolestima (ulcerative colitis, Alzheimer-ova bolest i povecan rizik od HIV infekcije). SNJ>s
koji se povezuju sa odgovarajucom bolesti su potencijalno korisni kao dijagnosticni markeri
za determinaciju rizika za razvoj bolesti. Forenzika koristi ove varijabilne regione kao
geneticke markere za formiranje DNK profila (genetickog bar koda) individue, koristeci
uzorke krvi, kostiju, kose, ili bilo kog drugog dela tela .
. ~':,.,.'
-.
,.
Download

02 Molekularna organizacija hromozoma