V. Víglaský, Š.
. Pristaš a P. Javorský
Praktikum z biochémie nukleových kyselín
3. Izolácia chromozómovej DNA
Izolácia nukleových kyselín patrí medzi ! postupy v biochemickom
výskume. S rozvojom génového "$#%"$#"'&)(+*-,/.0 sa tieto postupy podrobnejšie rozpracovali so
špecifickým zameraním na jednotlivé druhy nukleových kyselín. Nukleové kyseliny sa
v 123456 organizmoch 798;:9<>=?9<@/ABCD:E F GHJI výnimku tvoria KMLNOQPSRTK)U9V tRNA), ale vo forme
komplexov s bielkovinami, ktoré sú KNWO-PXRZYV[ \^] stabilné.
Základným problémom pri izolácii nukleových kyselín je práve odstránenie proteínov
a polysacharidov takým spôsobom, aby sa neporušila primárna a sekundárna štruktúra
nukleových kyselín. Treba _`9a9bc;_d9e f gihj prakticky neexistuje ideálna metóda na riešenie
uvedeného problému. Preto sa vypracovali viaceré k$lmn$opqr postupy, ktoré sú vhodné pre
jednotlivé druhy nukleových kyselín (tRNA, mRNA, chromozómovej DNA, plazmidová
DNA, mtDNA).
Pri izolácii nukleových kyselín je v prvom rade stu!vwx9yz|{9}t~ y9€ bunkový obsah
rozrušením bunkovej steny ‚$t9ƒwyw„
s9vw;}…;ƒy9w
†
polysacharidov a
cytoplazmatickej
membrány tvorenej fosfolipidmi a bielkovinami. V princípe je ‡ˆtƒ né navodi€ degradáciu
bunkovej steny pôsobením rôznych fyzikálno-chemických a enzymatických metód.
Fyzikálnymi metódami sú napríklad: mechanické drvenie a trenie buniek, opakované
zmrazovanie a rozmrazovanie buniek, t9;}‰{‹Šw;y9!w ultrazvukom (pri izoláciách nukleových
kyselín však ‡Œƒw Ž9;‘’Ž“”–• k ich degradácii).
Chemickú degradáciu bunkovej steny je —˜9™š9› Ž9>œ$”‘9šWž• pomocou detergentov ako
sú: dodecylsulfát sodný (SDS), Triton X-100, pomocou organických Ÿ“ ¡£¢-•M”Ž!¤¥!¦ ktoré
Ÿ9“ ¡£¢Q•”§-¡
molekuly lipidového charakteru ako fenol, chloroform alebo roztokov s rôznou
hodnotou pH a koncentráciou solí.
¨©;ª9«¬­9¬®)¯°
µˆ¶·¸¹º»¼½¶¾¿·ÀÁ!¿
±‹®²$¯9³9´
na membrány sa zvyšuje pôsobením špecifických enzýmov.
enzýmy sú napríklad u baktérií lyzozým, u kvasiniek komplex enzýmov
z hepatopankreasu slimáka záhradného a u rastlín celulázy.
Za ur Â
ÁÄÃ-ÅÆÇ
podmienok je È
¹»¾9É
bunkový
¹Ê>˶Ç̺9½¹T;9ÁÎ
pôsobením SDS, Â
Á
fenolu.
¹ÐË/ÃS¶ º ·-ыÆÁ
¹»Ô¶
Â
Tento spôsob je Ï
hlavne u buniek, ktorým chýba polysacharidová ÒWÓ
bunkovej
steny napr.
˶
È
¹½¹Í+¾9¿
pri gramnegatívnych baktériách. Po narušení steny vzniknuté protoplasty
praskajú
¸¹9Ô9Á$¶Í
nie sú osmoticky stabilizované.
Zvyšky materiálu z bunkovej steny a ÕÖW×ØÙ'Ú agregáty molekúl a subcelulárnych ×ÛÜ-ÝQÞ!ß
je à˜á9âã9ä áTå9å9Ú)æçÙè centrifugáciou. éˆÛêÕÖ×WØÙ!Ú problémy vznikajú pri áTå9å9ÚëáÕÛ)ã9Þ biopolymérov,
© Prírodovedecká fakulta UPJŠ, 2000
8
V. Víglaský, Š. ìí îïðñò . Pristaš a P. Javorský
Praktikum z biochémie nukleových kyselín
ÿ
9ó slabých väzieb.
hlavne RNA a bielkovín, ktoré ó˜ôõ)ö ÷9øù s DNA viazané úûü+ý9þó takýchto !#"%$&(')"* zvýšenie iónovej sily roztoku a rôzne
,
detergenty spomenuté vyššie. Odstránenie bielkovín sa )+
')"* +" - 0. /21/4365478/9 ktoré
majú 3:;<>=@?A:B/C1/2DE7.1!F G%./21=HJI denaturujú a D<>KLM7ONPG bielkoviny), napr. fenol, chloroform
alebo degradáciou bielkovín na nízkomolekulárne podjednotky nešpecifickými proteázami,
napr. pronáza a proteináza K. Rýchla denaturácia bielkovín ?/2:L napomáha odstránenie
1(:[email protected]/4RT enzýmových aktivít. [email protected][\^]`_ba
cd\M[ ef!g degradovaná rôznymi RN-ázami,
napr. RN-ázou I. Denaturované agregáty sa h6ijg
klf(mVon>p[
hrqrsYut>V vMwxy
centrifugáciou.
Nízkomolekulárne komponenty sú naopak rozpustné a na rozdiel od DNA sa z({|}>~0€xOy
etanolom.
Hlavnou ‚}>{Bƒ~ƒ„!w pri izolácii nukleových kyselín je pomerne vysoká aktivita nukleáz
v bunkách. V neporušenej bunke je …†‡!ˆ>‰2z€ nukleáz lokalizovaná v lyzozómoch a len pri
homogenizácii, ƒ{QŠ sa poruší štruktúra bunky, nukleázy prechádzajú do roztoku. V priebehu
celeho ‰‹|M„rŒ€‡ ného
postupu je preto potrebné w%Ž!}OM‰2€…%€)
k degradácii DNA
prítomnými DN-ázami.
také podmienky, aby nedošlo
RN-ázy patria medzi termostabilné enzýmy
a majú široké optimum pH. Preto ‚([email protected]{z‰{ ich aktivity je niekedy problematické (hlavne pri
izolácii RNA). Medzi inhibítory nukleáz, ktoré sa [email protected] [email protected]“‹…6€xOy pri ‰2|M„Œ€Q‡0z!”6•– technikách
na stabilizáciu izolovaných nukleových kyselín patria hlavne:
a) Bentonit: y%‡B‰Czz!”—‰2z–‰‹˜™“šA„}
ribonukleáz z ›>œž!Ÿ( 0¡¢0£!›>¤¥>¤!¦S§©¨bªO¥>«ª!¬­A®¥°¯>±®²¬ª´³¤!µ¶M·‹¦ª
v koncentrácii asi 10 mg/ml.
b) Dietylpyrokarbonát: (DEPC, C2H5–O–CO–O–CO-C2H5 ¸º¹>» ¼%½¾2¿¿!ÀÁ
¾2¿Â¾ÃÄÆÅAÇ6È>ÇÁ
É>ʋËÌÍ@ÎÏÐ4ÑÒÓÔÖÕ×Ñ0Ø(Ì Ù%ÚÊ2ÍÌÏ Û>Ü ÓMÜ ÏÐ2ÜÝÒ ÍÜ ÞÌÝ6Ê2ßOÊ2ÏÒàÊ4Ê#ÜÏ!áAâ‹ãÍÑØÌ àÑÍMáÉ>Ü ÑÍ!Óä(ÞåÎæÔ
V ÍÊÑBÏ!áAÌ6ÉPä(àØèçÉ>â‹çÜÝÌàØéØ(Ìêã™ë>ÜBÏìÍÑ0ÞåÌ6íMÍÌìçÌ!Îíʋî0ïðЍÑQË6ÌñÞÌÝ6Ê2ßÊ2Ï!Îò°Ñ^ÜOòóÛ>ÜÞÌ!áÍô^Í@ÎÏÐ4ÑÌ!ãô
kyseliny. Pri práci s õöW÷ùøûú>üþýþÿæú4ü
Mü™úú
"!$#%ü'&(
ú$!$
toxická a karcinogénna.
c) Heparín: v koncentrácii 50
ako 95%.
) *+,.-0/12'354/-$6354879:<;>[email protected](48CD32FE2G3HA
[email protected](CN=12$4ODCE6QPRES=TUVCO6Q,
ribonukleáz o viac
?CML
E6BAWEXLY6DZ\[4?]AJ^R_`4T6a6QOQLH31bc?4?2d4
z roztoku nukleových kyselín je problematické, a preto takto izolované nukleové kyseliny
?S4 ,e6@][email protected]?C/1`^g/1
2 1Y4gL31
2hDi ?4
BjC?C-$k=l4^
d) Prirodzené inhibítory nukleáz: patria medzi glykoproteíny a inhibujú nešpecificky.
mnopVqrsQtMuSqwvxzys{|~}ug€w(‚v„ƒq{†…$}o‡sS€ˆ]…G‰5…$Šs‹t†]rn]uŒ
e) Polyamidy: spermidín a putrescín inhibujú ribonukleázovú a deoxyribonukleázovú
aktivitu.
© Prírodovedecká fakulta UPJŠ, 2000
9
V. Víglaský, Š. Ž (‘
’F“
” . Pristaš a P. Javorský
f) Aniónové detergenty:
aktivitu a
napr. SDS, inhibujú ribonukleázovú a deoxyribonukleázovú
•–z—˜•™Sšœ›]˜žŸ$— $¡¢£
–
º» §¼¤½¾„¿ » ¤©¦
nízku cenu a
g)
ÄÅÆJÇÉÈËÊVÌÅÍ$ÎÅÏ<ÐÑÓÒÔ¼ÐÔ$Õȼք×
÷ÝäGõÞú.âÞñû
prídavkom
disociáciu
¤g¥¦§d¨©ª«©S¬¨­$¤©®¯°©M¦©±ª§d¨²l¥J³Š´"µ°¶V·¸©Q±¹¤·
º ·Àª©¥Á­F®·
Â
¾Ã®¨¶±
ÜëÞßÛÝáFìÞâgíîãËë]ïðòñáJâêÃñ
óÞôYëeîêVõ5ê ãFÛ]õ5áËàcîöe÷øñÞìëcâáËëóÛù]êÜgíô(ë
üýþVÿeþ
SþSý 2+
þ
» ¿· º ¬5©„³
napr. citrát sodný, EDTA (etylén-diamino-tetraoctová kyselina),
ØlÙÚÛÜÝÞßÛàÚá$âÞãËä$â„åQæÓçègéá$âê
, Mn2+!
þ"#$
%Fý&('
.þ*)+
ÿ
"*,þý.-
/0$1 þHýþ 23543"*dü* /6
"7]þ / 43
Pri
Praktikum z biochémie nukleových kyselín
technikách musíme
ü2,-
aj na
.þ*)þ8%-
mechanického poškodenia
vysokomolekulárnych nukleových kyselín. Vzniku krátkych fragmentov nukleových kyselín
je
.þ*)92+
kyselín a
7:$, !; *<-
obmedzením prudkého pretrepávania a miešania roztokov nukleových
) ý*= /<> 4
*?"
þ2')
ívania pipiet z úzkymi koncami.
Izolácia DNA z bunkových organel
DNA,
v
þ**
"4þA
*
ý*=2)@ü9'ÿ
podobné postupy ako pri izolácii bunkovej
sa najprv izolujú príslušné organely,
: 4$
þ2,*=24
ÿ
pomocou centrifugácie
gradientoch rôznych látok napr. sacharózy alebo Ficollu.
Princípy izolácie RNA:
Pri génových manipuláciach (
ktorej sa v K
[email protected]$STO*U:V
/(L þA
)
pri RT-PCR, kap.10) sa
kroku syntetizuje DNA. V
predstavuje
,
):
ÿ 0ýM4
WX<YZ[:Z*\^]_"`acbFdHegfihkjla$mnho:p
RNA. Všetky tieto RNA majú
ÿ
4B98Cþ
vychádza z DFEHG
I þü*J.
bunke je napr. asi 10-5 N g RNA.
transferová RNA a rôzne malé jadrové
qr*a$Wakstvu$W%X(wCtvX"q$sxzyu:{|sZ}w~a
je ich
\^Z*m9`€
wu$a$W!Z2ya~
pomocou
gélovej chromatografie, elektroforézy alebo izopyknickej qu`9tW%X"‚(ƒ„]qX0u…†h‡akmˆo:p‰[ celkového
obsahu predstavuje
qX"qa$yMŠŽ0qr
[email protected]{|sZwCtX^yMu{.\HX
buniek majú na 3´ konci poly(A)
heterogénna mRNA. Prakticky všetky mRNA
[:a$sZ*`*Šu`*X0uf [email protected]{ƒBu
ich izoláciu afinitnou
chromatografiou na oligo(dT) celulóze. V mnohých prípadoch sa dá úspešne
Zƒm9X~
i chromatografia na benzoyl alebo naftyl celulóze.
Izolácia mRNA má význam len pri získavaní eukaryotických génov, ktoré majú
mozaikovú štruktúru, kde sa striedajú kódujúce úseky, exóny, s nekódujúcimi úsekmi,
intrónmi. Takto organizované gény by po prenose do baktérií boli
komplementárna len k exónovým sekvenciám.
`u‚‘ƒM`sMŠ3`2€…
Zrelá mRNA je
Proces, ktorým sa intróny vyštepujú
a jednotlivé exóny spojujú, prebieha na RNA z primárneho transkriptu a nazýva sa zostrih
RNA alebo splicing.
© Prírodovedecká fakulta UPJŠ, 2000
10
V. Víglaský, Š. ’B“ ”–•%—<˜%™ . Pristaš a P. Javorský
šœ›ž&Ÿ( ­
¢
¦
¤*©
Ÿ®¯M°
mRNA je
£:«
Praktikum z biochémie nukleových kyselín
ž"¦
¡^¢*£:¤*¥
¢*§"¢¨M©ª
¦
imunoprecipitáciou polyzómov, ktorá je
¡5±A£
bielkoviny vznikajúce na ribozómoch
protilátkami proti kompletnej bielkovine.
ž&Ÿ ž
´
§ ¨¢µ³Cª
¯
›
«©$²¢¨©ª
³!¢
metódy sa ešte zvyšuje pri ­
chromatografie na monoklonálnej protilátke zakotvenej na
ž03ž·
¤*¢³
©§"¢*£:«¤*¬
na
špecifickými
¯
¢
ž&Ÿ¶
£
afinitnej
Pri izolácii špecifických
mRNA sa protilátkou proti bielkovine kódovanou príslušnou mRNA vyzrá£@©%¸
polyzómy,
ktoré ju práve syntetizujú. Z polyzómov sa izoluje RNA, ktorá teoreticky obsahuje len rRNA
a špecifickú mRNA.
¹
alšou
º^»¼B½*»¾C¿3»2À
ÀÁ!Â3ÐÄvÅ!Æ
izolácie
frakcie mRNA je frakcionácia celkovej mRNA
Ç*Å$½*È.Ä(ÀÁÈÂ$½É2ÊË
napr. centrifugáciou v hustotnom gradiente alebo elektroforézou za
Ì3È$Ã(¾C¿kÀƖÅ
podmienok. Frakcia mRNA, ktorá
obohatená
o príslušnú
Ã0º5ÀM½*»*Ô*ÁÅÊÃ<ÔÃ&ÄvȽɺTÃ
Práca s
mRNA.
pri translácii in vitro vznik ur ÂÃ&ÄvÅ%Æ bielkoviny je
Bielkovinné
Â3Ã
technikami, alebo detekciou biochemickej,
natívnymi RNA je omnoho
ÑMՖÈÇ*Å$Ô*ÁÖ&Äv»*ºˆ½2»}¾¿
ºT»¼:½2Í
produkty je
RN-áz. RN-ázy sú prítomné na
»ÒÄÃ"È$¼:½2Å!Æ.ÕÃ0È
Ñ×:Â9ÕÃ"½Å
Ƚ*ÈÎÐÏ2Ì:»ÑÈ¿
Ò*ÀMÓ
biologickej aktivity.
ako s DNA, najmä pre
laboratórneho
¾%Ø*Î0ÈÙÑÅÚ|ØÍ
ºT½*»*¼¾CÄ(Ñ»
je ich na prstoch experimentátorov a nachádzajú sa prakticky vo všetkých biologických
materiáloch. RN-ázy sú navyše vysoko termostabilné a ich kompletná inhibícia je
ako inhibícia DN-áz, ktorým
¾ÄvÈÂÖ »ÇA¾CÄÜÁÛ$½*Ã<¿
prácou s RNA »AÇÔ2»ÁCÝMÂBÈiÑ*ÏÔÈBÚ.»2ÑÈB¿
½Û$Á»Â$½2Å!Æ.ÕÃ0È
dvojmocné katióny. Laboratórne sklo sa pred
hodiny pri 250oC. Z roztokov a materiálu z plastických
Þ
hmôt sa RN-ázy odstránia dietylpyrokarbonátom (DEPC).
Princípy izolácie bakteriálnej DNA:
Na izoláciu bakteriálnych DNA sa
ß*à%á–âàãCävå%á|æç0å
èéêë9ì<íà
metóda, ktorú vypracoval
Marmur, prípadne jej modifikácie. Pri tomto postupe sa bakteriálne bunky opracujú
lyzozýmom pri teplote 37°C v prítomnosti EDTA a 25% roztoku sacharózy,
âç"àãCävéâ$ß2å
sféroplasty, ktoré majú
obsahu je výhodné
èé2êëç<ò
éþîvéô.äé*öêÿãàˆê*íéñ|ß*ç"à
ð
ï*ë:åïTå
ý
vznikajú
zachovanú bunkovú stenu. ðTàcê*íéAñ|ß2å3ß*ç0å cytoplazmatického
neiónové detergenty (Triton X-100, Tween), ktoré nespôsobujú
ã!àóè*îå%áà$íìµí2ôîà9ãävéïõíç(ã%öé*ô:ç&äC÷ùø<÷*ô@àâß*úû*éRîvéô.äé*öêMüAè*îå|äé*ë:å
chromozómové zlomy. Lýza buniek
ý
è*îvç"âéAï
ø"ûúˆíøköAß*ç&ävúlï^éAø0å$öêMøÐ÷2ü í*îävàkß*åRß9êöø‘åBé2í3ûnö*÷ã–åø"ì"ß
iû@îéï5éô*ï^éí
ç"ô:éAø"éíà.ò
è*îç"àï^é
ô
è*îçÐï$îß2å3û2é
ø<÷*ôä(êMü
èî%ç"â
om opakovanou extrakciou
odstránime kontaminujúce bielkoviny. K lyzátu pridáme rovnaký objem zmesi chloroformizoamylalkohol (24:1), miešame asi 20 minút a vodnú fázu oddelíme centrifugáciou.
î$û*ß
íé
ý
ß$ô@à
éãàû:êá–å
è*îåíàkë9ßå
ß9êöø0åéíú
ö÷Mãåø‘ç"ß*÷ü
èé9äéï
medzifáza, ktorá obsahuje bielkoviny a na spodku je zmes organických
© Prírodovedecká fakulta UPJŠ, 2000
11
îéôBè
ý
ß2à9ãø0å êBá|åç‘åø0à
ý
æCò3à ç0åøCèé*ö*ç"àñ
V. Víglaský, Š. "!$#&%$' . Pristaš a P. Javorský
Praktikum z biochémie nukleových kyselín
sme ()+*-,.0/1*324$56,)79869:;5*=<7>/1?=<A@$(B7B,<CED$CGF0.IH"JLK/NMOCGPRQ0S8M).UTB:G*=.V@
7(B.GT_UHJ
,79`MOJ;,a69bLTXY
prakticky vymizne).
7)$WB.;<*1:GTXBY*Z)7F;([\^]0.;,/1.0Y*
@.
@.c<B.c)d7F;5).G<?e()J@^MO.G<BJf`6Mg`hCG).i]jF;).UFJ;<*k<B.j()7aMOJG?=<979`ml$YJ;,F*kDOC;F.
nV_BT>/=J79`opT6Z@"J;/=*k<[email protected];[email protected](7iHJ;<XB:;5s`B7B,<XB:;5tDg)d.GTB:;*?uF;)CUK.;<?Y
vxwOyUz{|={>}u~€{zawOy;}‚kzƒ;„$…‡†xƒuˆŠ‰€‹Œ}{z{uŽ
( œUžŸ ¡¢Z£¤¥9¦0§©¨hª«§B¢u¬A¡­«®hžh¯
°
±;²a³´µ
¶9µ9·B¸;¹&º²;»
je Kirbyho metóda, pri ktorej sa na
fenol. Fenol je silnejšie
¶Bµ·B¸¹-º²
chloroform a denaturované proteíny sú
±;¿1²a³´Oµ>±GÀ9½
¼½G¶¾µa´O½G¿=À¿=Á²±;ÀÂ
ÀB²$Æ"±;²a³^´O½ÆxÇ¿1½
hydroxychinolín, ktorý
³gÉh±;²a³OÀ½
Á²GÈ9¾²;Åa·Æ«½
oxidácii fenolu a
jeho ¸aÃÌ´O sfarbenie ¶Bµ>ÊÄ;Í9²©Îi²;Í>Ç¿1½
vodnej frakcie). Extrakciu s fenolom
ako
pridáva 0,1% 8-
je aj komplexotvorným
fenolovú frakciu od bezfarebnej
¾µÁµÁÀ²xÏ
ÊÑи½;ʽ
±;¿=À¿¼Ã=µ
rozpustné vo fenolovej fáze (ÁÄG¾dµ9º½GÅ
inhibuje aj potenciálne nukleázy). K fenolu sa
±;¿=À¿¼Ã=µ>ʌË
ribonukleázou
bez DN-ázy !).
Druhou metódou, ktorá sa
deproteinizáciu
9{Bzv$„’‘$“GŽ;”•{B>–^w—“Gz‚&˜‚=z™ƒ>š“a†;‚={ƒ›–
ÒBµÊ©ÈB¿=Àµº²xÏ
aj s extrakciou so zmesou
fenol:chloroform (1:1). Z vodnej fázy sa nukleové kyseliny µÈÓB±²dÆÀB½
º>Ó9Á;¾ÄG¸0²dÆ$É
dvoma
objemami vychladeného etanolu. Fenol, ktorý sa neodstránil pri poslednej
chloroformovej extrakcii sa odstráni po rozpustení nukleovej kyseliny vo vode alebo
TE (Tris-EDTA) tlmivom roztoku extrakciou éterom alebo dialýzou.
Izolácia chromozómovej DNA z buniek S. bovis:
Ô
bakteriálne bunky získané centrigugáciou (10 min, 10 000 x g, pri 4 Õ C) zo 100 ml
Ö×BØGÖ9ÙdÚ
kultúry
S. bovis 47/3 (kultivované v
bujóne 2) premyjeme
ÛÝÜ&ÞBß9àá
v premývacom roztoku (10 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,9% NaCl) a suspendujeme
v 2,5 ml roztoku TES (50 mM Tris, 5 mM EDTA, 10% sacharóza) a inkubujeme
10 min. v â
î
ã;äåæBå>çèéBêBë;ì=í
ïðñBòUóôOõGö$÷=ø;ù=úBõ$ûLüýþüOÿBõ;ú ÷1õ©ÿö÷=ï>ø õ
ùù
ò;ú9ð
öOð xô ðóý
ù ðVýù
roztoku TE, pH 8,0) a inkubujeme 45 min. pri teplote 37 C v termostate, potom
!"#%$'&(#*),+-/.10
2 36587 9 :;-!=
4
+ <>?#@)A$CBD?EGFD?IHJ1K!HA)!?LHM(FNFOMQPMHA$
dvojmocných katiónov potrebných na aktiváciu nukleáz) a inkubujeme 5 min. pri
37 R SUTWVXZY\[^]O_Q`ba`dce[f%_hgif*j*gT!gkmlVnoprqstquXvapw`Xx^yQz{_f%_v] lýze pri 37 | C
} ~[email protected]
‹
bunkový lyzát extrahujeme fenolom (1:1) a následne dvakrát so zmesou
chloroform/fenol (1:1). Spojené vodné frakcie
s chloroformom, aby sa odstránili zvyšky fenolu
© Prírodovedecká fakulta UPJŠ, 2000
12
extrahujeme
na záver
V. Víglaský, Š. ŒŽ ‘d’”“d• . Pristaš a P. Javorský
–
Praktikum z biochémie nukleových kyselín
k vodnej frakcii pridáme 1/10 objemu 2,5 M acetátu sodného
—d˜*™š™›DœAžš\Ÿš ¢¡Dœ^Ÿ£¤¥š¦¨§D™D©§D™ª«Q¬­¯®ª{°C±\œš£Až=²´³¶µ*·¸œC¡¹ª™®ºŸ™¡»²¼³*µ
pH 6,0
™½Š¾œ¿\«¬‘ž
dostatok monovalentných katiónov z procesu prípravy, acetát sodný nemusíme
§ª£!©°C›Dœ À ÁÂÃÄÅ*ÆDÄÈÇÉ{ÄÅ*ÊAÄËÌÅ%ÄWÌÎÍÇDÌÐÏÉdÆÄÈÇÉIÊ!ÑÒŶÄÎÑÔÓDÍQÃÕÆDÒ\ÖÍ×DÆØÍ×QÑÄÅÙÓÚ¥ÛÜÝÌ\ÑÄÆÞÜÍ
ß
etanolu (najlepšie po stene skúmavky)
ÓÚàŽÉÒCá\ÌÆÔâOÂãÓDÝAÒCäDÆÊåÏGâ ÛÜ;ÉÍ¥Å6Í¥à\æDÅ*ÍÓ;âèç¼é†êÎÂiÆÌÅ6ÍÏIÒCÅ%ĹÆÌëÖdäDÝAÄÆÔâèÏÚìÊ!Æäí
Ì
÷ ÿ\ÿ
þ
premyjeme v 70% etanole
ß
DNA vysušíme na vzduchu alebo v î^ïDð!ñDò^óIôõîvöõdð*÷øù!ú\îøôDûüóýþCñÿ
rozpustíme v 2 ml sterilného roztoku TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0).
Izolácia chromozómovej DNA z buniek E. coli :
îôDîøî÷\øDþºÿ‘îWû*ðAîCõdøî
ùAû¶ðŠöDô û*ðAîøñDþû¶ðDöõðŠý÷\î
ÿOøðAîCñôZöõdð!þû*ôDð ù ôZ÷Ôýô¥ú\îQøùû ; ÿŠø;ñDô!¥î"# óIîCø $ õþû*øDî%$Dþ^óIù&Dø'(DþCñó*)Cõð!ù
(bunková stena grampozitívnych baktérií obsahuje 50 - 80 % peptidoglykanov, ktoré
+,.-!/!0'1%243%5675!380941%:;1%5!<#+=/2?>[email protected]%B!1DC*94E'FG9H186I3%94A%BJ/0KFL9M-'>+3249?5!1FN9PO%/([email protected]&A%B
WX;YZ@[]\8^_^`?aJ^cbd eJf"gih7jJk%l!m%nGj4k%op%nrqNstIuJvj?ow%x4ymnrq8egRz"o!g{m%yj|q~}€sDeJf"gih7jh7gnqG‚qyJogƒ!w
izolácia DNA z E. coli {þ
„
stena gramnegatívnych baktérií obsahuje len 1 - 10 % peptidoglykanov)
celkový postup pre izoláciu chromozómovej DNA z
gramnegatívnych
bakteriálnych buniek (G-) je principiálne podobný ako z grampozitívnych buniek
(G+
[email protected] f"gv{j4mx4ymˆ‡‰Šƒ‹;[email protected]{nGjmyJo'ux‘!vu’‚s“oh*m%f"j4wx4y'u'kl”‚Jqcyjm%o † ef•j&ŒgRn
„
existujú viaceré modifikácie upravené pre jednotlivé bakteriálne kmene
k suspenzii buniek E. coli
eJf"j4{wn€mN– †— nGx˜xuvsiŒy!pl!g™f*g'vh7goq›š — nLœ.x?uvgv‘nLqž7nNx
roztoku TE, pH 8,0) a inkubujeme 20 min. pri laboratórnej teplote, potom pridáme
Ÿ nGx Ÿ † Ÿ( ¢¡ yp%l!gˆ£¤¥£¦[email protected];ŒDq§mn€m#ƒ
1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 a inkubujeme 5 min. pri lab. teplote, na záver pridáme
¨ ©ª [email protected]«¬l!gR{c}HšIƒ ­s{gƒgn
kúpeli)
„ [email protected]®[email protected]%okj4j † [email protected]%¯sy°L¤V±²s³[email protected]{ygRn [email protected]°€eg´‡7hqeq§[email protected]!s%ogs%og
v predchádzajúcom postupe
© Prírodovedecká fakulta UPJŠ, 2000
13
lýze pri 0
Download

kap. 3