Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ
STANDARTLARI (UMS)
Rotavirüs Enfeksiyonunun
Mikrobiyolojik Tanısı
Hazırlayan Birim
Klinik Viroloji Tanı Standartları ÇalıĢma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Viroloji
Bölüm
Mikrobiyolojik Tanımlama
Standart No
V-MT-04
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
Rotavirüs
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3
GENEL BĠLGĠ ................................................................... 3
Hastalığın önemi............................................................... 3
Klinik özellikler ................................................................. 4
Virüsün özellikleri ............................................................. 4
Laboratuvar tanısı............................................................. 5
TEKNĠK BĠLGĠLER ............................................................. 6
1
2
3
4
5
6
Hedef mikroorganizma(lar) ............................................ 6
Tanı için asgari laboratuvar koĢulları ................................ 6
Rotavirüs tanısında kullanılan teknikler ............................ 8
Test sonuçlarının yorumu, raporlama, bildirim ................. 10
Olası sorunlar/kısıtlılıklar .............................................. 10
Rotavirüs tanısı için akıĢ Ģeması .................................... 11
ĠLGĠLĠ DĠĞER UMS BELGELERĠ .......................................... 12
KAYNAKLAR ................................................................... 12
Sayfa 2 / 13
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / V-MT-04 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Viroloji
Rotavirüs
Kapsam ve Amaç
Rotavirüsler, tüm dünyada bebekler ve küçük çocuklarda akut gastroenteritin en
sık nedenidir. Ağır dehidratasyon ile seyreden olgularda mortalite oranı da
yükselmektedir. Kesin tanı laboratuvar incelemesi ile konabilir. Laboratuvar tanısı
özellikle güvenilir bir sürveyans ve enfeksiyon kontrolüne yönelik epidemiyolojik
veri toplanması amaçları için önemlidir; klinikte gereksiz antibiyotik tedavilerinin
kullanılmasını da önler (1,2). Rotavirüs enfeksiyonları ülkemizde bildirimi zorunlu
hastalıklar listesinde yer alır (3).
Bu UMS belgesinde, rotavirüs enfeksiyonlarının laboratuvar tanısı için güncel ve
geçerli yaklaĢım ve prosedürlerin verilmesi hedeflenmiĢtir.
Kısaltmalar ve Tanımlar
cDNA
Komplementer DNA
ICT
Ġmmünokromotografik test
PAGE
Poliakrilamid jel elektroforezi
VP
Viral protein(ler)
Genel Bilgi
Hastalığın önemi
Rotavirüsler, dünyada beĢ yaĢın altındaki çocuklarda akut gastroenteritlerin en
önemli etkenleridir. BeĢ yaĢına gelinceye kadar çocukların çoğu rotavirüs
enfeksiyonu geçirmektedir. Her yıl 25 milyondan fazla kiĢinin rotavirüs
enfeksiyonu nedeniyle hastanelere baĢvurduğu ve bunların 2 milyondan
fazlasının hastaneye yatırıldığı tahmin edilmektedir (2,4). Ilıman iklim
kuĢaklarında rotavirüs enfeksiyonları tipik olarak kıĢ aylarında pik yapar, tropikal
bölgelerde ise yıl boyunca gözlenebilir. Büyük çocuklar ve yetiĢkinlerde yenileyen
enfeksiyonlar gözlenebilir ancak bu enfeksiyonlar genellikle subklinik seyirlidir.
DSÖ raporuna göre 2008 yılında dünya genelinde 5 yaĢın altında 453.000 çocuk
rotavirüs ishali nedeniyle ölmüĢtür. Bu oran 5 yaĢ altı çocuklarda gözlenen ishal
nedeniyle ölümlerin %37‟sini, genel ölümlerin %5‟ini oluĢturmaktadır (4,5).
Rotavirüslere bağlı gastroenterit vakaları, geliĢmiĢ ve geliĢmekte olan ülkelerde
benzer sıklıkta kaydedilse de mortalite geliĢmekte olan ülkelerde daha yüksektir.
Dünya genelinde rotavirüs ishallerine bağlı çocuk ölümlerinin %80‟i geliĢmekte
olan ülkelerde görülmektedir (5,6). Öte yandan, aĢılama ile morbidite ve
mortalite hızlarında ciddi azalmalar (%70-100) kaydedildiği rapor edilmektedir
(7,8,9). DSÖ 2009 yılından bu yana, rotavirüs aĢısının ulusal bağıĢıklama
programlarına konmasını önermekte; uygulamanın dünya geneline yaygınlaĢması
ile ilgili çalıĢmalar yürütmektedir (6).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Viroloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / V-MT-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 13
Rotavirüs
Klinik özellikler
Rotavirüs enfeksiyonunun ilk epizodu süresince, hastanın dıĢkı ve kusmuğundan
oldukça yüksek yoğunlukta virüs (>1012 partikül/g) atılmaktadır. BulaĢma primer
olarak fekal-oral yolla; kiĢiden kiĢiye yakın temas veya kontamine eĢyalar
aracılığı ile olur. Rotavirüs küçük bir enfeksiyon dozu ile (<100 partikül) hastalığa
neden olabilen oldukça bulaĢıcı bir etkendir ve muhtemelen kontamine su ve
gıdalarla ve solunum yolu (aerosoller) ile de yayılabilmektedir (6,10,11).
Çevresel koĢullara çok dirençlidirler. BulaĢtığı yüzeylerde dezenfekte edilmediği
sürece haftalarca veya aylarca canlı kalabilirler (12).
Virüs ince barsak epitel hücreleri içerisinde çoğalır, mikrovilluslarda ağır hasar
oluĢturur, malabsorpsiyona, sıvı ve elektrolit kaybına sebep olur. Rotavirüslerin
neden olduğu hastalık tablosu basit, sulu dıĢkılamadan, kusma, ateĢ ve
dehidratasyon ile elektrolit dengesizliği, Ģok ve ölüme kadar gidebilen ağır ishalle
seyredebilir. Genellikle, 1-3 günlük bir inkübasyon dönemini takiben ani ishal
baĢlar; ishalden önce kusma görülebilir. Belirtiler genellikle 3-7 günde düzelir.
Hastaların üçte bir kadarında ateĢ 39°C‟yi aĢar. Ağır, dehidratasyon ile giden
rotavirüs enfeksiyonu en çok 3-35 aylık çocuklarda gözlenir (6).
Virüsün özellikleri
Rotavirüsler Reoviridae familyası içerisinde yer alan, zarfsız, çift iplikcikli 11
segmentli RNA virüsleridir. Antijenik özellikleri temelinde ya da son zamanlarda
VP6 kapsit proteininin amino asit sekanslarına göre gruplara (A‟dan H‟ye) ayrılır.
Ġnsanlarda enfeksiyona A, B, C ve H gruplarının neden oldukları belirlenmiĢtir.
Grup A beĢ yaĢın altındaki çocuklarda akut gastroenteritlerden sorumlu virüsleri
içerir ki bunlar mevcut aĢı programlarının da hedefidirler. Grup B yetiĢkinlerde
ishal oluĢturur ve Grup A‟dan farklı olarak salgınlarla seyreder. Çin‟de binlerce
yetiĢkinin etkilendiği bir salgında gösterilmiĢtir. Grup C 4-7 yaĢ arasındaki
çocuklarda ishale neden olur; daha ziyade kendini sınırlayan özellikte, sporadiktir.
Kurumsal ortamlarda gıda kaynaklı salgınlar ile de iliĢkilendirilmiĢtir. Grup D, E
ve G rotavirüslerin yalnızca kuĢ türlerini enfekte ettikleri bilinir (13).
DıĢ kapsitte yer alan glikoprotein VP7 ve proteazlara duyarlı VP4 proteinler esas
alınarak rota virüsler P ve G serotiplerine (genotiplerine) ayrılırlar (9). Bugüne
dek 27 G (G1-G27) ve 35 P (P[1]-P[35]) serotipi tespit edilmiĢtir (10). On beĢ
farklı G/P kombinasyonu bulunmaktadır; dünyanın birçok yerindeki insan
rotavirüs enfeksiyonlarının %90‟ından G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8] ve G9[P8]
tiplerinin sorumlu oldukları gösterilmiĢtir (6,13). Özellikle G1P[8] güncelliğini
korumakta olup, A.B.D., Ġngiltere ve Avustralya gibi geliĢmiĢ ülkelerde saptanan
genotiplerin >%70‟ini oluĢturmaktadır (14). G12 ise dünyada yeni ortaya çıkan
bir genotip olarak tanımlanmaktadır (15).
Rotavirüs VP6 proteinin monoklonal antikorlarla oluĢturduğu reaksiyona göre
insan rota virüsleri iki alt gruba ayrılır. Yaygın görülen G1P[8], G3P[8], G4P[8] ve
G9P[8] genotipleri altgrup II, G2P[4] ise altgrup I‟de yer almaktadır (16). Dünya
genelinde dolaĢan rotavirüslerde büyük çeĢitlilik gözlenir. Ġnsanda hastalığa en
sık sebep olan tipler ülkeden ülkeye ve yıldan yıla değiĢmektedir (14). Ancak,
genellikle rotavirüs genotipleriyle hastalığın Ģiddeti arasında iliĢki yoktur (6).
Sayfa 4 / 13
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / V-MT-04 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Viroloji
Rotavirüs
Laboratuvar tanısı
Rotavirüs enfeksiyonunda –hastalığın diğer patojenlere bağlı ishallerden klinik
olarak ayrılması mümkün olmadığı için- tanı mikrobiyolojik inceleme ile konabilir.
Ancak vakalarda standart yaklaĢım rehidratasyon ve destekleyici tedavi olduğu
için ve tanı bu tedaviyi değiĢtirmeyeceği için mikrobiyolojik tanı çoğu durumda
gerekli değildir. Laboratuvar tanısı esasen güvenilir bir sürveyans için gerekir.
Bütün vakaların değil, ama epidemiyolojik veri toplamak için yeterli sayıda
vakanın tanısı hedeflenebilir. Ayrıca uzamıĢ ishalli komplike vakalarda ve immün
sistem yetmezliği olan konaklarda ayırıcı tanı için laboratuvar doğrulaması
amacıyla test edilebilir. Tanı klinikte gereksiz antibiyotik tedavilerinin kullanımını
da önler (1,2).
Rotavirüs ishalli çocukların dıĢkısı ile yüksek miktarlarda atıldığından tanı için
dıĢkı örneği tercih edilir. Tanıda öncelikle baĢvurulan yöntemler antijenik
yapıları saptamaya dayalı testlerdir. Virüsün görülmesi (elektron mikroskopi),
hücre kültürlerinden üretilmesi veya genetik materyalinin saptanmasına (PAGE,
nükleik asit hibridizasyonu, sekans analizi vb.) dayalı yöntemler ise daha ziyade
araĢtırma ve referans laboratuvarlarında kullanılırlar.
Antijen saptama
Enfeksiyonun baĢlangıcından itibaren yedi gün içinde dıĢkıda antijen saptanabilir.
Bu amaçla üç yöntem; EIA, lateks aglütinasyon ve ICT kullanılır (16). DıĢkıda
rotavirüs antijenlerinin tespiti için en yaygın kullanılan yöntem, tüm Grup A
rotavirüsler için ortak bir antijene yönelik bir EIA‟dir. Ucuz, kullanımı kolay, hızlı
ve yüksek duyarlılıkta (%90-100) olmaları nedeniyle hem rotavirüs sürveyansı
hem de klinik tanı için uygun çeĢitli ticari EIA kitleri mevcuttur. Lateks
aglütinasyon daha az duyarlı ve özgül olmakla birlikte bazı laboratuvarlarda
tercih edilmektedir (1).
Moleküler teknikler ve diğer ileri yöntemler
Ġshalli çocukların dıĢkılarında rotavirus çok büyük miktarlarda bulunduğundan,
ekstraksiyonu takiben nükleik asit segmentleri doğrudan akrilamid jelde
elektroforez uygulanarak ve gümüĢ nitrat ile boyanarak gösterilebilirler. Bu
teknik (PAGE) EIA kadar duyarlıdır. PAGE ile insan rotavirüs grup A, B ve C‟nin
ayrımı da yapılabilir. Ancak PAGE zahmetli bir tekniktir ve rutin kullanıma uygun
değildir (16).
RT-PCR dıĢkıda çok az sayıda rotavirüsü bile saptayabilecek derecede yüksek
duyarlılıktadır. Yüksek duyarlılığı nedeniyle -düĢük viral yükte bile pozitif sonuç
elde edilebildiği ve gerçekte semptomlardan baĢka bir patojenin sorumlu olduğu
durumda da yanlıĢlıkla rotavirus enfeksiyonu Ģeklinde tanı konmasına neden
olabildikleri için- RT-PCR ve gerçek zamanlı RT-PCR tanı testi olarak önerilmez
(16,17). RT-PCR daha ziyade, gastrointestinal sistem dıĢı örneklerde rotavirüsün
gösterilmesinde, suĢ genotiplerinin belirlenmesinde ve ileri analizler için
kullanılmaktadır.
Rotavirüs serotipleri EIA ve RT-PCR kullanılarak doğrudan rotavirüs pozitif dıĢkı
örneklerinden tespit edilebilir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Viroloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / V-MT-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 13
Rotavirüs
Monoklonal antikor tabanlı EIA teknikleri dünya genelinde en yaygın olan,
dolaĢan kökenlerin >%90‟ını temsil eden ve aĢı bileĢiminin 4/5‟ünü oluĢturan
dört serotipin (G1-G4) tanımlanmasında çok değerlidir.
Yakın zamanlarda, temsili serotipler için moleküler yöntemler (özellikle
multipleks, semi-nested RT-PCR genotiplendirme ve sekanslama) geliĢtirilmiĢ ve
en sık görülen rotavirüs serotipleri ile birçok nadir G ve P genotiplerini
tanımlamak üzere yaygın kullanılır hale gelmiĢtir (1).
Nükleotid sekanslama daha ziyade RT-PCR genotiplemesinde tespit edilemeyen
nadir suĢları ve genetik varyantları belirlemek için ve ayrıca genotiplendirme
sonuçlarını teyit etmek için kullanılmaktadır (1).
Elektron mikroskopi yüksek düzeyde özgüldür. Duyarlılığı da bazı EIA testleri
kadar iyidir. Ancak yoğun iĢ yükü ve çok pahalı donanım gerektirmesi nedeniyle
rutin kullanılamaz. Rotavirüsler arasında ayrım yapmaya da elveriĢli değildir (16).
Rotavirüsler MA104 ve primer Afrika yeĢil maymun böbrek hücre kültürlerinde
üretilebilmektedir. Hücre kültürünün duyarlılığı oldukça düĢüktür ve rutin tanıda
kullanıma uygun değildir (16).
Rotavirüs antijenleri, hastalık baĢladıktan 3-7 gün sonra serumda da saptanabilir.
Fakat rutin tanı testleri primer olarak serumda antijen araĢtırılmasına yönelik
değildir (12).
Teknik Bilgiler
1 Hedef mikroorganizma(lar)
Rotavirüs
2 Tanı için asgari laboratuvar koĢulları
2.1. Laboratuvar güvenliği
Rotavirüsler Risk Grubu 2 mikroorganizmalardır ve bu organizmalarla ilgili
iĢlemler asgari BGD2 laboratuvar Ģartlarında gerçekleĢtirilmelidir. Bütün klinik
örnekler enfeksiyöz kabul edilmeli, daima standart önlemler uygulanmalı,
önlemler risk değerlendirmesi ile de desteklenmelidir. Aerosol oluĢturması
muhtemel tüm laboratuvar çalıĢmaları bir biyolojik güvenlik kabini içinde
yapılmalıdır (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar Güvenliği Rehberi”).
2.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS‟yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) yöntem(ler)i uygulamadan önce,
amaçlanan kullanım ile ilgili eğitim almıĢ olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle
aĢina olmalı, ve; (iii) daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
Hem güvenlik önlemlerine uyumun sağlanmasından hem de testlerin standart
prosedürlere uygun yapılmasından ve tanının doğruluğu ve güvenilirliğinden
Mikrobiyoloji Uzmanı sorumludur.
Sayfa 6 / 13
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / V-MT-04 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Viroloji
Rotavirüs
2.3. Örnek, Reaktif, Kit, Donanım
İnceleme örneği (16)

DıĢkı örneği ve kusmuk – DıĢkı öncelikle tercih edilir. Akut gastroenterit nedeniyle hastanede yatan ve/veya acilde gözlem altında
tutulan 0-59 aylık çocuklardan ilk muayenede 1-2 mL ya da 1-2 g dıĢkı
örneği alınmalıdır.

Bezli çocuklarda bez ters bağlanarak spatula ile dıĢkı örneği alınabilir.

Seçilecek inceleme örnekleri, özellikleri, alınması ve gönderilmesi ile
ilgili bilgi için ayrıca bkz. “BulaĢıcı Hastalıkların Laboratuvar Tanısı için
Saha Rehberi”
Örnek ret kriterleri

Pamuk uçlu veya tahta saplı eküvyon ile alınmıĢ; uygun örnek kabına
konmamıĢ; kabının dıĢına sızmıĢ; önerilen süre içerisinde ve uygun
sıcaklıkta gönderilmemiĢ; kabının üzerinde hasta ve örnek bilgileri
yazılı olmayan; hastaya ait uygun bir istek formu düzenlenmemiĢ
örnekler laboratuvara kabul edilmez.

Biyolojik materyal taĢıma Ģartlarına uygun (18) gönderilmemiĢ
örnekler laboratuvara kabul edilmez.

5 yaĢ üzeri çocuklardan alınan örnekler veya uzamıĢ (≥14 gün)
diyaresi olan ya da baĢka bir nedenle hastaneye yatırılan hastalardan
(ishal varlığına rağmen) alınan örnekler veya hastaneye baĢvurduktan
48 saat sonra alınan örnekler rotavirüs incelemesi için laboratuvara
kabul edilmez.
Reaktif / Kit

EIA/ELISA kitleri

Lateks aglütinasyon test kitleri

ICT kitleri

RNA ekstraksiyon ve RT-PCR kiti
Diğer gereç, donanım
EIA için;

ELISA okuyucu, yıkayıcı

Ayarlanabilir otomatik mikropipetler (5-1000 µl) ve pipet uçları
PCR ve diğer moleküler testler için;

En az üç ayrı oda - Nükleik asit ekstraksiyonu, PCR karıĢımının
hazırlanması, amplifikasyonun ve sonuç gözetiminin yapılabileceği ayrı
odalar. Ġdeal olarak PCR karıĢımı hazırlama odası (temiz oda) pozitif
basınçlı, agaroz jel elektroforezi yapılan oda (kirli oda) negatif basınçlı
havalandırmaya sahip olmalıdır.

Donanım – biyogüvenlik kabini, soğutmalı mikrosantrifüj, hassas terazi,
vorteks, su banyosu, yatay çalkalayıcı, PCR ısı döngü cihazı,
mikrodalga fırın, jel görüntüleme sistemi, elektroforez ünitesi vb.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Viroloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / V-MT-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 13
Rotavirüs
2.4. Kalite kontrol

Referans laboratuvarlardan sağlanan rotavirüs pozitif ve negatif
standartlar (dıĢ kalite kontrol örnekleri) testlerde kontrol örneği olarak
kullanılmalıdır.

Her testte klinik örneklerin yanında pozitif ve negatif kontroller de
çalıĢılmalıdır.

Laboratuvarlar, belirli aralıklarla pozitif buldukları dıĢkı örneklerini
referans laboratuvara göndererek kendilerini kontrol etmelidir (16).
3 Rotavirüs tanısında kullanılan teknikler
Akut gastroenteritli çocukların dıĢkılarında yüksek miktarda virüs bulunması
nedeniyle laboratuvar tanı yöntemlerinin çoğu ile pozitif sonuç
alınabilmektedir.
Testlere geçilmeden önce örnekler ön hazırlık aĢamasından geçirilir.
3.1. Ön hazırlık iĢlemleri16

Santrifüj tüpüne sırasıyla 5 adet cam boncuk, 0.5 mL kloroform, 10 mL
PBS dağıtılır.

Her dıĢkı örneğinden yaklaĢık 2 g santrifüj tüpüne aktarılır.

Santrifüj tüpünün ağzı sıkıca kapatıldıktan sonra vortekslenir, tüpteki
dıĢkı parçalanıncaya kadar karıĢtırılır.

Örnek tüpü, soğutmalı santrifüjde (4°C) 3500 rpm‟de 20 dk santrifüj
edilir. Süpernatan berrak değilse kloroform muamelesi tekrarlanır.

Süpernatan antijen saptama veya moleküler çalıĢmalar için kullanılır.
3.2. Antijen saptama teknikleri

Enfeksiyonun baĢlangıcından itibaren yedi gün içinde dışkıda antijen
saptanabilir.

Bu amaçla EIA, lateks aglütinasyon ve ICT kullanılabilir (bkz. ġekil 1)
EIA

EIA, özgüllük ve duyarlılığının yüksek (≥%95) olması nedeniyle
rotavirüslerin laboratuvar tanısında en yaygın kullanılan yöntemdir.

Diğer antijen arama testleri lateks aglütinasyon veya ICT ile negatif
bulunan örnekler gerek görülüyorsa EIA ile de test edilmelidir .

EIA kitlerinin bazıları monoklonal antikor ile hazırlanmıĢken (ör.,
Rotaclone ve Pathfinder Rotavirus), diğerleri poliklonal antikor
bazlıdır (ör., Rotavirus Immunoassay, Rotazyme II, ve Wellcozyme
Rotavirus) (19). Monoklonal antikor içeren testlerin duyarlılığı oldukça
yüksek (%100), poliklonal antikor bazlı testlerin duyarlılığı %90‟dan
fazla fakat özgüllükleri değiĢkendir. Rotazyme II‟nin özgüllüğü %50‟ye
kadar inmektedir (19).
Sayfa 8 / 13
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / V-MT-04 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Viroloji
Rotavirüs

DSÖ, sürveyans çalıĢmalarında kullanılabilecek iki ticari EIA kitini
önermektedir. Bunlar “PremierTM Rotaclone” (Meridian Biosciences;
Cincinnati, Ohio) ve “IDEIATM Rotavirüs” (Oxoid (Ely) Limited Thermo
Fisher Scientific, Cambridgeshire, United Kingdom) kitleridir (16).
Lateks aglütinasyon testleri

Grup A rotavirüs enfeksiyonlarının tanısında kullanılan pratik ve
maliyet etkin testlerdir (16).

Özgüllükleri genellikle yüksektir (%82-99) (20,21). Hasta kaynaklı özel
durumlar hariç hatalı pozitif sonuçlar beklenmemektedir.

Duyarlılıkları (%68-83) PCR‟dan düĢük, elektron mikroskopiden yüksek,
EIA‟ye eĢit veya ondan biraz daha azdır (20-22).

Dört ticari lateks aglütinasyon testinin (Rotastat, Virogen Rotatest,
Meritec-Rotavirus, ve Wellcome Latex Test) duyarlılıkları %70-90,
özgüllükleri %80-100 arasında değiĢmektedir (19).
İmmünokomotografik testler (ICT)

Nispeten ucuz, kullanımı kolay „dip-stick‟ tarzı testlerdir. ġeritler
üzerinde VP6‟ya karĢı hazırlanmıĢ monoklonal antikor içerirler.

Bu kitlerin (IP-Rota V, Dipstick Eiken ROTA, ROTA-ADENO, ASAN Easy
Test Rota Strip ), RT-PCR ile karĢılaĢtırıldığında duyarlılık (%87-100)
ve özgüllükleri (%88-100) oldukça yüksektir (20, 23).
3.3. Moleküler teknikler

Klinik örnekte rotavirüs saptamak amacıyla geliĢtirilmiĢ olan RT-PCR
uygulamalarında virüsün VP6 iç kapsit proteinini kodlayan gen hedef
alınmaktadır.

RT-PCR; rotavirüslerin saptanmasında duyarlılığı en yüksek olan
yöntemdir. Mevcut kitlerin çoğu serogrup A rotavirüsü saptamaya
yöneliktir. Gerçek zamanlı RT-PCR kullanıldığında duyarlılık 2-4 log
daha da artmaktadır (16). Ancak, RT-PCR tanı testi olarak önerilmez.
Nedeni yüksek duyarlılığıdır; çok düĢük viral yükte bile pozitif sonuç
verir; gerçekte semptomlardan baĢka bir patojen sorumlu olduğu
halde tanının hatalı olarak rotavirüs enfeksiyonu Ģeklinde konmasına
yol açabilir (16,17).

Genotiplerin belirlenmesi için PCR uygulamasının ilk aĢamasında yaygın
insan P ve G genotiplerini saptayacak konsensus primerler, ikinci
aĢamada VP7 (G genotipler) ve VP4 (P genotipler) içerisindeki
genotiplere spesifik primerlerin kullanıldığı kısmi-nested multipleks PCR
uygulanmaktadır.

PCR yöntemiyle genotipleri belirlenemeyen örnekler, nükleik asit dizi
analiz iĢlemine alınır (16,24).
3.4. Saklama, Referans merkeze gönderme

DıĢkı örnekleri antijen taraması yapılana kadar (en fazla 7 gün)
+4°C‟de tutulabilir. Daha uzun süre için örnekler -80°C‟ye kaldırılır ve
bu süreçte dondurma ve çözme iĢlemi yapılmaz (16).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Viroloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / V-MT-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 9 / 13
Rotavirüs

Derin dondurucuda saklanan örneğe eğer birden fazla kez
baĢvurulacaksa dondurma-çözme iĢleminden kaçınmak için orijinal
örnek vida kapaklı tüplere alikotlar halinde bölünmeli, üzerlerine hasta
bilgileri de yazılarak dondurucuya kaldırılmalıdır.

Ġdeal olan, dıĢkı örneğine, alındığı yerde yukarıda “4.1 Ön hazırlık
iĢlemleri” baĢlığı altında anlatılan iĢlemlerin uygulanması ve elde edilen
süpernatanın 1-2 mL‟sinin laboratuvara gönderilmesi veya
saklanmasıdır. Bu süpernatan bir haftaya kadar buzdolabında
tutulabilir; daha uzun süreli saklama gereksinimi için küçük (0.5 mL)
alikotlar (en az 3 alikot) halinde derin dondurucuya (-80°C) kaldırılır.

Antijen pozitif olan örnekler moleküler analizler için Ulusal Referans
Merkez Laboratuarına gönderilir.

Örneklerin gönderilmesinde paketleme ve taşıma biyolojik materyal
taĢıma kurallarına uygun olmalıdır (18) (ayrıca bkz. UMS GEN-OY-01
Enfeksiyöz Maddelerin TaĢınması Rehberi).
4 Test sonuçlarının yorumu, raporlama, bildirim

Rotavirüs enfeksiyonu tanısı için direkt viral antijen arama yöntemleri
ile pozitif sonuç – “kesin tanı” bulgusudur.

Rotavirüs tanısı için nükleik asit amplifikasyon (RT-PCR veya gerçek
zamanlı RT-PCR) veya nükleik asit saptama (PAGE) yöntemleri ile
pozitif sonuç – “kesin tanı” bulgusudur.

Antijen arama testi sonucu örneği gönderen klinisyene / merkeze en
kısa sürede (örnek laboratuvara geldiğinden itibaren 24 saat) içinde
rapor edilmelidir.

Genotiplendirme ve moleküler çalıĢmaların sonuçları testi talep eden
hekime ve/veya laboratuvara bildirilir.
5 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Uygun zamanda alınmayan örneklerde pozitif sonuç alınmasında sorun
yaĢanabilir. Örnek alınmasında, taĢınmasında ve saklanmasında
önerilen Ģartlara uyulmaması da hatalı pozitif ve negatif sonuçlara
neden olabilir.

Viral kültür veya moleküler testler için örnek alırken her zaman
sentetik (dakron ya da rayon uçlu) eküvyonlar tercih edilmelidir.
Kalsiyum aljinatlı, pamuklu ve ahĢap saplı eküvyon kullanılmamalıdır.
Virüsler inaktive olabilir, PCR‟da inhibitör etki yapabilirler.

Lateks aglütinasyon testlerinin nispeten düĢük olan duyarlılıklarından
kaynaklanan hatalı negatiflikler ve nadiren de hatalı pozitiflikler
olabilir. Benzer sorunlar daha düĢük olmakla birlikte ICT‟lerde de
yaĢanmaktadır. Bu kitlerden alınmıĢ beklenmedik test sonuçlarının EIA
testleriyle doğrulanması önerilir.
Sayfa 10 / 13
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / V-MT-04 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Viroloji
Rotavirüs
6 Rotavirüs tanısı için akıĢ Ģeması
Rotavirüs enfeksiyonu Ģüphesinde kullanılan tanı yöntemleri ve karar adımları
ġekil 1‟de özetlenmiĢtir.
Örnek (dıĢkı, kusmuk vb.)
(uygun miktar ve kalitede alınmıĢ;
besiyeri, koruyucu vb. içermeyen)
Mikroskopik inceleme
Patolojik bulgular (eritrosit,
lökosit varlığı vb.) için
Negatif
Rotavirüs Antijen Testi
(EIA / Lateks aglütinasyon* / ICT*)
(üreticinin talimatı takip edilir)
ġüpheli pozitif
Diğer patojenler
yönünden inceleme
önerilir
Pozitif
Rotavirus
enfeksiyonu
Epidemiyolojik
amaçlar için
(KESĠN TANI)
Örneği Referans
Laboratuvara
gönder
klinisyene
rapor et!
örneği gönderen
laboratuvara
rapor et!
Pozitif
RNA-PAGE
gerçek zamanlı RT-PCR
VP7 (G) ve VP4 (P) spesifik primerler ile RT-PCR
Kısmi-nested-multipleks PCR
Filogenetik
analizler
G ve P tiplendirme
Tiplendirilemeyen virüslerin
VP7 ve VP4 genlerinin
sekanslanması
opsiyonel
* bu testler ile sonuç negatif bulunmuĢ ancak rotavirüs enfeksiyonu
Ģüphesi devam ediyorsa EIA ile doğrulanmalıdır.
Şekil 1. Rotavirus enfeksiyonu Ģüpheli vakaların tanısı için önerilen akıĢ Ģeması. Klinik
mikrobiyoloji laboratuvarlarında rotavirüs antijen testleri kullanılır. Tanı daha ziyade
sürveyans amaçları için olup gerektiğinde nükleik asit analizleri ve moleküler tiplendirme
çalıĢmaları ile desteklenir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Viroloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / V-MT-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 11 / 13
Rotavirüs
İlgili diğer UMS belgeleri
Bu prosedür belgesi (Rotavirüs Enfeksiyonunun Mikrobiyolojik Tanısı) ayrıca
aĢağıda listelenen UMS belgeleriyle de ilgilidir ve ilave bilgi için bu belgelere de
bakılması önerilir:
UMS, V-MT-03
Norovirüs enfeksiyonunun mikrobiyolojik tanısı
UMS, GEN-OY-01
Enfeksiyöz maddelerin taĢınması rehberi
Kaynaklar
1
Payne DC, Wikswo M, Parashar UD. Chapter 13: Rotavirus. VPD Surveillance Manual, 5th ed,
Center for Diseases Control and Prevention (CDC). 2011.
http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/surv-manual/chpt13-rotavirus.pdf (son eriĢim tarihi:
04.01.2014)
2
Dormitzer PR. Rotaviruses. Chapter 146.In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds). Principles
and Practice of Infectious Diseases. 6th ed. Churchill Livingstone. 2005.
3
BulaĢıcı Hastalıklar Sürveyans ve Kontrol Esasları Yönetmeliğinde DeğiĢiklik Yapılmasına Dair
Yönetmelik. Resmi Gazete; 02.04.2011 – 27893.
http://www.resmigazete.gov.tr/eskiler/2011/04/20110402-3.htm (son eriĢim tarihi:
06.01.2014).
4
World Health Organization. International travel and health. Rotavirus.
http://www.who.int/ith/diseases/rotavirus/en/ (son eriĢim tarihi: 15.12.2013).
5
Tate JE, Burton AH, Boschi-Pinto C, et al. 2008 estimate of worldwide rotavirus-associated
mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus
vaccination programmes: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis
2012;12(2):136-41.
6
WHO. Rotavirus vaccines WHO position paper-January 2013. Wkly Epidemiol Rec
2013;88(5):49-64.
7
El Khoury AC, Mast TC, Ciarlet M, Markson LE, Goveia MG. Projecting the effectiveness of
RotaTeq® against rotavirus-related hospitalizations and deaths in six Asian countries. Hum
Vaccin 2011;7(5):506-10.
8
Martinón-Torres F, Bouzón Alejandro M, Redondo Collazo L, Sánchez Lastres JM, Pértega Díaz S,
Seoane Pillado MT, Martinón Sánchez JM; ROTACOST research team. Effectivenes of rotavirus
vaccination in Spain. Hum Vaccin 2011;7(7):757-61
9
Goldman RD. Effectiveness of rotavirus vaccine in preventing severe acute gastroenteritis in
children. Can Fam Physician 2012;58(3):270-1.
10
Butz AM, Fosarelli P, Kick J, Yolken R. Prevalence of rotavirus on high-risk fomites in daycare
facilities. Pediatrics 1993;92:202–5.
11 Dennehy PH, Nelson SM, Crowley BA, Saracen CL. Detection of rotavirus RNA in hospital air
samples by polymerase chain reaction (PCR). Pediatr Res 1998;43:143A.
12 CDC. Rotavirus. http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/rota.html#diagnosis. (son eriĢim
tarihi: 15.12.2013)
13 Patton JT. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discov Med.
2012;13(68):85-97.
14 Kirkwood CD. Genetic and antigenic diversity of human rotaviruses: potential impact on
vaccination programs. J Infect Dis 2010;202(Suppl:S43-8).
Sayfa 12 / 13
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / V-MT-04 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Viroloji
Rotavirüs
15 Matthijnssens J, Heylen E, Zeller M, Rahman M, Lemey P, Van Ranst M. Phylodynamic analyses
of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread. Mol Biol
Evol 2010;27(10):2431-6.
16 WHO. Manual of rotavirus detection and characterization methods.
http://whqlibdoc.who.int/hq/2008/who_ivb_08.17_eng.pdf (son eriĢim tarihi: 15.12.2013).
17 WHO. Generic protocol for monitoring impact of rotavirus vaccination on gastroenteritis disease
burden and viral strains. http://whqlibdoc.who.int/hq/2008/WHO_IVB_08.16_eng.pdf (son
eriĢim tarihi: 15.12.2013).
18 Enfeksiyöz madde ile enfeksiyöz tanı ve klinik örneği taĢıma yönetmeliği. Sağlık Bakanlığı,
Ankara. Resmi Gazete 25.09.2010 – 27710.
19 Dennehy PH, Gauntlett DR, Tente WE. Comparison of nine commercial immunoassays for the
detection of rotavirus in fecal specimens. J Clin Microbiol 1988;26(9):1630-4.
20 Wilhelmi I, Colomina J, Martin-Rodrigo D, Roman E, Sanchez-Fauquier A. New
immunochromatographic method for rapid detection of rotaviruses in stool samples compared
with standard enzyme immunoassay and latex agglutination techniques. Eur J Clin Microbiol
Infect Dis 2001;20:741-3.
21 Pereira LA, Raboni SM, Nogueira MB, Vidal LR, Almeida SM, Debur MC, Cruz C. Rotavirus
infection in a tertiary hospital: laboratory diagnosis and impact of immunization on pediatric
hospitalization. Braz J Infect Dis 2011;15(3):215-9.
22 Lee SY, Hong JH, Lee SW, Lee M. Comparisons of latex agglutination, immunochromatography
and enzyme immunoassay methods for the detection of rotavirus antigen. Korean J Lab Med
2007;27(6):437-41.
23 Khamrin P, Tran DN, Chan-it W, Thongprachum A, Okitsu S, Maneekarn N, Ushijima H.
Comparison of the rapid methods for screening of group a rotavirus in stool samples. J Trop
Pediatr 2011;57(5):375-7.
24 Iturriza-Gomara M, Kang G, Gray J. Rotavirus genotyping: keeping up with an evolving
population of human rotaviruses. J Clin Microbiol 2004;31:259-265.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Viroloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / V-MT-04 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 13 / 13
Download

Rotavirus enfeksiyonu - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu