Prírodovedecká fakulta UPJŠ
PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVÝCH KYSELÍN
Základné techniky rekombinantnej DNA
Kolektív autorov
UNIVERZITA PAVLA JOZEFA ŠAFÁRIKA V KOŠICIACH
!"#"$#"%!#& '()*+& ,)-,
Prírodovedecká fakulta UPJŠ
PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVÝCH KYSELÍN
Základné techniky rekombinantnej DNA
Viktor Víglaský, Štefan
./1032547658:9<;=9?>
Pristaš a Peter Javorský
2000
Recenzent: prof. RNDr. Eva Mišurová, CSc.
@BADCFEHGJIKLCNMJKOEHP5QSR=TDUJV3WDQXCYGJIZ5[=C]\^G?KLC<[_G?`aZHPbKc[[email protected] tvuSw_xXyDxXzDyD{}|D~5x1D€u‚
ƒ zs~5u‚„~ … †a‡‡‡‡‡‡‡
ˆŠ‰]‹HŒbH‹5Ž_bg‘c’iŽ=“<•”J–}’c‹5—b’c‹o˜5™3‘=‹5”H‹›šL”5‹5œ‘L”HžD—5‹B–3Ÿs FH5ž<—‹B’L F¡•’i–„¢D‹HŒJ£5‹J˜H DŒ5‰_¤h¥‰F–5’L‹JŽL¦i§
1. Úvod
Š¨ ©<ª¬«¬­=©7®c¯5­_°±²F³H´XµD±D°5´X©¶?«·¶Y¸<¹»º¼©D½¬°J¾¬²D¿ ®L±D²<¿J°5ÀÁ¹ ­=±<¹H«5ªS´Á°H©D°b®c°±dÃnÄÆÅaÇÉÈhÊÌËH­=µD±<°ÍÎ5­=±
ÏcÐiÑ3Ò5Ó<ÔbНՁÖÌ×HØÁÕHÙDÚ5ÛDÜaØXÓÞÝß×HØÁÕHàÁá¬âHØXÓDãoä5å=ØÁæDÕHÜçԁÝDҁÖ3èké<ÑDê_ëÔ5Ýä5å=ÓDÒ5Ô5ìbÏLí¬îé biochémie nukleových
í5îHïðÓYàÁñÁԄÝòÜBÕ»àXÓ<íJÑSà¼ÕÖ3Ó_êó×HØÁÕ»àÁá5â»ØXÓ]ÝÔ5ØXÓ<íJÐcÕ5åhôÜaØ5ä5å=Ý<íJÐcØXÙ<í5ôHÜaØJë3àÁÕ»ÚHÝDÜ}ØSØXÙDÚ}Ò5Õ5ä õ^ö÷_ødùqú
ûdü<ýÿþ ¼þ þ !#"$%&'()*+,.-"/*0$,#-!1& 243 základných
laboratórnych technikách tvorby, prenosu, identifikácie, izolácie a analýzy plazmidovej
5.6879:<;=?>@>BA#>[email protected]=/A9: [email protected] 2 K 3 9OC.=QPRSA695.6TA#=?P!7UPR 3 6V9W:91KA#XZY\[XK7@>][email protected]
3
K mechanizmami a
prednášok, overia v J5`@!7][email protected]!R1dfehg85.9 !6 [email protected][^9[>lg:M=Q@
3 Ul[B>l@:9W:
3 J 5.6NV]c?9n^6^>]UPR
C`6V>l9l#A c?= 3 [email protected]#79 3 UlP^R
75`97l9 3
J59BAo97l9c?9P!RlYp7]Ao95.qrK#s
3t L]u.=v>l9lwx[@:I6!5.@8>qy>@r>l@`CzL@]K#A6`Czu.={6|J9]wnBX 3 @^>]U}9];8Cz6!7]A
klonovania, na bakteriálne bunky
Escherichia coli.
3
2
3
3t L]u.=?>@
Techniky molekulového 7c?9>9 @>=Q@~K.@[[email protected][email protected] >l6pCz6V>[email protected]?6
J5.9BAo97l9cZ9 3 [@!R]5.i ‚ƒz„†…‡ˆ‰]Š‹Œˆ~?‡ŽbŒ1QŽB‚?‡‘’“
”•.ˆ]”lˆlŒ–—”‹#ˆ•.˜†…™‰8‚š„O›lœ„!•.?…M„‡‹O‹#ˆ•ˆ]Œž„Ÿ
œ•.„NŽ’!“Ž]Ÿ¡ ƒ¢£’{’“¤Š”]¢¥Š.„‡lˆ£Š#‹¦§Šœ™£Š`ˆl©¨¨^ !‰”ˆ1Š‹?–¥ªˆ«Š. ¬ˆ]‘ª ƒ.‡„œ•.„ƒ. !Œ]‚Nƒz„<‡ ”]Œ {©‹„< <”]Œ ‡B‹/‹„
Œ­Š.{„Ž‡˜“ˆ®œ•ˆWŽB‚”‹‚¥¯<°±„Sœ]•`„O‹#ˆkŒ„ ²´³fµ¤¶·¸?¹!ºµ/»¼½E¾O¿ÀxÁ.¾
Ñ ¹¶ÏÇ]»#¸?µZÐÃÒÓÔÂÆ.ÇÂÇÒ!ÓÄÆÇB»#ÇÂǸ/ȚÂÇÏB»#ÆǸ?Çlо¸Õ¾
¾O¿À_Áz¾Ö¶Ç
¾!º¶]ÃÅÄÆ.ÇW¶BÈÂ]»ÊÉGËÌ
ÍBÎÁ¾^Ï]ÃÅÐ
Çlй!Æ.Ç]о!ϵQ¾×ÐÃ1Á.¸Q¹¶]ÂÇ]Ð
¾!º¶¹ Ñ
Æ.¹N¾!ÂÒµ?¹Ø;Ó]Æ.ÙÇ]о¸Qµ¾ Ñ ÂÇÏ»#ÆǸ?ϼÚÄÇÂ]È¥ÁÀIÁ.ÇfÍNÏÛ³Ç]ÈfÉÜËMÌÝ
Ñ
Z ³ÏǺ]Á»Ð a literatúry, v Â]»#ÇÆ.¹ Á.¾Ú³·º¹³M¹ÞÇl¿ÇÍÏlÛ!³Mµbß|Á technikami konštrukcie a
¾!Ïl¾¸vÃÍÀàÆ.¹!ÂÇW³<¿µ?ϾÏB»#Ϲ Ñ ÉÜËMÌ+ÐÀĸváо½<º¹ÄÇ1Áo»ÈÄ]ÀàÄÇlȺÎbоÏl¼áÐ molekulom klonovaní sa
Ïl¹OȧÁ#»Û¸?¹M³Ç¶¹!Æϵ?Í!È Ñ`â ¾ ã äåQæçØèé]èê çzäç`ëíìWîðïñòóMô nich sa prispôsobujú potrebám jednotlivých
laboratórií samotnými „génovými manipulátormi“, prípadne sa na základe praktických
õö]÷¥õ.øùú1õû#üý.þzøÿùlúWÿþ#÷ QøOûoú
úOûùøøùÚý !Nþ÷®ùQøö]û#ú"Úý#!ö
Nÿù$"&%ú1õû'%(
%úÿ)*+%,úÿ]ùøþ-%.ü./0!ö( Maniatis a kol.: Molecular 1 235464789:3;<>[email protected]$=:[email protected]$L5B 4<
a doplnené o praktické skúsenosti získané v laboratóriách Ústavu fyziológie hospodárskych
zvierat SAV a katedry Biochémie Prírodovedeckej fakulty UPJŠ v Košiciach.
MON PQRSTUWVXNTYIZ\[SR]^R_RNK`badcfehgUi[V] RjlkY_'m$P^Q_nYpoV]qT_SPTmP QrPgSsN Rt
[UuZv] wxS
yz|{K}~0€ ‚ ƒ„…G†‡/ˆ‰‹ŠGŒn…Ž„‰d…‡KŒ ‘n‰  xƒ‹†‡Œ+’^ƒ “ƒn…“‘”.„…ˆ• –F—|˜ƒ ŠvŒš™^Œš†‡Œ››ˆ“ Œ ‘Œ+œIˆ5Œ ŽŒ ‘ ž
pracovných postupov prispeje k Ÿ ¡/Ÿ5¢5£¤q¥¦§‹£X¤ ¨ ©ª¥¤K«*¬¤K«v­£¤ ®I¯/¡n°*Ÿ ¢²±³¤¡n´I®°›µ¶b­¢$§·›¸CŸ5° ¥¹µ ¶
v ±G¢I©¤º§0©¢5Ÿ5¤K«»¦¢©´5¼¦x¦0°²Ÿ½ »§0®¸f¦µ ¶\½¨*§ «¾¤ ±¿¢À¶©.»¬K¦¤\¬/¡'Á0®¦§0±±v¤¡n´®\¼Â¥¢ŸÂ¶$¢À¦¥·¦¥¦x¤q£¯¡'Ÿ°Ã
Kolektív autorov
1
2. Kultivácia a uchovávanie bakteriálnych buniek E. coli
Mikrobiálne laboratórne techniky, ktoré sú nevyhnutné pri molekulovom klonovaní sú
ÄÅ ÆÇ*ÈKÉ.ÊËÅÍÌÅ ÎËÏÎÐ0Ñ ÒÓGÇ\ËÅ ÔvÇ^ÆÕ×ÖØÙÖØÚGÛÄXÏ$ÖÆÓ ÔGÏIÔuÛÄÜÕÝÎÏIÎÄnÞÕCǛÊ5Ç ËÉ-ßàáÆxǛÎ5Ëâ5Ñ^ÒAßàãXÇ ÎäÛÄà›Ñ ÅåãXÏ
sterilnými materiálmi.
Bakteriálne bunky, vrátane
Escherichia coli, æGçèé æféëêìí.êìîïí.ðòñó0ôõníCï0ö›÷^íCø$óùï
tekutých alebo na tuhých rastových médiách.
Kultivácia v tekutých médiach:
ú+û5ü ýþÿ !#"%$'&#()*+,.-$,0/1(32'4-(,5,6.78$9:;,(=<>:2*6?
@ )()"BA<C D)EFHGIJ,KLGMONPK7GQ8RSTQ6IUEWVGPJ,D,EXJ,Y#IZR,[\]P_^D `abc,d6bXef1g7hdia1bkjlc)mn,`po%mq,drbBsutv`3jkb]w
statickej kultivácie, hustota bakteriálnych buniek stúpa dovtedy, kým koncentrácia buniek
c)xq,`wd6bn,c,xywhfzx{|cb]w}hxc,drbk~a|h`,oHh`€jkb]wxq`‚n)ƒq„b
e
„kc,…8†xc,d8f€‡})‚n,g`ˆw
hd‰q
elenia
bakteriálnych buniek, ktoré však nie je sprevádzané stratou vitality. Pri statickej kultivácii
rastú baktérie v
z,‡`w
h‡xkq…~=eh`‡mŠn,`‹agbw
hc)`whdŒbW„g`,†xc,d6x‹wbpo%xc,…Ža „ƒadwgi`ˆw
hd‘c,b’†d8a`hc,x“
jdc,c,`w
hd,”behxŠ‡•diƒlgc,–‚n—”f1c,d6xe~3z,‡dj`3o˜o™c)`*†lxlc,d6xš”f1c,d6xe›cxloCƒ
trvale vzostupnú tendenciu, ale
prebieha v charakteristických fázach vzostupu a poklesu (Obr. 2.1.).
Obr. 2.1. Rastová krivka baktérií v œ1ž7Ÿ 8¡1¢£¤,¥3¦§¦C¨©, 8vª a-fáza prispôsobovania, lag fáza; bfáza zrýchleného rastu; c-fáza exponenciálna; d-fáza spomalenia, stacionárna fáza; e-fáza
poklesu rastu, odumierania alebo neskorá stacionárna fáza («¬,­®
«¬,­¯°±7²³—´'µ¶¬·Z²´%¸´¹,±6º»Œ¹,¯¼³™«
»´1«7²±i½*¯·¹,¾¿,¬=³>¾À*±6¯Á³%Â*ÃlºÄ¸,ÅÆ ÇÈÉBÊÈË,ÌÇÍ%Î,ÏÐÑÒÓÎÔCÉ]Ô'ÕÐÎ]ÐÎÔpÖÈÓÐÌÊÑ×ØÇÌÙÚÓÔ1Ø7ÐÛÊÜ%ݚÞàߏá
2
â_ãäZåæ*çä™è1éäZåê,ëíìBîïBê*ë*ðñè,ãòåóï,äŽôCäZåóìæ3õö6÷ê,ø÷ùûú,ãæ3ü]îêåæèðþýkæÿ
åòZè*ó úæóÿ%÷äõäCü,æ)ì,ë
kultivácie v uzavretom prostredí, je systém baktérie-prostredie charakterizovaný ako uzavretý.
Faktory limitujúce rast sú tu podmienené zmenami prostredia, vyvolanými samotnými
!"$#!%&('")*+!"$+",!-.#!"/$01+!23(45'67""5"*
8$9: '")7<;=
I!JIK!LMNO"P/Q
>;?
.
?A@
B)!@
?C)DE!,
@F
odpadných produktov.
"@[email protected]*
R"SI"MT*LUWV!IXN>YZU[!\D]T1R!^_T/L`N`QaLMN5O"PQbIV]T&_U!Lced>[fY]I>]gWh
>44B+=
optical density, OD) pri
R!\O"I"R!LciJ j kl!mon"p"prq"satZu"vmwu"vm>xq"yzs3mv{q"|*{rx{w}f~{l}€4k{>‚ƒFmrxA„{.q"…}!mq"|*m†u!…!‡%„…}}!|D„ˆ‰q€!Š‹
buniek odpovedajúcich nameranej OD600.
q4…kx„}!…Ž‚!q"|*mlŽ}
Œ
bakteriálnej kultúre sa
stanovuje vysiatím presného objemu vzorky, získanej desatinným riedením pôvodnej
bakteriálnej kultúry, na
{!{v…}!yau‰{H„q"m‘’…!‡m“„”k|1}"•!Š‹–!{.l„mv|*ˆ‰—q"€!Š‹`‚Cq"|*mlWq"{sa‰˜u!™}!…!q"y‹4…
l‚C‰D„|&}{‡q"y‹"…šs›y|*{œx{u!…>„…"s
}"€"u!…!‡žD„{q"{Ÿˆl!‰/{"m saq"…"k"xA„}{zƒm"q"…„‰|&}!•!Š‹¡!{l„mv|ˆ‰q"€!Š‹
l!…"‰¢"q"|/ž"Ÿžxl!{5q•Š‹eu"v|q4{ƒq!|k~…sv|m"m5q"ž
Monitorovaním rastu bakteriálnych buniek pomocou OD600
l"v|1}"l‚Ct¨l>„…"vˆ©q"ˆs
sa™"kms3m£Ÿ…¤xA„¥v…Hƒ|1¦v{>xA„…}§
u!…<xl€>„‚ƒm–§C"{ƒªm«…¬­€4Ÿ>|&…‰…"|*Šl!…"s®x„{}mw"{q!y‹4…¯{l„mv|&ˆ5‰q!m‹"…rl!sam°"{©}
ŸˆH}!|­xª‰…¤xA„|eq!{r‡{xmr±AŸžxl!{q4y†§C"{ƒFmxA§²}"€‚!k|D„m ³%´4µr¶"·¹¸a¶"·º1¶"·»¼½¿¾!À"Áe¶C½%½´Â´Ã!ÄÅÇÆÈC´"¸*½¾!É
¶"·¸
stanovení produkcie biologicky aktívnych látok, enzýmov, sekundárnych metabolitov, pri
sledovaní bakteriostatického alebo Æ!»¾Â½·¸À!ĺÊ"´"½Å"ÀeËC̸´¾ÈÍ·ÎÏ´Ð"ÄÅaÑ*Ò%ÂÀ"¾"ÓFÔ
Õ ·½%¼4ÏÊ>ÈfÖ×"À¼!»´"¸*½
Æ»¾Â½·¸*ÒÑ´!½Øz¾ÈCÑDÂË!·Ð¡¶!À!Ì»>Ù·»>ÙÂȚ¼
¾>È!ÑD¸1¼!»Ì´4½Ø¯´!ÒÊ"À4ƽڴ!»ØÑ/½.¶ÛÖ¸*½
Ï»HÆC½Ï¶!½Ìº/Á3½Ü¸´Â½5´6Ϻ&¼!´"Ð"Á²Â·½¶!»´"º*ÁÚ¾ÈCÑD¸&¼C»Ì5´4µÅ"À`ÁµÊ¸*»É¤¶"·¸ÌÀÁÝÀ4Æ.ؽÁ¡¾ÈCÑD¸1¼»>Ì´4½Ø¨´4ÒÊ"À4Æ"Ð`Æ"Ð
Á3»ÑÆ"Ð6Þ
ßàá!à/ß3âã—á!äÜåæAç6èà1é"èâHæÛêëìåí!îé!ï$ðäZïñ.ðäߜß3òó"à/î6ô
õZöC÷Døù1úCûüý4þ
ÿ3þ
ù*û¹ùûúö
ÿ©ý!ûúý*ÿ ý >ø÷1ù—ú÷>ù¯û÷ !"ÿ"!÷#!ý!þ
média. Po rozpustení komponentov vo vode a úprave na príslušné pH sa médium sterilizuje
$%'&)(+*,$-.(+* //02134/657 8 C v 9;:<>[email protected]=G9IHKJLNMPOQ!RTSUIV<WYX[Z\ SART]^:_=`DH'9a=bB96c[=?d'CR
e A,[email protected]\ Ubg hiaj?=fR"E=UCUI<+=bBk9ml e @n= ^?ojUCBoaUb:<>UZpEd'C Ed+= E9,qAhSr: genotypových vlastností
?b:[email protected]<+SnB =B 9UZa="`9?b<[email protected]=t?RTCu9wvPU9EdxWb9U<>Sy`S=<>S?AzxW
{ SC,?b<+= d'Z ?=R"E=UCUI<>o lC E=I<>d|C;`UZ H><[email protected] e =B 9;c H|9R}=~HP<+9
<>UC vP>[email protected]<>d|AhS=: [email protected]` =
;‚ƒ…„ †‡nˆ‰ „‰ Š‹€ŒT'Ž"„4†b‚‡rƒmy‰ ‘Š’“„”ŒT’–•|2—˜'ˆ‰'™mš›œ[—„F™'“„ž„Ÿ“‡Š‹Š ~¡N¢£¡N¤ ¥ C
(glukóza, sacharóza, antibiotiká, MgCl , CaCl Ž¦§yŠ’,'Ž¨—˜m‹y—DŠ©—˜'ŒT„p—˜'ªŠ„f‘†„b‰,Š‹€Œ
« ‚~Š† « †bƒ+˜+€ˆ‡Š“„T†ŒT¬w­ inokuláciou).
®¯°±²±i²³§¯b´D°rµ+¶y·¸¹²³º²»¼½b¾¿ÀYÁ¶yÁ±;µ>¿ÀÃÂ+¯bÄ~Ÿ·¯¿À Petriho misky a odmerné valce sa
ÆbÇÈÉÊmË£Ì͞Î>Ï+ÍÐ'ÑҀÑÓÔË|Õ×ÖÆ ÐPÕDØÑÙ ÚÓÛIÔDØÖÆfÙ ÓÊÇ ÊiÒÍÌܔÛÆÝÖÒÑsÌÞßÆÚ ÍmËáà>âfҀÑ͔ãÖÆfÛ~ä}åNÐmÑ[æçNè é C.
V ÎPÕDÉÊIÎ'ÌÆêÎ>ÏmÑ~Î|Ê)ÚÆ"ÚëÉbì'ÑÌÍíÒnÊÇ Æ Ð|Ê;Ï>âÐmÑÞåÆÔîÞyÚÊmËmÕïåfÑyåÍ6ÏPÈð~ÎmßbÕDÙTÊÚßÈÊ Petriho misky z plastov,
ßbÏ…Æ Ð'ÜwÎ'ÊwÛNÆfÛñ;Ú ÊmË|ÕºÎ>Ï+ÍÐmÑÒÌÜÃåУÑnÊiÙòÆ}ÆÛóÚôNÐ'ÆbÇØ6Ô©ÊõÎ>ÕÌÊöË
ÍÛ ÌÆtåÆbÔîÑrÏ>ÑÍbä
2
2
3
÷ùøúbûü+ýíþòýÿ"þ
û
óû"!$# ú
%
ø&%Iü'(%ý)*
|øÿ+û,rü'-þ.
len rozriedime v primeranom objeme sterilnej destilovanej vody. Uzavreté, sterilné média
,%
(/0 (12 /3 4 5/ %
6 "/ 1 7 (1 89
5/1
;:(% /3 $<
þ
ÿ fÿ
mú ÿ
ÿ úø ø tú ü û©ÿ bû
;ü ø ü+ø bü+ø
Po inokulácii do rastového média, vytemperovaného na laboratórnu teplotu,
bakteriálne bunky kultivujeme v termostate bez trepania alebo vo vodnej, prípadne v
=?>@
ABCD,E$FHGI>JK='L>@MNO>P@
LQ8R
S T
C s regulovanou intenzitou trepania. Na inokuláciu sa
B(U
VNMJWI>[email protected],Z[CM\I
BNI]^UMO(=?>LQ]A3IM_O(FA`=baLMcC
objeme 1/100 z pripravovanej bakteriálnej
kultúry alebo jedna kolónia (single colony) z agarovej platne, ktorá sa odoberie so sterilnou
UMO(=?>LQ3B5A3B
dQ3eOB(FfOgWFNOB(FihkjMlBnmo=?Mp='I$aqUMO(=?>LQ]rA3I(FfOBA3sI
Q[FtmQu@
LQ[@
LMCZvl>wCQMeI
](mB(UI(xl
rozterom vzorky na agarovej platni (Obr. 2.2.) a následnou kultiváciou v termostate.
y L>zE{B|m?Q3M}
I$F
=?Q3>zE
B(U
Lxe}_O(FA`=?QCMNrI(xe}_C
xnmA>E(OB(C~mMkBE(@B(LoaNM @{LQ[@
LMCB(CMcN>Lpm'=bC€
tekuté rastové médiá.
ƒ‚„(…?†‡ˆ3‰Š3‹†Œ{Žn‹{„Ž‡†‹
‘’‹
‚’ˆ[“r”5Š3‰,•ˆ`Ž2–"—˜~“$™bš?„n‚›†œ“
tekutého média centrifugáciou
 ”žš?„”‹†‹
™„(ŽnŠŸ…ˆ[ ‰•ˆ†(¡¢£Ž‹(„
¤›¥¦r†r›†\”
„‚›’¦,ˆ`…?†c {(Ž¦$ˆ[§¨‹‚  ”
¦,‚©
”( ‚‹‘cª†rŠ[«‚Š†Œ”žˆ•¬
Ž•¬” ‚§¢ “,›‡‚“{†‹
”
›­šo…?‚ †"‚&¦®©
”8š  ‡‚•”( ‚&‹
ˆv‚{¡
1
2
3
¸ ¹ º¼Sterilizujte
»b½pº¿¾|ÀÂÁÄÃoÅ9Æ'ÇpÈ
½ÂÉvº¼Sterilizujte
»b½pº¿¾|ÀÂÁÄÃoÅ9Æ'ÇpÈ
Obr. 2.2. Postup pri izolácii jednotlivých bakteriálnych kolónií (single colonies).
”c„‚&¦,©
”›
1-prvý rozter, 2-druhý rozter, 3-tretí rozter, 4, 5, .... ¯ 
roztere sterilizujte
Œ‚&„(…?†‡ˆ3”5Š3”
°5ˆ•„(ªX„±WŽ„(Žk plameni). Opakovaným rozterom a následnou sterilizáciou
Œ‚&„(…?†‡ˆ3”5Š3”
°5ˆ•„†²9„n±WŽ„
³©
”|šˆ‚¬
‹
†›†¢‡ˆ3†©
†‹
ˆ†´Œ‚&„(…?‘‡ˆ3™n‚&¦P‹‚µ²†©
‹
”(…'Š3ˆ[ ‘ƒŒ{Žn‹{„¶5„(…'”
‡‘· termostate dorastú na samostatné kolónie.
4
Kultivácia na tuhých agarových médiách:
Tuhé pôdy vhodné na kultiváciu v bakteriologických Petriho miskách obsahujú okrem
základných komponentov aj 15 g Bakto-agaru na liter média, na prípravu vrchnej agarovej
pôdy (soft agarÊÌËÍέϤÐ(ÑbËbҜӿÔÕ
Ö¼×PØ
Ô$Ù'ÚÛÍÜ
Ý­Þ³ßà,ÍÞÍ~Õ
Ôâá?Ø
ÔÕ(Î
ãäÔå×Ë3ÍÜÔ­æ
Úç&ä
Î
ãä
Ô
agaru
Ø
Úè3Õ
éæ×¼êëÔì
ÚÍ&Þq×Î$Ù?è[Üè3Ô(Ùí[ìî×ïá'ð5Üiá'Ù'ÚéÂÙbÝÌæäÔ5Õ(Îã+Î×ñáoÙ?×ÎÔæÍÎ
èvÍÍòØ
ÚÍ(áèvÍÚÍìÔ
Þ³Üè3Î×Î$Ù'ÎÍï³óƒôöõ
vo forme enzýmovej aktivity v jednotlivých bakteriálnych klonoch (napr. nerozpustný škrob,
lichenan, chromogénnu celulózu alebo xylan) alebo iné substráty vhodné na primárnu
selekciu.
÷¼øùúûü'ý3þ[ÿûûúørú,ü
öúÿ,øú®úWþÿû(ÿú8ûøù
þ
û"!$#bü&%'øÿûÿûù
ø
upravíme s hydroxidom sodným na pH 7,5 a sterilizujeme v autokláve alebo inej tlakovej
nádobe.
Po sterilizácii a ochladení na 55 ( C a po pridaní termolabilných komponentov (napr.
"+ø®ù
û,#;ü?øþ3ý0ú-.þ/#þøÿ öúû
antibiotík) sa agarová pôda vylieva priamo z )&*
stve asi 25-30
ýžú,þ0#"!1#2Wþø3øÛû 4576899
:ù
ø;#ñú
ø-3. ÿ"-.ý<ùú>=?Ìù
û@#oü/!.{ú!
ü'þ<
agaru. Agarové
ýAü'úøBøCú,ü'þDþûüE%F;û,ú
û,ÛøùGû!þ`ü&%AH!I-.
û(ÿÿI?9.ûÛøù(úûJþHý<ûü0K"ú
ø8£ü?ø5ýûü?ø;L6M
ù(ú
þA
N#®ûù#oü&ú
þ3ý<¢ÿý'.ûO#?2
úûP!$#8ýAùQ
û(ÿ?"ÿ
povrchu platne. Dlhodobo ich mo
obrátenej
-.
ýAù
ú
þRøTS8ú$ü'þFþ3û(ü?þA-Uý¼ü'ú
øVW#Xzúø3ývþ
polohe v plastikovej fólii pri teplote 5 ( C v
!$#E5ý<ùQ
û(ÿY?>-.
ýù!kù
ýA.O+þøNû ü/"rù
ø3Q Z\[^]`_acbd/efVg"aEhFgaie_jk
agarové platne alebo platne z
i
o
j
<
h
p
q
,
r
s
t
r
u
b
P
i
v
i
^
h
g
a
_
N
o
g
f
w
x
y
h
8
d
A
z
{
v
3
p
<
h
i
&
b
E
d
f
p
j
|
_
g
a
_
&
b
$
w
}
D
h
P
~
B
i
j
i
a
<
h
Y
i
lmn
n
m ~9e dE_a8v9fObdEicdE_BjiPq"w n d&hFeIipj
i3€iafevCh‚gƒoiv9h9bi gf„jifpqf"eijz
teplotu (Pozor na presušenie!!!). Petriho misky s
gazb n w$}jk m f…siq"dE_aEhA† n j_ m f‡qv_ˆi‰gfv9f l fwŠb/dE_a8h n j_‹ŒsIiq"dE_a8hAf n f€h l q_8‹
qŽwIpqrq"w n dEhFew‹8
v obrátenej polohe (hore dnom) pri 37  C v teplovzdušnom termostate.
‘I’”“•$–$—™˜Žšu›œ–$œŠOžOŸ'šu D¡Iœ¢–£I¤¥ ¦,< ˜c §> ¨© ¦ªœ"Ÿ<œ«¨© ¬ ­®3¯I°²±³3´”µ¶·´$¸º¹$¯”µ»Y±¼
½¾$¿cÀÁ$Â"ÃÄ$ÅÆ<ÇVÈÊÉ$ËÂ$Á…ǪÌÉ$ÆÀÍ;ÎI½Ï”ÅÐÏOÑËÒÅÆ…ÀÏOÑÆ<¾”Æ<½"Ñ8Æ<ÎOÀÍtÏ$ÒÓ>½Ô¾$ÀÎÑÐËÆ<ÒÕ<Ï$ÐÁ$½ÖÎ$Ç,Ð ×$ØÖØ
Ù$Ú"ÛÜ$ÝßÞ3àáâ<à"ÛãOܪãOܔäAÛâFåIÚæâçè
Po kultivácii individuálnych bakteriálnych kolónií éêë>êì/éícì/îïðòñóTôõö÷øFù
úûAêïðù
üýAþYÿ0ÿ>ÿWü
0ÿü
uþ üþ"ÿ !#"$%'&$(*)#&+-,. / 013254687#9:617 tekutých
;%<=>@?AB!CDFEG#HJIKL>MNB OQPRST#P$UV3WX#Y-Z5[VTU\]^
bunky zmyjeme s _
P`ba
_c_
UX#de[TX
_
klonov po prenose z „master plate“) bakteriálne
ef[gihjZb`bUk^
o fyziologického roztoku a koncentrujeme ich
centrifugáciou.
5
lnmFo-piqrsFqutwvyxiz vyx{t|t~}€‚ ƒ…„†Q‡bˆ‰FŠŒ‹†iˆŽ‡ [email protected][email protected] [email protected]¡u¢ *™’F‡
:
£%¤¦¥b§5¨©ª…«©-¬f¨§b¥b­#®#¤$¯©L°±®­«²œ¯¤®³´-§@µ¶©·
Bacto-trypton (peptón)
10 g
Bacto-yeast extract
5g
NaCl
10 g
Bacto agar
15 g (pri príprave tuhej pôdy)
pH 7,5 upravíme s hydroxidom sodným
¸º¹»¼¾½¿À¶ÁÂÃÄÆÅ#ÇÈÉ»ÊÌËÍ8ÅÍ8½ËÎÏÑн#ÒʽÓËÍbÇiÒÔÁ¼jÍÕÁ¼¾»¿½¿»×ÖØýÙÈ-ÚÌÛܽÅÄÝyÛfËǼ͔ÞbÊǶßÈ-»¿¼¾ÇQËÀà¿#½
áâ ãä¾åFã*æ$ç%åbæçcèébçêèêë#êÓìíébãèÌî*ï{ðñ%ðóòô¾å€é@ã*ë#ê#ôÜãöõø÷#ôLùðfïyõðòébêõð›ãébðë#êàúØæçé@ãÌèùå@ûíðüýnô¾ðè¶òêîþåÿõbñ
ich rozvaríme pri teplote 100 C vo vodnom kúpeli alebo v mikrovlnnej rúre a po ochladení na
primeranú teplotu a pridaní termolabilných sterilných komponentov ich vylievame do
Podobným spôsobom sa pripravujú tekuté a tuhé agarové pôdy aj na kultiváciu iných
!#"%$'&)('(&*+-,'"/.0!(1 2#3'$546+87:9+<;=7','(>?4%"[email protected]$(!FE(,:=,G>(1HEI7D(:9'J:K+;L,=NMPO1"MQ
M
rastovými
RS'TU6VW'VX:YZV[U\W'V]:^C_:Sa`VYbcdLU6ef6]cC_:SgWdPh_0hji
Antibiotiká:
Roztoky antibiotík, pripravujeme ako zásobné sterilné roztoky, ktoré uchovávame
zmrazené pri -20 k C a na pracovnú koncentráciu ich nariedime tesne pred pridaním do
YhfbUXVl]'^_'Sg[a^WUVi
monqprsrutuv6wyx)z{p|:}~8vz{|€?|‚Lnƒ„x)|5…w:ƒ)†‡xL|5t6rˆ‚L|'‰p} xPŠƒ-w'ƒ†q|‹|…'ƒŒ‰CŽGxL|'w‘‚L|‰-Š?|'’yxLz
pripravuje v koncentrácii 25 mg/ml, pracovná koncentrácia je 50-100 “ g/ml
”•–—˜/™š›œ'ž:Ÿ
média.
Chloramfenikol je rozpustný v 100% etanole, zásobný roztok sa pripravuje
v koncentrácii
34 mg/ml, pracovná koncentrácia predstavuje 10-25
“
g/ml
”•Z– —˜/™š›œ'ž:Ÿ
média.
Kanamycín sulfát je rozpustný vo vode, zásobný roztok sa pripravuje v koncentrácii
25 mg/ml, pracovná koncentrácia sa upravuje na 50 “ g/ml ”•–—˜™š8›Cœ:ž'Ÿq¡#¢'˜š£
Tetracyklín hydrochlorid je rozpustný v zmesi etanol/voda (50% v/v), zásobný roztok
sa pripravuje v koncentrácii 12,5 mg/ml a uchováva sa v tme ( ¤C˜ —–6˜/™ŸZ¥
6
¦
na svetlo), pracovná
koncentrácia
§¨'©ª«¬L­®
predstavuje 12,5-15
«¼«-½L§:µ¶¿¾5²«À³?­'®³?½L®Á¨«±Â·:§:µÃ8µ«Ä¿µ
¯
g/ml
°±Z² ³´/µ«ª­¶·'§¹¸¶º'´«»
Tetracyklínové
tme pri teplote 5 Å C.
ÆÈÇÉÊ'ËÌËÍ'ÎÏпÍgÑÒÓ0Ô%Í'Õ Ö ×'Ø-Ù'ÚÛuÜÞÝGÙ'ßáà%Ü-âÁÛ%ãä6ÚÁå æçHß0è'äéà6êâ
:
ô6ìÀï?õ'òìþÿþCÿ:ö:üóüì ì õ'òðîö v !"#$&%('*)+-,.!%/102$4365872"9:;</ =>?2@-ACBDBFEHG=JI+=KBLNMPOQ>BM(GBRBDSG?2BTVUW1X2YKD[ZAC\+]^`_a=
T=>ZbEcBTdDeSK=fOghT[Ud=JYKiAjgTk=U ]mlgB]mBnU [email protected]>[email protected]+DB
kultúry s RoOXwAC=RD=ZxXA.?2OyAz=eZ4Uo{ACOPI+o|A.W1^}_~?2BTI€K2oB‚XCqJIO T=U1ODoBƒ>[email protected]+DdWdYK4qJ]„Bk=U…]†ldgB]„B
G?2o‡G?2O-Uoˆt O‰Or?2=eUdSŠUGoYPKe=eUdSŠq=DMBr?UWeL`qAz=d?2SX2O‹Z1T?FgrZrEwŒU tme pri laboratórnej teplote alebo
v Ž‘’“”•&–—8˜™‡š–›2œ+’ž1ŸŠ•’ P–›wžš¢¡d•£C–›F“¤+’šŽ¢•¥1|£¦›2§n•£.›2Ÿ†¥1rŽž¤ž¨„–ª©›2“`£C–©+£C–«w¬­
®¯H°C±² ³ ´¶µ6·m¸¹ºe¸»F¼½+¾¿¸À1¾QÁ¾ÃĺÅƼ¸Ç
¼¸ŠÈC¸d¼e¸eÀÊÉ
ëíìîïðñòóCô6õð\îöô6÷'õ'òðgøù'ú0ðøgðgõ:ì
ìûì-ñLö:ü'ýþÿ
ËÍÌÎπÐÑyҀÓÔ+ÕÐ Î(Ö6ÐÕЅ×ÍØ<ÙÚÔÒÜÛÍÚÝÞß+àÌÕá ÕÌ klonovanie
vektorov zahrnutých do â ã8äå1â€æçéè
êë[â€ìpärëFã8äå„äíìîïð1ñò
a selekciu plazmidových
óƒô2õ¶ö1õ÷øeõÂùúû÷üˆýdþøÿ
ý ÿ õþ
ù2þø.ú<þú ù þ
úý.ú øeõQý !÷þ [û#ô "
E. coli HB101: hybrid E. coli K-12 x E. coli
recipient s dobrými
$ -komplementáciu.
Mutácia recA- v %'&)(*%'&,+(
-./10243-05-6879:-;-</(/=.>[email protected](
&BC.D&FE%/1G&)(
&<&H/?4+-#9 rekombinácie
klonovaného plazmidu s chromozomálnou DNA.
E. coli JM109: I -galaktozidáza negatívny JLKM'N4OM'PRQCMTSUWVYXZ[K\][email protected]
rekombinantných plazmidov série pUC g -komplementáciu. Mutácia recA- h Nia h j a k8Kl:a
[email protected]
S\CODSF_MfLoSJ
S)cSp)f^e4Qa#l rekombinácie, mutácia endA- v endodeoxyribonukleáze
h X Zq#Kl:a*QXNcfrMsKtN*XVu v4wxy{z|x}^xD~v€#1‚}vd|Cƒz„xD~€b1…‡†ˆ
‰Š‹ƒŒ€Ž:€‹z^€4wŒDxFzr'€‘ ’)“•”1–˜—4™š›œ)“*
žŸ *¡#¢D£C¤'¥4¦d§¨4¢¤'©žª«4¦¬«­¤#®^¨4¯°¨4¯
¯«£±ª®¯©²³Wž®=ª®@´µ¯¤'©Ÿ¥¶§¬·©¸¹§º#»¼®=£½' ¯¨®^§
¾[§¿£® 4¯½#±4À¬
®Á
E. coli ÂÄÃÆÅdǘÈÊÉDËFÌÍÎrÍ'ÏÐ4Ì'ÑÒÓÑÔÏÕ Ö×bØÚÙÛÜrÝÞ@ßàáÞ@ÛâÖ)ÜãdäåŒÞæçßèÖéŽêWëŽìíîã{ÖéŽêWëŽìdï¿ðñéLåØò
obsahuje mutáciu gyrAóôõöŒ÷øTùúûýüþ­ÿ4ü ú
4üWøù
‹úWø^þ killer“ aktivite
produktu ccd génu kódovaného plazmidmi série pKIL.
7
3. Izolácia chromozómovej DNA
!#"%$&')(+*,-").!0/#1&23-5476
."98%*3:7(;=<8?>@.A0'?*(B
:!0,C8/5(*.BED
').:!F6=;,:04G/
výskume. S
<
!#/5!B
!>IHJ*#!0/J2#!K'%*0C'%*'9.L<6M;/5(
biochemickom
sa tieto postupy podrobnejšie rozpracovali so
špecifickým zameraním na jednotlivé druhy nukleových kyselín. Nukleové kyseliny sa
C'N/1&2K!#<H(*#'%>O!&2K*#./#4P6
-#4;,BQ3/!R*JST/#1*')>U-0,3;/5!5<'(VW'(6=;!VL*#.
v
tRNA), ale vo forme
')."%-!/'%*(>Y'%Z#-0;!0<
J[6=Q\V(6M;T!]/5.RE>U'^6M;( '9"%*J0_
X
komplexov s X
Základným problémom pri izolácii nukleových kyselín je práve odstránenie proteínov
a polysacharidov takým spôsobom, aby sa neporušila primárna a sekundárna štruktúra
`abc)de0f#ghijb#kPldc9m%`^nporq
dEst+uv#w#q
tu`#xy z?{|+#} ~
L€=‚%ƒ€#„†…||‡‚ˆ=‰Š
|K‚)‹#|Œ%…GŽ@|‹# na riešenie
uvedeného problému. Preto ˆ
‘#„’}#~
ƒ“0)‚”‚)ƒ|~
•–‚%—“%˜…•–}“Fˆ‰}0„z™€0=“#~
•+ˆMš3#›“‹0…•–}#~
|
jednotlivé druhy nukleových kyselín (tRNA, mRNA, chromozómovej DNA, plazmidová
DNA, mtDNA).
Pri izolácii nukleových kyselín je v }#~M5“Žœ~
‹#|–}“0)~|E#…•‘‰#“ž …#‚NŸ0‰7…0€“0# ¡“7ˆ
›
~
“#—L~M‰^¢
|…#£)Ž
’‰P…’€“7
 |ŠœˆM|…0„ —%“#{|…|Š¤}#~
|{…#| ˆ¥}“¦„7ˆ§ƒ›~
‚%‹#“  cytoplazmatickej
membrány tvorenej fosfolipidmi a bielkovinami. V }#~
‚%…ƒW£%}7|UŠ
|–Ž¨“5{ …•
…#5“‹#‚¦Ÿ©‹#|ª#~
‹#ŒƒW‚N‰
bunkovej steny pôsobením rôznych fyzikálno-chemických a enzymatických metód.
Fyzikálnymi metódami sú napríklad: mechanické drvenie a trenie buniek, opakované
zmrazovanie a rozmrazovanie buniek, “#—’‰7˜|…#‚)|‰P¦=~—0‰€“#Ž¥«M}#~
‚¬‚%—“Œƒ‚9ŒƒW›­…‰€)|“0# ƒ›
€#„ˆ§|W%£%…U7¢§€YŽ¨®5{|™‹#“ƒ›Œ‹0—Ÿ k ich degradácii).
¯ ›|ŽU‚)ƒ€0š©‹#|ª#~‹#Œƒ‚N‰–0‰7…0€“0|ŠOˆM|…0„¨Š|\ŽO“#{…#•\‹#“Pˆ
‚%›#…‰Ÿ\}“#ŽO“ƒ“‰°‹#|±|~=ª|…“©€“
²=³µ´U¶#·¶#¸¹º»T²¼7»%½¾E¿²
·¶0À0ÁÃÂÄ0Å\Ä#Æ
Ç@ÈrÉʦ¿·5ÀÌË]ÍÎLÏ#Ï0ÇYз5ÑO·¹·0¼Ã·5ÉÒÓÀ#Ê%¹Ô#Á¹ÕÌÉ
·5ÖÐ0³^×MØWÓ¶5Ê)¸»%Ç\Ô0¿·0É
Ù
É
·#ÖÐ0³^×=ØÓÚM³3Ѩ·»%¸Ô0¼7»ÛºÜ»%ÊÛÐÊ)¶#·Ý5ÙÕ#·K¹ÕÓÉ
ÓÔ0¿¸LÉM¼ÞÓÔ·ß½=¸LÀ#·»%Ǚ¹Õ#»%·#É
·#½=·5É
ÑàÓW»¸á5·KÉ·#Ö¿=·#Ô#·0ÝÞ² rôznou
hodnotou pH a koncentráciou solí.
Ũ¸Ò#É
Ó¶#ÓâLÀ0Áã³7âÊ%À#·#ÔäÀÓåÑO¸Ñ?áÉ
¾À0º¤²
ÓæÖÝ#ºP×=¼Ú§¸æÐçF²·á5¸À#è9Ñ
×и¹Ê%½Ê)¹Ô5Á5¹Õé¸WÀ’ÖÁÑO·5Ý^ê
ë ÓÚз¼ìèNÝÓÀ¸ÚE×
Ê)¸+¸À0ÖÁÑOºí²=³†ÀÓÐ#É
èÛÔ»)Ӷ߼
baktérií lyzozým, u kvasiniek komplex enzýmov
z hepatopankreasu slimáka záhradného a u rastlín celulázy.
îðï¨ñòóWôöõM÷øùúûü0ýOô)þWÿû
þYý¨ûÿ0ñ7ÿû
#÷ ûïù ñ
5ûEÿ#ôYú
ûþÿ%ý óô=þÿ#û¦ñ
þÿõû ú!û"§þ?ü#ûõïóñ#%$7øô ù)ï&
ÿþ”ñ 0ñÿ#ô)þ&0õ=û#òM÷’ý
øWù0÷'7ï[úû(ïøWùïò
ô%ü#û
)+*,%û-ï+0ñ7ÿû
þ.
V
steny napr. pri gramnegatívnych baktériách. Po narušení steny vzniknuté protoplasty
ïWý¨û
ûÿ#þ¬ú#ò
ï,.ï..$Yúû#ô%ï, ÿ#ô)þ+%$ û!
ý¨ûõ=ô%ø/(0=õï1ô2%ô3*û
5ïÿ
Zvyšky materiálu z bunkovej steny a 4576,8:92;=<&>?:;/>@1ACBEDFG3;&HIJGK< LNMOP7;-GQMJGR@&?:SBP-TE6-<L%ANURP
V
V
;+DFW,SX=FYY;/GZ9[\P,;-S7AN?.93]CM>@-P-93FM^+_E< 45-678:9R;"`?:FOGRX&DBa4b7S93H< I0`?:9JFYY;-cdF4</SUeO93F`FGBDEX&?:F4f
8
hlavne RNA a ghRikj3lmno3pqrlstmu:vxwyz/{|g}~€ ƒ‚a„…nhR†&‡,†&pvˆni-‰Šl‹wŒmŽdsNmw:jR†&g‹-‘’nJ“/‡7hRi&gK”
•=–—˜Š™š-™›2šœƒžŸ ¡t¢&£¤¥-¦7¡t—¢&§¨:š&§©Š¡N—–…ªJ˜d¢&¦«1ª-¬­š® -–¤J¯­š-™›2š°›3±™—–š.¬²:›R³Z´µ¨:— /¡N—£ª¢
rôzne
¶·1¸t·/¹.º·&»7¸C¼¾½t¿ÀÁ·-»7¸tÒļJŊÅ:ÆR·Ç=È=¶½%¸N¹:É&»·-»Æ2·ËÊÆR·-Ì3ÍÀÄλϽ­Ð€Ñ,Ð1ÊJ·&Ñ-¿·#Ò1Â-Ó­·ËÊ ԵÕkÖ3×ÖRØÙRÚ-ÛÖ2ÜÝÞNßà:á
ÛEÚ.â.ã¾Øä&åà:ß7Þtä/ÖZ×Ö3æ'Ú-Õ-×ç|ãJÕ-Ö3×ßÝéè.Øä-×Ú1ÞCêà%ê/â%ã
Ú
æ-à:ë&ì,Ú.â%ã¾íÖRä-ÙZÝßîÖ3×ïð:Ü×Ú&åàdñ+òNä-×ßÙ3Üó&ôÙ3ßà:ßòNßà:Û
alebo degradáciou bielkovín na nízkomolekulárne podjednotky nešpecifickými proteázami,
þù&ûþ1øö ü ú3þúRù ÷3û øtú3ù¾ûþ/õ÷ü þé÷%øNö:ü/ûù&ûúRù
ù&ûý ÷ þ ø.úQø ! þ øNúRù #"%$ '&
,ù(
)+*,ù-ö:þ÷+þ-ûü ö.&ý-û+)aú #"0/ ü&ý'þú21
ûù,ú2þ ú
#"0/ ü&ý,÷+43 65 ù&ûþ1øö.÷+þ-û7 þ- ö ù- ü1ø)8­ þ ÷õ9:* ý
)7; þ=:< ûù ÷N øCö:þ>?<@ ù-û7øNö:úA2-ü ú3÷ ûþ&õö "'$ þ ûù&ý-ö:ükþC<=
Nízkomolekulárne komponenty sú naopak rozpustné a ûþËöt÷ýB ú3ù ÷ 5
napr. pronáza a õö:÷7øtù&ú3ûü&ýkþ ÿ
etanolom.
D'EGFHIJKML
N.OQPRSPJ+KTL
N=U!UV?JEWRXU2U!IKPEWOJ+H
YXZ[P
\^].OEW_`Iba.OcLJd'OQN=IOeH
\f].J
PR([email protected](IKPEWORV
[email protected]'l+KfI+PfOma.O[Hno+j.UIF[IKPEWORV,EGJPFEUV?JHFI
R6H lyzozómoch a len pri
v bunkách. V
ZJd'J
pOI
UV?R?XBUUWqrPOs tCuwvxy{zk|i}~|@@y{z€+
y.uw‚+zƒ„€…†‡ƒz€
ˆW‰?ŠB‹…Œv
y.‰BŽŠ+‹„u={M
x[y=x
‹:@x
€+z’‘“ priebehu
‰ˆ‰Žx•”‹?xˆGu–ƒ
—Ž
x v
x^t{zv+z.‰˜v
y.‰™ixšvx@y.‰™‚ƒ
—˜zf+y=›?”uœfu™žiu€—žvx+Ÿ'”W‰ƒ+€+…†Mu‚
… ƒ‰
x¡|.ˆGx
k degradácii DNA
prítomnými DN-ázami.
RN-ázy patria medzi termostabilné enzýmy
Ÿ u==[|.”y.x
€—¢xv?@”`ŸwzfŸ˜v+£e‘¤’y.‰™¥xmvx@ˆu?–‰ƒ
”2‰w”Žeu€+@”œ^”¦@…¢§‰wƒ
”W‰€‰+…cv
y.x+‚ˆ‰Ÿ0u™i”€—w¨=Ž
ˆWuœƒ
‰©v
y.”
'
ª«?¬­G®¯ª2ª^°#±%²¢³:´+µ·¶¸+«?ª¹ªº
»
ª¼^½h¾i¬¿=Àcº?Á­W¶®«?ÃkÂ+¾@¬+¿.Ä%ÅCÆmÇÆÅ{¾¥¬ÉȬÁʽËÆCÌ=ÍÎÈ
¿.ª‡ª«?¬­ÆÇBº+ϯ»%¾i¶¯»
º
ªÂ®¯»
a
na stabilizáciu izolovaných nukleových kyselín patria hlavne:
a) Bentonit:
ÍfÇQª`º
º+ÏЪº
»ª¼^½¦¾i¬
¿ž¿=ª¼¬º?Á­W¶?®«b« ¿.Ñ
«º+À¯B»8«B¸+¿.¬Ì.¬+Ëk´M±%Æ=Ì.ÇÆ+Å@¾i¶ÇÒ.ª2¶ÓÅCÆÔȬ+ÁÊ?½ËÆ
v koncentrácii asi 10 mg/ml.
³ Ì.¶ ÍfǪº
ºÏÕ ªº
»ªG¼½h¾i¬¿.¬
Õ
š
Ö.×ØÙ
ÚÛÜÝWÞßà
ážâãÞBäÙ åfæ×Ú
Ù
Ü ç.è à?èÜÝèé
ß Ú
è ê'Ùé×ë=×Üßì×W× èÜ+íiîïÚ
Þä
Ù ìÞÚ?í@Ö.è ÞÚ+àðêñےá
V Ú
×2ÞQÜ+íiÙÖ{ðìäTò
Ö.îòèé
ÙìäóäÙ,ï^ô.èQܹÚÞBêñÙõ?Ú
Ù¹ò
Ù+Ûõ×öB÷øÝGÞØÙùê'Ùé×ë@×Ü+Ûú§Þ[è=úcç.èê'Ù+í@Ú
û[ÚÛÜÝWÞÙ+ïû
b) Dietylpyrokarbonát: (DEPC, C2H5–O–CO–O–CO-C2H5
kyseliny. Pri práci s üþý!ÿ
!"$#%!& '()"#*+,-/.#%021 e silne
toxická a karcinogénna.
3 45%687:9;<2=?>97/@=?>BACDFEHG I</JKLM>BNO=%<QP<R=SK ;<[email protected]> VGW@ viac
ako 95%. [email protected] YQPN[ZMN\G ;</>]ONP+@_^`PaG bcdN ]@_6 IN[[email protected]$KePf"Zg@+Ohji >IKk`lm> [email protected]@_]_ZS=%;VoI>I<>
c) Heparín: v koncentrácii 50
z roztoku nukleových kyselín je problematické, a preto takto izolované nukleové kyseliny
Ia>,6p@[email protected]@aKJ<RqIN9;mkU9;<;g>UZ$=%;<rOs,I>LtN IN 7/uGv>k
d) Prirodzené inhibítory nukleáz: patria medzi glykoproteíny a inhibujú nešpecificky.
w
G bcdN ]@_6[[email protected] >IUKxLM>{P}|NO~</i [email protected]<R=?</>@T6~>]G> I€k
e) Polyamidy: spermidín a putrescín inhibujú ribonukleázovú a deoxyribonukleázovú
aktivitu.
9
f) Aniónové detergenty:
napr. SDS, inhibujú ribonukleázovú a deoxyribonukleázovú
$‚yƒ „ …a†ˆ‡„‰Š‹/ƒ Œ/Ž ‚‘ŒS’“,Œ•”U“ ŒRŽ‘…UŽ–—† ’‰Š’a˜*†‹/…’™š ›’[–’œ‰—†vŽžŸ‡ › d„’_œ¡…„
nízku cenu a Œ—¢…£‚}ƒ Œ/…’–¤„¥‰’Ž¦ ‹Q™„‚§™ † œ~Œ"ƒ „$˜?’}ž
g) ¨©ª«­¬'®d¯©°/± ©²F³´¶µ ·¢³·/¸¬¢¹}º napr. citrát sodný, EDTA (etylén-diamino-tetraoctová kyselina),
»v¼$½¾+¿ÀÁ¾à ½Ä/ÅÁÆ'Ç/Å}È_É¶Ê ËUÌÄ/ÅÍ8¿Î Á¾ÀÄQÏÁÅUÐÑÆ'ÎÒÓ¤ÔÄÅͧÔÕÁÖgÎpÑÍd×?Í,ÆQ¾×?Ä'ÃoÑØpÙÚ"ÔÁÏÎoÅÄ'ÎÕ¾ÛÍ¿UÐ ÖMÎ
ÙÀÇR×*Á+Ü8ÅÁ"Ô$ÝÞ¿ÕÁdÖßÜpÁ"à Åàà ½áÑÍ×%ĕâ+ÅaÁaÕäã*åçæ 2+
ÙÀgÎ×%ÁáÄ/à ½êÍÑ×ÄQÕÄR×SÐëÖÎìÜpÁ+ÛÅØBÄ/ŽĕÏ+Á+ÕÍdÝ
, Mn2+èé
ÙÀÇ/¿ÍÕÑÁÜ[ÑÁ+ÜÙÆÎÂÁ×SÕÁÀÅàaÃ,½pË,Ä/ÅÄ¿Ä'Î Æ%È
aktivitu a
íÀÄîÄ/ÓÁ_Æ/Í Ë Åà+Ã,½ï×?ΠýÅÄ/ÑÒ Ã ½ðÜpÐ}ÔÇÜ~Îñ¿aÏ+ÍÝïÍÖHÅaÍòÜ8ÁÛ ÅÁ"ÔÝóÜpÎUà ½aÍ,ÅÄÃÑØ ½aÁôÙÁõÌ?ÑÁ¿ÎÅÄ/Í
vysokomolekulárnych nukleových kyselín. Vzniku krátkych fragmentov nukleových kyselín
ÖMÎöÜ8ÁÛUÅa؈ÓÍÏÀgÒ,ÅÄQÝ÷ÁaÏÜpÎ ¿+Ó,Î,ÅÇ/Ü ÙÀ$Ðy¿ÑØ ½Á[ÙÀÎF×%ÀÎÙÒÕ+ÍÅÄÍöÍ\Ü8ÄÎÌÍ ÅÄÍöÀÁ+Ód×%ÁÑÁÕ:ÅUÐÑÆÎ ÁÕàà ½
ѾÔMÎ,Æ/Ç/Å~Í{×%ÄÎÛ¥Õ¾ÆQøyËUÎ ÅÇ/Ü:ÙÁaÐÛÇQÕÍ ÅÄÍöÙ_ÄQÙÄÎ×ëÓ
úzkymi koncami.
ÏvÐ"ÅvÑÁaÕà+à ½¤ÁÀæÍÅÎ Æ"Õ¾ÛvÍ ¿UÐÖMÎÙÁ¿ÁÏÅØ:ÙÁõÔ%×SÐÙ¾¤ÍoÑÁùÙvÀÄ}Ä¢Ó,Á_Æ/Ò Ã Ä'Ä"ÏvÐ"ÅvÑÁaÕyÎÖ
Izolácia DNA z
úxû`ü é ÙÀÄ/Ë Á_Ü ÔÍðÅÍÖÙÀ$Õ Ä/ÓÁ_ÆýÐ Öø ÙÀÇ'ÔÆQÐ}ÌÅØôÁÀæÍÅaΠƕ¾ é ÁaϾaË ÍÖÅÎþÙÁÜ8Á_ÃÁaÐ ÃÎÅU×ÿÀÄ*ÐæÒ Ã ÄÎ
ÑÁÅÃÎ,Å×%ÀÍ ËÅà+à ½æÀÍ ¿ÄÎ,Å×?Á_Ão½ÀÚÓ Å¾aà ½8Æ'Òd×?Á+ÑÅaÍÙÀdÈÔÍ Ão½ÍÀâÓ ¾8Í ÆÎÏ
Á ĕà Á_Æ/ÆQÐÈ
v
Princípy izolácie RNA:
íÀÄæØ,ÅaÁaÕà+à ½BÜ~Í,ÅÄ/ÙÐyÆÒ Ã Ä'ÍÃ,½ëã*×%Ä/ÎoÛ§ÙÀÄt¼*í
é ÑÍÙ}È è ÔͧËÍUÔ$×*ÁùÕ¾aÃ,½Ò¿ÓÍ§Ó û§ü é ÙÁ¿dÍ
Í ÆSÌÁ_Ü[ÑÀÁÑÐ Ô$¾aÅU×?Î×%ÄQÓoÐ ÖMÎ{úxû§ü8ÈUÉ ÏÎÛÅÎ$Ötà ÄÃ Í ÕyËÎÖ2ÏvÐ"ÅvÑÎ2ÖMÎ ÅÍÙÀmÈÍUÔÄ -5
ktorej sa v !#"%$'&)(*,+-/.#"0!2143656758:9/;<=?>
@BA0CEDFGD/
(H!#<'&#I*"!#5J+=9K>
@BAL
>
@BA:MON:P#"Q(SRJTU(S1V",(*5W>
@:AX8:Y.[Z]\/^!#RJ(*"!Y1&)(*1\RJZ_+="`aR=5b&Scd
5J3s&[j^-t!#"/$'&S(*,+J-%.e"vu/5t$5w+="/`aR=5s&)(S1:+x"/`Q8B1^"Q(*"!#5 i
rôzne malé jadrové
.e"W1V\/^f8:5/<=gh&["=!#5J+=,cd=5'8:5=\/5J-
g/;5J+="Y.
\j^!#58BQ(S5 i !#IS1k"%CB"/;"RJ(S!*56IS5!#g7/Tl/;k"365m1475JTR=<1V\R="Y.n\/"/<o(S!Y1I- i
i
9/\/1V"JMODpqr7
celkového
g<J<yw8>
@BA:MzO![RJ(S1\RTt+sP#"Q(SR6Tt8>
@BA
\/1\/+xu/{V\/^K3J-x<1V"RB8Y.YZB<yK|~}6R=5<\/1s=5=;Ty€YAp7R=5<u/"/<1V"/C'RJ(‚56!#gp$5y+65'`2-%.#"K1\j^175';9/\/14-
chromatografiou na oligo(dT) celulóze. V
g RNA.
8q<y56^J„6\/^…!#{4=/$5=\/^
IS1<'1ƒ(Y<y5y-
&[†$9‡Zˆ&Y="oP#<y"‰=5J-=o1ƒc
i chromatografia na benzoyl alebo naftyl celulóze.
Izolácia mRNA má význam len pri získavaní eukaryotických génov, ktoré majú
mozaikovú štruktúru, kde sa striedajú kódujúce úseky, exóny, s nekódujúcimi úsekmi,
1<o(S![Š6<8:1SM‹RJ(S5:5! i
<1475J+=/<=g
i
g<JTB3Tl=5B!#"<5s&#"0$5l36RJ(*g!Y1{s3=5=;Œ1~<"/Ik-x<JRxuj<ygJMJ!#"/;98>[email protected]"
komplementárna len k exónovým sekvenciám.
Proces, ktorým sa intróny vyštepujú
a jednotlivé exóny spojujú, prebieha na RNA z primárneho transkriptu a nazýva sa zostrih
RNA alebo splicing.
10
’‘#“/”–•—˜K™nšB›_œ#K˜:žŸ ¡K”¢ž£žJ¤x¥,¦’”Œ˜§x ž¨‘#/©/”4¨=”–•*ª/©/”Vžy§«¨yž6£4¬¢j­'˜:žJ¤=®'¯J•‚ž6‘#ªOœ[?¢¥/£žŸ/ ªp ¥
¨=ž¢/ ¥Q•S¯J§x®vŸ‰°=”/£¯=žy¤=” ¬±¤=¢ ”Œ¯=¥YœY—x©/† =¥†‘#”4°=ž¢­˜:ž'©²
˜:³Ÿ§
‘[/¥´=žJ¤=¥,¦
µ[ž
¶Y¨=/©/”·)”V©¯¸=˜B”
¨‘#žo•S”£ªQ•S¯=¥j˜:”=¨‘#žo•S”¯=ž'˜¨=£V,•S Yœ¹°=”Vj£¯=žJ¤=” =JºJ»n”–•*£Œ”4¤6žµ)¦0˜:Q•*­'¼o¬µ#¥pJ¶)•*p¢¤¬x¶)§%œap¨‘#”'¨=žJ§=Ÿ”–•S½x¥j·*”Œ ”ƒ•Y y[œ
©²‘#ž'˜:¥Q•*ž6´‘#¥·S”k¾ y¥¾˜:ž ž¯'£ž ª/£ =Yœ¨‘#žo•S”£Vª,•S¯=h¢¥¯=žo•¤= =Yœ ¥¾ yžbµ#”“j”SºÀ¿~‘Y”p”¢ž'£ª/©/”k”¶Y¨=%©j”V·Y”V©¯¸=©/²
˜™
šB›‡µe¥Á¨‘#žo•S”£Vª,•S¯yžy§Â¨‘*žo•S”À°=”V/£Œ¯=žJ¤=” =Á¯=­=¼JžJ¤=¥/ žJ§Â¨‘Y½kµ#£4§ˆ¶# žJ§Ã˜K™
šB›
¤¬¢%‘#ªŸ¥Yœ[—è=ž£¬y¢­'˜¬=®
ktoré ju práve syntetizujú. Z polyzómov sa izoluje RNA, ktorá teoreticky obsahuje len rRNA
a špecifickú mRNA.
ÄlÅjÆÇ[ÈyÉËÊ:È6Ì%ÍÈsÎ)ÏjÈyÉËЌÑjÈ6ÆVÒ/Ó/ÐVÔÕÉ=Ö[×jЃØ*Ô[ÙdÚÖ#ÅÛ=Ó/ÐVԏÊ܎ÝÞXÙaÔÂÚÖ#ÅÛ=Ó/ÐÈ'ÍyÒ/Ó/ÐkÅÂÓ/Ô/ÆÛ=Èyß6ÔYÙhÊÜ
ÝBÞ
ɈÎSØ*ÈoØSÍÈÊ
áÖ#Å/âÐkÔ/ÍØ*Ô
ÅÆÔã=È
ÔjÆÔÛJØSÖ#ÈÚSÈ6Ö#äÑ/ÈJÉ
ÑÅ
âÔÍÅQØÉ=Ö#Å/×ÍJåyÓ
napr. centrifugáciou v à
à
æ
È=âJÊ:ÐkÔ/ÍyÈ6ۈçèbÖ#ÅÛ=Ó/ÐÅÁÊÜ
ÝBÞ0éÀÛJ؂ÈJÖ#ÒêÑjÅÐÎ)ÏÉ/ÙeÔ
obohatená
ÐVÊlÉxÍÈ
Ö#Ô/Ó/Ð
æ
o
æ
æ
ÖYìVÎ#ÆɈÇ#Íí
æ
in vitro
ÊÜ
ÝBÞ:çïîÐkÔ/Æ4Û=ÈJß=ÐÍÍ=ä
ЖØ*Å/×/ÍJå=ÊÐJØ*Ô/Ó
Ö#È'âoÉ=ÛJØë
ÍÐÛ=Å/ÊBÐVé'Å/ÆÔã6ÈBâÔ,Ø*ÔÛ=ÓÐÈyÉ:ã=ÐÈ=Ó
Ù[Ô
Ê:È6ÌÍyä
Å/ÍÅ/ƌëyÑÈJß=Å,Ï
ãJÉxð
Ô/ÊBÐVÓÛ=ÔYÙeé=×jÐã=ÐÈ'ÆÈ6á=ÐÓÛxÔYÙÅÛJØYÐ4ß=ЖØSëxç
à
ÍyÅ,ØSì–ß=ÍJë=ÊBÐr܎ÝÞ
ÙeÔ
ÈÊ:ÍÈ
È
ÈyãØSÐÅÌÍÔYÙQÇ#ÐVÅ
Å
ko s DNA, najmä pre
à
Ö#ì–Ø*ÈÊqÍyÈbÎSÏKÜ
ÝñYÒÑçJÜ
ÝñYÒÑ/ëFÎ)í
æ
æ
à
Práca s
ßxÇeÅ/âÔ
ßÑÍÐÛhÉ=Ö#×/ЖØ*ÔYÙpã=ÐVÔjÆÛ=ÈJß=ÐÍ6ëFÙeÔ
Ö2йØSÖ#ÅÍ=Î#ÆVÒ/Ó/ÐkÐ
Ö2ìƒØ*È6Ê:Íä:ÍÅKß=ò×oÇ#ÐÍ=Ô:ÆkÅã6È6Ö#ÅQØSóJÖYÍyÔ
æ
ÈhÎYÛÆVÅ/ésß=Ô/ôaÛ=ä:Ê:ÍÈÌJÎ)Øß6È
à
je ich na prstoch experimentátorov a nachádzajú sa prakticky vo všetkých biologických
materiáloch. RN-ázy sú navyše vysoko termostabilné a ich komæ
ÅÛ=ÈÂЌÍ
ÆVÔ,ØSÍyÒKÐÍ
ÐãxìVÓ/ÐkÅÙaÔpÍ=ÒÖ#È=×ÍyÔ[ÙQÇ#ÐVÅ
à
Ð4ã=ìVÓ/ÐVÅWõÝBñYÒÑéöÛJØSÈÖ)åʱÎSØ*Å/×/ìpÈ=â'Î)ØHÖ#ÒÍÐ4ÏÕâoß=ÈÙ#ÊÈ'ÓÍähÛ=ÅQØYÐóÍJëxçÀ÷nÅã6È6Ö#ÅaØSóÖYÍyÔ]ÎYÛ=ÆÈvÎ#Å
à
Ü
Ý:ÞøÈ'â
prácou s
æ
È6Ö)íx×%ÅEßë
æ
Å%ôQÈyß6Å%Ïù
È=âJЌÍJë
à
æ
Ö2Ð=úsûü
æ
Ö#Ô/â
o
C. Z roztokov a materiálu z plastických
hmôt sa RN-ázy odstránia dietylpyrokarbonátom (DEPC).
Princípy izolácie bakteriálnej DNA:
ÝÅýÐ4ÑÈ=ÆÒ/Ó/Ð4Éþã=ÅÛJØ*ÔÖYÐVÒjÆÍJë6Ó
õÝBÞ
ÎeÅÿÍÅYÙe×/ÅJÎ)Ø*ÔYÙaÇ#ÐVÔ
à
æ
ÈyÉ=Ìì4ß=Å
ÊBÔQØ*ó'âÅéqÛØSÈJÖ)í
ßë
æ
Ö#Å/Ó/ÈJß=Å/Æ
Marmur, prípadne jej modifikácie. Pri tomto postupe sa bakteriálne bunky opracujú
Åúsû ÖYÈÑQØSÈÛJɾÎ[Å/Ó
ÅÖ#ó6Ñ/ëyé
Ö*Ð×/È'ÊtßÑÍÐÛ=Å[ÙYí
æ
à
lyzozýmom pri teplote 37°C v prítomnosti EDTA
Î#ÚSäÖ[È
ÈJãsÎ[Å
æ
ÆÅoÎSØ)ëyé'ÛJ؂È6Ö#äpÊ:ÅYÙYíF×/ÐÅJÎ)Ø*È=×ÍyÔ?ÑÅ%Ó
É_Ù#Ôhßå
à
ÈJß=Å/ÍoíãÉsÍÛ=ÈyßíUÎSØ*ÔÍoÉ~ç/ÝÅ?Éß6È'ôaÍyÔjÍÐVÔÓëØ*È
à
È'âÍä
à
æ
ÈyÉ=Ì/Ð4Ï
æ
ÆÅÑoÊÅ,Ø*ÐÓÛ=ä
È
à
!#"$&%%'(*)+-,.'0/1
234567896.
:;=<?>
@A .
CBD
EFBD
GEHI
CB#KJLNMEFOP:-;9Q/R63OP7.<.OST5E.O6U
2BV6/
EF?WHXE-OY A Z
2E[U
/;'C7.\U
]F
R
2E[U
/;!6.O^;
_\OZH A ^Ha`&/CbBD
CHQ/;Hc5'd.`O&Z;/Ha=
5M @eA /96fHSKJg A .
2B+
2EFBD
>
hji^k
BD8]FBlmEF
CH
O[no7.OBD
pEo7.cBl`.5 A p
HXE-`;'q7Y=
CB
27O/
O&
;
r-U.O/ @ I 5;
odstránime kontaminujúce bielkoviny. K lyzátu pridáme rovnaký objem zmesi chloroformizoamylalkohol (24:1), miešame asi 20 minút a vodnú fázu oddelíme centrifugáciou.
s @A `t
`vuU`E-Ov
:96.O A ;<fv7.O&]v;/HQ
v/26.Ha'w7
1
2B 5O6.HQ;=<\v:aHQO
BlEFau`EFO='T/U
.`#
:963O A ;=<f^:QeH/
2xOy5Oz67
/;D<.DEFBy6j
2O @ /M @A .
2E=7>K{?neO2QHU7
2/O_
11
|.}l~G€‚Iƒ„e…QT†-‡ˆ‰2ƒ€.Š5‹‰5ŒˆŠC…QŽw|Šƒ‘’e„d“f~•”F…–—™˜ešN‹–U€.„&›Œ„#| Š€œ„QŒ›2}l9€.Š’žKŸ? e„ƒ…Q„e}l|.„
Š„›¡&“.~
ƒŠ5¢-–~ƒ‰5£•›}
|.„„€3Š2’ˆ-€.„ŽG€.~F|?–„~¤¢‰F–¢€.„[ ¥’€.„&’F~c„¥€.Š–~Ž5Š5¢§¦}l~ƒ’Fc’F„
€.„&›–UŒ›‰¨¢‰}lc’F5~—[˜G©#¡›C…~=Š5¢2ª«›‰9|f~…c‰¬’Ž|›9„}l~«’FŠ­|Š[“.~Œˆ¨¢ŠƒŒˆV€3„›ŒaŽZ’€.&”F„Ža}
~–„&Š…ŠC}Z˜y®¯Š–„}DcF¡“ž°Œ¡Z±²©y³´}DŠ2”=ŠZ’
¢5Šƒ~“µ’‰WŠƒC|?–U€.X D-›¡C¶2ŒŠ¡·| ribonukleázou
(¸&¹aºK»¼K½K¾9¿aÀ=Á5ÂeÃPÄÅ\þZÆw½KÇ\ÈºÉ Ê ËKÌÍqΑÏPÐ.ÑÍ&ÒxÓ ).
Ô¯Õ?Ö×ØÖÚÙDÛÜÝÞØÖßwàÜ1Ø2Õ3áãâ3äVåäâUÜUØçæ5Ø5ÖèéXê2äßyë.Ûãì¯íXÕîï×ØðÙDÛ[ÜÝCÞä&ߤæ-Õí·àÜØÕ.Û?ëvâfäVñä
òóôõ.ö÷ó&øcùøúFû=üeøXý
ôöýþFÿUóeù5ö
óùöfó
chloroform a .ø ùó\øQó
òóôõ.ö÷óøùøúù
øùøaòö
ö
!"$#&%')("*#+$-,/.10321456+07$#4-&8"*#9-(/!:07&';%#=<7#>#/%?@<7AB9BDC39A-"E#&% F
inhibuje aj potenciálne nukleázy). K G$HIJKML
NEOPIOQSRO+N3T$H7Q U*V6HWX*VYZ-[O
c/de/fEg&hdiBcjk&glmnkoqp/rsgf3tvuw-x&f*wy+z|{~}g&hje€ijj‚$}kglMzƒw
†jkjelgŠŽ{S}cgˆ‘+l’r$“8„7w-fx}kj6}‚‹gŠˆ€c&w
\]^_
`ba
„…‡†w+„$k}ˆ{~}‰w{ˆpgŠD‹l6}|hg&rŒg/fk/tŠ
”•–—*˜6™)š*›œ›œ|• ž Ÿ7¡B¢&£¤£/¥/¦1Ÿ§*¨©«ª¬M­®£¯D°¡-±Ÿ$¨-§*¡ °¢¡²
vodnej frakcie). Extrakciu s ³$´Bµ&¶·¶¸¹¸»º¼´¸½´¿¾¶¸8ÀÁµ¶ÂÃ
Ä1ÃňÆ
extrakciou so zmesou
fenol:chloroform (1:1). Z ¶Ç/µ´Åq³7È-ÉÊ1Æ*Ã˵+̾·´|¶&ÂÍ;¾ÊÆ*´·ÁµÊ=¶/ÀÊÎ|ÃEÅ*µ´;ÂÊ&ÉÏ*È-¼BÃEÅÐÇ+¶¸ˆÃ
objemami vychladeného etanolu. Fenol, ktorý sa neodstránil pri poslednej
chloroformovej extrakcii sa odstráni po rozpustení nukleovej kyseliny vo vode alebo
TE (Tris-EDTA) tlmivom roztoku extrakciou éterom alebo dialýzou.
Izolácia chromozómovej DNA z buniek S. bovis:
Ñ
bakteriálne bunky získané centrigugáciou (10 min, 10 000 x g, pri 4 Ò C) zo 100 ml
ÓÔÕ-Ó&ÖE×ÙØ/Ú«ÛMÜÝÞß
S. bovis
àá+â7ãåä3æ/çèMé$êëì/ëíîïðëòñóêëîìô
õbçö*÷îøðùúüûýEø-ôDþö~øô½ø
v premývacom roztoku (10 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,9% NaCl) a suspendujeme
v 2,5 ml roztoku TES (50 mM Tris, 5 mM EDTA, 10% sacharóza) a inkubujeme
10 min. v ÿíì/ëìô æ ûøèê
!"#$%&')(*,+-&-.0/1
243654789:7;=<(>&)[email protected]/4!6B4&)DC&
roztoku TE, pH 8,0) a inkubujeme 45 min. pri teplote 37 E C v termostate, potom
FG$HIJK'LNMOK-PRQSUTWV
XZY\[^]
F_
`1SQbacdK)F%P"LedfhgdGijWk6HiH"IPdlimOgngoH,mpmiH"L
dvojmocných katiónov potrebných na aktiváciu nukleáz) a inkubujeme 5 min. pri
37 q rts#uvxw!y8zo{|~}|A€y6'{ƒ‚„-…-‚s‚†ˆ‡=u‰Š4‹Œ4ŽŒv‘}‹’|$v“8”•–{6'{‘z lýze pri 37 — C
¦
˜š™›hœ$"ž Ÿ¡4¢%£¥¤
bunkový lyzát extrahujeme fenolom (1:1) a následne dvakrát so zmesou
chloroform/fenol (1:1). Spojené vodné frakcie
s chloroformom, aby sa odstránili zvyšky fenolu
12
extrahujeme
na záver
§
k vodnej frakcii pridáme 1/10 objemu 2,5 M acetátu sodného
¨©-ª«ª¬­®"¯6«!°«±³²­8°´Aµ:«¶¸·ª¹·ªº=»¼=½¿¾º–ÀÁ!­«´"¯bÂÄÃ>Å-ÆÇ­²Èº$ª¾É°ª²ÊÂËÃ-Å
pH 6,0
ªÌ¥Í$­Î!»¼Ï¯
dostatok monovalentných katiónov z procesu prípravy, acetát sodný nemusíme
·º$´¹À¬­8ÐÒÑ$Ó¼$¯©-«¯·º–¯6©-´"¯Ô$­©'¯#­Õª·­Ö°º«4¯·º´¹À©>¯Õ¹×¬ª¼Ø«À!Í$ªÌ«ÙDªÌ¼Ï¯©Ú¬¶:Ûή,­!¹¯«±Î4ª
etanolu (najlepšie po stene skúmavky)
¬¶¾Òº$ÀÁ!­«×½oÓݬ®"À²«´Þ°h½
Ü
ÛÎ1º$ª:©\ª:¾!µ©-ª4¬1½ßÂËÃÅÕӄ«4­6©\ª4°À©'¯È«4­àͲ®"¯«×½ß°¶4á6´«²»
­
premyjeme v 70% etanole
Ü
DNA vysušíme na vzduchu alebo v
¯8â´²À8°ªº$¯‘·º´-¾«ãÁ!¯«ª©ä°®A­²»¬¾6¹×»oÛ6Î!»å­
rozpustíme v 2 ml sterilného roztoku TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0).
Izolácia chromozómovej DNA z buniek E. coli :
Ü
izolácia DNA z E. coli
͖­Ë¬oÔ$¯ªÌ¯!Û«¯ ¬¶¾!«­áÉ»¼Ï¯#©-´"¯º«4¯–¼ÉÔ$ã"©>´¥·ª¹:©-´"¯«²­©>´·º$´¥®0Ù4¾!¯
Ì»o«´"¯²Ótáªx·º´­©-ªæÍ=½¬´hÍçãèÍ$ªx¾×®Aª:Á!¯«ã,©éÌ1»¥«1²ª4¬:¯¼7Í°¯«¶
êº$­©-«¯ê­8°ãA¬«¶:ÛÎëÌ­²°±º$´ã
(bunková stena grampozitívnych baktérií obsahuje 50 - 80 % peptidoglykanov, ktoré
Íh½ì²4ª4¬:­®¯«°«4¯\¬´­¾Ò­«4±7Ít·ª®í¶Í$­ÛÎ4­8º´¹:©-´î­\°9¯´ÛÎ1ª¬Ù©)´ï²:¶Í–¯6®´í«4­©´ðáªëÍ·ñ%ͪÌ!»¼$¯>´AÛÎ
òóÒô6õ$öÞ÷\øùøúíû1ø¥ü=ýtþ1ÿøö-ö
#÷!ö
úû#÷\þø%õ
4øùûö ÷8þ1ÿøöø÷!÷û
øò
"
stena gramnegatívnych baktérií obsahuje len 1 - 10 % peptidoglykanov)
celkový postup pre izoláciu chromozómovej DNA z
gramnegatívnych
bakteriálnych buniek (G-) je principiálne podobný ako z grampozitívnych buniek
(G+#%$ ÿø!ùöúûÝü'&WòóÒô×õ$öûø÷ú(û„þøù-ö)û
*
ú,+-./0
1ÿöúû**21÷¥ûö(
$ þÿØöAôø3
"
existujú viaceré modifikácie upravené pre jednotlivé bakteriálne kmene
k suspenzii buniek E. coli þ1ÿöù4 $)5 -ú ú,-×ôû-4ø~ÿø*ø
÷76 5 98ìú!ø+)÷;:<ú
roztoku TE, pH 8,0) a inkubujeme 20 min. pri laboratórnej teplote, potom pridáme
1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 a inkubujeme 5 min. pri lab. teplote, na záver pridáme
= -ú = $ =?>A@ û4øCBDEBF~þø
ÿ%Òô8÷GH-7ò
lýze pri 0 I JLK ú,õ$ö(NMO4ø%ùPQ69ò Rùøòø
"
kúpeli)
þÿ$ö!TSÿ%
öö $ ÿ%UûV9DWYXZ‘ûü$ú(ùûø3
v predchádzajúcom postupe
13
üþÿ%øòûV'þø ü<h÷þ÷GH-æÿ$øòû
øL
ø
4. Izolácia plazmidovej DNA
Metódy izolácie plazmidovej DNA vychádzajú z vlastností kruhovej uzavretej DNA
(cccDNA - covalent closed circular DNA). cccDNA molekuly, ktoré neobsahujú prerušenia,
tzv. zlomy (nicks), sa v [%\]T^\*_`Eabc<^<\Ydbefgih]bj'kml superšpiralizovanej (superhelical) forme,
ktorá dáva takýmto molekulám vlastnosti, ktorými sa odlišujú od
lineárnych alebo
nickovaných molekúl cccDNA. Ak v plazmidovej DNA existuje superhelikálne pnutie
n
dbh3o[<k3p*\ldq(e\lrO\^1ga_stmf\l\[%uvYwO\.c%eTxWy!z
n
supercoil) a ak je jedno vlákno prerušené
alebo v štruktúre molekuly DNA nie je superhelikálne pnutie hovoríme o forme otvorenej
ocDNA (open circular{|}~€‚Yƒ(„…†‡‰ˆWŠY‹ŒŽ-ƒ† oc alebo sc forme predstavujú len zlomok
z celkovej molekulovej hmotnosti chromozomálnej DNA. Superhelikálna štruktúra je
‘’“9”•‘–<—˜H™š%›(•œ’3’ž—˜™š%›(• Ÿ*’3¡›9¢'–<£1›¤—¥“
¢%›(ž)¦“!œ–1›˜T–1’§“!’3ž˜0‘¨Pž©.“•™Hª2’3ž›«š%—¬§¢­˜›“Y˜—–1•¡—¬
vlastnosti a ®¯°±²´³µ¶µ·§¯¶¸1µ0¹º°»)°i¼-¶½*¾¿À³!Á3»(µºÂ/»7ÃH¶°Ä¹Åmµ¸<ÆÇ*¯²/³9ȹ%Á3³!¯(ÇÉF¶µ±Ê¹%µ»(°iË*Á®*°¶Ì
³!Á»)µ0º²P»ÍO¯¶*½*¾¿Î¸<ÍÄÁ®Fë¸1ÏиÁή»°Ñ'¸<¶ÁPÑ ÒÔÓ%ÕmÖ×ØÙÚÖ/ÕÛÕÜÝÞ%ßáàß«Ó'â1ã0äډÝå(ÕæçYß(èéÖãÜëêWìYíîÝéç!é3ïiéØ
centrifugácie v hustotnom gradiente chloridu cézneho.
ðFñò(óôõ/ò÷öùøøøúWûYüþýñ ÿó õi ø
/
ó !#"$%!'&)(*,+-./0!102+)3+54!
6879;:=<5>[email protected]:!EF75GH92IKJMLNJ9PO<FQSR!R!RTVUXWZY[Q\F:!7EE:!92IPQ\FQNJ:!]^<5>_J`EIPQ!9P:F-7aYHbdc e5f:^GH7,efIg`)Fh2i:Fh
teploty dochádza k ich rýchlej reasociácii, na rozdiel od iných molekulárnych štruktúr. Práve
jHklmjonqporl!s!k2tok;s=uvxwyPz5{|jH}-na{HjHk~{|rl€l!yPk2u‚!y}ƒs!…„†n%yPlu5‡?y8wƒ5ˆd‰KwMzŠ$‡q}k;l=u5jon5€v,kK‹dn%yz)Œ}-v,rna{HjAr5ƒ
napr. lýza varom (boiling lysisŽm’‘“•”!–K—”!–;“P˜—™š\–2›-œd™ž$”Ÿ 5¡¢d£KŸM”ž¤H”=—5¥o¦†¢™§‘“¨§5©
ªm«¬ªm«¦2­
lineárne formy DNA denaturujú na rozdiel of sc formy plazmidovej DNA. Po neutralizácii
prostredia na pH 7,0 (pridanie acetátu draselného) dochádza k tvorbe agregátov DNA, ktoré
š[™¯®†°¢d±²8°³³™–“K´ µo¶;·'¸H¹º)»¶¼-½S¾!·¿À¼N»)¿Á#¸H¹¶µA½Âº!»!¶¼5½MÃÅĹƶÇ!¼%ÈÊÉ supernatante zostáva len sc forma
plazmidov a RNA.
ËÍÌÎ!Ï!Ì#ÐqÏ!Î#ÑÒxÓÔÕ5Öo×Ø×5ÓÙ8Ú×5ÛÜ!ÝKÓÎ!Ì5Þß!àáÌÎ,ÚØÔÌ-×aÑSßmÛMâ5ãd×Øo×âÔ|ä.ågæXçèâׅØÔ)ßéKÚé;Ô!ÌdÖHÌ5Þß!à
buniek pri molekulovom klonovaní, predstavujú práve vektory odvodené od plazmidov.
êìëÎãdíXéPâ5î~ÑÎïØÔ=Ú%ëéÕ5Û!äÐÌÔãdðÓéAÑëPÔg×%â8ØÔÚëéÕð!ß!éPÔñß!à5Ø$×í8×ãd×%í†ðëÌÔäòåVæXçóÙ%ÚØÔ^ÖH×ôíñےÑéPÎõ×-öMÑÎà-×-ÓMÎmÒ
sekvenciu ori (origin of replication), charakteristickú pre akceptorovú bunku. Plazmidové
ÓÔÕ5Öo×ØHî÷ãdðØ×5ÓÔ ø ù5ú?û[ü!#ý þ)ÿ û
#þ=ÿ
~û
-ü
!ü#û!où#"$
Aû!%Kþ&ü
markers
ü !'K
ú (ù !%)5+
þ *-,X.
ü Pü " /û #þ)ÿ 0
21'3
4'5*5û !o5
ü 3"/5"#6û !7"'82
ù#þ
9
3":!ù*;(!où".
(!ý<*ñþ û Pü
ú(= þ+:9>!7 ü2ùü
?:dù(ü
@3"9>5
û/
A*ü"'$"/0B
C<
(D!6E3F!ýG3"H%û!oü>I!%HJmù3Pü*Kù(F!ýL$(!où"où
klonovaní, patria plazmidy pBR322
a
sekvenciách kódujúcich
M! (
ù "¨ûüN!ü#û! O
ù dþ0PMQ)Müÿ'R3"
S(TOUDV
W
XYV$Z+[]\_^:`
aMbcdeS(fhgji(kklbnmpoq
rtsu+vw
14
xy:ze{(|
a nesie gény pre rezistenciu na tetracyklín a }
~€‚
€:ƒ:„:…‡†‰ˆ‹Š0Œ(Ž/ŽŒM&‘6}’~n“
…M”–•j—˜š™/}œ›“
Y~K€
ž
}™”%Ž5›Ÿƒ:}
Œ ¡ŒŽ¢Ž£ƒ}M™7”'€¤ŽŒ(Ž›“
Œ…“'¥DE}.“€‚™7”%“…
€¦Š<…}œ”%“>”§}
¨EŸƒ„?…©ª€
”¬ŽM”7Ž­}…M”7€)£€:Ž(”'€8Ÿ(Š+~
ž
™”7 H}
©
ž
Ž~«[email protected]}
Ž®™}p›¨Š¯„)›0}°}$ŸŽl~}'Ÿ“$5€n€:Œ“
…M”%€?‘%€?Ÿ H€€KŽ€I”'„)›…(¨±­Ÿƒ:Ž…Ž(›‡†
Plazmidy série pUC sú menšie (2,7 kb), obsahujú polylinker v oblasti lacZ génu a gén
zodpovedný za rezistenciu na ampicilín. Schématicky sú oba typy plazmidových vektorov aj
s ²/³´
µ¶·(¸¹7º·º»µ­¼½¾:·¿¶I¹7ÀÁ
ÂK¸/·ÃÄ0·ºÁ
¶‚»Å]²·M¸7¹7²'¶)Ã0Æ
º(ÀÁµK¶·(¸¹_´
ºÇ´³²'º·
ºÈ]ºÅ–ÉAʲYËṀË6ÍËÅṗËÏÎ0Ë
Pri izolácii plazmidovej DNA z buniek gramnegatívnych a grampozitívnych baktérií
Ð
¾:Å>¹%¶:Å
Ð
Ð
²¶)ʾ‚¶:¿º·p²/³ÄºÅÃÈ
´
²/ǿź¶·
Ø
Ð
²¶:ºÁ
»
ÐÑ
Ð
Åó
²·
Æ
¶6¸¹%·º¶·Ú/ØÃM¹¬³²/ÈA¸ÛÄ0ÜÅÃn³(Ê
Ñ
²%¶¶8´³¾:Ç
Á
¶¶KÁ$Â(²³µO³´³µnÇ
¾?º·'Ò.ÓjÔKÕ×Ö'¾¦À´EÅ
ØK·>ÙE¹7²ÅÃÁ
¶:Å
Ø
Ð
Æ
Å'Òº·
²¶‚¸
Ð
½+¸³(Ê·
ºÈNºÅLµ·
º+ܶ·]ÄÀÁ
³¼(´¶‚·N³(Ê$Ò·
µ
Ñ
ÖÍ$ÝßÞ
ml bakteriálnej kultúry, minipreparácia pri analýze DNA z pozitívnych rekombinantných
þ:³º³(ÄÚYËGà_³¼(µ¶·
º(Ã
Ñ
¾?À´
Ñ
ÊEá+º¶·Ã
¸7Û
³(Ê
Ñ
Æ
Å'Òº·
µK¶·²'º·'ÒYܶ·
ØâÅ>Ê
Ñ
¸Å
´ÅʲÇ
º¶‚¾¦³
Ûº¶:Ã(á
chromozomálnej DNA z bunky, ktorá spôsobuje kontamináciu plazmidovej DNA pri jej
ã¤ä
å6æçè
éç(êë
ìIí%î6ï5ð_ñ'ìòéñî)éñ/äHóôöõ(ê0÷ì‚ô$ø
E. coli na izoláciu rekombinantných plazmidov
éñì:ùúóä
ènô­ùçûø(êåIí'ì)óä
ü
÷ý
þçâèý
ùìälçù(éç(óô
ùä'ÿ
ô­ä÷Mí%ì)õì:ç(í'ì)øú.ø(í7çñýe÷ú
è
/ôåôøü
÷ýþçpí7å‚ä$ø(ê
$ó+æ'êHÿ
éñ/ç7í7ñô
ù(÷î>í6óçè
óEäë
øòéåäMèìùç(óô'ÿéñì–éñî)éñäóô2é
éñì:ùúóä
ènô¢ùç
tekutého LB média ampicilín alebo tetracyklín, prípadne zmes obidvoch, klony E. coli
ç(õ /äþê
ÿ
ô
ñôøçèDõì:÷ä÷í7÷ý
éåä!ènì‚ù
֊
õú!Eô
é"$#
è&%ëô
èô
óôø(í%çñ%ç(ó
ø(ê0åIí%ì¦óçóä'
v prítomnosti ampicilínu ale aj bez neho).
Izolácia plazmidovej DNA pomocou alkalickej lýzy:
(
)+*!,-/.!01325467.8)9 6,+:<;
=?>[email protected]&4E6GFIH!6G.JK,9 4L-NM70:
O
E. coli HB101 obsahujúcej plazmid
pBR322 alebo pUC19) centrifugujeme 1 min. pri 12 000g (stolová centrifúga, pri
(
laboratórnej teplote alebo pri 4oC)
supernatant odsajeme a bakteriálne bunky rozsuspendujeme pomocou cyklomixéra
(Vortex) v 0,1 ml vychladeného roztoku GTE (50 mM glukóza, 25 mM Tris-HCl, 10
PRQTSVU$WYX
Z[]\^_`ba/cedfGcZghcijZkl7mnLa/oP]P&pmqcPrcKik8g/k+s'atkulwvxWySbZg/niIz'{|z}~PR€

lyzozýmu na 1 ml výsledného roztoku

bakteriálnu suspenziu inkubujeme 5 min. v ‚
pridáme 200
zikƒ7kIPbu„7Z7c…n
† ‡‰ˆŠ!‹ŒŽN7‘“’‹”•’‹h–!+Š5—G˜™‘š–!‡œ›7–5‡”ž!›7˜™‘8‹‘+Ÿ'Žt‘› ¡¢£¡¥¤¦§•¨ª©¬«r–­®$§E¯'°
³
SDS) a premiešame obracaním ependorfovej skúmavky (3-6 x,
inkubujeme 5 min. v ´'µ¶·¸7·I¹bº»7¼7½¾B¿
15
± ²
)
À
pridáme 150
æ
Á ÂÄÃÅÆÈÇ/ÉÈÇNÊÌËÍhÃeÎÆ5ÂÏGÐ5ÑGÒÔÓtÕÂÒÖqÆÏ×BÆØÍhÒ+Õ'ÇtÒÙÊÛÚÝÜÞ
ÃËÒç7ÉèÙ+é7ÎÆ5×Ï7ÃêÒ7ÅÈÇëÒGç+ɪìì?åBÜrä&ÂåíËÆeΏÇ/×ÂÒ+ç+Ã5ÏGÉ$ç+ÒIËÃ&î ïåðÜ£äêÂñÃêòÍhÆ!ä&םÆóhÃärÆÒôÍhÃÅÃÏõBä
ependorfovej skúmavky (
ø
inkubujeme 15 min. v
ø
ÒIÅßÇ/Ã!ÏbËÍÃeÎhÆÂÏàâáãbä&ÂBå
æ
ö ÷
)
ÃËÒç7ÒIäbÙù7ò7ÆÂB×
centrifugujeme 5 minút pri 12 000g pri 4oC a supernatant prenesieme do novej
ø
skúmavky
k
ÎtÊ7ò7Æ!ÍÏÃ?ÏeÇ/Ã!ÏqÇNÊúòÍ×3ËÉ5ärÆjÍhÒçÏ7Ã!ÙàØÒô?ûÆäüä&ÏÒIÖΏÇNç7ÒØÍÒÕÈÇëÒ+ÙÊ<ýtÆ!ÏGÒIÂ
/chloroform (1:1) a
skúmavku dôkladne premiešame viacnásobným intenzívnym pretrepaním (roztok by
ø
ärÃÂ+ôéþÿÅÆÂ àÿÍhÒç7ÏÒIä&Æ?ÍÏ7Æ
ÕqÃ!Ù7ÝÆÏàñ
centrifugujme 2 min. pri 12 000g pri 4oC, extrakciu a centrifugáciu opakujeme ešte
ø
dvakrát
Ëeç7Ò?ûç7É!Ù7ÏÒçù
(-20 o
çéÕÍÉ!ÖÃ5ärÆÝÎ Ëeç+ÒIä&ÃxÒGô?ûÆärÃä×Içé+Å5ѝÃË7ÆÏÐÑÒKÆßÇ/Ã!ÏGÒ+ÂLÊKç
äRÍhÃ?ÕeÏ× !ÙÆ
ärÆÏIóhםÃRÃ?Ù7Ò ìEÙôÃ!Æô+ÒÙ7ÒÏÅÆ!ÏeÇtÍhÉÅ!×ÃRÏ×Ö+óhםÃRÃ?Ù7Ò
0,1 g/ml ÒIËò7Ò͏ùÃbÎhÃ
òÍÆË !"#"$%&')(+*,$-#/.0'"12&*3.546"!"#"$%"7$879
ñØÃqÎh× ã áã&ä&× ÏùÇYӏÙ7Æ KûhÆ
70oC)
:
centrifugujeme pri 12 000g, 5 minút pri 4o;=<
:
[email protected]'ST#UD$VWIJX$ZY\[
]4212'DP$).0$#.^*2S_A]?`'JN'abP>3cJX"d>34 12*
].0)d2-JN' e*A' S3$*J
">@?A'>[email protected]%$->2KJML+#'JN'
$2 QCE&f.CAg"$3h
12"12'"
:
a odstránime všetky kvapky etanolu zo stien skúmavky
:
:
zrazeninu DNA opatrne premyjeme vychladeným 70% etanolom (týmto krokom
*2S_5.CA"$JN'idjkP>jlA*_&-am>3.0*+AnoApdj!"#&EP12*2&f4/ DNA. Neodstránenie prítomných
!*+&-qJXL+r'/JN'$s*1.CJN&T$2'/12*2SJI'$3>jt1A'/A'C.CP>2$3cu"$&Th84,FGXH 12*61PS$*2S31*3d2'SP?]cB#'e*b.C&Jdne*v0*).w*+>34x13A'y1P-A&z4ZkA$#c A'C.CP>$c '"$8S*+$#42>_&'#""4a|{m}~[Aa
vysušíme vo vákuu a rozpustíme v 50  l roztoku TE, ktorý obsahuje pankreatickú
RN-ázu bez DN-ázovej aktivity (20  g/ ml)
kontaminujúcu RNA odstránime inkubáciou 15 min pri 37o;s< 12*p.C*JK.C*o>30*+>34€JXL#'
$88A&'S*3d2O?‚'gS+$8'gƒ„.CA">2B"K chloroformom na odstránenie RN-ázy)
#-E0>2r$#cs1_&"#JNES*3d3c%FGH^JXL#'JX'…12*%*2B"e&S'$-712*842#†1‡zrJM*$8=*+1!B*3d2"$'/
A'#].CP>2$3h2JN2'r$8S*+$#42>_&'#"#JN2r&'"(2*@[email protected]]ˆ2W oC.
16
Izolácia plazmidovej DNA lýzou varom (boiling procedure):
‰
Š2‹DŒ30Ž"A‘’T“”l•Ž’EŽ—–˜5™PŒ2‹“3šl–s›DœElžX’7“Ÿ2 "“2ŽP¡pŠ2‹DŒ30Ž"A‘’T“2ŽP¡qŒ3¢
’£5¤2!” E. coli obsahujúcej
plazmidovú DNA rozsuspendujme v 350 ¥ l roztoku STET (0,1 M NaCl, 10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH 8,0, 5% Triton X-100)
‰
pridáme 25
¥ ’¦ gŽ"‚™]5§+Ÿ¨•P•A‹"§2Ž“2©ªŸ¨0Ÿ+–CŸŒ3¢«’z”8–#Ÿ–"š2ž7¢€¬"›D­¨ž7®3¯Cž’°§†›D­žM±³²¦P5™A´wµM¶·’œ
pH 8,0) a premiešame na cyklomixéry (aktivita lyzozýmu je inhibovaná v roztokoch,
ktorých hodnota pH je menšia ako 8,0)
‰
Ž"•2Ž"“8¸Ÿ+A¹CŸ3§3¤q™PŒ3¤žN‹"§Œ3¢N•AŽžXEŽ#™]C“EžNŽ¸Ÿ7§A‹ºŽª8ŸM§2Ÿ2¸3“©ª8ŸIŒ3¤2•2Ž»[email protected]@¼2­½™!Ž"Œ3¤2“¸
‰
bakteriálny lyzát centrifugujme pri 12 000g, 10 minút pri izbovej teplote
‰
‰
zbytky baktérií odtránime z ºŽ“CA¹w¢2®2‹g r“8ŽP¡·™0Œ3¤
žN‹"§Œ”%•2ŸžXŸ2ºŸ8¢q™50Ž"P’“2©ªŸ—¾P•2‘"A‹g¸+’‹
k supernatantu pridáme 40 ¥ l 2,5 M octanu sodného (pH 5,2) a 420 ¥ l izopropanolu,
ó
•AŽžXŽ¾A‹žNŽy“‹yº"”8Œ_’Ÿ2ž¿©"P”À‹Á“8Žºª‘žNŽÂ™]0‘ÃbÄžX“3¤s•P/’‹"Š2ŸA‹)wÅ3P“ŽP¡Æ0Ž"•2’Ÿ30Ž
(izopropanol pridávame v pomere 1:1; •2Ÿ3¢2ǘ§2‹žNŽpªŸ§30Ž¸3”8œ·Œ2ŽÈ6º"ª8ºŽžNŽ¨–#‹ºªŸ3§2‹Ã
“˜–Œ”lŸ3ŠD¡`Žžb§–#ŸPŒ”É•AŽÊÈ ËÌ5ÍAÎÏÑÐ0ÒÓAËÔÕ3Ö2Ë×ÎÏ3Ø°ÙAÏÚ8ÕÛ×8Ï"ÖÜÚÕ2ÝÕ3ÞÊÙ`ÏÊ×ÎßÍAÎËÊÒÓAÔ"ÚË"Ö+ÕàÐCáÉË
árË"ß3ÍAÎÏÉÕ_Ý_ÐCâCÓAË"ãÕ3Ö2ËD×ÎEÏqقÏÚ8Õ/ä"åæ#âCç2Õ8ÖØÓAÕä)âwÕ+ç3æ=èéêUëKç3âwÕ+Ó!ìÊÕ3å
ÐAËÚ#ÞÙPíÆÐ!ËÔÚË"Ó!î+ä"ÞtËÌÏ"å+Õ
NaCl sa s ÎTärÕ+ÒÓ0Õ+Ò2ËD×ÕÌÕ_ïyäÓ!ð"ß#ËPÙPí†ñËrÚ
ÍAÎÏ ; èéêòÖæäÓAðDß#Ë×ðÊÐ izopropanolom sa však
Ú8Õ+ӂÍAÎzÏ@ÓAÕ+ägÒ3íZÍ]árËÀÖ TE tlmivom roztoku)
ó
zrazeninu nukleových kyselín oddelíme centrifugáciou pri 12 000g, 5 minút pri 4oC
Ð]Þ2Ò2ÏDÓP×Ë)â0Ë×#âUÕ2Ý_ÐAË]Ù`ÏïNÏëôÐ0ç3í
ïXË"Ö8ç3Þ=Ò2Õ
Ð]â0Ë)Ö2õïNÏoÝՅÎ×3Ö2Ï"Ó0ä×8ÏPÙÒ2Õ_ÌÕÚ3æÉ×Ëoö]ÎÌfâCÓAË÷×3ÜÉÒ2Ë"Ò2ÎÏ"Ó
a odstránime všetky kvapky izopropanolu zo stien skúmavky
øùAúDø#û"üýü3þ ÿ ùAû
‚ûNûúûü û0ú"ü "! 0ûDü#$&%ù'% )(*#û
+C-ù ,"ü/ý .Xø10-%qýø2 ù- ú"üfþiúMø
30`ý ù4+ø þ5$Cü36.8ø2ù'%ÿ TE), vysušíme vo
ó
vákuu a rozpustíme v 50 7 l roztoku TE, ktorý obsahuje pankreatickú RN-ázu bez
DN-ázovej aktivity (20 7 g/ ml)
! :$;$<%3ù=%3þ>)(*#û
8
kontaminujúcu RNA odstránime inkubáciou 15 min pri 37o9
8
ü8ú-û2ú?.Uû[email protected]ùAú
%rýzú; chloroformom na odstránenie zvyškov RN-ázy)
ùABú +ú"#ü C ú"2ø NDý C%ÿ E(*#ûXû F EúBûrüG 3þ*#ý. ù‡ýzúHE üúI060ýû ûüýû
ùA2û 6CùPJý %Kü Ný2ûrü +ü#þ % 2û ,"ø#ú Ný2úHûALMCþIþ1,HNû ùAýN6O oC.
17
RP QSTSUVXW)S?Y=Z T[J\]^W)_ `Aa^b]c d)efgih'gijeklmnXl'opmlqkr2s#t-gvuXew
oxuHd)yzk{|}ef~2gDu}e
j1€/=gklsmn}e<d)l=uA‚=gDƒ€/…„4d†lA‡g‰ˆ‚4uAˆlA‚-ƒ|gvlAŠ?‹ Œ‚'gŽgi~2e€iƒ|gDgŽˆ€vlH~2d)gvfek1u'oM‘’“dE”•2ud†uˆe•#g—–
l'oR}e#$eknB˜™jed)uA‚-smušfeœ›$+ˆmn:›6ˆ‚4lky˜žj$e‚-nšmƒd1d)e•Ÿ#Bo' gi~2e €iekl–¡ˆ€vlA~2dgvfek¢‘’
j€ie mekl|u'o£sHg+›$=e#=u˜#kF‚'”~my|})d¤me•¥›6+kƒ2| h (napr. Mini, Midi a Maxi Qiagen kit).
v
E co R I (4 3 6 0 )
C la I (2 5 )
S s p I (4 1 7 1 )
H in d III (3 0 )
B a m H I (3 7 6 )
Am p
S p h I (5 6 7 )
P s t I (3 6 1 2 )
S a l I (6 5 2 )
Tet
p BR322
4361 bp
ORI
ROP
Replikón: pMB1
¨¦ §©«ª¬œ­$®†¯#°±i²;ª³
´µ'¬¶)·¸$¬µ
¯¹ºv»¼½¾
Gén rezistencie: Amp (ampicilín), Tet (tetracyklín)
Klonovacie miesta: EcoRV, BamHI, SphI, Sal¿ÁÀÂ4ÃXÄJÅÆ¥ÃAÂ4ÇAÅ#ÈÉÄiÅÊAËÌ'ÄJÍÎÏÄÐÉÑÒÅ#Ð
rezistencie na tetracyklín, Pst¿MÀÂ4ÃÄÓÅ¥Æ2ÃAÂ-ÇÅ2ÈÔÄiÅÊAËÌ$ÄJÍÎ2ÏÄJТÑÒ
Å#Ð>Â-ÃAÆ2Ä+Õ6Ì=ÃAÅÏÄvÃÅʚÊÖ)ÀÄDÏÄv×DØiÅ
plus unikátne EcoÙÚ¿žÖ)ÄvÃ#Õ6Ì=Û;ÜÃAÆ;ÖEÛÝÅۜÕ$Ì'Ä3Õ4Ã×DÃ
ËÏHÄvÃ
Þ ÛœÕ+Ì$Ä/Ì=ÃßAÕ=Ëà¤ÛÂ'ÑÊ
ÅÄÓÆ2Ö;ЍÕ
á¥ßâÐ ÜÛÍÛ ß«Åà¨Ë ֆÃã
Escherichia coli (napríklad HB101)
ä ÜÂ?å2æ5å+ç2åMÙèÃ2Õ6Ì+Â=ÄJËÇÅÎéֆÊAÀÊêÀ×iÊAÆ2ÖÄvë#ІÀìíّîïï5å
18
LacZ -alf a
Ssp I (2504)
Hin d III (400)
Sph I (410)
Pst I (416)
Sal I (418)
Bam H I (430)
Am p
p U C18
2686 bp
Sma I (437)
K pn I (443)
Eco R I (451)
Lac prom otor
OR I
Replikón: pMB1
ð¨ñò«óôœõ$ö†÷#øùiú;óû
Promótor: lac
Gén rezistencie: Amp (ampicilín)
ü¨ýiþ ÿþ
þý ýi ÿ þ!#"%$&#('*)+ÿ,-$ÿ./012ÿ3#4
0
Eþ
þ Aÿ
Escherichia coli s delta lac mutáciou (len pre modro/bielu
ý#1<ÿ>[email protected]'*CDE<.F1#Gÿ8Aþþ8«ÿ3iÿ3=
5 &67#8.3 %9 :!
+;*
ÿ
ý
H >=!IJ=LKJ=NM!0612 ,O
4*N :!
GPQSRS'#T=
19
5. Elektroforéza v agarózovom géli
Agarózová elektroforéza patrí medzi jednoduché, pomerne rýchle metódy na izoláciu,
UVW#XYUZ0U[\#]#U^`_(abW#c#UedYWXUWfZ6b_ghPWX!Yijlknmpo4qsrtW#Vu#UwvxW%vyjz{i|V}~a_-Yb€_%v ab%U_#hP_VW-YW[]#U_
Z‚1^ƒ.bW!d]#W#Xc#Xzh„UXYW*b%[_#‚e_!c#Xzh
fragmentov DNA v ultrafialovom svetle, pomocou farbenia s
c#UXUV.‚ih4…†W-Y%V.U1^hS‡bi|h4UVi|h4…w[Yib‰ˆ{iŠab7Yih4Xi‹d0Œ^h4iŽ!^#vxWyjUu^_#‚eUu!ij_-Œj
agarózovom géli
^Ž„*‘4Xgpknm4o’_#‚W‡ip“”m4o4qS“•z]#{‚iJd0Œ–ai{}‡^—Z6b‰_gh˜W#XYijknm4o™j
agarózovom géli závisí od
týchto hlavných parametrov: od molekulovej hmotnosti DNA, koncentrácie agarózového
gˆ#‚7^…|[iXZib%h4\!]#UeWNknmpo–….jWš›[i&dYU|ai^Ž!U7Yˆ{iX_aœ-YU_–_–i|V4u#‚iŽ!W#XUe_–W#‚W[Yb%i‚1}!Y%U][z]#{4biu-Yi.[ijž_
teploty delenia.
Elektroforetická aparatúra:
Aparatúry na elektroforézu v agarózovom géli sú dostupné od viacerých výrobcov,
U]#{d%ai|‚i|cXzhŸab%j[ih’v›W… Ž!W¡d¢£[iX|¤Yb0^ij_#Xˆ¥j
horizontálnom prevedení, ktoré má výhody
{‚_jXW4abWh4iŽ#Xi‹d0ŒPai^Ž1j._XU_4X¦u[.}.]{—[iX]#W#XYb‰\#]#U¦§_*g_bƒu!ij.ˆ{igˆ#‚7^… j_bU_‡U‚eU1Y6^¨j.W#š›[i‹d0YU
pripravovaného gélu, jednoduchú prípravu a manipuláciu s
gˆ#‚i|hS… Z0UX_#Xc#X¢©XWX\bicXi‹d0ŒPabU
prípadnej konštrukcii aparatúry.
Elektroforetické tlmivé roztoky:
ª b%U«_*g_bƒu!ij.W%vW#‚W[Yb%iZibˆu!W˜d_pai^Ž#1j_%v%¢£jU_#]#WbˆPW‚W#[Yb%iZi.b‰W¬YU][ˆ¥Y‚¦hPU1jˆpbiu-Yi.[}­_*[i
d¢¯®‹°±b%Ud²%_#]!W-Y\>Yijz…;°±bUed²0‡ib\›Yijz—_#‚W‡i°«b%Ued‰²‰Zi‹dZ\-YijzPY‚hU1j|z—b‰i.uYi.[… i‡}c#_%vAXWpj
koncentrácii
³ ‘¥h¥r´_Naµ·¶… ³ ²%¶¸…e¹q+°«‚hU1jˆbi.u>Yi[}4abW–_g_b‰ƒ.uij¸¢—W#‚W[Yb‰i.Zibˆu^­d_Njœ#c!¤U¦Xi^žabU1ab_j^v0¢—_*[i
koncentrované zásobné roztoky, ktoré skladujeme pri laboratórnej teplote. Nariedené na
ab_]#ijX¢·[iX]#W#X!Yb\#]#U7^Ÿd_lai^Ž#1j_%v0¢
X_Šab1ab‰_-j^º_g_*bƒ.uij.ˆ{i’gˆ#‚7^
_ YUW Ž»_[i™j.i|VU1jˆ
hPˆ#VU1^‹h’aic#_d¼W#‚W[Yb‰i.ZibW›YU][ˆ{iVW‚WXU_q
½;¾e¿!À*ÁÂÃeÁ4ÄÅ>ÃÆ>Ç0ÈÉÁ!ÊËÊ¿Ì#ÍοŸÏ%Ä*ÐwыÒ`ÈÓÄŬæÆ>ljԿśËʦ¿ÌÍοPʦ¾¦Õ/ÃeÌÍο¥Å>¿!Ö#Ê¿×!ؘÏ%Ä#٧ыÒÚ
Pracovná koncentrácia :
0,04 M Tris-acetát
1x TAE
0,089 M Tris-borát
0,001 M EDTA
1x TBE
0,089 M kys. boritá
0,002 M EDTA
20
۔Ü݉ÞßàáNâÞ.àã#ä#àåæÞçèàáNæÞé-åÞ.âêSë0àèçÜìâ.êPàèíî7åäæ%ï-ð
242 g Tris báza
54 g Tris báza
ñ¸òó%ô†õ4ö ÷ ø#ù‹ú!ûü|ý¬úþÿþ
50x TAE
5x TBE
27,5 g kys. boritej
100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
20 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
Postup prípravy 0,8% - ného agarózového gélu na separáciu 0,5-20 kb fragmentov
DNA:
!
#"%$&#')(*,+#-/.0+2143*56879"%*
!:6;*<.#379"*=9*">?795!3:;*479.@AB:;*
roztoku TAE alebo TBE
C
agarózu rozpustíme vo vriacej vode, v tlakovej nádobe alebo v mikrovlnnej rúre
C
roztok agarózy ochladíme na 50 D C a pridáme etídiumbromid (zásobný roztok 10
mg/ml
Y
Z
EFGEFHIJLKNMOPHFEP Q
RSUTWV X
C v tmavej nádobe) do výslednej koncentrácie 0,5
g/ml
tesniacou páskou zalepíme okraje podnosu na prípravu gélu
Z
[ \/]^_[[email protected]`ih9[[email protected]%f!mf n [email protected]€%poxgwq‚8uvUxAw!})[email protected]{w
‡ˆ‰Ši‹9ŒiˆŽ!‰-‹N!‡‘“’8”z•%”–ˆ—‡Œ%i•%‰˜š™#œ›Ÿžˆ¡ >–•>¢£!’¤‰¤ž‰ˆ4¥ˆž‰ˆa iB‘¦ˆ¡ t‹N‹9‰˜¤™!›§ i¢
¨©%ª?«%¬­A®¯±°6²³
´®¶µ·¹¸t«tº»¼8º«²½ª!¾ª!©%¿ÀÁÂÀ6ª?ÃB®!Àµ®°®6¼ÄÆÅÁ«tÅ·©%®!¼­g®Ç´%ª³š­g®!¨È¸
dnom z
agarózového gélu)
ÅÁÊg®´{®6³®
É
µ©U­³®!©%ª¼ËÌ·Ã#´{®³Â©%·À2«9·¨º±ª!¾ª#©¿À!Á
Í·Î<¬²Ï©N¨ÁÐÀ!ºÃ·Åѵ·ºÒ­Ó«NÄ!»·Ñ»©%®!îԪ4ª
»Õ©i֜èÁ¾ÄÊϺGÃÕºBή×À8Ø!Å­t¸%­g®Ù ÚÛ#Ü%ÝÞàßáßâã%áßÝÜåäæ8Úçèé/êìëšíïîñðÚ¤òçóÏòç%á!äÝßô6õÚGòÚðßÚaöi÷á
!
ßÝøõâ6ÞÝcäéø6õùgáðßúû üý%þÿý
ý!üÿ%þ@þ
#$$%&%'(&*)'ÿ+%-,./0!ý%þ1234&ý0256789$9ý:þ3;þ<2=%
"
,ÿBDC13E8F!ÿ(>9ýHG ýI9þ=>A#ü!ý$ý.J
"
ÿKL34
ü:>%06 ü[email protected])'#ÿ9
identickým 1x koncentrovaným
elektroforetickým tlmivým roztokom, obsahujúcim 0,5 M g/ml etídiumbromidu tak, aby
ý
>
"
üýN&,ÿO)'ÿP8
,Q?R>.
%þTSU3
C[8þZ%0\ý9@þ<89]Bü^>_22C`8ÿ<2þ1a,HbG
,BD8.
üý%þ8:,0Yd8ÈüýþÏüý,H,H2'L&e)'!ÿ+%
)#ý
!ýþ<2=2
ý
!
>
ýNX>lm,>VG:
"
G#ýXþZY
H>%4>BLc&b27%C3
"
f6ÿ<>9ýG ýg9þ=>'2&Èý
üý%þ232&;G #ýNH2þ1W)'ÿZ%h C8þZ%?iýN9@þ18jK,kR(>;\HBD?XY
fragmentov DNA pod UV svetlom v
)'6ÿPVBD2W
,Q
"
ü
"
>%06*,Q&98%
"
ý,Hþ<šüH&./ÿjþZ,?XNþ
n6ÿ<>9ýG ýg9þ=>'2&386ÿ[Lþ<po
do jamiek v agarózovom géli, zaliatych s elektroforetickým roztokom, nanesieme
pomocou mikropipety vzorky DNA zmiešané s nanášacím tlmivým roztokom.
qsrtu
rHvwExyNz|{}L{~D}2{€<z|tDry€zvE‚nƒW„†…}‡rˆw‰D}Š{zaxy€Zxy}/‹2ŠŒŽ(‘’hvrH{“2z2{u yr}{”@}
21
obsahujú glycerín alebo
®s¯°
£¬
±
±
•N–2—2˜–™NšH›œ0žDŸ ™¡¢• £ g¤ œ¥˜Dœk•XŸ Ÿ
œ-œ¦V §2¨©nžª1«•¨DœŸ ¬1«;£›D ™žH­
U¨–¨¡²–³—«¤´¤I–2¦Vž­µ–·¶ –™¸¬Z£ U¸™Nš9¦V¶ «L¨ 9ª £¹
¬+Ÿ«2½g¨ ?•X¾¿» H˜­/¸œ
²XŸ–™XŸ
£H–2—2«¤W›LšH¨­ŽÀX¸™NšH¦Á¶«2¨ 9ª £¡Â¦\ ˜¦V Ÿ ¨ ?•X¾c–|£hĺLª¬Å•–@» H˜­/¸œ2¤K«E–ž Ù
×
Ù2ÚÃÛÜ
Õ@È
Ù
×
Ù
¦3 ØKÕ2Ý×ÞbÝÒßàDÞJ×
ëVìíDî2ë3î;ï2ðñ?òóZôhõ2íÂöõ
÷/øù(ú
Ù
×ßá
û
Ù
®s¯V°
ÎÒmÊZÍ
Ú
±
±
™X¹0¥žŸ
H™Nº·›D–¸H«›2»«2¼gœ2¤K«
™¡E¦V¡4¨©Ã›³žœ#¦V 9ª<«žœ0ª £¹
¶$™–ĦV«2¨Ÿ\ h£H«2½ ÆÇ?ÈXÉ ÊnË/ÌÌhÍÎÏgÐjÑÓÒÊÔÍÕÖD×ÕØ
Ù
ÊÃÖD×Õ@ÌâZã
ÖEÌâ1Ë
ä
åÂænçVè
Ù2Ú
Õ@é×ÇHÖ/ÈXÉ$êÇÂæsçè
g v závislosti od hrúbky gélu a šírky jednotlivých
elektroforetických dráh)
ü
ýþý(ÿýÿ
1
þÿZþ
ýÿ
ýþýþÿ
2ý"!#$%&'ý#ýþý)()*+ý-,/.0
2<ý0340657809:03;<9 ÿ =>ý[email protected]<9 ÿ CDHÿEFD.<6GH%3I%4J"0.0K!0
3<ýLÿýN=ÿ
Oþ39aþ<ý0PQ8ÿ!RDýÿNN
1
þÿL;0KýM
þÿ
ý0.0ýS=ýT0U5[ý%K"S<;V.SWG03IYX[Z\</5
]^_$]^`ba_;c;_edf%cgShij0kl9mnklhoVphrqD^sVo%_Il"mt`d`^ujvxwyz{9|~}~h"`_jl>cs0o0_$mna€ri4o0‚nƒ8l>c4pk9„ c
…‡†?ˆ
wŠ‰&‹Œyk9"}zŽkrqNl2^‘p’k^p0‚9k"zOl“9]l9^„ €0`gE`mƒ?_4prgDqh_$”•p%c4pk9qD^l–Dl2^pbqD_ok9„x`]`^`bq„^m
do o‚c`0“h_4€k2vU—
Farbenie DNA v agarózovom géli:
˜ l™gkl2h"€0phišp0c;pk9qD^l–Dl2^Efj0vzSav"]>h"p%ƒp›j%“9^lœh`]bq_`
z ]l“9hl6gmY—
˜ lk_`Ÿ’gƒp•hp]^_“`0c4_8pqDi“_$m6ƒ ^l>ƒ8_4“
``d`^ujl9aždf0cav& p^_;p0ƒp
“l#dfc¡mn]^_`0ƒ8lz¢ƒ¢£2¤p0ƒp
“l“`FqNl>€hp¦al al“9hlƒ›–`^_4`o0lƒn^ljqDlk9m8l96gE`0‚rmVE„ oVl>ƒ
0,5 § g/ml etídiumbromidu po dobu 45
ƒ_¨h9„q:]&^_©c4`V2l2^E`FqNu2^h"pªqp]cl"qp— ˜ ^_©“l6gq`«qDl€h"pE¬kl2h"o0p0hrqD^s0o0__ …­†ˆ
l9v"€0`Šhp®h_;p¯«pžhrmqDh"f™wD]^Š_:h_¤p›klho0p0hrqD^Es0o0_¨_
df0c¥j`0–D`^_$”
…‡†°ˆ
h"s"gc4p0“hf8l“9–D`^l9a`0h_4p df%c$m
l“9–`^l9a`0hi;ƒ
`d`^ujl9af‚"l±df0c'm
“l6g_4`0‚hp0ƒp?j0hi¤&p0h_4p°]l2j`V“2_`}b— ˜ l2ƒ8lo0l9m²pFqDi“_$m6ƒ "^l>ƒ8_4“rm7ƒ8l¤p0ƒpQ“pqpdl9a`b”­«pV“2h"l"a"c;s0khl9a9„
aj dvojvláknovú DNA a RNA, hoci farbenie jednovláknových nukleových kyselín je slabšie
s ³0´µ
¶D·>¸¹¶º´¼»½#¾¿¹ÀÁ0¿Â-ÃDÄ$Å Æ2ÇÁ¶È0Á0¿È0¹4»›ÉÆÊÌË Í
¶¸2ÁÎDÄƵ
Ï¿rÅÐÄ4Á0Æ"¸ ѯÐ2Ò ¶Á0Ä;¹¿ÒJ¾%»%ûÇÓÁ0¿"Ñ̶
etídiumbromidom posúvajú svoje emisné spektrum v UV svetle k ¸Ä¨¿"Æ"¸ÔµÕÊ Ö× ØÙ0ÚÜÛ&ÝÝ7Ù×
ÛÞÝ ßÚ8àá0âäãEَåæçèÙé&ê0èºç\âæÙß9×%â"é2â>á0çæéç0ßâ9êëì$ê âæçrãEí0ç0ßí0îâ9êïbð
ñ¬ò
ò
ãØÙ0ßóJåæâëî4ì¨ô®õ­ö°÷
Ú8ø2×%ç%Ú¢çžùâ2Ø9ê Ú8ç0ßrúâ9éÙû®ëDârúNâ2üæEÙëDâ"é2Ù0ß Ú
ò
s åâ9ê×î'ú Ú-áVçæéç0ßó â8ëî4ì'úDæÙ9ð
åâùþýeÿ
ãé2çúìâ>Ú
Etídiumbromid je mutagénna látka, preto pri práci s gélom a roztokmi, ktoré ho
!"#%$'&(&(&
22
Stanovenie koncentrácie DNA:
)+*-,/.102345276/893;:23"<=.>:4?273,[email protected]/:CD6E!FG2@?HI3KJMLN)PORQTSU)VOWPA
X(YZ\[MY9];Y^_a`1bdc/Ye/fgh/b
ikj/lmn=o(pq=pn=prl\n=o(s?tm!uvrl\nkw/xyvyz?l{/p|q}z~wol"i1tl€ur+l\nkw/xy‚Dm"n=po1u„ƒ…~/†‡ƒyˆq=yo({/ls5l„‰NŠV‹
pomocou etídiumbromidu.
Molekuly DNA obsahujú purínové a pyrimidinové bázy, ktoré majú aromatický
charakter a Œ\!Ž19}’‘“=”–•—/ŒŒ˜™kš(›œŽ}™=›5•˜žŸŽk /¡¢Ž1;9ž£‘!¤¥™=Œ¦=›%Œ¤?§¨ª©"›«Œš¬›5šD §¤?¬§/š(“®­ ¯I°²±/³
´
v µ1¶9·¸1¹º"»+¼/½½¾(¿½½'ÀÁÃÂÄ ÅÇÆÈ/ÆÇɜÊËÌÉkÍVÎÏ¥ÐÑÒÓÔ?Ó/ÕË×ÖØÙ/ÍÚ(Ô?ƲÛÆÓÊ/ÜÝ'Þ dsDNA do párov A-T resp.
ßRà(áãâ+ä1å(æèçéêë=éìídîNïVðvñ/ò"ó1é;ô9õ7äö!ó1é9ç(ñ/÷øõdókñ/ùìë=ç}ú/âûó
þ
#
ý 260 nm a hranou pre
þ
minimom pre ü ý 235 nm, maximom
ý 300 nm. Meranie absorpcie v ÿ
ÿ!"
#
#
$%&'&(*) ),+&%&-$%!.-
0/
12&- &3!&
$+465078 9:;(<&=>@?&[email protected];$?&C;DCE<GFC1HAB=A1IJKL:;'M&NO=:[email protected]
[email protected]!WXYZ[\U!S]([email protected] [email protected][\[[email protected]][email protected]@uvsQ[w]Z][rkxd&g[ y =260 nm je z
20.
260 {
|L}~l€‚O~Dƒ!„l…†1‡ˆ€T‡ ‰ Š$‹Œ&Ž‹Š&‘’D“•”,–—*˜(™’™6š&&!’›Žœ‘’ž1Ÿ ŠO¡(‹’$Ž›B¢£•’’$ŽB¤¦¥Oœ$š`§¨™’ª©‘«’¬œ$Ž&Š
len do hodnoty A260­¯®'°±D²0³&´!µ&¶,·¸±$¹@º»³¼³º³²0±½º»¿¾ÁÀ$¹Âxûij@ÅÆ$Ç0¹³&µ&À±µ!º»ÈÀ$¾ÃGɕÊ,ËÌÅ rozmedzí
do 100 Í Î@Ï1Ð0Ñ1Ò(ÓÕÔ!Ö ×½ØÙ&ÚÛ
Ü ÝÚ&Û'Þßà!áâálã@ÝBäå@Üæå@çèÜÚá$éäêäáOå!Ýìë!ílîä1ïðGÚ*Ùñë!òÚ&à!á$å&äØôóÚ&ë$ÝÚ&Ü&Ú@îß
pomeru báz a õ ö÷1øùúOûâüýþ&ÿ&ý
üýüýùBö &ÿ
!!ý"#"$%'&()! rôznych
!!þ*ý
ý*+ö,*-þ.Gÿ/012'÷ù1ø34 û&ýþ*&ý*Bö$ÿ 5 260 a 'ÿ1öö6
78-9$ý:; ö<!! ö(ø=B ö; þ&ö;þ*úû
podmienok pri izbovej teplote (10 mM K2HPO4/KH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,0).
V ö*÷0¬þ-
2.ú2
>Bö;*-@?
A BDC2E6FGIHKJHMLHONQPRTSU"BVB;WXZY[3B;Y\]7^_`A\WabBcW^[3daegfK[3h"[email protected]
n'op UimkqFbV\srtWFuY\s]bB^Yd;[#\UvGd;iw8A*^\[=lam p =1 pri koncentrácii 50 x g/ml. Hodnoty
260
molárnych koncentrácii v [email protected]"\s{ge|Y[3B;Y\]f^#F;WXiFY[3BV*Y\A{0FbVSuY[3egBr/B;[3WB2}<r\s{B;A*S@{g\"U"B}
hmotnosti nukleotidov 1 bp = 660 D (Daltonov).
E6FGIHJHLH;~[3B;Y\]7^_A\WaB;W^[3daegB n'oQp U
VsP n'op
(50 x g/ml)
roztoku.
Y\]B€^r\s{gB;A*R@{
r\s{4d;[3WF
na ml
mol/ml
koncentrácia
Bakteriofág ‚
9,78 x 1011
1,62 x 10-12
1,62 nM
pBR322
1,09 x 1013
1,81 x 10-11
18,1 nM
pUC18/pUC19
1,77 x 1013
2,94 x 10-11
29,4 nM
Segment DNA (1kb) 4,74 x 1013
7,87 x 10-11
78,7 nM
9,83 x 10-9
9,83 ƒ M
Oktamér dsDNA
5,92 x 1015
23
Pri spektrofotometrickej metóde meriame absorbanciu vzorky nukleových kyselín pri
„…g†‡„ˆ2‰‹Š"Œ Ž>‘’”“•—–>™˜y’”“•+š›œ*“œžŸ+ ¡“–•/;¢3–“£>¤¢3¥¦‘’j“•§“¨•ª©@•œs «¬b­=®`¯°#±;²³*´µ·¶
koncentráciu nukleových kyselín nasledovne: 1 A260 odpovedá 50 ¸ g/ml pre dvojvláknovú
DNA, 40 ¸ g/ml pre jednovláknovú DNA a RNA a 20 ¸ ¹*º»½¼¿¾À3Á ³ ¼ µ ¹ ³²¬Â ¼Á ³°µ4ÃÄ@Å™Æ ÀÁ °³Ç Á
¾À3È °M³ » ²³™¯=¶ÉËÊQÌ<Í ¾À ³° Á;È ²³*´ÍZà Á ° Á;À2¹Á ²°³*´§± ³ À#¹ ±;²µgÎ;ÂÏÎÐ À ³Ñ ¾ ®IÒ=¶c±Ãµ Á¼ ³´ ¾s¼ Ä*´«*¬b­ ÁÓ¾À µ Á;Ô@Á Ð
± Ô ¯³ ÀÔÕ ²Öгׯ ¾Á Â*° À ±Í »Ø Ç ÁÓÔ Äy¶Ù¯ ¾Á Â*° À ³"Ú³*°³ »Á ° À µ4Î;Â*Ä ´Äгsò³Î³*´±²Ûܵ Õ µ¯=°#³°#±Ý´Ñ³ À Â*ęÅ
Þ ÑÐßq±Ã³ »  °³ » ¬@ÍZÇ Á ²±­ Ô@Á Dz Á ­qÒൠÁ Ѳ ÁÕ µ¯2¶;¬b­=®Îµ » µ ¼ ۰± » µ bývajú proteíny, ktoré majú
± Ô ¯³ ÀÔÕ ²Ö » ±báµ » ¬ »¡¾À µs´ ¼ ²³"´ Á ­âÃ"ãgÇ Á8ä™åyæ ² » Í ¾ ³¬Ç È ´±¯3± Õ ±*¯°#³ç±;³ç À µè°#Ö À µ¬ »éÕ µ¯°#³°Ä ¾ ³ »Á;À
A260/A280.
¾ ³¯#Â"Ä°¬1­ Á µg²Ú³ À3» ÛÎcµ Á ³ Õ µ¯=°#³° Á
êë3ì1êí;ë3îïMðñ+òóôsõgìbðñö"÷cøçôù™úàìõgûgò™üí;ôjóñ@ìýìò*ö+êðsþÿì;ë8ýð™ú3í;øóàìQøðsý*òðïù
Iþcìcþ/ìøð*ñðë
Pri spektrofotometrickej metóde pomer A260/A280
"!$#&%'!('#*)+,-".0/12%34$ "1$56&%278.:9
;<.$%=>?%'.$@%A!$#&%'!('#*)+,4B.0/12@%C4$D1$56&%278.
EF %.-28-GHJI@%28148.(GK8LNM.$8O'/3PQ%R/4%S$%.TU!$G%'#*.$TU$SC.$C>5HKVM=)'#?4%'WXM=.$YO/PZ%U!$#*%0*.[\
spektrofotometrického stanovenia koncentrácie DNA alebo RNA.
]_^=`Dacb ad^fe gh>ikjl$m=n8ohhadpqratsluiv>wlXs0xeq8^lCw$yoz{e|}iZ^ q8n8sVpq@^3~lwm=l$€kep‚„ƒt…†*^
kontaminovaná látkami, ktoré interferujú s absorbanciou v ‡_ˆ"[email protected]*‹tŠ$‘$’“”•t–’C—˜™›šd”$œ
stanovenie koncentrácie nukleových kyselín etídiumbromid. Interkaláciou etídiumbromidu do
molekúl nukleových kyselín sa v UV svetle emituje fluorescencia, ktorá je priamo úmerná
ž$Ÿ$ ¡Ÿ0¢£*¤ ¥8¥
Ÿ0¦§@¡ž¨$© ª
$«6¬&¡§­8Ÿ6®°¯Ÿž±¬¢>¨ž
²„³´
¨
¬kCµ}¶d· Ÿ¡k¸
¨¹=ž$£k¡
¬>¢?·'Ÿž¨­8¶d¡
porovnávaním jej fluorescencie s intenzitou fluorescencie riedenej sady štandardnej DNA o
¹Ÿ¤¶K¡k¸<žŸ ¡Ÿ0¢£*¤3 ¥8¥8º$»C¦}¼¾½$£*¥8·¶žt¨
agarózom géli alebo na parafínovej fólii pod UV svetlom.
Stanovenie molekulovej hmotnosti fragmentov DNA :
¯ž$§8¡'C¦}§Y«½-§@·'¹=¶K¥@¿$žC¨¡k¸À²„³´Á½ž¿$§Y¥@¡ª$·k¸kµd½ž-Â3·0¬<¥›¹=ž-§8¤3 ¥@¡£*Ã$¹ŸC«¶Ä¹=¶K¡Ÿ¤ ¶dº¨
závislosti
Ÿ·t¹¨ž-§Å¡ Ÿž-¶Æ½ž6¬¢>¦½¡º[¢?·$±=¡c¨$©¬*§@¡¿$ŸC©Ç½$£*¡½·'£*¤+¢È¶cñ=¡dž»}¬*·'ªž¨}·ÊÉ ËÌÎÍÐÏkÑÒÏ*Ó$ÔÕ8Ñ@Ö×ØÚÙÓ$ÏkÛÝÜÇބßKàdá
superšpiralizovanú (superhelical alebo covalent closed circular, ccc),
kruhovú otvorenú
Ïkæ Ë ç×è¾Ñ@é'êUç$ÑÛdØ'ÏkÜ
ÍÓ$Ïìéê
Ó$êCÜCíÕ@ÑYîÓ[ïð
(relaxed alebo open circular, oc) a lineárnu (lâ*ãåä ä
ãë
ä
Ï?æ Ëçè Ì=è‚íË Í?è'ÏkÑ8ñÕ8×CÜ
Ûdè òÓí}ï*Ëê0ó3ôZèRîÑË3éè'Ï*Ó
Õ8Ë'Ô=ÛKÑ@ç$ÓCî
ã
ë
ë
ä
v agarózovom géli je rôzna. V ä ä
Ûõ$Ì=èÚîÔ=×$Ñ ×0ö$ð Ï&ÓíÕ8ØÛ
Í,ÓÏìøÙ>Ï*Ëù-Ûdè×0Í Ï*èç-ï>Í?Ë+îCóôZè
ccc formu pre stanovenie molekulovej
ë
ä
ã÷ë
ä
ú$ûüCýþ$ü6ÿýþú$ü
=ûþüý ü *!
û "#$%
û $
ü &('*),+%- û ./0%
û þ01ý 21234
ü &5
pomocou dvojrozmernej agarózovej elekroforézy po expozícii fragmentov DNA v UV svetle
6kü/789þ:!;!<"ÿ+ý8ü-ûÿ(&.6ÿ*ü4=4'>[email protected]þüA&B$3þ$ü4C08üûDE
nicks v
F7F7F
)G+-Æûcü#$34HB
F
úAI ÿKJ7L8û
súvisí vznik relaxovaných otvorených molekul DNA, ocDNA). Novo vzniknuté oc formy
24
majú v M7N&M$O9PQ0RS
N&T7UVWO9RAXAYM$Z4[]\&R^4_a`HUV
XRcbdeM$Z&R\&fAXR#g4YAThYiijA\&RYARAXM7YT
oc
kROlS!_cmDnDi7o
\&RO(R4XYAp7Si\&R^4_a`&U:VX&Rqbrds,[email protected]$N#S%i7Yx1R4X\Ryi$Ui$Z4xO1RkRO9T8Q0i?z9i7gY4{&S|b9S%i$O9RS}b \&R#^4_4`U:VX&RqbrdRA~
pôvodných a novovzniknutých fragmentov DNA po expozícii pod UV svetlom a po
elektroforéze v gOr~&^ARSb9S%i$O9i7€SDf‚0i7Siƒz9i7gYRQ0YM7„8Y&i…brx1M8YR4X&V
d†\O9‡ˆx1RSYRHbrdGz9i7gYR4xU2VX&{&‰7^ ccc
foriem DNA, ktoré odpovedajú
príslušným novovzniknutým oc formám. Všeobecne oc
formy DNA (platí pre plazmidy do molekulovej hmotnosti 7 kb) sa pohybujú v agarózom géli
najpomalšie, potom nasledujú l formy a ccc
s
kRO9SD_A€HZ4x1R4O9Tb9M!\AR^4_a`4~z@[ŠYM(z(O({&‰7^Ui(zŒ‹Vi7€„RŽbr[X&V:b9‡
V‰7^ƒ\O9Vibrx1RO1RAXRA~ZARYkRO([email protected]$^R\YRHbrdR4~WVYx1i$O1Z&M$Up7‰7V:i,ix‡gV~S!`&O9R#SVg~m
u,Z‘`&M8Z4x1i$O(Vp7U2Y4_’Z&[email protected]^0~7ziUi7YWz9i7g&i7Y‘\&UM$Q0SVg€”Z4xROr{•Sp…~YV2Z&pxYiŽ‹x(Vi8\#YAiŠSVi4brx1R
\O9iO9i0brxwO1VZ&„7Y[–i7YgRY~&Z&Ui7p$Q$~€—SR‚0i7S%iVQ0R#UR4X&M7Y0[˜Q7S%i4bƒkRO9Vi7S
bx1M$YR4X&VdšSDR#Ui$Z4~URXa[›^SR4xYRHbrd
œ
l”
žŸ9 D¡
\&UM$Q0SVg~–U2VY&i7M8OlVQ0R4X&M$d™M
¢&£¤$¥0 ¦§ž4¨&©(ª¬«K­®¯±°²ž#§ažA³A´&©µ´A¶7 Ÿ9©·¸Ÿ(¦¹º7´¶
¤$´A¤7£2»¥a¤Ÿ9©8¹&ž !³&¦´&¤7´¸´4»&¼7½˜¢&£:¤8¥ %¦§žA¨˜¾ ž¿´Àš·r¸1¤$´AžA¨&¦Á†¨&©7Â>¹&žH·rÁ㦴&©¶8Ÿ(´&©7½žÄ¹£ž´ž4¨&¤7´Å7½Až
wŸ9¤8Æ# %©7´¸w¾
Çr¢Ÿ(¦¹&ž´#ȸŸr¾&¹&¼7¦¦Ÿ9©$¹&ž# !³&¦´&¤7´¸´©(ªÄ«K­%®
¢&ž4¾&¿7À¨&¤7 %©
¢&£:¤8¥ %¦§žA¨Å
¨&©$¹4¸1ž4Ÿ¡
·
Ÿ9©0·r¸Ÿ(¦¹&º7´4»& %¦² %¦©A·¸1¤7 C¦
Éc¹4¸ÊžŸ@ÅË´¶7 ̾ ž¿7;ª(즩7£©7´Î¤7´¤7£2»A¥$¾W¨&¥0´¦¹#´0¾¸1Å$½žW¢Ÿ(ž&§¾&¹¸w¾AÏФ$£©$³ž¢Ÿ(¦
°ÒÑÔÓÕ¤8´¤7£2»A¥4©?¢&ž¸w¨AŸ9§¦ˆÁ?¨©7Â>¹&žH·rÁÖ·(¡´0¸1©Œ¸¦¥0žA¨¤7´Å7½žwŸ9¤$Æ& ©7´0¸w¾C«G­®¯
Podstata stanovenia molekulovej hmotnosti cirkulárnej alebo lineárnej molekuly DNA
·1¢&ž#º7À¨&¤
¨
porovnaní pohyblivosti fragmentu
DNA nášho
záujmu
s ¢&ž½4¡4³&£¦¨&žH·rÁžA¾
ȸ1¤$´§¤$Ÿ@§4´4»&¼7½wŸ¤$Æ& %©´0¸ž4¨«,­®Ì·@ž…¥7´A¶7 žA¾ ž#£
©$¹4¾&£ž¨&ž4¾×½ ž4¸´žH·rÁžA¾¯ØÙ¦´©7¶8Ÿl´A©!§¨&ž8ª@¨&£¶$¹&´ž4¨Å
molekuly DNA sa pohybujú v agarózovom géli rých£ž²·Á0ž4¾É¬¹¸ÊžŸ9¶—ª9©´©8¢Ÿl¦¤7 žÎH D©$Ÿ9´¶
logaritmu ich relatívnej molekulovej hmotnosti. Ako štandardy na stanovenie molekulovej
½ ž4¸´žH·r¸¦ÚwŸ9¤$Æ& %©´0¸ž4¨¬«G­C®†·9¤×º7¤4·r¸1žŽ¢AžA¾&¿À
¨¤…¥0 %©·Ö§4¨&ž$ª(¨&£¶$¹&´ž4¨»&¼7½‘£¦´&©0¶$Ÿ(´4¡&¼7½’wŸ>¤8Æ# %©7´¸1ž4¨
«G­C®·@ž…¥´¶7 ž4¾¬ ž&£©$¹4¾£ž¨&ž4¾×½ ž4¸´žH·rÁžA¾¯0°ž¾&¹&ž´º©$´Àq©7£©$¹4¸Ÿ(žžŸ9Å$¥7¡×·9¤Ë¥0 %©$Ÿ9¦¤±¨¥0§¦¤7£:©7´Ažc·Á
fragmentu DNA od štartu a porovná sa s
¢&ž½4¡a³H£¦¨žc·Á0ž4¾ƒÈw¸1¤$´§¤8Ÿ9§4´©(ª«G­®¯Ô°ÒžÛƟ9¤$¦¼$¹&ž# znázornení pohyblivosti jednotlivých fragmentov štandardnej DNA v závislosti od logaritmu
grafu na základe pohyblivosti hodnotu logaritmu
¦¼7½— ž#£©$¹4¾£ž4¨©@ª½ ž4¸´žH·r¸¦
Éܞ&§º$Àˆ¸1¤7 ©×¥
ž&£:©8¹4¾H£ž¨&©(ª}½ DžA¸´Ažc·¸¦·(¹4Î ¤7´&ŽAž
wŸ9¤8Æ# ©7´0¸w¾
«,­®†Çʨ&©Â>¹&žc·ÁywŸ9¤$Æ& %©´0¸1žA¨Ý§¨&žª(¨&£:¶8¹#´AžA¨©@ª
DNA sa uvádza v ¢&ž#º¸1©Ž³&¶$¥0ž4¨»A¼7½*¢&¶$Ÿ9ž4¨&ÉWÞy¹¦2£
ž³&¶$¥¤‘ß}Þ¹³Õ߆Þ8àààᳶ$¥0ž4¨»&¼7½*¢&¶[email protected]¨ÉÞ¹4³
§¨ž$ª(¨&£:¶8¹#´AžA¨©@ª«G­®˜ž&§4¢ž4¨&©§¶‘ ž#£©$¹4¾£ž¨©(ª½ ž4¸´žH·r¸¦GââàÛ¹4«ÖϯäãÖ©7团&žA¾&¿¦ ª©7 %©µÈ¸1¤$´§¤8Ÿ9§A¡
DNA, ktoré obsahujú fragmenty s £¦2´&©¶$Ÿ9´©h·¸wÎ&¢&¤@ªÎ¼7žA¾æ Dž#£©$¹4¾£ž¨žA¾æ½ ž4¸´žH·rÁž4¾çÇ$Þ8ààh³¢
rebrík - ladder, 1kb ladderÏ@ÉË ž#£©8¹4¾H£ž¨4Îæ½ ž4¸´žH·rÁÕ·1¹4ÎH ¤7´AŽAžšwŸ9¤$Æ& %©´0¸w¾š«G­C®è Dé¿0©7 %©
ž&§4½¤7§4´0Î#Áç¤(ª*¢Ÿ9¦¤7 ž¨
agarózom géli,
porovnaním jeho pohyblivosti s
¢&ž½4¡a³H£¦¨&žH·rÁžA¾
&ÿÿÿqï9öï9ö
1í4ðÛøð&÷7öëËøö&÷
ë,ówï9ì$ô&õ%öí0ë1÷Aø
ö
ëæøì0ñ7ö$ï&÷ ˆë1ì÷Aø!ï9÷ôaï9ì$õ#"%ü&
ì$qÿ%&0ÿ'ÿ
êë1ì$íîì$ï@î4í4ð&ñ7òÛówïì$ô&õ%ö7íë÷4ø—ùGúCû˜ü1ý±þïÿ
25
ùGúCû
()&*,+.-+/0+213 4&56879;:<3 =>5@?AB ?0C&*DA&EA&:FEHG*IJE A&:F7K6LCMFE =NGMFCO>EDPQ4&68CN9A&CSR9:TM<:UAE0B *;ANV34
fragmentov dvojvláknovej
DNA pomocou odhadu z pohyblivosti fragmentov
štandardnej DNA ( W -DNA~HindXDXDX;Y[Z
\$]\ ^D_&`0aNZa&b
]ced<fg\Kha&b8aiaNj Z&klhamnj
z grafického znázornenia pohyblivosti fragmentov DNA v závislosti od molekulovej
hmotnosti fragmentov štandardnej DNA.
26
Pri stanovovaní molekulovej hmotnosti neznámej plazmidovej DNA z prírodných
o!p qNr;s tu<vw<x!y!ze{|u<}0~w<vr;~N€‚p„ƒ&~L…t‡†s x&ˆƒ&t‰ˆŠr;~!‹8x&~Sruƒ~†r…|ƒ&w<p }0‹ŒuF&~NŽ
ccc foriem) dvojrozmernou
sw<s qNrt‡~!~&t‘ }J~…>€Nƒ~…’0ˆ“p}0‹8sN
q‹|se”p
ccc foriem plazmidových molekúl izolovaných z
E. coli
t~&}Np{0…•‹L~w<s qN…>w<~!>sD–„{&‹8~Nrx&~Sru2—$€<˜&™šp ’
V517, ktorý obsahuje osem ccc molekúl DNA v
~&w<s qN…>w<~!l š{&‹L~rx~¡
~!tu<s‹Txs‹8¢!’ls‹|sŒr;p x~!~!p¡|~&ƒ&tD~ru¤£r;p x&p t&~‹8€
35,84 x 106 ›œŸž
ccc
w<u<xsv tx&s¥tp ¦‹Œsx0ry€§&}0{¨,p&~‹¥x&p u<z{št~&}0!u©sew<xN…ªƒ~!{Nylow<u©!~§¡
ktoré obsahujú
agarózovom
géli.
Izolácia (elúcia) fragmentov DNA z agarózového gélu:
‚« ¬­$®¯|°±²³µ´·¶¹¸ º»¼;½S­±&¾¿°eÀF° ½N²¬;Á&ÂÁ!¬°²ÃFÄ ½&Å&¯ Æ&°ÀÇ°±&»<¯ ¯LÈÉ0°¯|°.º agarózového gélu
º±ÁÊlËÌÃ<º0ÁÀ©ÁÊ!­ÍÊÃF­Ä° ¬DůŒÃ¤Æ&ÁS¼²ËÎ&±NůŒÃϯ|°²;ÐÆ&­ ¯8ÃѧÒÔÓ ½ÀF­Æ!±NÅÕÎ&¬ÁNÖÀF¾¯×Î&¬ÃØÃ<º0ÁÀ©ÓÄÃÇÃϬ­ ®&¯|°±²;ÁNÊ
´·¶¹¸2¼DÎÁÙ»©Ê>­Ê ²;Á¯8ÚÉ0°#¼DÎÁ&ÀÛËܼ ´„¶|¸.¼­ÝÁNÖ&³Ù­DÞ±°ßº gélu extrahujú aj látky (napr. sulfátované
ÎÁ&À“³S¼à­Äá&­$¬‰Ã©Æ³âÚ½N²Á&¬¾¯8È&É ËÎȼ;ÁNÖéÍã­$½ÁŒÃU±&á&Óֻ۲;Á&¬D³|°±NºÅ¯8Á!ʝ䬇°¼²¬DÃå½Ùe±¾æ°±Æ&Á!±0˽ÀF°Ó º³ÚSÀÇÃ<®Ó º³Ú
´·¶¹¸çÎÁÀ“³¯|° ¬Ó º³>Ñ<ÑUÑ'âÝÎ&Á²¬°,Ö&±NÅÄáÎ&¬°éèØ­ÀêÃǰ鬰­ ½ÄÃF°š­ëÉ0°Ü°e°$½N²D»“ʱ&ÁS¼Íì°íl²¬­ ½ÄÃ<°#Þà°ëº0Ó ÊüÀÇÓÜÁÆ
¯8ÁÀÇ°$½NËSÀ<Á&Ê°Dޏá&¯8ÁN²±&ÁS¼²Ãî´·¶Œ¸Q¬­ ®¯|°±²;ÁNʂÑÝï&Áðº Ê&³SêËÞDñ>ÄÁNËò¯8Á&ÀF° ½NË>À<ÁÊ!ÁËóá&¯8ÁN²±&ÁS¼ÍeÁNË ½&À<°0¼Ó
°Â° ½N²;»“ʱ&ÁS¼Í„Ê&ÅNÍ ô õöN÷ùøú‚û‡ô üý|þÿ ÇþÝô ö #ö ô„ÿ&þ &ô 0ÿ l
÷ ;öô éý8!ÿ &õ "!#
þ &ý
ô ö $&% ('!)Nÿ&þ Ìÿ&ôÿþ ‡þÿ&þ *&&ûDö >#
ø + û‡þ ,.þ -/01&2-/34Ç5
þ 67-83 ö!ÿ !94:;<-1Uÿþ 3 ûÿ 4:
= ûô$üý|þÿ > [email protected]
ô 'N÷&õ Cô 'þ 483-<ÿþ
ô üô$û D; ö ENGû F ÿ&þ ,ô :÷ <&ÿ ;þ û = þ û÷ ",4þ
kontaminanty.
H þ ÜýŒþ6>D2;ëöI!ûFJ‡ôK'N÷õCô
ÿôJ1&2-134L“÷[email protected]
ô üô ûD!FM:! üF-Û÷¥ý&õÿ
0ô$ûô!N OQPLR8PMSTEUGV2PMRXW,YLZC[]\!V_^TEU"`Z1abcd\Z8eRfbg&eha!ij!VlkUPYMSec*m#npoqnsrutPMv!j!eY&PRN[_eLR8PM`Vlm npoqn
veMvZ1PMUGecwvV[xZXTZ1PyeMzeMU{!gb}| a!~1gS!bl`V2\!V!€TEV!vPMa!Z8ee<kZ8eYP.UV}v!UZ1ebYjdPM‚TEUeMSh.aƒYj}„P…T>{\c
STIVU"ƒYj‡†P\!a!VTER1Z/k,iqg&R1V!xS!b|"Wˆ\!V7|"T[v!ai‰kV‹ŠEV!UPŒSV!vRŽP6TEaƒYj|"Wv!UGek
27
6. Konštrukcia génových bánk - príprava rekombinantnej DNA
‘“’M”•–1—5˜™—!š›™Œ•„œL—!Ÿž 7¡8¢&£Ž’Œ•¤!¥&’*¦!§©¨(žš ¥Xª"«¬—œ¬­>1”š®¯0­®¢¡N techník. V
in vivo i in vitro
•‹—š°«£°®!”œ±1—¢£°›²­œM® ¥’6³I´Eª ±µ’#ž!”G’´—¢¶!’·E1—2–8£8œ#˜™—!š›!«£°•œ—!1ž 7¡8¢&£f–E¸!¹ºš¶!»6œ
najrozšírenejšej definície, akceptovanej legislatívou vo viacerých krajinách západnej Európy,
je génová manipulácia definovaná ako:
¼½"¾,¿!À.Á²ÂÄÃÅ¿¾!Æ,ÇÈÊÉ,¿!Ë<Á²ÌŽÃ²Í!ÇÌ8ÎqϲÐϲ̎ÑÃÅÒÈÅ¿Ä˽ÐÀ.̎ÍÓ8Ô(Õ²¿!Ë<¿!Ç¿!ÔÊÌ8ÐÖLÐ&ÀMÇÌ8Ð×Ë<¿!Ó8ÐÉ,ØÅÓ
Ù ÚÜÛÞݲßÅà.á!â²ã²ä7áå,æ!ç2è,éê ëì²í²îï,î!ë ð2ñ,òôóµõÅö!óµ÷!ø²÷2ò€òùŽò÷øÅú²ð²û7ú²üþý²÷ÿ&úÅø²÷,÷!ÿ&ð²÷
vírusu,
bakteriálneho
plazmidu
alebo
iného
"!$#%&#%' (*),+-.
vektorového
.0/21"3"457689:<;
systému,
)>=%."/.>8
(*3
prirodzene nevyskytujú, ale v ktorom sú schopné trvalej existencie.”
Nové molekuly DNA, ktoré vznikajú v tomto procese sa nazývajú aj rekombinantné
DNA, preto ?A@ sú to molekuly DNA ktoré vznikli kombináciou dvoch rozdielnych molekúl BDC2EFHGDIKJLJNMPOQC2IRFTSVUXWYMPCZFHG[FHC\2]O"MPE"^`_KJba"I%CcFdGeGDQOfJgcSihRjkO"MCE0Clf^<JmhnJ2E0GeI%C2E0G"oqp0MPO0JOFrOfsNtvuxw
techniky.
yz*{|D}f~>|€K{2}"{‚0~fƒD{|"„}"…†ˆ‡0{}f~fƒD…Š‰‹„}"Œ7ŽAŒ{Š}fŽ‰
|"~ƒ0~  ‘’R“•”&–A—>˜™š”&‘œ›0—Dž›"Ÿ% c¡r¢fš£
úsekov DNA z ich pôvodneho organizmu a ich následné pomno ¤ ¥¦"§¥©¨mª«­¬0®§P¯m§P°0±A²§´³0µ·¶§¸³0¹
v tom istom alebo aj inom organizme. Táto technika je známa aj pod menom molekulárne
klonovanie alebo len klonovanie. Zavedenie techník molekulárneho klonovania génov zhruba
º"»%¼i½¿¾rÀTÁ"»  ÃRÄdÅDÆHÅ0Ç2ÈPÉ
ÊDÅ>ËPÅÍÌ"ÆKÎcÏ0Ð"Ñ2Ì0Å0ÐÅÊ"Ò0ÑÔÓ%ÑÐ"ÒÕ0É
Ö×ÒfÎmÓØÐ"Ù0ËPÑÚÛÜÄHÑKÓZÝ%ÈÞßàÎáÒfÎKÓmÏ0Õ"ÖAÒ0ÎɋÒ0ÑKÓZÝ%ÈÞß
objavov v â"ãäHåæ%çRèZé%åmènê"ëTìRäHí"æmëPëˆî$ïâ>ìräTð0çñçñòfåió"ôžðçõ7ô0ö
ìm÷0ø,ì%ãó0ã"öù÷"æ%ëìm÷åõPãeú æHã"û2ð0ãZèRïkî$ïâ>ìmú0üêfã
poznania.
Princípom génových manipulácií je teda spájanie fragmentov DNA študovaného
organizmu s vektorovou (plazmidovou alebo fágovou) DNA schopnou autonómnej replikácie
ðDã[û2ðDã>õPåò"ã>öýêfãþìrärë´äHåî ÿùÿ,ÿ
!"#$%&'(%eÿ)+*,*'- ./0
1)2>ÿ)3145&'76,ÿ89:2ÿ<;<56='>[email protected]*1B('>C2
Y
Escherichia coliD)EGFHIJKLNMKPO)QMRQOTSVU(RVW<X
RIWRQZ?QR[O)QMR\]H)QWKL^SIR\R_R`bacedfL$KZ&QWU(Z?\EgW_hK<Hi`kj)\l_mUnH)Q2FZIoWUpOqQr\
y$z{|}8~m<{
€‚zs~€ƒ2„<…<ƒ†
„‡<ˆ€‰‹ŠŒŽ‘“’(m”–•q˜—™€š‚›?‚z‰œ†{}8~€9~‚ž}„‚Ÿ
)‚2„{<y^€z¤z~z¢¥¦e§š{¨ƒp©w}„¡ƒ†ªV (z€?‚„«¬„‚­}i¤
Y
Xs_
Y
K<Htu_\W
 >z„¡
Y
QvwWx
ˆ)‚ƒ†¢£s¤
®¯°±²]³i±´°µ¶·p²w±V¸u¹»º½¼º(¾h¿¯w¿ºÀÁº<ÂôºÀB¿±
bukových delení sa vytvára kolónia - klon identických buniek obsahujúcich identické kópie
rekombinantnej DNA. Súbor klonov nesúcich rôzne fragmenty klonovanej DNA sa nazýva
ÄÅÆÇÈ<É^ÊÆËÌsÆË?ÍÎÏGÎÐÑÒÇ]ÄÅÆÇÈ<ÉPÒÎÆÊÎÓ
gene bank, gene libraryÔBÕÖ
28
ÎÈ×ØÙBÎÚÉÈÎÆË?ÑPÊÐÇÆsÛ>ÓÇÈ
Ô
ÜÝ(Þißàsáâã>äåàÜçæè?ßéßêë=ã™Þ)å2ì<íïî!ðñfåòèhÞómáâiåôÜóÜõ,ö)è÷)Üìøköìøùßrßêßùíóè?äìúäàkóåpäàêûìügêßô÷Bý
mþ!ÿ
"! #%$&')(+*,*-/.0
1 2/3546798:;%7<:=>?;@=-A-B="[email protected]":=E;F6"B2:;HG&IKJ; LM
þÿ
a kol., 1995).
NPOQSRTVUWYX5RFZ M[\^]_ R` M ` _&ab U)cQ+R _ ZdSef M c ] Ue _]_ O b-_ Rhgicj"[email protected]`5k bM T \mlnoM]Mbpl_rqpb k
ef \ ef M cU b UFs qpb_ cUFstZ b\u?b\vY\ Tk RX"[email protected]` __ O"R Ml-_ c M g ]_ R` M ` _ab jVe _a Ux`yZ [_b_ c z{ _uYM]_ c Mb j
(P) v
e _a U|`}Z [_b_ c ~€‚ƒW/wxc \ RX _] cU n Z _ R` \„q U b… T<k †h`5k ]_ c Mbpl_ _ f qMb\ WYTk ~FNP‡ˆcU n Z _ R` \
Z [_b_ c Mb j vl‚‰ f Mq TVU b ` _ c~ŠO M T _ub-_l_ cQ
fwx` M g ‹ŒŽY‘Œ’“Ž”Y•–—Œ˜
ln (1 - P)
N=
ln (1 – b/A)
™ –“š‘›“œžŸ¡ ¢œ–“’&£h¤@Œx” ¥•¦[email protected]¨§V“–%Œ/‹-“F©ª”+“«|•"£¤hŸr¬­‹•”®—¯ƒ°+‹±‹Œ£‘“’? ²©%³+—²Œ´¤@Œo° +«|Œ
µF¶ Œx°¸·º¹"·5»Y·½¼i ”’YŒ¾œ•&¿“|¤À‘•‹•”œ•?¤h–“o°‹®—¯„œ–“Áœ–“’œ•‘Œ’Œ‹Y³Âœ–Œx”’“Ãœ•&’•°‹-•¸£hÄŋ-F©|’“‹ŸŒ
ÆYÇÈÉÈÊËÌÍÎÏÍÊ?Ð+ÑÒYÓ5ÔFÎÈÊËÁÕÍÐÆǺÖ@Ó×ØÖ@ÍÌ-Í?ÖhͪÙÒ/ÍÚÛ²ÈÜPÝ ×‚Í&ÉÞÃÏÍ-ÙÍ&× ÕÚÓ¡ÕÈÉÞÅÔßÈàÈÎÍáÙÞ²â|Î͸Ôhã
äåæ-ç&è<éVêëéì?íîïŽðëñæëò@ï<óŽôöõ÷øëtùåŽúYðûéõïŽêûíåèVåûæüŽýåþ|ÿë õ+ïÿò@åûFí›ü/îæåðë‚äåæçè<é !
"#$ %&')(&*!,+-(*.'0/&!(& /& 1%& 23"34
klonovaných
fragmentov (v kb)
_______________________________________
80
90
95
99,99
5
3218
4604
5998
18 414
7,5
2414
3453
4491
13 414
10
1609
2302
2994
9062
15
1072
1634
1998
6136
35
460
657
854
2627
5687&9;:9=<9
>[email protected] GH? I ?KJLM?DON3B87PIKQMRSTL N3BUL N3BCVKL ? F GH6V 6IWXL N36
JMV BLM?AV ?K7 IP?ZYO[\I ]_^`V BI a6
b aH6V 6IMcS ?F GH?dIe9
29
fUg hji;ki=li
mh_npo h3q8r0qUhts
uMvdwxgMyHzMqz{OzPst|~}€‚ƒuA„Hv z vKrMqz nHw†… vU|3s… z ‡ˆ vh3s‰{OhŠypuM‹z ‡ˆ vw,ysK‰{Šq;i
30
Œ_Ž‘’“Š”j•M‘K•M”– —™˜ŽHšM”›– œ_žŸXœK’3Ž 3Ž¡M‘d–M¢“O£M¡M¤ŽHŽš¥–P‘P• ¦d¤¨§©¡ – Ž«ª– —¤,“O3œ8¬d”­Ÿ®”C¯°– ”)3œ8“Šœ˜HŽ
– Žœ
¡M‘M±²¡M‘´³O”
¡K“Š‘K•¶µ¸·
i¹
“=t”
–A’3³O‘ 3Ÿ”›¨–Pº »0›ŽH– – ‘’¯
M‘K£MªŽÂ“Šœ_–P”ÓO3”–A’3³O‘ ÄŸ®º¤Ž¼£0ÅÆ·
ii¹
E. coli
’3”,C– Žpª
£C²œ)’U•MœC±²¡M‘Z’O¯‘K£¶Ÿ‘A˜¼œ
¡K£˜H½´¾À¿‚Á
”8¬ ½Ç’3Ÿ‚œÈ—=’_¡M”˜ÉŽÆÊ ‘Z’O“Š”8“O‘M›
–P¥ËŸ– ‘ ªK’O“=•M‘Ì¡ ˜H‘ – ‘K•TŸx£&’3—ͬA½;¯Î•
ÏЫÑMÒCÓ¨ÔPÕ_Öx×؂ÕÙ3иÚdÛKÜOÐHØXÝÏHÔMÕÞØÔPÚdßKÙOÜ=àMÚáàMÕ
âKÜãÚdäŠÚKàMÕ_֞åÀæ,çè~éT܊Ò8ê;ë0ì ídîðï`ñ´òótñtï3ôXõöø÷ñ´ù ótñú ú öHú úüû
ù ó3ýjþMÿ ñ
ùMÿ)þ
3ídîPþ õMõ þ íH÷ï`ñ)ù ó™í!KþMý"$#í%'&(3ñ
íKþ)+*-,
. õüò"_íMý /10!203/546!2798:<;=8;?>[email protected]@BC@%DEGFHIKJGLM0MHN0O2PQ7RS.TUWVX>NP@%D7R07/-7<Y@?LBFHTZX[7
\ R0!/54R]2F^630!_F`24
P/57EaEbF-S.RF2Ec.@[email protected] hi
jkdlnmoprq
kolónií na s g DNA, potom
t5uOvu3t5wx!vyftzv{|%}.~{€y%~.{‚ƒ„…~†{‚G‡ˆ~.‚y‰ƒ‹Š{Œ|Ku~zŠ‚]uŽ{v~.‚Œu!uX‘‡v{%y]’-‰ƒv%“”’•y'–„!—˜ ™ g
4
vektora (1,84.104 / 5.104).
Výber klonovacieho vektora:
še› ‰y‚
xA{v{ƒuyœ{
y%~.{‚ƒ
’y
Š‚u{v~.‚ŒruOu
‘‡v{% › œ
vu!|vž
’GyŸv › t
z vƒG’bŸ xAyQ|u~dy]’žœ¡‚{{%(¢ £a¤!¥¦¥%§¨K©Qª-§«¬%­d¥%®‹¯°²±5¨Q¤z¯°%³C´¨µ¶¬¥¸·º¹¥¤!¥%§¨»­d«K´•¦%¼½¨¿¾.­d¨»¯·3¤!¦¼À§
Á ¨¦¥±²µ¥¾­.·­d«´¾d¬¥±²¥®]¨¦·Ã¹±5«ÄÅ®·AÆ ¥±Ç«µ¥È¾.­d¨»¯·!¤!·A­d¨$¯°^±5¨¤¨É¹Q¥Ê¾.­d¨»³Ë¹¨©µ¥§¨¦Ì˨GÇÍÅ¥^¤O·ºÂÌ©··Î¾
Á Á
Á
klonovanými úsekami DNA. V systéme E. coli ¾¨X¦¨]Çbƨ¾.­d«GÇÏ·«XÅ¥ÐѪç¨]Ç]Ò-§«¬%­d¥®.°5¥ §¥ «r¦ÓË¥
Ô%Õ'Ö-×ÙØÚÔÛOÜ!ÝÞßàâáãåäÝÛæçß%èéêæÈßæGëì.ídæؕîï!éðí.ñ¶ÔòéôóÚrÝ%ídòØærõÍæëXÝÚö÷ìídäÛ!Ú^øKæìídòùÔò%àúïÃóæß%èézõëbÚ
plazmid pBR322 (Bolivar a kol áûõ$×rüýýõ=þ+ÿØáá×á á Úrßí.ò ÔÛ!æézÜç‹é5ä1ØÚÛ!æ»ídïÃóßÚ1óñìòÝè Ôòø et
ÝÞÔÜ!ï æ ßÚìÜÚ
%ß ñ¸ØÚÜìídÚßQÜÚ¡óòøÜ æQézÔÜQÜÛ!ïOß%à æ9ídÚ»í.Ødæñ¶ÝÛ!ï!ß%àâáXÚrÝòéaÿÜOßæßíñ éúà ÿñ
óñ
æçäóæQß na základe negatívnej selekcie tj. ìí.ØGæ»íñaØGÚÜ3ìídÚß
ÜÚnóòøÜæßídÜAÿÜAòí.ÜÃÝ%àÝærÔ(áábá
Øæ»óçÚÔòçò%ÿßÚÉßæ]ëbøæì.ídÚ]ë»îÜÚXÔòàúKïAóæßä ëÚÉó
dnešnej dobe sada pUC vektorov a vektory
z nich odvodené. Sú to malé vysokokópiové vektory, skonštruované na základe plazmidu
!#"$%$
&(')+*%,-.'0/21346574849
3:;'=<749
*%)>
:@?
A?.BC*DE?AGFIH9
8JA0K%4 lacZ komplementácie (Obr. 4.2. a
kap. 8.).
[email protected]
SUTV
WXR
Y
Z\[SCW]CWY^6[.SPW]7_a`7Ma` Y%bc%W
d%WefVWe
gQ;YMih2jkV%]mln[
W%oXOUSp]pe
[
[email protected]
_o%WY%b
qc
[email protected]%xyz|{U}~
€tC‚%ƒU„+u…‡†
‚%ˆIv‰CxŠ~
uI‹Œ{i€r€t
yv;‹Žƒi€t
‚
[email protected]
…u.pu‘yr’“#”G•+–—}+p‚G~
€tP‚ƒp„%ztP‚ƒ7˜™{7…š‹›
[email protected][email protected]%u%‚~
…u%€2ž“#”G•Ÿu%€+ %w‹E†
‚%™u‚wIv;¡rz¢…rŠ€0‚6
[email protected][email protected]%u%‚~
…u%€2£“#”G•aˆr…0
x ¤…i2}
’‚¥{ppv‰C€¦{2t
˜
‹ut%„§–©¨ªƒ7v«†
‚‹
wv¬pxž~
€tC‚%ƒ2‚~­u%…®†
‚%ˆv‰Cx;~%u‹¯{i€J€\t
yrv;‹°‚
±†
…±%²+7€±
€ru­ˆ³[email protected]%‘
y’
krokov, ktorý je nevyhnutný pri práci so štandardnými vektormi - defosforylácia
v´u
€0…ƒ7v´ˆr‚~…ru˜’%‚µt
[email protected]~…yv€r’‚¶~
€tC‚ƒi…z·tIp‚%ƒ7²¸ˆI…¹%ƒi…º »0¼¤½¾¼¤½r¿ÀÂÁ2Ã
ĹÅpƽ2¼ÈÇ@É@Ê
ËÌÉJÉpÍÏΪÐ2Ñ;Ò
ÇÓÔ%ÀXÕ
takéhoto vektora je plazmid pKIL18 nesúci ccdB killer (Bernard a kol., 1994), ktorý bude
Ã
À»
ÖɉÅp×ØÓ2¼¢Ù Ŝ×
Ì¿.ÅPÀ™Ã%Ð7Ó\Ò.ÅpÉ@ÌÒ%×
Ì¿Ø̹Ù
ÉÚ½Æ%ÉÓIÌ¿ØÛ2Ü#ÝÐÞÍßÍáàÍâãÍ
31
Replikón: pMB1
äæåçãè
éêUëìí%î´ïðèñ
òªóCéô+õöpé%ó\ì÷øùú%åû
Gén rezistencie: Amp (ampicilín)
Klonovacie miesta: polylinker z plazmidu pUC18, celkove 13 unikátnych miest pre
ó7åIêUöpó2ø;è
üûýšårûú%éûIþ
èXÿå
gyrA462 kmene (napríklad
B261, len pre prípravu vektora),
!#" $&%')(*,+.-$ !
/+10 " 2-!3/104-,,+ " -!576
8/9!:<;7=>;@?;ACBED2F:HGJI1KL,MONPQ1P/Q1R4P$D#NSGUTEVWQ$XZY2[Z\]1;
^ :HG4L1_`aQ
Q1b!cGF`ad1L!BHe
DfBRUBI1_GUB
DHQ1b1K`adPgd Fb!Nih/jkBld1BI$Fb!:iQ$XZY2[Z\]mD#PonFHG&BQGZL!GUBI$Fb!:Hb$V
:#BkD2F:HGaI1KL,b,VpBL!T!b!LEV1I1RUBMckb$VqhrIkFb!:#B2esckMEDfPt!b$d1u'NGUBED2FbvefB'R4b!I1PRwG4ckb$d1PL1uvd
ccdB géne (killer gene)
PxRwGJy$VezB{D|T!b!L!b!:#b$d1b$V~}Ci€i;‚BR4BIq_GUPx:#BI1b!N
91G4L1PLEFb$dƒe#B„ckPR4b!j7BL!M
neporušeného ccd…
y1uLkVqh†IEF‡b:2ˆ
‰5VqL$y$VŠezB~PI1b
t,bDFGFBŽDHI!ˆ1_t†97V>L!GUBID2‘D#_t!b!Q!L!u’Q!:fBjkGFHG&P“RUBL”9$VqL$I$‹L!B$D2q_ŠB’QRUPckNSGUT•D
génom.
32
na killer aktivite
y$‹7:#Mckb$d!ˆŒezBT!h†FPI!jkB~Q,bF:#PLD#‰b!:)N
M_G5G
prerušeným ccdB
–q—w˜U™5šs™›1˜U™œvž Ÿ¢¡£™¤—a¡<˜4¥k¦›<§>¨©˜>™›!ª1«$›1¬$¥k­U™®7¯±°1¨©˜2²
³C´Eµ¶·H¸a¹qº»,¼l´»,½!¾»k¿1¹ÀU´kÁÂÃÅÄHÄ<Æ
typu štiepia DNA za optimálnych podmienok v presne
definovaných sekvenciách za vzniku definovaných fragmentov (kapitola 9). Zoznam
Ç#ÈkÉ2ÊÇHËaÌ1ÍÎ$ÏÐÑÒÈÎ!Ó!Ô!ÎEÕ1Ì1Ö5Ȋ×ØÚÙHÙ<Û
òó4ôSõaöq÷ø!ù‚úùû<òù!ü$ý1þOòÿ!ó4ù,ò#ÿ
typu spolu s ÜUÝÞàß!áEâÜ4ãäå4æ!ç1ãSÜ>èféêë1ìæ$í1ãSÜá1ß1îãiÜUéæ$ë1êãSÜïðEå&ßñkéæ!ÜUé
ýöÿ!ÿ
‚ö‚ü±òó1ùø!ù±ö±òÿ !#"$%&('*)+,$.-
najznámejších patria firmy New England Biolabs, Boehringer Mannheim, Pharmacia,
Amersham, Gibco BRL a iné.
Štiepenie DNA v 20 / 02143#56.7#83:9<;>[email protected]
Do ependorfovej skúmavky napipetujeme v uvedenom poradí:
E
G
x F l roztoku DNA (v TE alebo H2O, max. 10 F l)
m
2 F HIKJ2LMJNOLPRQTSVUWOKXJZY[\^]J_UWOK_.`DaRJNP_bKXJcadO.ef`Dag:]h_bXJi`DHkj^g:NVbXJ^adJIB`DJ]l
m
18-x-y n l deionizovanej sterilnej H20
y n H*adOeT`Dadg:]h_OoQ
€ƒ‚R„}…V†‡ ˆ
endonukleázy (2 – 5 U, max. 2 n l). p*q.r s tu(v2w
‰Š.‹ŒŽ‰‘(’“2”V•–—ŠW“˜(™“(š(2›}ŠœžŒo‘Š#Œd™ Ÿ š‹Ž‘¡£¢2¤¥
x(tyoz{(z#|}x~
¦V§¨B©.ª}«¬V«­®°¯(¨#ª²±d³¯µ´}¶±d³
-20 · C !
¸
Þ
¹dºW»#¼½#¾¿ÁÀ.ÂÁºÃÅă¾¼Æ2ÇÈÆɎºÂÁºËʹÄÊÌÍ.»ÎÌÏ»¾ºRÉÑкÊ2҃Ìк*ÓD¾»RÉd½»ÃTкRÉÕÔdÄ}º×ÖÙØÌεÚ.ʹRÄÛÜ Ý
C)
reakciu zastavíme pridaním STOP roztoku ( 50 mM EDTA, 0,01% brómfenolová
ß^àáâdãäµåÈæçéèê:ëìíâdà2êƒäîïDàâTð&ß^ñòKíódêôò.õ ö ÷RøÅ÷#ùú^û÷ûüýo÷þÿ
dúfúù
výsledok štiepenia analyzujeme pomocou elektroforézy v agarózovom géli
Ligácia DNA:
!"$#&%('*),+)-+/.02143) 5 6798;:<>=@?A6/BDCE6C*:FC-GHIKJMLONQPK<R8TSUTLVCKW<YX[Z7\W/]PK^467WPK7/Z
_`acbdefhgKikjMlOmQnKoQg-pqpqrg-p/sFq/tvuxw
2+
a ATP. Za štandardných podmienok katalyzuje T4-DNA
ligáza len spájanie koncov s yz|{K}K~Y{-€T‚TƒQ„K†…ˆ‡;‰Š‹Œ-Ž&~/…‘‰Š~„KK…’“”…•{ ~Š–z|{M-‰}K~/—„K‹
í
yŠ˜/…†{K~Š‰™‡;…~Šš/›œ€Š™{-~/ŽK—…D–™€ ž|ŸM -¡¢K£ŸT¤A¥k¦•Ÿk§|¨Y©(¡ª£«KŸ-£&¬ž|­K«K¨ ‘®c¯±°±²³¦ª´&£ª¶µhª·§F¨† K¸£&¹º» T¤
§F¼­O¤V K£¨YŸ½¬¹¼/¾«¿¸À¡ª£«KªÁ O¤Ã¡Ÿ ÄÆÅÃÇOÈ¿ÉËÊÌTÍÎύÈ4ÏÐ!ÑÒOӍÔÖÕQ׿ÐÏύӷÅØ Ù/ÚÜÛÞÝDß-àááÙ9â;ãÀä†àåæKçKàYè2é&æ-êàâ|ëDÙ@ì
ÙáçKè$ákîï|æKçKàè½êÙ@ð ñ/òóKôöõ÷øúùûñóKû/üýü‘þ|ÿ-ù ñÿÿ
ûñó&ÿ õR÷øû "!#
ñFÿ-þ$
33
alebo intra-molekulovú ligáciu za vzniku oligomérnych lineárnych alebo cirkulárnych
%'&)(*+-,/.0213 456879:5/;=< >@?2%A*B:CD;, ?E; ./FG*H29IKJL?6,M5M:%A&D; .021ON:479/:P4,M?56/%A&N,/.021Q3 456879/:R5M;TSUV;&W&'*
od celkovej koncentrácie koncov DNA (i), a od pomeru relatívnej koncentrácie jedného konca
molekuly DNA v bezprostrednom susedstve druhého konca tej istej molekuly (j). (Pre danú
lineárnu molekulu j je konštantné a na rozdiel od i je nezávislé od koncentrácie DNA v
%'&)(*+-,M?JSXY?8W&AZB<G[?25/4\?]:&'0^9_`P ;*-1/I;?268PY9a3 4\?26/359 %b*26 5XcH-?KW:73? dYe-fhgi/jlkbm^gf)n-o8e2f'pqpsr t/uf)vYo2kAw/x
y^zO{|}~€=‚„ƒ…}b†V‡‰ˆŠ‡‰†^ˆ/‹†L‡}AŒ^zŽ ‘y2’/“”•'yV‡‰}Ay—–y—‹ˆ/‘ ˜MˆM‘™^š˜ †2’ ˆ›‡‰yV‘GœŽžz‡ˆ ‹ŸŠ‘= \y^z”ˆ¡y8›Q•)}A¢™2Œ2}'†
˜M†-˜My/›‡‰y^˜M†/‚8£¤™^‹ˆ/‘†2¥– ¦§M¨2©8¦‰ªa« ¬­©a¬ ® ¯°)§G¬Ž­2±l²³E´­^µ¶A´¸·°A¹³º¯³^»¨2³2¹¦‰ª¸»³^¼ ª ´E½¶A¹·8¨2¶'³2±¦¾ ¿B¾lÀ‰¯ªV¿³2¹ ¶'­
molekuly vektorovej DNA s inzertom je len okolo 20%. V reálnych podmienkach je však
Á ­À¦‰ª ¼·]¦s´³2¹l¶'³/¾ÄÞ½ ®À´Y³OÅ ªÆÀ¶b­-© °'¶Ç´Y­^µ¶È´Y·2°A¹³É»³^¼/¬Ž³2¹¨2¶'³Ê»³^¼ª ´K½¶A¹·2¨2¶'³Ê¯ªM˲ÌD¬­—À\­Íέ^²—Ï
´ª°È·»Ð¹/®Ñ¹M·MÀ\ªM½ª¼Ñ¼ ª ¹ ¨2³2¹¦»·2¨^¶'³ÓÒ@ÔÃ
ëìãÛÝEîèAàï2í2è'ìåðñìòî/܎ó
¶A¹ Õ³^»¦ËÖ¾ ×KØ^ÙÈÚÛ/ÜÞÝÛßà Ûláâ-ÛMÜÞØ^ãMÛåäæ çÚèDâêéëì^ã æì2àMí-èDÜ
ôÛ/Üßè"õ‰èAìòæŽì^ã/õ‰Û/ë‰ÛMæ
á
pozitívnou selekciou rekombinantov, alebo
ö^÷Gø2ùú¸ûBüýAþÿ ö
ù2þ2ý'ûÓÿ ÷ þöÿ/ü
ö!"#$%
12312456'278:92;<=>3@?BADC5E42F56'27GHJIK92;<LHINMPOQ2RSTIVUW'H
È ý'&^øû()Lû ü8üý+* ý-,û.0/
12X31LYUZ\[5^]_a`bOQc
calf intestinae
alkaline phosphatase, alebo BAP-bacterial alkaline phosphatase) dostaneme DNA, ktorá má
;Ld2e2<\Cf92;<2<\CfC5E42F56'278g39RhiI';5MQjkI'=YU2l3mLn;=ELobpq[T6rI's27LYtuj!vc#w$x%yz6'I's{Z\[T2RBMQ|}=~kST=
p{€I';;23bt
U4mL\;i3124HZ<I=
E. coli
6I';=Z‚4;5HIƒH2i6=\9R{6L„HJIzo…=
7=†‡HIˆ;W'[9{L‰Šh=\4<=\;‹U2
4=‚92HŒeI';L;‹U27o=Ž7G4…L\[T;=75‡I=MkOB4Ih2RSIVUW‘1231LYUZ‚[„5’L\6=\e2“L\9:;L96'2;27L;Ir=h2RSTI o”=HJ=
vektor s pozitívnou selekciou je optimálny molárny pomer vektor/inzert rovný 1.
OB4Iah4mZ<I•3m2–[;ZHŒ5HIawxJy—1N4L‚siHJ=;‹ULHI˜H2iST;2q1N4=\97{=;<I-R™4=\92HšeI';L;‹U27q7G4L\[T;=
[\7G{”I-t
bUI'=\h=;WrH
7=\9U24L
L
96'2;27L;=oˆwxy
E72iHŒI›4m=‹3bU4I-9€;GHIœ=;E2;
ukleázami
produkujúcimi nekompatibilné konce. Pri štiepení plazmidového vektora tak vzniknú dva
fragmenty, z ktorých funkciu vektora plní len jeden a
E4bRCG;=\h2‹U4=‡e;Gž3L2Ei3bU4mZ\;I!2e5€Lo;=
preparatívnou elektroforézou (Obr. 6.3.).
ŸB r¡T¢‚£\¤¥r£ ¥V¦§¨\¤£-©$ªY«}£\¬‡¥®­ ¯a°‡£ ¥V¦±²¥³Œ´T¡µ¶‡ªY¤‡·X²\µ´T¡¤²¡¸N¹iº
DNA (výsledná koncentrácia 200 » g/ml )
30 mM TRIS HCl, pH 7,5
6 mM MgCl
10 mM ditiothreitol
50 mg/ml BSA (bovínny sérový albumín)
0,5 mM ATP
0,05 - 0,1 U T4-DNA ligáza
34
¼¾½'¿ÀÁÂu½rÃ'ÄÅÆÇÈÉ¿gÊm¿Ë‡Ì¿ÁÍfοÁÊÏÐÒÑ$ÓÔÕŽ'ÁÄÖˏ×PØmÅÙ¿ÊÏÅ\ÁÚÃ'ÏÛÊÃ'ÙÖ\ÜÅÝޞÅ\Á¿à߂ádÁÊmÖâÌ
ãäåæç‚å‹èéäêë\åìgíî'ï{ëðåìdèí'ñî-êìéäò\è#äã{ó®ôõç\å‹è#äéäòYè#äãöçKä÷øðëöåçKùäiùúYêëåìqûüäiíþýlû
ÿ
ligázou a
!"$#&%"'()+*,#-/.00' 1 2/34657,8:9<;,=>[email protected]@"ACED02GF!HIE2KJ
LNMGO PNMRQTS$QBUVXWYQ0Z$[0\:]^E_`\aEVRPNMbV"cd[ef:MEgchiVVWkj$[0dSi\:]lQ[c6mon
p
q0rst!uv!u&qwyxz{}|,~€t6)r‚"oq0ƒu0„…u†‡v,r|ˆt‰v6:sTŠ…u†‹r$…&„u…†0s"Œ)riwŽŽu&†‚u0„E~‘|!s0’v“†qr„r$…”ƒ&u
postupu
p
v,r|tv6:s0Š…w•rŽ…&„u…†0s"Œ–rw~—|~˜„r$~$st:qK†™r€t!r$‚0rŒ)…u†š„r$…&~Gt+†0v,w›)u†œˆ)…s†0ž0w›)u† Ÿ¡‹¢y)…£t
pri 65 ¤ C), alebo extrakciou s chloroformom
¥
¦0§¨©!ª«!ª&¦¬®­¯°
±³²®¦´µ«,¬¶²¸·«,¹)º²$¦¨0ª0»
²¼:¨0ª½ª0¼¿¾À²¸·0ªÁ¦´0±¾Ã³§ŽÄK¹Å±,²š«,ªµi·¾k±ˆ©¹y¦ÇÆÃÈ
roztoku
É
podobným spôsobom sa pripravia fragmenty chromozómovej DNA. Pri príprave
Ê0Ë$Ì&Í&ÎÏÐрÒ0ÌÓ)ÔÌՖÐ×Ö,ØyÎ0ÙiÚÛ,Ó)ÌÍܘÝ0Í&Ü0ÔÕ:Î0Ø6Þ6߇à–áŽÌâÝ0Ø$ã,ÐÓ)äàÌ0áåÛæ6Ó
á$Ý0áÌÓØBçÍÌ&Íã³Í&Îá³ÞéèêëíìîØiïð
Ö,ñBáóòÕ+Ö6Ò0ØàÓôçÍôÖæ!ØbæõÍ"Ú$Ì&á“Î0áö ÷0ø`ù+ú,û$ü0ýBþÿ û
Ãúú,û0ûù+ú,û$ü0ý
þÿ!"ý
# û%$ &('*),+-) . /102(35476*8:9;6<=?>[email protected]/8(D13FE10FG4H2JI3F4B41G*354KD1LM8(9;NO9;PQ*NR9S4UT!VWYX[Z\>J]*AR3P9^0FE_D`3a
vhodných fragmentov DNA z agarózového gélu
b
B*8(3B*8(/Sced(/f0g3Fh/1i1GEjPNk4dlB9^m*n/jG*3Fo2(354paS41m*41GqD1LCB9m*N!3541G*9*6
b
k r*str*s(uvxw1y*wUz\{gtF|u1}1y*wUzj~kw€(t€‚uOr*s(tFƒ*„R…†‡ˆ‰!Š‹{FtF|„~uYukŒ1w1{F„Y{gtF|u1}1y„ zmes sa inkubuje
16 hodín pri teplote 16  C
Ž
r‘r*{“’y*”U•–tFy*—^˜;u1}1y*wUz™ƒ*˜*’š€‚u›r*œu1ƒvu1yž˜%z(w1C’š{gtF|u1}1yw:z™~Yw€(tHrœt zUŸ y*u
transformáciu
kompetentných buniek E. coli ¡Š[…l¢‹r*s•£”*Ry¤¥v"{FtF|u1}1yw:z¦~kw€(t
}1tFu€J”}ywYt§y*¨*t˜*_z‚w!”s(uy^€(©*s(R„Œ1t£xªl”u%—*œw7}_u€J”;—*s(„«”¬z(wr”­s(w˜*y®{§tF|u1}1yŸ¯~kw€[r*s(w%~1s(„œu°
r*RŒ1±u{—*¨*^{²¬³¢¬s(u—”t“Œ—;’´y*wv*’*¨*y*”y1ª;v~¨µu_ƒ*;›yu¶v*’€:;—*¤k˜€:u`¨€:^{F•^v{5t§|u_}`y^
tlmivom roztoku, je to v rMsU•ru1ƒ*w1ª·u—
rœ1t z‚w1kw
u%—
”s(u%y^€(©*s¸Ou1}1yŸ
kw”¹ƒ
elektroporáciu).
º¼»F½¾¿^À‹Á»5ý1Ä*»gÅÇÆ(½[È*ɸ»ÊÈ*É(Å»“ËÍÌÎ1Ä*¿ÂÏÐxÅ1ÄÑÒ¦Á%ÓÉ(¿^ÀO¿;ÔÕ*ÀR¿Â½¶Ö×YØÙÑ*Àk½1ÚÅ
ÛUÛÜÝ\Þpßà:áâãfä
Streptococcus bovis
nej gény kódujúce rezistenciu na antibiotikum kanamycín.
åÇæç èÇæ«éxêéìëgí²îéïðñòfóôCñõöí«èÇæí÷øð*ù%úæû÷ü1í5íîeýðø*ê1ñÊòRþé*ð*÷Uÿkóøxþø*ê1í§õ
do ependorfovej skúmavky pridáme 1,5
g plazmidovej DNA pKIL18 štiepenej
!#"$ HindIII a 4,5 g chromozómovej DNA Streptococcus
bovis % &#'()*,+#$-#. $ # /01!#"2 Hin $33354$6-7( "&.8 7
minimálnom objeme TE tlmivého roztoku alebo vody)
35
9;:<>=@?A=CBA=;DE<FG<
H#I/H;<
J#KLMN:O&PHPQPJRTSVUXWYK0Z-L0PL$IHP$F1M\[L][IL^#_<
J`Q<OKaP$b/^2_cMcO1J$`Qd=
36
e
f$gh
ijlk
im#n(opihrqj]is
tvufwxypz1j]i{s
| xv}jcpf~zm€‚,f$k,tvf0u$wf$kƒ(om„hƒ†… tomto
kroku krátkodobé zahriatie zmesi na 65 ‡ C a jej následné rýchle ochladenie v ˆ>muf…/f0j
n$ƒwix&t&‰ofXjcŠ;qm#giqwiot‹ Œ
Ž1#‘’“”]•–/—˜#™š$›’—•–š’–$œ
ž pridáme 20 Ÿ Ž¡ ¢£c•–/š’š¤Œ,–œ/š—–cŽy“&¥¦š˜—–cŒ–™>¤–•$”]§©¨«ª­¬¯®°
ž ±²
³&´µ¶]·¹¸º„»½¼¾»À¿ Á«ÂÄÃVÅÇÆ È&³&ɵ#ÊËÍÌÄη2ÈCÏÐÈ1³&ÉÌÑÒÏÓʶ]·$ÔÕ´Ö/×È&Ì´Ò·¹±²
·¶Ç³1·$Ø
̶]·
H2O do 180
pipetovaním
Ù
²
·Ì#×Ñ#ÒÏ]ʶ]·Ôv³&Ò×$Ú0Û@ÚÜd·¶]·X»ÝNÞß0´±²³«»>à]¼;»Ý á C
±ßâÚ±ÈËÒ$Úã,äX³&Ò×$Ú0Û/ÌÑÒ·Üå´ßÛ˹ÔdÌY±ß/æ2Ì´$ß$çÌÒèâ¶cÒß/æ$ÔãéçµâÈ&³&ÉÌÑ2Ò·Üêʶ]·Ô
³]±ßÚæ³ ÜÏÒÌ
Ù
transformáciu
Ù
kompetentných buniek E. coli HB101
z vybraných transformantov rastúcich na platniach s ampicilínom izolujeme
±È&Ì#ʶX³1´ß$ç$ÏcÃVÅXÆYÒÌrßç/·#²
·#Ò³1·ëÏ(ѳ&ÒÒßAÔã,³²
·#×߶NÛ³&ҵγ1·
Ù
všetky ostatné transformanty sterilne zmyjeme malým objemom LB média a
ìíîïð@íñ/ï2òóõôcòí/î$ö÷éñøëñù(ödú„ûdúô]úõòï;ì0ü-ï÷òúëývþâö
Obr. 6.4. Elektroforetické delenie DNA v 1%
"!#$!
%'&()+*,-(&.)/102%'&345&"6738:9';2<<>=2?@(BACC)+DFEG.) H+I"JKLM
NO$P QSR'T+UVWXZY[[]\^ZP#_a`b[[2[[c\^ad WedVf^ g h"i"j#klBm
noqprrsnut2v+wxy$zv+{5|+{x~}|€yz‚ƒ'|+{„…o†w|+‡ˆo‰„Š‹prr2r
ŒŽ‹‘’“”•'–—-˜š™œ›žŸ ¡-+›"“1¢+”’£¤'£¥¦¤'£"§"“1¨ª©†«
¬¤'+­•
Streptococcus bovis ®°¯±$² ³´¶µ·¹¸
º
chromozómová DNA S. bovis »¼½B¾¡¿u¾+À ²1± ¾Á¼ ± ½Ã µ ÀÄ#Å
endonukleázou Hin ÆÇÇǐÈ'ÆÉ$ÊËÌÎÍÏ:ÐÎÑÓÒÔÕÖ×Ô¡Ø-Ô+Ò"Ê
ÙªÚÜÛ
Ý5Þàß#áâ'ãä#åæÝçéèêéë ìí
ÝÞBßá â'ãä#å
Ýçéèêéëì
äî$ïðßòñóZôæõÎÙªÚÜÛ
ö7÷ãBøÝ-ø+ùï
endonukleázou Hin ýþþþÿaý
î$øú÷îãÃû5ñ+ùü#å
molekulovej hmotnosti "!$#
%"&'!#"()%*,+$!,#
-DNA
Bst-/..
ý
$ý
štiepená
021"3%4%5"6789
fragmentov 702 bp, 1264 bp, 1371 bp, 1929 bp,
2323 bp, 3675bp, 4324 bp, 4822 bp, 5687 bp, 6369
bp, 7242 bp a 8453 bp).
37
kanamycínom (50 ÿ g/ml).
1
2
3
4
5
6
7. Transformácia buniek E. coli
Prenos rekombinantnej plazmidovej DNA do recipientných bakteriálnych buniek patrí k
:";=<)>[email protected]
molekulovom klonovaní. OQP"RLS"TVUXW$YZ[\^])_`aPE[VUIbXP"YIcedfdhg$S"RIiLPETVi"\^] jhW k l m
noLpq^rEptsIuKpvnwuKx$yLz){|qhxyI}"pLy'~=$rL€‚ƒpL„)x$…~†„a‡‰ˆ‹ŠƒŒŽ$‘x$…w’aoL}"p†n“”wpIr"p'wpŽs"uzu^pLyI•–x$}E€$r"p—s"u^pL–x'n~‚q˜x™o=x š%›ƒœ
nízka (len 1 z 106 ŽžLŸ) $¡I¢XŸX£‹¤ƒ¥‚¦K§/¨©†ªK¨$¡¬«¨™­E®h¯$°²±³E´$µ¶ ·E¸X ®K°2— º¹±¼»ºŸ½¹I¾L´,µ¶¸LžL¿Iƒ°) $¹"žL¡Àh¨ŽŽ¹LžIÁ"À¼±©Ež
¸"®^° Âh¨Ã±³E´$µÄƒžLŸ) $¡¢XŸÅ£Æ¤ƒ¥ÇÉÈLÁ ʝƒ¹"ž=µ"žI¡"®h»Ã±Ë«$©I³Xªh°BÌ Í/Î|Ï^Ð,ÑvÒ^ÓEÔIϼÕÆÖÉÔ=×ÙØÚIÛX×Ý܋ރßà"Ôâá"ãXÑIä)Ø$Ú
ҘÐå֎æIçºØ
è$é"êXë äBìíÔIÓ"Ï^Ðî,Ô é Ð,ÑLï2ÖðáXÐÚ'ÕØÏ^ä)ñ×)ÑIòEî$óôá"ãXÑIä)Ø,ÚQî$ó"Øփä)î$Ú ê ÖÊä”×)ñ%ÕÚXÐ$փä)õ‘ÐÚEÔöÒÛ÷î$ó"×)ÔIÏ^ä)à é ñ$ÓEØ$ÑLÐ%Õ ê Ð×)ØáEÔ
î$ó"×)ÔIÏ^ä)à‹ÏãLáEï)à=äÙÐ$õÓIÏhä è ÑLï½çØ$ÑLØøùÕØÓL×)Ô'Õ¼Ø'Í úLû$ü"ýIþLÿ"ý
aÿEû$üXÿ
!#"$&%(' kompetentný
)!*$+',!.-/*102 354768*:9 ;=<(>@?ACB>EDGFIHKJMLON#P.QSRTAPURVN#A<XWY;8ZV[\^]_)`bacdEef\gih?jACNklQc<(mYnoN)PpZc(mph)<(;KRrqd?
kompetentných buniek E. coli, pripravených opracovaním s chloridom vápenatým, dosahuje
s ? t
ne 105-107 transformantov na mikrogram intaktného plazmidu pBR322, optimalizáciou
u <a;vd@?c<AQxwUZ:A=;8<tc<=a<xmdZjycCBn zY{}| ~€5‚„ƒ…†f‡)~‡)ˆpz‰(Šp‹)…ˆŒ8z‰C‡.…C|OŽ 7-108).
8‘“’””•–—™˜šU›”(–5œ•šŸž ’¢¡
•¦›§j¨©5¡Ÿ¡™ª&‘’””•«–—
E. coli závisí aj od formy DNA. £¤b¥
˜š5›j”(–5œ•šŸž ’¬¡ š5¡ š¨­•¦ª®œ•š5¨
›j°CK’¢±C¨³²”’¬¡´©5¡µ¦&¡¶
š5•°±’¢¡ Ÿ¡±°’K–Y¨ ¡š5­¡ ’ ž ”•¨³›
¥
¤
¥¯
¤·
¯
¥
¯ ¤ ¯
relaxovanou formou, prípadne plazmidovej kruhovej DNA s prerušeniami) za 100%, potom
ª&‘’””•x–Y— ¸¹5º»(¼5½¾¹5¿KÀÁ¢ÃĹ5¾Å»ºÆ¾Ç&ȺÉÃÊÉ»ÃÀ¹5»¾ÇKËÍÌvÎÐÏ5ÃÒÑÄɢû=ÓÔÕÈ(Öý¾x¼5½¾¹U×ɾSÅSº“»¾ÇØÉ»ÃÀ¹5»¾Ç
DNA desatiny percenta a
stotina percenta. Z
ÉÂ7»ÃrÀ¹5»¾ÇÙËÍÌvÎ
ÚY¸ÂÃÛ&û¾ÇÜÖCÅS¾S¿KºÝ¹5¾SÞrÉ7¢߻à¿ÒÂÐû־»CÇÆÉ¢ÃÀÞº¿K¬È
ÇÅSÃÖûáâ¾ãÏUÃãÞr¹5ÃÏ俟áÈæåÃbºÏ™Û¹5ÂæÛ¾ÇåCÂç¸èÐÖý¾¼5½¾¹×ɾź»ÃϙÅSÃƸp¾¹¾ÅÃÏ
¿K¾É¬ÃjÆÇxÉ×ËM̟΄Ï5ûûCÇ&ɾSÅSÀÄÛ¹5º:ÅSÖÃÛ¾(־黾¼êÅÞ»ÂÆǟ»Ã¹5Ãƾ¿=éÂ7»º»¸»àÁ⸹5º»¼5½¾S¹5¿Kº»¸p¾Åë
Îƾì¹pÃjÁ“ÂíÛÂû¸»á=Æ¿KûÃ=Û¹pÃʸ)¹pº»(¼p½)¾(¿8ÀÁÂlÇØËIÌvÎb¼5º=»º.πߺC¼)¸pÃYπÚ5ÂÃ=Û¾CÇåèlÅSºÏYîØÆ(¿8ûÃ
E. coli
HB101, DH5ï , MC1061, JM101, JM109, C600 a iné, ktoré sa líšia svojimi genotypovými
ðñòóôõó)ö“ò÷Køòùøúûüðýþÿõ1óðø¬ó
MóõS÷
ñEõôõðòújøÿûõüðÿõpòùòµóõôô÷KøMúøÿf÷Kø
jednotlivých experimentov.
Transformáciu bakteriálnych buniek s pÿõ÷þøEôòôôõG÷Oõ!rôõÿròñø"õðòöMò$# øEôý÷Kø
%&('*)+,%-/.0%&+1-02'*3456%73893:1,;4$9<= >@?A
B"?ADCFEGHCJIACKMLNOA$PQSRUTVGXWYCZI\[FA$T/QU]^K_`Rab?AOI*O?]cCLI*OE`d
medzidruhovú fúziu protoplastov, konjugatívny prenos rekombinantných plazmidov alebo
transdukciu pomocou fágových vektorov.
Nedávno L
CeE_EfT^KGg]hC:CjiUCkC]lCmL
C:[N$[nZI$B"EYK[j?YOGYoB"EYCpb[]l[UZI*AOI*A
CKYL
N*O!APqCSkUK`QeI[RaKT^ZYC
?A
[nKOfLrGqsutvdf[]^[ZI*A
O?OA
QRT/CwxyQFI*OqP[IzM{C@|D[iC]^Oo[KQ7KC7{[LrICFWYTl]hT^iQRThT}WGgKZYOE~YRaP[P7WYA
QK
L?Y€LDO`W![K[$|[]l[ZI*A$TlRZ~P‚?YOYƒOPd„kB^P…L
C†W!CZI[A$TlQ]^KY[JP[P‡WYADQUK_ˆLrICK‰b?A
[RaOY{K[Š?Y[A
P[CWYTh]^KY‹
?A
[?A$B |Œ[P
RFGg{iUO!A
OY{[r|sutqvwŽb[SRUa`CKTiP7G}L[]l[ZI*A
O?`O!ADQRTl[JKTl[7|([Š?A
[L$KY[[email protected]}L$?Y[
K`OL*p
I*A
CnKML
N*OA$PQRTh[6WGgKTl[ZmI*~PIO‘L$?`€LDO`W!O!P’iQEYTL
B“a]hCEYK`[M>„KC”i]^O!oU[UKB“WGgKZYOEY[$|6L*I[K_`d•A
CLrIOEYOP
1
–*—˜™šœ›žYŸ —¡n¢£š/˜U¤^¥¦Y§¨:›g¥šh¡ Y©ª
š^¤l¡j¡¤l¡ —*¢$š^§n f«¨¬ž­¬Y®Ÿ©¯Ÿª¬`°!¡$± Y¬!¥Y–r—Ÿ¥—¡©²­`¬M¯—¡jŸ­¤^š^ Y¬`°!Ÿ¥³Y§¨
­›g¤"´¬°Y©f´¤^¬µ¡¥¶}Ÿ²—¡­Y¤^¬—¡¡¤^¡ —*¢D¬!­`¬!¢
ŸS¯¥«¨`¬J·«™šhŸŸ—*š^¡µ¥Ÿ7 Y¬¥§¡¥—*¢D˜§š^š¹¸uºq»¼!½¾¤l¡ —*¢¬!­`¬!¢
˜S§š^Ÿ
±Œ¡•°q­Y¬¢¬`°`¥Ÿ¥¶Žª„š^¥³Y·š!—*¢
Ÿn¥fª
¿*¬!¢
·Ÿ¯¥³Y·šf·¡F—ÀM™Ÿn·šf°³`¨¬Y™!¥`¡D±–
šlŸ“­¢
¡‡ª$°!¬±r›†¯Ÿª
¬°ÁÂ¥Y¡¥˜¢
¬Y¯¥`¬ª*Ã
ٱ
¡™¥¬Y™›g§¨¬fªrÃU©ŸU¤/¡e°¦µŸ™›S±(¡:š^¥™š"°fšl™›g˜¤^¥›Ä¬­—*š^·ŸU¤cš´˜§š"›Ä¡¤l¡ —*¢¬!­`¬!¢DŸ¯¥³`§¨X­Y¬M™·šl¡U¥`¬! H­¢
¡
jednotlivé bakteriálne druhy.
Príprava kompetentných buniek E. coli
pomocou chloridu vápenatého a ich
transfomácia s rekombinantnou DNA:
Å
Æ^ÇÈÉÊY˜ÊSÌ
ÍÎÍÏÐqÎËfÑÓÒHÎÔÕÆ^֓׊ØMÏÐÎË}ÉÊYËÚÙ$ÆV×YÖÛÇ`Ír̕ÇÜÕÈ`Ý!ÍޓÏÐÐ ß àmáâYãáäråçæèYàÚéhêYërì
E. coli íîïð}ïçñ0ò`óôõ`ö÷ó0ø!ñFùú*óû$ü^öý"òþ‡ùþgýÿúûrþòñûö
600
0,3-0,4 (asi 2-3 hod.)
za trepania pri teplote 37 C
bakteriálnu kultúru ochladíme v ! "#%$&('*)+-,/.01.23&45761'981):<;7170
>
pri 4= C
rozsuspendujeme bakteriálne bunky vo vychladenom sterilnom roztoku 50 mM
CaCl2,
[email protected]/JLK [email protected][P[\Y]I-^&I_R`1Y\[a1bcd[e[1fg3h&ADi\jlkmY\P-[1n7o-Ahpa[<qrk&a&i
s
na 30 minút
centrifugujeme bakteriálne bunky ako predtým, rozsuspendujeme ich v 1/15
pôvodného objemu bakteriálnej kultúry vo vychladenom sterilnom roztoku 50 mM
CaCl2,
?@eAtCuEHGvIJrK MONQPwR7MxT(VW@ykzY]P[{n|o5AOhpa1[}q ~€&<‚\~4ƒ„†…‡W‚7ˆ1‰lŠ/‰~‹‰Œ<Ž1+‡WŽ+~]‘€‚\’
¯
bunky si v c“”-•|–1—˜-™€š›Qœ]–7+ž&˜-•%Ÿ¡ \¢¤£œš¢¥§¦›r¨›—©€˜ªœ–1¢§–7œ]“\«€“¢§–
rozdelíme bakteriálnu suspenziu po 200-300
skúmaviek a pridáme 5
l do vychladených ependorfových
° ±e²%³´¶µZ·3¸¹º»D¼]½-¾¿€¾&À¾1Áñ-¿€Ä7»½-ÅÃÆDZ-½WÈ]¿&ɀ¾\ÊËÄ7»¸Ì:Í!Â1·3½ª¼]±-½WÎ|¾¸
20-50 ng DNA) v TE a necháme v Ï
Ü
°
¬ ­®
Ð&Ñ1ÒÔÓ1Õ֍×]ÕDØÙWÚ7Û
t
skúmavky ponoríme na 2 minúty do vodného termostatu vytemperovaného na 42Ý C
(heat shockÞßàá]à€âWã1äÔå:æ1çè#é1æé7ê+ë|ì€ãí-àyî&ì(ïðyñ3àeáê+à<àòà€çß*óõô\ãæöï ÷4øZù:ú€ûýü:þZÿ
ù ø
potom ochladíme v "!#%$'&)(*,+-.0/21.3 4 C) a inkubujeme bez trepania
5
v teplovzdušnom termostate pri 374 C 1 hodinu
bakteriálne bunky vysejeme na vytemperované selektívne agarové platne (100 – 200
6 $879;:<='$?>2@ ABCDEGFIHJKLMNH;C.ANE.OQP R.STHP,HVU.JHW0XOYZKD[F\P^]TD_E`NaHNFbJ`9X9DcdB8ETF2`.Je
obsahujú príslušné antibiotikum, prípadne substrát na stanovenie expresie klonovanej
enzýmovej aktivity a inkubujeme ich hore dnom v teplovzdušnom termostate pri
2
37f gihj;kl0m.noZhpIqIrsthvuZr-k.s.lGq2wxtymz9{}|~h_€Gq2r_otw‚s.n9{|€l.wƒst„.qbohs8p…bl.o†,hsGq2lGmˆ‡‰†,tstŠ† }ws9r
{r‹;sl{Œk.lkGobŽ||lk.‘9h’
“
”.ot•pZrw
r€{tt–qbohsp…2l.o†,hs}qIl9m
sh
h†”t{twŠ„sl.m.—
or‹t˜pIqrs.{tyŽ
‹-s.„‚jTt†,r
†,s.l.jpIqbm9l
mnpZtrmhs.z9{|Q~.Žstr€'sh*uZrk.sTŽ™”wh[q2‘ šœ›^9ž Ÿ[¡.¢Ÿ£Q¤ž¥8¦§‚¨.©.šª«¬§­0®¯xž°-±Š² ­ ¯
›[³2¨9­¥.ž
¬¤¯›¥.¨§´©.µ9¶·›ªµ•¸›º¹›ª9»«¨§Š¯
ž¼®¹¨§‚©.š½¸›[³I­¯§y³2¨G¾9¬¤9¶ ¸Z­?š¿¥.ž¢2›²§¬§¯±¨À»Z­_¹G§˜¸I³I­[³2¨T¾9¬¤
kolónií, ktoré vznikajú v dôsledku produkcie extracelulárnej Á -laktamázy a rozkladu
ampicilínu v blízkosti ampicilín rezistentných kolónií.
Príprava elektrokompetentných buniek E. coli:
Â
ÃÄÅ.Æ.ÇÈyÇÉËÊÌ,Ê0ÍΐÌ,ÈÏ)ÐÑÌ,ÒÓ.ÃÔ0ÕÖÎ.×ØÍÌ,ÈÙÊ_Ú?ÕbÛbÜÊ2ÉÝÄÅÙÄÊËÉ)ÞÔ_ÆGÛIÊÚÃßȂÄÊÉ)Æ.ÇÈàÛbáډâãÔVÄÊ-äåßÌ Ê
ý
ì
é ï
é.î ö ì bunky rastú pomerne rýchlo; "!#$#%##'&()*+-,/.0132546%0-879
.0:1+6;<4=>#?1
@AB#CD;8*+%E#FG!
@A#1H
I ochladíme bakteriálnu kultúru v J:
KMLNOP @A>QRSFMTU;V-0WM&8@AX&' %#
vychladenom rotore pri 4000g, 15 min. pri teplote 4Y Z [V17\%
#]*^_!;7`!;86%
,
Þ.ÇÄTÆâæÄÔ_ÚßTՉç èTé"êbëì_íéîïéðîéòñôó
600
õ.öØ÷Tø2õ.öŠùûú î9é‰üZýìíÿþZïì
elektrokompetentných bakteriálnych buniek E. coli HB101 závisí od kontinuálneho
I
;'$56%0M
a+6!
=b*,Gc Y Z!
deF=fg!;<
FM*A!;7b!;86%
,H
rozsuspendujeme získané bakteriálne bunky v 100 ml vychladenej sterilnej
I
deionizovanej vody a centrifugujeme ako predtým
I
centrifugujeme ako predtým
rozsuspendujeme bunky v 50 ml vychladenej sterilnej deionizovanej vody a
rozsuspendujeme
bunky v 2 ml 10%-ného vychladeného sterilného glycerínu;
2 7-<10
4D1#hFU;4MFi.0
61G.
,g@A=.
,^ jklnmporq:s /ml
t uj:vu+wgxyl`xy<j6z0{M|
}~€0|v‚k<jCƒA„…€AzrqMss † ‡ƒA|wh…k*u*z0ˆM‰6Šg€h‰Šw#zhˆ6z0j6‹Œxylu{:x‡bwu{Œ'Žs  "jM…
10
6 mesiacov, bez straty elektrokompetencie.
Transformácia elektrokompetentných buniek E. coli:
t z
#‰Š
‡j‘’ƒA{“{‡{Mvu*y<wx
wy<jM”|}Cvhz0{•u*Az – —˜
™“š›œ\9žŸ3 ¡+¢
£h¤¥ —“¦
—§*¨—:©
ªŸA™G™T«¬™­¨U¡®¯#®¡—M°6¦±
prístroj Gene Pulser na kapacitu 25 ² F a 2,5 kV, Pulse controller nastavíme na
hodnotu 200 ohmov (Obr. 7.1)
3
³
³ ´<µ¶·?´¹¸6¶º·A»“»¼»M½¾*´<µ½
µ
·G¿0»À¾+»Á¾ÁÂÃÄ0Á½hÅƸÇ0¼`µ
Ⱥ·A»“ÉÊËA̵AÍ:¸ÌÄ0Î
̵ÏÇÅ#ÊË
¼¸Ì
»Á#»'ÐgÑÀÎ>Òg·A¼
ependorfovej skúmavky pridáme 40-50 Ó l bunkovej suspenzie a 1-5 Ó l DNA v TE
roztoku, dobre rozmiešame a necháme v Í:¸Ì
»Ô¸Õ<¿
µÖ‚ÑÔ·AÉ`Á×¾-Ä
premiestnime zmes buniek a DNA pomocou mikropipety na dno vychladenej
³
»¼»M½¾*´<µ¿
µ´<¸MØÁ»¹Ðe½ÅÇh»À¾*Å
aplikujeme jeden elektrický pulz s nastavenými parametrami, výsledný potenciálový
Ø ¸Õ<µÇ#ÙR½#µÁÚ*¾¸Á¾+¸RÃ
ÅÛ·A¸¼¸ÜÃ
ÅÝÞ¿´<ɬÃ0¼É`È5Á
»àß#Î>ÒáÒ
·Aɼ>É*Õ¹»½×0Á#ÌÎâ˵
ÌÁµ¾¸ãظյÇ0»Ðä½
µ
ÁÚ*¾+¸Á¾*Å忴ɸ·nµæÕ+×
Ç0ÉçÕºÕ ×èØÉ`Á
Áµ]ÕÝ5µÄ ¿´<»·géÇh¸Á
ɸ
spád predstavuje 12,5 kV/cm,
buniek a odstránenia solí z bakteriálnej suspenzie, ktorá je pri elektroporácii
nevyhnutná
ÿ
³ ê
ë0ì
í9îTï`ðñMò jemne rozsuspendujeme bunky v óôóõö*÷<øù
ø÷<úûMü
ó'ý kyvete s LB médiom
(37þ C, postupne do objemu 1 ml), premiestnime ich do sklenenej skúmavky (170 x
10 mm) a inkubujeme za trepania (225 ot/min.) 1 hod. pri 37þ C
bunky v primeraných objemoch vysejeme rozterom na selektívne agarové LB platne
a inkubujeme v termostate v obrátenej polohe pri 37
ù
ø5ø÷<ø
ú•öó•üGõ
ø
ô
ü
ö*÷<úüø÷AúMüTö+ø
4
þ
úø
<õ
úü
¬ú
!"#%$&#('#)+*-,.0/21!3"5436-7540891:40;<4=>?"636"510@-847A1-31"51B>(C"D#EGF1H7H4GI?CKJL40F408.!L 1M8N;9<@B>9840O
>P1=Q1=6RI?CSLDT810@4M8.U81V7540F86>?;9L+WX*M,Q@01I?>?91*M,Q131-"51B>(C"YDQZ
Gene Pulser, Pulse
Controller a Sample chamber).
8. Identifikácia a analýza rekombinantných bakteriálnych klonov
Základnými stavebnými prvkami pre konštrukciu rekombinantnej DNA sú dva typy
vhodne upravených molekúl DNA. Jedna z
89<*0,[754\L4-=>P6"6L]0OA=>?6"5]^I;_C`9a81b3"54-86&IcF"YJ,47
molekuly DNA, ktorá predstavuje donora, darcu génu (tzv. donorová molekula DNA).
Stratégia odlíšenia klonov obsahujúcich
rekombinantnú
DNA od nerekombinantných
dYeMfg+hji0kXlmXn0oqpr-gsPtutpmn0ovxw2t+hrgyh0z{r|efp}(~5h<ftkGs(€%‚ƒpXrgsPtu5i„…‡†uP}&u5ˆu5ipr|uHrgtXw‰}li0lsPtp
z{r|ts?u5r‰lŠ:eMpXt+h}‹|sPigŠ:t+kw2}<r0lg€Œi‰€2s(ptuY‰i:u5rgtwG‰}li0lsPtpK‰XtXh<iepmotkXlrMlfu5rkqs(ptuY‰t‚
nerekombinantných molekúl.
Na rozlíšenie rekombinantov a
lru5rgtw‰}Žli0ls?lmn0os?u5il~5?tXuwci0ls‘tpS~Hi’t‚†0ˆpXiHzy
“c”Ž•–H—˜”—™—Xš”›•œžPŸ› ¡”•X¢X£X•‘—X–5œA¤¢¥¦§¤¨©ª[«—¬0¡¨?•¢[“2—+™<Ÿ•¥™<­–¡Ÿ©®šŸM¡ŸBP”•X¢°¯±‡²0³´5”¡¨µ¤Ÿ-•P—–—¤
—˜&¶H¨M ¥0©{Ÿ^”¡·?—–¸“G­›0”¥£!•‘—X–H­¹¥“2—¦0º »¼{½¿¾H½MÀ<½ÁÂ0ûÅÄ5½-ÁÆXÇÈÃÉÊ0ÉË?ÉÌÂ0ÍÎÁ+ÀjÆ+ÉÆύÐÒÑ
Ç2Ö×½0Çc½!Ä5ÆØÀÃ(Ù5ÆÏÊÚ Û?ÜÝÛ?Þ%ßXÞ[àHá0âá-ãäMÝ<á!Ü5á-ãåXæçÝèé0èÛPåêìëèáíéBÛPîjêèïðXèáBïÛ?Ü5ñ0âèïòé
Ë?ÆÍÆˑÆÓÍÔÊ0ÕÃ(¾ÁÊ
pozitívnu.
Negatívna selekcia:
Pri negatívnej selekcii êÞïóîêéMæcá2åçÞô0éõ5èáKàYÛ?Ü5éBÛ(ïöé-èÛ?ÝçÝåÛÝä-ãáHõ÷Ü5áøÝ(àYÛPá0èä0Ý<áqßùêåúèû0üå
êXáãÛPåXÜHéýbþÛ(Ü5éÿÛPé’éèÛ?ÝjçÝjåÛPÝäãáõÓÜ5á-øÝ(à?ÛPáMèä0ÝáVêøèÝãñ’úù&à5âá0úãåæ
Û?øêý[Ýèø%áÜHôèáõ
ÝèéãÛPÝêñ0ä0Ý<áVßÜ5Ý
àHáãï úåKêè Û?Ü5é|íûèïð°ãÛ?åÜcßÜ5î(à5âï
5è Ü5áøÝ(àYÛPá-èä0ÝïöéMâ<áçå[Ýè êâ<éàYÛ?èå°à
!"$#&%(')+*-,&/.!')&02135467"894;:+&.:=<>:4)#$? .:A@BC,DEFG+H:+,I'%J8%J"'%K!F
0L%K4')!,+%M9N/,&:!*-O;+&,&: 4:P.&DQSRI6M.9: #&0T 0)$L+UV6XW;+,&%K '0:!,4Y&01Z.:+,[+ 8,&%K+ êâåóá0èîìäBïúøÝ<áMüå
netransformovaných. Napríklad v plazmide pBR322, ktorý obsahuje gény rezistencie na
ampicilín a tetracyklín, restriktáza BamHI štiepi v polohe 376 v géne pre Tet rezistenciu. Po
\^]_a`&bdcVe&f+g&hai3jlknmXbTf!oprq+gs)tuwvIf!x"t$g"y+q+gz{+|~}
rozštiepení plazmidu restriktázou Bam
BamHI
kohéznymi koncami, následnej ligácii a transfomácii sa budú transformované baktérie E. coli
t S}TfC|I€+d‚9{+q/bTq!xt$pƒcVgf+gsgz„`…Kf!vIplcKe†…VhX‡cMˆ>teHsbfg}mt&b‰pŠfCgIs)t"u†t"9}f+|€‹d‚9{CcK{+|Œ…Kq!g„`uteg‚
`…Vf!vIplcKe&tu‚ŽijlkcV{+|};{+|&t&`&g&tS}ˆCt"€‘b’}ˆ“u‘`&b‰h(s)t$pZtS}scŠfCpZ`cK{CcV…Kh”g€•f“s)q–sbTf+{=—Qx…KhVg€™˜šjrf›`e&q
u&—&bfI}sX‚wf!xs)q!bcV’+…Vgqxt$…J$g&cKq+_šxsžt$bŸ tS}Tf!|€‹d‚~bq!xt&pƒc”gf+gIsg&Ÿ¡`…Kf!vIplcKe—~fscVq!¢
s f+pZ`cœ{+cV…œhVg"tp
5
bunky, ktoré získali pôvodný plazmid pBR322. Po prenesení bakteriálnych klonov na pevnú
pôdu s tetracyklínom s
£$¤+¥-¦§"¨P©&ª«=£¬&¤©§¬&§­&®"§G¯°I§¨ ®&¤±£&²ªT«¯³X´µ­$«!¦³)¶!ªd·K¤+¸2¦³ž§ª¶„§"­9¯«!¹I¨+ºd´
rekombinantný plazmid (Obr. 8.1). Tento typ selekcie je pomerne nevýhodný, hlavne pre
¯£§!º¨¼»I¬ ½V¾¿!ÀÁSÂÃwÄ)Å+Æ+ÇJțÉÁ$ÊËÂlÌÎÍÀÏÑÐÀ$¿“¿ÒÓÌÍdÔ^ÐÕ&ÔVÖ¿ É&ÍT¿+Å+Õ&ÁSÂà ךرÙrÚ!ÛÜ=ÝÞMßà&á âã‹ØÓÝ)ÚäÝ)áâÚ!åJÚ!æSç+èKÚ
â)éáê+ÞMßÜëßåKÜâÝà"Úëß Ý)áìŠíîIښØIï&áð&ñTò!؃âóƒÝèJÚëÝñÜ!àâôá&ñìZÜ!àIÝõ"íæݞá$ñTòšà&Ú!ñÜIâÝXórà&Üöïñ÷ø"á$ìùÜàÝ)èJðèJá"Ý)èMæ÷™×
Neutrálna selekcia:
Neutrálnou selekciou rozumieme taký typ selekcie, kedy nie je zvýhodnený rast
ÝñÜàâôá&ñdìrÜCàIÝáߏáðSâTÜCøI÷+äóç+èKç+øŒñÚ!æá&ìƒðèVàÜCàIÝàóûúÙlü ß áê+è“ÝñÜ!àâôá$ñìZÜ+àIÝ)á$ì âTáOýIþ!æåVÜ+ï&àÿì
ß$Ú!æÝ)á$ñ)á&ì× ™áï ±Ü Ø!ß$á$àQæÜTä ÞKç+øØ ýà"Ü!æáß ä;Ú ìZá$‹î àò ñá&ý+åVÞèJã ñÚ!æáìƒðèVàÜ+àÝà"ò áï
!"#$%'&)(+*%,-%
$/.
01.3245%.346879%:<;<=>?3
A@
=
$B%CB4ED3GFH$JI%H$DKLIM
%ONP!$2C
%/;QR,S,L2F40%T&VUW/;<%F<;Q7X
génom tohoto typu je gén Y -galaktozidázy, lac Z, a to z nasledujúcich dôvodov:
Z
expresiu Y [ I*
$?FC?.\;R]#68M^;FF4:) J_<*B%WFH$
I%H`ab!A*,
$7B%.2cF
d
štruktúra NH2 konca e -galaktozidázy nie je kritická pre aktivitu enzýmu. Tento koniec
f#gh8ifWi jklm no9prq$m
stumvwyxv:zm{xnm|ulx}kx}~Hnm€oBjzi
sn:i~€oBj klir~oXiJsx‚Ksx-lAiz/qƒl<oBsq$
}„
… x†f‡o,i~sxj+ˆit‰mHvwŠzm)~i
kxl/j'‹o|^Œ_q$m8€Ž}8f‡w:zRi|zRi
sn:i~€o,i)0qR„ ˆ„‘kl$oŽns|Xm’†m~“kx|Bw|Xo~s”
lxn•†x
d
q$i/ˆq$xxv|9mzq<okxŒiKq“~js|ixqo†xnWfbj“zvwp–~8zxvsxf—ql$x€J{ )
aktivita e ˜™ m|9m
sq$x}’o†
}wšx‘zq$Hnmb}m€{xnm~t'm
s–ˆ/j›}|9xh8œfWib} dvoch polypeptidov, z ktorých
jeden obsahuje prvých asi 60 aminokyselín od NH2 konca ( - peptid), a žŸ/ ¡¢¤£Ÿ¥B¦:§œ¥¨8©ª
sekvenciu od 50-tej aminokyseliny po COOH koniec « - galaktozidázy. Tento jav je známy
ako  -komplementácia fragmentov « ¬­®
§®
¯°$±²¥ž³
²J´'µ#¶#ª
¯°$±Ÿ/´·)¸´ ¨8¹B¸:®Aº<»:¼8ª-½ª§,ª
¯¼¥B ©®
princípe inaktivácie « -galaktozidázy kódujú len  fragment, nesú neúplný lac¾¿µÀ#±‘½/°¥_°$ª’Á
½<¯³
bunka E. coli obsahuje gén pre « -galaktozidázu, ktorý však neobsahuje  fragment (gén je
Â
Â
¥®½/°$± ©ªÃž ª§ªH°$±¸®
©¢· Ä M15 delécia). Ak je bunka transformovaná plazmidom, ktorý má
neporušený lac Z gén, kódujúci Å ÆÇ
ÆÈÉÊËÃÈ$ÌKÈÍÏÎÇLÐÑ
ÒÍÆÓ́ÆÔÍÊÕÖÍ×ØHÙÛÚXÕ:ÓÖÜÓÝ Þ ß ØàØ
ÖÈ$ÍáÉÊÌá
Õ:ˏÆÔÇâÈ0ÍãÇäÊ3ÍÑ
ÒÌÊá8ØuÖåÐ$ÆÍHÎÇÓÉBÕ Å peptidu a á
×æ:çÓÇ<Î#Ü8ØÐÈ<ÉèÆÔAÍÈ$Ç
éÓÕ kódovanej
ÒÍêÐÈÉ_È$Çë
Ð<ÖÍՁìÕ:ÓÖÍ՚ÓØ
$ý
<ù3ùïAïþï
Ä í/î9ïð
ñò/óõôö÷uøúùüûKýõþ‘ÿRï
ù
plazmidom obsahujúcim cudzorodý fragment DNA, ktorý spôsobuje porušenie lac Z génu,
6
!"$#&%'(*)+'*,-/.01,231(4)65)'7%1-89:!0,<;2>=@?40A1<,ABC1ED F GIH2KJL2,<*M(L:-M0N9)>OE)7%<P.2
Q
TR SU"VWYXZ\[^]A[_a`bdcefg<VWY]f Lac mutantov E. coli, ktoré sa s ]<hifjfXkjlZImonf<XgUqp ako
ifVWUW*[_Vr`bs`c[e[<tvuwl8V[Kx4[K`yCUqXz[`f$c3{ULele!W*f<]|]f}][`<W"f$z*fyKi~`j[€j<fyij<‚Clƒ` inaktivácii
„ -galaktozidázy (séria plazmidov pUC, pUR, fágov M13 a iehAyi…3VldelrZ‡†l!VW*[\Z‰ˆUŠ[‹nfXgŒq]AlrZIm
n[>]eb j[>W*[`†Keb njŽ V\f VX{VIWz\>Wfc X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- „ -D lxLl`<W*fn<Žzlef‚EULj<…~‹`<Wf<zIh‘4XAe<`A†e „ -galaktozidáza mení na produkt modrej farby. Ako
„ ’“”C•–”—<˜*™$šœ›LžšCŸ¡ ”¢™<£¤¥q¦”§I¨ª©T« ¬I›qšE™¢­™¢<Ÿ¯®K’ ° -D-tiogalaktopyranozid).
induktor tvorby
peptid.
-
L• ›˜*±­”‰˜Y²­±³ ”N´”! I˜"™µ ±•L±—¶›Š”³ ¦A±K—<˜*™$­r·›¸˜*™¹™!˜"™³˜YŸ¢<£º™š»”´‰£¼‡± ”—™½¢™š›˜*¥–¦»”¾v”‰¦À¿”—
¦•Š”< I˜»™ ˜›Á¢™$š›Â˜r¥q¦»<Ÿ¶¹Ã \±•4±K—´»<Ķ¹Å¦$±—<˜*™­r™<¦¾T”—™Æ£¦±›L±·w±‹Ç6”•Š±\¼‡¾6 ”dšEžE ”»±‹•4¥Y¿›Š”<ÈÉd±>£˜­\ž•L»”
\±C•Š±—¶›Š”í±—™·3ʛL»”C»E˜*™¦Ë ”³¦Ÿ<£¤E¥q¦A”º”\¼Ì¢­›8—•L™»™¦$”»<¥“Í»™<¦¾8¢­r¥Â˜*™$·»™ Iκ—<˜"™$­Ä¶¹k¼a±º·™$¤œ»Í
¼‡±»™!£A¶¹™Ï±>˜*±K“™<¦”>Îл”Ѧ¹™<»<Ä$¶¹Ò±>˜*±K—´»<Ķ¹Ò¢Ó”¶¹¾Ô»”¢­‰ÈÕ¢­r›½—•–™»™<¦”»¥º”·Ÿ•ŠžšŸ¾
Ç֔!¿¥Š¶¹3“Í»™<¦ÀÈ
celulázy a
Rekombinanty tvoria bezfarebné a základné vektory modré kolónie (blue and white colonies).
V
¢™<£¤› ¼a±·w±¦ ¶‰¦›4´E±»¥Ø˜*›L±¤Ì»±‰£˜­ž•L»!£º ‡±•Š±—¶›–£ÙÈ
×
¨Ù­r¥˜*™·»™ IÎ ÚvÛÜÞÝßà!ásâ ãäåæçæ*èéårêäëìä$írÝîKàçqïEëdèµå\îÃðíèrñ‡îœâáñ‡èÃòEóæ*äïEèóLèàä<áõôIóqáAäíè!åöœèàöçLäáA÷
ê<æ"ä$íøâïàçLêøùðíçúä$òEçLîKíèàû¸íèKêäë3üçýàîàEæà<þöãÕêóLäàä<â½ðäÿÒåâè>æ*óLäëÒðíçÃàë^÷ ðíçLîëäºàî
Pri identifikácii plazmidov, ktoré obsahujú lichenázový gén ( pSA3-lich) a GFP gén
(green fluorescence protein, plazmid pKK-gfp
agarovej platni.
ÜÙírûæ*äëàäå
€íèêäë^üçLàîà!æàßãäðóLîïEëdçŠÿ!áÐåÃóLçŠöãèàøïEä<âþë Ýßàäë êÿ!áñ
AöçŠë åà!æ\ßïá
íîEåIæóLçLàà$þ€ð äóå‡îöãîíç4ÿ}óLçŠöãèàîàõ îòµàîÔÝóqáê$ïKáA÷8ëòEèëèƒåæ*îàä<âç½ærç–èòµðäëäöä<á|àè‰áæíøóLàèrñ
zmiešanej -glukanázy (1,3-1,4- -D-glukan 4-glukanohydroláza, EC 3.2.1.73), ktorá rozkladá
selekcie. Platne na detekciu lichenázovej aktivity obsahujú okrem 25 g/ml chloramfenikolu
ô îKí\üçŠîöEèãä‹í*ä$ï‰æäê<á@äà<Ýäèíâèàè Congo red; 0,5 mg na ml 25 mM
ôäåôrø‰æ*äâ$ßãäÆæóýëwçqâAßCãäÃíräï‰æäê<á½ð<÷ î‹àèöKãøëwèÅçLàê<áü$äâ$î!#"$%&"('ÕëçLàæ ðírçÖóLîü$ä$íî‰æ)íràèrñ
aj 0,1% lichenanu. Bakteriálne kolónie vyrastené na selektívnej platni opatrne prelejeme s
primeraným objemom
teplote. Pozitívne bakteriálne kolónie, obsahujúce rekombinantný plazmid s lichenázovým
èKíIâèàäë
ðäïEîÿ<û+*
génom, vytvárajú po odstránení farbiaceho roztoku okrúhlu bezfarebnú zónu na sýto
Pozitívna selekcia:
ܪä$ïœçærûqâàî³åèóŠèêöçŠîÅíèêäë3üçLàîà!æ"äâÌñèÅâ-,(/.çLàä<áºïEîóLäòEèàø àî³çLàîê<æ*çqâøöç4çÖÝßà!áA÷Öê<æäíßãä
produkt je pre bunku toxický, alebo inaktiváciou ktorého sa fenotypicky prejaví dovtedy
7
01/2)35476(198-4(:;<8=>91@?:;A83B4/C
2):91DC)E FG:94H0IKJLINMHO PC)2QMH:R(PB4S:4S4(:/2QPTP512)PUVXW&JZY týmto typom vektorov
04!2)IQP544\[]C^M(3BMHU6(:_`8aMHU2Q1I
b&8bVc d8a4[eaR(MP5:4HU2P8-;(R(PfVhg_H:/Vi0I\M EcoRI restriktázu, napr. plazmid
pSCC31, ktorý je derivátom pBR322, z ktorého obsahuje replikón s ampicílinovou
rezistenciou a gén pre EcoRI restriktázu (ale nie metylázu) z pMBl.
UWM(j47FkU2l1-I)=mU1:@n)2)Po2pV2)d8:9MqCb: 2QM!2PrOHV([^M EcoRI
kedy v E x7y9z|{~}H€9ƒ‚N…„†(‡B(€(€ˆŠ‰‹NŒ!)‰ŽŠp‹N$}@‘s(€/
Plazmidový vektor sa izoluje z
WsM!2)b3B;HOHVaFt4(35MHT1vu674/C
2QM
[KnNPBMHw#8
podobe,
cudzorodej DNA. Po transformácii baktérie, vyrastú len rekombinanty tohto vektora, lebo
transformanty, ktoré obsahujú základný vektor sú rozštiepené restriktázou. Nevýhodou
„-H‰Qy-‹\“’•”––“—Z˜$™H‰9y
‚›šG(‡pœNBx(ž“‚^(‘Ÿs’y@ ¡y9¢9€ˆx(ž™K‚^]y9¢‘s( £ (€ˆs’y†(!¤‹N/¥)p‹¦‰QŒ$£ ™@‰/ly-‹\ ‘y§(€9y
’‹NS‰‡5y€y„(€¦Bh„Ž¡Ÿ§ ¦f¨9©Zªsh¢-Œ(£  EcoRI endonukleázy sú konštruované aj plazmidy pKG2,
pKGW a pKGS, v ‰Qy-‹)ˆx(ž|‚N‘y-§ €9«‰@‡fy-€9y9„-7¨¬p‹NH}‘s(€/pŽs£ H‰y€†((€«‰yž$£(€Ž‘¦•‰y€x((‘¦a’y
štiepení restriktázou BamHI, BglII, BclI, MboI, XhoII, AcyI, AhaII, HindIII, AsuII, ClaI,
HpaII, MspI, NarI, TaqI, PstI a ich izoschizomérov.
­¬®°¯p±N²5³µ´¶-· ¸o¹Q²º»¼³ ½\¾°¯B¾H¿À(»Á³Âºa¾H¿¹)¶ÃQ¶-³Ä½)ÅÇƾ$Ãȸº-É!¹p¼~º¼ÊË ²ºa®\ÌÅaÍ(¾Î¿¯5¶@»9¶9º-®(»¸¾%ƶ
represora
Ï Ð)ÑHÒÓ(ÔAÕÖl×-Ø
ÙÛÚ^܅Ý
Þaß(Ó/Ýà°×áãâä5ÓHå æsçè/á¤ésêëÓHÕÖ)çìaÑ(í(çBÓÇØNÜHâØNÜ/Ý\×-Ø\Óîì-Ü(è-çfÜïÕ
cI
intenzívnej
transkripcii z PL promótora, pod kontrolou ktorého je gén pre rezistenciu na tetracyklín.
ð ÜHÕ×æñçòëÓ(ë Ö
ótæôõHá%âØ\Ü!Ö)×iØNÑ/Ý
àöëÓ&âô@èÜÝ
tetracyklínom, ale transformanty obsahujúce len
pôvodný vektor nie.
÷ ×-å7çoÖøìë9Ü ÝNÜ(äBÜHÕß(ëù ì-ÜHÕÖQ×Ø
ó â úûýü(þ•ü$ÿ Ó â úsû<ü(þ ìóáõ øìaÓÚÞ â×å(ë9Ó!Ö ×-Õ9Ô õ°Ü
í¡ØN×@æ×åæ×ìÑýØNÜHå çpÝ
ÖQÜHë9í°çBÓ<ì-×@ß(çÝ
Ö)ØNÜ$â/Ö)×æóí(ø5ëá&Ú^Ü<ØNÜ7í(Ü/ÝNøìë-óæÒù°ë9×@ævÕá ÒùHë áaÔGÕÖ)×Ø
ÙtÕ@è/á$Ú^Ü
í(çoÖQä5çfì-×DÝàÛÕ streptomycínu (Sm). Pri klonovaní do génu Sm ÔýÕÖ)×Ø
Ù~Ú\Ü«Ý
Þaß Ó/Ý
à°×á ì-ÜHÕÖQ×ØNÓHÔ
S
nastáva jeho inaktivácia. Ak rekombinanty selektujeme v kmeni E. coli, ktorý nesie
Ô ß(ç5õ Ü ÓHՊâ×
Î
a Ý)Ö)ØNÜHâ/Öl×-æó-í°ø5ë9×@æÔ Ø\Ñ/Ý
àÛæôõHá
ä5Ü(ë
chromozómový gén SmR, rekombinanty budú SmR a nerekombinanty SmS
transformácii bunky vysejeme na pôdu s ampicilínom
rekombinantné klony.
â ×å(çoÖ)øìë×á ÝNÜ(äBÜHÕí(ç5×á Ý
ÞÇì-ÜHÕÖ)×Ø
ó~ìóáaõ øfìaÓÚÞ ce „killer“
÷
aktivitu ccd ÒùHë/áaÔ ë9ÓHâØKéZâ ê
ü¡Ô ÕÖ)×Ø
Ùiâ×áõ(ç Ú^Ü°æsÜSÓÚâØNçGâØNøâØNÓHìÜ&Òù°ë9×9ì-ÜÚ ñÓ(ë¡Õ-óaé ×@èØQ×9ñ9ëÙ
Posledným typom vektorov s
popis tohoto plazmidu pozri v kapitole 6.
÷ ×-å7çoÖøìë9Ó Ý\Ü°äBÜHÕí(çBÓÄÝNÓ ìó¡áõ/øìaÓµÓÚ â ØNç…Õä5×@ë9×9ì-Ó°ëø Òù(ë×ìԅÕÖl×ØNù Õ×æâäBÜ°æsÜ(ë/Öpá7Ú
Þ
v baktériách mutované gény, prípadne k è/á7Ú
ÞµÝNÜ(äBÜHÕÖQ×9ì-Ó!ÖQÜ ëÙ ÐQÜ(ë×Öpó¡â)ØNÜHå çÝ
ÖQÜ$ëí(çBÓ ì-×@ß(ç
ÓHë Öçñç5×ÖQçÕÑ(æÔDà°ÓHõ(ÕÙæ Õ×ì×@æ Óâ×è@é é tomto prípade však z æsÜ!ÖQ×èç5íHÕù×KÓ(èçlÝNÕÓçfèÜ<ÝÕôØ
o ÓHëÓ(äÙåHásØNÜ$Õ×@æñçòëÓ(ë ÖQ×9ì-Ô@Ó
ÚLÕÜ <ÚNÜ`Ý)Þaß Ó/ÝNëÜ`ÝQâ×HÚNÜ(ëÑ`Ý\×<ÝNÜ(äBÜHÕí(ç5×á¤é
8
V podstate rovnaké metódy selekcie rekombinantov ako pre plazmidové vektory
!"$#%'&()*+,&
-.*0/%132'045
fágové M13 vektory. Odlišné sú metódy selekcie
rekombinantov v cháronových vektoroch.
9
Obr. 8.1. Postup pri selekcii bakteriálnych klonov s rekombinantným plazmidom na
princípe dvoch antibiotických markerov (negatívna selekcia).
10
Analýza rekombinantných klonov:
687:9<;(=?>
@'A(B0@B'>
CB
ADB'E9?=<;GFH'=IA(F@BJ>LKM?H7HON
HPQR
rekombinantnej plazmidovej DNA. V
@9?B'H'BS
TUF
CBON<SA(V'FH'M3F
BKXW(7ROY
C'AZ=[C7V'F\^]F)@'9?BJHBS07:HP`_<A(7a>!FHONcbed%fgT(F"V'F_DM?H'B0S07HP'\
W
N,7h=iS'j'@B'H'7kl>mM?HMnM?EBJ9poQMpYqCJ937E>rM3V'BSFDTsbtdrfuE
vybraných klonov a pomocou elektroforézy
W
N,7H'BSMkvT(FDTwSFxU@ByWzk{|}BLA,B0E~;zN
M?FCFH'=M?EBJ9?BS7H'FDT}bed%fA$FOWzN
ADM[@yhHP'>€FHEP>%BJ>!\JCB'>%BQBY@ON‚BA(ƒRB
sme klonovali, vznikne fragment vektorovej DNA a klonovaný fragment.
K
7H'79„PEF
A(F@B'>LKM„H7HN
HPQR
rekombinantnej DNA s
k
@9?B'H'BS
>%B']H'B
B0EH'7hFHBY†W(B'H'V'BY€‡
CBY ]M…k
7DT
N,FQRH'M?@Y
probe), ktorej sekvencia je komplementárna
R'xˆ7V'7H'ƒ>LYX‰z@9?B'H'BS7Hƒ>8Y‹ŠŒW$F@Y‹bed%f%{|ŽBME:BJ9?oQM?MLC9n7E>%M3V'BSXFDTbedrfE
klonov sa táto štiepi s
RjK'A(M3V'M„E:oOQM3F
A(FWzN
ADM[@h:HP>!M)FH~E:P>!7>rM7S'EHJM?@HOY'N,ƒ_<A(7a>
rekombinantných
enty DNA sa rozdelia
agarózovou elektroforézou. Potom sa DNA prenesie z agarózy na nitrocelulózovú, alebo
nylonovú membránu (Southern transfer, Southern blotting‘
\’@V'F“W(75HFQR'o”RjKA(MnV'M?EBS7k•W$B
sondou . Ireverzibilné naviazanie DNA na membránu sa dosahuje vysušením filtra pri teplote
80o–
793FKB"C'—yW(BKFH'=3>™˜Lš†]OM37A$F:H'M37{›fe@”V'—T(V'F@
hybridizácii sondy k niektorému fragmentu
C9?7E>rM3V'BSFDTLbed!fc\EH'7>!F:HoN
B'\^]FrN,FHON‚B5_<A(7a>rFHN%BKyW$7ROYTGFqRxˆ7V'7:HP0‰z@9?BJH'BS7HPœŠW$F@žbtdrf
(Obr. 8.2.).
Ÿ FQR'H'M?@7gRjKA(M3V0M?EoQM3F™WG7gCBY]=S07 7DT¡C'AZM"S'j'Rxˆ7V'oS07HJ="YA(hM…N,ƒR'B¢@'9pB0HY£S£aƒHBS0F$T
@'H'M?]H'M3Q:M3\rC'A(M?hB>
CBJhFUNœA(F@B0>LKM?H7HON
HPQRg@9?B'H'BSu@'H'M?]HJM3QF¤‡‚K07@N,FA(M?o9?HF@BJ9?¥'H'M3F¦SuC'A(=C7V'F
C9?7E>rM3V'BSFDT5@H'M?]H'MnQF\r79?FKBgC9?7@'j§S C'AZ=?C7V'F_
o¨aBSXFzT”@H'M?]H'MnQF
‘
>%—']FV'ByW(7RBS07©k¤RBJVHBN<j
rádovo 104-108. Táto technika sa nazýva hybridizácia v kolónii, resp. v plaku (colony
hybridization, plaque hybridization, Obr. 8.3.).
fe@B
W(B'H'VOY
TGF
>%B']H'ƒ
@B'>LC9nF>!FHON,oA,H'7c7OWDCB'­g@
rádioaktívne alebo v
EH7hFH'MnFLWDCBh=S7¦S
za
35
S v
CBY]M…kªTGFV0HBS93o@H'BSŠ
h7OW<N
MTGFV'H'ƒR'BrE
btdrf
793FKB
«¬drfc\I@ON‚B0A$o
T(F
A(F©k:7EQBS%@'9?B'H'BS7HFDT}bedrf%{®LjKAZM3V'M?E7hHƒmW(B'H'VjWzŠ
CB¯W,9nFV0HBJ>°h7OW$FSFxˆ>rM±h7OW
N,BžM¬H'FA(oV0M?B7@N,=SH'FEH'7hFH'ƒ{}«eoV0M?B7@N,=SH'F
substitúcii fosforu za rádioaktívny izotop
32
P alebo 33P, prípadne kyslíka
HOY@'93FBON
MpV'BJQR5CBY]M…N
PQR”H'7C'A(=C'A(7S~Y‹W(B'H'Vjy{b8F©N,F@QM?7CB'EM…N,=pSHFR'B•W(MaJHo9pY‹W$7CBON
B'>
YŒW,@Y'N
Bh­OYTGFCB0>8BJQBY`7©Y~N
BA(oVMpB0a'A(7_
M3F\^@N
B'A(oqW,CBJh¨=…SX7²S
odstránení nenaviazanej sondy z
N,B'>%\^]FCB³Y@B0HhFH'=’Rj~K'A(M3V0M?E~oQM3F)7
>!F>LKA(oHj‹W(7³H7N<ŠN
B.C'B'9?B0]=´_
BN‚B0a~A(7_
MnQ¨@0P`_zM39n>%\eH'7"@N,BADB'>
A(oV0M?B7@N
=SH'F°]Mn7¨A(FH'M3FµS'jNzS0B0AD=¶hM3FA(H'F·;,@0SA(Hj
H'7¸>rM3FOW
N,7QR'\¤@V'F¸V'By;(9?B
d!FA(oV'M?B7@N
=SH'F™EH'7hFH'MnF
¹º»¼3º½º¹'¾n¿
>%B']OHB¸VByWDM37R'HOY'k
@
hybridizácii.
ÀÁ(¼…Ã
ÄÅÆÇ3È©Ã,É'ʏËz̨½¹'ºÂ¼3ÍÊJΨ϶¹'º
¹ÀÊJÇ3ÍÉÃ
¼?ÐÑ"ÒÉÀÓ¼…Ã,ԐÒ'ÁZ¼¬Ò'ÁZ¾[Ò'Á(º©»XͳÕ$É0¹ÐÑXÖv×w¼?Í©Ã,É5̨½¹'ºÂ¨Ê0Ñγ¿8Ø0ÓÀ”Ù'Ñ~Ú"ÛDÇÀXÉ'Á(ÍOÕDÊÀÜzÝXÅÍ)Ç3È©Ã
Ê'ÑލÊÂÉÁ(Ô
¿%É'Ó¹'ɜÐ'Í©Ã,Íß'É»ºˆÚ¹'ºr½:ÈÊJÇ3ºÐ'́Û
ÇpÀXÉ'Á(ÍOÕ$Å͹'¼3ÍÞ^ºÇ?ÍÙɔ¿%ºDÜDÝ5»Ç3ºÕzÃ
¹'ÉyÕzÃ
¼¬º¹ÃD¼ßÔ¹'¹Ñ0Å:ƜÐ'Í©Ã,ͨÁZ¿%¼?¹º¹OÃ,É»
ËDÐ'¼ßÉà¼ßXÍ:¹'¾?¹~Ï(ÞsÒ'Á(¾ÒºÐ'¹'Í5Õ$ºq»'Ñ'½¹ºÂ©ÀÜ$ÝáºÛz¼?¹¼…Ã,ÉÀ‹Ê
11
iným látkam (napr. biotín k streptavidínu).
â8ã©ä,ãåæç3è¦é$è•êëOä
ë'ìîíŒé,åí'ä,ëJï¨ð'ñmêë'ì%ëæëígê'òDñ3é(ópíŒô(ðãDõ"ê'ò(ëOä
ç?ó3ö©ä
å'÷¶ø‚ù¶ê'ò(ñêXèú'ã“ûç?ëäDñ?ðOí€êë'ì%ëJæëí
íò(ïç…ä
üì°ãð'ýü'ì%ëì¸øDèó?åXèónç3æåö³þ
ëyé(þ
è©ä,öý:èÿ
streptavidínu) konjugovanej s
peroxidáza), ktorý po
ê'ò(ç?ú'èð'ñ¤ôDêãæç?þDç3æå'ë ézí'ûyé
ä
ò(ö©ä<íù'÷Oä<ù0ë0ò(ñ¡þ
èò(ãûðü¸ê'ò(ëúOíåä€èó3ãûë·ê'ò,ëúOíåOä¤ù'÷~ýð'èï©íõXæç¶é(è
chemiluminiscenciou.
ŽëJúì%ç3ãðå'÷ê'ò(ã÷û'ò(ç3ú'ç„ý:öOæç…í
é¸íò(ïëùèð
÷~ûòZç3ú'ç?ýèïð'ë)ò,ë0ýˆä
ë'åíXÿ
^èó?ãDõ’ä,ãêó?ëä
ëí”è
ëûXé(è'ëJì
ïèéDë'ì÷û'ò(ç3ú'ç„ý
þ
ë'ò(ì%èìrç3úOí
è
iónovou silou
ácie. Zmenou týchto podmienok je
ì%ëðLú'ëyé(ç?è'ðOí:ÿ:ãmé(ë'ð'ú'è÷~û'ò(ç3ú0ç?ýíõGãLèDõ^ê'ò(çŒðãê'ó?ðãZõ'ëJì8ëJóJç?ç?ÿ›ïë³é(è ù'÷íOñùXèLê'ò(ç}é(ë'ð'ú'öæ'ÿ
ç?ðërê'òDñûíýðëë0òè¨ð'çýì8í²èó?ãûëðOíŽëíç…äDçpã÷~û'ò(ç3ú0ç?ýèïðüæ%ä,ãæð'ñ?å
ktoré pochádzajú z
õGã”êëJúì%ç3ãðã:ð“ú'ëyézä<íê'ðë¯é !#"$&%'()+*-,'&%./1023"456"$7&8:9;<0=>";9?<"&%'@!BAC,D8(!E2FG?H!E
%9;JIKJ%89%.L4MN=G7!02%.POQ%)SR%TU/VE2%6"W?XAN,Y4!EFG?L"N%'@!Z"(%2[$,[F\028&9%@]^4J'_`9Y0%T/a,A
7Fb,I;8F%8,AY"N,;8,%cFb,)da9;_C;YAN,'%9e9/VF%;&("f,IgF%9e/V5E2,U7(?P;hJ'89%TP8Fb9ci,M./jF
;'h%/VFkAf,+4@[MN,7%Q"(%2[$,[$FG0289?l%Fb,;_C;9Im[$,M$%9[=G8%(cn"N5%'e"Nj0i&n_`9'%,%=g/o',O,%,MNTcFb,
genetického kódu. Pri výbere syntetického oligonukleotidu ako sondy, sa vyberajú také úseky
",;&8&,%cFb,kp;[q&MQr4MN,8&9E2%,s76"9n2!A]t[$9;Qs9/VF%;(6"N,IbFu%(k;[MNQ3"]t;h'89%QsI,%vAf,'%./
prípadne dvoma kodónmi (metionín, tryptofán, fenylalanín, tyrozín, histidín).
w 9Igx!y/VE%"? z{V|N}V~z{2€m€b}‚ƒ…„j†ˆ‡‰z‹Š$zŒŽ‘~}‚€’€b‚‰“‚ƒ…„j†LŠN‡”V•2}j–2—qŠ$‰‡˜
~zUŠ}™}‰$—KšŒ}|›€–2zJ™K“‚€g€~z2‡zš‡Œ}|B”œ„j†Ÿž‰z N“v–š™K“¡˜sš
z ¢“ŒzJ‚£}{‰‡ Žz&Œ2zšj”•&2}¤>š&z €m˜…~zJJŠ$‡-Œ2¥¦i‡@ŠW˜
§Ÿ¨ Œzš¥o‰JŒ€2Œ€b‚{t”VzŒz3~ N€G~ N‡š€G˜X‡|›Š©~z{2€m—”
niektorých špecializovaných
–šª}«~ N}@ŠN—GšŒ}£z¬š&}‰$z N‡žj‰2z W­
{”Vz®@{i|f}¯}«~ N}@ŠN€G{°‰™zŒzš‡Œ ¨ £z±¢ ¨ Œ@{³²´f |`H>šz Wµ¶{°~ —>ŠN™G{·¡NŒ ¨ £z±~ z@$}¸—uŒ2{¹Uš £zŠ€º$}»Š‰}|
µ&‡‰$} N€“™Œ}|¼µ{Œ‰}@½ —gŠN™G{¡NŒ­V‰J™KzJŒj”Vz2Œzj~z@z”3š¢ ¨ Œzš}|‰Œ€u2Œ€b‚€·Œ“|`Š˜ª~z”Vz‚z{¾~ $z@€™b“‰&Ž
{$z¿~ $z@$}—Œ@{žŸ‡™K}iµ&zÀšŽ2{@€º—”°’g{Œ‰¦Œ­‚£›š™b‡ŠWŒz6ŠW—l~ z@$}—Œzšžl‰z ¨ š–Œ€‰J™b€V}«~ N}@ŠN€Kz{
k tom
£»`‡J‡Œ­&‚£Á¢ ¨ Œzš&žÂŒ‡~ `ŠN™K}zš&‡Œ—g” }Œ–­”Vzš}|Ǹ‰€Kš€mŽž‰}S|f}›}`$}‰‚€b‡›”VzŒ“H~zJ”Vz‚z{
¡$~}‚€g“™ŒŽ‚£#}$}‰¦Œ­&‚£s~•J6ŸÄ¼‡‰­”$ztŠ~•6Šzµz”
µ&zJ™€ª¥ÅŠ$~}@¡NŒ}¿šŽ£»`‡“š‡Œ ¨ ‰™z&ŒŽ&žj‰z ¨
niesli rekombinantnú DNA s génmi pre amylázu, celulázu, proteázu, nukleázu, agarázu
”VŒz£ ¨ €Œ ¨ ‘ƒ}$}‰‚€‡j|f}j|f}Œz@{‚£“ځ$}Žž+‰}Æv|f}‹ŠŽŒ@$}€–2zš‡Œ“õ€b}™‰zš€Œ‡D~ NzJ@{‰zš‡¸Œ“
a
z&~‡i¦ŒzJ”Z~ N—G~‡}D”ª{·ŠN—g”a}‹Š$}ŒŽ¿µ¶{6Œ€}¸‰¿Œ‡|N~ š¿ Nz– W{·¡$€G˜2ž+Œ‡~ N—G‰J™b‡›š
z bunky von, v
parách
chloroformu alebo indukciou teplotne temperovaných fágov.
12
Obr. 8.2. Southern blotting a hybridizácia. Fragmentovaná DNA (rekombinantná
plazmidová DNA pri analýze rekombinantov, alebo napr. genómová DNA pri analýze
ÇÈNÉmÊËÌVÍË6ÎWÊ$ÏpÐÈÑϺÊ$ÒÓ<ÎNÒ¸Ô&Õ&ÒÍÖÏgÒ3Õ genóme) sa po denaturácii v géli, prenesie na
ÌaÒÌ×ÈØÍ2ÐZÙUÍØÎNÚgÒiÛ&ÍÒÜÎNÙeÝÞ¶×ÈNÏbÛ&ÏßÐiÓfÒàÎNËáßÍÙÑiÒÍËÐâÛÒÍÙÊ>ÐÈNËÕÙÍËÐãÎË&ÍÛËÐä
ÙÐÊqË&ÈNØiÛÏË&çÈÙèWÏbÏUÎÙ¯ÐÈNÑɬÕ&ÒéCÔË6ÎWêãÙëÇËÑÒÊìÔË̪ÇJÚbÒÌaÒÍ@Ê$ØÈÍÞ&ÖÝ
åæË
è>ÈÙçJÌaÒÍ@Ê$ËÕ°í…îðïVä
åñËJÛ¶Ë×ÍòÌLÎÇó6ÎNË×ËÌUÌË&ô2Í˾ÙÍÙÚGÞß2ËÕÙ`êVÙÓöõîjïo÷WÍÙÇÈ`äJß2ÏgÎê2ËÕÙÍÏbÒÇÈNÉmÊ$ËÌVÍË6ÎWÊÏ6ÐÈNÑÏmÊ$ÒÓ
mRNA v ÐÈNÑÏmÊ$Ë&Ì
ÊÔÙÍÏGÕÒø¿ÇÈNÏÑËJÌ
ÇÈNÒÍË6Λõùîjï
Northern blotting.
13
ß gélu na membránu sa nazýva
ú+ûü`ýÃþýºÿ6ý
!"#%$!&
'")(+*,"-(.
/
01ûü
2$3
"
kolónii. Bakteriálne kolónie (klony) sa prenesú z agarovej platne na nitrocelulózovú, alebo
34
%& #ü657ü,89:#ü;
=<>& ?(@)(
nylonovú membránu. Potom sa bunky lyzujú v
%A7ü-%
BDCEVý FGH
\ü %")ü $!
Gû 4>&I%"
%$J8BDCEK'L&M3&ªûü N5-O#ü P$!<Q5R
k
9S&ü Tû 5%!(UVW>UXBDCYEK5-%"'3
Zý
dochádza k hybridizácii v tých klonoch
[\]Q^W_;`ab4c6dWegfP^Weghjiejkjc6l4^Wm'noMpqb=n3ilmrbst>ujkja%bv)b7cmrb4sXsLn!mc6lshgejmXrwjsas>c>`-^ab2n3mrb4s
xDyz{|)}Z~€+y%€'‚ƒ€!„~>…y!†%‡ˆŠ‰S‹ŒŽ67‘!“’”‘!–•—˜z™šy%€,‡›œXˆX~,{žƒ|Ÿ|)ƒ‡ ƒ‡€'†W¡¢)£-™¥¤) yW¦3}§}¦~
sekvencie dvojvláknovej DNA a štiepia DNA v oboch vláknach, za vzniku definovaných
§7|¢¨>œMy€{žƒ,¡jxDyz{|)}Z~€Ry€‚ƒ€„~…y†%‡ˆM~¢A{ž¢…=ˆ'‡%„W£-™©¤{ž}y% y€}yOªD«¬­¡®¤}€ƒ,„:¯y%‡Q ƒ°!}¢‚¢%¡}y%~:€¢
y%€'y%|)¨}Z„±G²³œX€ƒ´,›¦´µ|-yz{|}Z~,{ž†%‡X£¶yN ƒ…=ƒ´'¢·¤{)}=y% >€'y´ƒ¸œM}4y!z{ž¢N |yzž€y¹‚y§}€ƒ¡¢3€'†º¡‡!´»¢‚ƒ>œ¼€¢
½¾¿À'¾¿Á'ÂAÃÄÁ!ŸƶÇÈÃÇ3Á'ÉÊ=˱̱ÁÄ!ÉÍÂÎ,¿!ĺÆ-Ä¿ÃÏÐÄ)ÑÁÇÒÃÁ!ÅÓ½)ÊqÄÔÇWÕ¾ÖÁÊÇ%Ⱦ×ØȾNÁËÈÔǾ,ÓÊξ'ÃÖ¾>ÎNÁÇ)Ñ̔Ã
ostatných nastáva hydrolýza väzby v nedefinovanej vzdialenosti od rozpoznávanej sekvencie.
Ù Ç ÆÓ½)ÊZÈÐ3Á'ÚÇ%ÁξÁËÈÔÇ!Â%¿Ï¼¾,ÕÏÐ!Ä)ÑÁÇÛÃÏÜJÄÎËWÑ-Å¼Ý·Þ 2+ ióny, prípadne podobné dvojmocné
ÈÄAÓÊ=ßÁ,ÏàáÊÇ%È,Ӟ¾½-ÚY¿V½ÇÆ7Ó½)ÊâÈÐ3Á,ãÉ͹ÇÁ,¿ãäX¾ÃNÃÏ'ÜJÄÎËÑ)Åå”À½)æZÀÄÎÁǺÆşÆÓÊ2äQËÔ¾ÃÄ3Á'ÚèçRéëêìÄ3Ô=ÇWÕ¾+íî
adenozylmetionínom. Štiepenie prebieha na 5´ strane väzby fosfát-deoxyribóza za vzniku
fragmentov s 5´ fosforylovými a 3´ hydroxylovými koncami. V prírode sa tieto enzýmy
ÃÏÆ)ÈÏÓ7ËWÑ)Å Æ)À½Ç%ÃÂÎ,¿JÄ3Á'ÚïäX¾>ÎÊð)ÊÈÄÐÁ,ãäÊñäMÇAÓÏÔòÓ½ÄÁÆð)Ç%½-Â%¿!ÄäÊÆ rovnakou špecificitou a
ÃÏ!ÓÃÂ%½Ä)Ñ)ŠӞÄ%È ½Ç!ÆSÓ½žÊZÈÐÁ¾îäX¾ÎÊð)ÊÈÄÐÁ,ã Æ)ÏÆӞÚäVàóéôÊÇӞ¾ Æ)Ï>ÆӞÚäHÏ Æ-Ä Á'Ä'õÔʏà äXÁ¾Í,ãÉÍ
À½¾ÈĽÏ'¾'ÓÊÉÈãÉ3Í äÊȽ¾¾,½)ÞÄ%ÁÊâ¿äH¾>ÉÍ Ä À½ÇÎ,À¾ÈÔÄΠÆÄ Ü!Ç ÆÅ ÍÔÄ%ÃÁ,ãä ¾,Õ½Ä%ÁÁ,ãä
14
öM÷øùúûüý!öXþ>ö ÿúž÷üû
øùÿûü÷þüþö ü2ûž÷øüö÷ !#"%$ü&6ö -÷')ü()ûþ)*
öX)þ $+ü ž+ü ú,û øù'-.'!0/öXþ©úXþ'ÿ21-ú3-÷4'!ü()ûøù:÷û$þû4))÷%ýöXþ
5!ûü6gý,7#'úúûü÷8$÷9üûþ
úûøù
#2ú >öM÷4
û žþ :<;>= úPü4øùYû '43÷ $,û "Vúû9ú ('9ý Ò@ú ?þ þ 5ü žú Xý,23ú $8?-@÷ )/%ûþ )/PöMú3ûü ?%6øü4A÷ B 4
÷ ')(ü %3û /P÷%û $þ4û )),÷ %ý '!"ÒûCú 10?þ )5,7(úû-÷ 1D74öü ÷3ûJý öMúöMü molekulárno biologických
ú%ÿ
þ ú FE)6ü ø.ù G:Hþ $DúºüøH
ù ,÷ IJ)/ºöXû'
þ 5'#K
þ 0?÷øüú 4üý!þ úû øL
ù ž(ü ü4÷Nö M ú O-ú Lý!ù Iú $þ>ö û'úºüøù
vlastnosti, predstavujú zaujímavý model pre izoláciu a charakterizáciu enzýmov.
÷ )ü û ñ÷%û$þû4))÷,%ýP'!"Q)R%û÷ñø,žþ
?úýöMúžüøSþú4üý!þúû/3MTžú !5 ÷?ö
B 4' (% /
krokom pri ich izolácii je rozbitie bakteriálnych buniek. Toto sa realizuje pomocou
ú%ý þ øùML?-7U?6ú$û÷ üûø3ùV$÷%ý!üû4ž÷Cžþ
žþOHWRýùIú$þö ûú¥øü&-ü(þO'!XY÷4')ü(0%ýZþü
%& 2) zvýšenej teplote sa bunky dezintegrujú pri teplote 0 [ C. Zvyšky bunkových stien sa potom
þ)$'#%ûüú øW÷3û,ü+))!øüþ\?)ü]%'þ
øù þ40úø%ù%L;Mú4'÷$431!"jøüö -þ
þö 1÷¼þ)$'!^%û÷ûü÷
û,)÷þ øù
%'÷7û)M_þ/Lÿ`?÷)5!úüa?üqøùú-úž÷)üý,øüüq÷3ûý'öXþ
÷-1RúžüRüb!%);ú>ž÷%û,žþc"%÷
dCegf)hi)jk(l)efmknel
h
oqprsrnr6tuvwoxhmygz3m{j,e-|!}~s,i)ou6thl)yco.dCturs
€F‚Oƒ…„‡†~fhuRtxu6ysrˆNksv‰eutŠ
h
streptomycín sulfát). Hrubý bunkový extrakt získaný po odstránení nukleových kyselín má
pe,d!x0hom{Jx‹nh.d#x0eŒxFhp2stl%dho}Yeoxr(l)r&x#i%v>x0eoj9tT|tŽˆ8hjs)yntx0thl)eD‘Žfmk&x0hˆ8sh.d!‘’mt4d!xm0r(o)ps“)”•
endonukleáz priamo v – hˆ—a˜<t4d!xmr(o)psyLtsnhs4i)o)u6t{zKlO™CeoKx#l
h
m rReql
hl)š3p4™rs)tLfm›kUf)enhlu6ts
ˆNr+sh
mr&xs,}qped!‘ œA.žAŸ) ¡¢
£¤H¥¦ §0¨©ž ¡‹ª-«8¨ž¨-¬­ž)¨2®K¯D°H±³²ž´¨­¬¨c«µ ®,ž¶·¨§0¨¸) ¡)²D¹H´£¤‹²Ÿ§´(¡)´&§#
priamo v bunkových extraktoch. Ak je hladina aktivít v hrubom bunkovom extrakte nízka,
§0¨ž,§ »º²S«8¼®,¨S½,²Ÿ) ž£¨ž,§¦ ¡
²¹P¥) «8 )£ \¥¦0©·²¡Ÿ\¾G¿ÁÀ‡ÂÃÃÃÄ]Ÿ4§F ¦!¢Å½3¦Æ®,²Çœ)´6¨ÈŸ) ¡)´žÉ.Ê
Ë ÉA½¦CÆ®A²ž)¶qœ)´6¨ÈŸ) ¡)´žÉ̺²Í¥) §F «\¦ ½¥Oº#§´²¡
malom objeme vhodného tlmivého roztoku a
º§0²ž ¡3¬Î¨]º²Ï²2Ÿ§´R¡)´b§0²§0²Ÿ§ Ž½9²¤4Oº§0¨ž¶¤ Ð¥¦¨¥)²2¦ÆŒ§#Ê<ÑÒ´¨D§0 Ž¥¦¨¥)²¦ÆJ§#ɒӲº!§F Ÿ¦ÆJ§¥ .º#§0²Ó2¬!Ô՞²
·¼Ÿ)²½¥¦-©b§ «>ž Öº§´O¦¨4º!§¦´(Ÿ)Ӟ¨C¬<¨ž· ž4)Ÿ)Ȩ3ƽɴמ²Ø¬Î¨!¬Ù¥¦¨·œ)¨®,ž,ÔÚ£¤²2¦²Ÿ§0¨¦´(½,Æ3£9´(Ê Ë ½¤)ÛD²3· «Üž²
§F Ä>®,¨H¬¨·ž §È´(¡%¶]¦¨4º§¦-´(Ÿ)Ӟ¶¨ž· ž4)Ÿ)Ȩ3ƽÉZºÎ²ŽÈ©#Ý´6²]¡ ¥) ®,´²3·²3¡Ÿ)Æ,£9¤Ìž²Þ½,È ®9¨9ž´6¨Þ¦¨²Ÿ)Ӟ¶¤ §È«ß´(¡%¶¤ Ϧ0 ½D§ Ÿª!¥à8ĉŸ ž£¨ž,§¦Æ£´6²L²Í·¦)¤ÏŸ)²§´áž ¡±Ä׬ΨL¥) 4§¦¨œž¶T§0¨4º§ ¡)²¹²Ÿ§´(¡)´&§#Þ§#¢£¤,§0 ¥¦¨2¥)²¦Æ§F ¡~¡Ï¦0¼½žÉ)£¤~¦¨²Ÿ)Ӟ¢
£¤§0È«ß´(¡¢
£¤K¦ ½D§ Ÿ )£¤Ïª#¡Þ£¡)´6Ó¨ž©â¥) )®,´ ¬Î¨«N¨Kº²·4¦¨3²Ÿ)Ӟ¢)£¤
tlmivých roztokov L, M a H firmy Boehringer Mannheim, SRN). V prípade potreby sa potom
¦¨,º!§¦-´(Ÿ)Ӟ¶
¨ž· ž4)Ÿ)È6¨Æ½É
ㅲÈ6¨C¬
¥)¦›´ä-´Ÿ3¬-Ô
¥) «8 £3 
Ÿ Èá
ž ¡
¨-¬
£¤¦C «8²§0 ¸¦²ä´¨
ª!¥¦¨
¥) )·¦- œž Öº§´¥) ½3¦-´ž²¥¦DÊAÑå)¦0æ çâç@èéê#ëbì×í2îîï,ðJë
Zák ê6çñòó)ôQçõçö!÷0éèøùJ÷úûñüò
ó)ôýèøéè)éôÿþøü)çøçè÷0û2ø›ü,ù9üü…øCû4ö!÷øü(è)õòó‹ûòñéò
)è)ê6ûù
úÎû)øõ3û9òü6ûÿøCéþé3òù%çòû-úQöûè)ûòü6ûëaù÷Fé
öCç)øõ2úûPòç,ùè)ê6çñû
ûJè)éÖö÷ü#øçôNûò4÷0é
4òüè)ç-úü!!÷0üûþ%û9ò"ô#%$'&Sö().ö÷øù÷éÏöCé*3òùô8é~ò
)è)êûé÷üñé
éÞöCûè)ûòüéë+$Nç-úõçö!÷0û!ú,ü6û
þ)é-".)
çò/0#1$2Z
& ö(O) ö!÷øùJ÷4‹
3 ö(
úÎûñòç2è5 ù) é/6#%$'&27 8 9#%$6&;-: é<) ûJ è)é.ö!÷ü>=@? ïBAC<) þðCìDFEGH#%$6&
(39936 bp), Adenovirus2-DNA (35937 bp), SV40 (5243 bp), I X174 (5386 bp), M13MP18-
15
RF (replicative form, 7249 bp), ako aj plazmidové DNA: pBR322 (4361 bp), pBR328 (4907
JKLNMOKPRQ0STU(VWXTBWYJKLNMZK[\Q^]_QRST`aU(`V``bJKL,cedfghijkmlNn
gpoplq.hrjkmKlNst(qvuxwygNimKslzs{j|{i}(~
s €‚ƒp„…‡†'„\ˆ‰YŠ‹Œ†Ž‘€N’
“(”p€z„.•–‹—˜’™‹š‹ˆ•X…v’ŒŠ›%œe“(”p•€NŒž”\ŸN’* ’
¡,†'„_€N¢“z’
£N‹Œ‚Ÿ¤€N’
“N‹Œ
lokalizácia niektorých, minimálne dvoch miest, na plazmidových substrátoch. Rozpoznávaná
“‚’• ’‹„v¥“NZ”p†ˆ€N–¦Š porovnania sekvencií v okolí lokalizovaných miest.
§
„‡’¡,X†  „v–’‹„v¨ŸN’©„‡ŠX…‡ ª«¬–™„v
“p”zX–‹’©€N•”z’€N„.Š ª¬€N’
“p”p€N„.•–‹­®’‹š‹
ˆ•…v’ŒŠ
z •†Ž’¯ Selenomonas ruminantium °±² ‘³´
²µ›Z¶>
ˆ‰·„ Ÿ¸’†2’¹€º„»”z† †ŽXš„‡ƒ„‡•Œ„.ˆ¼†2’”z½Xš

ˆ”H€z '¾¿ €ž“z•—21À_‹Œ”FÁ°Â³
ÃNĕ
”H€NŒeˆ†R‰¯
ˆ·Ÿ¸’O€p—….ˆ<„.Š™X…‡Œ„ňƀ‚’
“(”p€„•–™‹—Ç’‹š‹
ˆ•…v’ŒŠŽŸ
z malých objemov bakteriálnych kultúr.
ÈNÉÊËxÌÍ·ώÐ,ÑÒÓÅÐ,·ÔÕÖÑ.×_ÑÖØÊÖÙÔËÑÌÉ4Ú2É ÛÜ_Ý Þ ßXàZáâ·ãâäßå_ßäæç^è,éå_êxäæäë‡êéå2ì
6 000g, 4 C) a premyjeme ich v !#"%$
'&)(*+,"-/.10234457698;:=<>-?A@B$CED3
mM F GIHAJ,KILMN/OP!JQOM,RPS'T=UWVAX*JYO%L/Z [ \]_^*`badcea,f*gihj`kaml*\nf*c/o`\nefp`/qae]crqads t C v u vwx
y z/{|/}~€*‚/ƒ{„ƒ…†|‡ˆ{i‰Q†Š‹†ŒŽŠAƒ*|‘’‘}“W”|•–r˜—%Š‹‘kŒ•–r™‚=—%}/{š“›‚,z‘ ‰†Š‹†œ‘–
sonifikáciou 6 krát 30 sekúnd s minútovými prestávkami na chladenie v ž=“‡†ŸŠA†i‡/‚ˆ‘
í
bakteriálne bunky S. ruminantium
îÇïðòñŽó>ôõöô÷øZùúóüû4ýþÿ÷ô
ûpþ úú·øž÷ñ2÷
ð ñ ô
ýû
jednotlivými cyklami
¡
v ƒ*|‘’‘}“i”j|r!Š
zvyšky bakteriálnych stien odstránime centrifugáciou (10 minút, 12 000g, 0 C)
tlmivom roztoku
k supernatantu pridáme 1/10 objemu 20% streptomycín sulfátu
¡
po 30 minútovej inkubácii pri 0 C odstránime zrazeninu nukleových kyselín
¡
centrifugáciou (10 minút, 12 000g, 0 C)
k supernatantu pridáme 40% PEG 6 000 v
Û
získaný pelet raz krátko premyjeme fosfátovým tlmivým roztokom (20 mM NaPi, pH
¢*£¤¥¦¥§¨W©,¤r£ª«¬ªA¥k­£!ª€®*£¯«%£§/°²±³£´­µ¢*¬b¶i±¤r¶·
koncentrácie 10% a zmes inkubujeme 30 minút pri 0 ¸ C
¹ º»¼i½*¾,¿WÀÁÂÄÃÅÆÇÈÉ/ºÅÁ»ÊÉËËÆjÇÌÍ
ÆdÎiÆjÁWÏ%½*ÅÐbÑÒ¾ÎÅÉ/Ñ1Ó,ÔÕ4Í´ÅÁ/ÖÏ×ØÔ=ÙAÕÕÕ/Ò×Õ Ú C)
Ú
Û
7,2) a znova centrifugujeme (5 minút, 12 000g, 0 C)
dôkladne odstránime zvyšky premývacieho pufru a pelet rozpustíme v 30
Ü
l
fosfátového tlmivého roztoku. Takto pripraveným proteínovým extraktom potom
%
Þ
Ý
štiepime DNA substráty pBR322 a -DNA
získané fragmenty rozdelíme elektroforézou v
ß,àß,áâ/ãä/åräæçàèéêëìãˆê_í%îIïæ‹ð4êñò
óäôðYîõß÷öß
ãWøù!éßiú!ðdêñò4óäò/û/üéê'åäýíîê/åûóäôïþîßæAðÿåðQùäìí !"#
$
&"')(+* ,-./(0+1* 2$,-3
0453 +
$678( 3
947 &"65 /(0#*:2;
/< * 4/6=&>
16
?"@ABDCFE9G"HJIHLK-MNDOQPSR=H:TUSTVW9XK-Y8ZD[
Princíp PCR:
PCR (polymerase chain reaction \^] _`a b!cde=f"_$ge dc h ij"kl m nopiq rsLi=tvu:wk x y z{|
}.~4~€‚ƒ „ ~7…"†„‡ˆ"~„‰4~‹Š+Œ†Ž94‰J+‰J€ /‘‰“’ ”-’ •.–‰—#˜™‡›šS}.~€’œŸž¡ £¢•¤‰¥–‡9†¦ƒF~ §©¨ ª¬«­¯®°Ž±9²4³L´+³J¨ ªµ ®¶·¸$ª
¹Sº.»¼½¿¾DÀÁÃÂÄÆÅÇÈÉLÊ˽Ì+¹ÎÍ/Ï Ç7ÐÅÉJÑ!ÒÅ+ÓÕÔ
primers). Táto technika je alternatívou ku klonovaniu,
Ö×ØJÙÚ ÛQÜÝ¡×+Þ ßàá4Ý+ÜËâØLã‹ãDÜÝäåÚ ä/æFßà:âØ4ãç è7ãDÜÝ+ÜDéêæ ë"ؓì#ØLÝDÜ݋ãáLÝ7Ö Ú/ì×.Ýîíå$ïðÛ!ãîñ!æ ×Ùؓì#ïðØJåòÚ×ÛóßØ4݋Ú
ô.õö÷õøùúLúüûýø þÿSôõö
ùø
ô !$÷þÿøô")÷ ý#$%
&')ô+ö ý)(
*"+",-./0132547698:0,+"./ ; g DNA (po 20-40 cykloch, za 2-6 hodín).
PCR prebieha v troch krokoch:
<=?>@BACEDGFIH9JLK5MNCOQPIRISCUTWVD RH9@XZYRIK5[JY\]C_^PH`MaDb@BPdcNRDb@eRVRcNR
ikjlmno"pNqsrItIuvwrIpyx5z{jmw|$}~€objƒ‚Ip„x)oG…{†d‡Bn…Inˆm‰IvŠ‹IŒ9qylqNxLuŽq…‚Œ`qN3‘5Œ9nr“’
fdg h
C) k oddeleniu
2. Annealing (hybridizácia, naviazanie, „nasadnutie“) primérov ku komplementárnej
xErIqG”9pNn•”obq–ndl—l ˜™š›
h
sekvencii denaturovaného templátu DNA. Prebieha pri teplote 40-72 C, v
a sekvencie primérov.
œ•žŸ b¡5¢]£U¤y¥¦`¡§N¨¢©IªL«Ž¤y¥5¬®­¯I¨I°¥U±³² "¨´9¡µ·¶$¸%¹º¯I¨§»I¼3¡5´9ªB£¥½¯´9¤²I§y¥¾ª²¿œ–ÀÁ$ÂòI¨¢«EÄů´`¤N¼3Æ5´9¥
¢ÄI²d§y¡¨ "¤N¾»Ç¯I¨I¾È ÉËÊIÌ̓ÎIÏyЎÍ3ÐÑUÒbÓBÔ`ÑÐ`ÕÖ®Ð5Ê×IÐÑIØلÐÒbÐ5ÍÚÎdÏyÓEÒGÛÝÜÎÔ9ÐEÞIÙsЎßɀÎÔàكÒbÐ5ÎIÏNÌÒbкáâ ã äæå¿çBÌÕkÐ
optimum pre Taq DNA polymerázu).
Denaturácia, annealing a extenzia tvoria jeden cyklus PCR. Jeden primér nasadá na
jedno vlákno denaturovaného DNA templátu, druhý primér nasadá na druhé
ÜÊIÌ̓ÎIÏyЎÍ3ÐÑUÒbÓBÔ`ÑÐ5è7×IτÓBÊdÑÌÒbÐ5̓ÎIτÓ)ÒGÛ{åéÎÔbÙNçÌdÍaê“Ö®Ð5Ê%ë$ì%íÃÌß]Ô9É5ÑÙyçÐÑî¿Ò"îÍÙïÒbÌñðU×ÌdÍÙÎÔ9ÙyÍ%òBÔàÍÙ7Ö9É
amplifikuje opakovaním cyklov PCR - vznikne PCR produkt (Obr.10.1.).
ó–Ô`ÌIðUÛIÊUÒ ÌÍeó³äôõÔ9ÐÉBÊI؎ÙyÐöד÷®É5ÊÃÑلкÖêÏNÐÑaÍÌIτÐBÊەÏNø?ë$ì%í_ÌßԮɎÑÙyçÐÑòùÑɺÌÞIÙNð×IÌIØ5ß
ÊIÌÑØÌIØ5ß¿Ö9ÐBÊ×{ЎÑØÙNÌÛÅÎÔ9ÙúÍ3ò5Ô®Ì×å•çÌ×ø]ÎIÏúî]×{Éüû ýþ9ÿÅþ
ÿþ
cyklus“) je v
ÿ
"!#
$ %'&()+*,-/.0&(1
þ
/ÿNÿæýþ20&3546,578Iþ9$Žÿ:&7;46,<3>=?(&@3A@.%35=#,CBDFEG@5!H3þC5I/KJL3M535,5$
,52 ýþ+@7
<3
cyklu PCR bude v reakcii prítomný
½ýþ`ÿ%4 5N þ,IOJQPSR
&(!@
ýþ3UT-#&(V#&(3þ+1W@<!-,ÿ%NA&V=#X,5
templáte denaturovanej DNA vzorky sa od primérov dosyntetizuje komplementárne vlákno.
Y[Z-\(Z^]<Z>_a`bc
_Fc
d#\efCd5chgbie]Ud<ZFd5c
_
m
t#k+lc€\cd{-‚cptƒ{#t„mH‚t'\(]Z5_
ej`5fc#kCdc"lfm
cd#npo5qsr
]l8tvuc
w5ZxkCy<d-\z{Ht|k9tl]Z5d5m
}~k]Z>d<m
c
d5}i_
o5cd<t'\lfe
…
‚%cpd5t-kbc#o-l„u+n…„cw5Z†…„y]bslˆ‡sucƒ\c
o5t‰bŠcHd‹uc
o5d5Zk+\(ftd5d5c
Œ5Ž5‘i’„“H<”–•“—>˜/“
5™
‘%Œšœ›5Ž‘%F”ŽžŸF ŽC‘%
¡Ž¢
›5ŽŒ£-š—¤¥¤“„£5¤˜>Œ>ŽC¦§“
£55Œ8˜¨¡—5Œœ©–›<ª<˜>ŒU£<“C§S«¬F­
˜<©#Œ>Ž—>¢;j§9“
£><Œ®<Œ<˜>Œ¯•C¢<-¤“'¤(‘s©HŒ<˜>H<”G˜¨i¡—U<ŒU°±5h§“
£55“C§6•+¤(Ž<“²Œ>Ž5‘’#“
5”³•“—5˜“
5™
‘%ŒšM›5Ž‘%
QŒ’
-•[£5“<'¤šŽ¡
™‘%“˜´£Ž(š5Œ5
™¢<—U¨“µ˜5©#5‘%—-¶
©
17
—·H£5“9§¸£-˜>Œ§C˜¨i¡—U<Œ<˜>“9§¸6ŒU¨“—š/¨¹¢º›5Ž»‘%
”ŽŸ
¡Ž5“
<Œ
¼"½5¾¿ÀÁ¿À#¿6Â-þ+Ä/ÅÆ5ÇÈÉ
Ê<ËHÌ
͵ÎQÏvÐÑ¿
A
5´
3´
3´
5´
B
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
5´
C
5´
3´
3´
5´
A Ò-ÓÕÔ#Ö×CØÙµÚۖÜÝÙOÞ×Cß%à
á×Câaãä%Ö5åæHç<áhè5Öa×æ
ÙØé
ß%æ
B: Syntéza komplementárneho DNA vlákna smerom od primérov hybridizovaných
k denaturovanému templátu (vzorke DNA)
C Òaêëß%æ#ìÖ<ã5íÑÞ5×Öè-îØïðQêòñ
Sekvencia DNA identická so sekvenciou primérov
Sekvencia DNA komplementárna k sekvencii primérov
ÓaÖìóç5á"Þ5×ß%à
Priméry hybridizované k
templátu
á×Câ
Smer syntézy
komplementárneho DNA
vlákna od primérov
18
ô"õ5ö÷øù÷ú÷ûLöCü%ýõý
þaÿ5ö
þ(ö
þ
aûÑ÷[ýaÿ!#"%$~ÿ&('
ü)ö*),+&--/.-&0ý(ü213-)3&
!#"%$~ÿ5öýö45*
)&-('
ü6)ö*)+û7$~ÿöCü8ö*&6ÿ5ö*
904
0:+<;$.ý=4
&9ö&Ñÿ5ö*
904
>+<.?:)@>&-A.aõ
B.C
rovnaké ako na Obr. 10.1.
0. cyklus
5´
3´
3´
5´
1. cyklus
5´
3´
3´
P
5´
P
3´
P
5´
5´
3´
3´
2. cyklus
5´
3´
5´
5´
3´
5´
3´
5´
3´
S
3´
S
5´
5´
3´
3´
5´ P
19
3. cyklus
5´
3´
3´
P
5´
5´
3´
3´
5´
5´
S
3´
DFE6G H I0JKMLNIOPRQS
3´
5´
5´
3´
5´
3´
5´
3´
5´
5´
3´
3´
5´
S
3´
5´
3´
TUVWXI0JKMLYN=IOPQS
3´
5´
3´
5´
Z[*\
]0^
_0`?^a]0bced*f,]g-\-b
hi_
g\b
jk`:flmZ
hi`>n<oqprcsd*f]g\l
`:flmZhi`:f,tr_0`>\[>u
Z[*‚’l8j[|c
~*c
`>‚f{
P
`?b
\[v#w!prxyb
hz\{Xfg-f|d
Z-\€cX~%f`:fg}X‚6fƒ]\/~n-g0`:f`>‚„}^d…f†_
\lmZ
h6fl8fg0`:i[:gf‡b
hi_
g\
tˆ€vl
Z[*‚l8i[gnaZ[*\]0^
_X`…oŠp8c‹][^
Œ-\l
~|f_bfg‘‚\^
S
5´
3´
b-}X\[:_n-t~|c
S
}Xg\b^‰b
}Xg‚_
gf
`:flmZ
hi`:ftr_0`\[>uŽ`?b\[vrb
hi_
g\†gcˆd*f]g
fd~`>[*cg-f\Œ[*cg‚€fgj
]\<~ng0`:f“`>‚2}^,d”f
20
_
\lmZ
hf3l8fg0`:i=[gf
b
hi_g-\Yo•w—–2{_^
`>\Œ0`\
˜-™-š™/›œ-˜0:ž>Ÿ2 3™-š¢¡˜£¤-™¥š
¦§¨
˜
¡#©
ª«¡¦ž­¬©¢®0¯°™¤±*¡˜Ÿ²™š
¡“³s›…ž¨šž˜´Ÿžµ™¬
Ÿ®š
™
´3¤s¶±*Ÿ·8£±*™š
¸¶±Ÿz²™·
sekvencia na jednom konci vlákna bude identická s jedným primérom a sekvencia na druhom
konci bude komplementárna k druhému priméru. Tým vznikne sekundárny produkt, ktorý má
¹ ž®˜™µš
¦§¨
˜™º™¬
™ ¹ ›>±|¡˜˜ž8™¤±*¡˜Ÿ6²,ž3˜-£­›|ž¨šž˜
´3Ÿz™-©s¶±*Ÿ·8£±*™šs¡
¹ ž®˜ž ¹
¹ ž®˜™ºš
¦§¨
˜™»™¤±*¡˜Ÿ²Xž˜£B¦ž˜s˜¡
›>>±*¡˜ž¼½™
²¡0›¾®ž˜¡?©
±|§´Ÿžµ¶±*Ÿ·8§±*˜ž¤™°¡e›|ž¨©
˜®§±*˜-ž3¤-™¶±:™
®0©
¨0?©ˆšs>±*ž³,™·¿½ÀÁ´œ-¨¦ž
š- 0˜Ÿ¨
˜0¯°>±Ÿq®±©
¤œ
¹ ž,®˜-™-š
¦§¨
˜™šÃ
´¤ÅÄ!ÆrÇȝ:ž=·m¶¦§:™šRÉʶ±šÃ-·
¨™±:™·‰›|¡B®™/›>œ˜X:ž>Ÿ © ¹ žr¶±*Ÿ·8§±˜œs¶±*™
®0©
¨0:¸®±>©
¤0÷
¹ ž
¹ žeš
¦§¨
˜™kš
¦™ªXž˜ž ¹
š X™±¨œ-¸Š˜
¡
¹ ž®˜™<›>±*¡=˜˜˜ž«™¤±*¡˜Ÿ²ž˜
£rš
¦§¨˜-™¸Ë˜¡
ktorom sa dosyntetizuje sekundárny produkt a tretím druhom templátu je obojstranne
ÌÍÎ*Ï=ÐÑ6Ò,Ó3Ð-ÔÖÕ
×ØÙ
ÐÌ
ڋÐÏÛÙ0Ü>ÌÎ:ÌÝ
ë
áXÜ?ÕÌÎ*Ó=Ðì6Ý
Þ*ÏàßÌ<ÞáÐXÜ:ÓÜ>Ñ2âã,ä…ÓàÌå
æçèÌ-éÌä…ÞÜ>Î*ÏÐÐ-ÓàÌÍÎ*Ï=ÐÑ6Ò,Ó3Ð
ԉÕ
×ØÙÐ-ÌYê
ß-ÕÌäÕ
×ØÙÐ-Ì-ÕÔÍÌÈí!î#ï
åÎ*Ì
ß0ã
Ù0Ü?ãðÞñåÎ*Ó0Þ:ÐÓòÌÍÎ|ÏÐÑÒ0ÓÐ-Ì-ãðßó„ôÙ
Ì-ãöõÌ
ߎä*ÓßÐÔÍ-Ì
priméra po druhý) vznikol v Ü>Î*Óç3ÌÝø÷áÙ
×6ÓråÎÕùúÙÎ*ØÜ!÷ÑÓû“ÌÕùµüýÊþ†åÎ*Ì
ß0ã
Ù0Ü*êRÿËÓßÏMÕù¢Þ*×ÓßÙ
ÌÝ
üýþÎ|ÓÏÙ
÷ÑÓÞÜ>ÎÑÜ>áåáFí!îrï‹ÝÌ
×6Ó=Ù<×0åÎ*ÑÝ8ØÎÐá
Ú<Þ*Ó=Ùã<Ð-ßØÎ*ÐáÏ(÷ÑÓû“ÌÕù—åÎ*Ì
ß0ã
ÙÜ*ê
V Ù
Ï=ôXßÌÝaÐÏ0Þ*×ÓXß0ãä÷Ì
Ý
÷áÙ×ÓFßØÕ
Ïä…ÓßÐÏݾÌ×ÓÙã¢×ϋåÎÑÝrØ=Î Ð-ÓÍÌråÎ:Ìß0ã
ÙXÜ?ãmÜ:ÓÝmå
×ØÜËåÎ*Ó
vznik jednej molekuly primárneho produktu a jednej molekuly sekundárneho produktu.
Jedna molekula sekundárneho produktu dáva templát pre vznik jednej molekuly
Þ|ÓÙã<Ð-ßØÎÐ
ÓÍÌñåÎÌ
ß0ã
Ù0Ü?ã
Ïrä*ÓßÐÓäµÝ¾Ì×ÓÙã<×á%÷ÑÓû !"#%$&'()'*#,+.-*!/ !
01234#56$7'*23078!"-(94+:$&'*6;
'<+!-*/ 4.:=>)?A@
B0'CD4$E4GF0!H<I
$&"IB41-J$K26"!:&F05L0!#+.-*-MB2!'(N0"#6
!HO$&"4IBPB06"260"!9=
rastie s #!I@$
+6Q'($R'C-("26=",#%$&"IBS+!-(!/ !TU0#B-(VB #6I@$
+6Q'($
exponenciálne (Tab. 10.1.).
W #3XYZ)Y6[]\4"6"+!-*2!'("#^#.$&'C-(_=-(2+!-C#^+!-(/ !`badc]ef
gfhi4jk!l6jmKn6ohprqs
0.
1.
2.
3.
4.
5.
30.
V
P
S
C
1
0
0
0
0
0
0
0
2
2
2
2
2
2
0
0
2
4
6
8
58
0
0
0
2
8
22
~1,1x109
tul!iv0lxwy*n6h4m{zik!l w`|}i ~=}p*6hji}m4n!€{ƒ‚N„
…&ip(l6h†
p‡zv=yC…K6v0jl.€i‰ˆŠŒ‹Ts0l6hqj|6v=jl.€i‰ˆŽ4‹‘
n!y(l’ i}“!€i”ˆ=•M‹]zvi|qhwqNŠd•]–ƒ6h”|iNv0lD6hn6y(lG—ip(A}p*i4˜.l.j™~0lD|4j&|}i~}p*6hji}&…&ip*l6hq
p*fƒ‚N„
vzorky (V).
21
š›!œržŸ
%¡&¢ž£¤¥Ÿ4ž¦<š]§©¨ªž«¬¥¬U¡&ž£!¢žŸ­¨ž®!¯°¥±3²,¨ž¡&ž³!ž¬Ÿ´6² µ.¶·T¸¹¸
º&»¼½¾¿À4¼bÁ^Â&ÃTÄżÆÇȿǔÉ!ÊC¾ÈË.»ÌÍļÏλÐ7Ñ6ÒÈÓ(¼Ñ!ÔÕ×Ö
o Ø0Ù
ºb»¼4½Ú¾¿À¼NÁƒÂbÃSÀÓ(¼½
Ý!ÞßuàáAâãä!á3åOæ3çÚèéêã4ëìí™îï0é(ãÛðNëçàñ!òóôDàáAåá6ãó0áxåõ(æ6èöKâó0á!òâãèé(ñDò÷>ø.áAë
úƒûbü
ý
òëã6à0Þþïãÿî(÷Påì à ì
ø.á
ä!õJÞÞã>ï
n
o.2 ,
Ù
kde „x“ je
»Ì7ƼÛÅ
Ë6ÈÑÜ
Ù
Ë
Ù
è
ñ!øòãùEæ6çèéCá&ï0ñ7ù&Þãøïåë4ã
!!"
#$&%
('$*),+-/.10233546'7
amplifikácie pohybuje v #498';:=<?>@ABDCFEGHI<)
J3KL)
8;722:M#$I)K
4
0NEOP34H'QER)9ISUTWV
produktu má potom tvar x=xo.(1+E)nCX
JZY[$Z.10334,'7M
,\2^]C>@ACB=_&
`aN)
Cb
4
<
#$0cEG4d
4e0fEGg&h
49)i]j)
8;)
R'$4F'E,4
JIP34H'ER)
k)
4H@3l:4IEG;meNER<Mk.10n33546'E62me
;_
#$'QEGN)9I
NEGc7Z\%5
4935323
P8;)
j'-4,'Q7Zo\J8=XP34H'QER)94eiSUTbVd#$4
J=<
=ER<pI54e0fE4q;h
49)p
4r#$Ns92:3<EtF)9u0+$:54v4
0wER<pNh@
49)pJ4e;:5J8a;Ho
úplnému zastaveniu amplifikácie
|P}~€QR‚9~„ƒ†…b‡‰ˆŠG~
‹=Œ
=ŒŽŒ
v}5;;‚‘1’QŒ\“f\”b}
•=€QG–&‚
•—;‚6˜†ˆe™•&Gš,˜U›mœ‚
~
‹~|ž
‚‘9Ÿ;Šˆ
•} *} ;G~Š$Q“d
xzy${
plató“ efektu nebýva
Š•;
Ÿ}¡
¢£ž™~9 ;
”¤•™¥G•;
¦*}5•£Š$~|P•‹} §ƒU…¨‡
ˆŠ$~
‹=Œ
=RŒ9”©2
z termodynamického dôvodu dochádza k prednostnej reasociácii PCR produktov pred väzbou
ˆŠ$ |a¦;Š$~‚P}•ªˆŠ$~
‹=Œ
=R‘5”}•;ˆŠ$ ;~|gŒ1”ªˆŠ$ |o¦Š‘«|oœ;ŒP¬‘­m€QG–™®‚
nadbytku.
RT-PCR:
RT-PCR (PCR spojená s Š$;‚
Š}~ŒIŠ•;}e€GŠ¯ °ˆ
¢2 ±~5Œ
²†Œ
|P~³=Œ\“-g•|Pˆe™ ´ 
~5‚9•\­µ›·¶P¸¹”e~Š$–
~
‹ˆ~‚
\‹–
‡W¶I¸¹”ŽŸ~§Œ
|P~}º»}5•;ˆŠ$ºe™•‹¼€QG•;}5~5‚
½­¾Š•;}e€GŠ¯ °ˆ,Ÿ}=¿À•; ½‚
cRŒÂÁ
¦}=ŒÃ‚
Œ1Š$Ÿ c¡
¢£
tkanivách. Najprv sa z daného tkaniva izoluje celková RNA alebo len mRNA. V
Ä
•™j’~e|
Š$~Œ^€$•µˆ~|P~
¢~5Œi;}¡
|ŒrŠ$&‚
;Š}5“XŠ$•;}e€GŠ$ ½ˆG–;;‘Zŏ}¡
|¥€‘5}=GNG ½;Œ\“-·›·¶o¸zŠ$&­•;2¢}•k‡W¶o¸
templáte) a reverzného priméra (pozri „Priméry“), alebo oligonukleotidu dT (ktorý nasadá na
polyadenylový
koniec
mRNA)
nasyntetizuje
vlákno
DNA,
komplementárne
k
príslušnej mRNA (tzv. cDNA). V nasledujúcom kroku sa do reakcie pridá Taq DNA
polymeráza spolu s forward primérom (pozri „Priméry“) a na templáte cDNA sa potom
ŒÆ€GŒ~
Ÿ;}ºÇ’QG•}‹
•;Š$‹}–µƒ†…b‡m˜e¸µL€•gˆ
~rˆŠ$N¬9£}=ŒºeƒU…b‡È=ºR€G,•ˆŠ$º€$™½ŒÆ’$}¡^ˆŠ$~
‹=Œ
=¨Å•;|ˆ
™ ´ 
~‚
•}¡
¿Æ€;z¢N›·¶o¸É~e‹ˆ5~5‚9‹•“¿1¢2 ¹ˆŠ$ºR€$™±ŒÆ’$}
“L|‡W¶o¸µ²^}•;|a}
–[G~”!‚
danom tkanive dochádza
k expresii (transkripcii) sledovaného génu. V ˆŠº½ˆ
•‹\”brˆŠºR€$™½ŒÆ’$}¡LƒX…b‡‰ˆŠ~e‹=Œ
µ};‚5=} 
}”
sledovaný gén nie je v ‹•}~e|ʁ
•;} ½‚1ËN̈Š$ |P~9‚
•}¡9”o•™;¬
~¾Š$•
Ÿ;}¦Ëˆ
~e‹|P }@9‘z‡·ÍXÎjƒU…W‡
neboli dobre optimalizované.
ÏOÐ;ÑÒÓ;Ô
Õ×ÖØÙÚNÒGÛÝÜOÞÇϹß
àaá©âÆãäâåjæeçèé;èêé©ëUìîí¼ï$éËð
æ5åòñ$éNó5è
ô(õPá ö
÷5øùúûü¾ý·þIÿ
9ù
WþPÿ
ú
"!#%$&(')#%+*-,.'/102 3547698:;<2*3=$2")#>#?#@A&CBD'.$7E4F@2GH3I)J*7'. K7$L/NM2OP*HK747Q9R)J/#GAS47QT'%3 =M2Q9*?#'.*GVU
Reakcia prebieha v WX#YZ\[H]#^P_H`Ia#Yb c_7W.[YDdfeg1hAX#eJi2XJjlkJmnXpoDW.Yb XqgrbIXsWX#i`tPWvu jednotlivých cykloch.
22
Vzorka:
wyx2zN{P|Fz}%x2~~€+‚„ƒF…\†2zP‡2ƒˆŠ‰
‹PŒ#ŽlV2‘#‹P’H“\”7•2–+—˜™š•›2œ F”2ž ”P•„ŒJ‹2–
buniek, alebo prípadne len
F”Ž%Ÿ2ŒP”P 2¡œ ¢n‘¤£E˜"™¥œ F”ž ”7•AŒJ‹–
hrubý bunkový extrakt. V prípade RT-PCR sa ako v
2ŽR¦#œŠ§¨#©P”
tkaniva.
Priméry:
Sú to dva oligonukleotidy 14-40 báz dlhé, ktorých sekvencia zodpovedá sekvencii na
ª«¬­D®ª2¯#°"±D«2ª²¯Jª2¯#°´³¶µv·R¸#«7¹º»¼¾½2«7¿.ª¬DÀÁ·­¾Â\Ãp­JÂ\Ä2Å5ÆIÇ%Æ «2ªPȄ­#ÉÊ7¼y«Ë·­¤­J¤Ä2ÅÌÆIÇ%Æ «7¹J®n¸pÍ2ÎJ²P½Ï­JÅ ¸#ЄªÑ®¸J°Pª
Ò ­F·DÉ
Ó%ÔÖÕ×lØÚÙÜÛV؊ÝVØßÞà+áâ#ã"ä7×%å æ"ç#×à2ã7á.è×Dé\êâ7ëRâJìípêâ¤î-ï„ã2èêå ðFñÑò2ç#êFóËÓDã2ô2ìõóÜöD÷-ñJå7ø¤ù
úÁûüJýþÿüüÌú
2þúÜûü"üþ2þ
"!#$&%'( û(*)
2
koniec proteínu)
smere transkripcie) sa nazýva:
5´primér, upstream p., forward p., sense p. Tento primér nasadá na antikodónové (-) vlákno
(jeho sekvencia je teda komplementárna k sekvencii antikodónového a
identická so
sekvenciou kodónového vlákna DNA). Primér, ktorý nasadá na 3´ koniec génu (kódujúci
+-,.,/10"23465798:2$;<5=63$>"?A@-B5C2D5E;<5#3F4G@H8"20:@I>JB5LKMN5:O2MP0QSRT0"2U3V7>DW"X3$>ZY[;\ B\]8:2$;^4_KM`5:a>
transkripcie) sa nazýva: 3´ primér, downstream p., reverse p. antisense p. Tento primér nasadá
na kodónové (+) vlákno (jeho sekvencia je teda komplementárna k sekvencii kodónového a
identická so sekvenciou antikodónového vlákna).
5´ koniec génu kódujúci -NH2 koniec
3´ koniec génu kódujuci -COOH koniec
(+)
5´
CTAGGCAATAC
ATGATCTAAG
3´
FP 5´ CTAGGCAATAC
3´
TACTAGATTC
bcPdfe
3´
b]gih.e
3´
GATCCGTTATG
TACTAGATT C
5´
(-)
Obr. 10.3. Umiestnenie primérov pri amplifikácii génu (FP- forward primer, RP-reverse
primer).
23
DNA polymeráza:
jkml]jonqpsrt9u"vw"xy{zUtm|O}~<€km`v]ra~<t‚"l6ƒ6„"…‡†‰ˆNŠ‹u"vƒŒ"Ž€#kŒ‘u"v’#“”tm|m}S’€H
‚Ut•~<…kl6y6–L•~<vkO…—r^}™˜šw"„•S›„…œtm|u"vzŒSra~<tzU€ž„yŸzŒSrv•U V
v jednotlivýc
“™’ŒV•ƒ6v"’“£¤
ˆŽta|¥›tra~<€m|¦lš€1rt‹u"vw"xy{zUt
baktérie Thermus aquaticus
~<€uƒ6v~<
rôznych termofilných
¡au"v›Jt$r¢”€„t~[w"kO’l6€&†ˆŽŠ
Taq DNA polymeráza z termofilnej
¤_§q~^vuvƒŒ"N€ktŸ`L~[}¨„V€z “Vv”$wS–*x€©„V€Ž
ª¬«€­UvU„w"•ƒG€vz}
t•~^lz"l®~[wS–_•~^vkŽw"`vx„$wJ|¥€©vuktzw¯„€r<ukz"„"€°tkt”€#„"…ž“Vv„$w"•"ƒ6€v~^l6”$w¤f§¬ ±z„l6•"tm|m}¢’ž“Œ‚ŒZukl
amplifikácii v rozsahu asi jeden nesprávny nukleotid na 5000 správne zaradených
²³"´µG¶·¸^¹6º·»T¼½o·V³"¾¹¿¸^¹š¶±¹6²À"ÁÂø<¶ÄmÅ`·Æ^¹šµ6²À"ÁÂÈÇ"·µÉ"ÅN¶ÄÊËÌÎÍÐϬэ¶ÒU·U²³"´µG¶ÊË·»"·³
Ó^Ô·ÇÄÕ»V²·³"Ö
„proofreadingÖ×ØÕ´¸^¹»"¹®¸<·³SÌÅ`Ù¾¶P»ÀÄ¥Õ˲V¶Ú˲Û6¾¹{ÜÇ"·"ݶ¸œÁ#ÂÉÞ"²"¶ßËÕ#ÄÕº¶²À"ÁÂȲ³"´µG¶·¸^¹6º·»
v amplifikovanom produkte.
à9á"âã{äåVæ^ç{èVéNêìëOäêâ"íîï9æ<ã6ð`ç{ñ"ï`ëåòæ'åUâôó
õöåŽëäêâ"÷ç6ä*øä.ù"åVæúëäû"îü.ùëýç{èêþ ÿ
v 57698:<;>=@?<ACBD=@;E;>D=FGHI895J-K
!"$#%&('*),+'-'*).+/0',)1+123'*)4
B5LC6MCD=@;NH?;O:8=@;PB=QRH=6SUTV5WDXSHDAWYBZ[H=9;>D=\G]
^`_
2+
iónov,
abdc9efhgijklmnporqtsvuxwc@yiz{oCe|C}~k
€‚Cƒ„X…C†‡‰ˆ"Š‰C‹hƒ$Œ3ŽŒ†v.…Cƒ‹R‘’3h“RI”•ŽX–‚—*€™˜
šœ›žŸ7 ¡£¢,¤¦¥E§¨©C Ÿž©«ª¬©®­ª ­¯°@± ²³´µ·¶
objeme 50-100
¸
l a obsahuje nasledujúce
koncentrácie látok:
1-5 U Taq polymerázy
štyri druhy dNTPs - 200 ¸
¹Pº»9¼½¾C¼¿À¬Á½ÂÃÅÄÀ¾ÅºÃCÆXÇÈ{¼ÉºÊ<¾»¿ÂËÇ
primér 1 v koncentrácii 0,1-1 ¸ M
primér 2 v koncentrácii 0,1-1 ¸ M
vzorka DNA 0,01ng-500 ng (plazmid - komplexný genómový templát)
Mg 2+ v pufri - 1,5 mM koncentrácia v reakcii (1 - 5 mM)
̜Í
95 Ü
Ľ7º9ÈU¿¾CÄÊ»¿¼ÈÎÃÐÏÃѬ»ÒÈÓÄÀ»@ÔÂÊ*Õ,Öh×xؾмÃÑÊ<¾Ç»Ò¼È1ÙÚÄ»ÛÄ»ÏCÂÃ"¿»ÏC¼¾%Ø(Ǿ¼ÃR¿IÉÀÁ½ÂÂ-ÄÀÂ
ÝßÞà@áâãÐä>å>æçéè*çâãê<ëìíîpëðï ñò%óôöõC÷øêà9ùúã
pri 95 û
týmito parametrami (segmentami): denaturácia
!" ý #%$&(')$ *
üþýÿ
min. a extenzia pri 72 G H
ü
+ýÿ), -/.10235462789!2;:<9=>2?<@A4ABC:@D.0FE
IJKLMNOPMQRSUTWVYXZ[S%\]IJ)^_/L`^ acbdegf hijlkm(kdn5ofpqrnYstu?d5vw/xzy{n
i|u/}urpv~€vo6u‚u p5ƒ6„r†…‡&ˆ(‰Š‹„e&d)jŒn6ohnbpn‹Žf|f‚6k‘’u“]~€u”ujn6p&•–„kcv—pAu‚nzt(eAp~€u˜~]k™ŽnAo6fp5ƒ„r
|u/ š› œAž ŸW¡>¢¤£¥(¦§5¨ © ª«£)¬š­P§¯®;¦°²±
24
Optimalizácia PCR:
³U´µ·¶¸¹ ºA»½¼(¾¼]¿€ÀÁ
¸Á¯Â)Ã!ÄlÅ(ĶÆ5ǸÈÉ«ÊWË>̤Í`´(ÄÁ>À?´Î¾gÏе·ÂÆA¿Ñ´µ˜ÒÈAÀÓǾAÔÕ¸º¸˜Ö×ÆÂ5¿]ÄØÁFÉÃÈ6¾
¿€µÂÌÆA¿]È5»Ù¸WÚ¸¼ÎÆAÇ» ´Æ)Å]ÄÃ6³ÜÛÞÝ߸?¶Æ>¸(ÏàÆz¼á¿€¸˜¿]ÈAÀCÂƺ5ÁÄlµÈ&¶6¾´Îµ¸¶âÄ!µ5ã
³U´(Ä;Ç»&Ò²µ´µºµÈ¸˜¿áä´¸Úȵ(ÏÞ¿€µÂÃÆ5¿á¾F¸Ú¸¼åäÏεæÂÆ5¿á´µ/ÒÈÀCÒ´¸˜Ö ºÆ;çÇ6¸Ô5¾è¹µæ¶´Îɘ¿]¶µæÅá´Î¸é)ÁÙµ ȏ¿å¾
ÊêË;Ì뺵ȸ/¿áä´åäÏ]çìÕ/¸ÔíÄlµî¸¶Æìº5ÃÔÀè´ÄÚÆ)Á¤Â´ïØÃ!ÄáíðǾ¼ÎÆ6¶Éñ¿€µÂÃÆ5¿€¸«¸îÚ¸¼òºµÈ¸/¿áä´ÉâĵñǵºÄ!µó¶
ÂÆí(¶AÆ)ºµÈÄcä1ÊêË;Ìô¿€µÁ¯ÂÃ!ɘ¿áä²èYõ ¸ö¿]Ä!¸ÕÚƗÂ5´(ïÃ!Ä÷íÈïõ¶¸¿€µÂÃÆA¿€¸ ¸Ù¶&´É˜¿]¶5¾Ú¸¼ºµÈ¸˜¿áä´ÎÉâĵ¯Èµ˜ä²ÁƹÈï
väzbu primérov.
Výber teploty naviazania primérov, t.j. teploty pri ktorej primér hybridizuje
s templátom, patrí k najkritickejším momentom optimalizácie PCR. Ak je teplota naviazania
príliš vysoká, primér nenasadá na templát a neprebieha tvorba produktu. Ak je teplota
naviazania príliš nízka, primér nasadá na nešpecifické sekvencie templátu a vznikajú
nešpecifické produkty. Optimálna teplota naviazania primérov je blízka tzv. teplote topenia
Tm (melting temperature), ktorá je definovaná ako teplota pri ktorej duplex primér/templát
ºÄl¼ÆâđäÏøµÓùÎú/¿€ÆÂï>¼¸û?üè¯Â´(ÄÚÆ)ÁýÏе·ÂÆ¿]´µ/ÒÈÀè;¸/Ò¾½Æ5ÒÄlºÇ²¸îÂÆAä¹Ä¿€À·Â´ÄØÁFÀ´(¾þÁ>¸Ã!įÂÆ)ºÆ5Òȏç ÿ
ÿàµÂÃÆ¿€¸;¿]ƵÈĸ1õÉÇÄá¼ï Æ)º õÃÆ6¹ µÈÄ!¸Â´ÄÁFÀ´Æ5Ç«ù€Ú ïÁ
Á
nukleotidov k adenínový
¸C¿å¾AÁïØÈAÆ6Ç»Á
m.
Ç&¾í/íï ÂÆÁ>µ?´é5䲸ÈïÈAÆ6Ç»âÔP¸ð⾏¿€ÆõïÈÆ5Ç»âÔ
Èä¶Ã!µÆA¿]ČºÆ6Áè¿á»ÁßÏеêǾ²í/íÄl¸?üèº ¹ ¶¾Â´ÄlÁFÀ´Æ5Ç`ù(ÚïÁ‹¼åç
!#"$
%'&)(
+*$,-./*$$0/12#3!4$56387
*9:<;!=?>@$!%A>
>
B"!2%'6%CDFEHGJIKLB>MN"!D!% OP@+"$
%AQ$
9R!2L"$P%'&)(P0$;$%'2RF&.S$D+0T*$
%U%':<!WV
/1UX,!&Y>
2$!2X!%9Z&[2&#"!9R\D]#"/^$&_!:<X$% -9#&.X$$>\!BX/2^P"!2`Z%6%$,!FEHGQIa"$
!U^D!^
k ná
bLced
fhg/fi$j
k c1lf<mni!op!qr sutvi$j
r'w)xjyml'z{[|~}€<ƒ‚fc „\j
t…c†!tg!‡rfˆ|~}!€<o†${!‡zed
tc$†-tg$‡r'kŠ‰Œ‹Fb
Žo€g/fZwŠtZg!`q<t‘c!fqZm/{/‡z
templátu, ktoré sa náhodne zhodujú so sekvenciou priméra bude 48
}!…€<o/†${‡z#i!j
o†+d
f“†$”-dPc$”<‚Pg/tƒg$f•‚tw#i1lR‚t#d
t…c†!tg$‡rf1cp–c‚oj
t6s—dufƒw.˜$q<tLi$jPr'w)xjm$l'z{
65 536 (48’
|™}!…€hz”T}!jšrm$r'€<o/†f›$œ•bLced
ffc!ož‚t…w#i1lR‚–i$op!qr suthŸšp-m1d
c!™ !tg$¡$w.o/†-¢‰Œ‹‘b£N‚f…c¤i$jPrL†!t<Ÿ¥c!o8d6‚r
Ÿšp-m1dc!xZz/o‘ !tg/¡w£p+fd
r!¦§©¨…ª 9 «!¬­M®/¯#°-¬…±•²®‘«T­
³´1µ²¶R¯·…¸u³L¶^µ
¹!º!»F¼$¼$¼#¯!½±°!®¯$¾!¿À)Á‘¹³µ6²Â-îF±Ä/¶Á.³Ä$¬
priméry dlhšie, tým je Tm
Ǿí/íÄ!¸ü¸Æ)º
¯/±^Ä$¹'Å.¯!³Æ¥Å!ÇÀ$®FÁ.Ä/®Èµ²\¯!¶•Ä/³^ÉP«-³¿¹'ÊP¹¿Å¾¿ÀƒËHÌÎÍÏ«$­
®1´^·!Å<²®¯Ð<ÑLÅ+µ
¶L¶Ò³L«!®/·!ȹ ¸PÓ+«$­
¹'Á)Ç­PÔ)´$ÒÕÀ!Ç£Ä$¶«$­WÐ
Ö ¼‘°¬±<Â×°T·-´$³‘Ê\­
³…ů³ZÄ/¿¹¶.Ä$¬À$®!´Ä$ÇÀ/®?¯$¾8µÅÔ<²\·²¶Å!³P¸6²®ØµM³Å¯!³Ä/¿Z¹³.Ä$¶ƒÙLÚ)ÑÛ²³Á«1Ò¬R²³.Ò'³Ä+Å!¶È<´¾!¿À
asi 1x1012 (420) °¬±<®¯$¾!¿Àˆ«!¬­
®¯!Â.Å®v¸
³Ï¶^µ
¹.Ü1ÝT¼ÞÄ$¬^µM®/°®Å¤¯³Æ¥Å!®×µ²P¹ŠÆš·-´1µPÅ!ÇÀ$®Þß!³Ä$à!Áƒ·ŽÐ£á©®
±Ä/¶ÁF³Ä!¬ÂÈ<³e«$­P¹«!®·!È^¹â²ã Ö ¼ä°-¬±å´$Ò'À¾!¿Àæ«$­
¹'Á)Ç­
®¯YÄ$¶^µ²¶Ä$³ ÀÔT°!­
¹'´¹'±T¬¿¹¹çÒ³ZÄYÄ$¶è·!­
ùC²®$Á
špecifickom mieste genómovej DNA a teda k vytvoreniu len jedného (špecifického) PCR
«$­
®!´^·!Å^²\·×ÐÚ)¶#´­6·!À/³M¸Lµ²­
¶Ä$³`Âé«$­P¹'Á)Ç­PԏÄ/³^µ
Á#Ó]°$ÔꖶÄ$¹©«$­šã'Ò'¹\ÉL´$Ò'À!ÇFë6«$­
¹'Á)Ç­PÔy´Ò'À8Éu¹³F¶Å!®]Ü$¼F°!¬±µ
¶
«!®·!Èã ¯!¶P¸PÓ+Ò³Ä#±­
¹'³´Å!¶…ì
Â1¶W°$ÔFÄ/³´$®8É
Ò'®‘Å «­Pã'Ò¹\É
Ä!ÇÁƒ·)«$­
³´$í'È<³Ä$¹ ·Ã¶^µ·+«!®²\­
³W°$Ä!ÇÀ$®FÅ hybridizácii na
templát.
25
îŽïPð8ñ$ò$ó!ô!õRö÷£ø
ó$ï
÷#ù$ï
ú¥ö
ûPðü÷Šó$ï
ð'ý)þïPÿ$ô
!ù'÷`ô/öð$ôñ ý.ô$ôBó!ôðñ<ú8ø
"!$#%&'(*)!,+"-./01+23+")546'879;:<4.=>?:@BACD/;E(>7/./GFHIJKF
>-LM/CEON.C7&7
.LJP,NM/QCLRNSCFT>-LM/CUEONV.U9WGX;#YZ[0F
>-LM/CEON.C7!(\]C^FUC_ 79ACD`Ea4cbedfgXG+ih
jXGk+k6LCS
m
m
m
= 2x
priméri. Pre
10
konc J+) +
0,41 (%G+C)-(600/L) - 0,63 (% FA), kde J+ je koncentrácia jednomocných katiónov, L je
. l mno_pqrsptTunqiv?pTwOrxTuyo0z*{}|<v~]tpmOw€p&‚Opƒ,~]o~6rMxTu„€ ƒ<voGn…†rMr(‡‚Opƒ~Wo~0rMxˆ,o‰~]Šm
v_‹ƒ,rxoŒxp
ƒ,v?on…rvQto1vqri~6rtŽ
…ru<vGnutUxŽƒt‘…’“wOƒun
w”ƒ*•–]{1—nTw˜peƒš™›~]ŠmuWœƒ,ŽtrŒ1‹ƒ,žwu‹u‹ƒr~W™ƒ,p€_n ich
|,vŸxvtocwuƒ,o? t™Ÿ rtrMxqp—¡wavxo£¢?trRmGu|<v8¤ –Wo§€¨©‹p vcwª¤
väzobným miestam; formamid
m¥;¦
m
~]pm
tp$‹pumrŒ&oš|«‹p žwao? pU€e™‹ƒpsƒ,o~¡‘U—¬oqMvª€e­ “,rRtUpUuª|,v„oš|¡waon®‹pTwƒšvcœt™‰wav‹qpwu®to€rMo¢
otrMo
‹ƒ,r~W™ƒ,p€¯v~¡‹rƒ,ri…Gne‘°pU€evƒ,rVŒ†—±‹ƒ,ž‹oxtv²pTwOr~Woqir¢
p€oŒ nƒ,v~ wav‹qpw‘´|,vµxŠqvGmTr¶w¨·o|5 o
¦®³
š
ƒ
v
o
n
…
i
r
g
r
,
ƒ
v
M
q
c
o
a
w
V
ž
€
t
‘
x
p
O

a
w
c
o
O
w
p
n
…rv
¸;p€v|Qšvn€vt…rMv—¹‹pwao? cuG|,v¡º»‰¼(½»
naviazania primérov. Ak je v
…’U—nxv¾|švQ…rMv¸;p€v|<vne€evt…rMv¡‡˜w | wav|š—nw˜peƒšŽ0,oQ~¿Ž¡o~¡‹qMri‚rnp€ocŒ
sek. V komplexných templáto
¦¦
¥
p
O

a
w
À
o
O
w
U
t
v
¿
|
Á
•
6
–
Â
{
€
v
;
¸
0
~
r
W
~
Ž
q
±
p
O
‡
t
o
‹
ƒ
u
,
ƒ
r

w
ˆ
¨
s
G
™
$
t
Ÿ
€
?
…
†
v
Ã
q
n
U
p
Ä
€
v
|
v pomere k
genómovej DNA), je
¦
‹pTwOƒ,v;œt™±tv…’UocŒŸ€ ‹ƒ€¨…’Å…‘nqp…’Åxeq’“,ž_ ?oTKtUo€rioG¢oGtrio}‡to‹ƒ ºÆ~0rt ocœ‘Ç~Woqir6‹ƒ,r~W™ƒ‘
¦
¥
xpwaoÀw˜penW oTOu]€‘’¸;oxocŒ›xotT”,vn€vtU…†ru
¦
¤2v‹qVpTwuˆo_ ?oT1vcÈ©wavt¢
rMv0uƒ, cu?|,v0wav‹qpwOt™_p‹TwOr~¡uÄ~ɋpum
rwav|Q‹pq‘~6vGƒ,Ž¢†‘&‡pUœ€‘UnqMvpenUpeqVp
o$x̝m?no±o~0‹qir‚rnp€ot™’p͋ƒpxTunTwu·pœ€‘UnqMv£šo$‹pmTž€eoÐÏ$~]rt toÐψnœ {nÐ~¿oš|”
72 Ê Ë ¥
¦
¥;¦
e
—
]
~
p
m
U
t
0
p
‹
p
u
m
r
1
Œ
M
q
v
]
t
T
x
€
Q
o
<

v
s
W
~
v
T
t

w
¡
‘
€
n
G
o
m
x
p
Å
~
…
‘
n
M
q
v
Ñ
x
v
t
c
o
w
priméry vysokú Tm
urácia pri 92-96 Ê C
œ©€‘nqR¨W‹p vcw҅c‘©nqpe€6Ó Ë3Ô |<vQºÕ©¼aÖÕ©—tUo|š€rMo…Q€Ä“,on_½» Ó ƒr
a naviazanie/extenzia pri 68-72 Ê Ë ¦³
¦
€‘Ä“;“,p~͋p Àwav…;‘nqpe€WtUoƒ,oTOwaŽ›~]tpmOw€p¡ƒŠ¢t‘e…†’×tvT“,‹v…rM‚rM…ne¨e…’¡‹ƒ,pxTunTwOp€
¦
nƒ,v~Ðwav‹qpwOt™’Up‰o] o
,p€™’p‰‹ƒap‚rqu‰Ó Ë3Ô |<v¡‹pTwOƒ,vcœtU™]pe‹
wOrR~Woqir¢
p€ÄocŒWo|ÙØ(oq“,rMv0¢
qpmne‘
³
—t
unqv?pUwOrxp€—npetU…vtTwOƒšŽ…ruo¡ rwapTwiu_•Á–]{8€¢
pƒn‘ —
reakcie (koncentráciu polymerázy, Mg2+
¦¦¦Ú¥
‹ƒ,r p~8€¨,qMv
xpen_,o¬~¿Šem
vqž“,rVŒ›o|3€ ¢
Ž€r,qp¹OwOrpx¡‹pumrwa™’Up×w‘©‹u]wavƒ~¿p…‘©nqM™ƒšooQn”Ä~6o€rMvn –Wo
¦
Ó Ë3Ô šo6‹pUum?žV€eo|š”Û“‹v
…rMŽ†qtv6wavtnpwavGtt™n”Ä~Wo€n‘—2ne€eŠqr3ƒ¨…’qMv~¡u®‹ƒ,vtUpOuKwav‹qMo Ô v?on tŽ
¦
zmes sa v skúmavke prekryje vrstvou minerálneho oleja, aby nedochádzalo k odparovaniu (u
termocyklérov s vyhrievaným krytom to nie je nutné).
Analýza PCR produktov:
ELFO analýza:
–Wo|, oTwav|ܓ,rMv$<oK‹ƒ,pxTunTw¡Ó Ë3Ô otoq‘¢u?|Üvˆ‹p~]p…?pUuÎvqvnwOƒ,p‚Opƒ,vÀwOrV…n™’pÍxvqvtrMoy€ agarózovom
géli po ofarbení etídiumbromidom a vizualizácii v Ý]Þ ßàeácâaãáä]Þ¡áåÜæçßèÅéêšëìíWáîTâï5ðòñÒó
produktu sa porovnáva so štandardom, ktorý obsahuje éê<ëìíWáîTâOôÅçöõî÷í]áøˆàáåÜæçßâaùä¡úæ
àeáåÜæçßOèŸð"ñ3ó·ûê,çüTïæTâï5îë8ìýãù_õ
çüûçUàeáü÷£âaáçê,áÜâOùþæôöàôûçÿ âaëîá
ø ûçÿác
â Uû5çü$ø<áüîý Uç
26
primera k "!$#&%('*)+,-/.1023/4567 8&,98&:%;<=,>4*!?%A@B%?6C@DE56FGH,>'*
'I$JKMLNOPQE5RST,U,WV,X#&>
MK LNDPT
Y4B!?%;@B%?6U@Z56FHT,&'Z
[.]\[N'^
_`>abcedfghijZklAiifijnmWo&ipqkalc6_cfrAstbc>uDabl+vwfmsHlxcfo&msHi>s lpxijc6d`y_`s `z`{}|`{a~Wc6bBfdjS`Wa
analýzy.
€‚;ƒ6„ƒ…‚ƒ‡†ƒ>ˆ†B‚+‰Š…‹Œ"‚/ƒ…‹ŒHŽŒ"‚*
 ‰C„‘$…W’Œ"ƒˆƒJ‰$“$ƒT…”‚(•C–˜—š™R„†‘G›>•‰&Z•/œŒŸž$ &ƒŒHƒ¡…Ž:¢W‘GŒ£…’B¤eˆD¥§¦B‚Sƒ6„G…Wƒ:Œ"‚ƒ>ˆ*Ž]„†Eƒ]†ƒ&ˆI†*‚+‰Š…¨
ƒ6…©‹Œqª¬«9€‚;ƒ6„ƒ…­AŒU„†E‘G›>•‰Z•§„W‘>‘Œ£ŒŸž$ &ƒŒHƒ"&­ZˆB‰Ž®¥<¯Z†°Ž6±ŒHƒT…&Dª<•†Š‚(*ƒB¤²›³+ ‰ªœ9Š‘q¤ƒ¡›ž‰Ž6&‘Œ
I‘$´W‘œ$ &ƒ‡‚S›ƒµ‘]¦B„ƒM”T‚;¯‚”6‰$‹Ÿ„†‘G›>•‰&°«
Southern blot hybridizácia:
¶š·Z¸B¹º»¼y½˜¾À¿ÂÁÃÄGÅ>ƹ&ÇȟÄ$É»WÄXÁÄÅÃ*ÄWÊË(ÌÎÍÏÊÃËÅ$Ë;Ð&ÑÒË;Ë¸Ä Ð»ºÓÔ»WÄWÆոĻÅÄÆ^Öµ× Ø²Ùq¹ÇIÄÃÑÚÈ Ñ
sekvenciu zhodnú s
Óº>¸BÌTÄWÆÛ¸Ô6¹Ü$Ô»ÒËÔÝÄÓº6¹Ñ®Ü/º»WÞTÍWĽ˜¾š¿ßÁÃBÄÅ>ƹ>ÇZÆáàBâ‡ÊÃeã²äãæå¬ãæÙ¹º6Á/ã+äã çeã‡Øµ¹
¸EÄ$»Wź‡ÁÄ¡ÅÔ6»º®ÇZÆÃEÑÒ6Ë;ËÍÏÊÃËÅËnÐJÆè°Ôx¸éÅÔJ»º®ÇZÆÃBÄܺJ»¼ÈX½˜¾š¿ÎÁÃÄGÅ>ƹ&ÇÄÈ ÙGлºÈHԻчÇÄÙ$ÉTԟ¸EÔ6¹ÜÔ»Ò˺
sondy je komplementárna k
k
¸°Ô6¹ÜÔ»WÒTË˽ê¾é¿
ÁÃÄÅ>ƹ>ÇZÆëºìÈ ÄÉ»WÄ£¹Ä»GíÇ*º®ÇÄܺ®ÌTÙîÉTÔ
ÅÄíBïSÄ
º6ÈxÁïAË;ðBË;¹ÑMÒTËËÄGÓMº6¹Ñ6ܺ»ÞÍÄHñÀíBÁÔÒJËnð*ËAÒJ¹ÞTÍWÄqÁÃ*ÄGÅ>ƹ&ÇZÆ[ã
Sekvenovanie PCR produktu:
½˜¾À¿òÁÃEÄGÅ>ƹ&Ç§È ÄÉ»Ä}ÁÃÔÅQ¸Ô6¹Ü$Ô»Äܺ»·AÈ
»º6¹ï;ÄG»WÄWÜ$º6ÌóÅÄôí*ÁÔÒ6ËÑï;»ÔTÍWÄKÁï;ºJÐ>ÈHËÅ>ÆUº^ÁÄ>ÇÄÈ
¸EÔ6¹$Ü$Ô»Äܺ®ÌCÜ ÃÑÈHÒTËõ¹ÃDÆ/ÍÄÜÔBè:ȟÄGïÔ6¹Æï;ÏÚÖö×"Ø ã÷½˜¾À¿ëÁÃÄGÅ>ƹ&Ç È ÄÉ»Ä^¸Ô6¹Ü$Ô»ÄÜ/º®ÌºBè¡ÁÃ˺TȟÄ
àIÊ$Ô6Ðø»Wº6¹ï;ÄG»Äܺ»ËºYÅÄùÁï;º6Ð&ÈHËAÅ>ÆçÕº6¹ÄtïnË;»ÔÑJÃB»>Æ
¸EÔ6¹$Ü$Ô»ºÓ»¼}ÁÃË;ÈHÞ6ÃÚ¸º^È ûÉ&ÔyÁÄWÆÉMËSÌèEÔÅGÔ»ìÐ
Å>Ü$Ä6èDÜ/ïÑ6¹G»WÄWÜ©ú
È ÄGïÔ6¹Æ/ï+Æ/ÙÁÃBËSÓÄGÈ
primérov, ktorých extenziou
ºJ¹Ä
PCR produkt
vznikol. Jednovláknový PCR produkt, ktorý je pre sekvenovanie lepší ako dvojvláknový,
È ÄÉ&»ÄÐ&·A¸B¹º6ÌTÙêº6¹=¸EºqÁÄÆÉ&Ë èNÔxÜ
reakcii rôzna koncentrácia primérov - tzv. asymetrická PCR.
Ak bude napr. jeden primér 100x koncentrovanejší ako druhý primér, dôjde k prednostnej
syntéze jednovláknovej DNA. Dvojvláknová DNA bude produkovaná len dovtedy, kým sa
»WÔMÜÏ$Ó&Ô6ÃBÁÑîÁÃ*ËnÈHÞ6Ã¡Ü »Ë;ÉíÔBè<¹Ä$»WÒÔ»>ÇÃÑÒË;Ë
z
; z druhého priméra sa potom syntetizuje len jedno
Å>Ü$ÄGÒ6ÍxÜïÑ6¹Ô»Öö×"زÙÁÃBËÓÄGÈèÔÍÄqÈ »WÄ$ɸÇZÜÄ Ãº>¸DÇËSÔ
s
¹º6É&żÈÛÒ6Ϲï;ÄGÈóïAË;»ÔÑ6ûԩã
Okrem uvedených metód analýzy PCR produktu sú vyvinuté aj dalšie, napr. na
princípe monoklonálnych protilátok.
27
Problémy spojené s PCR (troubleshooting guide):
ü[ýBþÿ
qüý
!$#&%!'(&þ )**þ,+-.%(0/þ.%>þ1
2ý34657898:&
"
; =<>=?8@!@A9-&%B)3C
AB)D?8
E/þF+<> ; Gý7HI?&!@
J)*+0K-898:L/
þ94M(!G ; (ý7N/O5
bands),
alebo vznikla šmuha (smear).
P'Q/
þ94
%&þ1
Lý5?810:&G9L/0RQ!Hþ4!'A9
KTS
U
U
V WYX Z[VE\EZ0]^W_V
`aWTbEc?d&ef_gh9d
ibjBeWjTbkY`MW
lJj8bnm
ed4oZbcV
WQpgV
`bdhqjV
`rm
e`rmd&g`,c?sFpV
W7]Cbd
VcDe?d&hMWtucDeWwvj
]>Wo
V
dEcDh9`Mp&d(dc?WxDcDdEpjQy6pJz3WQcDb&{|gh9d
ib&{|eWjTbJk`1W}jCg`ax*c?`Fyt
bcNd&efq]3W}kY~E{vVf
v&d4h9dGm
e?sh1` z€'fh9d'k0{bh9d&plgp
‚Jz`Fy}mdƒWQckQ{bh9d&p'd'„E…‡†
c?W8m
hMdc?jCVjQp`1j8gjV
`1jCm
e‡`9€'ˆ8edEpLv&d4h1jCm
e‡s9h9` z.p
{Jxd
bf
lgV
sFi`FyCc?WTm4h9dEc Z'dL‰…*Š ‹ C
VW0p~d4oEVˆCm
e`€'ˆ8e7{lm
e`Fm
ej8p`Fy_V
dEpˆCm
e`9€(ˆTe3{
€'fh9d$c?WT€Lm4h1fQc Zlg8p
‚Jz`Fy}bd
V
kWVcDe3fk8`,Z@ŒŽ(
VW8b&p&jha`,c?VE‚c?W8€|m4h1fQc‘l’x7bd
VcDe?d&h9dEpjwy“c?W€Lmh1fQc_V
j2jT\j8e”
gdEpd
€•\ˆh9`Cj–j8bcDeWQv&j“mEZe7`9X7`9bdp&jQy"~d
U
U
U
U
U
metódami, ktoré minimalizujú fragmentáciu a tvorbu zlomov (nicks)
U
o
W8VjQc ZejƒTV
f=c?W8mh9dEc?jq]WCm
esh9` zV
s9gbJj0t4jh9W8vd@m
e7s9ha` z.p
{Jx3d&bf
lZm
ejQp`Fy}g€@WV
dEZm
d˜— ‹ C
ƒjxo
WV
jQc Zef0kY`MW™]WCm
es9ha` zo
h9~&‚tjhaW8v&dGm
e7s9ha` z.b
e3fQcDb&{ulYZm
e3jQp`Fy}g€'WYVdZm
d2—Tš4x
ƒjxW8›Ec?W8Vg`1W.]WCm
es9ha` z.b
efQcDb
{ulEœ*Vj3]>€'Cm
eW}o&h9~z`aW=c?W€Lmh1fQcD{Ež.m
e3WYŸ i`Fy¡ƒjx"md˜—w€@`9VJ¢
málo enzýmu alebo Mg2+ j8h1W8vd£o'¤q¥lEg8p
‚Jz`Fy_bd
V
kWVcDe3fk`,Z(c ‚k~c?d@ghMd&i`9W8b@p reakcii (ak sa
¦T§
¨r©>ªJ«J¬
­r®¯­J°>±T²
®ªa³@´JµL¶’·£¸T¯}­r¹J°­rº=¦8§
¨[©>ª » ¼8½6¾J¿
ÀrÁÂÀJÃÄTÅ
ÁÆaÇÉÈËÊ 2+ !)
U
U
Vzniklo mnoho produktov:
Ì
ÿ
Í
ÎÏ9Ð9ÑNÒ6ÓÔ Õ Ö£×8Ø
ÙÚ9Û&ÜÝrÞß
à9áâß
ãaâ(äÛåQæ çè×8ØÙÚ9Û&Üèé@ê
áâ(Þé@âßJëã ì íî4ï0ðQñóò
ðô7íðõöa÷Dö1õø&ù&õYú–í
ûî4üýøñDîEþ
(pásov)
"!#$&%'
()*'!,+
-./01-"23154687 9 :<;>=?@ACBEDBFGHJI
„touchdown“ PCR, ktorá výrazne zvyšuje špecifitu reakcie. Pri touchdown PCR sa na
K
K
=&LMH=NBO
=PQ=RSUTH@OBV WXZY[\W^]X_a`8bcdegf
hijkl mnponrq8stuwv)x
vyššou teplotou naviazania primérov ako sa
y"z{|ry}5~€z{|‚{ƒ„…}{|†€‡ˆ‰$„ŠŒ‹Q‰Žy‘’ˆ}“”•y"€}E…–ˆ˜—~–{‰
produktu, lebo je vysoká teplota naviazania. V ™š
ˆ
š
€‰
š
‡
š
ˆ‰
‡’ˆ}“‰$…ª€
š
~‰}€ ¡„y•}Šž‡
š¢
–£‡~–›
™
}'”y
š
fického
…"—8›{|œ{&ƒ„^…}^{|œ”žˆ‰“—}‹5y–~…}ryŸ}‹
y•}ˆzZ€z¤
š
“}„¥¦”
š
ˆ
š
y–§~^…Šy– ¨„y•}z©”
š
prvých („teplejších“) cykloch tvorí špecifický produkt (templát pre špecifický
produkt je v nadbytku oproti iným templátom). Príklad
28
touchdown
«­¬¯®±°²³U°´µ¶³Ž·¸
¹rºC»¼½¿¾&ÀÂÁwÃÀÄÅÆC¾Ç)¾ÈÉÅ»CºÊUËMÌÍ̹ÀÎÀ8¼ÏÎÌÐËÌѽÌûÉÓÒÕÔ\Ö×±¾È\É^Å»ºÙØ
naviazaním primérov pri
70 Ú C nasledované 3-5 cyklami s naviazaním pri 65 Ú C a potom 25-35 cyklov s naviazaním
primérov pri 60 Ú C
ÎÀ&ºÇ»^¹ÎÜÝÄͽ$ÞÜÍ8ÈßÒrËÞUÀν,àáÄͽÞÜÍ8È
Û
Û
kontaminácia
Vznikla šmuha:
Û
ÄÍ⎟㭺CÀräwÌá¾ÈÉ^Å»ºÓÒrËÎâå½,àáÄ»ÑÀÃæ¾È\ÉÅ»Cº»ÔÖ×
Û
ÄÍ⮟ãªÎâËÉçÌá¹ÀÎÌwÃ"èÍÌÑÎéêÃÀÄ^Å»ÃÌÒ˺Æçã½à
ð
óü
öù’ù÷
÷ôCòþ¿ùŽö÷Uöô§û^þ
ö 'ó!÷rö•ü"Cþ#ò$ %&!')(+*-,/.0,"123!(+4$,/.65''7!'89:<;&!;2=7!>)(+*?'@'%0,A81CB'D38E1)F)*+G,"*IH
ëìîí ï
C
ñòóªôõöô÷\ørùô­úôÝûüýþ¿ù"ÿ þ
J
templátovú DNA
Z
K"LM?KNPORQ!SUT!VWNOYX touchdown PCR“
Z
príliš vysoká koncentrácia enzýmu, alebo Mg2+ [W\)]^ VWNIO_L!S
Z
Q d ^#h jN ilk acm$nob"ap Q h eCb @
T k Ed a)n L ` N+N [c\)]^ VWNIOq ra g S p@] SVK b kS
]`)a)]cbAdEe)` NT b/f`)gWb S )\ h S VWN a L
kontaminácia
Pravidlá pre prácu v PCR laboratóriu:
Technika pipetovania:
Pri pipetovaní PCR reakcie sa pracuje s k
p@v V a k fwdxn\c]Ua SUkUQ Ih y k ] NIO_k f K haWz SL [
Z
Z
Z
L n V z M dEa)n{!a]U` NIT
d S \$b SL y|bAda t n}]n
K"L!S ]WbAd S h Sk n Os)N
bAda t n
O n)g Sk
]!n kS
aWmCp N psn)hPf!p NlStq arpsn)p Nu?Q d aCb S b"a<`g] N#L n Q!NIQ Ca b S k n ] N n
Q d a)z QST!V)N b"^#p Q dEarp N a i n O
n O z S~iQNPL y Q!S p@n)hy€n kUV zUy K L!S ]cbAd S h Sk n O rNq a}d S \Cb SL|kiQ!N#L a
] L n qCiES p Q!SUk d`)g T‚iQ!NL y6]!a\ SƒK "b nh N \ k y iL y„d S \$b SLT…u n L e] S„S z K bAde] N-O
Z
Z
ich
Q d N Q d N ze k n)]^?z S d S \b SLTQS ] S d NOsiQ!NLT…uƒk yWb"h+n rNIO@Q d N z!e k n)] M da)n{!a]!` NT n SQ hPe)`)g] TO0i"Q†NLT
]UnCb N nrg] T b^#p‡n k yWbhn  a)]^pˆd S \$b SLT ] N a L!S m L!SL dexb
Q!ST!V ^ k n O bA\ kƒ‰ŠX master mix‹ [Œn LK nŽd St ^ k!N n)`~‘Œ’“da)n L ` N ^•”jb ‰ q$‰–k!N n)` KLM p—n k!N a L˜ \Wh SV)L y
K"Q!S h S! ]™ Q da k…i aCb L y KLM psn kUL y„bAda t n—]Un Q!NQ a$b SUk n O š›œš!<žcŸ›† ¡›¢£¥¤) —¤¦š jednej skúmavke,
§ ›c¨j› ©¨"¤ªc¨j›— @«c¬A¨"¤­Œ @®I¯6°±²!³#«)°ª¤ § ­¤) ¦®¤Ÿ«$´Wµ†­E›¶W°¤³®I´D°›£¥¤)°ªU›U¨A³#®Iš!·!¸)¹Ž¬"²º s«š!®¤²6« § ›c¨A› 29
»¼½#¾¿CÀ ÁÂ~Ã"ÄÅ!ƗÇÈ!ÉÊÄ0ËÌ!Ê<ÍrÉÎÉÍ)Ä!Ï}ÐWÑ#ÂÒ)ÄÓDÔjÕ"Ê)ÆÌ!ÑÖCÕ?×_Ø@ÙYÚÌÛ"ÉÆsÏÛÓwÜ$Ý)ÞÛàßáÌÛÇCÈ!Ââ0ÆDÇcÃÕ"ÊÛãƦÉIäwâåÃ¥Ç
æ
zmenšuje chyba pri pipetovaní
ÈUÒWÁUӜÌÛàÉáÌÛÇÈ!ÉPç~Çè|é!Êê!Ç$ÕßIÈ!écâ‚Ä!ÂécÕAÛ"ÂÑ-â…ÚëÕ¥Ý è ÝëéUÇrÆsÉÊcÃÕ"ÂåÕAÊÆÌ!ÑÖCÕ/âì×_Ø@ÙíÌÛ"É#Á†Ç$ç6ÛÂUÈUéÇÄîïÂUðè¥Ê)Æ
ñ òóõôöl÷ø ù)úù)ûüUýwþ ÿ úþsù)ûUýcúó!ú
Wó#ù!þ)ú ñò ùúû
ú"ù@ó#ú)ó+ó"!$#%'&¥þ()*+)ú,-oñ)ó.
ïù/&—ñýcó0/12!ú3úAò/û.4û#ó56þòþ)úó2879…ú:!ù)úóù
vody;
reagencií
;
;
ñ12!ù
<"ñ!þ)ó9)û#ú'=ìñòEþ?>A@CBED/þóúó#ý6ù)úFCGH"þòó#û+ó#ý!ù)úI7Aó+û.Aò-róJ6FCG deklarovanou
úUþñò 1.K=@6ú LG
MONPý Q
ù BRNSý TU!VNsþñ 12…Wù Wù )=Xû !ù)ú F ñòþYWþ ñ!ùòEù
v Uù K=û Z
þ +4W[
þ !úóþ GH
Oú "\ù @ó#ú!ù)ú ó#ú ]óIÿ &/F)þ^>A@CB
ò-þ 6Wù 'ýWúó ù)þò Gû _ò W`)þú Aòó 7):-róJ6 G/Fsù !ó+aþ *ý òó#þ ñòEþbcòþú1+
GKsù còWù _
ñ @ù)û GKsù còWù _úU%
ù d¦úU/ù &/òWù .ó eÿ ñ 12!ù '"ñ†Xó d G 7ó.û Aòù —ó fò ,~ýrùCÿòù gh-ikjmlnopqrspq2h_sonktLukt=vtwIpsxrtpqoy{zPqrntlq2loW|}~
;
;

ƒ
lqX€r}+po-sWh|Kt=rvJ-w=t6wFsU‚
¬
„ …S†A‡‰ˆŠ/‹„Œ=ŽW ‘“’”•–—˜J”™K”š›”8œ’”-šKœžŸšH™K”› ¡
¨©6ª •ž-«Y” Taq polymeráza (aj iné) rozkladá dNTP
’k”•–—˜X”¢'£”¤‘¥•£2–•£9˜X—–¦Vœ§+¢
–™)‘=’k¦
­®°¯­“±²³´µ ¶¸·º¹O»P¼½±²¾2¿ÀS·ÁÂíP¯ÅÄÇÆ2·È²É³®¾9·-Â\Ã\²6Ê=²6³Ë­®Ìµ2ʵ.ÌK²³ËÍHÎ proofreading“), je nutné
Ï
Ï
Ï
­WÐf¶³ ²+Á·­®Ñaµ·[±²L¯¾J· ÉÒFÓ¾·Ô²ÕÊ neprítomnosti dNTP degraduje svojou exonukleázovou
aktivitou templát a priméry
Öº×ØÙKÚÛ+ÜØÝÞÜ9Ú%Ú%Úaß×^àá/àfâÚãäÝØÜ2åæ
çRèéêUëêìí%îPïðêñòKóì+ôñõöôX÷ì+øùúüûýÿþóûêéóWò=é/ñ6÷Hòê2ý½ó
êúù=ó\ñ
óéôXóè÷ñô9÷
éô
ék÷H òé/ô ð
ñ ìSôb÷ñìSóìPô
predošlej príprave DNA (izolácia plazmidu, štiepenie DNA s
ðé2 ùê
õ ðêñòKóaì ôñõöôXó
cross-contamination) medzi vzorkami a produktami predošlej PCR
óì9 ô/ ôðFõöô9÷ îSó óì+÷è ÷ñôX÷[ðêñòKóì+ô ñõ-ö\ôX÷ ë¸÷ êòé÷Wûñ%èêèéKùóWþ[úé!ô.ò" éó#ôXèXõ
êèè÷%ô2þ òé/ô&éóöêñÕì+ôX÷òKóHì+ôX÷Hòñ6ê'ò/ô(Ÿó ðóùè)ÿýûFó%ô2þ*
$
vlastnou sadou pipiet, ktoré sa
êúù+ó/ë-,.X÷ñ* ë¸÷èñ÷/ë5ìPôX÷òñêHòô/102 ì+ôX÷òñêHþSñó3ééó4ú.õkê6ûñ=ö5{éêWò)ê=ð6êËó ì?óòK÷é
mixov (zákaz práce s DNA a RNA, okrem primérov), 2
ì+ôX÷Hòñ6ê'þ'ñ6ó6ééó%ú7êé/ôX÷ð
$
pre PCR - izolácia DNA, RNA, zmiešanie vzorky s master mixom (zákaz práce s PCR
éêèúðòKóaì ô8 ó/ë ðêñ6ê=óñìPô“ñó%é4 ó%ìSô9èêö%5:9½ì ôX÷òñêHþ ñ6óúìSô9÷2Hòñ÷ñôX÷
termocykléru a ELFO
é÷-ó%
; ÷ñöôX÷ é÷=<?>A@ì+ó/ë-,Pûýÿþ/ðXóèêóñ miestn
30
ê'ò/ô02
B
CDEF+GHI%JLK/EMI#HNPO+QLI CKNCKR+O+NSNPO+TVU+I2WYX"D3Z[Q\NJ
B
CKNCKGCKI#H&Q K!Q+I%]Q%\ONPGP^_MXD_K`aCb4cdEedD[f?gAhiKQ+IjMO%NPQ)CDEF+GHI%JkcQ+d\DKR%l2DH`W-Mm&ZnIoHM_p3qYMX"DK`
nikdy neprišli do styku s DNA alebo RNA)
B
I#EXD_Mr8RoH_DH_I%J
KQ+I%]Qj\ONPQ+^sMX/DK`tZVDF+\D
I#EX/DMrPR%HDHI4J
q/CKuNZn`%K-p^vd+w*xyf?^:CDrpZ*QjKR%l%E
W!IZ[D_l+K!Q!cZnQL\Q+ZVDF\D*I#EXD_Mr8RoH_DH_I#Joz
B
CDEF+GHI%J{"CSNPU%Mp|W filtrom, najmä v Z*NPQWYX/\D'W/X-NU}~2}
€
I%KNIodSQ+\NPQMD\X"IjZ3N\D_HI+\`iW6‚ƒw*„…quWYX"Drp^[CNC&Q#X†p&}}‡}ˆz‰Z[D_F+\DŠdQjMD_\2X"I%ZVN‡\D_HI4JidQ%CEKN\R+O+NDE?‹
povrchy sa ošetria s 1N HCl, následne s 1N NaOH a potom sa neutralizujú s neutrálnym
tlmivým roztokom (napr. 0,05M Tris-HCl, alebo tlmivý fyziologický roztok PBS: 0,02%
KH2PO4, 0,06% Na2HPO4, 0,02% KCl, 0,8 % NaCl ) a nakoniec opláchnu s vodou.
V CK!I%MX/NO%MDSZ
O#HNPU2Q\G W!IŒE&dQŽIZVCrN-NMDHI%Jm‘W!Q%Msl génu ktorý je naklonovaný v
plazmide. Ako templát do PCR W!I6CDEF+N c’Q“X"Q%\XDK!Q%MDZŒN‡\D_HI+\”•CrIjlZnNPdI–IjMD—CK-NZn`%K-p
W’I
CDEF+N c-m
DrN‡]D\EMrPQ+DX/Ndp MDZCrPQZnQ+\X"RjK-\Q ME MDSd˜_\DH_`ZE
q/KQ#HQjK™WQ CKuNZnQ%K-z!^ KQW-C‘}
š%›2œ-(žŸS ¡›Ÿ¢£+¤¦¥¨§-©/ŸªY«[š%ª Š¬ª-¤V­jª-®–¢¯P°%ž›¥²±ƒ³*´Vµ¦¶·ª-¸¹œ"Ÿ¤V›ŸºY»¼ªŸ½+¬Ÿ½+›°o¢_š+¾+P­¿ŸÀ¤VP­ºYœ"ši¬ª­
ª­2ºYœ/ª-žÁ+›Ân­+›½Â¤Ã›šLš+¤V¬¯©-žŸ¢_š+›­!Ä1º’­jž_¢_­›¾+‘ºš=¢Å¥Æ2 ę­ ¬ªš+›š+¯Â½­=¶?ÇkÈɬªŸ ¥žœ†¥'µ
PCR v objeme 50 µl
Ê[˦ÌÎÍAϼÐ-ÑÒ&ÓVÔ%ÕÑÖnË×+ØÔ+ÙoÚØÚ-ÛÝÜ%Õ×Ë_Þ-ÑÔjßLàSáàÚ4â†ã+ÛÚ+ÓnÚ=Õ
ä
tomto poradí:
åæ|çSèé"êë2ìíPî+èïë-ðòñ_óSôõVö÷Ýôë%øèù%úóñù+ïóûnïë%êúü¹ý"óþVïó÷Yÿóûnï2ûøSèPë+î
5 µl 10x koncentrovaného PCR tlmivého roztoku (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH
8,3) – výsledná koncentrácia v reakcii bude 50 mM KCl a 10 mM Tris-HCl.
4 µl 25 mM MgCl2 – výsledná koncentrácia v reakcii bude 2 mM MgCl2
1 µl dATP (roztok 10 Mm) - výsledná koncentrácia v reakcii bude 200 µM
1 µl dTTP (roztok 10 Mm) - výsledná koncentrácia v reakcii bude 200 µM
1 µl dGTP (roztok 10 Mm) - výsledná koncentrácia v reakcii bude 200 µM
1 µl dCTP (roztok 10 Mm) - výsledná koncentrácia v reakcii bude 200 µM
2,5 µl forward priméru (roztok 10 µM) – výsledná koncentrácia v reakcii bude 0,5 µM
2,5 µl reverse priméru (roztok 10 µM) – výsledná koncentrácia v reakcii bude 0,5 µM
1 µl Taq DNA polymeráza (konc. 1,25 U/µl)
1 µl vzorky, t.j. roztoku rekombinovaného plazmidu (konc. 1ng/µl)
ó ô2úYûë-ð÷-ø&þnù%ñøõ•óoïù
2ë+ïë-ð%øóïý/úóèù|êíê&ë#ý†ûjðë2þ*ë*ý/íë6í†÷/ý2èó+øõkùè8ë6ïù+þ*íPë÷/ý"ó çSè
ñ2ó_ú"ø_õnêúíôî+þnëVçèSñóôõ‘ù%øó|ïëù#ý/üñïû øóïý/ú"ó_è¹ûLø ïë+ôjðôëêó
+ù2÷aêúî+ì+ëøû øóïý"ù%þVíïî+ì+íí 31
v !"$#%!&(')*,+.-0/)"1'2-43"5!6/&7$8:9<;=-0>"?3A@7B&>DC)<!FEHGI-+:;J"'%!& postupného pipetovania do dvoch
')*,+I-/;J")KL+.&9<3&
@7$;M@72-/;MNO3-$#P@7$/
'@&Q &R3D*
>D/&#23T'2&U3VW&U#F"?+
/YX2"5!Z)V[\ASDQ]&9<;J")K^&)72"+
S<+I"D'2K
master mix, kde sa napipetuje
/S<&7$)_a`Z72"D'$@YEb/&>D_W@7B"1)&3D!Z7&Q 3D*c72"-)[;dCe2K
potom sa „master mix“ rozpipetuje po 49 µl do dvoch skúmaviek a pridá sa 1µl vzorky, alebo
vody.
f
"-)R3ghS<+I"D'2;,/ obidvoch skúmav)T[\:@72")7$_i#F"+I"h)/-@)&Cj+k; 3"7BT?Q 3"\&^&Q "$#F-l-h/Q &9<8=+I"
>&!"7$+.&[_m)QJg7B-Kn)>"^3"[\T+I"^@72"U"\3D*N oqpsrutvDwx6y<z{|t}~€yx {Zt{ƒ‚…„vDwB{|}~€†2{‡%ˆJx {~Š‰
‹ŒŽ 5Œ‘’k“”‘56•–2’0—?Ž]k˜™ š ›œ‹Œ0D:žbŸ:Ž ‘ Z¡¢£‘2¤=”0“Œ¥?‘¦¨§©ª—¡m«¤=ŸIŽ¬
týmito parametrami:
denaturácia 94 š ­®¯°0±D²¨³µ´k¶ ·¸¹Zº»£·±¼¶J±?½?±?·¶J¾:®¿P¶ ´IÀ¿2¯¼ÂÁmÃÄ$ÅÃ Æ ­AÇ%®¯ÈÉi±²B¾Ê¼¾·Ë?¶J¾¨®¿2¶ ´IÀ¿2¯¼Ì
ÍÎÏÐDѵÒbÓ:Ô ÕÖ×6ØÙ£ÚÛ×ÚÕmÜ<Ô=Ð:ÝÞ ß àœÍÎÏÐ<Ñ:Òá%ÞÓ:Ô ÕÖ×ãâ%ÍÎäåiÐ:ä æ çèéªêë:ìíJî=ï$î èðñêòóôðªìõ$ðöD÷èDø6÷ùûú
÷èðòüýòþ,ÿéèíM÷
po
ìðüêbë:î òøqê ìðDøZðë ochladenie na 12 C.
Analýza PCR produktu
Agarózová elektroforéza
Z èêç?öý
õ2ý0êèî=ý6ñ<ðõ$èê^èðòDø õ$ðíJêù
ðömð õ2ê"!#$ìðö(ðí ýFê%$'&
- ./- 012.3465789:8<;*=>8?@BACD)CEGFIHKJ92LMON5-8P)8QR0SMO8T90DVUCH
(,í)ìõ2î öê*!+
,(,í
W.3X7.'92L<;/.XYO.ZQP)8[I4]\^T8Z_2.MO?`aEH
X. b.'92L<;c8QdX7 8ebdP]@gf<hi8ZQ5cTj ._*15_g_k./MO?`eQPl8<[I4m\n1o=:.'-T.X92TSW fragmentami hqpsrt;I- 0/Mu5_vQ5Ijw?8GWo=>4xf
y{zs|}2~"<~X€‚ƒ:„…~†6~X‡ƒ>}:z<ˆ>z}2‰XŠ‹ŒŽO‘>’“•”2–G|}2~XŠc}—)~"˜ ™š›sœž%Ÿo <¡"¢£lš<¤n¥G¦‘§ž¨2¡O©/¤O™£«ª)¬ª)§­®ª6©°¯…Ÿ™R¡±2²­³
v dráhe vzorky bude DNA s
druhý). V
š´c©X§­" R©²šµS ¡c¶w§š·Ÿ>¸Išµº¹Ÿ2¡X§ <¡X²®ª6©i»q¼s¦½š›°¨2¡›²¾¿šS™Àª)¤u¾XÀ2©O™š
›À2­X¿¡S² ¡XÁ©"¢:Âl ² ¡¨Ã§š²¢>À:š£lÄaÅÄƲ¡¤u©£ÇÅĸÉȪ6©I›¡²a™À2š›µ§I¢>³Ê£)¡²a™ÀŽª)¤u¾XÀÄa £)šÈ¡/²
reakcie.
Štiepenie s
é do
À2¡IŸo¢>À2ªm§´²Ë¤+¡²Ì/ˤiš¤
ÌI©'¿À2ª6©"¸ Î2ÏcÐXÑÒÓÔºÕIÖsÏIוØxÙÛÚÜÞÝßÓÐáàâ ã ÚåäæÒcÐ×OçSÖOè)ÓÔé:êÓÐeè)Ó ÐXÑéèmë<ìíèlîÆäæ<ïmðÖuÏXÎ2ì'Õ/ð<êäæé>æÖ
Í
Ó ÏíñÐ"òvë<æó*ÓϑæíXñï6Ðôèlò
õ
æôæöÎ2Ð*òn÷'ønùïÕ Î2ÏcÐXÑÒÓÏúÕIÖuÏ×2èôæOÓæëÏúÇ×:ÑÔGÖuÐXëÑð
õ
k 10 µl odobratým z
õ
äÎ2è)ôÐ"ò÷Î2Ï×>éxÎè ÑGÒÓñ æsÏXÓÕ
֕î
õ
è)ÓÑîöæëÐ"ò÷Çñ æôè)ÓîuäÎ2è ã
õ
ÐXÓ Ðï ðÕ/æ ëRÐ"òqÓБÐÐXÎÕcæ ë<ÏúüÏï6ÏXÑé>Î2æ>æÎXÕIÏ
Î2ÏÐXÑRÒÓÏú‘ÕIÖsÏ×2èÛäÎ2è6ôÐ"òa÷'øaùGïüûôæG×2æó*æ
vacieho” roztoku, ktorý upraví
ÑæÓíÏ'Óé>Î2ìíè]îá×æï)ý<ëOÎÏÐXÑíè«èÓÐÇé:ÐXÑÔRêÑéþæ<Îìÿú2ϑæäé>è)Ösì'ï«ÓÐväÎ2Ïväæîè]é•
ÎÏ×oé>Îè ÑÒ/ÓÃÏ/ÓÕÖ
C
Ñáäæxé>è6ÏXäÏÓýÿëÕIÓè)ÑÓÔ xÎ2ÐÖuÏ/ÓIéoðÉæÒÐXÑì*ëÐÓÏú‘ëÏówÑæG×oé>è)êú2ϕé:æeäæéxë Î2ôÏXÓè6ÏZ×:äÎ2ìXëÓæG×oé>è
PCR produktu.
32
Analýza DNA sekvencií pomocou PC
!"$#&%(')*+'),-.
.%$('!%%/0)01*2#3%54768*79;:<!=>%5'),>?*@%-;ACB".
EDF-0HG(#I8BJ%/
KLMN(OQPSR&TVU
WIXY(O3MYZ>LMT)L[\^].O`_aLbP2O3YZ>MLMcdMe>fghL>iMLdRj_kfLHl5m5L
M.Y.m2RMT)Lbnoqp3[srUW.Y5XM.Ytfu
fLlmLMYmRMT)RnovpQwxy_z[{P|}7LMT)L~XY5|R7iT!RM>Pl(g)LYxT!iYm€m študovanom fragmente DNA, je
základom moderných génových manipulácií a bez znalostí sekvencie DNA je prakticky
MLO3YZ8M.cPsfjlPxJY}MT?ukM.e|Y}MLj_ƒ‚„T)L…KcMYmckO3RMT!XP+g)eU>T)L[
Pri analýze DNA sekvencií sa s m5L†„lY.P‡m].WYi Y.P‡mˆ‰PZ>ŠVm2Rj_j‹ŒXY(}ŠxJR7}L[dŽY(}HŠxJR}Ym‹
RMRg].‘Pnovp’f;Ll5m2LM.U
T)Š“O&Y5Z>MY”|jY‘>iLg!T?u•iY~i8m5Y(UHW~‚–xJeiT!ŠF[s— X|–m5Y5O$f;RvXY(}ŠxJR}7LqmˆPZ>Š?m2R;_j‹
pri získavaní a kompilovaní údajov o sekvenciách dlhších úsekov DNA. Pomocou
špeciálnych programov sa porovnávajú sekvencie získané v jedM.Y.xJg!TVm]UW€f;Llm2L
M.}M]UW
LC˜XL|T)OvLM>xJY(UW.w™mˆ.W†HRiemRj_j‹
f;RšX|;Ll|jˆ8xJT!R
R›lY5OœX(T)gVP
_;‹
fR
f;LlmLMUT)L
‘>ŠFfjl2RMc
‘
Y
žŸ ž¡¢ £¡¤)£$Ÿ¢5¥œ¦(§)ž¥Iž
¡>¨J©ªj¡«5¬
­• §h©Ÿž¡+®s¯ƒžv°
£C±²>³ s£¡´¥$¦ª;£7 ¤)µ§!¢(¥3¶²>ž·¦ª¤¸žŸ ž¡.¢. 5£
¡³
£±ª¹ƒ±ºž»žŸ ž¡¬¤)£¼¢.½5¢(¬H­` §)©Ÿž¡¿¾¨F±2µ¢. 5£¡À­¢ÂÁFª£Ã2¥vž¡>¨F±2¶q¹H¢Â¦¢¥3©­£Ä ´‰ª£°8¡.žÄ°¡³!²>¤?Å
¥q¡.¢5²¨F ¢¼¬­´‰½Ä sekvencii. V µª–±­.žjºÆ¹£–¨¤V¶{ §)£–¨¡žjºI£¡£§´°
žSÇÈvÉ@;žŸ ž¡¬¤h³)¶k¥3ʲ>žË½«‰Å
získaná sekvencia analyzovaná z ¥q¡.¢5­´5¬­q­.Ì£7µ5³FjŸÍ
1. ÉΡ.£
§!«°±7ºaž€a£Ï ´2Ÿ5«>¨• +¾ažC¨Ÿ´5¬­Â°¡©¥q«5¬­Âªž8–¨ª¤?Ÿ¹¡´5¬­‡¥q¤)ž–¨J¶Æ¹H³¥ °>³FjŸ£¥IžÑЦ§!¡ÐŒ£
¦ªž8j¡>ÐIªž8–¨ªJ¤?Ÿ+¹¡>ÐÆ¥3£¦±2¶Ÿ¨¢ª©sº„ž…°
©Ÿ(§V£µ¢(¥Â¦ªž ÒÓÔFÕaÖV×ÙØ3ÓÚÖ!Û×+Ô)Ü>ÝÖVוÞàßá3â3ã
2. âÎÚ.Ó
Ô!äå×7æaç’ÞaÓéèê2Þë5ä>ìíìJÓëê.ÝîðïçHñ×+Ô)ÓòÚêÝîóçÔhçØIçÚ8ìJôèõöÓëôEޖ÷EÛïjÖVÓ
ØIçŒÓ’ôøïÜCìJçHÚù
opakovania a vlásenkové (stem-loop) štruktúry.
3. Získa sa a analyzuje sekvencia potenciálneho polypeptidu kódovaného daným úsekom
ßká3â3ã&úïûìJôØdÚô+ޖüþý5Ô!îùîô‡ô8ìFè5ô5ïçHÚùî.ôÿò
ûyìJÓÝÖ!çîô’ïÜØIÝ>ÓÂÛô8ìôØ ÚÓå>Ú.ÓòC×7æ„ç Ø3ô Ú.ôtÞü
existencie proteínu kódovaného týmto fragmentom DNA
4. Samotná DNA sekvencia, alebo dedukované sekvencie polypeptidov sa porovnajú so
známymi
sekvenciami
v !
"#$&%
%('
%!
%!)*%
'
%!%)&!+,.-/012%%('0(3546/78/$&-')9%::4
.;.)<=%!;%.>)*%@?=%!A&0BC3<
%D
neexistuje významná homológia na úrovni DNA sekvencie.
E
5)F7G%HI)J.;/7KL=%!;%>.)97G)F7K"M(0N;.HI)O4PQ; princípe dvoma spôsobmi,
0DR
;
%!'
%>I0S%;
$T4)&0S$9%!U!
2"$&%U%V
)W%>.)9%X?
/$&
Y!+2?%!./0Z
V !MI7,?A[?%\;^]!_?
.#P`%!;
%
)&AaH.7b%
G=3c?
/.#PK;
$9I55Aabd90)&A5
33
Rozsah dostupných sekvencií je v ef.ghfgCijekl
g8m
nKop!qr`s
gtuqr
vwnIgKfpKxIy!q
z9p{eg}|
k
ek.l.fk~5o
~g!qs
gf€*!i‚gFƒKknIf.„Js…†h&fkmKm
‡†‰ˆjŠ9mfq
€[m`~g!qs
gf.ksp!fr
€‹KŠW‡p!Œ
ƒbgfIok.s\JŽKK
 poplpfq‘’fm
q
z*gko&ek.sr€‹’k/esk/eg(fr
€‹“|‡kog(Of.k.s
r
€‹<~=g!qsgf€9F~5”’sk/tfg_|‡9~oWm
|f„
8
•–!—R˜™˜<˜
š›*–œ.Ÿž ›*•>¡£¢¤¥¦§–!¢
¨/§¨© .–ª ¥C«¬
¨/­K®¨¤5¯ .–5«u°›*¥ª¥± ¥C«‚²¥>¡°›*–ª¢¤³9š5¯W´
¢ .µ¶«‚–
v s·#¸ ¥š .–C«’§¨©
– GenBank¹
dostupná na adrese http://www4.ncbi.nlm.nih.gov. Obsah
tejto databázy je prístupný aj cez E-mail server (retrieve@ncbi.nlm.nih.gov). Okrem tejto
º»¼»½¾!¿À’Á‚ÂNÃ.»ÅÄ<Ä<Ä ÆÇÉÈ*Ê5¼WË
ÆÃÌSÍÂÎOÌ2Ç=»ºÏ½
ЉÑ/Î&ÑÒ/Ð*Í!ÓÌÍ>Ô2º
»¼»½¾!¿IÕK¿I»!Ô Ö×.Ø=ÙCÚÛÜbÝÞ=Ø!ßàÜ*Û!ßá
všetky aspekty molekulárnej biológie a genetiky.
âãåä ØæàWçß
ØFÝÞ ãè ÞØ!é ãê
ëìã}ê áíØ ê
îï Ü*ØðÝ ãñ
òIó‰ê Ø ïëìã ÝÞCÜØ ï ØôOç.õ î÷öFøbù2äî ß ê
îï Û>Ü ó*ú à !î ï à ã Ù î
ê
ûüý Ü ï ãñ
ÝÞ ã
þñ ß ãê Ø ï ç
ï Øÿß ã é î Þ üïî ÙUí!õ î{ú àØ!ß òIî
õ 9ó ä ß Ø ï Ü î9ñï ß üïëìã
ã è Þ Ø!é ñ
ÝÞ Ùî
ê ãuïî
ÝÞ ãè ÞØ!é ãê
ú Iß à ã Þ ë ä Ú mála “freeware
õ ó ÛÜ&Ü ú àÞ î íØ ä Ý ã é îï Ú !#"%$&'(')+*,"-.0/
k dispo
roku 1989. Tento
1 2342576 897:<;13=>3?1972@5A7BC6 DEFDHGI96J36 K,L&MONJLQPJR modernejších programov, ktoré
pracujú pod systémom Windows95 je to BioEdit autora Halla z 2I3STVU+WW'XPZY[9(\]6_^
ü Ø ä à ã ßÞà
êî é}Ü Ü ï Ø ï
üïîRï !Þ ã
ü!ïî
3`DI3:BC6>12342576J3'6bac9_5a VNTI-Viewer, ktorý názorným grafickým spôsobom zobrazuje
dáta získané z dfeg<hjigklImonjprq?stue0vxw?y{z<v|}s~|~@i7€J|}gte7kvI|~Hw?y{zƒ‚„i…x†‡ˆyz&‰_i+k|ŠiH‹Œe{€O|
e7~IŽteZ€Jg|zwyzk|'€Je+~gwyzs~|~i7€J|‘€J|’g&|“Ž‡”ki–•—ye7Ž™˜š˜›˜
”te(•œŽ
niektorého zo
serverov zameraných na biologické vedy. Najznámejšie sú tieto servery: IUBIO
(www.bio.indiana.edu) a EBI (Europen Bioinformatics Institute, www.ebi.ac.uk). Mnohé
z programov potrebných pri génových manipuláciach sú dostupné aj on line vo WWW
sieti. Z gtyz›€J|’g&|ƒ” s|?€Oe{g<'• Web cutter žH~e<”Hv~tŸkg& ¡i7g&i{…uwŽi¡Žg €¢e‹¤£j¥¤¦§”@e7k?oeg&y{te‰
http://www.medkem.gu.se/cutter/), Fragment sizer ž¨ws|e–v}?e©]k|`”vt#ªx~i7€¤eg<vI|&«gi
základe ich pohyblivosti v géloch, http://www.basic.nwu.edu/biotools/sizecalc.html),
MIT Primer 3 (návrh optimálnych oligonukleotidových primérov pre PCR analýzu,
zvxvs­¬ ®¯®°f°°±n ²?i”tyn³g°f´­nµeŒ´®²tu|vI||?…ˆ”®xs~tˆ€¢e7~@¶Fn·z<v€J…Ÿ¸¹nQºJ†e|²e(y{gws~ez©iŒ»| on line ”I…¼´o’{²? yz
s~e
€J|'…ue+k´F… 7~g´
²tu|'…½q?tŸ´
i
¾g|¾
€Jigt¯s´o… yte
€¢|?’(g|
g&i@‹”•
g&i
”@e7~e7~t
http://www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html. Vývoj v tejto oblasti však
gi7s~@eŒ´‹ce%e©€¤t~w?y{z…½|¤ij|²+‹i7´(‹@œ”@if”HvI …uejg|¾%e7~e‹ge%s~‡ˆ”Hvx´sg&¾jŒi–vIi–²? 7Žm¤t¿”…Ÿ´’²mFn
34
ÀÁÂ&ÃÅÄÆ{ÇQÈÉËÊ¿ÄÌoÍ{ίÏ@ÐÒÑÔÓίÏÐ<Õ+ÈÏÖ×Õ]Ø
Alberts, B. a kol.: Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing Inc. New York, 1994.
Bernard, P., Gabant, P., Bahassi, El M., Couturier, M.: Positive-selection vectors using the F
plasmid ccdB killer gene. Gene 148, 71-74, 1994.
Bolivar, F., Rodríguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heyneker, H.L., Boyer, H.W.,
Brown, T.A.: Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall, 1995.
Crosa, J.H., Falkow, S.: Construction and characterization of new cloning vehicles, II. A
multipurpose cloning system. Gene 2, 95-113, 1977.
Davies, L.G., Dibner, M.D., Battey, J.F.: Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New
York, 1986.
Ù­ÚÛIÚ7ÜÝޟß&à{ášâ³à'ãß&ä–Ûß&å7àæçâ³àå„ßèéxâuê–æ-ëŸèì7í&Ú7îJëuì7ßïðé½å–ñ&èÛå¹ò¨óÛHÜÚÔîJÚ¹ò¨óôõ&àöféu÷å+àæÔÛå]òëˆøéuåùå+à×úû?ü¿ú(â
Glover, D.M.: DNA Cloning, a practical approach, Oxford, 1985.
Javorský, P., Vanát, I.: Deoxyribonuclease activity in Streptococcus bovis. Lett.Appl. Microbiol.,
14, 108-110, 1992.
Levy, J., Campbell, J.J.R., Blackbum, T.H.: Introductory Microbiology, John Wiley, New York,
1973.
Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1982.
Old, R.W., Primrose, S.B: Principles of Gene Manipulation, an Introduction to Genetic
Enginering, 3rd. ed. Oxford, 1985.
PCR applications manual, Boehringer Mannheim, 1995.
Rosypal a kol., : Obecná bakteriologie, Státní pedagogické nakladatelství Praha, 1981.
Rolfs a kol..: PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer-Verlag, Berlin, 1-135, 1992.
ýQþ&ÿ "!$#%'&($) *+",-.&./ 02134 657.98;:9<<=
35
Obsah
1. Úvod
1
2. Kultivácia a uchovávanie bakteriálnych buniek E. coli
2
3. Izolácia chromozómovej DNA
8
4. Izolácia plazmidovej DNA
14
5. Elektroforéza v agarózovom géli
20
6. Konštrukcia génových bánk - príprava rekombinantnej DNA
28
7. Transformácie buniek E. coli
38
8. Identifikácia a analýza rekombinantných bakteriálnych klonov
42
9. >?@ACB7DEFGHI?GJKGMLEN.?OPQSRTDPKNOUD.VWMXLBYD.Z DEOU[DV\V2U]"VB3V9EA^?_B7D)PMOUD.V
50
10. `bacdegfhe.ikjmlonqpr7estsuv"wMi$xy'z
53
11. Analýza sekvencií DNA pomocou PC
69
12. {}|~€ƒ‚|„…†ˆ‡h‰‹ŠŒ.†Ž‡ ‰93€4‡6‹‘
71
36
Download

()&0